ES2541863T3

ES2541863T3 - Vacunas peptídicas para cánceres que expresan antígenos asociados a tumores

Info

Publication number: ES2541863T3
Application number: ES12151705.6T
Authority: ES
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Ohsawa
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2015-07-27
Anticipated expiration: 2028-02-21
Also published as: CY1114590T1; IL219040A0; HRP20141233T1; KR20150064236A; EP2573109A3; IL219044A; EP2570430A3; HRP20131044T1; EP2567971A2; TWI494319B; KR20150018895A; MY173379A; EP2583976A2; EP2574623A2; HRP20150108T1; ES2435194T3; IL219042A; EP2476694B1; CO6190536A2; IL219046A

Abstract

Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 80, o 101.

Description

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CDH3-A24-9-406 (SEQ ID NO: 22), CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30) y CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344) muestran potente producción de IFN-gamma. “f” representa la capacidad de inducción de LTC de CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30). CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y el clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #5 mostrado en los pocillos recuadrados. El clon de LTC establecido generado contra el péptido demostró la actividad de LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen CDH3 como la molécula HLA-A24 (gráfico derecho inferior). Por otra parte, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de CDH3 pero no con HLA-A24 y COS7 transfectadas con HLA-A24 pero no con la longitud completa de CDH3 para el control negativo. El clon de LTC mostró actividad LTC específica alta contra COS7 transfectadas tanto con CDH3 como HLA-A24. “g” representa la capacidad de inducción de LTC de CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344). CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se establecieron la línea y el clon de LTC del pocillo positivo #1 mostrado en los pocillos recuadrados. El clon de LTC establecido generado contra el péptido demostró la actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen CDH3 como la molécula HLA-A24 (gráfico derecho inferior). Por otra parte, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de CDH3 pero no con HLA-A24 y COS7 transfectadas con HLA-A24 pero no con la longitud completa de CDH3 para el control negativo. El clon de LTC mostró actividad de LTC específica alta contra COS7 transfectadas tanto con CDH3 como HLA-A24.

[figura 2] La figura 2 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestra que Epha4A24-9-453 (SEQ ID NO: 41), Epha4-A24-9-5 (SEQ ID NO: 44), Epha4-A24-9-420 (SEQ ID NO: 48), Epha4-A24-9869 (SEQ ID NO: 46), Epha4-A24-10-24 (SEQ ID NO: 78) Epha4-A02-9-501 (SEQ ID NO: 376) y Epha4-A02-9-165 (SEQ ID NO: 379) muestran producción potente de IFN-gamma. “a” representa el ejemplo de péptidos negativos que no se podrían detectar capacidad de inducir LTC a pesar de posible actividad de unión con HLA. “b” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A24-9-453 (SEQ ID NO: 41). Epha4-A24-9-453 (SEQ ID NO: 41) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #3 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “c” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A24-9-5 (SEQ ID NO: 44). Epha4-A24-9-5 (SEQ ID NO: 44) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #2 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “d” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A24-9-420 (SEQ ID NO: 48). Epha4-A24-9-420 (SEQ ID NO: 48) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma. El pocillo #6 mostrado en pocillos recuadrados en el panel superior demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. Además, la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #6 mostrado en los pocillos recuadrados en el panel medio, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “e” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A24-9-869 (SEQ ID NO: 46). Epha4-A24-9-869 (SEQ ID NO: 46) demostró potente producción de IFNgamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #5 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “f” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A24-10-24 (SEQ ID NO: 78). Epha4-A24-10-24 (SEQ ID NO: 78) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #4 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “g” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A02-9-501 (SEQ ID NO: 376). Epha4A02-9-501 (SEQ ID NO: 376) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea y clon de LTC del pocillo positivo #8 mostrado en los pocillos recuadrados. La actividad citotóxica de la línea de LTC establecida contra las células diana pulsadas con el péptido se midió mediante el ensayo de liberación de Cr (CRA) (gráfico inferior), y la línea de LTC tenía actividad citotóxica específica muy potente contra las células diana pulsadas con los péptidos. “h” representa la capacidad de inducción de LTC de Epha4-A02-9-165 (SEQ ID NO: 379). Epha4-A02-9-165 (SEQ ID NO: 379) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea y clon de LTC del pocillo positivo #3 mostrado en los pocillos recuadrados. La actividad citotóxica de la línea de LTC establecida contra las células diana pulsadas con el péptido se midió mediante el ensayo de liberación de Cr (CRA) (gráfico derecho), y la línea de LTC tenía actividad citotóxica específica muy potente contra las células diana pulsadas con los péptidos.

[figura 3] La figura 3 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO: 80), ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100) y ECT2-A24-10-101 (SEQ ID NO: 101) muestran producción potente de IFN-gamma. “a” representa el ejemplo de péptidos negativos que no se podrían detectar capacidad de inducir LTC a pesar de posible actividad de unión con HLA. “b” representa la capacidad de inducción de LTC de ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO: 80). ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO: 80) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma. Los pocillos #5 y #7 mostrados en los pocillos recuadrados en el panel izquierdo demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. Además, la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #7 mostrado en los pocillos recuadrados en el segundo panel, demostró la respuesta específica contra las células diana

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pulsadas con el péptido epítopo. La actividad citotóxica de la línea de LTC contra la línea de células cancerosas, TE6 que expresan endógenamente ECT2 y HLA-A24 se midió mediante ensayo de liberación de Cr (CRA), y el clon tenía una actividad citotóxica muy potente contra TE6. Por otra para, las células efectoras no demostraron la actividad citotóxica de la línea de LTC contra la línea de células cancerosas, TE5 que expresa solo ECT2 no se detectó. “c” representa la capacidad de inducción de LTC de ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100). ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea y clon de LTC del pocillo positivo #2 mostrado en los pocillos recuadrados. El clon de LTC establecido generado contra el péptido demostró la actividad de LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen ECT2 como la molécula HLA-A24. Por otra parte, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de ECT2 pero no con HLA-A24, COS7 transfectadas con HLA-A24 y el gen URLC10 como un sustituto para la longitud completa de ECT2 y COS7 transfectadas con HLA-A24 y pulsadas con ECT2-10-101 para el control negativo. El clon de LTC mostró actividad de LTC específica alta contra COS7 transfectadas tanto con ECT2 como HLA-A24. “d” representa la capacidad de inducción de LTC de ECT2-A24-10-101 (SEQ ID NO: 101). ECT2-A24-10-101 demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea de LTC del pocillo positivo #1 mostrado en los pocillos recuadrados. La línea de LTC establecida generada contra el péptido demostró la actividad de LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen ECT2 como la molécula HLA-A24. Por otra parte, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de ECT2 pero no con HLA-A24, COS7 transfectadas con HLA-A24 y el gen URLC10 como un sustituto para la longitud completa de ECT2 y COS7 transfectadas con HLA-A24 y pulsadas con ECT2-10-40 para el control negativo. El clon de LTC mostró actividad de LTC específica alta contra COS7 transfectadas tanto con ECT2 como HLA-A24.

[figura 4-1] La figura 4 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110), HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111), HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO: 387), HIG2-A2410-7 (SEQ ID NO: 112), HIG2-A24-10-18 (SEQ ID NO: 394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO: 116), HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO: 117) y HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121) muestran producción potente de IFN-gamma. “a” representa el ejemplo de péptidos negativos que no se podrían detectar capacidad de inducir LTC a pesar de posible actividad de unión con HLA. “b” representa la capacidad de inducción de HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110). HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #6 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “c” representa la capacidad de inducción de LTC de HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111). HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFNgamma, y la línea y el clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #7 mostrado en los pocillos recuadrados, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “d” representa la capacidad de inducción de HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO: 387). HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO: 387) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y el clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #5 mostrado en los pocillos recuadrados, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “e” representa la capacidad de inducción de HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114). HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea de LTC del pocillo positivo #10 mostrada en los pocillos recuadrados. La línea de LTC establecida generada contra el péptido demostró la actividad de LTC específica contra 273T transfectadas tanto con la longitud completa del gen HIG2 como la molécula HLA-A02. Se prepararon 293T transfectadas con la longitud completa de HIG2 pero no con HLA-A02, 293T transfectadas con HLA-A02 y el gen FoxP3 como un sustituto para la longitud completa de HIG2 y 293T transfectadas con HLA-A02 y pulsadas con HIG2-9-15 para el control negativo. La línea de LTC mostró actividad de LTC específica alta contra 293T transfectadas tanto con HIG2 como HLA-A02.

[figura 4-2] La figura 4 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110), HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111), HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO: 387), HIG2-A2410-7 (SEQ ID NO: 112), HIG2-A24-10-18 (SEQ ID NO: 394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO: 116), HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO: 117) y HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121) muestran producción potente de IFN-gamma. “f” representa la capacidad de inducción de LTC de HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112). HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea o el clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #1 y #7 mostrados en los pocillos recuadrados, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “g” representa la capacidad de inducción de LTC de HIG2-A24-10-18 (SEQ ID NO: 394). HIG2-A24-10-18 (SEQ ID NO: 394) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y el clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #7 mostrados en los pocillos recuadrados, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “h” representa la capacidad de inducción de HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO: 116). HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO: 116) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y se estableció una línea de LTC del pocillo positivo #10 mostrada en los pocillos recuadrados. La línea de LTC establecida generada contra el péptido demostró la actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen HIG2 como la molécula HLA-A02. Se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de HIG2 pero no con HLA-A02, y

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inducción de LTC de KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO: 213). KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO: 213) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #7 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo.

[figura 7-2] La figura 7 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que KNTC2-A24-9-309 (SEQ ID NO: 196), KNTC2-A24-9-124 (SEQ ED NO: 202), KNTC2-A24-9-154 (SEQ ID NO: 210) KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO: 213), KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217) y KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223) muestran producción potente de IFN-gamma. “f” representa la capacidad de inducción de LTC de KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214). KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y las líneas y clon de LTC que se establecieron del pocillo positivo #4 mostrado en los pocillos recuadrados en el panel izquierdo superior y #5 mostrado en pocillos recuadrados en el panel medio, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. Además, el clon de LTC seleccionado de la línea de LTC del pocillo #5 mediante dilución limitante demostró actividad LTC específica contra las células diana. La línea de LTC establecida del pocillo #4 mostró actividad LTC específica contra HEK293 transfectadas tanto con la longitud completa del gen KNTC2 como la molécula HLA-A24. Además, se prepararon HERK293 transfectadas con la longitud completa de KNTC2 pero no con HLA-A24, HERK293 transfectadas con HLA-A24 pero longitud completa de KNTC2 y HERK293 transfectadas con HLA-A24 y pulsadas con el péptido KNTC-9-309 para el control negativo. “g” representa la capacidad de inducción de LTC de KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217). KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #1 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “h” representa la capacidad de inducción de LTC de KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223). KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #8 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo.

[figura 8-1] La figura 8 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227), TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233), TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228) y TTKA02-10-462 (SEQ ID NO: 254), muestran producción potente de IFN-gamma. “a” representa el ejemplo de péptidos negativos que no se podrían detectar capacidad de inducir LTC a pesar de posible actividad de unión con HLA. “b” representa la capacidad de inducción de LTC de TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227). TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFNgamma, y la línea y dos clones de LTC que se establecieron del pocillo positivo #4 mostrado en los pocillos recuadrados, demostraron la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. El clon de LTC establecido mostró alta actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen TTK como la molécula HLA-A02. Además, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de TTK pero no HLA-A02, COS7 transfectadas con HLA-A02 pero no longitud completa de TTK y COS7 transfectadas con HA-A02 y pulsadas con el péptido TTK-9-547 para control negativo. “c” representa la capacidad de inducción de LTC de TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233). TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233) demostró potente producción de IFNgamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y clones de LTC se establecieron del pocillo positivo #1 mostrados en los pocillos recuadrados. La línea de LTC establecida mostró alta actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen TTK como la molécula HLA-A02. Además, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de TTK pero no HLA-A02, y COS7 transfectadas con HLA-A02 y el gen HIG2 como sustituto para la longitud completa de TTK para control negativo.

[figura 8-2] La figura 8 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227), TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233), TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228) y TTKA02-10-462 (SEQ ID NO: 254), muestran producción potente de IFN-gamma. “d” representa la capacidad de inducción de LTC de TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228). TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y clones de LTC se establecieron del pocillo positivo #2 mostrados en los pocillos recuadrados. La línea de LTC establecida mostró alta actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen TTK como la molécula HLA-A02. Además, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de TTK pero no HLA-A02, COS7 transfectadas con HLA-A02 pero no longitud completa de TTK y COS7 transfectadas con HA-A02 y pulsadas con el péptido TTK-10-462 para control negativo.

[figura 8-3] La figura 8 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227), TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233), TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228) y TTKA02-10-462 (SEQ ID NO: 254), muestran producción potente de IFN-gamma. “e” representa la capacidad de inducción de LTC de TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO: 254). TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO: 254) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y tres clones de LTC se establecieron del pocillo positivo #8 mostrados en los pocillos recuadrados. El clon de LTC establecido mostró alta actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con la longitud completa del gen TTK como la molécula HLA-A02. Además, se prepararon COS7 transfectadas con la longitud completa de TTK pero

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no HLA-A02, COS7 transfectadas con HLA-A02 pero no longitud completa de TTK y COS7 transfectadas con HA-A02 y pulsadas con el péptido TTK-9-547 para control negativo.

[figura 9-1] La figura 9 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que URLC10-A02-9-206 (SEQ ID NO: 271), URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO: 272) y URLC10-A02-10-211 (SEQ ID NO: 288) muestran producción potente de IFN-gamma. “a” representa el ejemplo de péptidos negativos que no se podrían detectar capacidad de inducir LTC a pesar de posible actividad de unión con HLA. “b” representa la capacidad de inducción de LTC de URLC10-A02-9-206 (SEQ ID NO: 271). URLC10-A02-9-206 (SEQ ID NO: 271) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #7 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “c” representa la capacidad de inducción de LTC de URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO: 272). URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO: 272) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea de LTC que se estableció del pocillo positivo #13 mostrado en los pocillos recuadrados, demostró la respuesta específica contra las células diana pulsadas con el péptido epítopo. “d” representa la capacidad de inducción de LTC de URLC10-A02-10211 (SEQ ID NO: 288). URLC10-A02-10-211 (SEQ ID NO: 288) demostró potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y la línea y clones de LTC se establecieron del pocillo positivo #5 mostrado en los pocillos recuadrados.

[figura 9-2] La figura 9 representa los resultados del cribado de péptidos epítopo que, a su vez, demuestran que URLC10-A02-9-206 (SEQ ID NO: 271), URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO: 272) y URLC10-A02-10-211 (SEQ ID NO: 288) muestran producción potente de IFN-gamma. “Continuación de d” El clon de LTC establecido mostró alta actividad LTC específica contra COS7, Hek293 y 293T que se transfectaron tanto con la longitud completa del gen URLC10 como la molécula HLA-A02. Además, se prepararon COS7, Hek293 y 293T que se transfectaron con la longitud completa de URLC10 pero no HLA-A02 y COS7, Hek293 y 293T que se transfectaron con HLA-A02 y se pulsaron el péptido URLC10-10-64 para el control negativo. En estas figuras “+” significa la diana pulsada con el péptido, “-” significa la diana sin pulsar con el péptido, “R” significa respondedor, “S” significa estimulador, “E” significa efector y “D” significa diana.

Descripción detallada de la invención

Las palabras “un”, “una”, “el” y “la” como se usan en el presente documento significan “al menos uno” a menos que se indique específicamente de otra manera.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende el experto en la materia a la que pertenece esta invención.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de dianas aplicables de inmunoterapia. La identificación de nuevos AAT, particularmente esos que inducen respuestas antitumorales potentes y específicas, garantiza el desarrollo adicional de la aplicación clínica de la estrategia de vacunación con péptidos en varios tipos de cáncer (Boon T et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52; Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88; Chen YT et al., (1997) Proc.Natl.Acd. Sci.USA, 94: 1914-8; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-55; Butterfield LH et al., (1999) Cancer Res 59:3134-42; Vissers IL et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308-14; Tanaka F et al., (1997) Cancer Res 57:4465-8; Fujie T et al., (1999) Int J Cancer 80:169-72; Kikuchi M et al., (1999) Int J Cancer 81 : 459-66; Oiso M et al., (1999) Int J Cancer 81:387-94). Puesto que con frecuencia los AAT no tienen inmunogenicidad, el descubrimiento de dianas ajustadas es un asunto extremadamente importante.

Como se ha indicado anteriormente,

CDH3 (No. de acceso de GenBank NM_001793; SEQ ID Nos.1, 2), EPHA4 (No. de acceso de GenBank L36645; SEQ ID Nos.3, 4), ECT2 (No. de acceso de GenBank AY376439; SEQ ID Nos.5, 6), HIG2 (No. de acceso de GenBank NM_013332; SEQ ID Nos.7, 8) INHBB (No. de acceso de GenBank NM_002193; SEQ ID Nos.9, 10), KIF20A (No. de acceso de GenBank NM_005733; SEQ ID Nos.11, 12), KNTC2 (No. de acceso de GenBank AF017790; SEQ ID Nos.13, 14), TTK (No. de acceso de GenBank NM_003318; SEQ ID Nos.15, 16) y URLC10 (No. de acceso de GenBank NM_017527; SEQ ID Nos.17, 18) se identificaron previamente como sobreexpresados en varios cánceres usando tecnologías de micromatriz de ADNc.

En el presente documento, se muestran que péptidos derivados de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK o URLC10 son epítopos de AAT restringidos por HLA-A24 y HLA-A2, un alelo de HLA comúnmente encontrado en las poblaciones japonesa y blanca. Específicamente, usando sus afinidades de unión a HLA-A24 o HLA-A2, se identificaron candidatos de péptidos de unión a HLA-A24 o HLA-A2 derivados de CDH3, EPHA4, ECT2,

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CDH3-A24-9-513 (SEQ ID NO: 19), CDH3-A24-9-406 (SEQ ID NO: 22), CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30), CDH3-A24-10-332 (SEQ ID NO: 34), CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344), CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO: 358), EphA4-A24-9-453 (SEQ ID NO: 41), EphA4-A24-9-5 (SEQ ID NO: 44), EphA4-A24-9-869 (SEQ ID NO: 46), EphA4-A24-9-420 (SEQ ID NO: 48), EphA4-A24-10-24 (SEQ ID NO: 78), EphA4-A02-9-501 (SEQ ID NO: 376), EphA4-A02-9-165 (SEQ ID NO: 379), ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO: 80), ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100), ECT2-A24-10-101 (SEQ ID NO: 101), HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110), HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111), HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO: 387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112), HIG2-A24-10-18 (SEQ ID NO: 394), HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO: 116), HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO: 117), HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121), INHBB-A24-9-180 (SEQ ID NO: 395), INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO: 133), INHBB-A24-10-305 (SEQ ID NO: 135), INHBB-A24-10-7 (SEQ ID NO: 137), INHBB-A24-10-212 (SEQ ID NO: 426), KIF20A-A249-305 (SEQ ID NO: 174), KIF20A-A24-9-383 (SEQ ID NO: 178), KIF20A-A24-10-304 (SEQ ID NO: 186), KIF20A-A24-10-66 (SEQ ID NO: 194), KNTC2-A24-9-309 (SEQ ID NO: 196), KNTC2-A24-9-124 (SEQ ID NO: 202), KNTC2-A24-9-154 (SEQ ID NO: 210), KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO: 213), KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217), KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223), TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227), TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228), TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO: 233), TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO: 254), URLC-A02-9-206 (SEQ ID NO: 271), URLC-A02-9-212 (SEQ ID NO: 272) y URLC-A02-10-211 (SEQ ID NO: 288).

Según esto, la posibilidad de respuestas inmunitarias desconocidas o indeseables con inmunoterapia contra estas moléculas se reduce significativamente.

Respecto a los antígenos HLA, los datos presentados aquí demuestran que los usos de antígenos de tipo A-24 o tipo A-2 (que se dice que se expresan mucho entre los japoneses) son favorables para obtener resultados eficaces. Los usos de subtipos tales como A-2402 y A-0201 son incluso más preferibles. Típicamente, en clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga por adelantado, lo que a su vez, permite la selección de péptidos apropiados que tienen niveles altos de afinidad de unión al antígeno del paciente, o que tienen inducibilidad de células T citotóxicas (LTC) por presentación de antígeno. Además, para obtener péptidos que tienen alta afinidad de unión e inducibilidad de LTC, se pueden realizar la sustitución, deleción o adición de 1, 2 o varios (por ejemplo, hasta 5) aminoácidos basada en la secuencia de aminoácidos de los péptidos parciales de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y URLC10 naturales. En el presente documento, el término “varios” significa que se refiere a 5 o menos, más preferiblemente 3 o menos. Por otra parte, además de los péptidos que se muestran de forma natural, puesto que la regularidad de péptidos mostrados por unión a antígenos HLA ya se conoce (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) lmmunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al., (1995) J. Immunol. 155:4307-12), se pueden realizar modificaciones basadas en tal

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(b): medir la inducibilidad de LTC del péptido sustituto candidato; y

(c): seleccionar el péptido cuya inducibilidad de LTC es igual o mayor que la del péptido original.

Por ejemplo, se divulga un método de identificar un péptido que tiene una capacidad de inducir LTC contra células que expresan al menos un antígeno asociado a tumor, en donde el antígeno asociado a tumor es un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y URLC10, dicho método comprende los pasos de:

(i): proporcionar o generar al menos una secuencia candidata que consiste en una secuencia de aminoácidos modificada por sustitución, deleción o adición de uno, dos o varios residuos de aminoácidos a una secuencia original de aminoácidos, en donde la secuencia original de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, 22, 30, 34, 344, 358, 41, 44, 46, 48, 78, 80, 100, 101, 110, 111, 387, 112, 394, 395, 133, 135, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 202, 210, 213, 214, 217 o 223;

(ii): seleccionar la secuencia candidata que no tiene homología sustancial significativa con los péptidos derivados de cualquier producto génico humano diferente de dichos antígenos asociados a tumor;

(iii) poner en contacto un péptido que consiste en la secuencia candidata seleccionada en el paso (ii) con células presentadoras de antígeno;

(iv): poner en contacto las células presentadoras de antígeno del paso (iii) con células T para evaluar la capacidad del péptido para estimular las células T; y

(v): identificar el péptido cuya inducibilidad de LTC es igual o mayor que la de un péptido que consiste en la secuencia original de aminoácidos.

Preferiblemente, el aminoácido se sustituye por un aminoácido diferente en el que las propiedades de la cadena lateral del aminoácido se conservan (un proceso conocido como sustitución conservadora de aminoácidos). Los ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y las cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Nótese que las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los aminoácidos. En la presente invención, una homología significativa sustancial es, por ejemplo, más del 90%, preferiblemente del 95%, más preferiblemente del 99% o 100% de identidad con un producto génico humano conocido que se va a comparar.

Los péptidos divulgados en el presente documento se pueden preparar como una combinación, que incluye dos o más péptidos como se divulgan en el presente documento, para su uso como una vacuna para una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10; por ejemplo cánceres, tal vacuna induce LTC in vivo. Los cánceres contemplados incluyen, pero no están limitados a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular. Los péptidos pueden estar en una mezcla o se pueden conjugar entre sí usando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos se pueden expresar como una única secuencia polipeptídica. Los péptidos en la combinación pueden ser iguales o diferentes.

Mediante la administración de los péptidos como se divulga en el presente documento, los péptidos se presentan en una alta densidad en los antígenos HLA de células presentadoras de antígeno que, a su vez, inducen LTC que específicamente reaccionan hacia el complejo formado entre el péptido presentado y el antígeno HLA. De forma alternativa, células presentadoras de antígeno que tienen inmovilizados los péptidos de esta invención en su superficie celular, obtenidas retirando células dendríticas de los sujetos, se pueden estimular por los péptidos de esta invención. La readministración de estas células a los respectivos sujetos induce LTC y, como resultado, se puede aumentar la agresividad hacia las células diana.

Más específicamente, se divulgan fármacos para el tratamiento y/o la prevención de proliferación, metástasis y similares, de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10; por ejemplo cánceres, que incluyen uno o más péptidos como se divulgan en el presente documento o un polinucleótido que codifica los péptidos. Los péptidos o polinucleótidos como se divulgan en el presente documento encuentran utilidad particular en el tratamiento de una enfermedad que se asocia a CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10; por ejemplo cánceres. Los cánceres contemplados incluyen, pero no están limitados a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular.

Los péptidos de esta invención se pueden administrar a un sujeto directamente, como una composición farmacéutica que se ha formulado por métodos de formulación convencionales. En tales casos, además de los péptidos de esta

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invención, se pueden incluir soportes, excipientes y similares, que se usan habitualmente para fármacos según sea apropiado, sin limitaciones particulares. Las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento se pueden usar para el tratamiento y la prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10; por ejemplo cánceres. Los cánceres contemplados incluyen, pero no están limitados a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular.

Las composiciones inmunogénicas para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10; por ejemplo cánceres, que incluye como principio activo uno o más péptidos como se divulgan en el presente documento, puede incluir además un adyuvante de modo que se pueda establecer la inmunidad celular eficazmente. De forma alternativa, se pueden administrar con otros principios activos, tales como agentes anticáncer.

Los cánceres contemplados incluyen, pero no están limitados a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular. Las formulaciones adecuadas incluyen gránulos. Los adyuvantes adecuados se describen en la bibliografía (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89).

Los adyuvantes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y alumbre. Además, se pueden usar convenientemente formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las que el fármaco está unido a bolas de unos pocos micrómetros, y formulaciones en las que un lípido está unido al péptido. El método de administración puede ser oral, intradérmico, subcutáneo, inyección intravenosa, o similar, y puede incluir administración sistémica o administración local en la vecindad del tumor atacado.

La dosis del/de los péptido(s) de la invención se puede ajustar apropiadamente según la enfermedad que se va a tratar, la edad del paciente, peso, método de administración, y similares. Aunque la dosis es habitualmente de 0,001 mg a 1000 mg, preferiblemente de 0,01 mg a 100 mg, más preferiblemente de 0,1 a 10 mg, preferiblemente administrada una vez en unos pocos días a pocos meses, el experto en la materia puede seleccionar fácilmente la dosis y método de administración apropiados ya que la selección y optimización de estos parámetros están dentro de las capacidades rutinarias.

La presente invención proporciona además vesículas intracelulares llamadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de esta invención y antígenos HLA en su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, usando los métodos descritos en detalle en la traducción japonesa publicada de la publicación internacional No. Hei 11-510507 y 2000-512161, y se preparan preferiblemente usando células presentadoras de antígeno obtenidas de sujetos que son dianas de tratamiento y/o prevención. Los exosomas de esta invención se pueden inocular como vacunas contra el cáncer, de forma similar a los péptidos de esta invención.

El tipo de antígenos HLA usados debe coincidir con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, HLA-A24 o HLA-A2, particularmente HLA-A2402 o HLA-A0201, es con frecuencia apropiado.

En algunas formas de realización, las composiciones de vacuna de la presente invención incluyen un componente que sensibiliza linfocitos T citotóxicos. Se han identificado lípidos como agentes que pueden sensibilizar LTC in vivo contra antígenos víricos. Por ejemplo, se pueden unir residuos de ácido palmítico a los grupos épsilon y alfa amino de un residuo de lisina y después unirlo a un péptido inmunogénico de la invención. El péptido lipidado se puede administrar después directamente, en una micela o partícula, incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante. Como otro ejemplo de un lípido que sensibiliza respuestas de LTC, se pueden usar lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcistinilseril-serina (P3CSS) para sensibilizar LTC cuando se une covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres K, et al., (1989) Nature 342:561-4).

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención también pueden incluir ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos inmunogénicos divulgados en el presente documento. Véase, por ejemplo, Wolff JA et al., (1990) Science 247:1465-8; Patentes en los EE UU Nos. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN incluyen “ADN desnudo”, administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y mediada por partículas (“cañón génico”) o administración mediada por presión (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.922.687).

Los péptidos inmunogénicos de la invención también se pueden expresar mediante vectores víricos o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen huéspedes víricos atenuados, tal como vaccinia o viruela aviar. Este planteamiento implica el uso del virus vaccinia, por ejemplo, como un vector para expresar

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La presente invención proporciona además células T citotóxicas aisladas inducidas usando los péptidos de esta invención. Las células T citotóxicas, inducidas por estimulación con una célula presentadora de antígeno que presenta uno o más péptidos de esta invención, preferiblemente derivan de sujetos que son dianas de tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar solas o en combinación con otros fármacos, incluyendo uno o más péptidos de esta invención o exosomas que tienen actividad antitumoral. Las células T citotóxicas obtenidas actúan específicamente contra células diana que presentan los péptidos de esta invención, o preferiblemente el/los mismo(s) péptido(s) usado(s) para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10 endógenamente, o células que se transfectan con los genes CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10. Las células que presentan los péptidos de esta invención en la superficie celular, debido a la estimulación con estos péptidos, también se pueden convertir en dianas de ataque.

La presente invención también proporciona células presentadoras de antígeno que presentan complejos formados entre antígenos HLA y uno o más péptidos de esta invención. Se divulga que las células presentadoras de antígeno, obtenidas mediante contacto con los péptidos de esta invención o los nucleótidos que codifican tales péptidos, derivan preferiblemente de sujetos que son diana de tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas, solas o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos, exosomas o células T citotóxicas de la presente invención.

También se divulga una composición compuesta de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor de célula T (TCR), y métodos de usar la misma. Las subunidades de TCR tienen la capacidad de formar TCR que confieren especificidad a las células T para células tumorales que presentan CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK o URLC10. Usando el método conocido en la técnica, se pueden identificar los ácidos nucleicos de las cadenas alfa y beta de las subunidades de TCR de los LTC inducidos con uno o más péptidos de esta invención (documento WO2007/032255 y Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Los TCR derivados preferiblemente se unen a células que presentan el péptido CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK o URLC10 con gran avidez, y opcionalmente median la destrucción eficaz de células diana que presentan el péptido CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK o URLC10 in vivo e in vitro.

Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de TCR se pueden incorporar en vectores adecuados, por ejemplo, vectores retrovíricos. Estos vectores se conocen bien en la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los contienen útilmente se pueden transferir a una célula T, célula T que es preferiblemente de un paciente. Ventajosamente, se divulga una composición lista para usar que permite la modificación rápida de las propias células T de un paciente (o las de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades de destrucción de células cancerosas.

Además, se divulgan LTC que se preparan mediante transducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades del TCR que se unen al péptido de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK o URLC10, por ejemplo, SEQ ID NO: 19, 22, 30, 34, 344, 358, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 100, 101, 110, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 395, 133, 135, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 202, 210, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 254, 271, 272 o 288 en el contexto de HLA-A24 o HLA-A2. Los LTC transducidos son capaces de retorno dirigido hacia células cancerosas in vivo, y se expanden por métodos de cultivo bien conocidos in vitro (por ejemplo, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Las células T de la invención se pueden usar para formar una composición inmunogénica útil en el tratamiento o la prevención de cáncer en un paciente en necesidad de terapia o protección (documento WO2006/031221).

En el contexto de la presente invención, el término “vacuna” (también denominada una composición inmunogénica) se refiere a una sustancia que induce inmunidad antitumoral o suprime cánceres tras la inoculación en animales. Según la presente divulgación, se sugirió que los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 22, 30, 34, 344, 358, 41, 44, 46, 48, 78, 80, 100, 101, 110, 111, 387, 112, 394, 395, 133, 135, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 202, 210, 213, 214, 217 o 223 eran péptidos epítopos restringidos a HLA-A24 y se sugirió que los de SEQ ID NO: 376, 379, 114, 116, 117, 121, 227, 228, 233, 254, 271, 272 o 288 eran péptidos epítopo restringidos a HLA-A2 que podían inducir una respuesta inmunitaria potente y específica contra células que expresan CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, células cancerosas que expresan CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10. Los cánceres contemplados incluyen, pero no están limitados a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular.

Por tanto, se divulga un método de inducir inmunidad antitumoral usando polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 22, 30, 34, 344, 358, 41, 44, 46, 48, 78, 376, 379, 80, 100, 101, 110, 111, 387, 112, 394, 114, 116, 117, 121, 395, 133, 135, 137, 426, 174, 178, 186, 194, 196, 202, 210, 213, 214, 217, 223, 227, 228, 233, 254, 271, 272 o 288 o una variante de las mismas (es decir, incluyendo 1, 2 o varias (por ejemplo, hasta 5)

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proliferación y/o metástasis de las células tumorales por esos anticuerpos, se determina que los polipéptidos inducen inmunidad antitumoral.

La inmunidad antitumoral se puede inducir administrando una vacuna como se divulga en el presente documento, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y la prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres. La terapia contra o la prevención del inicio de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres, puede incluir la inhibición del crecimiento de células que expresan CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, células cancerosas, involución de estas células y supresión de la aparición de estas células, por ejemplo, células cancerosas. La disminución en la mortalidad de individuos que tienen una enfermedad que se asocia a CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres, la disminución de los marcadores de la enfermedad en sangre, alivio de síntomas detectables que acompañan a la enfermedad y similares también se incluyen en la terapia o prevención de la enfermedad, por ejemplo, cánceres. Tales efectos terapéuticos y preventivos son preferiblemente estadísticamente significativos, por ejemplo, observados a un nivel de significación del 5% o menos, en donde el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra una enfermedad que se asocia a CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres, se compara con un control sin administración de vacuna. Por ejemplo, se pueden usar, la prueba de la t de Student, la prueba U de Mann-Whitney o ANOVA para determinar la significación estadística.

En eso se divulga un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres, los compuestos o composiciones terapéuticas se pueden administrar profiláctica o terapéuticamente a sujetos que padecen o en riesgo de (o susceptibles de) desarrollar la enfermedad. Tales sujetos se pueden identificar usando métodos clínicos estándar. En el contexto de la presente invención, la administración profiláctica se produce antes de la manifestación de síntomas clínicos evidentes de la enfermedad, de modo que se previene una enfermedad o trastorno o de forma alternativa se retrasa su progresión. En el contexto del campo de la medicina, el término “prevenir” abarca cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbilidad de una enfermedad. La prevención puede ocurrir a niveles de prevención primaria, secundaria o terciaria. Mientras que la prevención primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención, abarcan actividades dirigidas a prevenir la progresión de una enfermedad y el surgimiento de síntomas así como la reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida restableciendo función y reduciendo las complicaciones de la enfermedad.

En el contexto del tratamiento del cáncer, el término “eficaz” se refiere a un tratamiento que produce una disminución en tamaño, prevalencia o potencial metastásico del cáncer en un sujeto. Cuando se aplica un tratamiento profilácticamente, “eficaz” significa que el tratamiento retrasa o previene la aparición de no cáncer o alivia un síntoma clínico del cáncer. La evaluación del cáncer se puede hacer usando protocolos clínicos estándar. Además, la eficacia de un tratamiento se puede determinar en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el cáncer. Por ejemplo, el cáncer se puede diagnosticar histopatológicamente o identificando anomalías sintomáticas.

El péptido mencionado anteriormente, que tiene actividad inmunológica, o un polinucleótido o vector que codifica tal péptido, se puede combinar con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que aumenta la respuesta inmunitaria contra el péptido cuando se administra junto (o sucesivamente) con el péptido que tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen la toxina del cólera, toxina de salmonella, alumbre y similares, pero no están limitados a los mismos. Además, una vacuna de esta invención se puede combinar apropiadamente con un soporte farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales soportes son agua esterilizada, solución salina fisiológica, tampón fosfato, líquido de cultivo y similares. Además, la vacuna puede contener según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. La vacuna se administra sistémica o localmente. La administración de la vacuna se puede realizar mediante administración única o reforzada por múltiples administraciones.

Cuando se usan CPA o LTC como la vacuna como se divulga en el presente documento, se puede tratar o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y/o URLC10, por ejemplo, cánceres, por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recogen PBMC del sujeto que recibe tratamiento o prevención, se ponen en contacto ex vivo con un péptido de la presente invención. Después de la inducción de CPA o LTC, las células se pueden administrar al sujeto. También se puede inducir la CPA introduciendo un vector que codifica el péptido en PBMC ex vivo. Las CPA o LTC inducidos in vitro se pueden clonar antes de la administración. Al clonar y hacer crecer células que tienen alta actividad de dañar células diana, la inmunoterapia celular se puede realizar más eficazmente. Además, las CPA y LTC aislados de esta manera se pueden usar para inmunoterapia celular no solo contra individuos de los que derivan las células, sino también contra tipos similares de enfermedades en otros individuos.

Se describen aspectos de la presente invención en los siguientes ejemplos, que se presentan solo para ilustrar la presente invención y para ayudar al experto en la materia a hacer y usar la misma. No se pretende de ninguna manera que los ejemplos limiten de otra forma el ámbito de la invención.

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El donante no positivo no se define mediante pocillos de células no detectables, sino por líneas de LTC no establecidas.

Los péptidos mostrados en caracteres en negrita en las tablas poseen la actividad de estimulación de células T.

5 Sin datos en el número de donante positivo, número de pocillos positivos y línea de LTC positiva que indica “-” significa que los péptidos no se pueden sintetizar por alguna razón.

[Tabla 2A-1] 10 Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de CDH3

Posición inicial: Secuencia de aminoácidos Puntuación de unión Número de donantes positivos Número de pocillos positivos Línea de LTC positiva SEQ ID NO.

513: IYEVMVLAM 37,5 1/3 19

667: LFLLLVLLL 36 - - - 20

30: VFREAEVTL 24 0/3 1/22 0/1 21

406: LYVEVTNEA 16,632 1/3 22

332: KYEAHVPEN 16,5 0/3 1/22 0/1 23

180: KYELFGHAV 15 0/3 1/22 0/1 24

85: RSLKERNPL 14,4 0/3 1/22 0/1 25

5: RGPLASLLL 12 0/3 2/22 0/2 26

652: KGGFILPVL 11,2 0/3 0/22 - 27

248: TYNGVVAYS 10,5 0/3 2/22 0/2 28

65: LFSTDNDDF 10 0/3 0/22 - 29

94: KIFPSKRIL 9,6 0/1 0/8 - 306

221: RGSVLEGVL 9,6 0/1 0/8 - 307

668: FLLLVLLLL 8,4 - - - 308

754: IGNFIIENL 8,4 - - - 309

311: TAVAVVEIL 8,4 0/1 0/8 - 310

557: NQSPVRQVL 8,064 0/1 0/8 - 311

611: KQDTYDVHL 8 0/1 0/8 - 312

781: DYEGSGSDA 7,5 0/1 0/8 - 313

165: GWLLLNKPL 7,2 0/1 0/8 - 314

[Tabla 2A-2]

656: ILPVLGAVL 7,2 0/1 0/8 - 315

770: TAPPYDTLL 7,2 0/1 0/8 - 316

602: VVLSLKKFL 7,2 0/1 0/8 - 317

665: ALLFLLLVL 7,2 - - - 318

410: VTNEAPFVL 7,2 0/1 0/8 - 319

662: AVLALLFLL 7,2 - - - 320

613: DTYDVHLSL 6,72 0/1 0/8 - 321

6: GPLASLLLL 6 0/1 0/8 - 322

564: VLNITDKDL 6 0/1 0/8 - 323

159: AVEKETGWL 6 0/1 0/8 - 324

511: NNIYEVMVL 6 0/1 0/8 - 325

11: LLLLQVCWL 6 - - - 326

57: GCPGQEPAL 6 0/1 0/8 - 327

293: EYTLTIQAT 6 0/1 0/8 - 328

79: ETVQERRSL 6 0/1 0/8 - 329

475: SYRILRDPA 6 0/1 0/8 - 330

493: GQVTAVGTL 6 0/1 0/8 - 331

661: GAVLALLFL 6 0/1 0/8 - 332

388: GILTTRKGL 6 0/1 0/8 - 333

382: HPESNQGIL 6 0/1 0/8 - 334

663: VLALLFLLL 5,76 - - - 335

598: EGDTVVLSL 5,6 0/1 0/8 - 336

278: TISVISSGL 5,6 0/1 2/8 0/2 337

659: VLGAVLALL 5,6 0/1 0/8 - 338

811: EWGSRFKKL 5,28 0/1 0/8 - 339

445: KVVEVQEGI 5,04 0/1 0/8 - 340

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614: TYDVHLSLS 5 0/1 0/8 - 341

142: FYSITGPGA 5 0/1 0/8 - 342

246: IYTYNGVVA 5 0/1 0/8 - 343

[Tabla 2B-1]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de CDH3

Posición inicial: Secuencia Puntuación de unión Número de donantes positivos Número de pocillospositivos Línea de LTC positiva SEQ ID NO.

807: DYLNeWGSRF 150 1/3 30

248: TYNGvVAYSI 105 0/3 4/22 0/4 31

667 397: LFLLIVLLLL DFEAkNQHTL 42 30 -0/3 -2/22 -0/2 32 33

332: KYEAhVPENA 21 1/3 34

180: KYELFGHAVS 15 0/3 2/22 0/2 35

510: RNNIYEVMVL 12 0/3 4/22 0/4 36

5: RGPLASLLLL 12 0/3 1/22 0/1 37

477: RILRDPAGWL 12 0/3 1/22 0/1 38

556: CNQSPVRQVL 10,08 0/3 2/22 0/2 39

655: FILPvLGAVL 8,64 1/3 344

662: AVLAILFLLL 8,64 - - - 345

[Tabla 2B-2]

277: GTISvISSGL 8,4 0/3 0/20 - 346

781: DYEGsGSDAA 7,5 0/3 0/20 - 347

601: TVVLsLKKFL 7,2 0/3 3/20 0/3 348

158: FAVEkETGWL 7,2 0/3 0/20 - 349

665: ALLFILLVLL 7,2 - - - 350

259: SQEPkDPHDL 7,2 0/3 0/20 - 351

664: LALLfLLLVL 7,2 - - - 352

42: GAEQePGQAL 7,2 0/3 1/20 0/1 353

661: GAVLaLLFLL 7,2 - - - 354

595: VNEEgDTVVL 7,2 0/2 0/12 - 355

340: NAVGhEVQRL 7,2 0/2 0/12 - 356

411: TNEApFVLKL 6,6 0/2 0/12 - 357

470: ENQKiSYRIL 6 1/2 358

10: SLLLIQVCWL 6 0/2 1/12 0/1 359

721: GLEArPEVVL 6 0/2 2/12 0/2 360

345: EVQRITVTDL 6 0/2 4/12 0/4 361

2: GLPRgPLASL 6 0/2 3/12 0/3 362

657: LPVLgAVLAL 6 - - - 363

563: QVLNiTDKDL 6 0/2 1/12 0/1 364

159: AVEKeTGWLL 6 0/2 2/12 0/2 365

492: SGQVtAVGTL 6 0/2 - - 366

387: QGILtTRKGL 6 0/2 - - 367

525: SPPTtGTGTL 6 0/2 2/12 0/2 368

358: NSPAwRATYL 6 0/2 2/12 0/2 369

122: GPFPqRLNQL 5,76 0/2 3/12 0/3 370

753: EIGNfIIENL 5,6 0/2 1/12 0/1 371

310: TTAVaVVEIL 5,6 - - - 372

246: IYTYnGVVAY 5 0/2 2/12 0/2 373

805: DYDYINEWGS 5 0/2 0/12 - 374

[Tabla 3A]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de EPHA4

97: VYIEIKFTL 504 0/2 1/16 0/1 40

453: RYSVALAWL 400 2/3 41

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25: VYPANEVTL 300 0/3 0/22 - 42

384: HYTPQQNGL 288 0/3 1/22 0/1 43

5: FYFALFSCL 288 1/2 44

519: GYGDFSEPL 240 0/3 3/22 0/3 45

869: KFGQIYNML 67,2 1/3 46

777: AYTTRGGKI 55 0/3 1/22 0/1 47

420: KYNPNPDQS 18 1/3 48

749: RNILVNSNL 16,8 0/3 1/22 0/1 49

734: KYLSDMSYV 15 0/3 0/22 - 50

879: KLIRNPNSL 14,4 0/3 0/22 - 51

926: RYICDNFTAA 14,4 0/3 0/22 - 52

834: KAIEEGYRL 14,4 0/3 0/22 - 53

574: KYSKAKQEA 13,2 0/3 0/22 - 54

184: AFQDVGACI 12,6 0/3 1/22 0/1 55

252: WLVPIGNCL 12,096 0/3 0/22 - 56

326: RPPSAPLNL 12 0/3 0/22 - 57

203: KCPLTVRNL 12 0/3 0/22 - 58

360: SYNVVCKKC 11,55 0/3 0/22 - 59

[Tabla 3B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de EPHA4

25: VYPANEVTLL 300 0/3 0/22 - 60

244: MYCGADGEWL 200 0/3 1/22 0/1 61

657: GYTDKQRRDF 120 0/3 1/22 0/1 62

5: FYFAIFSCLF 100 - - - 63

102: KFTLRDCNSL 48 0/3 1/22 0/1 64

818: SYGERPYWDM 30 0/3 2/22 0/2 65

4: IFYFALFSCL 28,8 - - - 66

808: SYGIVMWEVM 25 - - - 67

630: EFGEVCSGRL 24 0/3 0/22 - 68

420: KYNPNPDQSV 21,6 0/3 0/22 - 69

930: NFTAAGYTTL 20 0/2 0/16 - 70

675: QFDHPNIIHL 20 0/3 0/22 - 71

708: AFLRKNDGRF 15 0/3 0/22 - 72

579: KQEADEEKHL 12 0/3 1/22 0/1 73

727: RGIGSGMKYL 12 0/3 0/22 - 74

96: RVYIEIKFTL 11,2 0/2 1/16 0/1 75

507: SYVFHVRART 10,5 0/3 1/22 0/1 76

251: EWLVPIGNCL 10,08 0/3 0/22 - 77

24: RVYPANEVTL 9,6 1/3 78

699: EYMENGSLDA 9 0/3 0/22 - 79

[Tabla 3C]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de EPHA4

8: ALFSCLFGI 514,942 - - - 375

501: GLNPLTSYV 382,536 1/1 376

12: CLFGICDAV 126,098 0/1 1/5 0/1 377

977: QMHGRMVPV 115,534 0/1 1/5 0/1 378

165: KLNTEIRDV 111,979 1/1 379

252: WLVPIGNCL 98,267 0/1 1/5 0/1 380

879: KLIRNPNSL 74,768 0/1 1/5 0/1 381

559: VVILIAAFV 56,902 - - - 382

812: VMWEVMSYG 39,386 0/1 0/5 - 383

728: GIGSGMKYL 37,157 0/1 0/5 - 384

750: NILVNSNLV 35,385 0/1 1/5 0/1 385

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[Tabla 4A]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de ECT2

515: TYPPFVNFF 216 1/1 80

140: LYCTSMMNL 200 0/1 0/8 - 81

298: LYVVKQEWF 150 0/1 0/8 - 82

435: NYVNILATI 105 0/1 0/8 - 83

773: IYTADPESF 100 0/1 0/8 - 84

110: LYKADCRVI 50 0/1 0/8 - 85

739: SFQMTSDEL 33 0/1 0/8 - 86

504: IFLKYSKDL 30 0/1 0/8 - 87

867: FFERRSHTL 30 0/1 0/8 - 88

178: DFNSKVTHL 30 0/1 0/8 - 89

61: KQEELIKAL 17,28 0/1 0/8 - 90

657: RGEQVTLFL 16,8 0/1 2/8 0/2 91

568: RLPSVALLL 16,8 0/1 0/8 - 92

550: KPECGRQSL 14,4 0/1 0/8 - 93

470: IFGSIPDIF 14 0/1 0/8 - 94

116: RVIGPPVVL 12 0/1 0/8 - 95

507: KYSKDLVKT 11 0/1 0/8 - 96

223: DFYAAVDDF 10 0/1 0/8 - 97

[Tabla 4B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de ECT2

322: LYEKaNTPEL 330 0/1 0/8 - 98

435: NYVNiLATII 90 0/1 0/8 - 99

40: SYVEeEMPQI 90 1/1 100

101: DFQDsVFNDL 72,576 1/1
101

866: SFFErRSHTL 24 0/1 0/8 - 102

811: SFSKtPKRAL 20 0/1 1/8 0/1 103

268: KYLPIGDERC 18 0/1 0/8 - 104

84: EFEGIDSPEF 16,5 0/1 1/8 0/1 105

236: KVPPfQDCIL 14,4 0/1 0/8 - 106

728: RPPTeQANVL 14,4 0/1 0/8 - 107

507: KYSKdLVKTY 12 0/1 0/8 - 108

281: VVEEnIVKDL 10,08 0/1 0/8 - 109

10 [Tabla 5A]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de HIG2

19: IFVRVMESL 42 1/3 110

22: RVMESLEGL 14,4 1/3 111

8: YLLGVVLTL 8,4 1/3 387

7: LYLLGVVLT 7,5 0/2 3/15 0/3 388

23: VMESLEGLL 7,2 0/2 0/16 - 389

9: LLGVVLTLL 5,6 - - - 390

[Tabla 5B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de HIG2

Posición inicial: Secuencia Puntuación de unión Número de donantes Número de pocillos Línea de LTC positiva SEQ ID NO.

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positivos
positivos

7: LYLLGVVLTL 420 1/3 112

22: RVMESLEGLL 17,28 0/3 4/24 0/4 113

8 5: YLLGVVLTLL LNLYLLGVVL 8,4 7,2 -0/2 -0/12 -- 391 392

46: LANTEPTKGL 6 0/2 0/14 - 393

18: SIFVRVMESL 5,6 1/2 394

[Tabla 5C]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de HIG2

8: YLLGVVLTL 836,253 1/1 114

13: VLTLLSIFV 650,311 0/1 0/12 - 115

15: TLLSIFVRV 488,951 1/1 116

4: VLNLYLLGV 271,948 1/1 117

9: LLGVVLTLL 83,527 0/1 0/12 - 118

22: RVMESLEGL 31,957 0/1 0/12 - 119

6: NLYLLGVVL 28,027 0/1 0/12 - 120

[Tabla 5D]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de HIG2

8: YLLGvVLTLL 836,253 1/1 121

12: VVLTILSIFV 210,538 - - - 122

29: GLLEsPSPGT 113,047 0/1 0/12 - 123

6: NLYLIGVVLT 54,847 - - - 124

4: VLNLyLLGVV 14,495 0/1 0/12 - 125

15: TLLSiFVRVM 13,174 0/1 0/12 - 126

18: SIFVrVMESL 12,248 0/1 0/12 - 127

14: LTLLsIFVRV 11,545 - - - 128

10 [Tabla 6A]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de INHBB

383: LYFDDEYNI 60 0/3 0/20 - 129

238: LFERGERRL 30 0/3 1/19 0/1 130

7: RALGAACLL 12 0/3 0/21 - 131

388: EYNIVKRDV 10,5 0/3 0/18 - 132

180: LYLKLLPYV 9 1/2 395

163: ISNEGNQNL 8,64 0/1 0/8 - 396

223: RSGWHTFPL 8 0/1 0/6 - 397

176: ASLWLYLKL 7,92 0/1 0/7 - 398

338: AYLAGVPGS 7,5 0/1 1/7 0/1 399

213: NMVEKRVDL 7,2 0/1 0/8 - 400

102: AMVTALRKL 6,6 0/1 0/8 - 401

250: VQCDSCQEL 6,336 0/1 0/8 - 402

369: NSCCIPTKL 6,16 0/1 0/8 - 403

330: NYCEGSCPA 6 0/1 0/7 - 404

172: FVVQASLWL 6 0/1 0/8 - 405

355: VNQYRMRGL 6 0/1 0/8 - 406

307: QFFIDFRLI 6 0/1 0/7 - 407

14: LLLLAAGWL 6 - - - 408

306: QQFFIDFRL 5,6 0/1 0/6 - 409

170: NLFVVQASL 5,6 0/1 0/7 - 410

E12151705

07-07-2015

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[Tabla 6B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*2402 derivados de INHBB

180: LYLKLLPYVL 360 1/3 133

171: LFVVQASLWL 30 - - - 134

305: RQQFFIDFRL 16,8 1/3 135

73: DFLEAVKRHI 12,6 0/3 4/20 0/4 136

7: RALGAACLLL 12 1/3 137

273: RPFVVVQARL 11,2 0/3 1/20 0/1 138

338: AYLAGVPGSA 10 0/3 2/20 0/2 139

169: QNLFvVQASL 8,4 0/1 1/6 0/1 412

249: DVQCdSCQEL 7,92 0/1 4/6 0/4 413

173: VVQAsLWLYL 7,2 0/1 0/6 - 414

383: LYFDdEYNIV 7,2 0/1 0/6 - 415

229: FPLTeAIQAL 7,2 0/1 1/6 0/1 416

299: RTNLcCRQQF 7,2 0/1 5/6 0/5 417

101: AAMVtALRKL 6,6 0/1 2/6 0/2 418

368: VNSCcIPTKL 6,16 0/1 2/6 0/2 419

13: CLLLIAAGWL 6 - - - 420

354: VVNQyRMRGL 6 0/1 0/6 - 421

150: DGLAsSRVRL 6 0/1 2/6 0/2 422

293: GLECdGRTNL 6 0/1 0/6 423

330: NYCEgSCPAY 6 0/1 1/6 0/1 424

176: ASLWIYLKLL 6 0/1 1/6 0/1 425

212: WNMVeKRVDL 6 1/1 426

74: FLEAvKRHIL 6 0/1 2/6 0/2 427

331: YCEGsCPAYL 6 0/1 1/6 0/1 428

77: AVKRhILSRL 5,6 0/1 1/6 0/1 429

175: QASLwLYLKL 5,28 0/1 2/6 0/2 430

326: GYYGnYCEGS 5 0/1 1/6 0/1 431

159: LYFFiSNEGN 5 0/1 4/6 0/4 432

327: YYGNyCEGSC 5 0/1 1/6 0/1 433

[Tabla 6C]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de INHBB

Posición inicial: Secuencia Puntuación de unión Número de donantes positivos Número de pocillos positivos Línea de LTC positiva SEQ ID NO.

177: SLWLYLKLL 407,808 0/1 0/8 140

14: LLLLAAGWL 96,074 - - - 141

170: NLFVVQASL 79,041 0/1 0/8 142

213: NMVEKRVDL 63,256 0/1 0/8 143

172: FVVQASLWL 47,291 0/1 0/8 144

306: QQFFIDFRL 46,48 0/1 0/8 145

281: RLGDSRHRI 42,774 0/1 0/8 146

174: VQASLWLYL 34,427 0/1 0/8 147

257: ELAVVPVFV 28,69 0/1 1/8 0/1 148

313: RLIGWNDWI 28,116 0/1 1/8 0/1 149

139: RVSEIISFA 22,546 0/1 3/8 0/3 150

151: GLASSRVRL 21,362 0/1 0/8
151

8: ALGAACLLL 21,362 0/1 1/8 0/1 152

250: VQCDSCQEL 15,096 0/1 1/8 0/1 153

10 [Tabla 6D]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de INHBB

Posición: Secuencia Puntuación Número de Número de Línea de LTC SEQ ID

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E12151705

07-07-2015

577: KLQQHSDKI 17,892 0/1 0/8 - 243

142: FAFVHISFA 14,856 0/1 0/8 - 244

322: CELRNLKSV 11,509 0/1 0/8 - 245

824: SILKAAKTL 10,868 0/1 0/8 - 246

[Tabla 9B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de TTK

68: LLLKLEKNSV 437,482 0/1 0/8 - 247

277: NLLNSPDCDV 257,342 0/1 0/8 - 248

653: FLIVDGMLKL 226,014 0/1 0/8 - 249

423: TTFEQPVFSV 195,487 0/1 0/8 - 250

542: VLNEKKQIYA 190,448 0/1 0/8 - 251

658: GMLKLIDFGI 161,697 0/1 0/8 - 252

194: LLSEEEKKNL 148,896 0/1 0/8 - 253

462: YMSCFRTPVV 94,738 1/1 254

57: MMANNPEDWL 70,685 0/1 0/8 - 255

600: MVMECGNIDL 48,205 0/1 0/8 - 256

689: YMPPEAIKDM 37,961 0/1 0/8 - 257

86: KLIGRYSQAI 36,515 0/1 0/8 - 258

669: NQMQPDTTSV 26,092 0/1 1/8 0/1 259

497: QILATPLQNL 24,997 0/1 0/8 - 260

654: LIVDGMLKLI 22,997 0/1 0/8 - 261

186: NLNLQKKQLL 21,362 0/1 1/8 0/1 262

670: QMQPDTTSVV 20,595 0/1 0/8 - 263

803: KGTTEEMKYV 20,102 0/1 0/8 - 264

11: LTIDSIMNKV 15,486 0/1 0/8 - 265

577: KLQQHSDKII 14,971 0/1 0/8 - 266

[Tabla 10A]

Péptidos 9-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de URLC10

131: KIFPRFFMV 1364,78 0/1 0/8 - 267

204: GLWLAILLL 407,808 0/1 0/8 - 268

65: LLVVALPRV 271,948 0/1 0/8 - 269

60: ALLALLLVV 242,674 - - - 270

206: WLAILLLLA 52,561 1/1 271

212: LLASIAAGL 36,316 1/1 272

210: LLLLASIAA 31,249 0/1 0/8 - 273

137: FMVAKQCSA 16,505 0/1 2/8 0/2 274

58: TMALLALLL 15,428 0/1 2/8 0/2 275

59: MALLALLLV 13,975 0/1 2/8 0/2 276

209: ILLLLASIA 12,812 0/1 0/8 - 434

208: AILLLLASI 12,208 - - - 277

69: ALPRVWTDA 8,446 0/1 0/8 - 278

197: SMGESCGGL 8,223 0/1 0/8 - 279

61: LLALLLVVA 7,964 - - - 280

67: VVALPRVWT 6,097 0/1 0/8 - 281

72: RVWTDANLT 5,412 0/1 0/8 - 282

160: FLLEEPMPF 5,2 0/1 1/8 0/1 283

62: LALLLVVAL 4,292 0/1 0/8 - 284

57: GTMALLALL 2,525 0/1 1/8 0/1 285

10 [Tabla 10B]

Péptidos 10-meros que se unen a HLA-A*0201 derivados de URLC10

Posición: Secuencia Puntuación Número de Número de Línea de LTC SEQ ID

5

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15

20

25

30

35

40

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inicial: de unión donantes positivos pocillos positivos positiva NO.

64: LLLVVALPRV 1006,21 0/1 0/8 - 286

204: GLWLAILLLL 407,808 0/1 1/8 0/1 287

211: LLLASIAAGL 134,369 1/1 288

258: TMALLALLLV 115,534 - - - 289

61: LLALLLVVAL 83,527 - - - 290

160: FLLEEPMPFF 65,782 0/1 0/8 - 291

209: ILLLLASIAA 31,249 0/1 0/8 - 292

131: KIFPRFFMVA 26,186 0/1 0/8 - 293

60: ALLALLLVVA 17,334 - - - 294

66: LVVALPRVWT 6,097 0/1 0/8 - 295

59: MALLALLLVV 5,73 - - - 296

2: RLQRPRQAPA 4,968 0/1 1/8 0/1 297

112: CQNPRRCKWT 4,156 0/1 0/8 - 298

72: RVWTDANLTA 3,608 0/1 0/8 - 299

53: WAPLGTMALL 3,139 0/1 0/8 - 300

121: TEPYCVIAAV 3,111 0/1 0/8 - 301

162: LEEPMPFFYL 2,739 0/1 1/8 0/1 302

181: LEGPPINSSV 2,299 0/1 2/8 0/2 303

170: YLKCCKIRYC 2,024 0/1 0/8 - 304

130: VKIFPRFFMV 1,81 0/1 0/8 - 305

Estimulación de las células T usando los péptidos predichos de CDH3 restringidos con HLA-A*2402 y establecimiento de líneas de LTC estimulados con péptidos derivados de CDH3

Se generaron LTC para esos péptidos derivados de CDH3 según los protocolos expuestos en la sección de “Materiales y Métodos” anteriormente. Los LTC resultantes que tienen actividad LTC específica detectable, determinada mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma, se muestran en la figura 1. En particular, CDH3-A24-9513 (SEQ ID NO: 19), CDH3-A24-9-406 (SEQ ID NO: 22), CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30), CDH3-A24-10-332 (SEQ ID NO: 34), CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344) y CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO: 358) demostraron potente producción de IFN-gamma comparado con el control mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma, y las células en el pocillo positivo #5 estimuladas con SEQ ID NO: 19, #2 con SEQ ID NO: 22, #5 con SEQ ID NO: 30, #4 con SEQ ID NO: 34, #1 con SEQ ID NO: 344 y #4 con SEQ ID NO: 358 se expandieron y se establecieron líneas de LTC. Se determinaron esas líneas de LTC que tenían mayores actividades LTC específicas contra la diana pulsada con péptido comparadas con las actividades contra diana sin pulso de péptido mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 1. Mientras, otros péptidos mostrados en la tabla 2 no pudieron establecer las líneas de LTC a pesar de la posible actividad de unión a HLA-A*2402. Por ejemplo, el péptido negativo típico (CDH3-A24-10-248) se mostraron en la figura 1a. En esta invención, los péptidos que pudieron establecer líneas de LTC se seleccionaron como péptido potente de estimulación de LTC.

Establecimiento de clones de LTC estimulados con péptidos derivados de CDH3

Además, se realizó la dilución limitante de estas líneas de LTC según los protocolos expuestos en la sección de “Materiales y Métodos” anteriormente. El establecimiento de clones de LTC de la línea de LTC CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30) #5 y CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344) #1 se muestra en la figura 1f y g. Los clones de LTC tenían actividades LTC potentes y específicas contra la diana pulsada con el péptido comparado con las actividades con la diana sin el pulso de péptido.

Actividad LTC específica contra las células diana que expresan CDH3 y HLA-A*2402

Se examinó la capacidad de las líneas de LTC establecidas generadas contra estos péptidos de reconocer células diana que expresan CDH3 y HLA-A*2402. Se probó la actividad LTC específica contra COS7 transfectadas tanto con del gen CDH3 de longitud completa como la molécula HLA-A*2402, que sirve como un modelo específico para las células diana que expresan endógenamente CDH3 y HLA-A*2402, usando como células efectoras las líneas de LTC generadas contra CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30) y CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344). COS7 transfectadas con CDH3 de longitud completa pero no HLA-A*2402 y COS7 transfectadas con HLA-A*2402 pero no CDH3 de longitud completa se prepararon como controles. Los clones de LTC que demuestran la actividad LTC específica más alta contra COS7 era esa transfectada tanto con CDH3 como HLA-A2402 (figura 1f y g).

Estos resultados demuestran claramente que CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30) y CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO: 344) se expresan de forma natural en la superficie de la célula diana con la molécula HLA-A2402 y reconocen LTC. Además, estos péptidos son péptidos epítopos, que pueden servir como vacunas contra el cáncer que se dirigen contra tumores que expresan CDH3.

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Claims

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