ES2545818T3 - Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos DEPDC1 - Google Patents

Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos DEPDC1 Download PDF

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Ryuji Osawa
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Abstract

Un péptido de menos de alrededor de 15 aminoácidos, en el que dicho péptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 12, o un péptido de menos de alrededor de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12 en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos.

Description

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pulsadas sin ningún péptido. R significa Respondedor: clon de CTL. S significa Estimulador: T2 pulsada con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 10] La Figura 10A representa los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-gamma para la identificación de péptidos epitópicos, que, a su vez, demuestran que DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID NO: 12) es un potente productor de IFN-gamma. Los CTLs para esos péptidos derivados de DEPDC1 se generaron según los protocolos descritos en la sección de “Materiales y métodos” de los ejemplos expuestos más abajo. Se muestran los CTLs resultantes que muestran actividad de CTL específica detectable. Las células en el pocillo número #10 estimuladas con DEPDC1-A24-9-294 mostraron una potente producción de IFN-gamma para reconocer células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control. La Figura 10B representa los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-gamma para la identificación de clones de CTL tras dilución limitante (clon de CTL DEPDC1-A24-9-294). Las células en el pocillo positivo se expandieron, y se llevó a cabo la dilución limitante. Como demuestran los resultados representados, se establecieron clones de CTL que tienen mayores actividades de CTL específicas frente a la diana pulsada con DEPDC1-A24-9-294 en comparación con las actividades frente a la diana sin pulso de péptido.
[fig. 11] La Figura 11 representa el establecimiento de clones de CTL estimulados con DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID NO: 12). El clon de CTL mostró actividad de CTL específica elevada frente a células diana (A24LCL) pulsadas con DEPDC1-A24-9-294, mientras que no mostró actividad de CTL significativa frente a las mismas células diana (A24LCL) pulsadas sin péptidos. R significa Respondedor: clon de CTL DEPDC-A24-9-294. S significa Estimulador: A24-LCL pulsada con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 12] La Figura 12 representa la expresión de DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID NO: 12) sobre la superficie de células diana con HLA-A24. La actividad de CTL específica frente a COS7 transfectada tanto con el gen DEPDC1 de longitud completa como con la molécula HLA-A*2402 se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon de CTL generado por DEPDC1-A24-9-294. Como controles, se prepararon COS7 transfectada con DEPDC1 de longitud completa pero no con HLA-A*2402, y COS7 transfectada con HLAA*2402 pero no con DEPDC1 de longitud completa. El clon de CTL establecido demostró actividad de CTL específica elevada frente a COS7 transfectada tanto con DEPDC1 como con HLA-A24. Sin embargo, no mostró actividad de CTL específica significativa frente a COS7 no transfectada ni con DEPDC1 ni con HLA-A24. R significa Respondedor: Clon de CTL DEP-A24-9-294. S significa Estimulador: transfectante de COS7 (1x104/pocillo).
[fig. 13] La Figura 13 representa la actividad de CTL frente a líneas celulares de cáncer de vejiga que expresan de manera endógena DEPDC1. El clon de CTL establecido inducido con el péptido DEPDC1-A24-9294 reconoció células tumorales que expresan de manera endógena DEPDC1. Las células HT1376, RT-4 y J82 expresaron DEPDC1 de manera endógena, respectivamente. El clon de CTL mostró producción de IFNgamma frente a HT1376 que tiene genotipo HLA-A*2402, pero no muestra respuesta frente a RT-4 y J82, que no tienen el genotipo HLA-A*2402.
[fig. 14] La Figura 14 representa el análisis de inmunogenicidad in vivo usando el péptido DEPDC1-A24-9
294. Se inyectó subcutáneamente péptido conjugado con IFA a ratones BALB/c en los días 0 y 7. En el día 14, se recolectaron esplenocitos de ratones vacunados y se usaron como células respondedoras, y se usaron como células estimuladoras 1x104 células RLmale1 pulsadas con el péptido DEPDC1-A24-9-294, para el ensayo ELISPOT de IFN-gamma. En los casos de cada ratón se indicaron los recuentos formadores de puntos (SFC); a cinco ratones (Ani1Ani5) se les vacunó el péptido epitópico, y a dos ratones (nega1 y nega2) se les inyectó la emulsión IFA de tratamiento simulado como control negativo.
[fig. 15] La Figura 15 representa la potente producción de IFN-gamma de DEPDC1-A02-10-644, -10-575, -10506, -10-765, -10-395, -10-224, -9-297, -10-296 y -10-302 mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma para la identificación de péptidos epitópicos. Los CTLs para esos péptidos derivados de DEPDC1 se generaron de la manera descrita en “Materiales y métodos”. Las células en los pocillos nº #4 y #7 estimuladas con DEPDC1A02-10-644, #2 con DEPDC1-A02-10-575, #7 con DEPDC1-A02-10-506, #1 con DEPDC1-A02-10-765 y #1 con DEPDC1-A02-10-395, #1 y #2 con DEPDC1-A02-10-224, #4 con DEPDC1-A02-9-297, #3 y #4 con DEPDC1-A02-10-296 y #2, #3, #5, y #7 con DEPDC1-A02-10-302 mostraron una potente producción de IFNgamma en comparación con el control.
[fig. 16] La Figura 16 representa la producción de IFN-gamma de la línea de CTL generada con el péptido DEPDC1-A02-10-296. Las líneas de CTL establecidas generadas con el péptido DEPDC1-A02-10-296 tienen una potente actividad productora de IFN-gamma. Se mostró producción de IFN-gamma frente a células diana pulsadas con péptido, pero no se mostró aquella frente a células diana sin pulso de péptido. Las células diana usadas fueron células T2, que expresaron la molécula HLA-A2 en la superficie celular.
[fig. 17] La Figura 17 representa la actividad de CTL frente a dianas que expresan de manera endógena las moléculas DEPDC1 y HLA-A2. Se mostró en el panel superior que la línea de CTL establecida generada con el péptido DEPDC1-A02-10-296 poseyó actividad productora de IFN-gamma frente a células diana que expresaron de manera endógena DEPDC1V2 y HLA-A2. El caso del uso del péptido DEPDC1-A02-10-296 se
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uno o dos aminoácidos. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Se sabe que los péptidos variantes (es decir, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos modificada sustituyendo, suprimiendo o añadiendo uno, dos o varios restos aminoácidos a una secuencia de aminoácidos original) retienen la actividad biológica original (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6.; Zoller MJ y Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500.; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13.). En el contexto de la presente descripción, es preferible que la modificación de aminoácidos dé como resultado la conservación de las propiedades de la cadena lateral de aminoácidos original (un proceso conocido como sustitución conservativa de aminoácidos). Los ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos incluyen los aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un grupo aromático (H, F, Y, W). Obsérvese que las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de aminoácidos.
En realizaciones preferidas, el péptido inmunogénico es un nonapéptido (9-mero) o un decapéptido (10-mero).
La presente descripción proporciona además un método para inducir inmunidad antitumoral frente a una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, en un sujeto, incluyendo dicho método las etapas de administrar a un sujeto que lo necesite un péptido inmunogénico de la presente descripción, a saber, uno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255, o una variante de los mismos (es decir, que incluye 1, 2, o varias sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos). Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
En el contexto de la presente descripción, el sujeto es preferiblemente un mamífero. Los mamíferos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo, o una vaca.
En la presente descripción, el péptido se puede administrar a un sujeto vía un protocolo in vivo o ex vivo. Además, la presente descripción también proporciona el uso de nonapéptido o decapéptido seleccionado de péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255 (y sus variantes) para fabricar una composición inmunogénica para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Los análisis de homología de MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID NO: 7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEC ID NO: 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID NO: 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID NO: 10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSSKLSNV (SEC ID NO: 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID NO: 12)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID NO: 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID NO: 195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID NO: 197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID NO: 209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID NO: 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID NO: 228)), DEPDC1-A2-10-302 (ILVVCGYITV (SEC ID NO: 230)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEC ID NO: 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID NO: 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID NO: 243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID NO: 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID NO: 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID NO: 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID NO: 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID NO: 254)) y DEPDC1-A02-10-301(NILGLLQPHL (SEC ID NO: 255)) demuestran que no tienen homología significativa con los péptidos derivados de ninguno de los productos génicos humanos conocidos. En consecuencia, la posibilidad de respuestas inmunitarias desconocidas o indeseables con inmunoterapia frente a estas moléculas está significativamente reducida.
Con respecto a los antígenos HLA, los datos presentados aquí demuestran que los usos de antígenos de tipo A-24 o de tipo A-2 (que se afirma que están muy expresados entre los japoneses) son favorables para obtener resultados eficaces. Los usos de subtipos tales como A-2402 y A-0201 son incluso más preferibles. Típicamente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga previamente, lo que permite, a su vez, la selección de péptidos apropiados que tienen niveles elevados de afinidad de unión por el antígeno del paciente, o que tienen inducibilidad de células T citotóxicas (CTL) mediante presentación de antígeno. Además, a el fin de obtener péptidos que tienen elevada afinidad de unión e inducibilidad de CTL, se puede llevar a cabo la sustitución, supresión, o adición de 1, 2, o varios aminoácidos basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial MPHOSPH1 y DEPDC1 de origen natural. Aquí, el término “varios” significa 5 o menos, más preferentemente 3 o
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Los péptidos de la presente descripción se pueden preparar usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar sintéticamente, usando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente descripción se pueden sintetizar individualmente, o como polipéptidos más largos que comprenden dos o más péptidos. Los péptidos de la presente descripción están preferiblemente aislados, es decir, sustancialmente libres de otras proteínas de origen natural de la célula hospedante y fragmentos de las mismas.
Los péptidos de la presente descripción pueden contener modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral o fosforilación, con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica de los péptidos como se describe aquí, a saber, la capacidad para unirse a un antígeno HLA e inducir CTL. Otras modificaciones incluyen la incorporación de D-aminoácidos u otros miméticos de aminoácidos que se pueden usar, por ejemplo, para incrementar la semivida sérica de los péptidos.
Los péptidos de esta descripción se pueden preparar como una combinación, que incluye dos o más péptidos de la descripción, para uso como una vacuna para una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, tal como una vacuna que induce CTL in vivo. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando. Los péptidos pueden estar en un cóctel, o se pueden conjugar entre sí usando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos se pueden expresar como una única secuencia polipeptídica. Los péptidos en la combinación pueden ser iguales o diferentes. Administrando los péptidos de esta descripción, los péptidos se presentan a una densidad elevada en los antígenos HLA de células presentadoras de antígeno, que, a su vez, inducen CTLs que reaccionan específicamente frente al complejo formado entre el péptido presentado y el antígeno HLA. Como alternativa, las células presentadoras de antígeno, que tienen inmovilizados los péptidos de esta descripción sobre su superficie celular, obtenidas retirando células dendríticas de los sujetos, pueden ser estimuladas por los péptidos de esta descripción. La readministración de estas células a los sujetos respectivos induce CTL y, como resultado, se puede incrementar la agresividad frente a las células diana.
Más específicamente, la presente descripción proporciona fármacos para tratar y/o prevenir la proliferación, metástasis, y similar de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, que incluyen uno o más de los péptidos de esta descripción. Los péptidos de esta descripción encuentran utilidad particular en el tratamiento de una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Los péptidos de esta descripción se pueden administrar a un sujeto directamente, como una composición farmacéutica que se puede formular mediante métodos de formulación convencionales. En tales casos, además de los péptidos de esta descripción, se pueden incluir, según sea apropiado, portadores, excipientes, y similares que se usan normalmente para fármacos, sin limitaciones particulares. Las composiciones inmunogénicas de esta descripción se pueden usar para el tratamiento y prevención de una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Las composiciones inmunogénicas para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, que comprenden como ingrediente activo uno o más péptidos de la presente descripción, pueden incluir además un adyuvante de manera que se establecerá de forma eficaz la inmunidad celular. Como alternativa, se pueden administrar con otros ingredientes activos, tales como agentes contra el cáncer. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando. Las formulaciones adecuadas incluyen gránulos. Los adyuvantes adecuados se describen en la bibliografía (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89.). Los adyuvantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, y alumbre. Además, se pueden usar convenientemente formulaciones liposómicas, formulaciones granulares en las que el fármaco está unido a perlas de unos pocos micrómetros de diámetro, y formulaciones en las que un lípido está unido al péptido. El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similar, y puede incluir administración sistémica o administración local en la vecindad del tumor seleccionado como diana. La dosis del péptido o péptidos de esta descripción se puede ajustar apropiadamente según la enfermedad a tratar, la edad del paciente, el peso, el método de administración, y similar. Aunque la dosis es normalmente 0,001 mg a 1000 mg, preferentemente 0,01 mg a 100 mg, más preferentemente 0,1 mg a 10 mg, administrada preferiblemente una vez en unos pocos días a unos pocos meses, el experto en la técnica puede seleccionar fácilmente la dosis apropiada y el método de administración, ya que la selección y optimización de estos parámetros está perfectamente dentro de la pericia habitual.
La presente descripción proporciona además vesículas intracelulares denominadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de esta invención y antígenos HLA en su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, usando de los métodos descritos con detalle en la traducción japonesa publicada de
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las publicaciones internacionales nos Hei 11-510507 y 2000-512161, y se preparan preferiblemente usando células presentadoras de antígeno obtenidas a partir de sujetos que son dianas de tratamiento y/o prevención. Los exosomas de esta descripción se pueden inocular como vacunas del cáncer, de forma similar a los péptidos de esta descripción.
El tipo de antígenos HLA usados debe de coincidir con el del sujeto que requiera tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, a menudo es apropiado HLA-A24 o HLA-A2, particularmente HLA-A2402 o HLA-A0201.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna de la presente descripción incluyen un componente que estimula linfocitos T citotóxicos. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de estimular CTL in vivo frente a antígenos víricos. Por ejemplo, los restos de ácido palmítico se pueden unir a los grupos épsilon-y alfaamino de un resto de lisina y después se pueden enlazar a un péptido inmunogénico de la descripción. El péptido lipidado se puede administrar entonces ya sea directamente, en una micela o partícula, se puede incorporar en un liposoma, o se puede emulsionar en un adyuvante. Como otro ejemplo de un cebado lipídico de respuestas de CTL, se pueden usar lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS), para cebar CTL cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres K, et al., (1989) Nature 342:5614.).
Las composiciones inmunogénicas de la presente descripción también pueden incluir ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos inmunogénicos descritos aquí. Véanse, por ejemplo, Wolff JA et al., (1990) Science 247:1465-8; patente de EE.UU. nos 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de suministro basadas en ADN incluyen “ADN desnudo”, suministro facilitado (bupivicaína, polímeros, mediado por péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y suministro mediado por partículas (“pistola génica”) o mediado por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.922.687).
Los péptidos inmunogénicos de la descripción también se pueden expresar por vectores víricos o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen hospedantes víricos atenuados, tales como el virus de la vacuna o el virus de la viruela aviar. Este enfoque implica el uso del virus de la vacuna, por ejemplo como un vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican el péptido. Al introducirlo en un hospedante, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca una respuesta inmunitaria. Los vectores del virus de la vacuna y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, la patente de EE.UU: nº 4.722.848. Otro vector adecuado es BCG (Bacilo de Calmette Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover CK, et al., (1991) Nature 351:456-60. En la técnica se conoce una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización, por ejemplo vectores de adenovirus y virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina del carbunco destoxificado, y similares. Véanse, por ejemplo, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ y Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; e Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.
La presente descripción también proporciona métodos para inducir células presentadoras de antígeno usando uno o más péptidos de esta descripción. Las células presentadoras de antígeno se pueden inducir induciendo células dendríticas de los monocitos de sangre periférica, y poniéndolos entonces en contacto (estimulándolos) con uno o más péptidos descritos in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente descripción se administran a los sujetos, las células presentadoras de antígeno que tienen los péptidos esta descripción inmovilizados a ellas son inducidas en el cuerpo del sujeto. Como alternativa, tras inmovilizar los péptidos de esta descripción a las células presentadoras de antígeno, las células se pueden administrar al sujeto como una vacuna. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
a: recolectar células presentadoras de antígeno de un sujeto, y
b: poner en contacto las células presentadoras de antígeno de la etapa a con un péptido de la presente descripción.
Las células presentadoras de antígeno obtenidas mediante la etapa b se pueden administrar al sujeto como una vacuna.
La descripción también proporciona un método para inducir células presentadoras de antígeno que tienen un nivel elevado de inducibilidad de células T citotóxicas, en el que el método incluye la etapa de transferir in vitro genes compuestos de polinucleótido o polinucleótidos que codifican uno o más péptidos de esta descripción a células presentadoras de antígeno. Los genes introducidos pueden estar en forma de ADN o de ARN. Para el método de introducción, se pueden usar de forma adecuada, sin limitaciones particulares, diversos métodos llevados a cabo convencionalmente en este campo, tales como lipofección, electroporación y método de fosfato de calcio. Más específicamente, la transfección se puede llevar a cabo como se describe en Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7.; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13.; Boczkowski D, et al., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72.; traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº 2000-509281. Al transferir el gen a las células presentadoras de antígeno, el gen sufre la transcripción, la traducción, y similar, en la célula, y entonces la
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La presente descripción también proporciona una composición que comprende ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor de célula T (TCR,) y métodos para usarlos. Las subunidades de TCR tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a células T por células tumorales que presentan MPHOSPH1 o DEPDC1. Usando el método conocido en la técnica, se pueden identificar los ácidos nucleicos de la cadena alfa y beta como las subunidades de TCR del CTL inducidos con uno o más péptidos de esta descripción (documento WO2007/032255 y Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Los TCRs derivados se unen preferiblemente con avidez elevada a células diana que presentan el péptido de MPHOSPH1 o DEPDC1, y opcionalmente median la muerte eficiente de células diana que presentan el péptido MPHOSPH1 o DEPDC1 in vivo e in vitro.
Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de TCR se pueden incorporar en vectores adecuados, por ejemplo vectores retrovíricos. Estos vectores son bien conocidos de la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los comprenden de forma útil se pueden transferir a una célula T, célula T la cual procede preferiblemente de un paciente. Ventajosamente, la descripción proporciona una composición disponible en el mercado que permite la modificación rápida de las células T del propio paciente (o las de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades exterminadoras de células cancerosas.
También, la presente descripción proporciona CTLs que se preparan mediante transducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades de TCR que se unen con el péptido MPHOSPH1 o DEPDC1, por ejemplo SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255 en el contexto de HLA-A24 o HLA-A2. Los CTLs transducidos son capaces de encontrar el camino hacia las células cancerosas in vivo, y de expandirse mediante método de cultivo bien conocido in vitro (por ejemplo Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Las células T de la descripción se pueden usar para formar una composición inmunogénica útil para tratar o prevenir cáncer en un paciente que necesite terapia o protección (documento WO2006/031221).
En el contexto de la presente descripción, el término “vacuna” (también denominada como composición inmunogénica) se refiere a una sustancia que induce inmunidad antitumoral o suprime cánceres al inocularla en animales. Según la presente descripción, se sugirió que los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 8 o 12 son péptidos epitópicos restringidos por HLA-A24, y se sugirió que aquellos de SEC ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255 son péptidos epitópicos restringidos a HLA-A2 que pueden inducir respuesta inmunitaria potente y específica frente a células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células cancerosas que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando. De este modo, la presente invención también engloba un método para inducir inmunidad antitumoral usando polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255 o una variante de la misma (es decir, que incluye 1, 2, o varias sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos). En general, la inmunidad antitumoral incluye respuestas inmunitarias tales como las siguientes:
-una inducción de linfocitos citotóxicos frente a tumores que contienen células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1,
-una inducción de anticuerpos que reconocen tumores que contienen células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, y
-una inducción de la producción de citocinas antitumorales.
Por lo tanto, cuando un determinado péptido induce una cualquiera de estas respuestas inmunitarias al inocularlo en un animal, se afirma que el péptido tiene efecto inductor de inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral por un péptido se puede detectar observando in vivo o in vitro la respuesta del sistema inmunitario en el hospedante frente al péptido.
Por ejemplo, es bien conocido un método para detectar la inducción de linfocitos T citotóxicos. Una sustancia extraña que entra en el cuerpo vivo se presenta a células T y células B mediante la acción de las células presentadoras de antígeno (APCs). Las células T que responden al antígeno presentado por APC de una manera específica del antígeno se diferencian en células T citotóxicas (también denominadas linfocitos T citotóxicos o CTLs) debido a la estimulación por el antígeno, y entonces proliferan; este proceso se denomina aquí como “activación” de células T. Por lo tanto, la inducción de CTL por un determinado péptido se puede evaluar presentando el péptido a una célula T por la APC, y detectando la inducción de CTL. Además, las APCs tienen el efecto de activar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos y células NK. Puesto que las células T CD4+ son también importantes en la inmunidad antitumoral, la acción inductora de la inmunidad antitumoral del péptido se puede evaluar usando el efecto de activación de estas células como indicadores.
Un método para evaluar la acción inductora de CTL usando células dendríticas (DCs) como APC es bien conocido en la técnica. DC es una APC representativa que tiene la acción inductora de CTL más potente de entre las APCs.
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En este método, el polipéptido de ensayo se pone en contacto inicialmente con DC, y entonces estas DC se pone en contacto con células T. La detección de células T que tienen efectos citotóxicos frente a las células de interés tras el contacto con DC muestra que el polipéptido de ensayo tiene una actividad induciendo las células T citotóxicas. La actividad de CTL frente a tumores se puede detectar, por ejemplo, usando como indicador la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr. Como alternativa, es bien conocido cómo evaluar el grado de daño de las células tumorales usando la actividad de incorporación de 3H-timidina o la liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador. Además, también se puede examinar midiendo IFN-gamma producido y liberado por CTL en presencia de células presentadoras de antígeno que portan péptidos inmovilizados mediante la visualización usando anticuerpos anti-IFN-gamma, tal como un ensayo ELISPOT.
Aparte de DC, también se pueden usar como la APC células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs). Se da a conocer que la inducción de CTL está potenciada al cultivar PBMC en presencia de GM-CSF e IL-4. De forma similar, se ha mostrado que CTL es inducido al cultivar PBMC en presencia de hemocianina de lapa californiana (KLH) e IL-7.
Los polipéptidos de ensayo que se confirmó que poseen actividad inductora de CTL por estos métodos son polipéptidos que tienen efecto de activación de DC y actividad inductora de CTL subsiguiente. Por lo tanto, los polipéptidos que inducen CTL frente a células tumorales son útiles como vacunas frente a enfermedades asociadas con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Además, las APC que han adquirido la capacidad para inducir CTL frente a una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, mediante la puesta en contacto con los polipéptidos son útiles como vacunas frente a la enfermedad. Además, los CTL que han adquirido citotoxicidad debido a la presentación de los antígenos polipeptídicos mediante APC también se pueden usar como vacunas frente a una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Tales métodos terapéuticos para una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, usando inmunidad antitumoral debido a APC y CTL, se denominan como inmunoterapia celular. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Generalmente, cuando se usa un polipéptido para inmunoterapia celular, la eficiencia de la inducción de CTL se puede incrementar combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen diferentes estructuras y poniéndolos en contacto con DC. Por lo tanto, cuando se estimulan DC con fragmentos proteicos, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.
La inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido se puede confirmar adicionalmente observando la inducción de la producción de anticuerpos frente a tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos frente a un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando se suprime el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de células tumorales por esos anticuerpos, se determina que el polipéptido induce inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral se puede inducir administrando una vacuna de esta descripción, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. La terapia contra o la prevención del comienzo de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, puede incluir la inhibición del crecimiento de células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células cancerosas, involución de esas células y supresión de la aparición de esas células, por ejemplo células cancerosas. La disminución de la mortalidad de individuos que tienen una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, la disminución de los marcadores de la enfermedad en la sangre, el alivio de síntomas detectables que acompañan a la enfermedad, y similares, también están incluidos en la terapia o prevención de la enfermedad, por ejemplo cánceres. Tales efectos terapéuticos y preventivos son preferiblemente estadísticamente significativos, por ejemplo observados a un nivel de significancia de 5% o menos, en el que el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, se compara con un control sin la administración de la vacuna. Por ejemplo, para determinar la significancia estadística, se puede usar la prueba de la t de Student, la prueba de la U de Mann-Whitney o ANOVA.
Ya que la presente descripción proporciona un método para tratar, o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, los compuestos o composiciones terapéuticas se pueden administrar profiláctica o terapéuticamente a sujetos que sufren o tienen riesgo de (o son susceptibles a) desarrollar la enfermedad. Tales sujetos se pueden identificar usando métodos clínicos estándar. En el contexto de la presente descripción, la administración profiláctica se produce antes de la manifestación de síntomas clínicos manifiestos de la enfermedad, de manera que se previene o como alternativa se retrasa el avance de una enfermedad o trastorno. En el contexto del campo de la medicina, el término “prevenir” engloba cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbilidad de la enfermedad. La prevención se puede producir a los niveles de prevención primaria, secundaria y terciaria. Mientras que la prevención primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención engloban actividades destinadas a prevenir el avance de una enfermedad y la aparición de síntomas, así como a reducir el impacto negativo de una enfermedad ya establecida restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad.
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En el contexto del tratamiento del cáncer el término “eficaz” se refiere a un tratamiento que conduce a una disminución del tamaño, prevalencia o potencial metastásico de cáncer en un sujeto. Cuando un tratamiento se aplica profilácticamente, “eficaz” significa que el tratamiento retrasa o previene la aparición de cáncer o alivia un síntoma clínico de cáncer. La evaluación de cáncer se puede realizar usando protocolos clínicos estándar. Además, la eficacia de un tratamiento se puede determinar junto con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar cáncer. Por ejemplo, el cáncer se puede diagnosticar histopatológicamente, o identificando anomalías sintomáticas.
El péptido mencionado anteriormente, que tiene actividad inmunológica, o un polinucleótido o vector que codifica tal péptido, se puede combinar con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria frente al péptido cuando se administra junto (o sucesivamente) con el péptido que tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen toxina colérica, toxina de Salmonella, alumbre y similar, pero no se limitan a ellos. Además, una vacuna de esta descripción se puede combinar apropiadamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales portadores son agua esterilizada, disolución salina fisiológica, tampón de fosfato, fluido de cultivo, y similar. Además, la vacuna puede contener, según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. La vacuna se administra sistémica o localmente. La administración de la vacuna se puede llevar a cabo mediante administración única o se puede revacunar mediante múltiples administraciones.
Cuando se usa APC o CTL como la vacuna de esta descripción, una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, se puede tratar o prevenir, por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recolectan PBMCs del sujeto que recibe tratamiento o prevención, y se ponen en contacto ex vivo con un péptido de la presente descripción. Tras la inducción de APC o CTL, las células se pueden administrar al sujeto. Las APC también se pueden inducir introduciendo un vector que codifica el péptido en PBMCs ex vivo. APC o CTL inducidos in vitro se pueden clonar antes de la administración. La inmunoterapia celular se puede llevar a cabo de forma más eficaz clonando y cultivando células que tienen actividad elevada de producción de daño a células diana. Además, APC y CTL aislados de esta manera se pueden usar para la inmunoterapia celular no solo frente a individuos de los que derivan las células, sino también frente a tipos de enfermedades similares en otros individuos.
Los aspectos de la presente descripción se describen en los siguientes ejemplos, que se presentan solamente para ilustrar la presente descripción y para ayudar a un experto normal en la realización y uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar de otro modo el alcance de la descripción.
Aunque en la práctica o ensayo de la presente descripción se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.
EJEMPLOS
En lo sucesivo, la presente descripción se ejemplifica, pero no se restringe, mediante los siguientes Ejemplos. Sin embargo, los materiales, métodos, y similares descritos aquí solo ilustran aspectos de la descripción y de ningún modo están destinados a limitar el alcance de presente descripción. Como tal, en la práctica o ensayo de la presente descripción se pueden usar materiales, métodos y demás similares o equivalentes a los descritos aquí.
EJEMPLO 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas celulares
Las células A24LCL (HLA-A24/24), las líneas celulares linfoblastoides B humanas, células T2 y COS7 se adquirieron de ATCC.
Selección de péptidos candidatos derivados de MPHOSPOH1 y DEPDC1
Los péptidos 9-meros y 10-meros derivados de MPHOSPOH1 o DEPDC1 que se unen a una molécula HLA-A*2402 y HLA-A*0201 se predijeron usando el software de predicción de unión “BIMAS” (bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.; 152(1):163-75.; Kuzushima K, et al., (2001) Blood.; 98(6):1872-81.). Estos péptidos se sintetizaron por Sigma (Sapporo, Japón) según el método de síntesis en fase sólida estándar, y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos se determinaron mediante HPLC analítica y análisis de espectrometría de masas, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml y se almacenaron a -80 grados C.
Inducción de CTL in vitro
Como células presentadoras de antígenos (APCs), se usaron células dendríticas (DCs) derivadas de monocitos para inducir respuestas de CTL frente a péptidos presentados sobre HLA. Las DCs se generaron in vitro como se describió en otra parte (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7., Tsai V et al., (1997) J. Immunol 158:1796802.). De forma breve, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un voluntario normal (HLA
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[Tabla 3A] Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO. de unión
575
KLLDLIEDL 31 1278,29 1184 KLKEEITQL 93 24,677
282
YIYDLFVPV 9 1096,62 888 TLSKEVQQI 94 23,995
298
KMLRLSQDV 67 650,504 280 NEYIYDLFV 95 23,802
218
ALLRQIKEV 68 591,888 552 LLDEDLDKT 96 23,415
850
FLLTIENEL 42 363,588 461 LAYDETLNV 97 21,546
1108
ALSELTQGV 69 285,163 980 NLPNTQLDL 98 21,362
331
KLGIKHQSV 70 243,432 409 TLGKCINVL 99 20,145
1689
TLQKFGDFL 71 218,772 175 TLNVLFDSL 100 19,888
1251
KLTDAKKQI 72 149,711 923 KLSNEIETA 101 19,596
638
RLAIFKDLV 10 129,506 1389 KEHENNTDV 102 19,407
1467
QLTEKDSDL 73 87,586 987 DLLGNDYLV 103 19,301
1195
NLQDMKHLL 74 87,586 920 KIMKLSNEI 104 18,577
270
SVWVSFFEI 75 83,497 1703 ILQSKAKKI 105 17,736
129
FQGCIMQPV 76 74,608 512 ILNVKRATI 106 17,736
839
VLQENNEGL 77 72,959 1124 KELETILET 107 17,695
1094
TLDVQIQHV 78 63,988 453 IVNISQCYL 108 17,477
1019
AIWEECKEI 79 48,816 771 LICNETVEV 109 16,258
1696
FLQHSPSIL 80 40,289 623 TLLQEREIL 110 15,879
528
DLMEDEDLV 81 38,775 560 TLEENKAFI 111 15,057
406
SLLTLGKCI 82 38,601 1415 YNADRKKWL 112 14,465
1400
KLTNLQDEL 44 36,637 307 KGYSFIKDL 113 13,65
170
GILPRTLNV 83 35,385 133 IMQPVKDLL 45 12,852
171
ILPRTLNVL 84 34,246 1594 KMAVKHPGC 114 12,558
786
KICSERKRV 85 33,472 365 SEMSRVIRV 115 11,509
880
SLSEKKNLT 86 30,553 1191 QLTNNLQDM 116 11,426
944
LMHTKIDEL 87 29,559 871 QIVHFQQEL 117 11,162
1422
WLEEKMMLI 88 28,963 245 NISEFEESI 118 10,951
466
TLNVLKFSA 89 28,814 484 TLNSSQEKL 119 10,468
1539
KLQTEPLST 90 26,082 764 SLIINNKLI 120 10,433
132
CIMQPVKDL 91 24,997 587 LINEKKEKL 121 10,032
1260
KQVQKEVSV 92 24,681
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de MPHOSPH1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
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[Tabla 4A] Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión partida aminoácidos NO. de unión
295
YYELFVNIL 163 360 505 KQLCRSQSL 167 14,4
294
EYYELFVNI 12 86,4 275 VFRTIADYF 168 14
282
YFLDLPEPL 164 43,2 36 HFKKYGNCF 169 12
118
RYPELRKNN 165 21,6 307 GYITVSDRS 170 10,5
338
SFKSTECLL 166 20 298 LFVNILGLL 171 42
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de DEPDC1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 4B]
Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
Posición de partida
Secuencia de aminoácidos SEC ID NO. Puntuación de unión Posición de partida Secuencia de aminoácidos SEC ID NO. Puntuación de unión
294
EYYELFVNIL 172 288 275 VFRTIADYFL 182 20
281
DYFLDLPEPL 173 240 113 KTLPRRYPEL 183 15,84
118
RYPELRKNNI 174 216 277 RTIADYFLDL 184 14,4
770
EYPLIYQKRF 175 150 270 GFERDVFRTI 185 12,6
267
TYVGFERDVF 176 150 146 RTPKRHGLHL 186 12
523
SYINTPVAEI 177 82,5 505 KQLCRSQSLL 187 12
282
YFLDLPEPLL 178 36 340 KSTECLLLSL 188 11,52
191
RYVILIYLQT 179 21 295 YYELFVNILV 189 10,5
338
SFKSTECLLL 180 20 129 NFSKDKDSIF 190 10
103
LFRFPATSPL 181 20
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de DEPDCI. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 5A] Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de DEPDC1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO. de unión
674
FLMDHHQEI 191 728,022 563 RLCKSTIEL 209 21,362
589
LLQPHLERV 192 133,255 506 QLCRSQSLL 210 21,362
575
SLLPASSML 193 79,041 193 VILIYLQTI 211 20,753
246
WVLSAMKCL 194 73,172 297 ELFVNILVV 212 18,201
619
LLMRMISRM 195 71,872 235 ILQNKSDDL 213 17,795
23
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Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO. de unión
581
SMLTGTQSL 196 57,085 616 KLQLLMRMI 214 16,797
290
LLTFEYYEL 197 54,474 623 MISRMSQNV 215 16,258
220
YIMYNMANT 198 40,111 72 TIQLLRKFL 216 16,155
283
FLDLPEPLL 199 39,307 421 CSLEGIVDV 217 15,841
787
ALFGDKPTI 200 38,601 303 LVVCGYITV 218 15,519
582
MLTGTQSLL 201 36,316 524 YINTPVAEI 219 15,177
773
LIYQKRFPT 202 32,33 194 ILIYLQTIL 220 14,89
114
TLPRRYPEL 203 32,044 239 KSDDLPHWV 221 14,333
505
KQLCRSQSL 167 28,049 576 LLPASSMLT 222 12,668
765
KQFQKEYPL 204 28,049 646 MIHTFSRCV 223 12,356
395
IMGGSCHNL 205 26,228 645 LMIHTFSRC 224 11,589
296
YELFVNILV 206 23,018 653 CVLCCAEEV 225 11,034
278
TIADYFLDL 207 22,882 297 ELFVNILGL 226 13,635
601
ALQLCCLLL 208 21,362
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de DEPDC1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 5B] Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de DEPDC1
Posición Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Unión de partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO.
666
LLAGRLVSFL 227 459,398 575 SLLPASSMLT 241 27,572
674
FLMDHHQEIL 228 299,484 296 YELFVNILVV 242 21,706
588
SLLQPHLERV 229 290,025 506 QLCRSQSLLL 243 21,362
302
ILVVCGYITV 230 177,358 765 KQFQKEYPLI 244 20,547
291
LTFEYYELFV 231 137,017 682 ILQVPSYLQT 245 19,003
201
ILGVPSLEEV 232 133,255 269 VGFERDVFRT 246 16,735
195
LIYLQTILGV 233 119,657 381 QLVNLRNRRV 247 13,91
688
YLQTAVEKHL 234 98,267 283 FLDLPEPLLT 248 13,712
645
LMIHTFSRCV 235 64,9 395 IMGGSCHNLI 249 12,809
581
SMLTGTQSLL 236 57,085 403 LIGLSNMHDL 250 11,485
622
RMISRMSQNV 237 50,232 773 LIYQKRFPTT 251 10,591
618
QLLMRMISRM 238 42,278 488 TLTVQDQEEL 252 10,468
654
VLCCAEEVDL 239 36,316 224 NMANTSKRGV 253 10,046
644
SLMIHTFSRC 240 34,925 296 YELFVNILGL 254 16,26
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significativa relacionada con la proliferación celular (véase el documento PCT/JP2006/302684). De este modo, los péptidos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1 pueden servir como epítopos de TAA que, a su vez, se pueden usar para inducir respuestas inmunitarias significativas y específicas frente a células cancerosas.
De este modo, puesto que MPHOSPH1 y DEPDC1 son nuevos TAAs, las vacunas que usan estos péptidos epitópicos encuentran utilidad como sustancias inmunoterapéuticas frente a diversos carcinomas y otras enfermedades que expresan estas moléculas.
EJEMPLO 2
MATERIALES Y MÉTODOS Péptidos y adyuvante Los péptidos sintetizados de grado GMP se adquirieron de Neo Multi Peptide System (MPS) (San Diego, CA). Como
adyuvante, se usó adyuvante incompleto de Freund (IFA) (MONTANIDE *ISA51). Se emulsionó 1 mg del péptido apropiado con 1 mg de IFA.
Expresión antigénica Los presentes inventores llevaron a cabo un análisis inmunohistoquímico. Las células tumorales o tejidos tumorales procedentes de cánceres de vejiga que se obtuvieron de cirugía o biopsia se tiñeron con cada anticuerpos policlonal específico de MPHOSPH1 y de DEPDC1. El protocolo de tinción fue el establecido en el Human Genome Center, Institute for Medical Science, the University of Tokyo como se describió previamente (Kanehira M et al. Cancer Res.; 67(7):3276-3285, 2007., Kanehira M et al. Oncogene. 23 de abril de 2007 [publicación electrónica previa a la impresa]). La expresión de HLA-A*2402 se sometió a ensayo en SRL (Tachikawa, Japón).
Pacientes enrolados Los criterios de enrolamiento fueron los siguientes:
1.Pacientes con cáncer de vejiga recurrente no operable previamente tratados con quimioterapia estándar que resultó fallida. 2.Pacientes con un estado funcional 0 o 1 en los criterios japoneses. 3.Pacientes de 20 años de edad a 80 años de edad.
4.
Pacientes con tumor primario o metástasis que se puede reconocer mediante inspección de imágenes (CT/MRI) antes del tratamiento, independientemente de la directriz RECIST.
5.
Pacientes con más de 4 semanas después del tratamiento previo (cirugía, quimioterapia, radioterapia, termoterapia, otra inmunoterapia, etc.).
6.Pacientes con pronóstico esperado de más de 3 meses. 7.Pacientes con función de la médula ósea (WBC de más de 2000, 15000 menos que, placa más de 50000), función hepática (GOT menor que 150, GTP menor que 150, T-bil menor que 3,0), función renal (Cr menor que 3,0).
8.Pacientes con HLA-A*2402.
9.Tumor de los pacientes con expresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Los criterios de exclusión fueron los siguientes:
1.Pacientes embarazadas.
2.Pacientes lactantes.
3.Pacientes con deseo de gestación.
4.Pacientes con infección incontrolable.
5.Pacientes con necesidad de seguimiento médico durante el periodo de ensayo clínico, administración
sistémica de esteroides, administración sistémica de inmunosupresores. 6.Pacientes que el médico o investigador principal considera que no deben incluirse en el ensayo. Protocolo
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Los pacientes enrolados con cáncer de vejiga con HLA-A*2402, cuyos tumores expresan fosfoproteína 1 de fase M (MPHOSPH1) y/o dominio DEP que contiene 1 (DEPDC1), se inmunizaron con los péptidos epitópicos restringido por HLA-A*2402 MPHOSPH1-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID NO: 7)) y/o DEPDC1-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID NO: 12)). Cada péptido se combinó con 1 ml de adyuvante incompleto de Freund (IFA, (MONTANIDE *ISA51) y se
5 inyectó subcutáneamente en una lesión axilar o inguinal una vez a la semana. Una inyección durante cuatro veces se define como una tanda, y tras 1 tanda para la evaluación inmunológica y clínica, se extrajo sangre y se llevó a cabo CT/MRI.
Evaluación de seguridad
La evaluación del efecto adverso se llevó a cabo junto con los criterios de toxicidad comunes del National Cancer 10 Institute, versión 3 (NCI-CTC ver. 3).
Evaluación inmunológica
Éste es un criterio de evaluación secundario en este estudio, y confirmamos si la respuesta de CTL específica del péptido se produjo o no. La respuesta de CTL específica se midió según lo siguiente: se recolectaron células mononucleares de sangre periférica, y se reestimularon mediante los péptidos apropiados. La respuesta de CTL se
15 sometió a ensayo en el día 14º mediante el ensayo ELISPOT de IFN-g.
Evaluación de efectos antitumorales
La evaluación de la respuesta clínica se llevó a cabo según los criterios RECIST.
RESULTADOS
La Tabla 7 muestra el sumario de este ensayo clínico. No hubo efectos secundarios graves, excepto exantema de
20 grado 2 del Caso 3. Se obtuvo una respuesta menor (Caso 3) y una respuesta mixta (Caso 4). La expresión de MPHOSPH1 se produjo en 4 de 5 casos, mientras que la de DEPDC1 se produjo en 5 de 5 casos, respectivamente.
[Tabla 7]
Sumario de este ensayo clínicoExpresión del antíg. CTL
Caso Edad/Sexo Vacunación Efecto adv. DTH Eval. lesión Eval. Estado actual
MPHOSPH1 DEPDC1 LNs,
1 79/H 1 tanda No No PD 1,8 mes, muerto ○ ○ No
cerebro SD (4,5
2 72/M en 3 tandas No No Rec. local 5,0 meses, vivo ○ ○ NT
meses) Metást. Respuesta
3 49/H en 4 tandas exantema No 3,7 meses, vivo × ○ Sí
pulm. menor Respuesta
4 74/H en 2 tandas No No Rec. local 1,4 meses, vivo ○ ○ NT
menor 5 78/M en 2 tandas No No Rec. local SD 1,4 meses, vivo ○ ○ NT
NT: no sometido a ensayo
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Claims (1)

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    imagen2
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