CN104302646B

CN104302646B - 可用作Raf激酶抑制剂的2-氨基, 6-苯基取代的吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物

Info

Publication number: CN104302646B
Application number: CN201380012913.9A
Authority: CN
Inventors: M.C.阿尔盖尔; D.L.弗林; M.D.考夫曼; P.J.帕特尔; C.D.沃尔芬格
Original assignee: Eli Lilly and Co; Deciphera Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Eli Lilly and Co; Deciphera Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2012-03-07
Filing date: 2013-03-05
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2033-03-05
Also published as: BR112014018528A8; CO7010837A2; ME02423B; MX2014010701A; MA37316A1; HRP20160654T1; IL234052A; US9334267B2; RS54840B1; EA024824B1; DK2850082T3; PH12014501986A1; KR20140129087A; AU2013230146B2; CR20140378A; DOP2014000200A; CL2014002220A1; MA37316B1; TN2014000375A1; US20150119392A1

Abstract

本发明提供了化合物1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐，其抑制Raf且因此可用于治疗癌症。

Description

可用作Raf激酶抑制剂的2-氨基, 6-苯基取代的吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物

Ras/Raf/促分裂原活化的蛋白激酶激酶(也称作MAP2K；MAPK激酶；和MAPK/ERK激酶或MEK)/细胞外信号调节的激酶(ERK)信号传导级联(在本文中称作“Ras/Raf/MEK/ERK”或“Ras/Raf/MEK/MAPK”)是在哺乳动物的发育和组织内稳态中起整体作用的进化保守途径。此信号传导途径由激酶级联组成，该级联将细胞外信号传递至核以调节基因表达和关键细胞功能。由Ras/Raf/MEK/ERK信号传导途径控制的基因表达调节基本细胞过程(包括增殖、分化、细胞凋亡和血管发生)。Ras/Raf/MEK/ERK信号传导的这些多样作用在不同类型的癌症中异常活化。此途径内的基因突变可导致组成型活性蛋白，从而引起增加的细胞增殖和对细胞凋亡的抗性。

Raf(丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)是由基因家族编码，该基因家族由三种提供三个Raf异构体成员(B-Raf、C-Raf(Raf-1)和A-Raf)的基因组成。这些蛋白中的每一种在羧基末端处共享高度保守氨基末端调节区和催化结构域。除非另外指明，否则Raf是指所有三个成员。尽管每一异构体在Ras/Raf/MEK/ERK途径中起作用，但已显示B-Raf为MEK的主要活化剂。B-Raf由Ras:GTP募集至细胞内细胞膜，在此处B-Raf被活化。B-Raf又负责活化MEK1/2且MEK1/2活化ERK1/ERK2。B-Raf基因的突变允许B-Raf独立于上游信号信号传导。因此，突变B-Raf蛋白(诸如V600E)引起MEK和ERK的过量下游信号传导。这导致过量细胞增殖和存活以及癌发生。通过突变B-Raf的信号传导级联的过度活化与多种恶性肿瘤有关。

受体酪氨酸激酶(RTK)c-Kit(也称作CD117)在多种细胞类型上表达。c-KIT的配体是干细胞因子(SCF)。SCF结合至c-KIT的细胞外结构域诱导受体二聚化和下游信号传导途径(包括RAS/RAF/MEK/ERK途径)的活化。突变c-KIT与几种癌症的发病有关。

尽管存在B-Raf特异性抑制剂(诸如威罗菲尼(vemurafenib))和化合物诸如公开于WO2006/039718和WO2008/034008中的化合物，但仍需要有效抑制Raf蛋白的所有异构体(包括A-Raf、B-Raf、C-Raf和B-Raf V600E突变)的Raf抑制剂。进一步需要有效抵抗通过N-Ras突变、K-Ras突变和cKit突变而上游途径活化的肿瘤细胞的Raf抑制剂。此外，仍需要提供用于治疗癌症的替代Raf抑制剂。也仍需要提供有效抑制A-Raf、B-Raf、C-Raf和B-Raf V600E突变以治疗癌症的替代Raf抑制剂。因此，本发明提供可有效抑制Raf蛋白的所有异构体的Raf抑制剂。此外，本发明提供可有效抵抗通过N-Ras突变、K-Ras突变和cKit突变而上游途径活化的肿瘤细胞的Raf抑制剂。另外，本发明提供替代Raf抑制剂。此外，本发明提供可用于治疗癌症的替代Raf抑制剂。本发明还提供有效抑制A-Raf、B-Raf、C-Raf和B-Raf V600E突变的替代Raf抑制剂。另外，本发明提供有效抑制A-Raf、B-Raf、C-Raf和B-Raf V600E突变的可用于治疗癌症的替代Raf抑制剂。

图1是实施例1的代表性X射线粉末衍射图。

本发明提供化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲，或其药学上可接受的盐。

作为具体实施方案，本发明提供化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲。

本发明提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。本发明提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲以及药学上可接受的载体。

本发明提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

作为具体实施方案，本发明提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐和聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯(PVP-VA)。本发明还提供药物组合物，其包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲和聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯(PVP-VA)。此外，本发明提供如本文所述药物组合物的优选实施方案，其中PVP-VA选自Kollidon® VA 64和Plasdone ™ S-630共聚维酮。优选地PVP-VA是Kollidon® VA 64。

目前优选的制剂包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-{2-氟-4-甲基-5-[7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]苯基}脲或其药学上可接受的盐、以及Kollidon® VA 64 (BASF CORPORATION产品编号95405-2-43)、比率为60:40的1-乙烯基-2-吡咯烷酮与乙酸乙烯酯的共聚物和1-2%(w/w)月桂基硫酸钠。制备固体分散物，其可包含20%或40%药物载量且可包括0-2%月桂基硫酸钠或适当量的其它合适药学上可接受的润湿剂、增塑剂、处理助剂或一种或多种其它合适赋形剂。

本发明提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐。本发明提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲。

本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐，其用于治疗中。本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症。本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐。

本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲，其用于治疗中。本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲，其用于治疗癌症。本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲。

本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本发明还提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

本发明提供呈结晶形式的1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲。本发明还提供呈结晶形式的1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲，其特征在于X射线粉末衍射图在16.0处和6.9、7.0、18.2和23.2中的一处或多处出现特征峰(以2θ ± 0.2表示)。

此外，本发明提供如本文所述方法和用途的优选实施方案，其中癌症选自：急性髓性白血病(AML，急性粒细胞性白血病)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴母细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合症、卵巢癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌或甲状腺癌。更优选地，癌症选自：甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、急性髓性白血病(AML，急性粒细胞性白血病)和结肠直肠癌。甚至更优选地，癌症是黑色素瘤或结肠直肠癌。

本发明提供治疗癌症的方法，所述癌症是甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、AML或结肠直肠癌，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐。

本发明提供化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐，其用于治疗中。

本发明提供化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症，所述癌症是甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、AML或结肠直肠癌。

本发明提供1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症是甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、AML或结肠直肠癌。

在具体实施方案中，药物组合物包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-{2-氟-4-甲基-5-[7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]苯基}脲或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体和任选地其它治疗成分。

在具体实施方案中，药物组合物包含1-(3,3-二甲基丁基)-3-{2-氟-4-甲基-5-[7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]苯基}脲或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体和任选地尤其用于治疗一般或特定癌症类型的癌症的其它治疗成分。

本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

。

术语“患者”意指哺乳动物且“哺乳动物”包括，但不限于，人。

“治疗有效量”或“有效量”意指抑制癌症患者中的B-Raf、C-Raf、A-Raf和/或B-Raf V600E信号传导和破坏靶癌细胞或减缓或停止患者的癌症进展所需的化合物或其药学上可接受的盐或含有示例性化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的剂量。示例性化合物或其药学上可接受的盐的预期剂量在300 mg至1500 mg/患者/天范围内。预期优选剂量在400 mg至1400 mg/患者/天范围内。预期最优选剂量在600 mg至1200 mg/患者/天范围内。医师可鉴于疾病的阶段和严重度以及个别患者的特定需要和反应和所施用具体化合物来确定治疗患者所需的精确剂量和治疗时间长度。尽管表示为以每天计的剂量，但可调节给药方案以便为患者提供更优化的治疗益处。除每日给药外，一天两次(BID)或一天三次(TID)给药可以是适当的。BID给药通常是优选的。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意指包括全谱干预患者患有的癌症，诸如施用活性化合物以减轻、减缓或逆转癌症的一种或多种症状和延迟癌症进展，即使癌症实际上未消除。

本发明示例性化合物优选使用药学上可接受的载体或使用一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制为药物组合物且通过多种途径施用。优选地，此类组合物用于口服施用。此类药物组合物和其制备方法是本领域众所周知的。参见，例如，REMINGTON: THE SCIENCE和PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro等人编辑，第21版，Mack Publishing Co., 2005)。

本发明示例性化合物能够与多种无机和有机酸反应以形成药学上可接受的酸加成盐。此类药学上可接受的盐和制备其的一般方法是本领域众所周知的。参见，例如，P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S. M. Berge等人，“Pharmaceutical Salts”， Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。

应当理解，1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲或其药学上可接受的盐可以通过本领域已知的多种程序以及下文所述的那些程序来制备。

实施例1命名为：1-(3,3-二甲基丁基)-3-{2-氟-4-甲基-5-[7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]苯基}脲；且也可以命名为：N-(3,3-二甲基丁基)-N’-[2-氟-4-甲基-5-[7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3d]嘧啶-6-基]苯基]脲；且可以使用其它名称以明确鉴定实施例1。

在1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲的合成中用作初始起始材料的化合物是众所周知的，且在没有商售的程度，则可以使用提供的特定参考文献通过本领域普通技术人员通常采用的标准程序容易地合成，或者可见通用参考文本中。

已知程序和方法的实例包括描述于通用参考文本和其中所引用参考文献中的那些，通用参考文本诸如Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989；Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 第5版, Michael B. Smith和Jerry March, Wiley Interscience, 2001；Advanced Organic Chemistry, 第4版, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey和Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, 等。

如本文所用，以下术语具有所示含义：“d6-DMSO”是指六氘代-二甲亚砜；“DCM”是指二氯甲烷；“DMSO”是指二甲亚砜；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇；“HPLC”是指高效液相层析；“IPAC”是指乙酸异丙酯；“KF”是指Karl Fischer；“MS”是指质谱；“MeOH”是指甲醇；“MTBE”是指叔丁基甲基醚；“NMR”是指核磁共振；“RT”是指室温；“THF”是指四氢呋喃。

除非说明相反的情形，否则使用ACDLABS或Symyx Draw3.2对本文所述化合物进行命名和编号。

制备例1

5-溴-2-氟-4-甲基苯胺

方法 A:

将1-溴-4-氟-2-甲基苯 (30.0 g, 159 mmol)合并于浓硫酸 (100 mL)中，冷却至约-5℃，并经20分钟用硝酸 (11.00 mL, 174 mmol)逐滴处理。将反应混合物升温至RT并搅拌30 min。在搅拌下倾倒至碎冰上并用叔丁基甲基醚 (MTBE) (200 mL)分配。分离水层并用MTBE (2 x 50 mL)萃取。合并有机层，干燥并在减压下浓缩，以提供作为橙色粘稠油状物的1-溴-4-氟-2-甲基-5-硝基苯(39.0 g)。

在摇瓶中合并粗1-溴-4-氟-2-甲基-5-硝基苯 (32.4 g, 138 mmol)、乙醇 (100 mL) 和Raney镍 (1.00 g, 17.04 mmol)。用氢气(275 kPa)装填烧瓶并搅动直至氢气停止吸收。将反应容器减压，通过过滤去除催化剂并将滤液蒸发至干燥。添加MTBE，然后再次过滤并将滤液蒸发。将残余物在己烷中搅拌。通过过滤收集固体，用冷己烷洗涤并在真空干燥，以提供作为深色固体的标题化合物(17.8 g, 63%收率)。MS (m/z): 204.0 (M+1)/206.0 (M+3)。

方法 B:

向配有机械搅动、温度计、冰浴和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加1-溴-4-氟-2-甲基苯 (1.4kg, 7.4 mol)，然后在0-10℃添加浓H₂SO₄ (6.3kg)。搅拌10-20分钟后，将混合物冷却至-10~0℃，并在约6小时内分份添加KNO₃ (0.82kg, 7.8 mol, 1.05 当量)，同时将温度维持在-10~0℃。在添加后，将反应混合物升温至10-20℃，并通过TLC (EA:PE=1:20)和HPLC监测，直至1-溴-4-氟-2-甲基苯的含量<0.5 %。将混合物倾入冰/水混合物(11.2kg, 冰:水=1:1)中并用MTBE(4.7L和1.9L)萃取两次。将有机层合并，用饱和盐水(5.6kg)洗涤并在低于45℃在减压下浓缩至1.5~2V。用EtOAc (5.6L)稀释残余物并将所得溶液直接用于下一步骤中(1.22 kg(校正的wt%)，70.5%收率，和68.3%纯度，通过在210 nm的UV吸收检测)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.35 (s, J = 7.1 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 2.59 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。

向配有机械搅动、温度计和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加EtOAc (5L) 中1-溴-4-氟-2-甲基-5-硝基苯 (1.16kg, 4.96 mol.)的溶液和36% HCl 溶液(4.9kg, 49.6 mol, 10.0 当量)。在20~30℃搅拌5~10分钟后，分份添加Fe粉(1.34kg, 24.0 mol, 4.8当量)，同时将温度维持在20-30℃。反应通过TLC (EA:PE=1:10)监测。完成反应后，使用NaHCO₃将pH值调节至2~3，并添加Celite® (0.56kg)。将混合物搅拌0.5~1小时并过滤。将固体用甲苯 (2 x 2.6L)洗涤。将滤液合并并再搅拌0.5~1 h，然后分离各层。将水层用甲苯 (2.6L)萃取。将有机层合并，用盐水(3L)洗涤，并经硅胶垫(2~3 cm)过滤。将滤液浓缩至2~2.5L，并将残余物与正庚烷 (3.3L)混合。再次浓缩至2~2.5L后，添加正庚烷 (1.65L)。将混合物冷却至-10-~0℃并搅拌1小时。通过过滤收集沉淀物，用正庚烷 (0.5L, 预冷却至-10~0℃)洗涤并干燥，以得到作为棕色固体的标题化合物的粗产物。用正庚烷(3.3 L)使粗产物重结晶，给出标题化合物的灰白色至褐色固体。(527g，52%收率和98%纯度，通过在210 nm的UV吸收检测)。¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 6.97 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 2.16 (s, 3H); ¹³C NMR (500MHz, CDCl₃): δ 21.41, 116.60, 118.30, 119.66, 127.22, 132.88, (149.37,151.12);¹⁹F NMR (400 MHz, CDCl3): δ 151.14

制备例2

2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯胺

方法 A:

将5-溴-2-氟-4-甲基苯胺 (3.1 g, 15.2 mmol)、联硼酸频那醇酯(4.24 g, 16.7 mmol)和乙酸钾 (4.47 g, 45.6 mmol)合并于二氧杂环己烷 (40 mL)中，并用氩气吹扫。添加[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯化钯(II)–二氯甲烷络合物(0.620 g, 0.760 mmol)，再次用氩气吹扫并在100℃加热过夜。将反应混合物过滤并在真空浓缩。通过硅胶层析(0-50% EtOAc/己烷)纯化，以得到标题化合物(3.24 g, 85% 收率)。MS (m/z): 252.1 (M+1)。

方法 B:

向配有机械搅动、温度计和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加5-溴-2-氟-4-甲基苯胺 (200g, 0.98 mol)、CH₃COOK (192g, 1.95 mol, 2.0当量)、联硼酸频那醇酯(248g, 0.98 mol,1.0当量)和IPAC (3L)。用N₂ 脱气30 min后，将混合物升温至50℃并添加Pd(dppf)Cl₂ (8g, 4wt%)。将反应混合物在回流下加热至少10h，直至起始原料的含量≤2% (GC)。将混合物冷却至20~30℃，经Celite®垫过滤并用IPAC (1L)冲洗。将滤液浓缩至剩余400~500ml。将残余物与正庚烷 (700ml)混合，经SiO₂垫过滤并用IPAC/正庚烷 (首先1/5, ~2L, 然后2/5, ~3L )洗脱。将滤液浓缩至350~400ml。添加正庚烷(300ml)并将混合物再次浓缩至350~400ml。将残余物(悬浮液)冷却至-10~ -20℃并在搅拌2-5 h后过滤。在30~40℃将粗产物溶解于MeOH (200 ml)，然后在0.5~1h内缓慢逐滴添加H2O (600 ml)。将悬浮液冷却至20~30℃并在搅拌1-2 h后过滤。将固体在高真空下干燥，以得到作为灰白色固体的标题化合物(183g，74%收率和99%纯度，通过在210nm的UV吸收检测)；¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.42 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.76 (s, 2H), 2.64 (s, 3H), 1.55 (s, 12H); ¹³C NMR(500MHz,CDCl3): δ 20.66, 20.67, 24.40, 82.93, 116.20, 124.37, 130.64, 135.02, (151.93,153.37);¹⁹F NMR (400 MHz,CDCl3): δ 145.72。

制备例3

2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基氨基甲酸丙-1-烯-2-基酯

在EtOAc (60 mL) 和饱和NaHCO₃ 水溶液(60 mL)中添加2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯胺 (5.0 g, 19.91 mmol)和氯甲酸异丙烯酯 (2.40 mL, 21.90 mmol)，并在RT搅拌6 h。分离各层，将水层用EtOAc (2x)萃取，将合并的有机物用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩，以获得标题化合物。未进一步纯化即用于下一反应(假定100%收率)。MS (m/z): 336.2 (M+1)。

制备例4

3,3-二甲基丁-1-胺盐酸盐

向配有机械搅动、温度计和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加3,3-二甲基正丁醛 (200g, 2.0 mol)。然后逐滴添加1-苯基甲胺 (214g, 2.0mol, 1.0当量)。将反应混合物在20~30℃搅拌2~5小时，直至通过GC转化率大于99%。添加NaCl (4 g)，并弃去水相。添加THF (800 ml)并将混合物浓缩至400ml。重复该操作，直至残余物的KF小于0.2%。添加THF (800 ml) 和 t-BuOK (44.8g, 0.4 mol, 0.2当量)。将混合物升温至60~65℃并搅拌，直至N-苄基-3,3-二甲基-丁-1-亚胺的含量通过GC小于1%。冷却至10-20℃后，添加水(1500 ml)并将混合物用MTBE (2 x 1500 ml)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl(800 ml)洗涤，取样用于水含量分析并确保1% -2% KF含量。N-(3,3-二甲基丁基)-1-苯基-亚甲胺流直接用于下一步骤。(通过GC 83%纯度；GC- MS m/z 188.2 [M-H]+)。

向配有机械搅动、温度计和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加上述获得的N-(3,3-二甲基丁基)-1-苯基-亚甲胺溶液(412g, 2.18mol, 3.27L MTBE 1.3L THF.)并在20~30℃逐滴添加HCl/MTBE溶液(16%,398g, 1.74 mol, 0.8当量)。添加期间，白色固体沉淀。在搅拌1~2小时后，过滤悬浮液的等分试样。通过GC检查母液。如果N-(3,3-二甲基丁基)-1-苯基-亚甲胺的含量大于30%，则添加额外HCl/MTBE溶液(45g, 0.10当量)，直至N-(3,3-二甲基丁基)-1-苯基-亚甲胺的含量通过GC测定为20%~30%。通过过滤收集固体，用MTBE (870 ml)洗涤，并在N₂干燥，以得到作为白色晶体材料的期望标题化合物(195g, 65%收率; ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 7.90 (s, 3H), 2.74 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 0.89 (s, 9H); ¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ 28.98, 29.31, 35.49, 40.34。

制备例5

1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲

方法 A:

用3,3-二甲基丁-1-胺 (2.42 g, 23.9 mmol)和1-甲基吡咯烷 (0.169 g, 1.99 mmol)处理二氧杂环己烷 (60 mL)中2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基氨基甲酸丙-1-烯-2-基酯 (6.67 g, 19.90 mmol)的溶液，并在75℃加热过夜。将混合物冷却至RT，经由过滤收集固体并用二乙基醚洗涤，以获得标题化合物(6.62 g, 经两个步骤88% 收率)。MS (m/z): 379.2 (M+1)。

方法 B:

向配有机械搅动、温度计和N₂入口的4颈圆底烧瓶中添加2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯胺 (40g, 0.159 mol)、THF (600 ml)和NaHCO₃(16.0g, 0.19 mol, 1.20当量)。将混合物冷却至0~5℃并逐滴添加氯甲酸苯酯 (26.14g, 0.167 mol, 1.05当量)。将反应混合物升温至60℃并搅拌，直至2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯胺的含量 ≤ 2%。将混合物过滤并将固体(盐)用THF (120 ml)洗涤。将滤液浓缩至65~80ml。向残余物中添加甲苯 (720 ml)、3,3-二甲基丁-1-胺 (HCl盐, 26.14g, 0.19 mol, 1.2当量) 和TEA (20.87g, 0.21 mol, 1.3当量)。将所得混合物加热至90℃并搅拌，直至中间体的含量≤ 2%。将混合物冷却至15~20℃，搅拌2小时并过滤。将固体用甲苯 (120 ml)、H₂O (2 x 400 ml)洗涤并在高真空下干燥，以提供作为白色固体的标题化合物。(54.9g，91.3%收率和99%纯度，通过在210 nm的UV吸收检测)；¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 8.34 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 6.98 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 1.36 (m, 14H), 0.90 (s, 9H);¹³C NMR (500MHz, d6-DMSO): δ 21.12,24.65,29.37,29.58, 35.65,43.50,83.25, 104.32116.09, 125.02, 128.19, 138.71, (152.40,154.34) ,154.81; ¹⁹F NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 136.34。

制备例6

4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯

方法 A:

向乙醇 (EtOH) (450 mL)中4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯 (200 g, 860 mmol)的剧烈搅拌悬浮液中添加浓氢氧化铵(335 mL, 8.60 mol)并将其搅拌过夜。通过过滤收集固体，用EtOH (2 x 100 mL)和 H₂O (3 x 200 mL)冲洗，并在真空炉(65-70℃)干燥过夜，以提供作为白色固体的标题化合物(164.4 g, 90% 收率)。MS (m/z): 214.1(M+1)。

方法 B:

向反应容器中装入1190g THF和660g 4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯 (1.0当量 2.84 mol)。在10~20℃搅拌20-30min，然后将907 g NH₃-H₂O和989 g Et₃N添加至混合物。加热至45-55℃，在45-55℃搅拌2-6小时。反应完成后，冷却至8-12℃并添加4000g水。在8-12℃搅拌4-8小时，过滤并用200g水冲洗。将滤饼在真空下在80℃干燥8-24小时，以获得标题化合物(560g；98.8%纯度，92%收率；[M+1]=213.8, ¹H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): δ = 8.564 (s, 1H), 8.278 (s, 1H), 8.011(s, 1H),7.649 (s, 1H), 4.293-4.240 (dd, J₁=6.8, J₂=14, 2H), 2.462 (s, 3H), δ 1.308-1.272 (m, 3H))。

制备例7

4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇

将四氢呋喃 (THF) (900 mL)中4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯 (72.3 g, 339 mmol)的溶液冷却至0℃。经1 h逐滴添加LiAlH₄ (THF 中的2 M)的溶液(195 mL, 390 mmol)。在0℃搅拌2 h，并将反应升温至RT过夜。将混合物冷却至0℃，通过连续添加水 (15 mL)、20% KOH水溶液 (15 mL)和水 (30 mL)谨慎地淬灭。将所得混合物搅拌1 h。经MgSO₄干燥，过滤，在减压下浓缩并在真空下干燥，以获得标题化合物(55.85 g, 96%收率)。MS (m/z): 172.1(M+1)。

制备例8

4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醛

方法 A:

将MnO₂ (49.8 g, 572 mmol)添加至氯仿 (818 mL)中4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇 (28 g, 164 mmol)的悬浮液，并将反应在55 ℃(内部测量)加热4 h。将热反应混合物过滤并将滤饼用热氯仿和THF冲洗。在减压下将合并的滤液浓缩并在真空下干燥，以获得作为淡黄色固体的标题化合物(26.7 g, 96% 收率) MS (m/z): 170.1(M+1)。

方法 B:

向反应容器中装入450 g (2.08 mol, 1.0当量) 4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯和6750 mL (15.0 V) THF。向单独的反应容器中装入88.1 g (1.1当量) LiAlH₄ 和2250 g (5.0 V) THF。将此LiAlH₄混合物冷却至-5~5℃。在低于10 ℃下，将4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的THF溶液逐滴添加至LiAlH₄混合物。添加后，在5~15℃将混合物搅拌2~3小时。冷却至-5~5℃，并在低于20 ℃下逐滴添加279 g (1.5当量) EtOAc。在10~20℃将混合物搅拌1~2小时。在低于20 ℃下，分份添加450 g (0.66当量) Na₂SO₄.10H₂O。在10~20℃将混合物搅拌1~2小时。将悬浮液通过硅藻土过滤。将滤饼用THF洗涤。向含有4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)甲醇溶液的滤液中装入734 g (4.0当量) MnO₂。将混合物加热至40 ℃。在40~45℃将混合物搅拌6~8小时。将悬浮液通过硅藻土过滤。将滤饼用THF洗涤。将滤液合并，浓缩并逐滴添加1530 g (5.0 V)正庚烷。在10~20℃将混合物搅拌3~4小时。将悬浮液过滤并将滤饼用庚烷洗涤。在40~50℃在减压下将滤饼干燥10-16小时，以获得标题化合物( 276g; 97.9%纯度，75%收率; [M+1]=171.8,¹H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): δ = 7.887 (s, 1H), 6.704 (s, 2H), 5.066-5.042 (m, 1H), δ 4.292-4.280 (d, 2H), 2.392 (s, 3H); [M+1]=169.8,¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ = 9.769 (s, 1H), 8.414 (s, 1H), 8.190 (s, 1H), 5.772 (s, 1H), 2.540 (s, 3H))。

制备例9

7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-醇

方法 A:

将1-羟基丙-2-酮 (24.3 mL, 355 mmol)和4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醛 (50 g, 296 mmol)添加至氢氧化钠 (23.64 g, 591 mmol)和水 (200 mL)的溶液。将EtOH (600 mL)添加至悬浮液并在RT搅拌过夜。缓慢添加水 (350 mL)中浓HCl (50 mL)的溶液。添加1:1 EtOH/H₂O (100 mL)并通过过滤收集固体。将固体用1:1 EtOH/H₂O (250 mL)、冰冷EtOH (4 x 25 mL)和己烷 (2 x 250 mL)洗涤。在30-35℃在真空炉干燥，以提供作为黄褐色固体的标题化合物(34 g, 56% 产率)。MS (m/z): 208.1 (M+1)。

方法 B:

向反应容器中装入2400 g (8.0 V) H₂O 和177.3 g (2.5当量) NaOH 和300.0 g (1.77mol, 1.0当量) 4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醛和157.6 g (1.2当量)羟基丙酮。将混合物加热至35-45℃，在35-45℃搅拌10-20小时。将混合物冷却至5-15 ℃。逐滴添加4500 mL 1N HCl，在低于15℃下将pH调整至3~4。在10-15℃搅拌1-2小时。过滤并将滤饼用300g水冲洗。在50~60℃在减压下将滤饼干燥16-24小时，以提供标题化合物(372 g棕色固体; 98.0% HPLC面积(测定: 90.0%); 90%收率; ¹H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): δ = 10.864 (s, 1H), 9.276 (s, 1H), 7.529 (s, 1H), 2.570 (s, 6 H))。

制备例10

三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯

方法 A:

合并7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-醇 (25 g, 121 mmol)、DCM (1100 mL)和吡啶 (98 mL, 1206 mmol)并用冰浴冷却混合物，直至内部温度<3℃。经由注射器以维持内部温度低于5℃的速率缓慢添加三氟甲磺酸酐 (24.5 mL, 145 mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2h。用水 (3 x 300 mL)和盐水(300 mL)洗涤，经由MgSO₄干燥并过滤。在减压下将滤液浓缩(水浴温度 ~ 35℃)并在高真空下在RT干燥2-3 h。将残余物溶解于DCM并通过硅胶层析(EtOAc/己烷)纯化。将级分浓缩，以得到半纯固体。将固体用20% EtOAc/己烷 (100 mL)研磨，通过过滤收集，用20% EtOAc/己烷 (2 x 10 mL)冲洗，并在室温在真空下干燥，以提供作为浅粉色固体的标题化合物(28.6 g, 70% 收率)。MS (m/z): 340.0 (M+1)。

方法 B:

向反应容器中装入4000 mL (20.0 V) DCM和208 g (1.0 mol, 1.0当量) 7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-醇。将混合物搅拌10-20分钟。在低于20℃下装入312 g (4.0当量)吡啶。冷却至-5~0℃，并在低于0 ℃下逐滴添加DCM (2000 mL, 10.0 V)中416 g三氟甲磺酸酐 (1.5当量)的溶液。添加后，在0-5℃搅拌2-3小时。将反应用2000 mL 1N HCl (2X)淬灭。用500 mL H₂O洗涤两次。添加100.0 g硅胶并在10~20℃搅拌1-2小时。将混合物通过硅藻土过滤。将滤液浓缩，并在10~20℃在搅拌下逐滴添加1000 mL (5.0 V)正庚烷。在10~20℃将混合物搅拌3-4小时。在35~40℃在减压下将滤饼过滤并干燥8-12小时，以提供标题化合物( 307 g棕色固体; 99.1% HPLC面积(测定: 96.8%); 86%收率; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ = 9.216 (s, 1H), 8.120 (s, 1H), 2.890 (s, 3H), 2.773 (s, 3H)。

制备11

三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯

方法 A:

将三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯 (28.6 g, 84 mmol)、二甲基甲酰胺 (74 mL) 和冰醋酸 (9.61 mL, 169 mmol)的混合物加热至45℃，然后经2 h逐滴添加6.15% NaOCl水溶液 (漂白剂, 612 g, 506 mmol)。在45-50℃加热2 h，冷却至RT，通过过滤收集固体并用水(300 mL)洗涤。将DCM (200 mL)添加至固体，将悬浮液在冰水浴中冷却并用THF中2.0 M N-甲基胺的溶液(126 mL, 253 mmol)处理。将混合物缓慢升温至RT并搅拌2 h。将溶剂在减压下去除，用甲醇 (MeOH) (50 mL)处理并在RT搅拌30 min。通过过滤收集固体并用MeOH洗涤。将固体用EtOAc (30 mL)处理并在RT 搅拌30 min。通过过滤收集固体并用EtOAc洗涤，以获得标题化合物(19.82 g, 73% 收率)。MS (m/z): 323.0 (M+1)。

方法 B:

向反应容器中装入150 g (0.442 mol, 1.0当量，Limited Reagent)三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯，将3000 mL DCM添加至澄清，将混合物冷却至-5~5℃。在低于5 ℃下，分份添加105 g (0.442 mol, 1.0 当量) m-CPBA。在0~5℃将混合物搅拌3~4小时(E/A=1%)。在低于10 ℃下，逐滴添加2M THF中660 mL (1.326 mol, 3.0当量)甲基胺，并在0~10℃将混合物搅拌3~4小时。在搅拌下添加1500 mL DCM 和1000 mL H₂O并分离水层。将有机层用500 mL H₂O洗涤四次，并在低于40℃下浓缩至600g。将溶剂用正庚烷交换两次，并在10~20℃将混合物搅拌3~4小时。将悬浮液过滤。用150 g 正庚烷冲洗并在65~75℃在减压下将滤饼干燥10-16小时，以获得标题化合物(129.6 g, 96.5%纯度，82%收率; LC-MS (MS+=371.8); ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ = 8.932 (s, 1H), 7.86 (m, 1H), 5.707 (s, 1H), 3.192-3.180 (d, 3H), 2.754 (s, 3H)。

制备例12

N,7-二甲基吡啶并[2,3- d]嘧啶-2-胺

用KOH (3.32 g, 59.1 mmol)处理丙酮 (100 mL)中4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醛 (10 g, 59.1 mmol)的溶液，在RT搅拌10 min，然后浓缩至干燥。将残余物用EtOAc处理，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤，然后用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩，以获得7-甲基-2-(甲硫基)吡啶并[2,3-d]嘧啶。MS (m/z): 192.1 (M+1)。添加乙醇 (33%, 80 mL)中甲基胺的溶液，并在110℃在压力管中加热过夜。将溶剂在减压下去除，并将粗产物通过硅胶层析(50-100% EtOAc/己烷)纯化，以获得标题化合物(6.73 g, 65%, 经两个步骤)。MS (m/z): 175.1 (M+1)。

制备例13

6-溴-N,7-二甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-胺

在冰浴中冷却乙腈 (160 mL)中N,7-二甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-胺 (6.73 g, 38.6 mmol)的溶液并用铝箔避光。添加N-溴代琥珀酰亚胺 (6.88 g, 38.6 mmol)并在0℃搅拌2h。将反应转移至5 ℃冰箱，持续4天。通过过滤收集固体。将固体用DCM洗涤并将洗涤液浓缩，以获得标题化合物(3.0 g, 31% 收率)。MS (m/z): 253.0/255.0 (M+1)。

实施例1

1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲

实施例1可以用方法A、方法B或方法C制备。

方法 A:

将1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲 (25.9 g, 68.5 mmol)、三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯 (22.09 g, 68.5 mmol)和NaHCO₃ (17.28 g, 206 mmol)合并于1,4-二氧杂环己烷 (500 mL)和水 (125 mL)中，并用氩气吹扫20分钟。添加四(三苯基膦)钯 (3.96 g, 3.43 mmol)，然后在氩气下在50℃加热。添加又一份三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯 (300 mg, 0.55 mmol)并在50℃继续加热过夜。将混合物冷却至RT，通过过滤收集固体并用水洗涤，然后用二乙基醚洗涤。用乙腈 (50 mL)处理固体并在80℃将浆料加热30分钟。通过过滤收集固体，用乙腈洗涤并在80℃在真空下干燥，以获得淡黄色固体。用MeOH (50 mL)处理固体并在80℃将混合物加热1小时。冷却至RT，经由过滤收集固体，用MeOH (20 mL)洗涤并在真空下干燥，以获得作为淡黄色固体的标题化合物(22.5 g, 77% 收率)。MS (m/z): 425.2 (M+1)。

方法 B:

用氩气吹扫二氧杂环己烷 (80 mL)和水 (20 mL)中1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲 (4.48 g, 11.8 mmol)、6-溴-N,7-二甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-胺 (3.0 g, 11.8 mmol)和K₂CO₃ (4.91 g, 35.6 mmol)的悬浮液，用四(三苯基膦)钯 (0.685 g, 0.593 mmol)处理并在85℃加热过夜。将二氧杂环己烷在减压下去除，用EtOAc和盐水处理混合物，分离各层，将有机物经Na₂SO₄干燥，浓缩并通过硅胶层析(40% 至100% EtOAc/己烷, 100% EtOAc, 5% MeOH/ EtOAc)纯化。用CH₃CN处理材料，在80℃加热1小时，冷却至RT并经由过滤收集固体，以提供作为淡黄色固体的标题化合物(3.52 g, 70% 收率)。MS (m/z): 425.2 (M+1)。

方法 C:

用N₂鼓泡反应容器中的混合物溶剂1, 4-二氧杂环己烷 (1250 g)和水 (200 g)。将混合物加热至80~85℃。在氩气下装入100 g (0.31 mol, 1.0当量，limited reagent)三氟甲磺酸7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基酯、117.4 g (0.31 mol, 1.0当量) 1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲、128.7 g (0.93 mol, 3.0当量) K₂CO₃ 和6.81 g (0.0093 mol, 0.03当量) Pd(dppf)Cl₂。在80~90℃将混合物搅拌4~6小时。将混合物冷却至40~50℃。浓缩并在低于30℃下逐滴添加2000 g水。添加后，在10~30℃将混合物搅拌6~8小时。过滤并用200 g水冲洗，然后洗涤滤饼。将滤饼在减压下在60~70℃干燥14-16小时，以获得工业级API的标题化合物(158g, 90.4%纯度，测定：63.4%，KF:5%-6%)。在10~30℃将工业级API的标题化合物溶解于1000 mL DCM和1000 mL EtOH中。添加50 g硅胶、80 g Na₂S₂O₃.5H₂O 和10 g 活性炭。将混合物加热至40~50℃并搅拌3~5小时并冷却至10~30℃。过滤并将滤饼用200 g DCM/EtOH (1:1)洗涤。在40~50℃用5 g SilicaThiol搅拌并过滤。将溶剂用390.0 g EtOH交换两次。浓缩并将悬浮液过滤，然后将滤饼用39.0 g EtOH洗涤。在65~75℃在减压下将滤饼干燥14-16小时，以获得API的标题化合物(61 g, 98.5%纯, 测定: 97.5%, 65%收率; ¹H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): δ = 9.077 (s, 1H), 8.278 (s, 1H), 7.968-7.947 (d, 1H), 7.893 (s, 1H), 7.680 (s, 1H), δ 7.193-7.162 (d, 1H), 6.512-6.485 (m, 1H), 3.088-3.035 (m, 2H), 2.924-2.914 (d, 3H), 2.296 (s, 3H), 1.955(s, 3H), 1.344-1.304 (m, 2H), 0.875 (s, 9 H)。

X射线粉末衍射

利用配备有CuKa源(λ=1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪在35 kV和50 mA下操作获得结晶固体的XRD图。在4°至40°2θ扫描样品，其中步长为0.009°2θ且扫描速率为0.5秒/步，且散度为0.6 mm，固定抗散射为5.28，且检测器狭缝为9.5 mm。将干粉末堆叠于石英样品固持器上并使用载玻片获得平滑表面。在环境温度和相对湿度下采集晶体形式衍射图。结晶学领域中众所周知，对于任何给定晶体形式，衍射峰的相对强度可因由因素诸如晶体形态和习惯产生的优选定向而变化。当存在优选定向的效应时，则峰强度改变，但多晶型的特征峰位置未变化。参见，例如，The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18，第1843-1844页，1995。此外，结晶学领域中也众所周知，对于任何给定结晶形式，角峰位置可稍微变化。例如，峰位置可因分析样品的温度或湿度变化、样品更换或的存在或不存在内标而变动。在本发明情形下，±0.2的2θ的峰位置可变性将考虑这些潜在变化，而不阻碍所示结晶形式的明确鉴定。可基于区别峰(以°2θ为单位)、通常更显著峰的任何独特组合确认结晶形式。基于8.853和26.774度2-θ下的NIST 675标准峰调节在环境温度和相对湿度下采集的结晶形式衍射图。

游离碱结晶固体

因此，实施例1的游离碱结晶固体的制备样品的特征在于使用CuKa辐射具有如下表1中所述的衍射峰(2-θ值)的XRD图，且具体而言其在16.0下具有峰以及一个或多个选自6.9、7.0、18.2和23.2的峰；衍射角的公差为0.2度。

表1：实施例1的游离碱结晶固体的X射线粉末衍射峰：

通常已知，差溶解性化合物的生物利用度可通过将其在聚合物基质中配制为固体分散物得以增强。此类固体分散物是药物在惰性载体基质中的分散物，其通过熔融(融合)药物-聚合物混合物、随后通过快速冷却(例如使用方法诸如热熔融挤出)固化均相熔融混合物、或通过将药物和聚合物溶解于适当有机溶剂中、随后通过蒸发(例如喷雾干燥)或通过使用反溶剂沉淀去除溶剂来制备。固体分散物通常使得药物呈非晶形式，其产生更快溶出速率和/或更高过饱和度(水平)和持续时间，从而导致溶解性差的化合物相对于未分散结晶药物具有增强的口服生物利用度。已成功用于固体分散物的聚合物包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯(PVP-VA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯(HPMCAS)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP-55)、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯(CAP)和Eudragit® EPO。

固体分散物的物理和化学稳定性是此类制剂的适用性中的因素。药物载量是可影响药物的亚稳定非晶形式以及其体内性能的物理稳定性的另一个变量。在人中施用固体分散物的优选方式是通过添加药学上可接受的载体和任选地适于此类剂型制备和性能的其它赋形剂将其进一步配制为胶囊、片剂或其它固体口服剂型。可通过将粉末或粒化掺合物填充至胶囊中、作为合适媒介物中的悬浮液或任何其它合适口服药物剂型(诸如(但不限于)，片剂、药囊、颗粒、喷洒剂等)给药固体分散物。

由于实施例1因其差溶解性导致的低生物利用度，所以期望能够使制剂在狗和大鼠小动物研究中和针对临床测试实现目标暴露。中性聚合物PVP-VA(Kollidon® VA 64)产生如下固体分散物：在加速稳定性测试(40℃；相对湿度75%，经1个月期间，以及在长期储存(对于20%药物载量为11个月且对于40%药物载量为10个月))下在环境条件下化学且物理都稳定。

组合物实施例1：含有实施例1:PVP-VA(20:80)的20%固体分散物

使用结晶实施例1制备固体分散物。聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯(PVP-VA)是以Kollidon® VA 64商标名从BASF CORPORATION商购。溶剂是1:1二氯甲烷和甲醇，其通过混合等体积的二氯甲烷(Fisher Scientific)与甲醇(OmniSolv)来制备。月桂基硫酸钠(Fisher Scientific)是商售的。

程序：分两个子批次制备并喷雾干燥固体分散物。对于第一子批次，向2000 mL瓶中添加实施例1(22.22g)。添加1180 mL溶剂(二氯甲烷:甲醇，1:1)并将样品浴超声波处理约20分钟直至所有化合物都溶解，从而产生19 mg/mL的理论浓度。向该溶液中添加88.86 g PVP-VA并通过混合溶解直至获得均相溶液。使用微喷雾干燥器(Buchi Mini Spray Dryer 290)喷雾干燥二氯甲烷:甲醇(1:1)中实施例1和PVP-VA(20:80)的溶液。溶液流速是9-12 ml/min，入口温度设定为100℃-110℃，从而产生37℃-55℃的出口温度。对于第二子批次，向2000 mL瓶中添加实施例1(34.62 g)。添加1820 mL溶剂(二氯甲烷:甲醇，1:1)并将样品浴超声波处理约20分钟直至所有化合物都溶解，从而产生19 mg/mL的理论浓度。向该溶液中添加138.48 g PVP-VA并通过混合溶解直至获得均相溶液。使用微喷雾干燥器(Buchi Mini Spray Dryer 290)喷雾干燥二氯甲烷:甲醇(1:1)中实施例1和PVP-VA(20:80)的溶液。溶液流速是14-15 ml/min，入口温度设定为100℃-110℃，从而产生62℃-70℃的出口温度。混合从两个子批次收集的喷雾干燥材料并在40℃-60℃之间在真空炉中进一步干燥过夜，且随后在真空下在室温下再储存一天。

向236.28 g含有实施例1:PVP-VA(20:80)的固体分散物中添加4.278 g月桂基硫酸钠并使用刮勺使其在大结晶盘中彻底掺和，以给出含有98%固体分散物加上2%月桂基硫酸钠的最终组合物。

该制剂可通过将掺和粉末填充至胶囊中、或通过悬浮于，例如，1%羟基乙基纤维素/0.25%聚山梨醇酯80/0.05% Dow Corning消泡剂1510-US的媒介物中作为悬浮液来给药。

组合物实施例2:含有实施例1:PVP-VA(40:60)的40%固体分散物

结晶实施例1、聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯(PVP-VA)、溶剂和月桂基硫酸钠如对于组合物实施例1所述。

程序：通过实质上如对于组合物实施例1所述的喷雾干燥方法使用3.79 g实施例1、适当体积的溶剂(二氯甲烷:甲醇，1:1)以获得20 mg/mL浓缩溶液来制备固体分散物。向该溶液中添加5.68 g PVP-VA并通过混合溶解直至获得均相溶液。基本上如对于组合物实施例1所述喷雾干燥溶液。溶液流速设定为使用2mm硅酮管为40%，入口温度设定为80℃，从而产生34℃的出口温度。收集喷雾干燥材料并在缓慢氮进料且存在干燥剂的情况下在室温下在真空炉中进一步干燥14小时。

向6.64g含有实施例1:PVP-VA(40:60)的固体分散物中添加0.0665g月桂基硫酸钠并使用刮勺使其在罐中彻底掺和，从而产生含有比率为99:1的固体分散物和月桂基硫酸钠的最终组合物。

癌症正越来越多地被视为起始和进展受一种或多种基因的异常功能诱导的疾病的异源集合，所述基因在细胞和组织微环境中调节DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、附着、血管发生、侵袭和转移。“癌症”基因的变体或异常功能可由天然存在的DNA多态性、基因组拷贝数变化(通过扩增、缺失、染色体损失或复制)、基因和染色体结构变化(通过染色体易位、侵袭或导致失调基因表达的其它重排)和点突变而产生。癌性肿瘤可由一种异常基因功能诱导，且由相同异常基因功能维持，或由其它异常基因功能维持和进展加重。

除上文提及的遗传染色体畸变外，每种癌症还可包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化、基因组印记和通过乙酰化、甲基化或磷酸化的组蛋白修饰。表观遗传修饰可在恶性肿瘤的诱导和/或维持中起作用。

人癌症中的细胞遗传畸变的广泛类别已经被编译且维持并定期在线更新(参见The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) 网址: http://cgap.nci.nih.gov)。数据库包括至少一些本发明恶性肿瘤的染色体畸变。The Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project维持已经因果关系地与肿瘤发生相关联的所有人基因的详细在线“Cancer Gene Census”(参见http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census)以及人癌症中的体细胞突变的COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库(参见http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic)。含有关于因果关系地与各种癌症相关联的细胞生成变化的丰富信息的进一步来源是Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (http://atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste.html#MDS)。这些数据库还包括至少一些本发明恶性肿瘤的染色体畸变。

已知且通常使用通过活检的癌性恶性肿瘤的诊断、免疫表型分型和其它测试。除高分辨率染色体显带和先进染色体成像技术外，还可以通过细胞生成分析(诸如荧光原位杂交(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、多重FISH(M-FISH)、比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNP芯片)和本领域技术人员已知且使用的其它诊断和分析测试)测定在癌症怀疑情形下的染色体畸变。

Ras/Raf/MEK/MAPK信号传导途径将细胞外剌激传递至核，由此调节多种细胞反应(包括细胞增殖、分化和细胞凋亡)。这些过程由异常MAPK信号传导的干扰(诸如遗传改变)经常导致恶性转化。通过在多种人恶性肿瘤中活化该途径的许多突变体等位基因的发现，此信号传导途径在肿瘤中的重要性是明显的。受体酪氨酸激酶(RTK)(诸如EGFR和cMet)的致癌突变或RTK和其配体的过表达异常地活化Ras和其下游组分。已在约30%人癌症中检测到活化Ras突变。这些突变显著减少GTPase活性，由此使得Ras呈GTP结合且活性状态。在哺乳动物中，Ras家族由三种基因组成：K-Ras、N-Ras和H-Ras。K-Ras经常在上皮癌(诸如胰腺癌、肺癌和结肠直肠癌)中突变，而N-Ras突变经常发生于黑色素瘤、肝和髓样(AML、CML)恶性肿瘤中。B-Raf(Raf家族的成员)的活化突变以高频率在黑色素瘤和甲状腺癌中且以较小程度在结肠直肠癌、卵巢癌和肺癌中发现。已在黑色素瘤患者中鉴定出MEK1和MEK2的体细胞突变。最后，负调节剂(诸如Sprouty家族和GAP(GTPase活化蛋白)的成员，诸如NF1)的损失可间接活化该途径。据信许多肿瘤呈现Ras/Raf/MEK/MAPK途径的失调，这使其成为治疗干预的有吸引力的靶标。

Raf蛋白由三个成员A-Raf、B-Raf和C-Raf(也称作Rafl)组成，所述成员在将信号从Ras转导至下游组分MEK1/2和ERK1/ERK2中起重要作用。已显示Raf蛋白激酶在肿瘤发生(包括肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和血管发生)中起作用，Sebolt-Leopold等人，Nat Rev Cancer, 2004, 4: 937-947; Wellbrock等人, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 875-885。肿瘤细胞中通过多种机制(诸如RTK的突变或过表达和Ras突变)的MAPK途径活化均通过Raf蛋白。更重要的是，经常在几种恶性肿瘤(包括黑色素瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺癌)中观察到B-RAF的活化突变(Davies等人，Nature, 2002, 417: 949-954)。几乎90% B-Raf突变是外显子15中的T1799A变化，其结果是Val至Glu氨基酸取代(B-Raf V600E)。B-Raf的这种突变产生比野生型蛋白大约500倍的组成型激酶活性且导致恶性转化。其它突变(诸如T529I(即苏氨酸至异亮氨酸B-Raf持家基因(gatekeeper)突变)和G468A(外显子11中G1403C处的B-Raf次级突变))也是已知的且据信在引起、维持或加剧恶性转化中起作用，Whittaker等人, Sci. Transl. Med., 2010, 2(35) ra41; Wan等人, Cell, 2004, 116: 855-867。

最近，B-Raf特异性激酶抑制剂威罗菲尼(也称作PLX-4032)由美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration(FDA))批准用于治疗具有B-Raf V600E突变的黑色素瘤患者。威罗菲尼在这些患者中是有效的且提供存活益处。然而，对该药物有反应的患者通常发展药物抗性，其导致在平均7个月内疾病复发。类似于许多其它靶向治疗，对B-RAF抑制的获得性抗性对在该患者群体中的长期存活益处提出治疗挑战。

为了改善B-Raf抑制剂的益处，继续研究以鉴定使得表达突变B-RAF的黑色素瘤细胞对威罗菲尼具有抗性的机制。最近研究已指示，MAPK途径的重新活化是对B-RAF抑制的抗性的机制。抗性机制主要涉及ERK信号传导通过旁路机制的重新活化，所述机制是Ras/RAF依赖性的(诸如N-Ras活化，Nazarian等人，Nature. 2010, 468: 973-7)，H-Ras活化(Su等人，New England Journal of Medicine. 2012, 366: 207-215)或C-RAF上调(Johannessen等人, Nature. 2010, 468: 968-72; Montagut等人, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61)，B-RAF V600E的异常剪接变体((Poulikakos等人, Nature. 2011, 480: 387–390)，或Ras/RAF不依赖性的(Tpl2/COT过表达)(Johannessen等人, Nature. 2010, 468: 968-72)。因此，多重机制可减弱B-RAF突变癌症中B-RAF抑制对MAPK信号传导的效应。尽管在临床上尚未鉴定可引起对BRAF抑制的抗性的B-RAF的持家基因(gatekeeper)突变(T529I)，但已在实验上证实该突变可引起抗性，Whittaker等人，Sci Transl Med. 2010, 2(35): ra41。最近研究也已表明，由RTK(诸如IGF-1R或PDGFRβ)活化MAPK-冗余信号传导途径可在对B-RAF抑制的获得性抗性中起作用；Nazarian等人, Nature. 2010, 468: 973-7; Villanueva等人, Cancer Cell. 2010, 18: 683-95; Shi等人, Cancer Res. 2011, 71: 5067-74。显然，MAPK重新活化参与这些抗性机制中的许多机制。预计泛Raf抑制剂阻断MAPK重新活化。

另外，证实B-Raf特异性抑制剂(包括威罗菲尼和其接近类似物N-[3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺 (PLX4720；商售选择性B-Raf抑制剂))在B-Raf野生型背景下通过与其它Raf同工型异构体的二聚化诱导反常途径活化，Hatzivassiliou G, 等人 Nature,2010, 464: 431-435; Poulikakos 等人, Nature, 2010, 464: 427-430; Heidorn, 等人, Cell, 2010, 140: 209-221。据信威罗菲尼通过结合B-Raf野生型并剌激B-Raf-C-Raf二聚化活化Raf/MEK/ERK途径。据信通过B-Raf特异性抑制的这种反常途径活化是用威罗菲尼治疗的一些黑色素瘤患者中的皮肤副作用(诸如鳞状细胞癌)的主要原因。威罗菲尼因由于其在B-Raf野生型遗传背景中的反常途径活化活性而未批准用于治疗具有该遗传背景的癌症患者。

所测试的示例性化合物是抑制Raf蛋白的所有同工型异构体(包括A-Raf、B-Raf、C-Raf和B-Raf V600E突变)的Raf激酶抑制剂。所测试的示例性化合物因其泛Raf活性而有效抵抗通过上游信号传导(诸如N-Ras突变和K-Ras突变，二者均具有B-Raf野生型遗传背景)而MAPK途径活化的肿瘤细胞。因此，所测试的示例性化合物具有治疗具有以下的癌症患者的潜能：B-Raf突变(诸如黑色素瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺癌)、N-Ras突变、B-Raf野生型(诸如黑色素瘤、AML、CML、ALL、CLL、肝癌)(Schubbert等人，Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta 等人, Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761)；或K-Ras突变、B-Raf野生型(诸如胆管、子宫颈、结肠直肠、子宫内膜、肺、卵巢、胰腺和肝；Schubbert等人, Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta 等人, Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761)或其它Raf活化机制(包括上游活化RTK突变/过表达)。所测试的示例性化合物还有效抵抗黑色素瘤肿瘤细胞，所述细胞对威罗菲尼形成抗性。因此，据信所测试的示例性化合物将对于威罗菲尼或其它B-Raf抑制剂失效的黑色素瘤患者有效。

所测试的示例性化合物也是c-Kit的抑制剂。C-Kit是通常控制原发造血细胞、黑色素细胞和生殖细胞的功能的受体酪氨酸激酶。c-Kit在与其配体干细胞因子(SCF)结合后，经历二聚化/寡聚化和自体磷酸化。c-Kit中组成型活化c-Kit的遗传突变(诸如L576P、K642E、T670I和V654A)可导致黑色素瘤、急性髓性白血病和胃肠道间质瘤(GIST)，因此，所测试的示例性化合物具有治疗黑色素瘤、急性髓性白血病和GIST患者的潜能，Lennartsson等人，Current Cancer Drug Targets, 2006, 6: 65。

示例性化合物可作为单一药剂或与一种或多种其它批准药物组合用于治疗癌症患者。这些癌症患者包括：具有B-Raf V600E突变的黑色素瘤患者、威罗菲尼或其它B-Raf抑制剂失效的黑色素瘤患者、具有N-Ras突变B-Raf野生型的黑色素瘤患者、具有c-Kit过表达或cKit突变的黑色素瘤患者；具有B-Raf V600E突变或K-Ras突变B-Raf野生型的结肠直肠癌患者；具有B-Raf V600E突变或K-Ras突变B-Raf野生型的卵巢癌患者；具有B-Raf V600E突变或K-Ras突变B-Raf野生型的肺癌患者；具有N-Ras突变B-Raf野生型、或c-Kit过表达或c-Kit突变的髓样白血病患者；具有N-Ras或K-Ras突变B-Raf野生型的肝癌患者；具有K-Ras突变B-Raf野生型的胰腺癌患者；具有B-Raf V600E或N-Ras突变B-Raf野生型的甲状腺癌患者；具有K-Ras突变B-Raf野生型的胆管癌患者；具有c-Kit突变或过表达的GIST患者。

以下体外和体内研究证实示例性化合物的Ras/Raf/MEK/ERK途径信号传导抑制活性。这些测定通常由本领域技术人员鉴定为指示人临床化学治疗活性。可基本上如下或通过提供类似数据的类似测定实施证明泛Raf抑制和途径信号传导抑制活性的测定。除非另外指明，否则报告的IC₅₀值是绝对值。

B-Raf、C-Raf和B-Raf突变的激酶活性的酶分析

评价测试化合物针对人野生型B-Raf、人野生型C-Raf、人B-Raf V600E、人B-Raf V600E+T529I或人B-Raf V600E+G468A的抑制活性。T529I是苏氨酸至异亮氨酸B-Raf持家基因(gatekeeper)突变且G468A是外显子11中G1403C处的B-Raf次级突变。B-Raf、C-Raf和B-Raf突变的酶测定评价Raf和MEK1复合物的性质，所述复合物在ATP存在下催化增强的ATP水解(Rominger, 等人, Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137；美国专利公开号2006/0211073)。通过NADH氧化形式的众所周知偶联的PK/LDH(丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶)系统监测形成的ADP，这可以分光光度法通过340 nm下的吸光度(A340；关于方法的原理，参见Schindler等人, Science,2000, 289: 1938-1942)监测并检测。Raf活化的MEK1 ATPase活性是所有形式的Raf蛋白共享的性质。

Raf蛋白的表达和纯化

通常，细胞系是使用商售材料通过本领域技术人员已知且通常使用的程序生成的。编码全长B-Raf野生型DNA(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)，参照序列NC_000007.13)、C-Raf(国家生物技术信息中心(NCBI)，参照序列NC_000003.11)和A-Raf(国家生物技术信息中心(NCBI)，参照序列NC_000023.10)的核苷酸序列是已知的。还参见，例如，关于B-Raf：S. Ikawa, 等人, “B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement,” Mol Cell Biol, 8(6):2651-4 (1988); 关于C-Raf: M. Fukui, 等人, “Molecular cloning和characterization of an activated human c-raf-1 gene,” Mol Cell Biol, 7(5):1776-81 (1987); Bonner, 等人, “The complete coding sequence of the human raf oncogene and the corresponding structure of the c-raf-1 gene,” Nucleic Acids Res., 14 (2), 1009-1015 (1986); 关于MEK1: C.F. Zheng, 等人, “Cloning and characterization of two distinct human extracellular signal-regulated kinase activator kinases, MEK1和MEK2,” J. Biol. Chem., 268 (15), 11435-11439 (1993); 关于tag信息: J. Tsai, 等人, “Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105(8), 3041-3046 (2008); G. Hatzivassiliou, 等人, “RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway和enhance growth,” Nature, 464 (7287), 431-435 (2010)。

含有N末端纯化标签的B-Raf V600E(含有V600E突变的残基433-726)基本上如前文所述表达并纯化(Wan等人, Cell, 2004, 116, 855–867)。

通过基本bRaf(433-726,V600E)构建体的定点诱变(Quikchange，Strategene)产生含有次级T529I突变或G468A突变的B-Raf V600E构建体。

本文所用序列包括：无N末端纯化标签的B-RafV600E(含有V600E突变的残基433-726)；无N末端纯化标签的B-RafV600E(含有V600E和T529I突变的残基433-726)；无N末端纯化标签的B-RafV600E(含有V600E和G468A突变的残基433-726)；BRAF-V600E；BRAF-V600E+T529I；BRAF-V600E+G468A；BRAF-野生型，全长；C-RAF；用于筛选的MEK1蛋白序列。

测量Raf激酶活性的酶测定

评价测试化合物针对野生型B-Raf、野生型C-Raf、B-Raf V600E、B-Raf V600E+T529I和B-Raf V600E+G468A的抑制活性。T529I是B-Raf持家基因(gatekeeper)突变且G468A是B-Raf次级突变。B-Raf、C-Raf和B-Raf突变的酶测定评价Raf和MEK1复合物的性质，该复合物在ATP存在下催化增强的ATP水解(Rominger等人，Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137)。通过NADH氧化形式的众所周知偶联的PK/LDH(丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶)系统监测形成的ADP，这可通过340nm下的吸光度(A340；关于方法的原理，参见Schindler等人，Science,2000, 289: 1938-1942)监测并检测。Raf活化的MEK1 ATPase活性是由所有形式的Raf蛋白共享的性质。在B-Raf野生型酶测定中，反应混合物含有1.2 nM B-Raf、30 nM MEK1、1000μM ATP、3.5单位(每100μl) PK、5单位(每100μl) LDH、1mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和280μM NADH。在C-Raf测定中，反应混合物含有0.6 nM C-Raf、26 nM MEK1、2000 μM ATP和相同量的上述PK、LDH、PEP和NADH。在B-Raf V600E测定中，反应混合物含有1.6 μM B-Raf V600E、26 nM MEK1、200 μM ATP和相同量的上述PK、LDH、PEP和NADH。在B-RafV600E+T529I测定中，反应混合物含有6.2 nM B-RafV 600E+T529I、30 nM MEKl、200 μM ATP和相同量的上述PK、LDH、PEP和NADH。在B-Raf V600E+G468A测定中，反应混合物含有3.5 nM B-Raf、30 nM MEKl、200 μM ATP和相同量的上述PK、LDH、PEP和NADH。通过混合上述混合物与测试化合物并在A340下连续监测约5小时来开始所有测定。收集3至4小时时限时的反应数据以计算IC50值。

对于实施例1，B-Raf V600E的酶IC₅₀结果是6 nM且对于C-Raf是15 nM。这些数据证明，在这些测定中，示例性化合物抑制B-Raf V600E和C-Raf。

在通过基本上类似于上述方法的方法实施的其它酶测定中评价实施例1。实施例1分别以9.8、15.47和16.9nM的IC₅₀值抑制野生型B-Raf、B-Raf V600E+T529I和B-Raf V600E+G468A。这些数据证明，在这些测定中，实施例1是B-Raf抑制剂。

c-Kit激酶活性的酶测定

c-Kit是重要的癌基因，且其过表达和遗传突变经常发生在黑色素瘤和胃肠道间质瘤(GIST)患者中。在c-Kit酶测定中，以分光光度法监测聚E4Y被由人c-Kit催化的ATP的磷酸化。使从激酶反应产生的ADP与丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)反应偶联，其中NAD是从丙酮酸和NADH形成的。NADH可通过340nm下的吸光度监测，如上文针对B-Raf、C-Raf和B-Raf突变的激酶活性的酶测定所述。

c-Kit野生型受体的表达和纯化

通常，细胞系是使用商售材料通过本领域技术人员已知且通常使用的程序产生的。

编码全长人野生型c-Kit受体DNA(国家生物技术信息中心(NCBI)参照序列NC_000004.11)的核苷酸序列是已知的。还参见，例如，关于人cKit蛋白序列：Y. Yarden,Y., 等人, “Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand ,” EMBO J. 6 (11), 3341-3351 (1987); 关于GST融合蛋白：D.B. Smith, 等人, “Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase,” Gene 67 (1988) 31–40; D.B. Smith, “Purification of glutathione S-transferase fusion proteins,” Methods Mol. Cell Biol. 4 (1993) 220–229。

c-Kit测定

测定反应混合物包括6 nM人野生型c-KIT、1 mg/mL多(Glu, Tyr)(Sigma)、1 mM磷酸烯醇丙酮酸、280 μM NADH、5U/3.5U(每100μl)丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶、85 mM Tris (pH 7.5)、17 mM MgCl₂、0.0042% Triton®X-100、0.005% BSA、1%DMSO。将测试化合物与反应混合物一起孵育0.5小时，然后在30℃下添加200μM ATP以开始反应。使用0.5h至1h时的反应速率以计算抑制％和IC₅₀。

本文所用序列包括具有N末端GST融合的c-KIT。

对于实施例1，人c-Kit抑制IC₅₀结果是21nM。该数据证明，在该测定中，所测试的示例性化合物是人野生型c-Kit抑制剂。

为了进一步评价测试化合物，针对黑色素瘤和/或GIST中通常出现的c-Kit突变对其进行测试。将Ba/F3细胞系(来自ATCC)分别用野生型(WT)c-Kit，c-Kit L576P (Willmore-Payne等人, Human Pathology, 2005, 36(5), 486; Willmore-Payne等人, Human Pathology, 2006, 37, 520)，c-Kit K642E (Willmore等人, Am J Clin Pathol, 2004, 122(2), 206; Monsel等人, Oncogene, 2010, 29, 227)，c-Kit T670I (Tamborini等人, Oncogene, 2006, 25,6140)，或c-Kit V654A (Tamborini 等人, Oncogene, 2006, 25,6140)转染，其通过本领域技术人员众所周知且使用的逆转录病毒转染方法确立。突变通过聚合酶链式反应(PCR)诱变产生且通过PCR扩增c-Kit表达构建体的自动测序来确认。通过用质粒DNA转染产生Ba/F3稳定细胞系。通过Western印记分析确认适当c-Kit突变体的表达。

野生型Ba/F3细胞通常依赖于IL-3进行生长。在c-Kit转染后，这些细胞在干细胞因子(SCF)(c-Kit的配体)存在下在Ba/F3 ATCC推荐的生长培养基中生长。在IL-3或SCF存在下测试测试化合物针对这些细胞的抗增殖活性。

表2：实施例1在Ba/F3c-Kit细胞系中的抗增殖活性

表2中的数据证明，实施例1具有针对Ba/F3细胞中的野生型c-Kit和鉴定的c-Kit遗传突变的细胞增殖和存活力抑制活性。

利用天然全酶使用ActivX Biosciences Inc.的KiNativ测定的Raf激酶活性测量

为了进一步评价测试化合物的酶泛Raf活性，在由ActivX Biosciences Inc.研发并实施的KiNativ测定中使用A375细胞的全细胞裂解物对其进行评价。A375细胞是具有B-Raf V600E突变、A-Raf野生型和C-Raf野生型的人黑色素瘤细胞。

样品制备：通过在商售裂解缓冲液中超声波处理使来自ATCC的A375(B-Raf V600E)细胞裂解，通过离心去除细胞碎片，并将所得上清液凝胶过滤至含有20mM MnCl₂的商售激酶反应缓冲液中。裂解物的最终蛋白浓度是10 mg/mL。将5μL每种测试化合物从DMSO中的100 μM、10 μM、1 μM或0.1 μM储存溶液添加至500 μL裂解物中，一式两份，最终浓度为1 μM、0.1 μM、0.01 μM和0.001 μM。向500μL裂解物中添加5μL DMSO，一式四份，用于对照。在15分钟孵育后，向每份样品中添加脱硫生物素-ATP酰基磷酸酯探针至5μM的最终浓度，并与样品一起孵育10分钟。在探针反应后，制备样品以使用ActivX标准方案进行靶向质谱分析。简而言之，制备样品进行胰蛋白酶消化(变性、还原烷基化物)，利用胰蛋白酶消化，且在链霉抗生物素树脂上富集脱硫生物素化肽。

数据采集：通过LC-MS/MS在Thermo-LTQ Velos离子阱质谱仪上针对A375 V600E细胞使用ActivX数据采集方法分析富集肽样品。

数据分析：通过从靶向MS/MS谱减去特征性片段离子信号并比较对照和经处理样品中的信号进行所有定量。根据需要基于数据标记/过滤量度进行的人工验证/目视检查使用ActivX软件。目视验证所有抑制数据点，如同显示正常限值外的可变性的所有数据点一样。根据下式测定显示>35%抑制的数据点的显著性：|平均对照峰面积-平均经处理峰面积|/(2*StdDev(对照峰面积)+|经处理重复一个峰面积-经处理重复两个峰面积| >0.8。使用IGOR®软件测定IC₅₀值。

表3. 实施例1在ActivX KiNativ A375全细胞裂解物测定中的泛Raf活性

如表3中所示，实施例1分别以44 nM、31-47 nM和42 nM的IC₅₀值抑制A-Raf、B-Raf V600E和C-Raf。这些数据证明，在全细胞裂解物测定中实施例1抑制A-Raf、C-Raf和B-Raf V600E。

实施例1抑制细胞含磷-ERK活性

为了研究实施例1的体外生物化学活性是否转变成细胞活性，使用实施例1来处理黑色素瘤细胞、A375 V600E和WM-266-4 V600E、A375 V600E-PLX4032抗性细胞(A375-res；下述生成)和HCT-116(K-Ras突变B-Raf野生型)细胞、具有K-Ras突变的结肠肿瘤细胞。A375 V600E、WM-266-4 V600E、HCT-116 K-Ras突变B-Raf野生型来自ATCC。通过从TGR Biosciences商购的ELISA测定评估细胞活性以测量每种细胞类型的含磷-ERK水平。

使A375 V600E、A375 V600E-PLX4032抗性细胞、WM-266-4 V600E或HCT-116(K-Ras突变B-Raf野生型)细胞在来自PerkinElmer的96孔板中的生长培养基(下文针对CellTiterGlo测定所述)中生长过夜，随后用实施例1以0.17 nM至10000 nM范围内的0和11个不同连续稀释浓度处理1小时。随后用50 μL来自TGR Biosciences的裂解缓冲液使每个孔中的细胞裂解。利用来自TGR Biosciences的SureFire含磷-ERK AlphaScreen测定试剂盒根据制造商说明书测定含磷-ERK活性。

实施例1在所有测试细胞系中以剂量依赖性方式抑制含磷-ERK水平。A375 V600E、WM-266-4 V600E、A375 V600E-res和HCT-116(K-Ras突变B-Raf野生型)细胞的IC₅₀值分别为3 nM、4.9 nM、9.7 nM和132.8 nM。这些数据证明，在该测定中，实施例1由于Raf抑制而抑制A375 V600E、WM-266-4 V600E、A375 V600E-res和HCT-116 K-Ras-突变B-Raf野生型细胞中的下游信号传导。

CellTiter-Blue细胞增殖和存活力测定

A375 细胞增殖测定

A375细胞(目录号CRL-1619)从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)获得。简而言之，使细胞在37℃、5%CO₂和95%湿度下在补充有10%表征的胎牛血清(Invitrogen, Carlsbad, CA)和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖中生长。使细胞扩增直至达到70-95%汇合度，此时将其亚培养或收获用于测定使用。一式三份地将测试化合物的连续稀释物分配于384孔黑色透明底板中。在384孔板中的50μL完全生长培养基中每孔添加625个细胞。将板在37℃、5% CO₂和95%湿度下孵育67小时。在孵育期间结束时，向板的每个孔中添加10 μL PBS中刃天青(resazurin)(Sigma, St.Louis, MO)的440 μM溶液，并将板在37℃、5% CO₂和95%湿度下再孵育5小时。在Synergy2读数器(Biotek, Winooski, VT)上使用540 nm的激发和600 nm的发射对板进行读数。使用Prism软件(Graphpad, SanDiego, CA)分析数据以计算IC50值。

Colo-205细胞增殖分析

Colo205细胞(目录号HB-8307)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas,VA)获得。简而言之，使细胞于37℃、5%CO2和95%湿度下在补充有10%表征的胎牛血清(Invitrogen， Carlsbad，CA)、1mM丙酮酸钠和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI 1640中生长。使细胞扩增直至达到30-60%汇合度，此时将其亚培养或收获用于测定使用。一式三份地将测试化合物的连续稀释物分配于384孔黑色透明底板中。在384孔板中的50μL完全生长培养基中每孔添加1250个细胞。将板在37℃、5% CO2和95%湿度下孵育67小时。在孵育期间结束时，向板的每个孔中添加10μL PBS中刃天青(Sigma, St.Louis, MO)的440μM溶液，并将板于37℃、5% CO₂和95%湿度下再孵育5小时。在Synergy2读数器(Biotek, Winooski, VT)上使用540nm的激发和600nm的发射对板进行读数。使用Prism软件(Graphpad, SanDiego, CA)分析数据以计算IC₅₀值。

HT-29细胞增殖分析

HT-29细胞(目录号HTB-38)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。简而言之，使细胞于37℃、5% CO₂和95%湿度下在补充有10%表征的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的McCoy’s 5A中生长。使细胞扩增直至达到75-90%汇合度，此时将其亚培养或收获用于测定使用。一式三份地将测试化合物的连续稀释物分配于384孔黑色透明底板中。在384孔板中的50μL完全生长培养基中每孔添加1250个细胞。将板在37℃、5%CO₂和95%湿度下孵育67小时。在孵育期间结束时，向板的每个孔中添加10μL PBS中刃天青(Sigma, St.Louis, MO) 的440μM溶液，并将板于37℃、5%CO₂和95%湿度下再孵育5小时。在Synergy2读数器(Biotek，Winooski，VT)上使用540nm的激发和600nm的发射对板进行读数。使用Prism软件(Graphpad，SanDiego，CA)分析数据以计算IC₅₀值。

HCT-116细胞增殖分析

HCT-116细胞(目录号CCL-247)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。简而言之，使细胞于37℃、5%CO₂和95%湿度下在补充有10%表征的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的McCoy’s 5A中生长。使细胞扩增直至达到75-90%汇合度，此时将其亚培养或收获用于测定使用。一式三份地将测试化合物的连续稀释物分配于384孔黑色透明底板中。在384孔板中的50μL完全生长培养基中每孔添加625个细胞。将板在37℃、5%CO₂和95%湿度下孵育67小时。在孵育期间结束时，向板的每个孔中添加10μL PBS中刃天青(Sigma，St.Louis，MO) 的440μM溶液，并将板于37℃、5%CO₂和95%湿度下再孵育5小时。在Synergy2读数器(Biotek，Winooski，VT)上使用540nm的激发和600nm的发射对板进行读数。使用Prism软件(Graphpad，SanDiego，CA)分析数据以计算IC50值。

SK-Mel-2细胞增殖分析

Sk-Mel-2细胞(目录号HTB-68)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。简而言之，使细胞于37℃、5%CO₂和95%湿度下在补充有10%表征的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的MEM中生长。使细胞扩增直至达到70-95%汇合度，此时将其亚培养或收获用于测定使用。一式三份地将测试化合物的连续稀释物分配于384孔黑色透明底板中。在384孔板中的50μL完全生长培养基中每孔添加1250个细胞。将板在37℃、5%CO₂和95%湿度下孵育67小时。在孵育期间结束时，向板的每个孔中添加10μL PBS中刃天青(Sigma，St.Louis， MO)的440μM溶液，并将板于37℃、5%CO₂和95%湿度下再孵育5小时。在Synergy2读数器(Biotek，Winooski，VT)上使用540nm的激发和600nm的发射对板进行读数。使用Prism软件(Graphpad，SanDiego，CA)分析数据以计算IC₅₀值。

A375、HT-29和Colo-205细胞(ATCC)具有V600E突变。HCT-116细胞(ATCC)具有K-Ras突变B-Raf野生型，且SK-Mel-2细胞(ATCC)具有N-Ras突变B-Raf野生型。

表4细胞增殖和存活力抑制

表4中的数据证明，在该测定中，示例性化合物抑制具有所鉴定突变的指定细胞的增殖和存活力。

增殖和存活力抑制活性

在CellTiter-Glo测定中在多组人肿瘤细胞系中测试实施例1的增殖和存活力抑制活性。

通常，对于CellTiter-Glo测定(Promega)，在补充有10%胎牛血清(FBS，Invitrogen)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM, Thermo Scientific)中培养细胞。在处理之前一天将维持于生长培养基中的细胞(5 X l0³)平铺于96孔板(BD Biosciences)中的多-D-赖氨酸包被的孔中。将细胞处理48-72小时，且随后使用CellTiter-Glo发光细胞存活力测定根据制造商的说明书(Promega)和SpectraMax板读数器(Molecular Devices)分析增殖和存活力。使用非线性回归和S形剂量反应曲线以利用GraphPad Prism 4软件计算半数最大抑制浓度(IC₅₀)。

测试其它N-RAS突变B-Raf野生型血液癌细胞系对实施例1的敏感性。N-Ras活化突变在血液癌中常见，以10-30%的频率出现。测试两种B-Raf V600E突变黑色素瘤细胞系(A-375和SK-Mel-28)、九种N-Ras突变血液细胞系(HL-60、THP-1、TALL-1、C8166、H9、IM-9、GA-10 clone 4、P31-FUJ、MOLT-4)和七种N-Ras野生型细胞系(LOUCY、HEL、U266、EB2、P30-OHK、NOMO-1、CCRF-CEM)，并报告IC₅₀数据。尽管这些细胞系中存在一定范围的敏感性，但9种具有N-Ras突变B-Raf野生型的血液癌细胞系中的7种对亚微摩尔浓度的实施例1敏感(IC₅₀<1μM)。

表5实施例1的增殖和存活力抑制活性(以nM表示)

上述数据证明，A375黑色素瘤细胞对实施例1敏感。在该筛选中的大多数敏感细胞系中是HepG2和THP-1细胞。HepG2衍生自肝细胞癌，THP-1是AML细胞系，且二者均携带活化N-RAS突变B-Raf野生型。该数据证明该测定中泛Raf抑制活性和实施例1的对上游信号传导活化的干预。

实施例1抑制具有K-Ras突变的HCT-116细胞的细胞生长：

K-Ras突变B-Raf野生型是许多癌症类型(包括胰腺癌、肺癌和结肠直肠癌)中的最常见且最重要的突变之一(Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682)。K-Ras突变导致Ras/Raf/MEK/MAPK级联活化，该级联促使细胞转换和恶性肿瘤。为了评估实施例1在K-Ras突变B-Raf野生型细胞中的抗增殖活性，在CellTiter-Glo细胞增殖和存活力测定中使用具有K-Ras突变B-Raf野生型的结肠肿瘤HCT-116细胞(ATCC)。实施例1以剂量依赖性方式以178nM的IC₅₀抑制HCT-116K-Ras突变B-Raf野生型增殖和存活力。这些数据证明，在该测定中，实施例1的Raf抑制活性干预不当活化的上游信号传导。

实施例1抑制具有N-Ras突变的肿瘤细胞的细胞生长：

N-Ras经常在黑色素瘤、急性髓样白血病(AML)和肝癌中突变(Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682)。N-Ras突变B-Raf野生型通过Raf蛋白、尤其C-Raf导致MAPK活化。在针对细胞增殖和存活力抑制的CellTite-rGlo测定中测试实施例1在N-Ras突变B-Raf野生型肿瘤细胞、具有N-Ras突变Q61R和B-Raf野生型的人黑色素瘤细胞系SK-Mel-2(ATCC)中的抗增殖活性并进行Western印记分析。

免疫印记(Western印记)分析

以0和11个0.17 nM至10000 nM范围内的连续稀释物的剂量实施测试。通过用来自Millipore的RIPA裂解缓冲液处理细胞生成蛋白裂解物。基本上如Yadav等人，Molecular Carcinogenesis, 2011, 50: 346-52中所述进行Western印记分析。简而言之，在含有20 μg总蛋白的细胞裂解物上使用4-20% Novex®三-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)进行SDS-PAGE。在100V、4℃下使用NuPAGE®转移缓冲液(Invitrogen)和10%甲醇将蛋白转移至0.45 μM硝基纤维素膜上并持续1小时。通常，以1:1000稀释度使用一级抗体，且以1:20000稀释度使用二级抗体。使用Odyssey红外成像系统(Li-COR Biosciences)检测蛋白。针对ERK1/2、含磷-ERK1/2、含磷-MEK1/2和肌动蛋白的抗体从Cell Signaling Technology获得。

实施例1在具有N-Ras突变Q61R和B-Raf野生型的SK-Mel-2细胞中呈现剂量依赖性含磷-MEK和含磷-ERK抑制，如通过Western印记分析测定。含磷-ERK活性在370 nM的剂量下基本上消除。

实施例1在CellTiter-Glo测定中以188 nM的IC₅₀抑制SK-Mel-2细胞增殖和存活力。这些数据证明，在该测定中，实施例1在具有野生型B-Raf和N-Ras突变Q61R的SK-MEL-2细胞中抑制细胞增殖和存活力。

实施例1在抑制威罗菲尼抗性黑色素瘤细胞中的活性：

威罗菲尼(PLX4032)和PLX4720是突变B-Raf V600E的抑制剂(Johannessen等人, Nature, 2010, 468: 968-72; Montagut等人, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61; Wagle等人, Journal of Clinical Oncology, 2011, 29: 3085-96)。一些最初对威罗菲尼治疗有反应的患者形成药物抗性且在平均7个月内变得难治，Whittaker等人，Sci Transl Med. 2010, 2: 35-41。通过长期用渐增浓度的PLX4720处理具有B-Raf V600E突变的人黑色素瘤细胞系A375(ATCC)产生威罗菲尼抗性细胞系。

对B-RAF抑制具有抗性的B-RAF V600E黑色素瘤细胞系的产生

为了产生抗性细胞，在如上文针对CellTiter-Glo测定所述的生长培养基中在0.02 μM至2 μM的逐渐增加浓度的N- [3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺 (PLX4720；商售选择性B-Raf抑制剂)存在下通过约4个月和30代培养A375 B-Raf V600E细胞(ATCC)，从而得到命名为A375res的抗性细胞系。通过Western印记分析的MAPK重新活化和CellTiter-Glo细胞增殖和存活力测定中IC₅₀值的变动来确认A375res对威罗菲尼和PLX4720的抗性。

在这些A375res细胞中，PLX4032损失其许多活性，从252 nM至大于7 μM变动几乎30倍。实施例1针对这些抗性细胞的活性证明，IC₅₀从11 nM至34 nM仅变动3倍。这些数据证明，在该测定中，实施例1在A375res细胞中抑制细胞增殖和存活力。

实施例1具有最小反常途径活化：

最近公开的研究(参见上文)表明，B-Raf特异性抑制剂(诸如威罗菲尼(PLX-4032))在B-Raf野生型背景下通过与其它Raf同工型异构体B-Raf二聚化诱导“反常途径活化”。威罗菲尼未批准用于治疗具有B-Raf野生型遗传背景的黑色素瘤癌症患者。还相信该反常途径活化是用威罗菲尼治疗的一些黑色素瘤患者中的皮肤副作用(诸如鳞状细胞癌)的病因。

在CellTiter-Glo存活力测定中针对具有B-Raf野生型和K-Ras突变的HCT-116(ATCC)细胞测试实施例1。以0和11个0.17 nM至10000 nM范围内的连续稀释物的剂量实施测试。通过免疫印记(Western印记)分析评价含磷-MEK和含磷-ERK活性。

实施例1显示最小反常途径活化，且在具有B-Raf野生型和K-Ras遗传背景的HCT-116细胞中维持含磷-MEK和含磷-ERK抑制活性。实施例1在该测定中在高于41 nM的剂量下基本上消除含磷酸化-ERK信号。由于实施例1也证明C-Raf抑制(前述分析，上文)，所以据信将不出现反常途径活化。

实施例1抑制具有B-Raf V600E突变的肿瘤细胞的细胞生长：

经常在人恶性肿瘤(包括黑色素瘤、结肠直肠癌、肺癌和卵巢癌)中观察到人癌症中的B-Raf突变、尤其B-Raf V600E。B-Raf中的该突变可导致组成型激酶活性和恶性转化。在CellTiter-Glo测定中在三种黑色素瘤细胞系A375(ATCC)、WM-266-4(ATCC)和SK-Mel-28(ATCC)和两种结肠肿瘤细胞系HT-29(ATCC)和Colo-205(ATCC)中测试实施例1；所有五种细胞系均具有B-Raf V600E突变。

表6. 实施例1针对具有B-Raf V600E突变的肿瘤细胞的活性

实施例1分别以9.2 nM、52.9 nM和29 nM的IC₅₀值抑制三种黑色素瘤细胞系A375、WM-266-4和SK-Mel-28的细胞存活力。类似地，实施例1以7.3 nM和27 nM的IC₅₀值抑制两种结肠细胞系HT-29和Colo-205的细胞存活力。数据证明，在该测定中，实施例1有效抑制具有B-Raf V600E突变的肿瘤细胞的细胞存活力和生长。

实施例1还在上文测试的A375细胞中抑制含磷-MEK和含磷-ERK活性，通过Western印记分析对所述活性进行进一步评价，证明以剂量依赖性方式抑制下游信号传导。含磷-ERK活性在41 nM基本上消除。

体内活性

为了评价实施例1的体内活性，使用A375 V600E(ATCC)和HCT-116K—Ras突变B-Raf野生型(ATCC)异种移植肿瘤模型。简而言之，通过在裸雌性大鼠(NIH模型编号NIHRNU-M，来自Taconic)的后腿中皮下注射植入1:1培养基与基质混合物(0.2 mL总体积)中的10x10⁶个细胞(A375)或5x10⁶个细胞(HCT-116)。每组中总共使用8只大鼠进行功效研究，且每组中使用总共3-4只大鼠进行药效动力学研究。Eli Lilly公司实验动物管理和使用委员会(Eli Lilly and Company Animal Care and Use Committee)批准所有实验方案。在肿瘤大小达到约500 mg时，利用经口施用(管饲法)0.6 mL体积的实施例1或媒介物(20% Captisol®、25 mM磷酸盐，pH2.0)开始治疗。对于A375异种移植模型，实施例1以5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg和20 mg/kg的剂量一天经口给予2次达21天，或对于HCT-116异种移植模型以15mg/kg和30mg/kg的剂量一天两次经口给药，持续21天。随时间监测肿瘤生长和体重以评价活性和毒性迹象。每周两次实施肿瘤的二维测量且基于中轴长度和中轴宽度计算肿瘤体积。肿瘤体积数据转换为log量度以均衡时间和治疗组间的方差。使用SAS®软件(8.2版)中的MIXED®程序利用时间和治疗的两因素重复测量方差分析来分析log体积数据。重复测量的相关模型是空间幂(spatial power)。比较每个时间点时的治疗组与对照组。每个治疗组还单独使用MIXED®程序以计算每个时间点时的调节平均值和标准误差。两种分析考虑在早期从研究去除具有大肿瘤的动物时出现的每个动物内的自相关性和数据损失。针对每个治疗组对时间绘制调节平均值和标准误差。

在A375异种移植模型中，所有剂量组均显示肿瘤生长抑制和肿瘤生长消退，且在这些组中的任一组中均无动物体重损失。在HCT-116异种移植模型中，30 mg/kg组显示统计上显著的肿瘤生长抑制。这些数据证明实施例1的体内活性且支持酶、细胞裂解物和细胞增殖数据与体内活性相关。

在A375异种移植模型中评估实施例1的药效动力学(PD)效应的单独研究中，实施剂量在3.125 mg/kg至50 mg/kg范围内的单一剂量研究。

单一剂量治疗后两小时，观察到剂量依赖性PD效应，如通过Western印记分析所证明。在该模型中，在所有剂量组中均观察到含磷-MEK和含磷-ERK抑制且25mg/kg几乎完全消除含磷-MEK和含磷-ERK活性。

Claims

1.化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲，或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1的化合物，其为1-(3,3-二甲基丁基)-3-(2-氟-4-甲基-5-(7-甲基-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)脲。

3.药物组合物，其包含权利要求1的化合物以及药学上可接受的载体。

4.药物组合物，其包含根据权利要求1-2中任一项的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

5.药物组合物，其包含根据权利要求1-2中任一项的化合物和聚乙烯吡咯烷酮乙酸乙烯酯(PVP-VA)。

6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述PVP-VA是Kollidon® VA 64。

7.根据权利要求1-2中任一项的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。

8.根据权利要求7的用途，其中所述癌症选自甲状腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、急性髓性白血病(AML)和结肠直肠癌。

9.根据权利要求8的用途，其中所述癌症是黑色素瘤。

10.根据权利要求8的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。