ES2545817T3 - Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos MPHOSPH1 - Google Patents

Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos MPHOSPH1 Download PDF

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Takuya Tsunoda
Ryuji Osawa
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Abstract

Un péptido de menos de alrededor de 15 aminoácidos, en el que dicho péptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, 10, o 11, o un péptido de menos de alrededor de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 9, 10, y 11, en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos.

Description

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mostró en el panel inferior. Como control negativo, se prepararon células diana que expresan solamente DEPDC1V2 y que expresaban solamente HLA-A2 con tratamiento de pulso de péptido DEPDC1V1-9-674 o DEP-9-462. Las células diana se prepararon a partir de transfectante de HEK293, que expresó de forma estable HLA-A2 o el tratamiento simulado.
[fig. 18] La Figura 18 representa la expresión antigénica en el Caso 2. En el Caso 2, tanto MPHOSPH1 como DEPDC1 fueron expresados fuertemente. Por lo tanto, se han vacunado dos tipos de péptidos epitópicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
[fig. 19] La Figura 19 representa la evaluación clínica de la recurrencia local de cáncer de vejiga en el Caso 2. El caso 2 se evaluó como enfermedad estable (SD) según los criterios RECIST.
[fig. 20] La Figura 20 representa la expresión antigénica en el Caso 3. En el Caso 3, DEPDC1 se expresó fuertemente. Por lo tanto, se ha vacunado el péptido epitópico derivado de DEPDC1 solo.
[fig. 21] La Figura 21 representa la evaluación clínica del lóbulo derecho de pulmón metastásico en el Caso 3. La tasa de progresión se redujo tras la vacunación. Especialmente, el tamaño del tumor se redujo después de la tercera tanda de vacunaciones.
[fig. 22] La Figura 22 representa la evaluación clínica del lóbulo izquierdo de pulmón metastásico en el Caso
3. La tasa de progresión se redujo tras la vacunación. Especialmente, el tamaño del tumor se redujo después de la tercera tanda de vacunaciones.
[fig. 23] La Figura 23 representa el efecto antitumoral en el Caso 3. La tasa de progresión de tumor metastásico se redujo tras la vacunación.
[fig. 24] La Figura 24 representa la respuesta de TCL específica en el Caso 3. Se mostró una fuerte respuesta de TCL específica tras la vacunación.
[fig. 25] La Figura 25 representa la expresión antigénica en el Caso 4. En el Caso 4, se expresaron MPHOSPH1 y DEPDC1. Por lo tanto, se han vacunado dos tipos de péptidos epitópicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
[fig. 26] La Figura 26 representa la evaluación clínica de la recurrencia local de cáncer de vejiga en el Caso 4. El tamaño del tumor se redujo 20% según los criterios RECIST después de la primera tanda de vacunaciones.
Descripción detallada de la invención
Los términos “un”, “una” y “el” o “la”, como se usan aquí, significan “al menos uno”, excepto que se indique específicamente de otro modo.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por el experto normal en la técnica a la que pertenece esta descripción.
La identificación de nuevos TAAs, particularmente aquellos que inducen respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas, garantiza el desarrollo posterior de la aplicación clínica de la estrategia de la vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon T et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.; Chen YT et al., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 19148.; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-55.; Butterfield LH et al., (1999) Cancer Res 59:3134-42.; Vissers JL et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308-14.; Tanaka F et al., (1997) Cancer Res 57:4465-8.; Fujie T et al., (1999) Int J Cancer 80:169-72.; Kikuchi M et al., (1999) Int J Cancer 81: 459-66.; Oiso M et al., (1999) Int J Cancer 81:387-94.). Como se señala anteriormente, se identificó previamente usando tecnologías de micromatrices de ADNc que MPHOSPH1 (fosfoproteína 1 de la fase M; nº de acceso de GenBank NM_016195; SEC ID Nos: 1, 2) y DEPDC1 (dominio DEP que contiene 1; nº de acceso de GenBank BM683578), más particularmente sus dos variantes DEPDC1V1 (SEC ID Nos: 3, 4) y DEPDC1V2 (SEC ID Nos: 5, 6), estaban sobreexpresados en diversos cánceres. MPHOSPH1 se identificó previamente como una de las proteínas fosforiladas específicamente en la transición G2/M, y se caracterizó como una proteína relacionada con kinesina dirigida al extremo (+) (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.). Más particularmente, se documentó previamente que MPHOSPH1 es un motor molecular dirigido al extremo (+) que desempeña un papel crucial en la citocinesis, y se acumula en la zona media del husillo durante la anafase a la telofase en células HeLa (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8.). El ADNc de MPHOSPH1 codifica una proteína de 1780 aminoácidos que está compuesta de tres dominios: un dominio motor de NH2-quinasina, un dominio de tallo de espiral superenrollada central y un dominio de cola C-globular. Estos datos sugieren que MPHOSPH1 es una proteína relacionada con kinesina de tipo NH2.
La función de la proteína DEPDC1 sigue sin estar clara. El dominio DEP incluido en esta proteína se encuentra en Dishevelled, Egl-10 y Pleckstrina. En particular, el dominio DEP en Dishevelled de Drosophila es esencial para
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rescatar defectos de polaridad plana e induce la señalización de JNK; no obstante, su función en el ser humano todavía no se ha aclarado. Sin embargo, como describe en el documento PCT/JP2006/302684, DEPDC1 (nº interno B5860N) tiene dos variantes transcripcionales diferentes que consisten en 12 y 11 exones, que corresponden a DEPDC1 V1 y V2, respectivamente. Se observaron variaciones alternativas en el exón 8 de V1, y se encontró que los otros exones restantes son comunes a ambas variantes. La variante V2 no tiene el exón 8 del V1, pero genera el mismo codón de parada en el último exón. Las secuencias de ADNc de longitud completa de las variantes B5860NV1 y B5860NV2 consisten en 5318 y 4466 nucleótidos, respectivamente. El ORF de estas variantes comienza dentro de cada exón 1. Eventualmente, los transcritos de V1 y V2 codifican 811 y 527 aminoácidos, respectivamente. Los ARNip suprimieron el crecimiento de células cancerosas. Estos resultados demuestran que DEPDC1 desempeña papeles importantes en el crecimiento de la mayoría de las células cancerosas.
Como se describe en el documento PCT/JP2006/302684, MPHOSPH1 y DEPDC1 están sobreexpresados en cáncer de vejiga, pero muestran una expresión mínima en tejidos normales. Además, se encontró que estos genes tienen una función significativa relacionada con la proliferación celular.
En la presente descripción, se muestra que los péptidos derivados de MPHOSPH1 o DEPDC1 son epítopos de TAA restringidos por HLA-A24 y HLA-A2, un alelo de HLA encontrado habitualmente en las poblaciones japonesa y caucásica. Específicamente, usando sus afinidades de unión por HLA-A24 y a HLA-A2, se identificaron candidatos de péptidos de unión a HLA-A24 y HLA-A2 derivados de MPHOSPH1 o DEPDC1. Tras la estimulación in vitro de células T por células dendríticas (DCs) cargadas con estos péptidos, los CTLs se establecieron con éxito usando MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID NO: 7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEC ID NO: 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID NO: 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID NO: 10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSSKLSNV (SEC ID NO: 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID NO: 12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID NO: 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID NO: 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID NO: 243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID NO: 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID NO: 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID NO: 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID NO: 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID NO: 254)), DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEC ID NO: 255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID NO: 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID NO: 195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID NO: 197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID NO: 209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID NO: 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID NO: 228)) y DEPDC1-A2-10-302 (ILVVCGYITV (SEC ID NO: 230)). Estos CTLs demostraron una potente actividad citotóxica frente a células A24LCL y T2 pulsadas con péptido. Además, clones de CTL derivados de estas células también demostraron citotoxicidad específica frente a células positivas para HLAA24 o HLA-A2 que expresan MPHOSPH1 o DEPDC1, respectivamente. Sin embargo, estos clones de CTL no expresaron actividad citotóxica frente a células que tienen expresión de uno solo de los péptidos, incluyendo HLA-A24, HLA-A2, MPHOSPH1 y DEPDC-1. Juntos, estos resultados sugieren la utilidad de MPHOSPH1 y DEPDC1 como TAAs para células cancerosas, y que MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID NO: 7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEC ID NO: 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID NO: 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID NO: 10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSSKLSNV (SEC ID NO: 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID NO: 12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID NO: 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID NO: 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID NO:243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID NO: 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID NO: 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID NO: 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID NO: 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID NO: 254)), DEPDC1-A02-10-301 (NILGILQPHL (SEC ID NO: 255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID NO: 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID NO: 195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID NO: 197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID NO: 209)), DEPDC1A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID NO: 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID NO:228)) y DEPDC1-A210-302 (ILVVCGYITV (SEC ID NO: 230)) son péptidos epitópicos de cada TAA restringidos por HLA-A24 o HLA-A2. Puesto que estos antígenos están sobreexpresados en la mayoría de los cánceres y están asociados con proliferación de células tumorales, encuentran utilidad como dianas inmunoterapéuticas frente a cánceres. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
En consecuencia, la presente descripción proporciona además métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC-1, por ejemplo cánceres, en un sujeto, incluyendo dichos métodos las etapas de administrar a un sujeto que lo necesite un péptido inmunogénico de menos de alrededor de 40 aminoácidos, a menudo menos de alrededor de 20 aminoácidos, habitualmente menos de alrededor de 15 aminoácidos, y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255. Como alternativa, el péptido inmunogénico puede estar compuesto de una secuencia de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 o 255 en la que 1, 2 o varios (por ejemplo, hasta 5) aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos, con la condición de que el péptido variante resultante retenga la actividad inmunogénica (es decir, la capacidad para inducir CTLs específicos para células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres). El número de restos a sustituir, suprimir, o añadir es generalmente 5 aminoácidos o menos, preferiblemente 4 aminoácidos o menos, más preferiblemente 3 aminoácidos o menos, incluso más preferiblemente
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las publicaciones internacionales nos Hei 11-510507 y 2000-512161, y se preparan preferiblemente usando células presentadoras de antígeno obtenidas a partir de sujetos que son dianas de tratamiento y/o prevención. Los exosomas de esta descripción se pueden inocular como vacunas del cáncer, de forma similar a los péptidos de esta descripción.
El tipo de antígenos HLA usados debe de coincidir con el del sujeto que requiera tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, a menudo es apropiado HLA-A24 o HLA-A2, particularmente HLA-A2402 o HLA-A0201.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna de la presente descripción incluyen un componente que estimula linfocitos T citotóxicos. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de estimular CTL in vivo frente a antígenos víricos. Por ejemplo, los restos de ácido palmítico se pueden unir a los grupos épsilon-y alfaamino de un resto de lisina y después se pueden enlazar a un péptido inmunogénico de la descripción. El péptido lipidado se puede administrar entonces ya sea directamente, en una micela o partícula, se puede incorporar en un liposoma, o se puede emulsionar en un adyuvante. Como otro ejemplo de un cebado lipídico de respuestas de CTL, se pueden usar lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS), para cebar CTL cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres K, et al., (1989) Nature 342:5614.).
Las composiciones inmunogénicas de la presente descripción también pueden incluir ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos inmunogénicos descritos aquí. Véanse, por ejemplo, Wolff JA et al., (1990) Science 247:1465-8; patente de EE.UU. nos 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de suministro basadas en ADN incluyen “ADN desnudo”, suministro facilitado (bupivicaína, polímeros, mediado por péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y suministro mediado por partículas (“pistola génica”) o mediado por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.922.687).
Los péptidos inmunogénicos de la descripción también se pueden expresar por vectores víricos o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen hospedantes víricos atenuados, tales como el virus de la vacuna o el virus de la viruela aviar. Este enfoque implica el uso del virus de la vacuna, por ejemplo como un vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican el péptido. Al introducirlo en un hospedante, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca una respuesta inmunitaria. Los vectores del virus de la vacuna y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, la patente de EE.UU: nº 4.722.848. Otro vector adecuado es BCG (Bacilo de Calmette Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover CK, et al., (1991) Nature 351:456-60. En la técnica se conoce una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización, por ejemplo vectores de adenovirus y virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina del carbunco destoxificado, y similares. Véanse, por ejemplo, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ y Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; e Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.
La presente descripción también proporciona métodos para inducir células presentadoras de antígeno usando uno o más péptidos de esta descripción. Las células presentadoras de antígeno se pueden inducir induciendo células dendríticas de los monocitos de sangre periférica, y poniéndolos entonces en contacto (estimulándolos) con uno o más péptidos descritos in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente descripción se administran a los sujetos, las células presentadoras de antígeno que tienen los péptidos esta descripción inmovilizados a ellas son inducidas en el cuerpo del sujeto. Como alternativa, tras inmovilizar los péptidos de esta descripción a las células presentadoras de antígeno, las células se pueden administrar al sujeto como una vacuna. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
a: recolectar células presentadoras de antígeno de un sujeto, y
b: poner en contacto las células presentadoras de antígeno de la etapa a con un péptido de la presente descripción.
Las células presentadoras de antígeno obtenidas mediante la etapa b se pueden administrar al sujeto como una vacuna.
La descripción también proporciona un método para inducir células presentadoras de antígeno que tienen un nivel elevado de inducibilidad de células T citotóxicas, en el que el método incluye la etapa de transferir in vitro genes compuestos de polinucleótido o polinucleótidos que codifican uno o más péptidos de esta descripción a células presentadoras de antígeno. Los genes introducidos pueden estar en forma de ADN o de ARN. Para el método de introducción, se pueden usar de forma adecuada, sin limitaciones particulares, diversos métodos llevados a cabo convencionalmente en este campo, tales como lipofección, electroporación y método de fosfato de calcio. Más específicamente, la transfección se puede llevar a cabo como se describe en Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7.; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13.; Boczkowski D, et al., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72.; traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº 2000-509281. Al transferir el gen a las células presentadoras de antígeno, el gen sufre la transcripción, la traducción, y similar, en la célula, y entonces la
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proteína obtenida se procesa mediante MHC de Clase I o de Clase II, y continúa a través de una ruta de presentación para presentar péptidos parciales.
La presente descripción proporciona además métodos para inducir CTL usando uno o más péptidos de esta descripción. Cuando los péptidos de esta descripción se administran a un sujeto, se inducen CTL en el cuerpo del sujeto, y de ese modo se potencia la resistencia del sistema inmunitario dirigido contra las células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células cancerosas en los tejidos tumorales. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando. Como alternativa, los péptidos de la presente descripción se pueden usar en el contexto de un método terapéutico ex vivo, en el que células presentadoras de antígeno derivadas y células positivas para CD8
o leucocitos mononucleares de sangre periférica derivados del sujeto se ponen en contacto (son estimulados) con uno o más péptidos de esta descripción in vitro, y, tras inducir CTL, las células se devuelven al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de:
a: recolectar células presentadoras de antígeno del sujeto,
b: poner en contacto las células presentadoras de antígeno de la etapa a con un péptido de la presente invención,
c: mezclar las células presentadoras de antígeno de la etapa b con células T CD8+ y cocultivar para inducir células T citotóxicas; y
d: recolectar células T CD8+ del cocultivo de la etapa c.
Las células T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenidas mediante la etapa d se pueden administrar al sujeto como una vacuna.
La presente descripción proporciona además métodos para producir células T citotóxicas activadas usando los péptidos de esta descripción. Por ejemplo, el método puede incluir las siguientes etapas de:
a: recolectar células T de un sujeto, y
b: poner en contacto células T con los siguientes péptidos.
(1)
un péptido aislado de menos de alrededor de 15 aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255.
(2)
Un péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255, en la que 1, 2, o varios aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos.
La presente descripción también proporciona un método para producir APC que tienen inducibilidad de células T activadas, usando los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, el método puede incluir la etapa de poner en contacto células presentadoras de antígeno con los péptidos para producir células presentadoras de antígeno que presentan el péptido y el antígeno HLA en la superficie.
En el contexto de la presente descripción, la “célula T citotóxica activada” induce producción de IFN-gamma, liberación de IFN-gamma y muerte de células tumorales.
La presente descripción proporciona además células T citotóxicas aisladas inducidas usando los péptidos de esta descripción. Las células T citotóxicas, inducidas mediante estimulación con una célula presentadora de antígeno que presenta uno o más péptidos de esta descripción, derivan preferiblemente de sujetos que son la diana de tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar solos o en combinación con otros fármacos, incluyendo uno o más péptidos de esta descripción o exosomas que tienen actividad antitumoral. Las células T citotóxicas obtenidas actúan específicamente contra células diana que presentan los péptidos de esta descripción, o preferiblemente el mismo péptido o péptidos usados para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan de manera endógena MPHOSPH1 y/o DEPDC1, o células que son transfectadas con genes MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Las células que presentan los péptidos de esta descripción sobre la superficie celular, debido a estimulación con estos péptidos, también pueden convertirse en dianas de ataque.
La presente descripción también proporciona células presentadoras de antígeno que presentan complejos formados entre antígenos HLA y uno o más péptidos de esta descripción. Las células presentadoras de antígeno, obtenidas a través del contacto con los péptidos de esta descripción o los nucleótidos que codifican dichos péptidos, derivan preferiblemente de sujetos que son la diana de tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas, solas o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos, exosomas o células T citotóxicas de la presente descripción.
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En este método, el polipéptido de ensayo se pone en contacto inicialmente con DC, y entonces estas DC se pone en contacto con células T. La detección de células T que tienen efectos citotóxicos frente a las células de interés tras el contacto con DC muestra que el polipéptido de ensayo tiene una actividad induciendo las células T citotóxicas. La actividad de CTL frente a tumores se puede detectar, por ejemplo, usando como indicador la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr. Como alternativa, es bien conocido cómo evaluar el grado de daño de las células tumorales usando la actividad de incorporación de 3H-timidina o la liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador. Además, también se puede examinar midiendo IFN-gamma producido y liberado por CTL en presencia de células presentadoras de antígeno que portan péptidos inmovilizados mediante la visualización usando anticuerpos anti-IFN-gamma, tal como un ensayo ELISPOT.
Aparte de DC, también se pueden usar como la APC células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs). Se da a conocer que la inducción de CTL está potenciada al cultivar PBMC en presencia de GM-CSF e IL-4. De forma similar, se ha mostrado que CTL es inducido al cultivar PBMC en presencia de hemocianina de lapa californiana (KLH) e IL-7.
Los polipéptidos de ensayo que se confirmó que poseen actividad inductora de CTL por estos métodos son polipéptidos que tienen efecto de activación de DC y actividad inductora de CTL subsiguiente. Por lo tanto, los polipéptidos que inducen CTL frente a células tumorales son útiles como vacunas frente a enfermedades asociadas con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Además, las APC que han adquirido la capacidad para inducir CTL frente a una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, mediante la puesta en contacto con los polipéptidos son útiles como vacunas frente a la enfermedad. Además, los CTL que han adquirido citotoxicidad debido a la presentación de los antígenos polipeptídicos mediante APC también se pueden usar como vacunas frente a una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Tales métodos terapéuticos para una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, usando inmunidad antitumoral debido a APC y CTL, se denominan como inmunoterapia celular. Los cánceres contemplados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
Generalmente, cuando se usa un polipéptido para inmunoterapia celular, la eficiencia de la inducción de CTL se puede incrementar combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen diferentes estructuras y poniéndolos en contacto con DC. Por lo tanto, cuando se estimulan DC con fragmentos proteicos, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.
La inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido se puede confirmar adicionalmente observando la inducción de la producción de anticuerpos frente a tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos frente a un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando se suprime el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de células tumorales por esos anticuerpos, se determina que el polipéptido induce inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral se puede inducir administrando una vacuna de esta descripción, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y prevención de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. La terapia contra o la prevención del comienzo de una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, puede incluir la inhibición del crecimiento de células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células cancerosas, involución de esas células y supresión de la aparición de esas células, por ejemplo células cancerosas. La disminución de la mortalidad de individuos que tienen una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, la disminución de los marcadores de la enfermedad en la sangre, el alivio de síntomas detectables que acompañan a la enfermedad, y similares, también están incluidos en la terapia o prevención de la enfermedad, por ejemplo cánceres. Tales efectos terapéuticos y preventivos son preferiblemente estadísticamente significativos, por ejemplo observados a un nivel de significancia de 5% o menos, en el que el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, se compara con un control sin la administración de la vacuna. Por ejemplo, para determinar la significancia estadística, se puede usar la prueba de la t de Student, la prueba de la U de Mann-Whitney o ANOVA.
Ya que la presente descripción proporciona un método para tratar, o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, los compuestos o composiciones terapéuticas se pueden administrar profiláctica o terapéuticamente a sujetos que sufren o tienen riesgo de (o son susceptibles a) desarrollar la enfermedad. Tales sujetos se pueden identificar usando métodos clínicos estándar. En el contexto de la presente descripción, la administración profiláctica se produce antes de la manifestación de síntomas clínicos manifiestos de la enfermedad, de manera que se previene o como alternativa se retrasa el avance de una enfermedad o trastorno. En el contexto del campo de la medicina, el término “prevenir” engloba cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbilidad de la enfermedad. La prevención se puede producir a los niveles de prevención primaria, secundaria y terciaria. Mientras que la prevención primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención engloban actividades destinadas a prevenir el avance de una enfermedad y la aparición de síntomas, así como a reducir el impacto negativo de una enfermedad ya establecida restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad.
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En el contexto del tratamiento del cáncer el término “eficaz” se refiere a un tratamiento que conduce a una disminución del tamaño, prevalencia o potencial metastásico de cáncer en un sujeto. Cuando un tratamiento se aplica profilácticamente, “eficaz” significa que el tratamiento retrasa o previene la aparición de cáncer o alivia un síntoma clínico de cáncer. La evaluación de cáncer se puede realizar usando protocolos clínicos estándar. Además, la eficacia de un tratamiento se puede determinar junto con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar cáncer. Por ejemplo, el cáncer se puede diagnosticar histopatológicamente, o identificando anomalías sintomáticas.
El péptido mencionado anteriormente, que tiene actividad inmunológica, o un polinucleótido o vector que codifica tal péptido, se puede combinar con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria frente al péptido cuando se administra junto (o sucesivamente) con el péptido que tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen toxina colérica, toxina de Salmonella, alumbre y similar, pero no se limitan a ellos. Además, una vacuna de esta descripción se puede combinar apropiadamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales portadores son agua esterilizada, disolución salina fisiológica, tampón de fosfato, fluido de cultivo, y similar. Además, la vacuna puede contener, según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. La vacuna se administra sistémica o localmente. La administración de la vacuna se puede llevar a cabo mediante administración única o se puede revacunar mediante múltiples administraciones.
Cuando se usa APC o CTL como la vacuna de esta descripción, una enfermedad asociada con la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, se puede tratar o prevenir, por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recolectan PBMCs del sujeto que recibe tratamiento o prevención, y se ponen en contacto ex vivo con un péptido de la presente descripción. Tras la inducción de APC o CTL, las células se pueden administrar al sujeto. Las APC también se pueden inducir introduciendo un vector que codifica el péptido en PBMCs ex vivo. APC o CTL inducidos in vitro se pueden clonar antes de la administración. La inmunoterapia celular se puede llevar a cabo de forma más eficaz clonando y cultivando células que tienen actividad elevada de producción de daño a células diana. Además, APC y CTL aislados de esta manera se pueden usar para la inmunoterapia celular no solo frente a individuos de los que derivan las células, sino también frente a tipos de enfermedades similares en otros individuos.
Los aspectos de la presente descripción se describen en los siguientes ejemplos, que se presentan solamente para ilustrar la presente descripción y para ayudar a un experto normal en la realización y uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar de otro modo el alcance de la descripción.
Aunque en la práctica o ensayo de la presente descripción se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.
EJEMPLOS
En lo sucesivo, la presente descripción se ejemplifica, pero no se restringe, mediante los siguientes Ejemplos. Sin embargo, los materiales, métodos, y similares descritos aquí solo ilustran aspectos de la descripción y de ningún modo están destinados a limitar el alcance de presente descripción. Como tal, en la práctica o ensayo de la presente descripción se pueden usar materiales, métodos y demás similares o equivalentes a los descritos aquí.
EJEMPLO 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas celulares
Las células A24LCL (HLA-A24/24), las líneas celulares linfoblastoides B humanas, células T2 y COS7 se adquirieron de ATCC.
Selección de péptidos candidatos derivados de MPHOSPOH1 y DEPDC1
Los péptidos 9-meros y 10-meros derivados de MPHOSPOH1 o DEPDC1 que se unen a una molécula HLA-A*2402 y HLA-A*0201 se predijeron usando el software de predicción de unión “BIMAS” (bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.; 152(1):163-75.; Kuzushima K, et al., (2001) Blood.; 98(6):1872-81.). Estos péptidos se sintetizaron por Sigma (Sapporo, Japón) según el método de síntesis en fase sólida estándar, y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos se determinaron mediante HPLC analítica y análisis de espectrometría de masas, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml y se almacenaron a -80 grados C.
Inducción de CTL in vitro
Como células presentadoras de antígenos (APCs), se usaron células dendríticas (DCs) derivadas de monocitos para inducir respuestas de CTL frente a péptidos presentados sobre HLA. Las DCs se generaron in vitro como se describió en otra parte (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7., Tsai V et al., (1997) J. Immunol 158:1796802.). De forma breve, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un voluntario normal (HLA
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A*2402 y/o HLA-A*0201) mediante disolución de Ficoll-Paque (Pharmacia) se separaron mediante adherencia a un matraz de cultivo tisular de plástico (Becton Dickinson) para enriquecerlas en la fracción monocítica. La población enriquecida en monocitos se cultivó en presencia de 1000 U/ml de GM-CSF (Genzyme) y 1000 U/ml de IL-4 (Genzyme) en AIM-V (Invitrogen) que contiene suero autólogo (AS) inactivado por calor al 2%. Después de 7 días en el cultivo, las DCs generadas con citocinas se pulsaron con 20 mcg/ml de los péptidos sintetizados en presencia de 3 mcg/ml de beta 2-microglobulina durante 4 h a 20 grados C en AIM-V. Estas DCs pulsadas con péptido se inactivaron entonces mediante MMC (30 mcg/ml durante 30 min.) y se mezclaron en una relación 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas mediante selección positiva con Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) y DETACHa BEAD™ (Dynal). Estos cultivos se montaron en placas de 48 pocillos (Corning); cada pocillo contenía 1,5x104 DCs pulsadas con péptido, 3x105 células T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (Genzyme) en 0,5 ml de AIM-V/AS al 2%. Tres días más tarde, estos cultivos se suplementaron con IL-2 (CHIRON) hasta una concentración final de 20 IU/ml. En los días 7 y 14, las células T se volvieron a estimular adicionalmente con las DCs pulsadas con péptido autólogas. Las DCs se prepararon cada vez de la misma manera como se describió anteriormente. CTL se sometió a ensayo frente a células A24LCL pulsadas con péptido o células T2 después de la tercera ronda de estimulación peptídica el día 21.
Procedimiento de expansión de CTL
Los CTLs se expandieron en cultivo usando el método similar al descrito por Riddell SR, et al., (Walter EA et al., (1995) N Engl J Med 333:1038-44.; Riddel SR, et al., (1996) Nature Med. 2:216-23.). Un total de 5x104 de CTLs se resuspendieron en 25 ml de AIM-V/AS al 5% con 2 tipos de líneas celulares linfoblastoides B humanas, inactivadas mediante MMC, en presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de iniciar los cultivos, se añadieron 120 IU/ml de IL-2 a los cultivos. Los cultivos se alimentaron con AIM-V/AS al 5% reciente que contiene 30 IU/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11.
Establecimiento de clones de CTL
Se realizaron diluciones para obtener 0,3, 1 y 3 CTLs/pocillo en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (Nalge Nunc International). Los CTLs se cultivaron con 7x104 células/pocillo de 2 tipos de líneas celulares linfoblastoides B humanas, 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en total de 150 mcl/pocillo de AIM-V que contenía AS al 5%. 10 días más tarde, se añadieron al medio 50 mcl/pocillo de IL-2, de manera que IL-2 alcanzase 125 U/ml en la concentración final. La actividad de CTL de los CTL se sometió a ensayo en el día 14, y los clones de CTL se expandieron usando el mismo método anterior.
Actividad específica de CTL
Para examinar la actividad específica de CTL, se llevaron a cabo el ensayo ELISPOT de IFN-gamma y el ELISA de IFN-gamma.
De forma breve, se preparó célula A24-LCL o T2 pulsada con péptido (1x104/pocillo) como célula estimuladora. Como células respondedoras, se usaron células cultivadas en 48 pocillos, o clones de CTL tras dilución limitante. El ensayo ELISPOT de IFN-gamma y el ELISA se llevaron a cabo siguiendo el procedimiento del fabricante.
Cultivo celular y transfección
Se establecieron B-LCLs HLA-A24 (A24LCL), transformadas con virus de Epstein-Barr. Jiyoye, EB-3, COS7, HT1376, RT-4 y J82 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). A24LCL, Jiyoye y EB-3 se mantuvieron en RPMI1640 que contenía suero fetal bovino al 10% (GEMINI Bio-products) y disolución de antibiótico al 1% (Sigma). COS7, HT1376, RT-4 y J82 se mantuvieron en medio apropiado y antibióticos. La transfección de COS7 y HEK se realizó usando FUGENE6 (Roche). La célula HEK-A2, un clon estable que expresa la molécula HLA-A*0201, se estableció mediante transfección del plásmido pcDNA6.2-HLA-A2 y se aisló mediante el método de dilución limitante en presencia de 5 mcg/ml de blasticidina S.
Inmunogenicidad de péptidos epitópicos en ratones BALB/c
Para la inducción de los CTLs específicos de péptido, la inmunización se proporcionó usando 100 ml de mezcla de vacuna, que contiene 50 mcl (100 mcg) de péptido restringido por HLA-A24 y 50 mcl de IFA por ratón. La vacuna se inyectó subcutáneamente en el flanco derecho para la primera inmunización en el día 0, y en el flanco izquierdo para la segunda en el día 7. En el día 14, los esplenocitos de los ratones vacunados, sin ninguna estimulación in vitro, se usaron como células respondedoras, y como células estimuladoras para el ensayo ELISPOT de IFN-gamma se usaron las células RLmale1 pulsadas con o sin péptidos.
RESULTADOS
Expresión potenciada de MPHOSPH1 y DEPDC1 en cánceres
Los datos globales del perfil de expresión génica obtenidos de diversos cánceres usando micromatrices de ADNc revelaron que la expresión de MPHOSPH1 (nº de acceso de GenBank NM_016195; SEC ID No. 1) y DEPDC1 (nº de acceso de GenBank BM683578), que tuvo dos variantes: DEPDC1 V1 (SEC ID Nos. 3) y DEPDC1 V2 (SEC ID No.
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Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO. de unión
236
LYGSLTNSL 18 288 1421 KWLEEKMML 35 14,4
1446
KYAEDRERF 19 240 1617 KSNEMEEDL 36 14,4
899
NYDIAIAEL 20 220 1555 KIEDGSVVL 37 14,4
1118
CYKAKIKEL 21 220 1456 KQQNEMEIL 38 12
57
DYLQVCLRI 22 105 389 KTQNEGERL 39 12
676
KFNQIKAEL 23 92,4 1371 KWKEKCNDL 40 11,52
14
SYVFSADPI 24 75 1122 KIKELETIL 41 11,52
326
AYRLLKLGI 25 60 850 FLLTIENEL 42 11,088
255
DYEQANLNM 26 37,5 763 SSLIINNKL 43 11,088
29
NFDGIKLDL 27 28 1400 KLTNLQDEL 44 10,56
286
LFVPVSSKF 28 27,72 133 IMQPVKDLL 45 10,08
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de MPHOSPH1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 2B] Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de MPHOSPH1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Unión partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO.
1414
KYNADRKKWL 46 600 1274 KLLRIKINEL 56 15.84
278
IYNEYIYDLF 8 252 1332 KIIEDMRMTL 57 14,4
1446
KYAEDRERFF 47 240 1299 RTIQQLKEQL 58 14,4
611
QYWAQREADF 48 100 1134 KVECSHSAKL 59 13,2
1740
LYTSEISSPI 49 70 859 KNEKEEKAEL 60 13,2
293
KFQKRKMLRL 50 60 586 KLINEKKEKL 61 13,2
849
AFLLTIENEL 51 55,44 943 KLMHTKIDEL 62 13,2
1667
TYSLRSQASI 52 50 838 RVLQENNEGL 63 12
1695
DFLQHSPSIL 53 30 369 RVIRVSELSL 64 12
174
RTLNVLFDSL 54 17,28 1159 RNLKEFQEHL 65 12
870
KQIVHFQQEL 55 15,84 281 EYIYDLFVPV 66 10,8
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de MPHOSPH1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
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[Tabla 3B] Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Unión partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO.
1274
KLLRIKINEL 56 626,279 1318 QQYERACKDL 140 28,417
551
KLLDEDLDKT 122 445,913 452 MIVNISQCYL 141 27,464
460
YLAYDETLNV 123 319,939 923 KLSNEIETAT 142 26,082
943
KLMHTKIDEL 62 311,777 1257 KQIKQVQKEV 143 24,681
262
NMANSIKFSV 124 291,346 980 NLPNTQLDLL 144 24,075
178
VLFDSLQERL 125 269,948 985 QLDLLGNDYL 145 23,029
770
KLICNETVEV 126 243,432 1427 MMLITQAKEA 146 22,569
34
KLDLSHEFSL 127 173,463 1523 QIMDIKPKRI 147 21,762
407
LLTLGKCINV 128 118,238 1484 QLVAALEIQL 148 21,362
1714
TMSSSKLSNV 11 115,534 466 TLNVLKFSAI 149 19,822
1353
QVLEAKLEEV 129 104,046 511 KILNVKRATI 150 18,577
880
SLSEKKNLTL 130 87,586 1340 TLEEQEQTQV 151 18,25
235
TLYGSLTNSL 131 68,36 372 RVSELSLCDL 152 17,627
1019
AIWEECKEIV 132 65,381 1561 VVLDSCEVST 153 16,816
552
LLDEDLDKTL 133 59,558 309 YSFIKDLQWI 154 14,663
1093
VTLDVQIQHV 134 57,298 353 SIFTVKILQI 155 12,208
559
KTLEENKAFI 135 42,314 1094 TLDVQIQHVV 156 11,407
1332
KIIEDMRMTL 57 42,151 1688 GTLQKFGDFL 157 11,242
152
GLTNSGKTYT 136 40,986 311 FIKDLQWIQV 158 10,732
830
NIAEIEDIRV 137 39,21 1079 TLIQQLKEEL 159 10,468
586
KLINEKKEKL 61 36,637 1128 TILETQKVEC 160 10,363
182
SLQERLYTKM 138 30,553 1487 AALEIQLKAL 161 10,352
1043
QQIEKLQAEV 139 28,912 170 GILPRTLNVL 162 10,249
870
KQIVHFQQEL 55 28,807
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de MPHOSPH1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
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[Tabla 4A] Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión partida aminoácidos NO. de unión
295
YYELFVNIL 163 360 505 KQLCRSQSL 167 14,4
294
EYYELFVNI 12 86,4 275 VFRTIADYF 168 14
282
YFLDLPEPL 164 43,2 36 HFKKYGNCF 169 12
118
RYPELRKNN 165 21,6 307 GYITVSDRS 170 10,5
338
SFKSTECLL 166 20 298 LFVNILGLL 171 42
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de DEPDC1. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 4B]
Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
Posición de partida
Secuencia de aminoácidos SEC ID NO. Puntuación de unión Posición de partida Secuencia de aminoácidos SEC ID NO. Puntuación de unión
294
EYYELFVNIL 172 288 275 VFRTIADYFL 182 20
281
DYFLDLPEPL 173 240 113 KTLPRRYPEL 183 15,84
118
RYPELRKNNI 174 216 277 RTIADYFLDL 184 14,4
770
EYPLIYQKRF 175 150 270 GFERDVFRTI 185 12,6
267
TYVGFERDVF 176 150 146 RTPKRHGLHL 186 12
523
SYINTPVAEI 177 82,5 505 KQLCRSQSLL 187 12
282
YFLDLPEPLL 178 36 340 KSTECLLLSL 188 11,52
191
RYVILIYLQT 179 21 295 YYELFVNILV 189 10,5
338
SFKSTECLLL 180 20 129 NFSKDKDSIF 190 10
103
LFRFPATSPL 181 20
La posición de partida indica el número de aminoácido desde el término N de DEPDCI. La puntuación de unión deriva de “BIMAS” descrita en Materiales y Métodos
[Tabla 5A] Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de DEPDC1
Posición de Secuencia de SEC ID Puntuación Posición Secuencia de SEC ID Puntuación partida aminoácidos NO. de unión de partida aminoácidos NO. de unión
674
FLMDHHQEI 191 728,022 563 RLCKSTIEL 209 21,362
589
LLQPHLERV 192 133,255 506 QLCRSQSLL 210 21,362
575
SLLPASSML 193 79,041 193 VILIYLQTI 211 20,753
246
WVLSAMKCL 194 73,172 297 ELFVNILVV 212 18,201
619
LLMRMISRM 195 71,872 235 ILQNKSDDL 213 17,795
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Los pacientes enrolados con cáncer de vejiga con HLA-A*2402, cuyos tumores expresan fosfoproteína 1 de fase M (MPHOSPH1) y/o dominio DEP que contiene 1 (DEPDC1), se inmunizaron con los péptidos epitópicos restringido por HLA-A*2402 MPHOSPH1-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID NO: 7)) y/o DEPDC1-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID NO: 12)). Cada péptido se combinó con 1 ml de adyuvante incompleto de Freund (IFA, (MONTANIDE *ISA51) y se
5 inyectó subcutáneamente en una lesión axilar o inguinal una vez a la semana. Una inyección durante cuatro veces se define como una tanda, y tras 1 tanda para la evaluación inmunológica y clínica, se extrajo sangre y se llevó a cabo CT/MRI.
Evaluación de seguridad
La evaluación del efecto adverso se llevó a cabo junto con los criterios de toxicidad comunes del National Cancer 10 Institute, versión 3 (NCI-CTC ver. 3).
Evaluación inmunológica
Éste es un criterio de evaluación secundario en este estudio, y confirmamos si la respuesta de CTL específica del péptido se produjo o no. La respuesta de CTL específica se midió según lo siguiente: se recolectaron células mononucleares de sangre periférica, y se reestimularon mediante los péptidos apropiados. La respuesta de CTL se
15 sometió a ensayo en el día 14º mediante el ensayo ELISPOT de IFN-g.
Evaluación de efectos antitumorales
La evaluación de la respuesta clínica se llevó a cabo según los criterios RECIST.
RESULTADOS
La Tabla 7 muestra el sumario de este ensayo clínico. No hubo efectos secundarios graves, excepto exantema de
20 grado 2 del Caso 3. Se obtuvo una respuesta menor (Caso 3) y una respuesta mixta (Caso 4). La expresión de MPHOSPH1 se produjo en 4 de 5 casos, mientras que la de DEPDC1 se produjo en 5 de 5 casos, respectivamente.
[Tabla 7]
Sumario de este ensayo clínicoExpresión del antíg. CTL
Caso Edad/Sexo Vacunación Efecto adv. DTH Eval. lesión Eval. Estado actual
MPHOSPH1 DEPDC1 LNs,
1 79/H 1 tanda No No PD 1,8 mes, muerto ○ ○ No
cerebro SD (4,5
2 72/M en 3 tandas No No Rec. local 5,0 meses, vivo ○ ○ NT
meses) Metást. Respuesta
3 49/H en 4 tandas exantema No 3,7 meses, vivo × ○ Sí
pulm. menor Respuesta
4 74/H en 2 tandas No No Rec. local 1,4 meses, vivo ○ ○ NT
menor 5 78/M en 2 tandas No No Rec. local SD 1,4 meses, vivo ○ ○ NT
NT: no sometido a ensayo
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Caso 2
En el Caso 2, se enroló en este ensayo clínico una mujer de 72 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado con fracaso de la quimioterapia estándar. En la figura 18, la expresión antigénica de su tumor reveló que tanto MPHOSPH1 como DEPDC1 estaban fuertemente expresados. Por lo tanto, vacunamos dos tipos de péptidos epitópicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1. El Caso 2 tuvo recurrencia local del cáncer de vejiga. Se evaluó como enfermedad estable (SD) según los criterios RECIST (Figura 19).
Caso 3
En el Caso 3, se enroló en este ensayo clínico un hombre de 49 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado con fracaso de la quimioterapia estándar. Solamente DEPDC1 estaba expresado fuertemente (Figura 20). Por lo tanto, vacunamos el péptido epitópico derivado de DEPDC1 solo. El Caso 3 tuvo múltiples metástasis pulmonares del cáncer de vejiga. En los lóbulos derecho (Figura 21) e izquierdo (Figura 22) de las metástasis pulmonares, la tasa de progresión disminuyó tras la vacunación. Especialmente, el tamaño del tumor disminuyó después de la 3ª tanda. La Figura 23 muestra el efecto antitumoral según los criterios RECIST. Estaba claro que la tasa de progresión del tumor metastásico disminuyó tras la vacunación. Se manifiesta que se obtuvo una respuesta menor mediante la vacunación usando péptido epitópico derivado de DEPDC1. En términos de evaluación inmunológica del Caso 3, la respuesta de CTL específica se midió antes y después de la vacunación. Se observó fuertemente una respuesta de CTL específica tras la vacunación (Figura 24). Se manifiesta claramente que CTL inducido por el péptido epitópico derivado de DEPDC1 puede mostrar efecto antitumoral.
Caso 4
En el Caso 4, se enroló en este ensayo clínico un hombre de 74 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado con fracaso de la quimioterapia estándar. MPHOSPH1 y DEPDC1 se expresaron a partir de este tumor (Figura 25). Por lo tanto, vacunamos dos tipos de péptidos epitópicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1. El Caso 4 tuvo recurrencia local del cáncer de vejiga. Tras 1 tanda de vacunaciones, el tamaño del tumor se redujo 20% según los criterios RECIST (Figura 26). Sin embargo, aparecieron nuevas lesiones metastásicas en el pulmón. Se manifiesta que se obtuvo respuesta mixta mediante la vacunación usando dos tipos de péptidos epitópicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
DISCUSIÓN
A continuación se describe el fundamento de este ensayo clínico:
1.Puesto que MPHOSPH1 y DEPDC1 no se expresan en tejidos normales excepto en los testículos, ambos antígenos son muy específicos de tumores.
2.Se considera que estos péptidos tienen una fuerte inmunogenicidad, puesto que se establecieron CTL potentes y específicos por estos péptidos epitópicos.
3.Hay un 60% de la población japonesa con HLA-A*2402.
4.Estos péptidos son suficientemente estables desde el punto de vista químico para aplicarlos al ensayo clínico.
El fin de este estudio es obtener información clínica de su toxicidad, respuesta inmunológica y actividad antitumoral.
Los efectos adversos previamente dados a conocer del ensayo clínico de vacunas que usan péptidos son síntomas similares a la gripe, tales como fiebre, cefalea y malestar. En casos raros, se ha informado de una reacción radical de la piel con ampollas, considerada como reactividad cruzada transitoria en el sitio de inyección. En este estudio, no hubo efectos adversos graves, excepto exantema de grado 2 en el Caso 3. Este paciente tuvo una historia clínica de exantema durante la quimioterapia. Se manifiesta que este efecto adverso no se origina de esta vacunación, y por lo tanto este protocolo puede ser seguro.
Se llevó a cabo un análisis inmunológico mediante inducción de una respuesta de CTL específica frente a la vacunación. En el Caso 1, no se obtuvo respuesta de CTL específica tras la vacunación (datos no mostrados). En el Caso 3, se obtuvo claramente una respuesta de CTL específica frente a péptido derivado de DEPDC1 tras la 1ª y la 2ª tanda de vacunaciones. En el Caso 3, se obtuvo un efecto antitumoral mediante la vacunación. Se demuestra claramente que este péptido derivado de DEPDC1 mostró efecto antitumoral frente a cáncer de vejiga al inducir CTL específicos.
En el Caso 4, solamente después de la 1ª tanda de vacunaciones, se obtuvo claramente un efecto antitumoral frente a la recurrencia local del cáncer de vejiga. Estas pruebas apoyan fuertemente que estos péptidos epitópicos muestran efecto antitumoral frente a cáncer de vejiga.
En conclusión, estaba claro que esta terapia epitópica era segura, y además mostró un fuerte efectos antitumoral sin efectos secundarios graves.
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Aplicabilidad industrial
La presente descripción identifica nuevos TAAs, particularmente aquellos que inducen respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas. Dichos TAAs justifican el desarrollo posterior como vacunas peptídicas frente a enfermedades asociadas con MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres.
Aunque la descripción se ha descrito con detalle y con referencia a sus realizaciones específicas, se ha de entender que la descripción anterior es de naturaleza ejemplar y explicativa, y está destinada a ilustrar la descripción y sus realizaciones preferidas. Mediante experimentación habitual, un experto en la técnica reconocerá fácilmente que se pueden realizar en ellas diversos cambios y modificaciones sin separarse del espíritu ni del alcance de la descripción. De este modo, la descripción está destinada a estar definida no por la descripción anterior sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.
Además, la presente invención se refiere a los siguientes apartados:
[1] Un péptido aislado que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido deriva de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 4 o 6.
[2] Un péptido aislado de menos de alrededor de 15 aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 8 y 12, o un péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 7, 8 y 12, en la que 1, 2, o varios aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos.
[3] El péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas del apartado 2, en el que el segundo aminoácido desde el término N es fenilalanina, tirosina, metionina, o triptófano.
[4] El péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas del apartado 2, en el que el aminoácido Cterminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano, o metionina.
[5] Un péptido aislado de menos de alrededor de 15 aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 y 255, o un péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 y 255, en la que 1, 2, o varios aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos.
[6] El péptido que tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos del apartado 5, en el que el segundo aminoácido desde el término N es leucina o metionina.
[7] El péptido que tiene inducibilidad de células T citotóxicas del apartado 5, en el que el aminoácido Cterminal es valina o leucina.
[8] Un vector en el que el ADN codifica péptidos de uno cualquiera de los apartados 1 a 7.
[9] Una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la sobreexpresión de los genes de SEC ID NO: 1, 3 y/o 5, comprendiendo dicha composición uno o más péptidos del apartado 2 o
5.
[10] La composición farmacéutica del apartado 9, en la que la enfermedad es cáncer.
[11] La composición farmacéutica del apartado 10, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido blando.
[12] Un exosoma que presenta sobre su superficie un complejo que comprende un péptido del apartado 2 o 5 y un antígeno HLA.
[13] El exosoma del apartado 12, en el que el antígeno HLA es HLA-A24.
[14] El exosoma del apartado 13, en el que el antígeno HLA es HLA-A2402.
[15] El exosoma del apartado 12, en el que el antígeno HLA es HLA-A2.
[16] El exosoma del apartado 13, en el que el antígeno HLA es HLA-A0201.
[17] Un método para inducir células presentadoras de antígeno que tienen una inducibilidad de células T citotóxicas elevada, que comprende la etapa de poner en contacto una célula presentadora de antígeno con un péptido del apartado 2 o 5.

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