ES2529453T3 - Nuevas composiciones de liposomas - Google Patents

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ES2529453T3 ES06737793.7T ES06737793T ES2529453T3 ES 2529453 T3 ES2529453 T3 ES 2529453T3 ES 06737793 T ES06737793 T ES 06737793T ES 2529453 T3 ES2529453 T3 ES 2529453T3
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Tadayuki Ibuki
Donghyun Kim
Tadashi Fujisawa
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Abstract

Un liposoma dirigido que comprende: uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, un fármaco encapsulado o compuesto marcado y, al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico; en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50μg por mg de lípido; y en el que: la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,**Fórmula** y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-()-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,**Fórmula** en la que: R1, R2, R5 y R6 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol o fosfatidilcolina de huevo, en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,**Fórmula** en las que: R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10; y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.

Description

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DESCRIPCIÓN
Nuevas composiciones de liposomas
Antecedente de la invención
La eficacia de los tratamientos de muchas enfermedades, incluyendo cáncer, ha mejorado drásticamente en las últimas décadas pasadas, sin embargo, muchos regímenes de tratamiento requieren el uso de fármacos con efectos secundarios perjudiciales incluyendo, por ejemplo, alopecia, náusea, vómito, cansancio, etc. Algunos regímenes de tratamiento pueden también implicar el uso de fármacos que no son estables en condiciones fisiológicas, por ejemplo, agentes bioterapéuticos (por ejemplo, genes o productos génicos) y/u otros fármacos que se degradan fácilmente o se alteran de otra manera tras la administración y pierden por tanto su eficacia antes de conseguir el resultado terapéutico deseado. Dicha inestabilidad hace que los fármacos sean más difíciles y costosos de almacenar y preparar para su administración.
Existen numerosas clases de agentes anticancerosos que abarcan cerca de 100 grupos individuales, así como numerosos tratamientos combinados de fármacos, métodos de administración y regímenes de tratamiento. Los agentes anticancerosos pueden clasificarse de acuerdo con varios criterios, tales como la clase de compuesto y patología tratados. Se han desarrollado determinados agentes que aprovechan la rápida división de las células cancerosas y de las fases específicas de las dianas en el ciclo celular, proporcionando otro método de clasificación. Los agentes se pueden agrupar también de acuerdo con el tipo y la gravedad de sus efectos secundarios o el método de administración. Sin embargo, la clasificación más común de los agentes anticancerosos basados en composiciones no bioterapéuticas es por la clase de compuesto químico, que abarca ampliamente el mecanismo de acción de estos compuestos.
Dependiendo de la fuente de referencia consultada, existen ligeras diferencias en la clasificación de los agentes anticancerosos. Las clases de compuestos se describen en la Physician’s Desk Reference como sigue: alcaloides; agentes alquilantes; antibióticos antitumorales; antimetabolitos; hormonas y análogos de hormonas; inmunomoduladores; agentes fotosensibilizantes; y diversos agentes diferentes.
La clase alcaloide de compuestos puede denominarse también como inhibidores mitóticos, ya que son específicos de la fase del ciclo celular y sirven para inhibir la mitosis o inhibir las enzimas necesarias para la mitosis. Se derivan generalmente de alcaloides vegetales y otros productos naturales y trabajan durante la fase M del ciclo celular. Esta clase de compuestos se usa a menudo para tratar neoplasias tales como leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin; neuroblastomas y cánceres de pulmón, mama y testículos.
Los agentes alquilantes constituyen una gran clase de agentes quimioterapéuticos, que incluyen las siguientes subclases, que representan cada una numerosos fármacos individuales; alquil sulfonatos; aziridinas; etileniminas y metilmelaminas; mostazas de nitrógeno; nitrosoureas; y otros, incluyendo compuestos de platino. Los agentes alquilantes atacan las células neoplásicas alquilando directamente el ADN de las células y haciendo de esta manera que el ADN no sea competente para su replicación. Esta clase de compuestos se usa comúnmente para tratar varias enfermedades, que incluyen las leucemias crónicas, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple y determinados cánceres de pulmón, mama y ovario.
Las nitrosoureas se clasifican a menudo como agentes alquilantes, y tienen un mecanismo similar de acción, pero en vez de alquilar directamente el ADN, inhiben las enzimas que reparan el ADN produciendo un fallo en la replicación. Estos compuestos tienen la ventaja de poder cruzar la barrera hematoencefálica y se pueden usar por tanto para tratar tumores cerebrales.
Los antibióticos antitumorales tienen actividad antimicrobiana y citotóxica e interfieren también con el ADN inhibiendo químicamente las enzimas y la mitosis o alterando las membranas celulares. No son específicos de la fase del ciclo celular y se usan ampliamente para tratar varios cánceres.
La clase de antimetabolitos de los agentes anticancerosos interfieren con el crecimiento del ADN y el ARN y son específicos de la fase S del ciclo celular. Pueden degradarse además según el tipo de compuesto, que incluye análogos de ácido fólico, análogos de purina, y análogos de pirimidina. Se emplean a menudo en el tratamiento de la leucemia crónica, tumores de mama, de ovario, y gastrointestinales.
Existen dos clases de hormonas o análogos de hormonas usados como agentes anticancerosos, las hormonas corticoesteroides y las hormonas sexuales. Aunque algunas hormonas corticoesteroides pueden destruir las células cancerosas y ralentizar el crecimiento de los tumores, y se usan en el tratamiento del linfoma, leucemias, etc., las hormonas sexuales funcionan principalmente para ralentizar el crecimiento de los cánceres de mama, próstata y endometriales. Existen numerosas subclases de hormonas y análogos de hormonas, incluyendo, andrógenos, antiadrenérgicos, antiandrógenos, antiestrógenos, inhibidores de la aromatasa, estrógenos, análogos de hormonas liberadoras de hormonas luteneizantes (LHRH) y progestinas.
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Una clase más pequeña adicional de agentes anticancerosos se clasifica como inmunoterapia. Son agentes previstos para estimular el sistema inmune para atacar más eficazmente las células neoplásicas (cancerosas). Este tratamiento se usa a menudo combinado con otros tratamientos.
Existen también numerosos compuestos, tal como campotectinas, que se relacionan generalmente como 'otros' agentes anticancerosos y se pueden usar para tratar varias neoplasias.
Se utilizan también combinaciones de agentes anticancerosos en el tratamiento de numerosos cánceres. Por ejemplo, Sanofi Syntholabo comercializa ELOXATIN™ (oxaliplatino para inyección) para el tratamiento del cáncer colorrectal para uso en una combinación con 5-fluorouracilo y leuvocorina. Esta combinación de fármacos se usa a menudo de forma auxiliar con cirugía en el tratamiento del cáncer colorrectal. El oxaliplatino es un agente alquilante que se cree que actúa inhibiendo la replicación y la transcripción del ADN. A diferencia de otros agentes de platino, oxaliplatino he demostrado una disminución en la probabilidad de aparición de resistencia. Oxaliplatino se describe además en las patentes de los Estados Unidos: números 4.169.846; 5.338.874; 5.298.642; 5.959.133; 5.420.319; 5.716.988; 5.290.961; y en Wilkes GM. "New therapeutic options in colon, cancer: focus on oxaliplatin" Clin J Oncol Nurs. (2002) 6:131-137.
Aunque que existe una plétora de agentes anticancerosos, el beneficio de estos compuestos se compensa por la gravedad de los efectos secundarios producidos por el agente. Esta comparación se denomina a menudo como índice terapéutico, que describe el equilibrio entre la dosis necesaria para llevar a cabo la destrucción de las células cancerosas en comparación con la dosis a la cual la sustancia es inaceptablemente tóxica para el individuo. El inconveniente para la mayoría de agentes anticancerosos es el intervalo relativamente pequeño del índice terapéutico, (es decir, el estrecho intervalo de dosificación en el cual se destruyen las células cancerosas sin toxicidad inaceptable para el individuo). Esta característica limita la frecuencia y la dosificación en la que el agente es útil, y a menudo los efectos secundarios llegan a ser intolerables antes de que el cáncer sea erradicado completamente.
Los efectos secundarios graves experimentados con la mayoría de cánceres quimioterapéuticos son un resultado de la naturaleza no específica de estos fármacos, que no distingue entre células sanas y cancerosas, y en su lugar destruye ambas. Determinados fármacos específicos del ciclo celular intentan disminuir estos efectos, dirigiéndose a las fases del ciclo celular implicadas en la replicación y en la división celular. Estos fármacos, sin embargo, no distinguen entre células cancerosas y células sanas que están experimentando una división celular normal. Las células sometidas a mayor riesgo debido a estos tipos de quimioterapia son aquellas que experimentan la división celular frecuentemente, incluyendo células de la sangre, células foliculares pilosas, y las células de los tractos reproductor y digestivo.
Los efectos secundarios más comunes de los agentes anticancerosos son las náuseas y los vómitos. Una gran proporción de individuos padece también de mielosupresión, o supresión de la médula ósea, que produce glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Estos y otros efectos secundarios se exacerban también mediante la supresión del sistema inmune simultánea a la destrucción y a la ausencia de producción de glóbulos blancos, y a los riesgos asociados de una infección oportunista.
Otros efectos secundarios comunes a un amplio intervalo de agentes anticancerosos incluyen: pérdida del cabello (alopecia); pérdida del apetito; pérdida de peso; cambios en el gusto; estomatitis y esofagitis (inflamación y llagas); estreñimiento; diarrea; fatiga; lesión cardiaca; cambios en el sistema nervioso; lesión pulmonar; lesión en el tejido reproductivo; lesión hepática; lesión en el sistema renal y urinario.
La amplia gama de efectos secundarios asociados con la mayoría de agentes anticancerosos y su gravedad en individuos que están ya debilitados con la enfermedad y posiblemente inmunocomprometidos ha conducido a los investigadores a investigar mecanismos por los cuales se puedan aliviar algunos de los efectos secundarios manteniendo a la vez la eficacia del tratamiento. Se han desarrollado algunas soluciones para este problema. Incluyen la quimioterapia combinada, en la que se administran juntos múltiples agentes anticancerosos; tratamientos auxiliares, en el que se prescriben agentes adicionales junto con el agente anticanceroso para luchar con los efectos secundarios de los agentes anticancerosos; tratamientos de modalidad combinada, en el que la quimioterapia se combina con radiación y/o cirugía; y vehículos de administración alternativos para la administración de agentes anticancerosos, tales como la encapsulación de agentes anticancerosos en liposomas.
Se forman liposomas cuando los fosfolípidos y sus derivados se dispersan en agua. Tras la dispersión en agua, los fosfolípidos forman vesículas cerradas denominadas "liposomas", que se caracterizan por bicapas lipídicas que encapsulan un núcleo acuoso. Se han usado diversos liposomas como portadores de agentes terapéuticos atrapados, tales como fármacos, enzimas y secuencias genéticas para uso en la ciencia médica, en la ciencia farmacéutica y en bioquímica.
Los ejemplos de composiciones de liposomas incluyen las patentes de los Estados Unidos Nos 4.983.397; 6.476.068; 5.834.012; 5.756.069; 6.387.397; 5.534.241; 4.789.633; 4.925.661; 6.153.596; 6.057.299; 5.648.478; 6.723.338; 6,627218; Nos de Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos: 2003/0224037; 2004/0022842; 2001/0033860; 2003/0072794; 2003/0082228; 2003/0212031; 2003/0203865; 2004/0142025; 2004/0071768; solicitudes de patente internacional WO 00/74646, WO 96/13250, WO 98/33481, Papahadjopolulos D, Allen TM,
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Gbizon A, et al. "Sterically stabilized liposomes: Improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy "Proc Natl Acad Sci U.S.A. (1991) 88: 11460-11464; Allen TM, Martin FJ. "Advantages of liposomal delivery systems for anthracyclines" Semin Oncol (2004) 31: 5-15 (supl. 13). Weissig et al. Pharm. Res. (1998) 15: 1552-1556.
En las etapas iniciales de desarrollo de liposomas se utilizaron fosfolípidos de la membrana celular que se producían de modo natural tales como fosfolípidos de yema de huevo y fosfolípidos de soja. En el caso de administrarse por vía intravenosa, sin embargo, es probable que los liposomas que utilizan estos fosfolípidos se incorporen en el sistema del retículo endotelial del hígado o el bazo, produciendo un problema de tiempo de retención en sangre bajo y reduciendo por tanto la eficacia del fármaco. A continuación, como un medio para resolver este problema, se utilizaron fosfolípidos sintéticos cuyas porciones lipídicas contenían solo enlaces saturados como constituyente de la membrana liposómica a fin de endurecer la membrana del liposoma.
En un esfuerzo por prolongar la semivida en circulación y evitar la captación por el sistema reticuloendotelial, los investigadores han desarrollado liposomas que se han modificado mediante la incorporación de polietilenglicol u otros polímeros hidrófilos (por ejemplo, un liposoma PEG en el que se han modificado uno o más de los lípidos constituyentes mediante la unión de PEG). Los liposomas modificados con PEG se han denominado también liposomas "protegidos". Doxil™ (inyección de liposomas mediante HCl de doxorubicina) es una doxorubicina encerrada en liposomas, con un polietilenglicol auxiliar (PEG) utilizado para evitar el sistema reticuloendotelial (RES) y prolongar el tiempo de circulación del fármaco. Véase Vail DM, Amantea MA, Colbern GT, et al., "Pegylated Liposomal Doxorubicin: Proof of Principle Using Preclinical Animal Models and Pharmacokinetic Studies." Semin Oncol. (2004) 31 (Supl 13): 16-35. Sin embargo, se han producido también efectos adversos por la retención prolongada en sangre (por ejemplo, síndrome de manos y pies, un efecto adverso de Doxil® en el sistema periférico, etc.) ha llegado a reconocerse como un problema.
Los ejemplos de liposomas incluyen las patentes de los Estados Unidos, Nos 4.983.397; 5.013.556; 6.316.024; 6.056.973; 5.945.122; 5.891.468; 6.126.966; 5.593.622, 5.676.971; 6.586.559; y las publicaciones de solicitudes de patentes de los EE.UU. 5.846.458 Nos 2003/0224037, 2004/0022842; 2003/0113262; 2002/0136707; solicitudes de patente internacional WO 99/30686, WO 02/41870 Aliminana et al., Prep. Biochem. Biotech. (2004) 34(1): 77-96. se describen además liposomas en las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.228.391; 6.197.333; 6.046.225; 5.292.524; publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses Nos 20050271588; 20040213833; 20040029210; 20030175205; 20030162748; 20030130190; 20030059461; y 20020034537.
Además de los liposomas modificados con PEG, los investigadores han desarrollado varios lípidos diferentes derivatizados. Estos lípidos derivatizados podrían incorporarse también a los liposomas. Véase, por ejemplo: la publicación de patente internacional WO 93/01828, Park YS, Maruyama K, Huang L. "Some negatively charged phospholipids derivatives prolong the liposome circulation in vivo." Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1108: 257-260; Ahl et al., Biochimica Biophys. Acta (1997) 1329: 370-382.
Se describen composiciones lipídicas adicionales en las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.936.272; 6.897.196; 6.077.834; publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses Nos 20.050, 136.064; 20040234588; 20030215490; 20030166601; y 20010038851.
Además de la modificación de liposomas con PEG y otros polímeros hidrófilos, los investigadores han desarrollado también liposomas que tienen por objeto dirigirse específicamente a tipos de células concretos incorporando factores de direccionamiento (denominados también como ligandos de direccionamiento) de tipos de células concretos. Los ejemplos de factores/ligandos de direccionamiento incluyen asialoglicoproteína, folato, transferrina, anticuerpos, etc. En algunos casos, uno o más de los lípidos constituyentes podrían modificarse mediante la unión de un factor de direccionamiento.
Los ejemplos de composiciones lipídicas que incluyen factores de direccionamiento incluyen las patentes de los Estados Unidos. Nos 5.049.390; 5.780.052; 5.786.214; 6.316.024; 6.056.973; 6.245.427; 6.524.613; 6.749.863; 6.177.059; 6.530.944; publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses Nos 2004/0022842, 2003/0224037; 2003/143742; 2003/0228285; 2002/0198164; 2003/0220284; 2003/0165934; 2003/0027779; las publicaciones de patente internacional WO 95/33841; WO 95/19434, WO 2001037807; WO 96/33698, WO 2001/49266, WO 9940789; WO 9925320; WO 9104014; WO 92/07959, EP 1369132; JP 2001002592; Iinuma H, Maruyama K, et al., "Intracellular "targeting therapy of cisplatin-encapsulated transferrin-polyethylene glycol liposome on peritoneal dissemination of gastric cancer" Int J Cancer (2002) 99 130-137; Ishida O, Maruyama K, Tanahashi H, Iwatsuru M, Sasaki K, et al., "Liposomes bearing polyethylene glycol-coupled transferrin with intracellular targeting property to the solid tumors in vivo." Pharmaceutical Research, (2001) 18: 1042-1048; Holmberg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989) 165(3):1272-1278; Nam et al., J. Biochem. Mol. Biol. (1998) 31(1): 95-100; Nag et al., J. Drug Target. (1999) 6(6): 427-438.
En particular, Iinuma et al. han desarrollado un liposoma Tf-PEG, con transferrina (Tf) unida a la superficie del liposoma. Iinuma et al., han mostrado que un número mayor de liposomas se han unido a la superficie de células tumorales, y hubo una mayor captación de liposomas por las células tumorales por el liposoma Tf-PEG en comparación con el liposoma PEG (Inuma et al., ibid; Ishida et al., ibid).
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Sin embargo, a pesar de los recientes avances realizados en el campo de la administración de compuestos farmacéuticos y marcados, incluyendo el uso de composiciones de liposomas, sigue existiendo necesidad de composiciones de liposomas mejoradas para la administración de fármacos y de compuestos marcados para células y/o tejidos específicos que consigue un efecto terapéutico o diagnóstico. En particular en el campo del cáncer, se necesitan formulaciones de fármacos con especificidad mejorada y toxicidad reducida para asegurar el beneficio terapéutico sin afectar adversamente las células sanas y que no dan como resultado efectos secundarios perjudiciales para el individuo que se está tratando. De manera similar, los compuestos marcados que pueden utilizarse para detectar dolencias, especialmente en dolencias que suponen una amenaza para la vida en una etapa inicial (por ejemplo, con una elevada especificidad y/o una elevada sensibilidad) y también vigilar de manera precisa la gravedad/extensión de la dolencia (por ejemplo, la progresión y/o la regresión con o sin tratamiento) podrían también mejorar significativamente la calidad y el éxito del tratamiento.
El documento EP 1 209 469 A1 (Vectron Therapeutics AG, 29 de mayo de 2002) describe un "sistema diagnóstico dirigido" que comprende un portador cargado negativamente, un resto de direccionamiento, y un agente diagnóstico, y métodos para su preparación y uso. El sistema diagnóstico dirigido puede estar en forma de un liposoma (véase, por ejemplo, párrafo [0021] del anterior). Tal como se describe en el párrafo [0081] del anterior, se prepararon liposomas a partir de una mezcla de DOPS / DLPE / Colesterol / N-glutaril-DPPE (3:3:3:1 en una base molar). Tal como se describe en el párrafo [0083] del anterior, un péptido RGD se unió a continuación a la superficie liposómica activando en primer lugar el grupo N-glutaril-DPPE carboxilo con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EC-DI) y haciendo reaccionar a continuación este con el RGD-péptido. Señalar que "DOPS" es una 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina; "DLPE" es una 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetaanolamina; y "DPPE" es una "1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina".
El documento WO 96/04232 A1 (Cooper-Lipotech, Inc., 31 de julio de 1986) describe composiciones formadas por liposomas que tienen proteínas funcionalmente activas unidas a superficie, a una concentración de 100-600 µg de proteína/µmol de lípidos. Las proteínas se unen a través de enlaces amida a cadenas separadoras ancladas a los liposomas que utilizan, por ejemplo, grupos carboxilo o N-hidroxisuccinimida activados. Tal como se describe en la página 21, líneas 18-27 del anterior, bajo el encabezado "PE-NHS Liposomes [Liposomas PE-NHS]", antisuero de conejo contra BSA-DNP (un anticuerpo) se acopló a los liposomas PE-NHS que se habían preparado a partir de una mezcla de PC (50 moles por ciento), reactivo de acoplamiento de PE-suberoil-NHS (10 moles por ciento), colesterol (40 moles por ciento), y una cantidad traza de 125I-PE. Los ejemplos de dicho documento describen la preparación de PE-amidas de diversos ácidos dicarboxílicos de la PE-amida del ácido glutárico (Ejemplo I), la PE-amida de ácido succínico (Ejemplo II), la PE-amida del ácido 1,12-dodecan-edicarboxílico (Ejemplo III), la PE-amida del ácido 1,20-eicosanodicarboxílico (Ejemplo IV), y la PE-amida del ácido 1,8-octanodicarboxílico (Ejemplo VI). El Ejemplo VI describe también la preparación de liposomas correspondientes a partir de las mezclas de una de las PE-amidas (1 µmol) con colesterol (10 µmol) y PC (9 µmol). El Ejemplo VII describe el posterior acoplamiento de la IgG de ratón (un anticuerpo) a los liposomas utilizando la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (ECDI), con eficacias de acoplamiento de 30 a 60 %. El Ejemplo VIII del anterior describe la preparación de los ésteres de succinimidilo de varias PE-amidas de diversos ácidos dicarboxílicos: ácido glutárico, ácido adípico, ácido subérico y 1, ácido 12-dodecanodicarboxílico. El Ejemplo X describe también la preparación de liposomas correspondientes a partir de las mezclas de una de las PE-amidas (1 µmoles) con colesterol (10 µmoles) y PC (9 µmoles). El Ejemplo XI describe el posterior acoplamiento de la IgG de ratón (un anticuerpo) a los liposomas utilizando tampón MEPS-MOPS con unas eficacias de acoplamiento del 65 al 73 % y unos contenidos de proteínas de entre 428 a 479 µmoles de proteína/µmol de lípido.
Sumario de la invención
Un primer aspecto de la presente invención es un liposoma dirigido que comprende:
uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, un fármaco encapsulado o compuesto marcado y, al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en la que:
la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que:
125 6
R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; 10 y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo,
en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por 15 las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
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en la que:
12345 6
5 R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n y p son independientemente un número entero de 1 a 10; y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
En una realización, la fosfatidilcolina incluye un resto de un ácido graso saturado. 10 En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC.
En una realización, el liposoma comprende DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, POPC y colesterol, o DPPC y colesterol. 15 En una realización, el liposoma comprende DMPC y colesterol.
En una realización, m y p son cada uno, de manera independiente, un número entero de 2 a 4.
20 En una realización, m y p son iguales.
En una realización, m y p son 3.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. 25
12 56
En una realización, Ry Rson iguales, y Ry Rson iguales.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson iguales.
125 6
30 En una realización, R, RRy Rson oleoílo.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y p son 3.
En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol.
35 En una realización, el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar, y un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
En una realización, el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico 40 y una cadena de azúcar.
En una realización, el ligando de direccionamiento es transferrina.
En una realización, la transferrina es una holoforma pero no una apoforma. 45 En una realización, la transferrina es una holoforma.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, la fosfatidilcolina es 50 DMPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol.
En una realización, el diámetro promedio del liposoma es de 50 nm a 250 nm.
En una realización, está presente el fármaco. 55
15
25
35
45
55
65
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En una realización, el fármaco es un agente anticanceroso. En una realización, el fármaco es un agente citotóxico.
En una realización, el fármaco es un compuesto de platino. En una realización, el compuesto de platino es biplatino, cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino o espiroplatino.
En una realización, el fármaco es oxaliplatino.
125 6
En una realización, el fármaco es oxaliplatino; R, R, Ry Rson oleoílo; m y p son 3; el ligando de direccionamiento
es transferrina; la fosfatidilcolina es DMPC; y el al menos un lípido adicional es colesterol. En una realización, el oxaliplatino se disuelve en una solución acuosa de un azúcar seleccionado de trehalosa, maltosa, sacarosa, manosa, lactosa, manitol, glicerol y dextrosa.
En una realización, el azúcar está a una concentración de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento de azúcar (v/v). En una realización, la concentración de oxaliplatino es de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml en el liposoma. En una realización, el fármaco es un inhibidor de la topoisomerasa I. En una realización, el inhibidor de la topoisomerasa I es topotecán o irinotecan.
En una realización, el fármaco es un alcaloide de la vinca. En una realización, el alcaloide de la vinca es la vincristina, vinblastina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina o vindesina.
En una realización, el fármaco es un ácido nucleico. En una realización, el ácido nucleico es un oligonucleótidos o una ribozima. En una realización, el fármaco es un agente alquilante. En una realización, el fármaco es un taxano, un antagonista metabólico, un antibiótico antitumoral, un fármaco para
tratamiento hormonal, o un fármaco para una diana molecular. En una realización, el liposoma no comprende un lípido catiónico. En una realización, el liposoma no comprende un lípido aniónico. Un segundo aspecto de la presente invención es un método de preparación de un liposoma dirigido del primer aspecto,
que comprende las etapas de:
(a)
mezclar:
el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida;
(b)
añadiendo el fármaco o compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
(c)
formando un liposoma. En una realización, el método comprende además una etapa de: (d) purificar el liposoma de la etapa (c). En una realización, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla. En una realización, la etapa (c) comprende la sonicación, agitación, o extrusión. Un tercer aspecto de la presente invención es un método de preparación de un liposoma dirigido del primer aspecto,
que comprende las etapas de:
(a)
mezclar:
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el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida,
en la que el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
imagen5
en la que:
R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; 15
(b)
añadiendo el fármaco o compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
(c)
formando un liposoma; y,
(d)
uniendo un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
20 En una realización, el método comprende además una etapa de: (e) purificar el liposoma de la etapa (d).
En una realización, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla.
25 En una realización, la etapa (c) comprende la sonicación, agitación, o extrusión.
Un cuarto aspecto de la presente invención es una formulación farmacéutica que comprende un liposoma del primer aspecto y uno o más portadores, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables.
30 Un quinto aspecto de la presente invención es un liposoma dirigido del primer aspecto, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
Un sexto aspecto de la presente invención es un liposoma dirigido del primer aspecto, en donde el liposoma dirigido 35 comprende un fármaco, y el fármaco es un agente anticanceroso, para uso en un método de tratamiento del cáncer.
Un séptimo aspecto de la presente invención es el uso de un liposoma dirigido del primer aspecto, en donde el liposoma dirigido comprende un fármaco, y el fármaco es un agente anticanceroso, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
40 Un octavo aspecto de la presente invención es un liposoma dirigido del primer aspecto, en donde el liposoma dirigido comprende un compuesto marcado, para uso en un método diagnóstico.
Un noveno aspecto de la presente invención es el uso de un liposoma de preparación de un liposoma dirigido del 45 primer aspecto, en donde el liposoma dirigido comprende un compuesto marcado, en la fabricación de un agente diagnóstico.
Un décimo aspecto de la presente invención es un liposoma vacío que comprende:
50 uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
55 en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un
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ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento; en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en la que:
la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y
la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
imagen7
en la que:
125 6
15 R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo,
20 en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
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en la que:
123456
5 R, R, R, R, R, y Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10; y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
En una realización, la fosfatidilcolina incluye un resto de un ácido graso saturado. 10 En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC.
En una realización, el liposoma comprende DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, POPC y colesterol, o DPPC y colesterol. 15 En una realización, el liposoma comprende DMPC y colesterol.
En una realización, m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4.
20 En una realización, m y p son iguales.
En una realización, m y p son 3.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. 25
12 56
En una realización, Ry Rson iguales, y Ry Rson iguales.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson iguales.
125 6
30 En una realización, R, R, Ry Rson oleoílo.
125 6
En una realización, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y p son 3.
En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol.
35 En una realización, el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar, y un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
En una realización, el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico 40 y una cadena de azúcar.
En una realización, el ligando de direccionamiento es transferrina.
En una realización, la transferrina es una holoforma pero no una apoforma. 45 En una realización, la transferrina es una holoforma.
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En una realización, R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, la fosfatidilcolina es DMPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol. 50 En una realización, el diámetro promedio del liposoma es de 50 nm a 250 nm.
En una realización, el liposoma no comprende un lípido catiónico.
55 En una realización, el liposoma no comprende un lípido aniónico.
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Un undécimo aspecto de la presente invención es un método de preparación de un liposoma dirigido del primer aspecto, que comprende las etapas de:
(a) mezclar:
5 el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
10
(b) formar un liposoma.
En una realización, el método comprende además una etapa de (c) purificar el liposoma de la etapa (b).
15 En una realización, la etapa (b) comprende la sonicación, agitación, o extrusión.
Un duodécimo aspecto de la presente invención es un método de preparación de un liposoma vacío del décimo aspecto, que comprende las etapas de:
20 (a) mezclar:
el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y,
25 el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida,
en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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en la que:
R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; 35
(b)
formar un liposoma; y,
(c)
unir un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
40 En una realización, el método comprende además una etapa de (d) purificar el liposoma de la etapa (c).
En una realización, la etapa (b) comprende la sonicación, agitación, o extrusión.
45 Un decimotercer aspecto de la presente invención es un método de preparación de un liposoma terapéutico, que comprende la etapa de: (a) encapsular un fármaco en un liposoma vacío del décimo aspecto.
Un decimocuarto aspecto de la presente invención es una mezcla lípida que comprende una mezcla de:
50 uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
55
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en la que: la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y
en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
imagen12
123 4
R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y en la que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo, en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por
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en la que:
12 3456
R, R, R, R, R, y Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y 5 m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10.
12 34 1
En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y n son 3; R, R, Ry Rson iguales; y R, R2, R3 y R4 son oleoílo o estearoílo.
10 Un decimoquinto aspecto de la presente invención es un método de preparación de una mezcla lípida del decimocuarto aspecto, que comprende la etapa de:
mezclar:
15 el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
Un decimosexto aspecto de la presente invención es una mezcla lípida que comprende una mezcla de:
20 uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y,
25 al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en la que:
30 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y
la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que:
12 5 6
R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y
5 m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y en la que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo, en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están
10 abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
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en la que: 15
12 3456
R, R, R, R, R, y Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10; y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
12 34 12
20 En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y p son 3; R, R, Ry Rson iguales; R, R, R3 y R4 son oleoílo o estearoílo; y el ligando de direccionamiento es transferrina.
Un decimoséptimo aspecto de la presente invención es un método de preparación de una mezcla lípida del decimoquinto aspecto, que comprende la etapa de: 25 mezclar:
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el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
5 Un decimoctavo aspecto de la presente invención es una composición que contiene liposoma que comprende:
uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, 10 un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
en la que:
15 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y
en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está 20 representado por la Fórmula 2,
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en la que:
123 4
R, R, R y Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y
25 m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y en la que la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo, en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por
30 las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
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en la que:
123 456
5 R, R, R, R, R, y Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10.
1234 1
En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y n son 3; R, R, Ry Rson iguales; y R, R2, R3 y R4 son oleoílo o estearoílo.
10 En una realización, la composición que contiene liposomas de decimosexto aspecto comprende además un fármaco, en el que el fármaco es oxaliplatino.
Un decimonoveno aspecto de la presente invención es un método de preparación de una composición que contiene 15 liposomas del decimosexto aspecto, que comprende las etapas de:
(a) mezclar:
el uno o más lípidos fosfolípidos,
20 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
25 (b) añadir el fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
(c) formar una composición que contiene liposomas.
un vigésimo aspecto de la presente invención es una composición que contiene liposoma que comprende liposomas que comprenden:
30 uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y,
35 al menos un lípido adicional, en el que el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento;
40 en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en la que:
la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que:
125 6
R, R, R y Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un
10 número entero de 1 a 10; y en la que la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo, en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por
15 las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
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en la que:
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R, R, R, R, R, y Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y 5 m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10; y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
12 56 12
En una realización, la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y p son 3; R, R, Ry Rson iguales; R, R, R5 y R6 son oleoílo o estearoílo; y el ligando de direccionamiento es transferrina.
10 En una realización, la composición que contiene liposomas de decimonoveno aspecto comprende además un fármaco, en el que el fármaco es oxaliplatino.
Un vigesimotercer aspecto de la presente invención es un método de preparación de una composición que contiene 15 liposomas del decimonoveno aspecto, que comprende las etapas de:
(a) mezclar:
el uno o más fosfolípidos,
20 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
(b) añadir un disolvente a la mezcla formada en la etapa (a) para formar una composición que contiene liposomas.
25 Un vigesimosegundo aspecto de la presente invención es un método de preparación de una composición que contiene liposomas del decimonoveno aspecto, que comprende las etapas de:
(a) mezclar:
30 el uno o más lípidos fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y el al
35 menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
(b)
añadir el fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
(c)
formar una composición que contiene liposomas.
40 Se describen en el presente documento composiciones que contienen lípidos novedosos (que incluyen liposomas (por ejemplo, liposomas dirigidos, liposomas vacíos), mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas) que pueden incorporar opcionalmente un fármaco o un compuesto marcado, o se pueden usar en la preparación de formulaciones que incorporan un fármaco o un compuesto marcado, en el que la composición que contiene lípidos confiere el beneficio de reducir los efectos secundarios del fármaco o el compuesto marcado y/o evita también la
45 degradación y/o la pérdida de la eficacia del fármaco o compuesto marcado. Se describen también en el presente documento métodos de preparación y utilización de las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento. Como se describe en el presente documento, las composiciones que contienen lípidos se pueden usar para tratar o diagnosticar el cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de cerebro, cáncer
50 de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, o neoplasias hematológicas (por ejemplo, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, etc.).
En determinadas realizaciones se proporcionan liposomas dirigidos que comprenden uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido 55 N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, un fármaco encapsulado o compuesto marcado y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido
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N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; y en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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125 6
en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol, y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
15 En otras realizaciones se proporcionan liposomas vacíos que comprenden uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con un ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de
20 direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con un segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico; y en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, cuando está presente, está representada por la Fórmula 3,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no 5 derivatizada, polietilenglicol, fármaco o compuesto marcado, y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
125 6
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y p son 3. En determinadas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina. En 10 realizaciones particulares, el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional está presente
12 5 6
y es colesterol. En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el uno o más fosfolípido es DMPC y el lípido adicional es colesterol.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, m y p son cada uno
15 independientemente, un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, m y p son iguales y son un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, m y p son iguales y son 3. En determinadas realizaciones, R2, R5 y R6 son cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas realizaciones, R1 y R2 son
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iguales, y Ry Rson iguales. En otras realizaciones, R, R, Ry Rson iguales. En realizaciones particulares, R, R,
56 1256
Ry Rson oleoílo o estearoílo. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo.
20 En otras realizaciones se proporcionan mezclas lipídicas que comprenden una mezcla de uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
25
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y
en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está 30 representado por la Fórmula 2,
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12 3 4
en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, y en la que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o 35 polietilenglicol.
En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, m y p son cada uno independientemente, un número entero de
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2 a 4. En algunas realizaciones, m y n son iguales y son un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, m y n son iguales y son 3.
123 4
En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente,
12 34
oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas realizaciones, Ry Rson iguales, y Ry Rson iguales. En
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realizaciones particulares, R, R, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo. En determinadas realizaciones, m y n son 3, en el que el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC y el al menos un lípido adicional está presente y es colesterol. En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, R1, R2, R3 y R4 son oleoílo, m y n son 3, el uno o más fosfolípido es DMPC y el lípido adicional es colesterol.
En otras realizaciones se proporcionan mezclas lipídicas que comprenden una mezcla de uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en el
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y y la fosfatidil etanolamina derivatizada por un ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con un segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico; y en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con el segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, en el que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol, y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, en el que está presente una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4. En determinadas realizaciones, m y p son iguales y son un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, m y p son iguales y son 3.
En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, en el que está presente una fosfatidil etanolamina derivatizada
125 6
con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, R, R, Ry Rson cada uno, de manera
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independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas realizaciones, en las que Ry Rson iguales, y R
6 1256 1256
y Rson iguales. En realizaciones adicionales, R, R, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones, R, R, Ry R
125 6
son oleoílo o estearoílo. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, m y p son 3, el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC, el al menos un lípido adicional es colesterol, y el ligando de direccionamiento es
125 6
transferrina. En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el uno o más fosfolípidos es DMPC, el lípido adicional es colesterol y el ligando de direccionamiento es transferrina.
en determinadas realizaciones se proporcionan composiciones que contienen liposomas que comprenden liposomas que comprende uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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12 3 4
en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, en la que la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o
10 polietilenglicol.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas m y n son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4. En determinadas realizaciones, m y n son iguales y son un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, m y n son iguales y son 3.
15
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En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas, R, R, Ry Rson cada uno, de manera
12 34
independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En realizaciones particulares, Ry Rson iguales, y Ry R
12 34 1234
son iguales. En algunas realizaciones, R, R, Ry Rson iguales. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson
123 4
oleoílo o estearoílo. En algunas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y n son 3 y el uno o más
12 3 6
20 fosfolípidos es DMPC, DSPC, POPC o DPPC. En determinadas realizaciones, R, R, Ry R4son oleílo, m y n son 3, el uno o más fosfolípido es DMPC y el lípido adicional es colesterol.
En determinadas realizaciones se proporcionan composiciones que contienen liposomas que comprenden liposomas que comprenden uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una
25 fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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30 y y la fosfatidil etanolamina derivatizada por un ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con un segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico; y en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con el segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico está
35 representada por la Fórmula 3,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, en la que la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol, y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
En determinadas composiciones que contienen liposomas, cuando está presente una fosfatidil etanolamina ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, m y p son iguales y son un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, m y n son iguales y son 3.
En determinadas composiciones que contienen liposomas, cuando está presente una fosfatidil etanolamina ácido
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N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, R, R, Ry Rson cada uno, de manera
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independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En realizaciones particulares, Ry Rson iguales, y Ry R
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son iguales. En determinadas realizaciones, en la que R, R, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones, R, R, R
6 125 6
y Rson oleoílo o estearoílo. En realizaciones particulares, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC, el al menos un lípido adicional es colesterol, y el ligando de direccionamiento es
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transferrina. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el uno o más fosfolípidos es DMPC, el lípido adicional es colesterol y el ligando de direccionamiento es transferrina.
En realizaciones adicionales de las composiciones que contienen liposomas se incluye un fármaco. En determinadas
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realizaciones, el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC, R, Ry, cuando está presente, Ry Rson oleoílo o estearoílo, m y, cuando está presente, p es 3, el al menos un lípido adicional, cuando está presente, es colesterol, el fármaco es oxaliplatino, y el ligando de direccionamiento, cuando está presente, es transferrina. En determinadas realizaciones, la composición incluye además un azúcar a una concentración de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 20 % de azúcar (v/v). En determinadas realizaciones, el uno o más fosfolípido es DMPC o DSPC,
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R, Ry, cuando está presente, Ry Rson oleoílo, m y, cuando está presente, p es 3, el al menos un lípido adicional, cuando está presente, es colesterol, el fármaco es oxaliplatino, y el ligando de direccionamiento, cuando está presente, es transferrina.
En realizaciones adicionales de las composiciones que contienen liposomas, se incluye un compuesto marcado. En determinadas realizaciones, el compuesto marcado comprende un resto radioisotópico.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, está presente el al menos un lípido adicional. En realizaciones particulares, el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol.
En particular, realizaciones de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina o fosfatidilglicerol. En realizaciones particulares, el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina neutra. En algunas realizaciones, el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina incluye un resto de un ácido graso saturado. En determinadas realizaciones, el uno o más fosfolípidos es DMPC, DSPC, POPC o DPPC. En particular, de estas realizaciones, está presente el al menos un lípido adicional. Y en determinadas de estas, el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol. En realizaciones particulares, DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, POPC y colesterol, o se incorporan DPPC y colesterol. En determinadas realizaciones, DMPC y colesterol.
En particular, realizaciones de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, cuando está presente, el ligando de direccionamiento se dirige a una célula diana. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se dirige a un receptor de la superficie celular de una célula diana. En realizaciones particulares, el ligando de direccionamiento es transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar y un fragmento de un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico o una cadena de azúcar. En otras realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico o una cadena de azúcar. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina. En realizaciones particulares, la transferrina es una holoforma pero no una
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apoforma. En algunas realizaciones, la transferrina es una holoforma.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, el diámetro promedio del liposoma es de 50 nm a 250 nm. En otros, el diámetro promedio del liposoma es de 90 nm a 200 nm.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, el potencial zeta del liposoma es negativo. En determinadas realizaciones, el potencial zeta es de aproximadamente -75 mV a aproximadamente -90 mV. En otros, el potencial zeta es de aproximadamente -80 mV a aproximadamente -85 mV.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas, liposomas dirigidos y liposomas vacíos, las formulaciones incluyen además una solución.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, está presente el fármaco.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, el fármaco es oxaliplatino. En determinadas realizaciones en las que el fármaco es oxaliplatino, el ligando de direccionamiento es transferrina. En determinadas realizaciones, el al menos un lípido adicional está presente y es colesterol.
En determinadas realizaciones, el fármaco es un agente anticanceroso. En realizaciones particulares, el fármaco es un agente citotóxico. En algunas realizaciones, el fármaco es un inhibidor de la topoisomerasa I. En realizaciones particulares, el inhibidor de la topoisomerasa I es topotecán o irinotecan. En otras realizaciones, el fármaco es un alcaloide de la vinca. En realizaciones particulares, el alcaloide de la vinca es la vincristina, vinblastina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina o vindesina. En algunas realizaciones, en el que el fármaco es un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un oligonucleótidos o una ribozima. En algunas realizaciones, el fármaco es un agente alquilante. En realizaciones particulares, el fármaco es un taxano. En otras realizaciones, el fármaco es un antagonista metabólico. En determinadas realizaciones, el fármaco es un antibiótico antitumoral. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco para tratamiento hormonal. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco diana molecular.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos y de las composiciones que contienen liposomas vacíos, el fármaco es un compuesto de platino. En realizaciones particulares, el compuesto de platino es biplatino, cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino o espiroplatino. En algunas realizaciones, el compuesto de platino es oxaliplatino.
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En algunas realizaciones en las que el fármaco es oxaliplatino, R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, el uno o más fosfolípidos es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional está presente y es colesterol. En determinadas realizaciones en las que el fármaco es oxaliplatino, R1, R2, R5 y R6 son oleoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, el uno o más fosfolípidos es DMPC, y el al menos un lípido adicional está presente y es colesterol. En realizaciones particulares, los liposomas dirigidos y las composiciones que contienen liposomas están exentas de otros componentes lípidos.
En algunas realizaciones en las que el fármaco es oxaliplatino, el oxaliplatino se disuelve en una solución acuosa de un azúcar seleccionado entre el grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, manosa, lactosa, manitol, glicerol y dextrosa. En determinadas realizaciones, el azúcar está a una concentración de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento de azúcar (v/v). En realizaciones particulares, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,1 mg/ml a 25 mg/ml en el liposoma. En otras realizaciones, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,5 mg/ml a 10 mg/ml en el liposoma. En otras realizaciones adicionales, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,5 mg/ml a 3 mg/ml.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos y de las composiciones que contienen liposomas, está presente el compuesto marcado. En determinadas realizaciones, el compuesto marcado incluye un resto radioisotópico. En realizaciones particulares, el resto radioisotópico incorpora 125I.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos y de las composiciones que contienen liposomas, la concentración del ligando de direccionamiento incorporada en el liposoma es de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml. En otras, la concentración del ligando de direccionamiento incorporada en el liposoma es de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos y de las composiciones que contienen liposomas en las que está presente el fármaco y es oxaliplatino, el ligando de direccionamiento es transferrina. En realizaciones particulares, la transferrina es una holoforma. En algunas realizaciones, el hierro férrico está en una concentración de entre aproximadamente 0,4 a aproximadamente 3.0 µg/ml. En otras realizaciones, el hierro férrico está en una concentración de entre aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1.5 µg/ml.
En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, los liposomas, las mezclas lipídicas o la composición que contiene liposomas no comprende un
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lípido catiónico. En realizaciones particulares, los liposomas, las mezclas lipídicas o la composición que contiene liposomas no comprende un lípido aniónico. En algunas realizaciones, los liposomas, liposomas lipídicos, mezclas lipídicas o la composición que contiene liposomas no comprende un lípido aniónico o un lípido catiónico.
5 En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, las formulaciones incluyen además una solución, En determinadas realizaciones, las mezclas lipídicas están exentas de solución. En realizaciones particulares, la solución es una solución acuosa o una mezcla de una solución acuosa y un disolvente miscible en agua.
10 En realizaciones concretas de los liposomas dirigidos, liposomas vacíos, mezclas lipídicas y composiciones que contienen liposomas, las formulaciones incluyen además sacarosa.
Se describen también en el presente documento formulaciones farmacéuticas de las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento. Las realizaciones concretas de las composiciones que contienen
15 liposomas, liposomas dirigidos y liposomas vacíos incluyen composiciones que contienen liposomas, liposomas dirigidos o liposomas vacíos como se describen en el presente documento y uno o más portadores, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables.
Se describen también en el presente documento kits que incluyen composiciones que contienen lípidos descritas en el
20 presente documento. Determinadas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas, liposomas dirigidos y liposomas vacíos incluyen composiciones que contienen liposomas, liposomas dirigidos o liposomas vacíos como se describen en el presente documento, el envase y las instrucciones para el uso.
En determinadas realizaciones de los kits, las composiciones que contienen lípidos, liposomas dirigidos o liposomas
25 vacíos como se describen en el presente documento en un primer recipiente y uno o más portadores, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables están contenidos en un segundo recipiente.
En las realizaciones concretas se proporcionan kits que incorporan las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el envase y las instrucciones para el uso.
30 Se describen también en el presente documento métodos de preparación de las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento.
En las realizaciones concretas se proporcionan métodos de preparación de liposomas dirigidos como se describen en 35 el presente documento, que comprenden las etapas de:
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida;
40 b) añadiendo el fármaco o compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
c) formando un liposoma.
45 En realizaciones adicionales del método se proporciona una etapa (d), que purifica el liposoma de la etapa (c). En realizaciones particulares, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla. En determinadas realizaciones, la etapa (c) comprende sonicación o agitación. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende la extrusión.
50 En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de liposomas dirigidos como se describen en el presente documento, que comprende las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, opcionalmente, el al menos
55 un lípido adicional, para formar una mezcla lípida en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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en la que R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
5 b) añadiendo el fármaco o compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
c) formando un liposoma. y,
d) uniendo un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con 10 ácido N-(ω)-dicarboxílico
En algunas realizaciones del método anteriormente descrito, el método incluye también una etapa (e), purificando el liposoma de la etapa (d).
15 En realizaciones particulares, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende sonicación o agitación. En determinadas realizaciones, la etapa (c) comprende la extrusión. En realizaciones particulares, la etapa (c) comprende la agitación.
En determinadas realizaciones se proporcionan métodos de preparación de liposomas vacíos como se describen en el 20 presente documento, que comprenden las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
25 b) formar un liposoma.
En determinadas realizaciones de los métodos de preparar los liposomas vacíos, el método adicional comprende además una etapa (c), de purificación del liposoma de la etapa (b).
30 En realizaciones particulares, la etapa (b) comprende sonicación o agitación. En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la extrusión.
En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de liposomas vacíos como se describen en el 35 presente documento, que comprenden las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, opcionalmente, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida,
40 en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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45 en la que R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
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b) formar un liposoma; y,
c) unir un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
En algunos de los métodos de preparación de los liposomas vacíos, los métodos incluyen además una etapa (d), que purifica el liposoma de la etapa (c).
En realizaciones particulares, la etapa (b) comprende sonicación o agitación. En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la extrusión.
En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos como se describen en el presente documento, que comprenden la etapa de mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o éster de succinimidilo de una etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En realizaciones adicionales se proporcionan métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos en los que están presentes al menos un lípido adicional, tal como se describe en el presente documento, que comprenden la etapa de mezclar el uno o más fosfolípidos, el al menos un lípido adicional, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o éster de succinimidilo de una etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos como se describen en el presente documento, que comprenden la etapa de mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos, en los está presente el al menos un lípido adicional, tal como se describe en el presente documento, que comprenden la etapa de mezclar el uno o más fosfolípidos, el al menos un lípido adicional, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
Se describen también en el presente documento métodos de preparación de las composiciones que contienen liposomas descritas en el presente documento, que comprenden las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, cuando está presente, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, o una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y, opcionalmente, cuando está presente, al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
b) añadir un fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
c) formando un liposoma.
En determinadas realizaciones de los métodos de preparación de las diversas composiciones que contienen lípidos (liposomas dirigidos, liposomas vacíos, composiciones que contienen liposomas), cuando está presente un fármaco, el fármaco está en una solución acuosa. En determinadas realizaciones, la etapa a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la solución acuosa comprende además un azúcar. En determinadas realizaciones, la solución acuosa puede incluir también un disolvente orgánico miscible en agua.
En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de composiciones que contienen liposomas, que comprenden las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, cuando está presente, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, o la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, opcionalmente, cuando está presente, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
(b)
añadiendo un compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a).
(c)
formando un liposoma
En determinadas realizaciones de los métodos de preparación de las diversas composiciones que contienen lípidos
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(liposomas dirigidos, liposomas vacíos, composiciones que contienen liposomas), cuando está presente el compuesto marcado, el compuesto marcado está en solución acuosa. En determinadas realizaciones, la etapa a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente orgánico. En determinadas realizaciones, la solución acuosa puede incluir también un disolvente orgánico miscible en agua.
En determinadas realizaciones se proporcionan también métodos de preparación de las composiciones que contienen liposomas como se describen en el presente documento, en el que la composición que contiene liposomas incluye una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, que comprenden las etapas de
a) mezclar el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y, opcionalmente, al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
b) añadir un disolvente a la mezcla formada en la etapa (a) para formar una composición que contiene liposomas.
En realizaciones particulares, la etapa de mezcla (a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente orgánico. En realizaciones particulares, la solución de la etapa (b) es una solución acuosa o una mezcla de una solución acuosa y un disolvente miscible en agua.
En determinadas realizaciones, la etapa (b) comprende sonicación o agitación. En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la extrusión.
En realizaciones concretas de los métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos, en la etapa (a) está presente el al menos un lípido adicional.
En algunas realizaciones de los métodos de preparación de composiciones que contienen lípidos, en la etapa (a), está presente el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En determinadas realizaciones de los métodos de preparación de las composiciones que contienen lípidos en la etapa (a), está presente la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con un factor de direccionamiento.
Se describen también en el presente documento métodos de tratamiento o diagnóstico utilizando las composiciones que contienen lípidos descritos en el presente documento.
En realizaciones concretas se proporcionan métodos para tratar el cáncer que comprenden, a) administrar un liposoma dirigido que se describe en el presente documento a un individuo que lo necesita en una cantidad eficaz para tratar el cáncer, en donde el liposoma dirigido comprende un fármaco, y el fármaco es un agente anticanceroso.
En determinadas realizaciones del método de tratamiento o diagnóstico, el individuo es un mamífero. En realizaciones particulares, el individuo es un ser humano.
En determinadas realizaciones de los métodos de tratamiento, el cáncer es cáncer de mama, gástrico, de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, o neoplasias hematológicas.
En algunas realizaciones de los métodos de tratamiento, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo o después de un tratamiento contra el cáncer de modalidad combinada En realizaciones particulares, el tratamiento contra el cáncer de modalidad combinada comprende quimioterapia, radioterapia, o cirugía.
En algunas realizaciones particulares de los métodos de tratamiento, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo o después del tratamiento auxiliar contra el cáncer. En realizaciones particulares, el tratamiento auxiliar contra el cáncer comprende la administración de uno o más agentes para reducir la pérdida del cabello, el vómito, la inmunosupresión, náusea, diarrea, prurito, perturbaciones sensoriales, anemia, fatiga, estomatitis, o el síndrome de manos y pies. En algunas realizaciones, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo con o después de la administración de uno o más agentes cancerosos adicionales. En determinadas realizaciones, el uno o más agentes anticancerosos adicionales comprenden 5-fluorouracilo, leucovorina, capecitabina, UFT/LV (tegafur-uracilo y leucovorina), irinotecan, un anticuerpo dirigido contra EGFR, un anticuerpo dirigido contra VEGF, un inhibidor de la tirosina quinasa, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones de los métodos de tratamiento, el liposoma dirigido se administra mediante administración parenteral. En realizaciones particulares, la administración parenteral es mediante inyección o infusión intravenosa.
Se proporcionan también métodos de diagnóstico que comprenden las etapas de
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a) administrar un liposoma dirigido como se describe en el presente documento a un individuo que lo necesita en una cantidad eficaz para la detección, en donde el liposoma dirigido comprende un compuesto marcado, y, b) detectar el compuesto marcado.
5 En algunas realizaciones de los métodos de diagnóstico, los métodos comprenden además una etapa (c), comparando un nivel de compuesto marcado detectado con la cantidad de compuesto marcado detectado en un punto anterior en el tiempo.
10 En otras realizaciones de los métodos de diagnóstico, la etapa (b) comprende la detección mediante un contador gamma.
Se describen también en el presente documento fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con transferrina, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está 15 representada por la Fórmula 3,
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en la que R5 y R6 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo y p es un número entero de 1 a 10, y la 20 transferrina queda unida a la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En determinadas realizaciones de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con transferrina, p es un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, p es 3.
25 En algunas realizaciones de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con transferrina, R5 y R6 son cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En
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realizaciones particulares, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones, Ry Rson oleoílo o estearoílo. En determinadas realizaciones, R5 y R6 son oleoílo o estearoílo y p es 3.
30 Se describen también en el presente documento formulaciones farmacéuticas que comprenden las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con transferrina como se describe en el presente documento y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables.
35 en otras realizaciones se proporcionan mezclas lipídicas que comprenden una mezcla de al menos dos fosfolípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y
en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, y en la que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol.
5 en otras realizaciones se proporcionan mezclas lipídicas que contienen liposomas que comprenden al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizado con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un fármaco encapsulado o un compuesto marcado, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con el ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada
10 por la Fórmula 1,
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y
15 en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo; m y n son, de manera independiente, 20 un número entero de 1 a 10; y, y en la que la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y las mezclas lipídicas, m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4. En determinadas realizaciones, m y n son iguales y son un número 25 entero de 2 a 4. En otras realizaciones, m y n son iguales y son 3.
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En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y las mezclas lipídicas, R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas realizaciones, R1 y R2 son
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iguales, y Ry Rson iguales. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones,
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30 R,R,RyRsonoleoílo.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y las mezclas lipídicas, la relación molar de lípidos neutros: fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico:éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es de aproximadamente 95:4:1.
35 En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y las mezclas lipídicas, en el que los lípidos neutros son DPMC y colesterol, La relación molar de DMPC:colesterol: una fosfatidil etanolamina derivatizada con
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ácido N-(ω)-dicarboxílico + el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico) es de 50:45:5. En algunas de estas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NHS-NG-DOPE.
5 En otras realizaciones se proporcionan liposomas dirigidos que comprenden una mezcla de al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y un fármaco o compuesto marcado encapsulado, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con un ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por
10 un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con un segundo ácido N-(ω)-dicarboxílico; y, en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol, y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
25 en determinadas realizaciones se proporcionan liposomas dirigidos que comprenden una fosfatidil colina neutra, colesterol o un derivado de colesterol, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina y oxaliplatino encapsulado, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con un ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado con una transferrina unida por una amida de ácido carboxílico unida a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con
30 ácido N-(ω)-dicarboxílico; y en la que la fosfatidil etanolamina derivatizada con el ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
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35 y en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2, y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
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en la que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; y, en la que el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada o polietilenglicol. En determinadas realizaciones, el liposoma dirigido está sustancialmente exento de EDC y/o DCC.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos, m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, m y p son iguales y son un número entero de 2 a 4. En realizaciones particulares, m y n son iguales y son 3.
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En algunas realizaciones de los liposomas dirigidos, R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo,
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estearoílo, palmitoílo o miristoílo. En determinadas realizaciones, Ry Rson iguales, y Ry Rson iguales. En
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realizaciones particulares, R, R, Ry Rson iguales. En algunas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo o
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estearoílo. En determinadas realizaciones, R, R, Ry Rson oleoílo.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos, el ligando de direccionamiento se dirige a una célula diana. En realizaciones particulares, el ligando de direccionamiento se dirige a un receptor de la superficie celular de una célula diana. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar y un fragmento de un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico o una cadena de azúcar. En realizaciones particulares, el ligando de direccionamiento es transferrina. En algunas de estas realizaciones, la transferrina es una holoforma pero no una apoforma. En otras realizaciones, la transferrina es una apoforma.
En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas y los liposomas dirigidos, las formulaciones no comprenden un lípido aniónico. En algunas realizaciones, las formulaciones no comprenden un lípido catiónico. En algunas realizaciones, las formulaciones no comprenden un lípido catiónico o un lípido aniónico. En determinadas realizaciones, la formulación no comprende un fosfatidil glicerol o su derivado. En realizaciones particulares, las formulaciones no comprenden fosfatidilcolina de huevo.
En algunas realizaciones de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas y los liposomas dirigidos, los al menos dos lípidos neutros diferentes son uno o más fosfolípidos y colesterol o derivados de colesterol. En algunas realizaciones, al menos uno de al menos dos lípidos neutros diferentes es un fosfolípido. En determinadas realizaciones de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas y los liposomas dirigidos, los al menos dos lípidos neutros diferentes son una fosfatidil colina y colesterol. En realizaciones particulares, uno de al menos uno de al menos dos lípidos neutros diferentes es DMPC, DSPC o DPPC. En algunas de las realizaciones anteriores, uno de al menos dos lípidos neutros diferentes es colesterol o un derivado de colesterol. En realizaciones particulares, los al menos dos lípidos neutros diferentes son una DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, o DPPC y colesterol. En realizaciones particulares, los al menos dos lípidos neutros diferentes son una DMPC y colesterol.
En algunas realizaciones de los liposomas dirigidos, el diámetro promedio del liposoma es de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 250 nm. En determinadas realizaciones, el diámetro promedio del liposoma es de 90 nm a 200 nm. En realizaciones particulares, el diámetro promedio del liposoma es de 100 nm a 140 nm.
En algunas realizaciones de los liposomas dirigidos, el potencial zeta del liposoma es negativo. En realizaciones particulares, el potencial zeta es de aproximadamente -75 mV a aproximadamente -90 mV. En algunas realizaciones, el potencial zeta es de aproximadamente -80 mV a aproximadamente -85 mV.
En algunas realizaciones de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas y los liposomas dirigidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE (en el que NG-DOPE es equivalente a R1 y R2 siendo oleoílo y siendo m 3) y, cuando está presente, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NHS-NG-DOPE (en el que NHS-NG-DOPE es equivalente a R3 y R4 siendo oleílo y siendo n 3) o, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es TF-NG-DOPE (en el que TF-NG-DOPE es equivalente a R5 y R6 siendo oleílo y siendo p 3).
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En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y de los liposomas dirigidos, las formulaciones incluyen además una solución.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos, la relación molar de lípidos neutros: fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico:fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de direccionamiento es aproximadamente 95:4:1.
En determinadas realizaciones de los liposomas dirigidos, La relación molar de DMPC:colesterol: fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico + fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico) es de 50:45:5.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y de los liposomas dirigidos está presente un compuesto marcado. En determinadas realizaciones, el compuesto marcado incluye un resto radioisotópico. En realizaciones particulares, el compuesto marcado incluye 125I.
En algunas realizaciones de las composiciones que contienen liposomas y de los liposomas dirigidos, está presente un fármaco. En realizaciones particulares, el fármaco es un agente anticanceroso. En algunas realizaciones, el fármaco es un agente citotóxico. En determinadas realizaciones, el fármaco es un inhibidor de la topoisomerasa I. En realizaciones particulares, el inhibidor de la topoisomerasa I es topotecán o irinotecan. En otras realizaciones, el fármaco es un alcaloide de la vinca. En algunas realizaciones, el alcaloide de la vinca es la vincristina, vinblastina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina o vindesina. En otras realizaciones, el fármaco es un ácido nucleico. En algunas de estas realizaciones, el ácido nucleico es un oligonucleótidos o una ribozima. En realizaciones particulares, el fármaco es un compuesto de platino. En determinadas realizaciones, el compuesto de platino es biplatino, cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino o espiroplatino. En realizaciones particulares, el compuesto de platino es oxaliplatino. En algunas realizaciones, el fármaco es un agente alquilante. En realizaciones particulares, el fármaco es un taxano. En otras realizaciones, el fármaco es un antagonista metabólico. En determinadas realizaciones, el fármaco es un antibiótico antitumoral. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco para tratamiento hormonal. En realizaciones particulares, el fármaco es un fármaco diana molecular.
En realizaciones particulares, en el que está presente oxaliplatino, el oxaliplatino se disuelve en una solución acuosa de un azúcar seleccionado entre el grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, lactosa, manosa, manitol, glicerol y dextrosa. En determinadas realizaciones, el azúcar está a una concentración de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento de azúcar (v/v). En algunas realizaciones, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,1 mg/ml a 25 mg/ml en el liposoma. En otras realizaciones, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,5 mg/ml a 10 mg/ml en el liposoma. En otras realizaciones adicionales, la concentración de oxaliplatino es entre aproximadamente 0,5 mg/ml a 3 mg/ml.
En realizaciones en las que está presente una fosfatidilcolina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de direccionamiento, la concentración del ligando de direccionamiento incorporada en el liposoma es de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml. En determinadas realizaciones, la concentración del ligando de direccionamiento incorporada en el liposoma es de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml.
En determinadas realizaciones, cuando está presente una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificado por un factor de direccionamiento, el ligando de direccionamiento es transferrina. En algunas realizaciones, la transferrina es una holoforma pero no una apoforma. En determinadas realizaciones, la transferrina es una holoforma. En algunas realizaciones, el hierro férrico está en una concentración de entre aproximadamente 0,4 a aproximadamente 3.0 µg/ml. En otras realizaciones, el hierro férrico está en una concentración de entre aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1.5 µg/ml.
En algunas realizaciones de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas y los liposomas dirigidos, las formulaciones están exentas de componentes lípidos diferentes de los dos lípidos neutros diferentes, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento. En realizaciones particulares, las formulaciones están exentas de componentes lípidos diferentes de la fosfatidil colina, colesterol o un derivado de colesterol, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina.
Se describen también en el presente documento formulaciones farmacéuticas que comprenden un liposoma y una composición que contiene liposoma como se describe en el presente documento y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables.
se describen también en el presente documento kits que contienen una o más de las mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas o liposomas dirigidos descritos en el presente documento, el envase y las instrucciones para el uso.
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En determinadas realizaciones, el kit incluye liposomas dirigidos. En realizaciones particulares, el liposoma dirigido está contenido en un primer recipiente y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, diluyentes, estabilizantes, o conservantes farmacéuticamente aceptables están contenidos en un segundo recipiente.
5 Salvo que se indique otra cosa, se pretende que las composiciones que contienen lípidos como se describen en el presente documento sean para el uso en los métodos de tratamiento y diagnóstico que se describen en el presente documento y puedan incorporarse en las formulaciones y kits farmacéuticos descritos en el presente documento. Las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento (que incluyen mezclas lipídicas, composiciones que contienen liposomas), liposomas (incluyendo liposomas dirigidos, liposomas vacíos, etc.)) pueden,
10 a menos que se indique de otra manera, realizarse mediante los métodos de producción que se describen en el presente documento.
Se describen también en el presente documento métodos para preparar las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento, que comprenden la etapa de mezclar al menos dos lípidos neutros diferentes, la 15 fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En determinadas realizaciones se proporcionan métodos de preparación de las composiciones que contienen liposomas descritas en el presente documento, que comprenden las etapas de
20 a) mezclar el al menos dos lípidos neutros diferentes, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una mezcla lípida;
25 b) añadir un fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
c) formando un liposoma.
En determinadas realizaciones, la etapa de mezcla (a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente orgánico. 30 En algunas realizaciones, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla.
En determinadas realizaciones, la etapa (c) comprende sonicación o agitación. En realizaciones particulares, la etapa
(c) comprende la extrusión.
35 En otras realizaciones se proporcionan métodos de preparación de liposomas dirigidos como se describe en el presente documento, que comprenden las etapas de
a) mezclar el al menos dos lípidos neutros diferentes, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido 40 N-(ω)-dicarboxílico y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una mezcla lípida;
b) añadiendo el fármaco o compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
45 c) formando un liposoma. y,
d) uniendo un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
50 En algunas realizaciones de los métodos anteriormente descritos, el método comprende además una etapa (e), purificando el liposoma de la etapa (d). En realizaciones particulares, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla. En algunas realizaciones la etapa (c) comprende sonicación o agitación. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende la extrusión.
55 Se proporcionan también métodos adicionales de preparación de un liposoma dirigido que comprende las etapas de
a) mezclar la fosfatidil colina, colesterol o un derivado de colesterol, y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una mezcla lípida;
60 b) añadir oxaliplatino a la mezcla lípida formada en la etapa (a);fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
c) formando un liposoma. y,
d) funcionalizar una porción de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar un 65 éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; y
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e) uniendo transferrina al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
En determinadas realizaciones, el método comprende además una etapa (f) de purificar el liposoma de la etapa (e).
En realizaciones concretas del método, el fármaco en la etapa (b) está en una solución acuosa antes de la mezcla.
En algunas realizaciones del método, la etapa (c) comprende sonicación o agitación.
se describe también en el presente documento el uso de composiciones que contienen lípidos (incluyendo liposomas dirigidos) y sus formulaciones para el uso en el tratamiento o el diagnóstico de dolencias como se describe en el presente documento. En concreto, la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o diagnóstico de las dolencias descritas en el presente documento. Además, las formulaciones farmacéuticas de los mismos, se describen de manera variada en el presente documento, se pretenden también para el uso en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento y diagnóstico de las dolencias y, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Se describen también en el presente documentos métodos para tratar el cáncer que comprenden la etapa de a) administrar un liposoma dirigido como se describe en el presente documento a un individuo que lo necesita en una cantidad eficaz para tratar el cáncer, en el que el fármaco es un agente anticanceroso.
En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero. En realizaciones particulares, el individuo es un ser humano.
En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, gástrico, de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, o neoplasias hematológicas.
En algunas realizaciones de los métodos de tratamiento, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo o después de un tratamiento contra el cáncer de modalidad combinada En realizaciones particulares, el tratamiento contra el cáncer de modalidad combinada comprende quimioterapia, radioterapia, o cirugía.
En algunas realizaciones de los métodos de tratamiento, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo o después del tratamiento auxiliar contra el cáncer. En realizaciones particulares, el tratamiento auxiliar contra el cáncer comprende la administración de uno o más agentes para reducir la pérdida del cabello, el vómito, la inmunosupresión, náusea, diarrea, prurito, perturbaciones sensoriales, anemia, fatiga, estomatitis, o el síndrome de manos y pies. En determinadas realizaciones, se llevó a cabo la etapa (a) antes, en paralelo con o después de la administración de uno
o más agentes cancerosos adicionales. En realizaciones particulares, el uno o más agentes anticancerosos adicionales incluyen 5-fluorouracilo, leucovorina, capecitabina, UFT/LV (tegafur-uracilo y leucovorina), irinotecan, un anticuerpo dirigido contra EGFR, un anticuerpo dirigido contra VEGF, un inhibidor de la tirosina quinasa, o combinaciones de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra una representación esquemática de un liposoma dirigido.
La Fig. 2 muestra una representación esquemática del fármaco activo dirigiéndose a las células tumorales utilizando liposomas dirigidos.
La Fig. 3 muestra una representación esquemática del modo de acción propuesto de los liposomas dirigidos que contienen oxaliplatino.
La Fig. 4 muestra una representación esquemática de un procedimiento de producción A para liposomas dirigidos.
La Fig. 5 muestra una representación esquemática de un procedimiento de producción B para liposomas dirigidos.
La Fig. 6 muestra la citotoxicidad del oxaliplatino en células AsPC-1 a diversas concentraciones de oxaliplatino.
La Fig. 7 muestra el número de receptores de la transferrina presentes en la superficie celular de leucocitos normales y líneas de células derivadas de tumor.
La Fig. 8 muestra los resultados de la distribución de tamaños de las mezclas que contienen liposomas preparadas en el Ejemplo 6 y obtenidas mediante QELS; A) Entrada 1, B) Entrada 2, C) Entrada 3, D) Entrada 4, E) Entrada 5, F) Entrada 6.
La Fig. 9 muestra las concentraciones de liposomas en la sangre, en el que (♦) indica los liposomas de Tf-PEG preparados en el Ejemplo 6, (■) indica los liposomas Tf-NG-DSPE:NG-DSPE:DSPC:CH preparados en el Ejemplo
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5, e (▲) indica los liposomas Tf/PEG-NG-DSPE preparados en el Ejemplo 6.
La Fig. 10 muestra las concentraciones de liposomas en tejidos cancerosos; en el que (♦) indica los liposomas de Tf-PEG preparados en el Ejemplo 6, (■) indica los liposomas Tf-NG-DSPE:NG-DSPE:DSPC:CH preparados en el Ejemplo 5, e (▲) indica los liposomas Tf/PEG-NG-DSPE preparados en el Ejemplo 6.
La Fig. 11 muestra la acumulación en el tejido tumoral de liposomas NG-PE, preparados como se describe en el Ejemplo 13, Tras la inyección intravenosa, en la que se inyectaron liposomas NGPE encapsulados con tiraminil inulina etiqueta con tiraminil inulina marcada con 125I en ratones que soportaban 26 tumores de colon. Se presentan los datos como promedio. Se presentan los datos como promedio ± SD (n = 5). (□) 0 % en mol (-); (■) 1 %en mol (+) Tf-NG-DOPE. * Diferencia significativa entre 0 % mol (-)
La Fig.12 muestra los efectos inhibidores de los liposomas sobre el crecimiento tumoral representando gráficamente la relación del crecimiento tumoral frente a los días tras el tratamiento inicial, en el que (♦) indica los liposomas de Tf-PEG preparados en el Ejemplo 9; (■) indica los liposomas de PEG preparados en el Ejemplo 6 sin Tf; (A) indica los liposomas Tf-NG-DSPE:NG-DSPE:DSPC:CH preparados en el Ejemplo 8; (O) indica los liposomas NG-DSPE:NG-DSPE:DSPC:CH preparados en el Ejemplo 8, sin Tf; (*) indica los liposomas Tf/PEG-NG-DSPE preparados en el Ejemplo 9; (•) indica los liposomas PEG-NG-DSPE preparados en el Ejemplo 9, sin Tf; (+) indica /solución de -OHP; e (-) indica sin tratamiento.
La Fig. 13 muestra el efecto de variar la concentración de NG-PE (NG-DSPE) sobre el porcentaje de dosis de fármacos detectados en sangre, en el que la concentración (% de contenido total de lípidos de NG-DSPE es como sigue: (♦) 0%, (■) 1 %; (A) 3 %; (x) 6 %; (O) 12 %; y con los siguientes lípidos: (•) MPB 6 %; (+) PDP 6 %.
La Fig. 14 muestra la retención de liposomas en sangre con diversos enlazadores de ácidos dicarboxílicos, con y sin Tf; en elque (♦) Tf-NGPE, (■) Tf-NSPE; (A) TF-MPB; (x) NGPE (sin Tf), (*) MPB (sin Tf).
La Fig. 15 muestra el análisis ilustrativo de liposomas mediante electroforesis: banda 6 (transferrin-N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina-liposoma (Tf-NG-DSPE liposoma)); la banda 5 (transferrin-polietilenglicol-distearoil fosfatidil etanolamina-liposoma (Tf-PEG-DSPE liposoma)). Bandas 1-4, contienen h-apo-Tf (240 ng), h-apo-Tf (120 ng), h-apo-Tf (60 ng), y h-apo-Tf (30 ng), respectivamente.
La Fig. 16 muestra la cantidad de transferrina unida a los liposomas Tf-NG-DSPE con la (banda 5) y sin (banda 4) sin NG-DSPE incorporado en el liposoma. Bandas 1-3, contienen h-apo-Tf (400 ng), h-apo-Tf (200 ng), y h-apo-Tf (50 ng), respectivamente.
La Fig. 17 muestra la acumulación de oxaliplatino en sangre tras la administración de (■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a 5 mg/kg y (•) liposomas Tf-PEG a 5 mg/kg.
La Fig. 18 muestra la acumulación de oxaliplatino en tumores colon 26 tras la administración de (■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a 5 mg/kg y (•) liposomas Tf-PEG a 5 mg/kg en tumores de colon 26 de ratón.
La Fig. 19 muestra el efecto antitumoral en 26 ratones que soportan tumores de colon de liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, en el que (•) el vehículo control indicado (sacarosa al 9 %); (▲) indicado /-solución de OHP a 5 mg/kg, (♦) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 5 mg/kg y (■) indica liposomas Tf-PEG a 5 mg/kg.
La Fig. 20 muestra el efecto antitumoral en ratones que soportan xenoinjertos de tumores de colon HCT-116 de liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, en el que (•) el vehículo control indicado (300 mM (10,27 %) de sacarosa); (O) liposomas vacíos indicados (sin fármaco), (▲) indicado /-solución de OHP a 15 mg/kg, (♦) liposomas NG-DOPE Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 10 mg/kg e (■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 15 mg/kg. Se han administrado todos los liposomas mediante un peso corporal exacto con un volumen de inyección de 0,103 ml/10 g de peso corporal.
La Fig. 21 muestra el efecto antitumoral en ratones que soportan xenoinjertos de tumores de colon HCT-29 humanos de liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, en el que (•) el vehículo control indicado (300mM (10,27 %) de sacarosa), (A) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 15 mg/kg, (■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 10 mg/kg, y (♦) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 6,7 mg/kg.
La Fig. 22 muestra el efecto antitumoral en ratones que soportan xenoinjertos de tumores gástricos MKN45 humanos de liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, en el que (•) el vehículo control indicado (300mM (10,27 %) de sacarosa), (▲) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 15 mg/kg, (■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 10 mg/kg, y (♦) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 6,7 mg/kg.
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La Fig. 23 muestra el efecto antitumoral en ratones que soportan xenoinjertos de tumores COLO 205 humanos de liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, en el que (•) el vehículo control indicado (sacarosa al 9 %); (A) indicado /solución de -OHP a 5 mg/kg q4d x3 (día 16), 10 mg/kg q2d x2 (día 47), 2 mg/kg q2d x 6 (día 51); (♦) liposomas indicados NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a 5 mg/kg q4d x3 (día 16), 10 mg/kg q2d x2 (día 47), 2 mg/kg q2d x 6 (día 51); y(■) liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH indicados a 10 mg/kg q4d x3 (día 16), 15 mg/kg q2d x2 (día 47), 4 mg/kg q2d x 6 (día 51).
La Fig. 24 muestra el modelo de SDS-PAGE tras la reducción con 2-mercaptoetanol, en el que la banda 1 es la de marcadores del peso molecular, la banda 2 es holo-transferrina, las bandas 3-5 son los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH, y la banda 6 es Tf-NG-DOPE.
La Fig. 25 muestra un cromatograma de HPLC ilustrativo de la adecuabilidad del sistema.
Descripción detallada
Se describen en el presente documento composiciones que comprenden lípidos (incluyendo liposomas dirigidos, liposomas vacíos, composiciones que contienen liposomas, mezclas de lípidos, etc.), y métodos para preparar y utilizar las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento. Las composiciones que contienen lípidos, y en particular los liposomas que se proporcionan en el presente documento, son adecuados para la preparación de formulaciones farmacéuticas y para su uso en el tratamiento o diagnóstico de varias dolencias, incluyendo cáncer. Las composiciones, incluyendo las formulaciones farmacéuticas, proporcionan regímenes de tratamiento y diagnóstico más eficaces con efectos adversos reducidos asociados en el fármaco o compuesto marcado administrado al individuo. La mayor eficacia y los efectos adversos reducidos deberán aumentar el índice terapéutico de la formulación de fármaco y proporcionar la oportunidad para conseguir un tratamiento correcto de varias dolencias, incluyendo el cáncer y también deberá aumentar la eficacia y reducir los efectos adversos asociados con el diagnóstico. La mayor especificidad de las formulaciones de fármacos con la reducción concomitante en los efectos secundarios debería garantizar un beneficio terapéutico para un mayor número y gama de individuos a tratar, de esta manera, preservando o prolongando las vidas y mejorar la calidad de vida de los individuos que necesitan tratamiento. Esta mayor especificidad de las formulaciones de compuestos marcadas con la reducción concomitante en los efectos secundarios debería aumentar el número de individuos que reciben un diagnóstico correcto, por ejemplo, capaces de tolerar la formulación de diagnóstico, y también aumentar la precisión (por ejemplo, sensibilidad, etc.) del diagnóstico, incluyendo permitir un diagnóstico más temprano de las dolencias y un seguimiento más eficaz de la enfermedad (por ejemplo, progresión o regresión con o sin tratamiento).
En las composiciones actualmente descritas se encuentran formulaciones farmacéuticas de las composiciones que contienen lípidos. Las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, liposomas que encapsulan fármacos y compuestos marcados, y se pueden utilizar en el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades u otras dolencias que requieran tratamiento o diagnóstico, incluyendo, por ejemplo, cáncer (por ejemplo, mama, gástrico, colorrectal o cáncer de colon).
Cuando se administran los agentes anticancerosos (incluyendo citotóxicos) convencionales por vía intravenosa, la totalidad del organismo queda expuesto y afectado por el fármaco de una forma no selectiva. Como resultado, pueden producirse numerosas reacciones adversas, el cáncer no está dirigido, y/o el efecto del fármaco se puede perder durante el proceso de circulación. La encapsulación de un fármaco en una composición de liposoma antes de su administración puede dar como resultado uno o más beneficios, incluyendo la reducción del(de los) efecto(s) adverso(s) del fármaco sobre una célula normal, proteger el fármaco hasta que llegue a una célula patológica diana en el caso en que el fármaco sea inestable, prolongar la presencia del fármaco en el sistema circulatorio para permitir su administración a células patológicas, y/o facilitar la administración del fármaco a una célula patológica diana concreta. De manera más específica, el direccionamiento del fármaco y la reducción de la pérdida de fármaco por captación en el RES incluye también la reducción de la cantidad de fármaco que se debe administrar y también de esta forma se reduce el coste del tratamiento, así como otras ventajas descritas en el presente documento.
De manera similar, muchos compuestos marcados tienen efectos adversos y/o se pueden degradar en el tiempo transcurrido entre la administración y el diagnóstico (por ejemplo., el momento en que se realiza la técnica diagnóstica -por ejemplo, detección de radioisótopos, adquisición de imagen por resonancia magnética, ultrasonidos, etc.). La incorporación de compuestos marcados en las composiciones que contienen lípido descritas en el presente documento deberán aumentar la eficacia del compuesto marcado, tal como, por ejemplo, el umbral de detección se puede conseguir a dosis menores de compuesto marcado, reduciendo los efectos adversos del agente, y/o prolongando la ventana temporal en la que se puede realizar el diagnóstico.
Las composiciones que contienen lípido también incluyen lípidos modificados con ligandos de direccionamiento (por ejemplo, liposomas dirigidos, liposomas vacíos, composiciones que contienen liposomas, mezclas de lípidos) u otra derivatización. Por ejemplo, las composiciones liposomiales que incorporan factores de direccionamiento (por ejemplo, transferrina, folato, etc.) y lípidos derivatizados (por ejemplo, fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico) se desarrollaron para mejorar la seguridad y eficacia de agentes anticancerosos (por ejemplo, oxaliplatino, etc.) mediante la prolongación del tiempo de circulación del fármaco en plasma (comparado con el
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fármaco administrado solamente en solución) y mediante receptores específicos del factor de direccionamiento en las células tumorales. Esta biodisponibilidad mejorada y direccionamiento tumoral, deberán dar como resultado una mayor seguridad y una actividad antitumoral aumentada, y por tanto una mayor posibilidad de conseguir un tratamiento eficaz de los individuos que lo necesitan reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios asociados con muchos fármacos, especialmente los efectos adversos graves asociados con la mayoría de agentes anticancerosos. De manera similar, dicha derivatización y factores de direccionamiento también se pueden utilizar para dirigirse de forma eficaz a sitios concretos (por ejemplo, tipos de tumor, órganos, tejidos, etc.) para la administración de compuestos marcados.
Se describen en el presente documento fosfatidil etanolaminas derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con transferrina, que pueden utilizarse en las composiciones que contienen lípidos y sus formulaciones descritas en el presente documento.
Las composiciones que contienen lípidos, incluyendo los liposomas, descritas en el presente documento, pueden prepararse por los métodos descritos en el presente documento, así como los métodos para fabricación de liposomas conocidos del técnico experto y adecuados a la vista de las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria descriptiva. Salvo que se indique otra cosa, los liposomas y las composiciones que contienen liposomas descritos en el presente documento se pueden incorporar sin limitación en formulaciones farmacéuticas y/o kits, incluyendo las formulaciones farmacéuticas y/o kits descritos en el presente documento y, además, aquellos que sean evidentes para un experto en la técnica a la vista de las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria descriptiva. Análogamente, los liposomas y composiciones que contienen liposomas y las composiciones farmacéuticas que incorporan los liposomas y composiciones que contienen liposomas se pueden utilizar sin limitación, a menos que se indique de otra manera, en los métodos de tratamiento o diagnóstico consistentes con la descripción proporcionada en la totalidad de la presente memoria descriptiva y de acuerdo con la práctica de la persona experta en la materia a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.
Un liposoma dirigido ilustrativo que incorpora un fármaco (oxaliplatino) se representa esquemáticamente en la Fig. 1. Los mecanismos de captación propuestos y el modo de acción de los liposomas dirigidos se proporcionan en las Figs. 2 y 3. Como se usa en el presente documento, el término "liposoma dirigido" se refiere de manera general a un liposoma con componentes que incluyen al menos uno o más fosfolípido(s), NωPE, TF-NωPE y que también incorporan un fármaco o compuestos marcado tal como se describe en el presente documento. Cada uno de estos componentes, tal como se describe en la totalidad de la memoria descriptiva, sin limitación, puede incorporarse a los liposomas dirigidos descritos en el presente documento en continuidad con las enseñanzas provistas en el presente documento. Debe resaltarse que los liposomas vacíos, descritos con mayor detalle en el presente documento, también se pueden "dirigir", en el sentido que pueden incorporar NωPE modificados mediante TF, pero por lo general no incorporan un fármaco o un compuesto marcado.
Fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico
Las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento incorporan al menos una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de acuerdo con la Fórmula 1, a continuación:
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en la que R1 y R2 son, independientemente, un grupo acilo, y m es un número entero de 1 a 10.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico", y sus análogos, se refieren a fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico abarcadas por la Fórmula 1 tal como se proporciona en el presente documento. Análogamente, la abreviatura NωPE se utiliza para referirse a las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico abarcadas por la Fórmula 1 (por ejemplo, Nco-DOPE, Nω-DSPE, NG-DOPE, etc.), y, por ejemplo, NG-PE se refiere a N-glutaril fosfatidil etanolamina(s) de Fórmula 1, a menos que se indique lo contrario.
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Se pretende que solamente las fosfatidil etanolamina(s) incorporadas en las composiciones que contienen lípidos (incluyendo los liposomas dirigidos) descritos en el presente documento sean fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 1 o ésteres de succinimidilo de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 2 o las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con un factor de direccionamiento de la Fórmula 3, que se describe con mayor detalle en lo sucesivo. Como se usa en el presente documento, la expresión "fosfatidil etanolamina no derivatizada" y sus términos análogos, se refieren a fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o derivados de las mismas que no están abarcados por la Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3.
Una amplia variedad de grupos acilo, representados mediante R1 y R2, pueden usarse en la Fórmula 1, como entenderán bien los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, el grupo acilo se deriva de ácidos carboxílicos alifáticos saturados o insaturados que tienen 12-22 átomos de carbono. Los grupos acilo ilustrativos incluyen, pero sin limitación, grupos acilo derivados de ácido láurico, ácido tridecanoico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido nonecanoico, ácido aráquico, ácido heneicosánico, ácido behénico ácido 2-lauroleico, ácido 5-lauroleico, ácido 11-lauroleico, ácido 5-miristoleico, ácido miristoleico, ácido 2-palmitoleico, ácido 7-palmitoleico, ácido cis-9-palmitoleico, ácido trans-9-palmitoleico, ácido petroselínico, ácido petroselidínico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido vaccénico, ácido gondoico, ácido trans-gondoico, ácido erúcico, ácido linoleico, ácido linoelaídico, ácido αeleosteérico, ácido β-eleosteérico, ácido linolénico, ácido pseudoeleosteárico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaénico, o ácido docosahexaénico.
En determinadas realizaciones, el grupo acilo se deriva de ácidos carboxílicos alifáticos saturados o insaturados que tienen 14-18 átomos de carbono. Los grupos acilo ilustrativos de este tipo incluyen, pero no se limitan a los derivados de ácido oleico (18 átomos de carbono), ácido palmítico (16 átomos de carbono), ácido esteárico (18 átomos de carbono), o ácido mirístico (14 átomos de carbono). Como reconoce un experto en la materia, los correspondientes grupos acilo son oleilo, palmitoílo, esteroílo y miristoílo, respectivamente.
En otras realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácidos carboxílicos alifáticos saturados o insaturados que tienen 14-18, 14-20, 14-22, 16-18, 16-20, 16-22, 18-20, 18-22, 12, 14, 16, 18, 20 o 22 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácidos carboxílicos alifáticos saturados o insaturados que tienen un número par de átomos de carbono.
En algunas realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácido oleico (oleílo), ácido esteárico (estearoílo), ácido palmítico (palmitoílo), ácido linoleico (lineloílo, 18 átomos de carbono), o ácido mirístico (miristoílo). En otras realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácido oleico (oleílo). En determinadas realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácido esteárico (estearoílo). En otras realizaciones adicionales, los grupos acilo se derivan de ácido palmítico (palmitoílo). En otras realizaciones, los grupos acilo se derivan de ácido mirístico (miristoílo).
En algunas realizaciones, el grupo acilo se deriva de un ácido carboxílico alifático saturado, tal como, pero sin limitación ácido palmítico (16 átomos de carbono), ácido esteárico (18 átomos de carbono), o ácido mirístico (14 átomos de carbono).
En otras realizaciones, el grupo acilo se deriva de un ácido carboxílico alifático insaturado, tal como, pero sin limitación ácido oleico (oleoílo, 18 átomos de carbono), ácido linoleico (lineloílo, 18 átomos de carbono) o linolénico (linolenoílo, 18 átomos de carbono). En algunas realizaciones, el grupo acilo se deriva de ácido linoleico.
En determinadas realizaciones, m es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En otras realizaciones, m es un número entero de 1-8, 1-6, 1-5, 1-7, 1-3, 1-2, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-4, 3-5, o 3-6. En algunas realizaciones, m es un número entero de 2-4. En otras realizaciones, m es 1, 2 o 3.
En determinadas realizaciones, n es un número entero de 1 a 4. Como reconoce un experto en la materia, m=1 corresponde a un derivado de ácido malónico de la fosfatidil etanolamina (PE), mientras que m= 2, 3, o 4, representan derivados de ácido succínico, ácido glutárico, ácido ádípico de la PE, respectivamente. En algunas realizaciones, m es 3 (ácido glutárico).
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En determinadas realizaciones, Ry Rson el mismo grupo acilo. En otras realizaciones, Ry Rson grupos acilo diferentes. En determinadas realizaciones, R1 y R2 son oleoílo, esteroílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas
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realizaciones, Ry Rson oleoílo. En otras realizaciones, Ry Rson estereaolilo. En realizaciones particulares, Ry
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Rson palmitoílo. En otras realizaciones, Ry Rson miristoílo.
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 1 es N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (NG-DOPE (es decir, en la que R1 y R2 son oleílo y m es 3)). En otras realizaciones, es N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina (NG-DSPE (es decir, en la que R1 y R2 son esteroílo y m es 3). En otras realizaciones, es N-glutaril-dimiristoil fosfatidil etanolamina (NG-DMPE (es decir, en la que R1 y R2 son miristoílo y m es 3)). En otras realizaciones, es N-glutaril-dipalmitoil fosfatidil etanolamina (NG-DPPE (es decir, en la
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que R1 y R2 son palmitoílo y m es 3)). En otras realizaciones, es N-succinil-distearoil fosfatidil etanolamina (NS-DSPE (es decir, en la que R1 y R2 son estearoílo y m es 2)). En otras realizaciones, es N-adipinil-distearoil fosfatidil etanolamina (NA-DSPE (es decir, en la que R1 y R2 son estearoílo y m es 4)). En determinadas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 1 es NG-DOPE o NG-DSPE.
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Preparación de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico
Las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico descritas en el presente documento se pueden obtener uniendo un ácido dicarboxílico al grupo amino de la fosfatidil etanolamina.
10 Los fosfolípidos, incluyendo las fosfatidil etanolaminas y sus derivados utilizados para los fines descritos en este documento, deben ser de alta pureza e idealmente ser homogéneos. Los métodos conocidos para la preparación de fosfolípidos de alta pureza incluyen extracción del lípido de una solución tampón y la purificación usando cromatografía en columna. Por ejemplo, los métodos de producción de N-succinil dipalmitoilfosfatidiletanolamina se describen en la
15 publicación de solicitud de patente internacional WO93/01828 (JPAH7-501316) y en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.804.552 y 5.554.728. Estos métodos de producción incluyen la purificación del derivado de fosfolípido de la mezcla de reacción mediante cromatografía en columna de gel de sílice 60 de la mezcla de reacción. Dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE) se hacer reaccionar con anhídrido de ácido succínico con catalizador trietilamina a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno durante 16 horas.
20 Otros métodos de producción de los derivados fosfolípidos de N-(ω-carboxi) acilamido-fosfatidil etanolamina se describen en la solicitud de patente japonesa publicada JP A2001-261688, que incluye la purificación mediante separación de una capa líquida tras adición de una solución tampón a pH 3,5-7,5 a la mezcla de reacción. En este caso, la PE se hacer reaccionar con anhídrido de ácido dicarboxílico con el catalizador alcalino trietilamina a 4 ºC
25 durante 1 h. Este método puede que no funcione bien para todos los derivados de fosfatidil etanolamina.
DOPE (dioleoil-fosfatidil etanolamina) también se puede obtener comercialmente o puede prepararse por métodos conocidos del experto en la técnica. Por ejemplo, En resumen, la lecitina (material de partida API) puede hidrolizarse químicamente para generar glicerol-fosfo-colina que se aísla por precipitación. El lípido se acila a continuación usando
30 ácido oleico activado, y DOPC (dioleoil-fosfatidil colina) se aísla mediante cromatografía en columna en fase normal y se hace pasar por una columna de intercambio iónico para purificar. DOPE se puede preparar a partir de DOPC por reacción con etanolamina usando fosfolipasa D.
Los derivados fosfolípidos de N-(ω-carboxi) acilamido-fosfatidiletanolamina también se pueden preparar de la manera
35 descrita en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.534.899. En resumen, un anhídrido dicarboxílico se hacer reaccionar con un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina para obtener una fosfatidiletanolamina derivatizada con ácido dicarboxílico.
Ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico
40 Los ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico tal como se describen en el presente documento se representan mediante la siguiente Fórmula 2:
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45 en la que R3 y R4 son, independientemente, un grupo acilo, y n es un número entero de 1 a 10.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ésteres de succinimida de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico", y sus análogos, se refiere a ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico abarcadas por la Fórmula 2 tal como se proporciona en el presente
50 documento. Análogamente, la abreviatura SuccNωPE se utiliza para referirse a los ésteres de succinimida de las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico abarcadas por la Fórmula 2 (por ejemplo, SuccNω-DOPE, SuccNω-DSPE, SuccNG-DOPE, etc.), y, por ejemplo, NHS-NG-PE se refiere al éster de succinimida de las N-glutaril fosfatidil etanolamina(s) de Fórmula 2 formadas por reacción con NHS, a menos que se indique lo contrario.
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Se puede utilizar una amplia variedad de grupos acilo representados por R3 y R4, tal como entienden bien las personas expertas en la materia y como se ha descrito anteriormente para R1 y R2. Salvo que se indique de otra forma en el presente documento, se pretende expresamente que la descripción provista en el presente documento de los grupos acilo con respecto a la Fórmula 1 (por ejemplo, R1 y R2) es igualmente aplicable a los grupos acilo con respecto a la Fórmula 2 (por ejemplo, R3 y R4). Incluyendo, en particular, la descripción anterior en la sección titulada "fosfatidil etanolaminas derivatizadas con N-(ω)-dicarboxílico".
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En determinadas realizaciones, Ry Rson el mismo grupo acilo. En otras realizaciones, Ry Rson grupos acilo diferentes. En determinadas realizaciones, R3 y R4 son oleoílo, esteroílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas
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realizaciones, Ry Rson oleoílo. En otras realizaciones, Ry Rson estereaolilo. En determinadas realizaciones, R
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y Rson palmitoílo. En otras realizaciones, Ry Rson miristoílo.
En determinadas realizaciones, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En otras realizaciones, n es un número entero de 1-8, 1-6, 1-5, 1-7, 1-3, 1-2, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-4, 3-5, o 3-6. En algunas realizaciones, n es un número entero de 2-4. En otras realizaciones, n es 1, 2 o 3.
En determinadas realizaciones, n es un número entero de 1 a 4. Como reconoce un experto en la materia, n=1 corresponde a un derivado de ácido malónico de la fosfatidil etanolamina (PE), mientras que n= 2, 3, o 4, representan ácido succínico, ácido glutárico, y derivados de ácido adípico de la PE, respectivamente. En algunas realizaciones, n es 3 (ácido glutárico).
En algunas realizaciones, el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 2 es un éster de succinimidilo de N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (NG-DOPE). En otras realizaciones, es un éster de succinimidilo de N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina (NG-DSPE). En determinadas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 2 es un éster de succinimidilo de NG-DOPE o NG-DSPE.
En algunas realizaciones, el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 2 es el éster de succinimidilo de N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (SuccNG-DOPE (es decir, en la que R3 y R4 son oleílo y n es 3)). En otras realizaciones, es el éster de succinimidilo de N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina (SuccNG-DSPE (es decir, en la que R3 y R4 son estearoilo y n es 3). En otras realizaciones, es el éster de succinimidilo de N-glutaril-dimiristoil fosfatidil etanolamina (SuccNG-DMPE (es decir, en la que R3 y R4 son miristoílo y n es 3)). En otras realizaciones, es el éster de succinimidilo de N-glutaril-dipalmitoil fosfatidil etanolamina (SuccNG-DPPE (es decir, en la que R3 y R4 con palmitoílo y n es 3)). En otras realizaciones, es el éster de succinimidilo de N-succinil-distearoil fosfatidil etanolamina (SuccNS-DSPE (es decir, en la que R3 y R4 son estearoilo y n es 2)). En otras realizaciones, es el éster de succinimidilo de N-adipinil-distearoil fosfatidil etanolamina (SuccNA-DSPE (es decir, en la que R3 y R4 son estearoilo y n es 4)). En determinadas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 2 es SuccNG-DOPE o SuccNG-DSPE.
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DOPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNω-DOPE. En otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DSPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNω-DSPE. En otras realizaciones adicionales, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DOPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNω-DSPE. En algunas otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DSPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNω-DOPE. En algunas de estas realizaciones, el éster de succinimidilo puede ser NHS (por ejemplo, NHS-Nω-DOPE, NHS-Nω-DSPE, etc.).
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNG-DOPE. En otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DSPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNG-DSPE. En otras realizaciones adicionales, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNG-DSPE. En algunas otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DSPE y el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es SuccNG-DOPE. En algunas de estas realizaciones, el éster de succinimidilo puede ser NHS (por ejemplo, NHS-NG-DOPE, NHS-NG-DSPE, etc.).
Preparación de ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico
Los ésteres de succinimidilo de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico descritas en el presente documento se pueden obtener por derivatización de las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílicos descritas en el presente documento, preparadas como es sabido en la materia y como se describe en el presente documento. La preparación de los ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico también se describe con mayor detalle a continuación, incluyendo los Ejemplos. A la vista de
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las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria descriptiva, el experto en la materia podrá también modificar los métodos descritos en el presente documento.
Un método para la producción de los ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido 5 N-(ω)-dicarboxílico descrito en el presente documento en de la siguiente forma:
A 1 equivalente de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico representadas por la Fórmula 2 tal como se describe en el presente documento se añaden aproximadamente 0,7-1,3 equivalentes de NHS, que se disuelven en un disolvente orgánico que no tiene hidrógeno activo. A continuación, la mezcla se hace
10 reaccionar con aproximadamente 0,7-1,3 equivalentes de un compuesto de carbodiimida a 0-50 ºC, durante aproximadamente 1-7 días.
De forma ilustrativa, los disolventes orgánicos que no tienen un hidrógeno activo incluyen, pero sin limitación, ésteres (por ejemplo, acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), hidrocarburos alifáticos (por ejemplo, hexano, heptanos, etc.),
15 hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, tolueno, xileno, etc.), hidrocarburos halogenados (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, dicloroetano, etc.), éteres (por ejemplo, THF, dioxano, dietil éter, etc.), hidrocarburos cíclicos (por ejemplo, ciclohexano, etc.), DMF y DMSO. El disolvente orgánico también puede estar deshidratado.
Puede usarse una amplia variedad de compuestos de carbodiimida, siempre que los compuestos tengan un grupo
20 carbodiimida (-N=C=N-). Por ejemplo, los compuestos de carbodiimida que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitación, grupos carbodiimida tales como N,N’-diciclohexil-carbodiimida (DCC), N,N’-diisopropil-carbodiimida, clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), etc. En determinadas realizaciones, se utiliza DCC. En otras se utiliza EDC.
25 La reacción anteriormente descrita también se puede llevar a cabo en condiciones que minimizan o eliminan la producción de subproductos. Los subproductos no deseados incluyen compuestos de urea (por ejemplo, N, N’-diciclohexilurea, N-etil-N’-(3-dimetil-aminopropil)urea, etc.), compuestos de urea N-acilados, compuestos de carboxianhidro y compuestos de 5-oxazolona. Las condiciones y materiales que no favorecen o minimizan la formación de subproductos incluyen, 1) disolución lenta de los compuestos de carbodiimida en un disolvente orgánico,
30 2) llevar a cabo la reacción bajo 0 ºC para evitar el desprendimiento de calor por la reacción, etc. Otros medios de optimizar la reacción y minimizar la producción de subproductos serán comprendidos por las personas expertas en la materia, especialmente a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.
El disolvente orgánico que puede disolver los compuestos de carbodiimida es el mismo que el disolvente orgánico, que
35 no tiene un hidrógeno activo tal como se ha descrito anteriormente.. El disolvente utilizado para disolver la carbodiimida y el disolvente orgánico sin hidrógenos activos pueden ser iguales o diferentes.
El progreso de la reacción se controla mediante sistemas de cromatografía analítica en capa fina (TLC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), y/o detectores evaporativos de dispersión de luz. Otros métodos para controlar el
40 progreso de la reacción también serán conocidos de los expertos en la materia.
La purificación se puede llevar a cabo mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando una mezcla de cloroformo y etanol. Otros métodos de purificación son conocidos generalmente por los expertos en la técnica.
45 En disolventes orgánicos completamente deshidratados y en ausencia de fuerte acidez o fuerte alcalinidad, los ésteres de succinimida de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico tal como se describen en el presente documento suelen ser estables.
Fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con un factor de 50 direccionamiento
Las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con un factor de direccionamiento incluyen un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, en el que la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, se
55 representa mediante la Fórmula 3,
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en la que R5 y R6 son, independientemente, un grupo acilo, y p es un número entero de 1 a 10.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento", y sus análogos, se refieren a las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico abarcadas por la Fórmula 3 modificadas con un factor de direccionamiento tal como se proporciona en el presente documento. Análogamente, la abreviatura TF-NωPE se utiliza para referirse a las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con un factor de direccionamiento (por ejemplo, TF-Nω-DOPE, TF-Nω-DSPE, TF-NG-DOPE, etc.), y, por ejemplo, TF-NG-PE se refiere a N-glutaril fosfatidil etanolamina(s) unidas a un factor de direccionamiento de Fórmula 3.
Se puede utilizar una amplia variedad de grupos acilo representados por R5 y R6, tal como entienden bien las personas expertas en la materia y como se ha descrito anteriormente para R1 y R2. Salvo que se indique de otra forma en el presente documento, se pretende expresamente que la descripción provista en el presente documento de los grupos acilo con respecto a la Fórmula 1 (por ejemplo, R1 y R2) es igualmente aplicable a los grupos acilo con respecto a la Fórmula 3 (por ejemplo, R5 y R6). Incluyendo, en particular, la descripción anterior en la sección titulada "fosfatidil etanolaminas derivatizadas con N-(ω)-dicarboxílico".
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En determinadas realizaciones, Ry Rson el mismo grupo acilo. En otras realizaciones, Ry Rson grupos acilo diferentes. En determinadas realizaciones, R5 y R6 son oleoílo, esteroílo, palmitoílo o miristoílo. En algunas
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realizaciones, Ry Rson oleoílo. En otras realizaciones, Ry Rson estereaolilo. En determinadas realizaciones, R
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y Rson palmitoílo. En otras realizaciones, Ry Rson miristoílo.
En determinadas realizaciones, p es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En otras realizaciones, p es un número entero de 1-8, 1-6, 1-5, 1-7, 1-3, 1-2, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-4, 3-5, o 3-6. En algunas realizaciones, p es un número entero de 2-4. En otras realizaciones, p es 1, 2 o 3.
En determinadas realizaciones, p es un número entero de 1 a 4. Como reconoce un experto en la materia, p=1 corresponde a un derivado de ácido malónico de la fosfatidil etanolamina (PE), mientras que p= 2, 3, o 4, representan ácido succínico, ácido glutárico, y derivados de ácido adípico de la PE, respectivamente. En algunas realizaciones, p es 3 (ácido glutárico).
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento de Fórmula 3 es una N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina modificada con un factor de direccionamiento (TF-NG-DOPE). En otras realizaciones, es una N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina modificada con un factor de direccionamiento (TF-NG-DSPE). En determinadas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento de Fórmula 3 es TF-NG-DOPE o TF-NG-DSPE.
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 3 es N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (NG-DOPE (es decir, en la que R5 y R6 son oleílo y p es 3)). En otras realizaciones, es N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina (NG-DSPE (es decir, en la que R5 y R6 son estearoilo y p es 3). En otras realizaciones, es N-glutaril-dimiristoil fosfatidil etanolamina (NG-DMPE (es decir, en la que R5 y R6 son miristoílo y p es 3)). En otras realizaciones, es N-glutaril-dipalmitoil fosfatidil etanolamina (NG-DPPE (es decir, en la que R5 y R6 son palmitoílo y p es 3)). En otras realizaciones, es N-succinil-distearoil fosfatidil etanolamina (NS-DSPE (es decir, en la que R5 y R6 son estearoilo y p es 2). En otras realizaciones, es N-adipinil-distearoil fosfatidil etanolamina (NA-DSPE (es decir, en la que R5 y R6 son estearoilo y p es 4). En determinadas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico de Fórmula 3 es NG-DOPE o NG-DSPE.
En determinadas realizaciones, el ligando de direccionamiento es transferrina (Tf), que se describe con mayor detalle en lo sucesivo, y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico incorporada en la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina tiene la Fórmula 3, como se describen en el presente documento.
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En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DOPE y el ligando de direccionamiento es transferrina (Tf), y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es Tf-Nω-DOPE. En otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DSPE y el ligando de direccionamiento es transferrina (Tf), y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es Tf-Nω-DSPE. En otras realizaciones adicionales, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DOPE y el ligando de direccionamiento es transferrina (Tf), y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es Tf-Nω-DSPE. En algunas otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es Nω-DSPE y el ligando de direccionamiento es transferrina (Tf), y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es Tf-Nω-DOPE. En algunas de estas realizaciones, m puede ser 3 y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-PE de acuerdo con la Fórmula 1.
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es TF-NG-DOPE. En otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DSPE y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es TF-NG-DSPE. En otras realizaciones adicionales, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DOPE y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es TF-NG-DSPE. En algunas otras realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico es NG-DSPE y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento es TF-NG-DOPE.
La fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento se puede preparar a partir de SuccNωPE por reacción con el ligando de direccionamiento y otros reactivos tal como se describe con mayor detalle en el presente documento. El TF-NωPE bien puede prepararse antes de la mezcla con el resto de componentes lípidos de las composiciones que contienen lípidos descritos en el presente documento (y purificado de forma opcional) o bien puede prepararse in situ a partir de la reacción de SuccNωPE previamente preparado que se ha incorporado a una composición que contienen lípidos.
Componentes lípidos adicionales
Las composiciones que contienen lípidos tal como se describe en el presente documento también contienen uno o más componentes lípidos adicionales además de las NωPE, SuccNωPE y/o TF-NωPE descritas en el presente documento. Se puede utilizar varios componentes lípidos adicionales, sin embargo, no se pretende que la expresión "componente(s) lípidos(s) adicional(es)" incluya fosfatidil etanolaminas (PE) no derivatizadas o derivados de PE como en las Fórmulas 1, 2 o 3. En algunas realizaciones, el uno o más componente(s) lípidos(s) adicional(es)" puede(n) ser un fosfolípido o uno o más fosfolípidos. En determinadas realizaciones, el uno o más componente(s) lípidos(s) adicional(es)" puede(n) incluir al menos dos lípidos neutros. En otras realizaciones, pueden estar presentes uno o más fosfolípidos y, opcionalmente, un "lípido adicional" (que no es un fosfolípido). Se puede utilizar varios lípidos neutros, sin embargo, no se pretende que los al menos dos lípidos neutros incluya fosfatidil etanolaminas (PE) no derivatizadas
o derivados de PE como en las Fórmulas 1, 2 o 3. No se pretende que el término "fosfolípido", tal como se usa en el presente documento, deberá incluir PE o sus derivados, como en las Fórmulas 1, 2 o 3. De manera similar, el término "lípido adicional" no incluye PE o sus derivados, como en las Fórmulas 1, 2 o 3, ni tampoco incluye otros fosfolípidos.
En realizaciones particulares, el(los) fosfolípido(s) pueden utilizarse en las composiciones que contienen lípidos y sus formulaciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, uno o más, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro fosfolípidos; o, dos, tres, o cuatro fosfolípidos. En realizaciones concretas, hay un fosfolípido. En determinadas realizaciones, los componentes lípidos de las composiciones están limitados a un fosfolípido, el NωPE, y el SuccNωPE (o NωPE modificado por TF, en el que se ha llevado a cabo la reacción con el factor de direccionamiento).
En realizaciones particulares, dos o más lípidos neutros pueden utilizarse en las composiciones que contienen lípidos y sus formulaciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro lípidos neutros; o, dos, tres, o cuatro lípidos neutros. En realizaciones particulares hay dos lípidos neutros. En determinadas realizaciones, los componentes lípidos de las composiciones están limitados a dos lípidos neutros, el NωPE, y el SuccNωPE (o NωPE modificado por TF, en el que se ha llevado a cabo la reacción con el factor de direccionamiento).
En algunas realizaciones, en el que el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen un fosfolípido, el fosfolípido puede ser una fosfatidilcolina, incluyendo las fosfatidilcolinas naturales, semisintéticas o sintéticas (por ejemplo, DSPC, DMPC, etc.). En algunas realizaciones, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina de origen no natural (por ejemplo, fosfatidilcolina no de huevo). En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una acilfosfatidilcolina (por ejemplo, DMPC, DPPC, POPC, DSPC, etc.). En algunas realizaciones, el fosfolípido es catiónico. En otras realizaciones el fosfolípido es aniónico. En otras realizaciones adicionales, el fosfolípido es neutro. En realizaciones particulares, el uno o más fosfolípido(s) no son aniónicos. En otras realizaciones, el uno o más fosfolípido(s) no son catiónicos. En determinadas realizaciones en el que más de un fosfolípido está presente, se puede incluir un lípido
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aniónico y neutro. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, fosfatidilcolinas (PC), ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, etc. En algunas realizaciones, las composiciones que contienen lípido no contienen fosfatidilserina o fosfatidilglicerol.
En determinadas realizaciones, al menos uno de al menos dos lípidos neutros puede ser un fosfolípido. En algunas realizaciones, el fosfolípido puede ser una fosfatidilcolina, incluyendo las fosfatidilcolinas naturales, semisintéticas o sintéticas (por ejemplo, DSPC, DMPC, etc.). En algunas realizaciones, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina de origen no natural (por ejemplo, fosfatidilcolina no de huevo). En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una acilfosfatidilcolina (por ejemplo, DMPC, DPPC, POPC, DSPC, etc.).
En algunas realizaciones, al menos uno de al menos dos lípidos neutros pueden ser colesterol o un derivado de colesterol (por ejemplo, colesterol pululano, colesterol cargado positivamente (por ejemplo, DC-Chol)), que incorpora
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un resto de un radioisótopo (por ejemplo, H, C, I, I, etc.), que tiene un resto funcional (por ejemplo, un resto fluorescente, etc.).
En determinadas realizaciones, en el que las composiciones que contienen lípidos incluyen uno o más fosfolípidos, las composiciones pueden comprender adicionalmente un no fosfolípido neutro adicional como el lípido adicional. Por ejemplo, colesterol o un derivado de colesterol como se ha descrito anteriormente.
Los fosfolípidos (no PE) para su uso en las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento incluyen fosfolípidos sintéticos, semisintéticos y naturales. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, etc. En otras realizaciones, los uno o más fosfolípidos incluyen fosfatidilcolina (PC) o ácido fosfatídico y no incluyen fosfatidilserina o fosfatidilglicerol.
En algunas realizaciones, el fosfolípido es una fosfatidilcolina. En determinadas realizaciones, la fosfatidilcolina puede ser, por ejemplo, distearoil fosfatidil colina (DSPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), etc. En determinadas realizaciones, al menos un fosfolípido es una fosfatidilcolina. En algunas de estas realizaciones, la fosfatidilcolina es DMPC. En otras realizaciones, la fosfatidilcolina es DSPC. En otras realizaciones, la fosfatidilcolina es DPPC. En otras realizaciones, la fosfatidilcolina es POPC. En otras realizaciones, la fosfatidilcolina es EPC. En otras realizaciones, la fosfatidilcolina es HSPC. En algunas realizaciones, se incluye un fosfolípido y es DMPC, DSPC, DPPC, POPC, EPC o HSPC. En realizaciones particulares en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es DMPC. En otras realizaciones en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es DSPC. En otras realizaciones en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es DPPC. En otras realizaciones en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es POPC. En otras realizaciones en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es EPC. En otras realizaciones en el que la composición que contiene lípidos incluyen un solo fosfolípido (fosfolípido no PE), el fosfolípido es HSPC.
En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) pueden incluir al menos un fosfolípido y, opcionalmente, un lípido adicional tal como colesterol o un derivado de colesterol. En realizaciones particulares, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son un único fosfolípido y colesterol. En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen al menos una fosfatidilcolina y colesterol. En realizaciones particulares, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen una sola fosfatidilcolina y colesterol. En determinadas realizaciones en el que se incluye colesterol, el fosfolípido es DSPC, DMPC, DPPC, POPC, EPC o HSPC. En algunas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y DMPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y DSPC. En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y uno de DMPC o DSPC. En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y DMPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y DSPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y DPPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y POPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y EPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen colesterol y HSPC. En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y uno de DMPC, DSPC, DPPC, POPC, EPC o HSPC. En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y DMPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y DSPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y DPPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y POPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y EPC. En otras realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) son colesterol y HSPC.
En realizaciones particulares, hay un fosfolípido y el fosfolípido no es HSPC o EPC.
En realizaciones particulares, hay uno o más fosfolípidos. En determinadas realizaciones, el uno o más fosfolípidos incluyen una fosfatidilcolina. En realizaciones particulares, están incluidos uno o más fosfolípidos y colesterol (o un derivado de colesterol). En determinadas realizaciones, el fosfolípido es una fosfatidilcolina y la composición incluye
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adicionalmente un colesterol (o un derivado de colesterol). En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina que incluye un resto de ácido graso saturado (por ejemplo, DMPC, DSPC o DPPC). En determinadas realizaciones la fosfatidilcolina no es fosfatidilcolina de huevo. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina no es HSPC.
5 En realizaciones particulares, hay dos lípidos neutros. En algunas realizaciones, los dos lípidos neutros son colesterol (o un derivado de colesterol) y una fosfatidil colina. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina que incluye un resto de ácido graso saturado (por ejemplo, DMPC, DSPC o DPPC). En determinadas realizaciones la fosfatidilcolina no es fosfatidilcolina de huevo.
10 El(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) tal como se describen en el presente documento, y los conocidos por los expertos en la materia, están comercialmente disponibles de numerosos proveedores, incluyendo, por ejemplo Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AK), Northern Lipid Inc. (Canadá), Lipoid GmbH (Alemania), NOF Corporation (Japón), Nippon Fine Chemical Co., Ltd (Japón).
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Fármacos
Pueden incluirse varios fármacos en las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento, por ejemplo, un compuesto o gen. En determinadas realizaciones, el fármaco puede ser un agente anticanceroso, por 20 ejemplo, un agente anticanceroso adecuado para su encapsulación en un liposoma. La cantidad de fármaco a incluir en las composiciones que contienen lípidos, y sus formulaciones, tal como se describe en este documento se pueden determinar fácilmente por el experto en la materia a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento y dependiendo del fármaco seleccionado y el uso previsto de la composición o formulación, teniendo en cuenta factores específicos tanto del fármaco como del individuo a tratar, tal como se describe adicionalmente en el
25 presente documento.
En determinadas realizaciones, el fármaco puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, ácido nucleico que codifica secuencias con propiedades anticancerosas. Por ejemplo, pero sin limitación, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, etc.
30 En algunas realizaciones, el agente anticanceroso puede ser un fármaco citotóxico, incluyendo los conocidos por los expertos en la materia y los especialistas médicos. Los agentes anticancerosos ilustrativos incluyen inhibidores de la topoisomerasa I, alcaloides de la vinca, agentes alquilantes (incluyendo compuestos de platino), taxanos y otros conocidos por los expertos en la materia.
35 En algunas realizaciones, el fármaco anticanceroso puede ser un inhibidor de la topoisomerasa I, por ejemplo, pero sin limitación, topotecan, irinotecan, etc.
El fármaco anticanceroso también puede ser un alcaloide de la vinca, por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinleurosina, 40 vinrodisina, vinorelbina, vindesina, etc.
Además, el fármaco anticanceroso también puede ser un compuesto de platino. Los ejemplos no limitantes de compuestos de platino incluyen biplatino, cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino, espiroplatino, etc.
45 El oxalilplatino (complejo de cis-oxalato de platino(II) de trans-1-1,2-diaminociclohexano) es un complejo de platino, más específicamente, un complejo de organoplatino que tiene la estructura representada por la siguiente fórmula que se muestra a continuación. El oxalilplatino también se conoce como los siguientes: diaminociclohexano platino, DACH-platino, y cis-[(1R, 2R)-1,2-ciclohexanodiamina-N,N'] [oxalato(2)-0,0’] platino (C8H14N2O4Pt; PM 397,4 g/mol).
50 Como se ha mencionado anteriormente, el oxaliplatino es el principio farmacéuticamente activo de Eloxatin™.
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El oxalilplatino es útil como agente antitumoral, ya que tiene una actividad terapéutica similar a la del cisplatino y una
55 nefrotoxicidad y emetotoxicidad (vómitos) relativamente bajas. Los procedimientos de producción del oxaliplatino son bien conocidos en la materia (por ejemplo, el documento JP-A-9-40685; las patentes de los Estados Unidos números 4.169.846, 5.338.874; 5.959.133; 5.298.642; y 5.290.961. El oxalilplatino se describe adicionalmente en Chaney SG et al. "Recognition and processing of cisplatin-and oxaliplatin-DNA adducts. "Crit Rev Oncol Hematol. (2005) 53: 3-11.
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En determinadas realizaciones, la concentración de oxaliplatino encapsulada en el interior del liposoma es de aproximadamente 1 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 0,8 mg/ml.
En general, la composición de lipídica descrita en el presente documento contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido. Por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de 10 a aproximadamente 150 µg TF/mg lípido.
En determinadas realizaciones, las composiciones contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 µg de oxaliplatino/mg lípido, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 1 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 2 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 4 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 5 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 10 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 15 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 20 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 30 µg de oxaliplatino/mg lípido, aproximadamente 40 µg de oxaliplatino/mg lípido, o aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido.
En determinadas realizaciones, las composiciones contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 145 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 115 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 140 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 125 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 µg de TF/mg lípido, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 1 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 5 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 10 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 25 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 40 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 50 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 70 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 120 µg de TF/mg lípido, aproximadamente 140 µg de TF/mg lípido, o aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido.
En algunas realizaciones, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido. En algunas realizaciones, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 µg/mg. En determinadas realizaciones, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido; de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido; o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 µg de oxaliplatino/mg lípido y de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 µg de TF/mg lípido.
En determinadas realizaciones, la concentración de oxaliplatino en la formulación de liposoma es 0,8 +/-10 % mg/ml.
En determinadas realizaciones, en el que el fármaco es oxaliplatino, el oxaliplatino se puede disolver en una solución (por ejemplo, una solución acuosa). En algunas realizaciones, la solución incluye un azúcar (por ejemplo, trehalosa, maltosa, sacarosa, lactosa, manosa, manitol, glicerol, dextrosa, fructosa, etc.). La concentración del azúcar puede ser
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de varias unidades porcentuales. Por ejemplo, concentraciones de azúcar (v/v) de aproximadamente 0,1 -12 %; 0,5-12%, 1%-12%, 2%-8%, 2%-6%, 2%-5%, 2%-4%, 2%-5%, 2%-6%, 2%-8%, 2%-9%, 2%-10%, 4 %-10 %, 4 %-9 %, 4 %-8 %, 4 %-6 %, 3 %-4 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 % o aproximadamente 10 %. En determinadas realizaciones, la solución incluye un azúcar y es acuosa. Se pretende que la solución en la que se disuelve el oxaliplatino pueda también contener componentes adicionales, incluyendo los conocidos por los expertos en la materia.
En determinadas realizaciones, la concentración de azúcar es de aproximadamente 5 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 % o aproximadamente 10 %. En otras realizaciones, la concentración de azúcar es de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, el azúcar es dextrosa y la concentración de dextrosa en la solución de oxaliplatino es de aproximadamente 5 %. En algunas realizaciones, el azúcar es dextrosa y la concentración de dextrosa en la solución de oxaliplatino es de aproximadamente 9 %. En determinadas realizaciones, el azúcar es sacarosa y la concentración de sacarosa en la solución de oxaliplatino es de aproximadamente 9 %. En determinadas realizaciones, el azúcar es sacarosa y la concentración de sacarosa en la solución de oxaliplatino es de aproximadamente 10 %.
En algunas realizaciones, la concentración del azúcar en la solución puede ser, por ejemplo de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, de aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 105 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, o aproximadamente 140 mg/ml.
La solución también puede contener otros ingredientes conocidos de los expertos en la materia, tal como, pero sin limitación, sales, tampones, alcoholes azucarados, etc. En determinadas realizaciones, la solución en la que se disuelve el oxaliplatino es fosfato de sodio (por ejemplo, fosfato de sodio monobásico y/o dibásico).
En determinadas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mM. Por ejemplo, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 12 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 10 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 7 mM, entre aproximadamente 7 mM y aproximadamente 12 mM, entre aproximadamente 7 mM y aproximadamente 15 mM, entre aproximadamente 9 mM y aproximadamente 12 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 12 mM o aproximadamente 15 mM.
En determinadas realizaciones, el azúcar puede incluir adicionalmente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,5 mg/ml de fosfato de sodio. Por ejemplo, de aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,5 mg/ml, de 1,0 a aproximadamente 1,7 mg/ml, de 1,0 a aproximadamente 2 mg/ml, de 1,0 a aproximadamente 2,5 mg/ml, de 1,0 a aproximadamente 3 mg/ml, de 0,5 a aproximadamente 3,5 mg/ml de fosfato de sodio.
En algunas realizaciones, el pH de la solución será de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 6,8, o aproximadamente 6,5.
En algunas realizaciones, el fármaco es oxaliplatino, y está contenido en una solución de aproximadamente 9 % de sacarosa. En algunas realizaciones, el fármaco es oxaliplatino, y está contenido en una solución de aproximadamente 9 % de sacarosa para una concentración de oxaliplatino de aproximadamente 1 mg/ml. En algunas realizaciones, el fármaco es oxaliplatino, y está contenido en una solución de aproximadamente 105 mg/ml de sacarosa. En algunas realizaciones, el fármaco es oxaliplatino, y está contenido en una solución de aproximadamente 105 mg/ml de sacarosa para una concentración de oxaliplatino en el liposoma de aproximadamente 1 mg/ml. En algunas de estas realizaciones, la solución comprende además fosfato de sodio. En determinadas realizaciones, el oxaliplatino está en una concentración de aproximadamente 0,8 +/-10 % mg/ml de solución de liposoma.
Compuestos marcados
Pueden incluirse varios compuestos marcados en las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento. En general, el compuesto marcado puede ser un agente útil para llevar a cabo procedimientos diagnósticos in vivo.
Tal como para la incorporación y uso de los fármacos descritos en el presente documento, la cantidad de compuesto marcado a incluir en las composiciones que contienen lípidos, y sus formulaciones, tal como se describe en este documento se pueden determinar fácilmente por el experto en la materia a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento y dependiendo del compuesto marcado y el uso previsto de la composición o formulación, teniendo en cuenta factores específicos tanto del compuesto marcado como del individuo a diagnosticar, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
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Los compuestos marcados ilustrativos incluyen, por ejemplo, materiales que comprenden radioisótopos (por ejemplo,
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H, C, Ga, In, I, I, Xe, etc.), material que comprende restos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, etc.), material que comprende enzima (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.), así como compuestos marcados adicionales conocidos por los expertos en la materia.
Como apreciarán los expertos en la materia, la selección del compuesto marcado y los métodos utilizados en diagnóstico dependerán del órgano (por ejemplo, hígado, páncreas, próstata, etc.), tejido (por ejemplo, tipo de tejido maligno o no maligno (por ejemplo, mama, etc.)) a investigar. Por ejemplo, las composiciones que contienen lípidos (por ejemplo, liposomas dirigidos, composiciones que contienen liposomas, etc.) que incorporan 125I son especialmente útiles para identificar la presencia y determinar la gravedad (por ejemplo, inicialmente, durante un ciclo de tratamiento, después del tratamiento) de varios cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, etc.) mediante recuento gamma.
Factores de direccionamiento
Salvo que se indique otra cosa, los términos "factor de direccionamiento" y "ligando de direccionamiento" pueden usarse indistintamente en el presente documento.
Las composiciones que comprenden lípidos descritas en el presente documento se caracterizan por incorporar una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada por un factor de direccionamiento (es decir, TF-NωPE) dirigido a una célula diana particular. El término "factor de direccionamiento" se refiere a un resto que se puede unir a un receptor o a un antígeno superficial presente en la superficie de una célula diana. En determinadas realizaciones, los factores de direccionamiento se dirigen a los receptores del a superficie celular de una célula diana particular. El factor de direccionamiento es frecuentemente una proteína o péptido que se puede unir a un componente lípido de la composición que comprende lípidos.
De forma más eficaz, los factores de direccionamiento se seleccionan de tal forma que el receptor o antígeno diana está presente solamente en las células que son objetivo de la administración del fármaco o compuesto marcado (por ejemplo, células patógenas) y no está presente en células sanas. Como alternativa, un mayor número de receptores o antígenos se expresan en las células diana (por ejemplo, células patógenas o enfermas) en comparación con las células no diana (por ejemplo, células sanas). Preferentemente, el receptor o antígeno que se une al factor de direccionamiento bien no está presente o está presente en baja cantidad en las células sanas de forma que la unión al factor de direccionamiento no se produce con frecuencia. En otras palabras, los factores de direccionamientos deben administrar los liposomas selectivamente como se describe en el presente documento (incluyendo fármaco encapsulado) a las células diana (por ejemplo, patógenas, no sanas, etc.). La administración selectiva del fármaco encapsulado a las células diana reduce de esta forma la aparición de efectos adversos debido al efecto del fármaco encapsulado o compuesto marcado sobre las células no diana (por ejemplo, células sanas), reduciendo también de esta forma los efectos adversos experimentados por el individuo al que se administra la composición o formulación de la misma.
Los factores de direccionamiento ilustrativos incluye, pero sin limitación, transferrina, ácido fólico, folato, ácido hialurónico, cadenas de azúcar (por ejemplo, galactosa, manosa, etc.), fragmentos de anticuerpos monoclonales, asialoglicoproteína, etc., así como otros factores de direccionamiento conocidos del experto en la materia.
En realizaciones particulares, el factor de direccionamiento es una proteína o péptido dirigido a un receptor de la superficie celular (por ejemplo, transferrina, folato, ácido fólico, asialoglicoproteína, etc.).
En otras realizaciones, el factor de direccionamiento se dirige a un antígeno (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab’)2, Fc, etc.)). No está previsto que los factores de direccionamientos incluyan anticuerpos monoclonales intactos o completos. El término "anticuerpo completo" o "anticuerpo intacto", y sus análogos, tal como se usa en el presente documento se refiere de forma general a una IgG anticuerpo de una globulina inmune. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal se refiere de forma general a un producto de descomposición del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un fragmento obtenido usando digestión con proteasa, tal como pepsina, etc.
En determinadas realizaciones, el factor de direccionamiento no se dirige a un antígeno (por ejemplo, no es un fragmento de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab’)2, Fc, etc.).
En determinadas realizaciones, el factor de direccionamiento es transferrina.
La transferrina (Tf) es una proteína de unión a hierro con un peso molecular de 80.000, que se sintetiza en los hepatocitos y se encuentra en la sangre. La transferrina suministra hierro (Fe) a las células a través de los receptores de Tf en la superficie de cada célula. El receptor de transferrina se expresa de manera general en tejidos tumorales en una mayor cantidad si se compara con los tejidos normales independientemente del tipo de tumor. Las membranas de las células tumorales son conocidas por expresar en exceso los receptores de transferrina para mantener la proliferación celular. Véase Shindelman JE, Ortmeyer AE, Sussman HH. "Demonstration of the transferrin receptor in human breast cancer, tissue. Potential marker for identifying divining cells." Int J Cancer. (1981) 27(3):329-34; Lloyd
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JM, O’Dowd T, Driver M, Tee DE. "Demonstration of an epitope of the transferring receptor in human cervical epithelium--a potentially useful cell marker." J Clin Pathol. (1984) 37(2):131-5; y Habeshaw JA, Lister TA, Stansfeld AG, Greaves MF. "Correlation of transferrin preceptor expression with histological class and outcome in non-Hodgkin lymphoma." Lancet. (1983) 1(8323): 498-501. La unión de los agentes terapéuticos a la transferrina mejorará de esta forma la captación del fármaco al interior de las células tumorales a través del receptor de la transferrina. Sin desear quedar vinculado a un mecanismo de acción, la ruta de captación probable de los liposomas de transferencia descritos en el presente documento se representa esquemáticamente en las Figs. 2 y 3. El transferrina está comercialmente disponible, o se puede producir de forma recombinante como se describe en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nº 5.026.651.
Sin desear quedar vinculado por teoría alguna, se cree que la conjugación de transferrina (Tf) con la NωPE se produce por reacción entre una amina primaria con la NωPE que da como resultado la formación de un enlace amida de ácido carboxílico entre el ancla del lípido y la proteína.
En determinadas realizaciones, la relación molar de Tf al lípido total presente en el producto de liposoma dirigido es de aproximadamente 0,00014:1 mol/mol (Tf:lípido total ) (0,015, p/p). En otras realizaciones, la relación molar de Tf: lípido total es de aproximadamente 0,016 a aproximadamente 0,029:aproximadamente 126 aproximadamente 158 mM/mM.
Composiciones que comprenden lípidos
Las composiciones que comprenden lípidos descritas en el presente documento incluyen liposomas dirigidos que incorporan lípidos derivatizados, lípidos adicionales y fármaco o compuesto marcado encapsulado, así como los compuestos intermedios utilizados para preparar los liposomas dirigidos, incluyendo mezclas de lípidos y composiciones que contienen liposomas, tal como se describe en el presente documento, en el que las composiciones que comprenden lípidos (incluyendo liposomas dirigidos) están exentos de -fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como, pero sin limitación, polietilenglicol. Las composiciones que comprenden lípidos también incluyen liposomas que incorporan una TF, pero no incluyen un fármaco o un compuesto marcado (por ejemplo, liposomas vacíos).
Como se usa en el presente documento, el término "polímero hidrófilo", y sus análogos, se refiere a polímeros tales como polietilenglicol (PEG) y otros polímeros polietoxilados que se usan en el campo de los liposomas para proteger los liposomas en un intento de mejorar la semivida en circulación del liposoma. Se pretende que este término abarque polímeros hidrófilos libres asociados no covalentemente con los liposomas, así como polímeros hidrófilos que se hayan conjugado de alguna forma o se hayan unido covalentemente a un componente particular del liposoma (por ejemplo lípidos modificados con PEG, etc.). Dichos polímeros hidrófilos también se denominan alternativamente en el campo como polímeros "solubles en agua". Los polímeros hidrófilos adicionales ilustrativos incluyen, pero sin limitación, poli(alcohol vinílico), poli(ácido láctico), poli (ácido glicólico), polivinilpirrolidona, poliacrilamida, poliglicerol, polioxazolinas, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "mezcla de lípidos", y sus análogos, se refiere a mezclas de componentes lípidos tal como se describe en el presente documento, en el que la mezcla lípida no incorpora solución, por ejemplo, solución acuosa (por ejemplo, agua, tampón o una mezcla de agua y un disolvente miscible con el agua (por ejemplo, azúcar (por ejemplo, trehalosa, sacarosa, lactosa, manosa, dextrosa, fructosa, etc.), alcohol de azúcar (por ejemplo, sorbitol, maltitol, lactitol, glicerol, manitol, etc.), alcoholes (por ejemplo, etanol, t-butanol, etc.), etc.)) o disolvente orgánico.
El término "composición que contiene liposoma," y sus análogos, se refiere a una mezcla de lípidos y, opcionalmente, fármaco(s) o compuesto(s) marcado(s), en el que una solución acuosa (por ejemplo, agua, tampón (por ejemplo, tampón acetato, tampón fosfato, tampón citrato, tampón borato, tampón tartrato, etc.) o una mezcla de agua y un solvente miscible con el agua) se ha incorporado por mezclado (por ejemplo, uno más de, agitación, sacudida, etc.). La solución acuosa también puede incluir componentes adicionales tales como uno o más azúcares (por ejemplo, trehalosa, maltosa, sacarosa, lactosa, manosa, dextrosa, fructosa, etc.), alcohol de azúcar (por ejemplo, sorbitol, maltitol, lactitol, manitol, glicerol, etc.), alcoholes (por ejemplo, etanol, t-butanol, etc.), etc. Y la solución acuosa también puede incluir disolvente orgánico ((por ejemplo, ésteres (por ejemplo, acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), hidrocarburos alifáticos (por ejemplo, hexano, heptano, etc.), hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, tolueno, xileno, etc.), hidrocarburos halogenados (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, dicloroetano, etc.), éteres (por ejemplo, THF, dioxano, dietil éter, isopropil éter, etc.), hidrocarburos cíclicos (por ejemplo, ciclohexano, etc.), DMF, DMSO, etc.)
o sus mezclas). La composición que comprende lípidos contendrá por lo general una mezcla no homogénea de lípidos, solución acuosa, y liposomas que tengan una amplia distribución de aproximadamente 100-10.000 nm y un diámetro promedio de 500-2.000 nm. La caracterización de composiciones que contienen liposomas ilustrativas se proporciona adicionalmente en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden lípidos no incorporan polímeros hidrófilos. En realizaciones particulares, las composiciones que comprenden lípidos no incorporan PEG.
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En algunas realizaciones, las mezclas de lípidos intermedios incluyen al menos dos lípidos neutros diferentes o uno o más fosfolípidos, y una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, en el que los componentes lípidos se describen con más detalle en el presente documento y en el que la mezcla está exenta de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende lípidos. En determinadas realizaciones, la mezcla lípida no incluye un fármaco o compuesto marcado. En realizaciones particulares, la mezcla lípida se puede tratar para formar una composición que contiene liposomas o una formulación de liposomas.
En algunas realizaciones, las mezclas de lípidos intermedios incluyen al menos dos lípidos neutros diferentes o uno o más fosfolípidos, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un fármaco o compuesto marcado, en el que los componentes lípidos y el fármaco/compuesto marcado se describen con más detalle en el presente documento y en el que la mezcla está exenta de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende lípidos, por ejemplo, en el que el fármaco o compuesto marcado se añaden a una solución acuosa de fármaco/compuesto marcado. En determinadas realizaciones, la composición que comprende lípidos se puede tratar (por ejemplo, mediante uno o más entre extrusión, cromatografía de exclusión por tamaño, etc. o métodos conocidos en la materia) para formar un liposoma.
En algunas realizaciones, las mezclas lípidas incluyen uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, en el que los componentes lípidos se describen con más detalle en el presente documento y en el que la mezcla está exenta de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. Las mezclas también pueden estar sustancialmente exentas de material de partida no NHS, subproductos y/o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende lípidos.
En algunas realizaciones, las mezclas lípidas intermedias incluyen uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico fármaco y modificada con un factor de direccionamiento, en el que los componentes lípidos se describen con más detalle en el presente documento y en el que la mezcla está exenta de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. Las mezclas también pueden estar sustancialmente exentas de material de partida no NHS, subproductos y/o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende lípidos. En algunas realizaciones, la mezcla lípida no incluye un fármaco o compuesto marcado. La mezcla lípida se puede tratar para formar una composición que contiene liposomas o una formulación de liposomas.
En algunas realizaciones, las mezclas lípidas intermedias incluyen uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un fármaco o compuesto marcado, en el que los componentes lípido y fármaco/compuesto marcado se describen con más detalle en el presente documento y en el que la composición está exenta de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. Las mezclas también pueden estar sustancialmente exentas de material de partida no NHS, subproductos y/o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende lípidos.
En determinadas realizaciones, las composiciones que contienen lípidos intermedias incluyen un liposoma que contiene uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y un éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y un fármaco encapsulado, en el que los componentes lípidos y de fármaco se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. Los liposomas también pueden estar sustancialmente exentos de material de partida no NHS, subproductos y/o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). En algunas realizaciones, la mezcla lípida no incluye un fármaco o compuesto marcado. La mezcla lípida se puede tratar para formar una composición que contiene liposomas
o una formulación de liposomas.
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En determinadas realizaciones, las mezclas lípidas incluyen uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y un fármaco o compuesto marcado encapsulado, en el que el lípido, factor de direccionamiento y componentes lípido y fármaco/compuesto marcado se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones de las mezclas lipídicas, los liposomas están sustancialmente exentos de material de partida no NHS, subproductos o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). En realizaciones particulares, la mezcla lípida es una composición que comprende liposomas (por ejemplo, en el que el fármaco o compuesto marcado se añaden en forma de solución acuosa de fármaco/compuesto marcado. De manera opcional, una solución acuosa como se ha descrito en el presente documento se puede mezclar con los componentes lípidos para formar una composición que comprende liposomas.
En determinadas realizaciones, los liposomas dirigidos incluyen liposomas que contienen uno o más fosfolípidos o al menos dos lípidos neutros diferentes, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y un fármaco o compuesto marcado encapsulado, en el que el lípido, factor de direccionamiento y componentes lípido y fármaco o compuesto marcado se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones de los liposomas dirigidos, los liposomas están sustancialmente exentos de material de partida no NHS, subproductos o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.). Sin embargo, en algunas realizaciones, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico puede estar presente en las etapas iniciales de la preparación de los liposomas dirigidos (por ejemplo, NHS-NG-PE (por ejemplo, NHS-NG-DOPE, NHS-NG-DSPE, etc.), por ejemplo, antes de la hidrólisis del éster de succinimidilo que puede ocasionar, por ejemplo NHS y NG-DOPE en la formulación final. En determinadas realizaciones, en el que SuccNωPE no se ha incorporado al interior del liposoma, el liposoma o la composición que comprende lípidos también puede estar exenta o prácticamente exenta de NHS, como cuando TF-NωPE se preforma y se utiliza como material de partida. En realizaciones particulares, los liposomas dirigidos están prácticamente exentos de DCC y EDC. En determinadas realizaciones, los liposomas dirigidos están prácticamente exentos de DCC.
Adicionalmente, cada una de las composiciones que comprende lípidos descrita en el presente documento se puede tratar para producir liposomas. La producción de liposomas es bien conocida en la materia y, además, se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo como se describe para los métodos de producción A y B, que se describen con mayor detalle en lo sucesivo. Los métodos de producción de liposomas a parir de composiciones que contienen lípidos incluyen, pero sin limitación, extrusión, sonicación, vesículas en fase inversa, congelación-descongelación, cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración, etc. y sus combinaciones. Los liposomas formados a partir de las composiciones que composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento pueden incorporar un fármaco o compuesto marcado o pueden estar exentas de fármaco o compuesto marcado (por ejemplo, para liposomas, también se denominan en el presente documento como "liposomas en blanco"). En realizaciones particulares, las composiciones que contienen lípidos, liposomas (incluyendo liposomas en blanco) y liposomas dirigidos pueden formularse como formulaciones farmacéuticas y, además, pueden usarse en los métodos de tratamiento o diagnóstico y/o kits descritos en el presente documento.
El término "sustancialmente exento" se refiere a niveles de materiales que no son detectables o mínimamente detectables mediante métodos analíticos rutinarios usados en el campo. Por ejemplo, HPLC (véase por ejemplo, European Pharmacopoeia 5ª Ed.), TLC, cromatografía de gases, etc., así como otros métodos analíticos conocidos del experto en la materia.
Por ejemplo, las composiciones que comprenden lípidos pueden contener menos de aproximadamente 0,1 %, menos de aproximadamente 0,5 %, menos de aproximadamente 1 %, menos de aproximadamente 2 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 4 %, menos de aproximadamente 5 %, o menos de aproximadamente 6 % en peso de un material de partida concreto, subproductos o producto de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico con respecto al contenido lípido total. En realizaciones particulares, las composiciones contendrán menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 7 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de impurezas totales (por ejemplo, % suma de materiales de partida, subproductos y productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico).
En algunas realizaciones, los liposomas dirigidos incluyen liposomas que contienen una fosfatidilcolina (por ejemplo, neutra, aniónica o catiónica), colesterol o un derivado de colesterol, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y un fármaco o compuesto marcado encapsulado, en el que el lípido, factor de direccionamiento y
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componentes de fármaco se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina neutra.
En realizaciones particulares, los liposomas dirigidos incluyen liposomas que contienen una fosfatidilcolina (por ejemplo, neutra, aniónica o catiónica), colesterol o un derivado de colesterol, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina y fármaco o compuesto marcado encapsulado, en el que los componentes lípidos y el fármaco/compuesto marcado se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina neutra.
En realizaciones particulares, los liposomas dirigidos incluyen liposomas que contienen una fosfatidilcolina (por ejemplo, neutra, aniónica o catiónica), colesterol o un derivado de colesterol, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina y oxaliplatino encapsulado, en el que los componentes lípidos se describen con más detalle en el presente documento y en donde el liposoma está exento de fosfatidil etanolamina no derivatizada y polímeros hidrófilos, tal como polietilenglicol. En realizaciones particulares, la fosfatidilcolina es una fosfatidilcolina neutra.
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden lípidos (incluyendo liposomas dirigidos y liposomas en blanco), y sus formulaciones, descritos en el presente documento contienen además lípidos obtenido por derivatización de fosfatidilglicerol, esfingosina, ceramida, un derivado de colesterol o similares con un ácido dicarboxílico. Estos derivados de ácido dicarboxílico pueden prepararse como se describe en el presente documento para las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico y de acuerdo con los métodos de preparación conocidos del experto en la materia.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden lípidos (incluyendo liposomas dirigidos y liposomas en blanco), y sus formulaciones, descritas en el presente documento no incluyen lípidos aniónicos (por ejemplo, fosfatidilserinas, fosfatidilinnositoles, fosfatidilgliceroles, etc.) o lípidos catiónicos (por ejemplo, esfingosina, DOTAP, DOTMA, DC-CHOL, etc.). En realizaciones particulares, las composiciones están exentas de lípidos aniónicos. En otras realizaciones, las composiciones están exentas de lípidos catiónicos. En determinadas realizaciones, las composiciones están exentas de lípidos catiónicos y aniónicos.
En algunas realizaciones, las composiciones que contienen lípidos, la composición comprende un fármaco. En otras realizaciones, las composiciones que comprenden lípidos comprenden un compuesto marcado.
En determinadas realizaciones de las composiciones que comprenden lípidos, el fármaco es oxaliplatino, el factor de direccionamiento (TF) es transferrina (Tf) y los componentes lípidos incluyen: DMPC o DSPC, y, colesterol o un derivado de colesterol, y una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina, en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con transferrina comprende una transferrina unida a una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico mediante un enlace amida al ácido carboxílico.
En algunas realizaciones, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento son NG-DOPE o NG-DSPE.
En realizaciones particulares, los componentes lípidos de las composiciones que comprenden lípidos son DMPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones, los componentes lípidos son DSPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones adicionales, los componentes lípidos son DMPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con transferrina. En algunas otras realizaciones, los componentes lípidos son DSPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con TF. En algunas de estas realizaciones, el factor de direccionamiento (TF) es transferrina y el fármaco es oxaliplatino.
En realizaciones particulares, los componentes lípidos son DPPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones, los componentes lípidos son POPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones adicionales, los componentes lípidos son DPPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con transferrina. En algunas otras realizaciones, los componentes lípidos son POPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con transferrina. En algunas de estas realizaciones, el factor de direccionamiento (TF) es transferrina y el fármaco es oxaliplatino.
En realizaciones particulares, los componentes lípidos son HSPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones, los componentes lípidos son EPC, colesterol, NG-DOPE y NG-DOPE modificada con transferrina. En otras realizaciones adicionales, los componentes lípidos son HSPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con transferrina. En algunas otras realizaciones, los componentes lípidos son EPC, colesterol, NG-DSPE, y NG-DSPE modificada con transferrina. En algunas de estas realizaciones, el factor de direccionamiento (TF) es transferrina y el fármaco es oxaliplatino.
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Relaciones de componentes lípidos
En general, el porcentaje molar de los materiales de partida NG-DOPE estará comprendido entre aproximadamente 2,5 % en moles y aproximadamente 4,5 % en moles, en comparación con el contenido lípido total. Adicionalmente, el porcentaje molar de los materiales de partida NHS-NG-DOPE estará comprendido entre aproximadamente 0,5 % en moles y aproximadamente 2,5 % en moles, en comparación con el contenido lípido total. En algunas realizaciones, la relación molar relativa de NG-DOPE a NHS-NG-DOPE será de aproximadamente 3.4: 1. En determinadas realizaciones, la relación %molar relativa de NG-DOPE a NHS-NG-DOPE puede ser de aproximadamente 4:1. En realizaciones particulares, en el que un fosfolípido neutro y un lípido neutro está presente, la relación molar de (por ejemplo, DMPC:Cho1:NG-DOPE:NHS-NG-DOPE) puede ser 43,0:38,5:3,42:1, que también se puede expresar como
50:45:4:1 mediante %mol.
En determinadas realizaciones, el %mol relativo del(de los) lípido(s) adicional(es) a NωPE a SuccNωPE (por ejemplo, al menos dos lípidos neutros:NωPE:SuccNωPE o uno o más fosfolípidos:NωPE:SuccNωPE o (uno o más fosfolípidos
+ lípido(s) neutro(s)):NωPE:SuccNωPE) puede ser de aproximadamente 98 %mol a aproximadamente 87 %mol de lípidos adicionales: de aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 12 %mol de NωPE: aproximadamente 0,5 %mol a aproximadamente 1 %mol de SuccNωPE; en el que el %mol total de todos los componentes es 100 %mol. Por ejemplo, lípidos adicionales:NωPE:SuccNωPE puede ser aproximadamente 95:4:1,90:9:1,92:7:1,93:6:1, etc.
En realizaciones particulares, en el que los lípidos adicionales incluyen un fosfolípido y otro lípido tal como colesterol, derivados de colesterol, etc., el intervalo de %mol para cada componente lípido es de aproximadamente 30 %mol a aproximadamente 64 %, en el que el total de lípidos adicionales es de aproximadamente 98 %mol a aproximadamente 87 %mol.
En determinadas realizaciones, en el que los lípidos adicionales son dos lípidos neutros diferentes, el intervalo de %moles de cada lípido neutro es de aproximadamente 30 %mol a aproximadamente 64 %mol, en el que el total de lípidos neutros es de aproximadamente 98 %mol a aproximadamente 87 %mol.
En una realización ilustrativa, en el que un lípido adicional es una fosfatidil colina y un segundo lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, el %mol de la fosfatidil colina es de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 %mol, (por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 64 %mol, de aproximadamente 40 a aproximadamente 65 %mol, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 %mol, de aproximadamente 50 a aproximadamente 62 %%mol, de aproximadamente 55 a aproximadamente 60 %mol, de aproximadamente 35 a aproximadamente 55 %mol, aproximadamente 30 %mol, aproximadamente 40 %mol, aproximadamente 45 %mol, aproximadamente 50 %mol, aproximadamente 55 %mol, aproximadamente 60 %mol, aproximadamente 65 %mol, aproximadamente 70 %mol) y el %mol del colesterol o derivado de colesterol es de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 %mol (por ejemplo, de aproximadamente 32 a aproximadamente 45 %mol, de aproximadamente 32 a aproximadamente 42 %mol, de aproximadamente 32 a aproximadamente 40 %mol, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 %mol, de aproximadamente 35 a aproximadamente 55 %mol, de aproximadamente 35 a aproximadamente 60 %mol, de aproximadamente 45 a aproximadamente 60 %mol, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 %mol, aproximadamente 30 %mol, aproximadamente 35 %mol, aproximadamente 40 %mol, aproximadamente 45 %mol, aproximadamente 50 %mol, aproximadamente 55 %mol o aproximadamente 60 %mol). En algunas realizaciones, la fosfatidil colina es aproximadamente 50 %mol, aproximadamente 52 %mol, aproximadamente 55 %mol, aproximadamente 58 %mol, aproximadamente 60 %mol, aproximadamente 62 %mol y el colesterol o derivados de colesterol es de aproximadamente 30 %mol, aproximadamente 32 %mol, aproximadamente 34 %mol, aproximadamente 35 %mol, aproximadamente 37 %mol, aproximadamente 38 %mol, aproximadamente 40 %mol, aproximadamente 42 %mol, aproximadamente 43 %mol, aproximadamente 45 %mol.
En realizaciones particulares, el %mol de NωPE es aproximadamente 1 a aproximadamente 11 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 6 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mol %, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 %mol, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 5 %mol, aproximadamente 1 %mol, aproximadamente 2 %mol, aproximadamente 3 %mol, aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 5 %mol, aproximadamente 7 %mol, aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 9 %mol aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 11 %mol, o aproximadamente 12 %mol.
En determinadas realizaciones, el %mol relativo del primer lípido adicional:segundo lípido adicional :NωPE:SuccNωPE es, por ejemplo 50:45:4:1. En algunas realizaciones, el primer lípido adicional es una fosfatidil colina (por ejemplo, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, etc.) y el segundo lípido adicional es colesterol. En algunas realizaciones, el PE de la NωPE es DOPE o DSPE. En realizaciones particulares, la NωPE es NG-DOPE o NG-DSPE. En algunas realizaciones, los lípidos son DM-PC:Chol:NG-DOPE:NHS-NG-DOPE y su %mol relativo es 50:45:4:1. En otras realizaciones, los lípidos son DSPC:Chol:NG-DSPE:NHS-NG-DSPE y su %mol relativo es 50:45:4:1. En otras realizaciones, los lípidos son DSPC:Chol:NG-DSPE:NHS-NG-DSPE y su %mol relativo es 62:33:4:1.
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En algunas realizaciones, el %mol total de NωPE y TF-NωPE (NωPE + TF-NωPE) es aproximadamente 2 a aproximadamente 13 %mol del contenido lípido total. Por ejemplo, aproximadamente 2 a aproximadamente 12 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 6 %mol, aproximadamente 2 a aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 2 %mol, aproximadamente 3 %mol, aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 5 %mol, aproximadamente 6 %mol, aproximadamente 7 %mol, aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 9 %mol, aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 11 %mol, o aproximadamente 12 %mol.
En general, el %mol total de TF-NωPE es aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,2 %mol relativo al contenido lípido total. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el %mol total de TF-NωPE es aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,15 %mol, el %mol de TF-NωPE es aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,1 %mol, 0,002 a aproximadamente 0,05 %mol, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,03 %mol, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,007 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,007 a aproximadamente 0,05 %mol, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,025 %mol, aproximadamente 0,015 a aproximadamente 0,025 %mol, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,04 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,06 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,08 a aproximadamente 0,2 %mol, aproximadamente 0,002 %mol, aproximadamente 0,008 %mol, aproximadamente 0,01 %mol, aproximadamente 0,02 %mol, aproximadamente 0,03 %mol, aproximadamente 0,025 %mol, aproximadamente 0,015 %mol, aproximadamente 0,06 %mol, aproximadamente 0,08 %mol, aproximadamente 0,1 %mol, aproximadamente 0,15 %mol, o aproximadamente 0,2 %mol.
Caracterización de liposomas y composiciones que composiciones que comprenden liposomas
Además de caracterizar las composiciones que comprenden lípidos según las relaciones de componentes (por ejemplo, relaciones de lípidos, relación de fármaco/compuesto marcado a lípido, etc.), las composiciones que comprenden liposomas tal como se describen en el presente documento también se pueden caracterizar (por ejemplo, propiedades fisicoquímicas, etc.) usando métodos analíticos convencionales, como apreciarán los expertos en la materia. Dichos métodos analíticos incluyen, pero no se limitan a y, en el que sea adecuado, determinación de diámetro promedio, volumen encapsulado, carga neta (potencial zeta), cantidad de fármaco atrapado (es decir, encapsulado), tamaño de partícula, estabilidad en diferentes condiciones (por ejemplo, en almacenamiento, tal como se prepara para la administración, in vitro), propiedades osmóticas, cantidad de factor de direccionamiento conjugado, etc. Los métodos analíticos ilustrativos para dicha caracterización se definen a continuación, así como en los Ejemplos, y los métodos adicionales conocidos del experto en la materia también pueden utilizarse para caracterizar las composiciones.
Como apreciarán los expertos en la materia, el contenido en fármaco de los liposomas también se puede determinar estableciendo métodos para análisis mediante HPLC, con los controles adecuados, tal como se lleva a cabo de forma rutinaria en la técnica y, además, tal como se describe en los Ejemplos. Usando los controles adecuados, la identidad del fármaco encapsulado también se puede determinar mediante HPLC o, para determinados fármacos (por ejemplo, fármacos que contienen platino) mediante los métodos analíticos tales como ICP-MS (plasma acoplado inductivamente-espectrometría de masas) tal como llevan a cabo los expertos en el campo.
En determinadas realizaciones, la cantidad de fármaco (por ejemplo, oxaliplatino, etc.) o compuesto marcado encapsulado en el interior del liposoma o composición que contiene liposoma puede ser de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml en el interior del liposoma. Por ejemplo, la concentración de fármaco puede ser de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,4 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml o aproximadamente 15 mg/ml en el interior del liposoma.
El potencial eléctrico en el plano de cizalladura se denomina el potencial zeta de un liposoma. Como conoce el experto en la materia, el potencial zeta de los liposomas se puede determinar experimentalmente usando instrumentación adecuada, por ejemplo tal como se mide en un equipo ELS-6000 (Otsuka Electronics, Japón) con el método de microelectroforesis con Doppler láser u otra instrumentación y los protocolos disponibles para el experto en la materia.
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Por ejemplo, J. Colloid and Interface Sci., 39, 670-675(1972), nition.com/en/products/zeecom_s.htm, etc.
En determinadas realizaciones, los liposomas (incluyendo los liposomas dirigidos y los liposomas de la composición que contiene liposomas) tal como se describe en el presente documento muestran un potencial zeta global neto negativo. En algunas realizaciones, el potencial zeta es de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -200 mV. Por ejemplo, de aproximadamente -50 mV a aproximadamente -150 mV, de aproximadamente -50 mV a aproximadamente -130 mV, de aproximadamente -60 a aproximadamente -120 mV, de aproximadamente -50 a aproximadamente -100 mV, de aproximadamente -75 mV a aproximadamente -90 mV, de aproximadamente -80 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente -80 mV a aproximadamente -85 mV, de aproximadamente -85 mV a aproximadamente -90 mV, de aproximadamente -75 mV a aproximadamente -85 mV, de aproximadamente -70 mV a aproximadamente -90 mV, aproximadamente -75 mV, aproximadamente -80 mV, aproximadamente -85 mV, aproximadamente -83 mV, aproximadamente -90 mV, aproximadamente -100 mV, aproximadamente -120 mV.
Tras la inyección intravenosa de pequeños liposomas, se cree que atraviesan las ventanas de los sinusoides hepáticos y entrarán rápidamente en contacto con los hepatocitos. Se cree que los liposomas de tamaño intermedio quedan retenidos en el interior del compartimento sanguíneo y pueden circular durante un considerable plazo de tiempo. Sin embargo, los liposomas grandes atraviesan más lentamente los sinusoides hepáticos, y quedan capturados rápidamente por las células de Kupffer. De esta forma, el tamaño del liposoma es muy importante para determinar el comportamiento in vivo. Véase, por ejemplo, Liu et al., Biochim. Biophys. Acta (1992) 1104(1):95-101; Harashima et al., J. Drug Target. (1995) 3(4):253-261.
El tamaño de partícula del liposoma se puede obtener a partir de la función de correlación usando diferentes algoritmos usando espectroscopía de correlación fotónica (PCS; dispersión dinámica de luz o dispersión casi elástica de luz (QELS)). El tamaño de partícula de partícula obtenido mediante estas técnicas es comparable al diámetro promedio determinado mediante PCS. PCS utiliza la desviación estándar y χ2 para describir la distribución por tamaño de partícula. En los sistemas PCS, χ2 determina si el sistema es unimodal (distribución gaussiana) o multimodal (distribución Nicomp). El tamaño de partícula promedio se puede determinar usando mediciones ponderadas según la intensidad y se notifica a partir de la distribución gaussiana si χ2,5. Si χ2 > 5, es entonces el promedio del pico principal en una distribución Nicomp. Dicho análisis será familiar para el experto en la materia, así como el hardware adecuado, por ejemplo, el dimensionador de partículas Nicomp QELS, PSS Modelo 380ZLS, S/N 0103301; pssnicomp.com/zetaspec.htm.
En determinadas realizaciones de los liposomas, especialmente los liposomas dirigidos, descritos en el presente documento, el diámetro promedio del liposoma estará comprendido de aproximadamente 50 a aproximadamente 275 nm. Por ejemplo, el diámetro promedio del liposoma puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 265 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 225 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 175 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 175 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 125 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 95 a aproximadamente 175 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 130 nm, o aproximadamente 150 nm. Para una composición de liposoma particular, el liposoma dirigido tendrá un diámetro de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nm mayor que el de un liposoma formado por los mismos componentes pero sin incorporar el factor de direccionamiento.
Los liposomas (por ejemplo, liposomas dirigidos, liposomas vacíos, liposomas en las composiciones que comprenden lípidos) descritos en el presente documento también se pueden caracterizar por la concentración del ligando de direccionamiento que se incorpora al interior del liposoma. Dependiendo del ligando de direccionamiento seleccionado, varios medios de cuantificar la cantidad de ligando de direccionamiento serán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos, el contenido en transferrina (Tf) de los liposomas se puede determinar mediante el uso de migración electroforética (por ejemplo, tal como se mide mediante SDS-PAGE) del liposoma en comparación con los controles adecuados.
En resumen, la confirmación del contenido de transferrina en los liposomas se puede evaluar usando dos ensayos para el contenido y/o la identidad de la transferrina conjugada con los liposomas. En primer lugar, la migración electroforética de la transferrina del liposoma tal como se analiza mediante SDS-PAGE se puede comparar con el modelo de migración de las transferrina conjugada purificada, por ejemplo, TF-NωPE. Además, la migración electroforética de la transferrina conjugada también se puede comparar con el patrón de referencia de la transferrina libre. Se puede obtener respaldo adicional de la identidad de la transferrina en los liposomas mediante ELISA, una
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formulación de grado investigación que demuestra la unión específica del anticuerpo contra transferrina a los liposomas dirigidos. La concentración de los liposomas dirigidos con transferrina se puede medir usando ensayos colorimétricos de cuantificación de proteína, tales como un BCA, un ensayo bien conocido del experto en la material. El experto, a la vista de las enseñanzas del presente documento, también apreciará métodos similares y otros métodos conocidos en el campo para determinar la cantidad de varios factores de direccionamiento.
En resumen, la cantidad de transferrina en un liposoma se puede analizar usando el reactivo del ensayo ácido bicincónico (BCA). El cobre (II) se reduce a cobre (I) por la proteína en condiciones alcalinas. El ion cobre(I) generado forma un complejo soluble intensamente coloreado con BCA. La proteína unida a micropartícula total se mide por la reacción de una cantidad conocida de suspensión de micropartículas con los reactivos. Una vez tiene lugar la formación de color, las micropartículas se eliminan mediante filtración y el color se mide espectrofotométricamente.
En algunas realizaciones, la concentración de ligando de direccionamiento incorporado al liposoma será de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml, o de aproximadamente 1,3 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml.
El papel del ion férrico es muy importante en la unión de la transferrina a la superficie de las células tumorales. Por lo tanto, el contenido en ion férrico de los liposomas dirigidos que incorporan Tf es otra forma significativa de caracterizar los liposomas. Aunque el experto en la materia conoce números métodos para determinar el contenido en ion férrico, un método es ICP-MS.
Cuando un liposoma contiene transferrina, el contenido en ion férrico del liposoma puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,25 µg/ml a aproximadamente 3 µg/ml, 0,4 µg/ml a aproximadamente 3 µg/ml, 0,25 µg/ml a aproximadamente 2 µg/ml, 0,25 µg/ml a aproximadamente 1,5 µg/ml, 0,25 µg/ml a aproximadamente 1 µg/ml, 0,4 µg/ml a aproximadamente 2 µg/ml, 0,4 µg/ml a aproximadamente 1,5 µg/ml, 0,5 µg/ml a aproximadamente 2 µg/ml, aproximadamente 0,5 µg/ml a aproximadamente 1,4 µg/ml, o aproximadamente 0,5 µg/ml a aproximadamente 1,5 µg/ml.
Los liposomas, incluyendo los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, también se pueden caracterizar por su presión osmótica a una temperatura dada. La presión osmótica a una temperatura dada depende de la concentración molar de la solución de azúcar (sacarosa). Y también depende de la densidad iónica total y del tamaño de las moléculas en el interior de la solución. La presión osmótica normal se puede medir usando un instrumento conocido como osmómetro, que mide la presión osmótica en unidad de presión adecuadas, como apreciarán los expertos en la materia.
En determinadas realizaciones, la presión osmótica de los liposomas, especialmente los liposomas dirigidos y los liposomas vacíos, a temperatura ambiente será be de aproximadamente 310 a aproximadamente 410 mOsm/kg. Por ejemplo, la presión osmótica puede ser de aproximadamente de aproximadamente 310 a aproximadamente 400 mOsm/kg, de aproximadamente 310 a aproximadamente 380 mOsm/kg, de aproximadamente 320 a aproximadamente 360 mOsm/kg, de aproximadamente 315 a aproximadamente 375 mOsm/Kg, de aproximadamente 320 a aproximadamente 375 mOsm/Kg, de aproximadamente 315 a aproximadamente 370 mOsm/Kg, de aproximadamente 320 a aproximadamente 370 mOsm/Kg, aproximadamente 360 mOsm/Kg, aproximadamente 350 mOsm/Kg, aproximadamente 340 mOsm/Kg, aproximadamente 370 mOsm/Kg o aproximadamente 380 mOsm/Kg a temperatura ambiente.
En las diferentes condiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, condiciones de almacenamiento, preparado para la administración y/o en condiciones in vitro), la presión osmótica puede variar menos de aproximadamente 25 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 15 % cuando se controla durante un periodo de tiempo concreto asociado con las diferentes condiciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, 360 +/-50 mOsm/kg.
Producción de composiciones que comprenden lípidos
Existen tres requisitos principales para fármacos y compuestos marcados previstos para su administración a individuos durante el tratamiento, a saber, eficacia, seguridad, y garantía de calidad. A pesar de la eficacia y seguridad demostradas, la capacidad de utilizar un fármaco en un tratamiento viene determinada por su calidad (por ejemplo, pureza, homogeneidad, reproducibilidad de la dosis, estabilidad con el tiempo, etc.) no se pueden garantizar de forma consistente durante la fabricación y la distribución. Los métodos de producción de fármacos o compuestos marcados que no garanticen de forma consistente un fármaco de alta calidad también incrementan la posibilidad de reacciones adversas en los individuos a los que se administra el fármaco. Durante la vida de un fármaco o compuesto marcado, es importante que el producto que se fabrica y se distribuya cumpla los mismos estándares que el producto que recibió inicialmente la aprobación normativa. De esta manera, la capacidad para producir fármacos o compuestos marcados de alta calidad de forma consistente es necesaria para producir productos de fármacos o compuestos marcados seguros que se puedan fabricar y purificar de una forma segura y sencilla y son ventajosos desde un punto de vista
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comercial y de seguridad. En el que, por ejemplo, la eficacia de un compuesto marcado se refiere a su capacidad para ser útil en el diagnóstico de una enfermedad o dolencia concreta junto con los métodos de diagnóstico particulares (por ejemplo, la actividad de los compuestos marcados (por ejemplo, capacidad para poder visualizarla por el contador gamma, etc.) no se ve afectada negativamente por una diferencia inaceptable entre lotes o durante el almacenamiento.
Se describen a continuación métodos generales para la producción de las composiciones descritas en el presente documento que se pueden utilizar para producir alta calidad de forma consistente (por ejemplo, de elevada pureza, homogeneidad, etc.) liposomas dirigidos (y sus compuestos intermedios) y liposomas vacíos. Estos métodos también se representan sistemáticamente en las Figs. 4 (método de producción A) y 5 (método de producción B).
Los ésteres de succinimidil de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico y las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico tal como se describe en el presente documento son útiles como componentes de fosfolípidos complejos tales como liposomas, micelas poliméricas, microesferas y nanoesferas, emulsiones y polímeros solubles en agua. La preparación de estos derivados de PE se describe en el presente documento y sus métodos de producción también son conocidos en la materia, como se ha mencionado anteriormente.
En particular, los ésteres de succinimidilo de fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico y las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico son también útiles como componentes de las composiciones que comprenden lípidos tal como se describe en el presente documento. Las composiciones que comprenden lípidos se pueden preparar de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, por modificaciones de dichos métodos también serán evidentes para el técnico experto. Por ejemplo, se pueden usar varios métodos conocidos del experto en la materia para utilizar en la formación de liposomas a partir de componentes lípidos (por ejemplo, sonicación, agitación, extrusión, deshidratación, etc.). Por ejemplo, como se describe en la solicitud publicada de patente de los Estados Unidos Nº 2004/0142025.
El uso de los métodos generales descritos en el presente documento, incluyendo los de los ejemplos, para producir los liposomas dirigidos también abarca métodos para producir el resto de composiciones que contienen lípidos (por ejemplo, mezclas de lípidos, composiciones que contienen liposomas, liposomas vacíos, y los liposomas intermedios), como se describen en el presente documento.
Método de producción A
El método de producción A se representa gráficamente en la Fig. 4.
A: Producción de NωPE:SuccNωPE:mezcla lípida adicional (Compuesto intermedio 1)
Los ésteres de succinimidilo de las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílicos (SuccNωPE) y las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílicos (NωPE) tal como se describen en el presente documento se mezclaron con lípido(s) adicional(es) ((por ejemplo, al menos un fosfolípido(s) (por ejemplo PC (por ejemplo, DMPC, DSPC, etc.), PI, esfingomielina, ácido fosfatídico, etc.) y al menos otro lípido adicional (por ejemplo, colesterol)), y a continuación se disolvieron en un disolvente adecuado (por ejemplo, etanol, t-BuOH, cloroformo, isopropil éter, etc.). La cantidad de disolvente es por lo general de 1 a 100 v/p (vs. peso total de lípidos). En determinadas realizaciones, esto es 2 a 20v/w.
Los SuccNωPE y NωPE usados como se describe en el párrafo anterior se pueden preparar y purificar con los métodos descritos en este documento o métodos conocidos del experto en la materia. Los SuccNωPE y NωPE, así como el resto de componentes descritos en el presente documento para la producción de liposomas dirigidos y sus compuestos intermedios, deben tener pureza y homogeneidad suficientes para producir finalmente liposomas dirigidos de pureza y homogeneidad suficiente para estar comprendidos en las directrices de la normativa para la administración de los liposomas dirigidos a los individuos y de acuerdo con las directrices de buenas prácticas de laboratorio (GLP) y buenas prácticas de fabricación (GMP).
Cuando se utiliza(n) lípido(s) adicional(es) (además del uno o más fosfolípidos) junto con el fosfolípido, la relación entre fosfolípido(s) y el resto de lípido(s) adicionales es aproximadamente 2:1. Una relación de mezclando de los derivados de SuccNωPE con los fosfolípidos es de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 % (1:99 a 12:88), o aproximadamente 3-6 % (3:97 a 6:94) de la concentración total/relación de (NHS-NGPE + NGPE) a (CHOL +Fosfolípido). Por ejemplo, relaciones ilustrativas incluyen 50:45:4:1 (por ejemplo, PC:Chol:NG-PE:NHS-NG-PE), en el que, por ejemplo 17,5 mg de NHS-NG-DOPE, 63,1 mg de NG-DOPE, 312 mg de Chol y 607 mg de fosfolípidos en 1 g de mezcla.
B: Producción de fármaco:NωPE:SuccNωPE:Mezcla lípida adicional (Compuesto intermedio 2)
La NωPE:SuccNωPE:mezcla lípida adicional preparada en la Etapa A se mezcla a continuación con una solución acuosa (por ejemplo, tampón, etc.) que contiene el fármaco o compuesto marcado a encapsular (por ejemplo, agente
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anticanceroso (por ejemplo, oxaliplatino, inhibidor de topoisomerasa I, alcaloide de la vinca, etc.)) para obtener el fármaco:NωPE:SuccNωPE:mezcla lípida neutra (Compuesto intermedio 2).
Cuando el fármaco es oxaliplatino (/-OHP), la concentración de la solución de oxaliplatino es aproximadamente 8 mg/ml en una solución de sacarosa aproximadamente al 9 %. Por ejemplo, la concentración de oxaliplatino en el liposoma dirigido es aproximadamente 0,8 mg/ml +/-10 %.
C: Producción del liposoma fármaco:NωPE-SuccNωPE:lípido adicional (Compuesto intermedio 3)
La mezcla fármaco:NωPE:SuccNωPE:lípido adicional (Compuesto intermedio 2) obtenida en la etapa B se sonicó o se agitó después seguido por la evaporación del disolvente para formar el liposoma fármaco:NωPE:SuccNωPE:lípido adicional (Compuesto intermedio 3). Los métodos y condiciones para realizar la sonicación, agitación y evaporación y los medios para llevar a cabo estas etapas son bien conocidos del experto en la materia y también se describen adicionalmente en los Ejemplos. Véase, por ejemplo, los métodos de producción mediante vesícula de fase invertida (REV), en la patente de Estados Unidos Nº 4.235.871. Los métodos de producción de liposomas generales tales como los métodos de hidratación y los métodos de inyección de etanol sencillos, conocidos del experto en la materia, también se pueden utilizar.
El liposoma fármaco:NωPE:SuccNωPE:lípido adicional formado como se ha descrito anteriormente. se extrude a continuación según el tamaño, y se aísla el liposoma fármaco:NωPE:SuccNωPE:lípido adicional. De manera opcional, a continuación se puede utilizar ultrafiltración para concentrar la solución de liposoma.
Cuando el liposoma contiene /-OHP (fármaco), DMPC (lípido adicional/fosfolípido (neutro)), colesterol (CHOL, lípido adicional/lípido neutro), N-glutaril-DOPE (NG-DOPE) y NHS-NG-DOPE, se puede aislar un liposoma con un diámetro promedio de aproximadamente 0,2 micrómetros (200 nm). Liposomas de tamaño similar también se pueden obtener para liposomas que contienen /-OHP (fármaco), DSPC (lípido adicional/fosfolípido (neutro), colesterol, N-glutaril-DSPE (NG-DSPE) y NHS-NG-DSPE. Las cantidades de diana ilustrativas de los componentes lípidos son, por ejemplo, aproximadamente 40 mg/ml de DMPC (un lípido adicional/fosfatidil colina/fosfolípido/lípido neutro), aproximadamente 20 mg/ml de CHOL (lípido adicional/lípido neutro) y aproximadamente 5 mg/ml NG-DOPE (cantidad combinada de NG-PE y NHS-NG-PE). Una relación ilustrativa de los componentes lípidos es 50:45:5 (lípido adicional 1 (por ejemplo una fosfatidil colina)): lípido adicional 2 (por ejemplo, CHOL):NG-PE (por ejemplo, NG-DOPE + NHS-NG-DOPE).
D: Producción del liposoma Fármaco:NωPE:TF-NωPE:lípido adicional (Liposoma dirigido)
El liposoma fármaco:NωPE:SuccNωPE:lípido adicional formado como se ha descrito en la etapa C se puede funcionalizar con el factor de direccionamiento de elección para producir el liposoma fármaco:NωPE:TF-NωPE:lípido adicional (también denominado "liposoma dirigido").
La unión del factor de direccionamiento (TF) (por ejemplo, funcionalización del liposoma intermedio (Compuesto intermedio 3) con el factor de direccionamiento) se lleva a cabo mediante unión covalentemente del factor de direccionamiento a SuccNωPE mediante reacción del resto succinimidilo con el factor de direccionamiento. En las condiciones de reacción adecuadas, los grupos succinimidilo de la superficie expuesta del liposoma (en la parte exterior de la bicapa lípida, cuando el fármaco o el compuesto marcado) está encapsulado en el interior del liposoma) se puede modificar covalentemente para formar las fosfatidil etanolaminas derivatizadas con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificadas con el factor de direccionamiento (TF-NωPE). La unión del factor de direccionamiento al liposoma da como resultado la formación del liposoma fármaco:NωPE:TF-NωPE:lípido adicional (liposoma dirigido).
Más específicamente, en las condiciones adecuadas, el resto succinilcarboxilo del SuccNωPE como se describe en el presente documento queda funcionalizado. Si el factor de direccionamiento tiene grupo(s) amino, los grupos amino(s) del factor de direccionamiento reaccionan con el esto succinilcarboxilo y forman un enlace amida de ácido carboxílico. Las condiciones adecuadas para esta reacción se describen adicionalmente en el presente documento, incluyendo los de los ejemplos, y también son bien entendidas por el experto en la materia. El experto en la materia también podrá modificar las condiciones de reacción para optimizar las condiciones para combinaciones particulares de factor de direccionamiento y liposomas sin experimentación excesiva dadas las enseñanzas del presente documento.
Varios factores de direccionamiento tal como se describen en el presente documento y conocidos del experto en la materia se pueden obtener comercialmente o producirse por métodos conocidos del experto en la materia.
Cuando, por ejemplo, se selecciona la transferrina como factor de direccionamiento, la transferrina se puede obtener comercialmente como proteína purificada, por ejemplo, de Celliance Corp., GA, EE.UU. La transferrina también se puede obtener con métodos recombinantes bien conocidos en la materia (por ejemplo, usando células procariotas (E.coli, etc.), usando células eucariotas (CHO, BHK, etc.), etc.). Como se entenderá bien, la transferrina se puede obtener y utilizar en los liposomas dirigidos tanto en apoforma como en su holoforma. Como alternativa, los liposomas dirigidos que incorporan apo-transferrina se pueden tratar con compuestos férricos, tales como citrato férrico, cloruro de hierro (III), etc., para producir liposomas dirigidos que incorporan liposoma derivatizado con holotransferrina.
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Una cantidad ilustrativa de transferrina como factor de direccionamiento es, por ejemplo, aproximadamente 2 mg/ml de transferrina. Dicha cantidad sería adecuada para un liposoma dirigido ilustrativo que contiene aproximadamente 40 mg/ml de DMPC, aproximadamente 20 mg/ml de CHOL y aproximadamente 5 mg/ml NG-DOPE (cantidad combinada de NG-PE y NHS-NG-PE).
Tras funcionalizar el liposoma (compuesto intermedio 3) con factor de direccionamiento como se ha descrito anteriormente. para obtener los liposomas dirigidos, los liposomas resultantes se pueden purificar opcionalmente usando métodos conocidos del experto en la materia, incluyendo los métodos de purificación descritos en el presente documento, especialmente los descritos en relación a la etapa C, anterior.
Cuando el liposoma contiene /-OHP (fármaco), DMPC, colesterol (CHOL), N-glutaril-DOPE (NG-DOPE) y Tf-NG-DOPE, se puede aislar un liposoma con un diámetro promedio de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 micrómetros (de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm). Liposomas de tamaño similar también se pueden obtener para liposomas que contienen /-OHP (fármaco), DSPC, colesterol, N-glutaril-DSPE (NG-DSPE) y NHS-NG-DSPE.
La producción de liposomas dirigidos según el método anteriormente descrito (denominado por comodidad método de producción A) produce de forma reproducible liposomas dirigidos de elevada pureza y homogeneidad. En particular, los liposomas dirigidos están prácticamente exentos de materiales de partida no NHS (descrito en el presente documento) y subproductos (por ejemplo, compuestos de urea acilados, etc.) asociados con la generación de SuccNωPEs. En particular, la preparación y purificación de Succ NωPEs antes de la formación de liposomas produce liposomas (compuesto intermedio 3) y liposomas dirigidos que están prácticamente exentos de materiales de partida de carbodiimida (por ejemplo, DCC, EDC, etc.) usados para funcionalizar NωPEs para formar SuccNωPEs. Como se ha mencionado anteriormente, los fármacos y los compuestos marcados, incluyendo los liposomas dirigidos que incorporan fármacos o compuestos marcados, que están previstos para su administración a individuos durante el tratamiento o diagnóstico, deben ser necesariamente de calidad elevada.
De manera opcional, las mezclas lípidas descritas en A (compuesto intermedio 1) se pueden tratar con el factor de direccionamiento para formar una mezcla lípida que contiene TF-NωPE. Además, esta mezcla lípida se puede mezclar con una solución acuosa para formar una composición que comprende lípidos. Finalmente, la composición que comprende lípidos se puede tratar para producir una formulación de liposoma. De manera opcional, la solución acuosa puede incluir un fármaco o compuesto marcado.
Método de producción alternativo (Método B)
El método de producción B se representa gráficamente en la Fig. 5.
A. Producción de fármaco: liposoma NωPE:lípidos adicionales
Los liposomas dirigidos tal como se describen en el presente documento también se pueden producir disolviendo los lípidos adicionales y la NωPE en un disolvente adecuado (por ejemplo, etanol, t-BuOH, cloroformo, isopropil éter, etc.), dispersando la solución resultante en una solución acuosa que contiene opcionalmente un fármaco o compuesto marcado, y a continuación llevar a cabo una ultrasonicación o vesícula de fase invertida de la dispersión resultante para formar un liposoma fármaco:NωPE:lípidos neutros). La solución de liposoma se puede concentrar mediante ultrafiltración.
Como ejemplo no limitante, los liposomas se pueden producir según el método de la vesícula de fase invertida (REV) (patente de los Estados Unidos nº 4.235.871). Por supuesto, también se pueden usar métodos generales de composición de liposomas tales como los métodos de hidratación y los métodos de inyección de etanol sencillos.
Para retener de forma estable la NωPE(s) en la bicapa lípida, la(s) NωPE(s) se puede(n) preparar y purificar, y a continuación la(s) NωPE(s), junto con los lípidos adicionales (por ejemplo, fosfolípido(s), colesterol, etc.) se utiliza(n) para preparar el liposoma de acuerdo con los métodos conocidos del experto en la materia.
Como ejemplo no limitante, lípidos adicionales (por ejemplo, uno o más fosfolípidos (por ejemplo, DSPC, DMPC, etc.), y, opcionalmente, otro lípido adicional (por ejemplo, colesterol, etc.) y al menos una NωPE se mezclan entre sí y se disuelven etc. en un disolvente orgánico adecuado.
En el que los lípidos adicionales son fosfolípido y colesterol, la relación de mezclado entre el fosfolípido y el colesterol puede ser, por ejemplo, aproximadamente 1:1, por ejemplo, aproximadamente 1,1:1, aproximadamente 1,2:1, aproximadamente 0,9:1 (por ejemplo, DMPC y colesterol, 50:45 (% mol). El contenido de la NωPE(s) en proporción del contenido lípido total es, por ejemplo, 6 % con respecto al fosfolípido. Después, la solución resultante se mezcla con una solución de oxaliplatino en un tampón acuoso. La NωPE puede estar de aproximadamente 0,8 %mol a aproximadamente 12 %mol con respecto al contenido lípido total. Por ejemplo, de aproximadamente 1 mol a aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 6 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 5 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 3 %mol, aproximadamente 1 %mol a aproximadamente 2 %mol, aproximadamente 2 %mol a aproximadamente 12 %mol, aproximadamente 2 %mol a aproximadamente 10 %mol, aproximadamente 3 %mol a aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 1 %mol, aproximadamente 2 %mol, aproximadamente 3 %mol, aproximadamente 4 %mol, aproximadamente 5 %mol, aproximadamente 6 %mol, aproximadamente 8 %mol, aproximadamente 10 %mol, o aproximadamente 12 %mol.
La concentración de fármaco o compuesto marcado en solución puede ser como se ha descrito en el presente documento o fármaco, y, en particular como anteriormente en el método de producción A. Análogamente, la solución que contiene el fármaco o compuesto marcado incluye los componentes de la solución descritos en el presente documento.
Los liposomas que incorporan /-OHP (fármaco), DSPC, colesterol y N-glutaril-DSPE (NG-DOPE) preparados mediante este métodos se pueden aislar para proporcionar un liposoma que contiene oxaliplatino (por ejemplo, mediante filtración en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración, ultracentifugación, etc.) que tiene un diámetro promedio de aproximadamente 0,2 µm.
B. Producción de fármaco: Liposoma SuccNωPE:NωPE:Lípidos adicionales
Después de la etapa A, una parte de la NωPE presenten en el liposoma preparado en la etapa A (liposoma fármaco:NωPE:lípidos adicionales) se funcionaliza para dar un liposoma que incorpora SuccNωPE (es decir, liposoma fármaco:SuccNωPE:NωPE:lípidos adicionales), que se puede modificar posteriormente para formar TF-NωPE.
Para formar SuccNωPE, el grupo carboxilo de un extremo de la NωPE se modifica para formar un grupo succinimidilo. Dicha funcionalización puede llevarse a cabo usando los métodos descritos para la producción de las SuccNωPE.
Por ejemplo, una carbodiimida (por ejemplo, EDC, DCC, etc.) y N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) se hace reaccionar en presencia del liposoma para dar el liposoma fármaco:SuccNωPE:NωPE:lípidos adicionales.
C. Producción de fármaco: Liposoma TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales
Después de la etapa B, el liposoma:SuccNωPE:NωPE:lípidos adicionales preparado en la etapa B se hace reaccionar con el factor de direccionamiento para formar el liposoma fármaco:TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales. Los métodos y condiciones de la reacción son como las descritas para el método de producción A, etapa D.
Los liposomas fármaco:TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales obtenidos mediante el método de producción B se pueden purificar y concentrar usando métodos como los descritos en el presente documento y conocidos del experto en la materia.
Comparación entre los métodos de producción
El método de producción A tiene varias ventajas con respecto al método de producción B, aunque ambos se pueden usar para obtener liposomas fármaco:TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales (liposomas dirigidos, que contienen opcionalmente bien fármaco o bien compuesto marcado). De forma más notable, los liposomas obtenidos por el método A estarán exentos o prácticamente exentos de impurezas (por ejemplo, materiales de partida no NHS y/o subproductos) relacionados con la producción de las SuccNωPE. En particular, como se ha indicado anteriormente, los liposomas dirigidos preparados según el método de producción A estarán exentos, o prácticamente exentos, de por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, EDC, DCC, etc.), y ureas aciladas. En determinadas realizaciones, en el que SuccNωPE no se ha incorporado al interior del liposoma, el liposoma o la composición que comprende lípidos también puede estar exenta o prácticamente exenta de NHS. Adicionalmente, cuando mayor sea la escala de la reacción, mayor será el tiempo de preparación. El tiempo de producción del método A es sustancialmente más corto que el del método de producción B.
Aunque la purificación de los liposomas fármaco: TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales preparados de acuerdo con el método de producción B reducirá la cantidad de dichas impurezas, es más difícil purificar liposomas (por ejemplo, los liposomas fármaco:SuccNωPE:NωPE:lípidos adicionales obtenidos en la etapa B del método de producción B) que los lípidos (por ejemplo, las SuccNωPE preparadas y purificadas antes de la etapa A del método de producción A). Como parte de la SuccNωPE está probablemente orientada hacia el interior de los liposomas (por ejemplo, la funcionalidad éster de succinimidilo está en el interior de la bicapa lípida e inaccesible a la reacción con el factor de direccionamiento), es probable que los liposomas dirigidos preparados según el método de producción A deberían tener cierto SuccNωPE residual incorporada en la anterior.
Una ventaja adicional del método de producción A es que el contenido relativo de TF-NωPE vs. NωPE en los liposomas fármaco:TF-NωPE:NωPE:lípidos adicionales finales se puede controlar con más precisión cuando se utiliza el método de producción A. Las cantidades relativas de estos lípidos están directamente relacionadas con las cantidades relativas de SuccNωPE y NωPE usadas como materiales de partida en la etapa A del método de producción A. De esta forma, la cantidad de SuccNωPE modificadas también se puede controlar con más precisión.
Cuando se utiliza el método de producción B, las cantidades relativas de NωPE vs. SuccNωPE dependen de la eficacia de reacción de la etapa B del método B. Se cree que esta reacción avanza hasta su finalización para aproximadamente el 10 % de la NωPE presente en el liposoma, pero se esperarían variaciones experimentales entre lotes. La baja eficacia de reacción se debe posiblemente, en parte, al impedimento estérico del liposoma reformado. Cuando SuccNωPE se forma a partir de NωPE aislada (solamente lípido), existe mucho menos impedimento estérico y la reacción progresa hasta su finalización. Asimismo, tras la formación de SuccNωPE (solamente en forma de lípido), el producto resultante se puede purificar de la mezcla de reacción, eliminando de esta forma NωPE, carbodiimida y NHS sin reaccionar, así como otros subproductos que se puedan formar durante la reacción.
Los liposomas formados por cualquiera de los métodos parecen ser más homogéneos (y por tanto se pueden utilizar para producir un producto farmacéutico/de diagnóstico más reproducible) que los liposomas que incorporan PEG u otros polímeros hidrófilos, tales como los descritos en la sección de Antecedente de la presente memoria descriptiva. En general, cuando se utiliza PEG u otros polímeros hidrófilos para aumentar el tiempo de circulación de los liposomas (por ejemplo, para proteger los liposomas de la captación por el RES), su uso da como resultado liposomas con una distribución de tamaños moleculares = debido a la amplia distribución propia del PEG o los polímeros hidrófilos. Esta distribución aumenta las dificultades asociadas con la fabricación (por ejemplo, reproducibilidad y/o purificación) y puede también aumentar la variabilidad en la eficacia clínica. Los liposomas dirigidos preparados por cualquiera de los métodos A o B deberán ser superiores a este respecto.
Métodos de producción adicionales
Las mezclas lípidas y las composiciones que comprenden lípidos (que se pueden usar para preparar liposoma) también se pueden preparar por modificación de los métodos de producción A y B. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las mezclas lípidas y las composiciones que comprenden lípidos que incorporan componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE o componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco/compuesto marcado (en el que ·componentes lípidos adicionales" se refieren a uno o más fosfolípidos (por ejemplo, uno o más fosfolípidos neutros, uno o más fosfolípidos aniónicos, uno o más fosfolípidos catiónicos o combinaciones de dos o más de los anteriores), comprendiendo opcionalmente de forma adicional uno o más lípidos como se describe en el presente documento (por ejemplo, colesterol o uno de sus derivados); o al menos dos lípidos neutros diferentes tal como se describe en el presente documento, (por ejemplo, al menos un fosfolípido(s) (por ejemplo PC (por ejemplo, DMPC, DSPC, etc.), PI, esfingomielina, ácido fosfatídico, etc.) y al menos otro lípido neutro (por ejemplo, colesterol)) pueden prepararse por los métodos de producción descritos más adelante, así como otras modificaciones de los métodos previstos por el experto en la materia a la vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva. Los lípidos adicionales, NωPE, TF-NωPE y, cuando está presente, componentes de fármaco o compuesto marcado pueden ser como se ha descrito a lo largo de la presente memoria descriptiva. De manera similar, las cantidades relativas de los componentes también son como se ha descrito a lo largo de la presente memoria descriptiva.
En determinadas realizaciones, la mezcla lípida producida en la primera etapa del método de producción B (la mezcla lípida producida al disolver los lípidos adicionales y NωPE en un disolvente orgánico adecuado) se puede modificar para incorporar NHS y posteriormente modificarse con un TF para producir una mezcla lípida de componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE. Esta mezcla lípida se puede mezclar a continuación con una solución acuosa para formar una composición que comprende lípidos. Como alternativa, se puede incorporar un fármaco o un compuesto marcado una vez que se ha preparado la composición que contiene liposoma. En algunas realizaciones, el fármaco o compuesto marcado exento de solución acuosa se puede incorporar a la mezcla lípida formada tras la modificación con NHS y TF, para formar una mezcla lípida de componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco/compuesto marcado. Esta mezcla lípida se puede mezclar posteriormente con una solución acuosa para formar una composición que comprende lípidos.
En algunas realizaciones, la mezcla lípida producida en la primera etapa del método de producción B (la mezcla lípida producida al disolver los componentes lípidos adicionales y NωPE en un disolvente adecuado) se puede mezclar con una solución acuosa para formar una composición que comprende liposomas (componentes lípidos adicionales:NωPE). Esta composición que comprende liposomas puede tratarse con cualquiera de NHS y TF y mezclarse posteriormente con fármaco o compuesto marcado para formar una composición que comprende liposoma de componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco/compuesto marcado. Como alternativa, la composición que comprende liposoma de componentes lípidos adicionales:NωPE se puede tratar con fármaco o compuesto marcado y a continuación modificarse con NHS seguido por TF.
En algunas realizaciones, la mezcla lípida producida en la primera etapa del método de producción B (la mezcla lípida producida al disolver los componentes lípidos adicionales y NωPE en un disolvente adecuado) se puede mezclar a continuación con fármaco o compuesto marcado (incluyendo opcionalmente solución acuosa) para formar una mezcla lípida (en el que el fármaco o compuesto marcado no incluye solución acuosa) o composición que comprende liposomas. Cuando se forma una mezcla lípida, la mezcla lípida se puede tratar a continuación con NHS y TF para formar una mezcla lípida de componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco/compuesto marcado, que a continuación puede mezclarse con una solución acuosa para formar una composición que comprende liposomas. Como alternativa, cuando se forma una composición que contiene liposomas (por ejemplo, cuando el fármaco o compuesto marcado se incorporan en solución acuosa), esta composición que contiene liposomas se puede tratar posteriormente con NHS y TF para también proporcionar una mezcla lípida de componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco/compuesto marcado.
En un método de producción alternativo adicional, método C, los componentes individuales se mezclan simultáneamente en un disolvente orgánico para formar una mezcla lípida (C-1) (por ejemplo, componentes: componentes lípidos adicionales; NωPE; TF-NωPE o componentes: componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE:fármaco o compuesto marcado), en el que la TF-NωPE se prepara y se purifica adicionalmente antes de la premezcla. La mezcla lípida C-1 se puede mezclar a continuación con una solución acuosa para formar una composición que contiene liposomas C-2 componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado). Cuando la composición que contiene liposomas así formada no contiene fármaco o compuesto marcado, el fármaco o compuesto se pueden añadir después de la formación de la composición que contiene liposomas (C2-A). Como alternativa, cuando se utiliza como material de partida inicial un fármaco o compuesto marcado que incluyen una solución acuosa, la composición que contiene liposomas se puede formar simultáneamente tras el mezclado de todos los componentes de partida.
C-2 (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado) o C2-A, puede tratarse a continuación para formar un liposoma (C-3). Cuando C-3 no incluye un fármaco o compuesto marcado, el liposoma será un liposoma vacío, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, un liposoma componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE). Cuando C-3 incluye un fármaco o compuesto marcado, el liposoma será un liposoma dirigido como se ha descrito en el presente documento . Cuando C-3 es un liposoma vacío, un fármaco o compuesto marcado, como se ha descrito anteriormente, puede añadirse al liposoma vacío en una etapa posterior para formar un liposoma dirigido, lo que se puede llevar a cabo inmediatamente después de la preparación de C-3 o transcurrido un plazo de tiempo, que puede incluir el almacenamiento del liposoma vacío C-3 durante un periodo de tiempo.
En un método de producción alternativo adicional, método D, los componentes individuales se mezclan simultáneamente en un disolvente orgánico para formar una mezcla lípida (D-1) (por ejemplo, componentes: componentes lípidos adicionales; NωPE; o componentes: componentes lípidos adicionales:NωPE:fármaco o compuesto marcado). La mezcla lípida D-1 se puede mezclar a continuación con una solución acuosa para formar una composición que contiene liposomas D-2 componentes lípidos adicionales:NωPE: (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado). La composición que contiene liposomas D-2 se puede mezclar a continuación con TF-NcoPE para formar una composición que contiene liposomas D-3 (componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado)), en el que la TF-NωPE se prepara y se purifica adicionalmente antes de la premezcla. Cuando la composición que contiene liposomas así formada no contiene fármaco o compuesto marcado, el fármaco o compuesto se pueden añadir después de la formación de la composición que contiene liposomas (D3-A). Como alternativa, cuando se utiliza como material de partida inicial un fármaco o compuesto marcado que incluyen una solución acuosa, la composición que contiene liposomas se puede formar simultáneamente tras el mezclado de todos los componentes.
D-3 (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado) o D3-A, puede tratarse a continuación para formar un liposoma (D-4). Cuando D-4 no incluye un fármaco o compuesto marcado, el liposoma será un liposoma vacío, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, un liposoma componentes lípidos adicionales:NωPE:TF-NωPE). Cuando D-4 incluye un fármaco o compuesto marcado, el liposoma será un liposoma dirigido como se ha descrito en el presente documento . Cuando D-4 es un liposoma vacío, un fármaco o compuesto marcado, como se ha descrito anteriormente, puede añadirse al liposoma vacío en una etapa posterior para formar un liposoma dirigido, lo que se puede llevar a cabo inmediatamente después de la preparación de D-4 o transcurrido un plazo de tiempo, que puede incluir el almacenamiento del liposoma vacío D-4 durante un periodo de tiempo.
Como en el caso de las mezclas lípidas, composiciones que contienen liposomas, y liposomas (incluyendo liposomas dirigidos, liposomas vacíos, etc.) formados según el método de producción A, las composiciones que comprenden lípidos preparadas según el método de producción C o el método D estarán sustancialmente exentas de material de partida no NHS, subproductos y/o productos de descomposición asociados con la síntesis del éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico (por ejemplo, carbodiimidas (por ejemplo, DCC, EDC, etc.), compuestos de urea acilados, etc.), siempre que el material de partida (por ejemplo, TF-NG-PE) esté sustancialmente exento de estas sustancias antes de la etapa inicial del método de producción C o el método D. Cuando SuccNωPE no se ha incorporado como material de partida (y por tanto no se ha incorporado al interior del liposoma), el liposoma o la composición que comprende lípidos también puede estar exenta o prácticamente exenta de NHS, como cuando TF-NωPE se preforma y se utiliza como material de partida. En realizaciones particulares, las composiciones que comprenden lípidos preparadas según el método de producción C o el método D estarán sustancialmente exentas de DCC y EDC. En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden lípidos preparadas según el método de producción C o el método D estarán sustancialmente exentas de DCC.
En determinadas realizaciones, los componentes lípidos adicionales incluyen uno o más fosfolípidos (por ejemplo, una fosfatidilcolina, etc.) y un colesterol o derivado de colesterol. En realizaciones particulares, la fosfatidil colina es DMPC, POPC, DSPC, etc. tal como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, la fosfatidil colina es DMPC o DSPC. En realizaciones particulares, los lípidos adicionales son fosfolípido y colesterol. En determinadas realizaciones, el fosfolípido es un fosfolípido neutro.
En determinadas realizaciones, el(los) componente(s) lípido(s) adicional(es) incluyen al menos dos lípidos neutros diferentes, que incluyen un fosfolípido (por ejemplo, una fosfatidilcolina, etc.) y un colesterol o derivado de colesterol. En realizaciones particulares, la fosfatidil colina es DMPC, POPC, DSPC, etc. tal como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, la fosfatidil colina es DMPC o DSPC. En realizaciones particulares, los al menos dos lípidos neutros diferentes son un fosfolípido y colesterol.
En algunas realizaciones, la NωPE es una NG-PE. En realizaciones particulares, la NωPE es Nω-DOPE o Nω-DSPE. En determinadas realizaciones, la NωPE es NG-DOPE o NG-DSPE.
En realizaciones particulares, el TF es, por ejemplo, asialoglicoproteína, folato, transferrina, etc. En determinadas realizaciones, la TF es transferrina (Tf). En algunas realizaciones, la TF-NωPE es una Tf-NωPE (por ejemplo, Tf-NG-DOPE o Tf-NG-DSPE).
En realizaciones particulares, el fármaco es, por ejemplo, un agente anticanceroso (por ejemplo, oxaliplatino, inhibidor de topoisomerasa I, alcaloide de la vinca, etc.). En otras realizaciones, la mezcla lípida o composición que comprende liposomas incluye un compuesto marcado. En algunas realizaciones, la mezcla lípida o composición que comprende liposomas no incluye un compuesto marcado o un fármaco.
Como se ha mencionado anteriormente, cada una de las mezclas lípidas se puede mezclar con una solución acuosa para formar composiciones que contienen liposomas y cada una de las composiciones que contienen liposomas se puede tratar para formar los correspondientes liposomas (por ejemplo, liposomas dirigidos (por ejemplo, incorporando fármaco o compuesto marcado), liposomas intermedios, liposomas vacíos, etc.), tal como se describe detalladamente en el presente documento.
Con respecto a las variaciones en los métodos de producción descritos en el presente documento, se pretende que la modificación de NωPE con NHS, la modificación de NHS-NωPE con TF, la preparación de composiciones que contienen liposomas a partir de mezclas lípidas, y la preparación de liposomas a partir de composiciones que contienen liposomas se puede llevar a cabo por el experto en la materia tal como se describe en el presente documento dadas las enseñanzas que se proporcionan en la presente memoria descriptiva, incluyendo, en particular, la descripción detallada de los métodos de producción A y B y como se presenta en los ejemplos.
Formulaciones farmacéuticas
También se describen en el presente documento formulaciones farmacéuticas para el tratamiento o el diagnóstico de los individuos que lo necesitan, que comprenden composiciones que contienen lípidos tal como se describe en el presente documento y uno o más portadores, excipientes, diluyentes, estabilizantes, conservantes, u otros ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables, incluyendo combinaciones de los anteriores, conocidas de los expertos en la materia y descritas adicionalmente en el presente documento.
En determinadas realizaciones de las formulaciones farmacéuticas, la composición que comprende lípidos es un liposoma dirigido tal como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la composición que comprende lípidos es una composición que contiene liposomas. En algunas realizaciones, la composición que comprende lípidos es un liposoma vacío. En determinadas realizaciones, la composición comprende un fármaco. En otras realizaciones, la composición comprende un compuesto marcado.
En determinadas realizaciones, el portador puede incluir uno o más de agua estéril, una solución tampón o un suero salino, diluyente, y sus combinaciones.
Las formulaciones farmacéuticas pueden contener además uno o más entre diferentes sales, azúcares, proteínas, almidón, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicol y similares, incluyen combinaciones de dos o más de los anteriores.
También se describe en el presente documento el uso de las combinaciones y formulaciones de la invención tal como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento. En concreto, la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o diagnóstico de las dolencias descritas en el presente documento. Además, las composiciones activas y formulaciones de las mismas, descritas de forma variada en el presente documento, también están previstas para su uso en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o diagnóstico de las dolencias y, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Uso de las composiciones
Administración
También se describen en el presente documento métodos para el tratamiento o diagnóstico de dolencias tal como se describe en el presente documento usando las composiciones que comprenden lípidos que contienen el fármaco o el compuesto marcado (por ejemplo, liposomas dirigidos, composiciones que contienen liposomas que contienen fármaco/compuesto marcado) y formulaciones farmacéuticas tal como se describe en el presente documento.
En una realización, los métodos se pueden llevar a la práctica como solución terapéutica destinada al tratamiento de las dolencias descritas en el presente documento. De esta manera, en una realización específica, las composiciones que comprenden lípidos que contienen fármaco o las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar las dolencias descritas en el presente documento en los individuos que lo necesitan, incluyendo seres humanos. Los métodos comprenden de forma general administrar al individuo una cantidad de una composición, o formulación descrita en el presente documento, eficaz para tratar la dolencia.
En otra realización, los métodos se pueden llevar a la práctica como solución diagnóstica destinada al diagnóstico de las dolencias descritas en el presente documento. De esta manera, en una realización específica, las composiciones que comprenden lípidos que contienen compuesto marcado o las composiciones farmacéuticas pueden usarse para diagnosticar las dolencias descritas en el presente documento en los individuos que lo necesitan, incluyendo seres humanos. Los métodos comprenden de forma general administrar al individuo una cantidad de una composición, o formulación descrita en el presente documento, eficaz para diagnosticar la dolencia. Dicha administración se lleva a cabo por lo general junto con métodos para detectar la dolencia.
En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, bovinos, caballo, felino, can, roedor o primate. En otras realizaciones, el individuo es un ser humano.
Los términos "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad de la composición suficiente para tratar un trastorno, dolencia o enfermedad especificados o uno o más de sus síntomas y/o prevenir la aparición de la enfermedad o trastorno. En referencia a los cánceres, una cantidad terapéuticamente o farmacéuticamente eficaz comprende una cantidad suficiente para, entre otras cosas, hacer que un tumor se encoja o disminuya la velocidad de crecimiento del tumor.
Las expresiones "una cantidad eficaz para el diagnóstico" o sus análogos "cantidad diagnósticamente eficaz" o "cantidades eficaces para el diagnóstico", se refieren a una cantidad de una composición compuesto suficiente para diagnosticar un trastorno, dolencia o enfermedad específicos, y/o una o más de sus manifestaciones, en el que el diagnóstico incluye la identificación de la existencia de la enfermedad y/o la detección de la extensión o gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, en referencia a los cánceres, una "cantidad diagnósticamente eficaz" comprende una cantidad suficiente para detectar, por ejemplo, la presencia y/o concentración de una o más células neoplásicas malignas, tumor(es) u otras manifestaciones del cáncer. A menudo, el diagnóstico se llevará a cabo con referencia a un valor inicial o nivel de detección de fondo observado en los individuos que no padecen la dolencia. Los niveles de detección por encima de los niveles de fondo o iniciales (niveles de detección elevados) son indicativos de la presencia y, en algunos casos, de la severidad de la dolencia.
Cuando se utiliza con respecto a los métodos de tratamiento y el uso de composiciones que contienen fármaco, un individuo "que lo necesita" puede ser un individuo que haya recibido un diagnóstico o que haya sido anteriormente tratado para la dolencia que se va a tratar. Con respecto a los métodos de diagnóstico y al uso de composiciones que contienen compuestos marcados, un individuo "que lo necesita" puede ser un individuo que se sospecha que tiene una dolencia, está en riesgo de padecer una dolencia (por ejemplo, antecedentes familiares de la dolencia, factores de estilo de vida que sean indicadores de riesgo para la condición (por ejemplo, fumar como factor de riesgo para el cáncer de pulmón, etc.)) o previamente ha recibido un diagnóstico de la dolencia (por ejemplo, el diagnóstico puede incluir controlar la severidad (por ejemplo, progresión/regresión) de la enfermedad con el tiempo y/o junto con el tratamiento).
En determinadas realizaciones, la dolencia a tratar o diagnosticar es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser un cáncer gástrico, colon, colorrectal o cáncer de mama. En determinadas realizaciones, el cáncer es un cáncer de colon. En otras realizaciones, el cáncer es un cáncer de mama. En otras realizaciones adicionales, el cáncer es un cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, o neoplasias hematológicas (por ejemplo, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, etc.).
Las composiciones que contienen fármaco, que incluyen las formulaciones descritas en el presente documento, se pueden usar solas o junto con (por ejemplo, antes de, en paralelo con, o después) de otros modos de tratamientos (por ejemplo, tratamiento del cáncer auxiliar, tratamientos en modalidad combinada). Por ejemplo, junto con otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer tal como se describe en el presente documento y conocidos del experto en la materia (por ejemplo, agentes alquilantes, taxanos, antagonistas metabólicos, antibióticos antitumorales, alcaloides vegetales, fármacos para terapia hormonal, fármacos con direccionamiento molecular, etc.)), cirugía, y/o radioterapia. Cuando la dolencia a tratar es cáncer, las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar junto con uno o más de los agentes anticancerosos o compuestos tal como se describe en el presente documento y es conocido en la técnica, uno o más agentes adicionales para reducir la incidencia y/o la gravedad de las reacciones adversas y/o las manifestaciones clínicas de la misma, cirugía (por ejemplo, para extirpar un tumor o ganglios linfáticos, etc.) o radiación. Cuando uno o más entre cirugía o radiación son parte del régimen de tratamiento, las composiciones se pueden administrar antes, en paralelo con, o después de la radioterapia o la cirugía. Del mismo modo, las composiciones, y sus formulaciones, tal como se describe en el presente documento se pueden administrar antes, en paralelo con, o después de la administración de uno o más agentes anticancerosos. Los liposomas dirigidos y sus formulaciones descritos en el presente documento también se pueden administrar junto con (por ejemplo, antes de, en paralelo con, o después) de fármacos para aliviar los síntomas asociados con la dolencia o el régimen de tratamiento (por ejemplo, fármacos antieméticos, pérdida de cabello, inmunosupresión, diarrea, prurito, perturbación sensorial, anemia, fatiga, estomatitis, síndrome de manos y pies, etc.). Los liposomas dirigidos también se pueden administrar en más de una etapa de (incluyendo la totalidad) del régimen de tratamiento (por ejemplo, después de la cirugía y en paralelo con la radioterapia, etc.).
Las composiciones que contienen compuestos marcados, que incluyen las formulaciones descritas en el presente documento, se pueden usar solas o junto con (por ejemplo, antes de, en paralelo con, o después) de otros modos de tratamientos (por ejemplo, tratamiento del cáncer auxiliar, tratamientos en modalidad combinada). Por ejemplo, las composiciones pueden usarse para realizar un seguimiento de la evolución del tratamiento. Por ejemplo, para determinar si la dolencia que se está tratando se puede detectar antes, después o en paralelo con un régimen de tratamiento (tal como se ha descrito anteriormente. con respecto a los modos de tratamiento).
En determinadas realizaciones, las composiciones se administran antes o después de la cirugía (por ejemplo, extirpación de tumor o ganglios linfáticos, etc.). En otras realizaciones, las composiciones se administran después de la cirugía y antes, en paralelo o después de la radioterapia. La combinación óptima de uno o más entre cirugía y/o radioterapia junto con la administración de las composiciones descritas en el presente documento, y, opcionalmente, uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales, se puede determinar por el médico a cargo del tratamiento en función del individuo y teniendo en cuenta los diferentes factores que afectan al individuo particular, que incluyen los descritos en el presente documento.
En realizaciones particulares, las composiciones que contienen fármaco o las composiciones farmacéuticas se pueden administrar junto con uno o ambos de 5-fluorouracili y/o leucovorina. En otras realizaciones, la composición que contiene fármaco o las formulaciones farmacéuticas se pueden administrar junto con uno o más fármacos anticancerosos adicionales tales como capecitabina, UFT/LV (tegafur-uracilo y leucovorina), irinotecan, anticuerpo dirigido contra EGFR (por ejemplo, cetuximab, etc.), anticuerpo dirigido contra VEGF (por ejemplo, avastina, etc.), inhibidores de la tirosina quinasa (por ejemplo, erlotinib), etc. Dicha administración también se puede combinar con un régimen de tratamiento que incluya radioterapia y/o cirugía. En determinadas realizaciones, el fármaco encapsulado en el liposoma dirigido es oxaliplatino.
Junto con los métodos de uso descritos en el presente documento, las composiciones que comprenden lípidos o las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar por vía parenteral. La administración parenteral se puede llevar a cabo mediante inyección en bolo (IV), infusión (IV), inyección intraperitoneal, o mediante inyección local (tal como inyección intracraneal). En algunas realizaciones, la administración es mediante una inyección en bolo o infusión continua.
La infusión intravenosa continua se puede administrar durante un periodo de minutos o de horas. Por ejemplo, pero sin limitación, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 2 horas, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, 80 minutos, aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, o aproximadamente 48 horas.
Formulación y dosificación
Como se ha indicado anteriormente, las composiciones que comprenden lípidos y las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar a individuos que lo necesitan para el tratamiento o diagnóstico de dolencias tal como se describe en el presente documento junto con los métodos de uso descritos en el presente documento.
Las composiciones que contienen lípidos descritas en el presente documento, y, en particular los liposomas dirigidos descritos en el presente documento, se utilizarán de forma general en una cantidad eficaz para dar el resultado previsto, por ejemplo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la dolencia particular que se está tratando. La composición o composiciones se pueden administrar terapéuticamente para lograr un beneficio terapéutico. Por beneficio terapéutico se entiende erradicar o mejorar el trastorno subyacente que se está tratando y/o erradicar o mejorar uno o más de los síntomas asociados con el trastorno subyacente de forma que el paciente notifique una mejora en la sensación o la dolencia, entendiendo que el paciente puede seguir estando afectado por el trastorno subyacente. El beneficio terapéutico también incluye detener o ralentizar la progresión de la enfermedad, independientemente de si se logra una mejora.
En algunas realizaciones, cuando la dolencia a tratar es cáncer, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para reducir el crecimiento tumoral, tal como se mide por la velocidad de aumento en el volumen tumoral promedio antes y/o después del tratamiento. En determinadas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para disminuir el volumen tumoral promedio, en el que el volumen tumoral promedio después del tratamiento se ha reducido en comparación con el volumen tumoral medio antes del tratamiento).
La cantidad de composiciones administradas para administrar una cantidad eficaz de fármaco encapsulado (por ejemplo, oxaliplatino) dependerá de varios factores, incluyendo, por ejemplo, la dolencia particular a tratar, el modo de administración, la gravedad de la dolencia que se está tratando y la edad y el peso del paciente, la biodisponibilidad de la composición, los efectos adversos experimentados por el individuo que se está tratando, etc. La determinación de una dosis eficaz está bien incluida entre las capacidades de los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas provistas en el presente documento.
En determinadas realizaciones, la dosis de oxaliplatino encapsulado se administra en un punto temporal particular que estará en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 mg/m2/día. Por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 mg/m2/día, 1 a aproximadamente 300 mg/m2/día, 1 a aproximadamente 250 mg/m2/día, 1 a aproximadamente 200 mg/m2/día, 1 a aproximadamente 150 mg/m2/día, 1 a aproximadamente 100 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 70 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/m2/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/m2/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/m2/día, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/m2/día, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/m2/día, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 mg/m2/día, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 mg/m2/día, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 mg/m2/día, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mg/m2/día, de aproximadamente 80 a aproximadamente 150 mg/m2/día, de aproximadamente 80 a aproximadamente 140 mg/m2/día, de aproximadamente 80 a aproximadamente 135 mg/m2/día, de aproximadamente 80 a aproximadamente 130 mg/m2/día, de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 mg/m2/día, de aproximadamente 85 a aproximadamente 140 mg/m2/día, de aproximadamente 85 a aproximadamente 135 mg/m2/día, de aproximadamente 85 a aproximadamente 135 mg/m2/día, de aproximadamente 85 a aproximadamente 130 mg/m2/día, o de aproximadamente 85 a aproximadamente 120 mg/m2/día. La dosis administrada en un punto temporal particular también puede ser de aproximadamente 130 mg/m2/día, aproximadamente 120 mg/m2/día, aproximadamente 100 mg/m2/día, aproximadamente 90 mg/m2/día, aproximadamente 85 mg/m2/día, aproximadamente 80 mg/m2/día, aproximadamente 70 mg/m2/día, aproximadamente 60 mg/m2/día, aproximadamente 50 mg/m2/día, aproximadamente 40 mg/m2/día, aproximadamente 30 mg/m2/día, aproximadamente 20 mg/m2/día, aproximadamente 15 mg/m2/día, o aproximadamente 10 mg/m2/día.
La dosis administrada puede ser más elevada o más baja que los intervalos de dosis descritos en el presente documento, dependiendo de, entre otros factores, la biodisponibilidad de la composición, la tolerancia del individuo a los efectos secundarios adversos, el modo de administración y varios factores descritos anteriormente. La cantidad de dosis y el intervalo puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles de la composición en plasma que son suficientes para mantener el efecto terapéutico, de acuerdo con el criterio del médico a cargo del paciente. Los expertos en la materia pueden optimizar las dosificaciones locales eficaces sin experimentación excesiva a la vista de las enseñanzas provistas en el presente documento.
Las dosificaciones también se pueden estimar con modelos animales in vivo, tal como apreciarán los expertos en la materia.
Las dosis múltiples (por ejemplo, en continuo o en bolo) de las composiciones tal como se describe en el presente documento también se pueden administrar a los individuos que lo necesitan en el curso de horas, días, semanas, o meses. Por ejemplo, pero sin limitación, diariamente, en días alternos, cada 10 días, semanalmente, mensualmente, dos veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces al mes, tres veces al mes, cuatro veces al mes, cinco veces al mes, meses alternos, cada tres meses, cada cuatro meses, etc.
Kits
También se proporcionan kits para administración de las composiciones descritas en el presente documento, incluyendo formulaciones farmacéuticas que comprenden las composiciones.
En determinadas realizaciones, los kits pueden incluir una cantidad de dosis (por ejemplo, tal como se usa para tratamiento o diagnóstico) de al menos una composición que contiene lípido, o formulación farmacéutica de la misma, como se divulga en el presente documento. Los kits pueden comprender además un envase adecuado y/o las instrucciones para utilizar la composición. Los kits también pueden comprender un medio para administrar la administración, o formulación farmacéutica de la misma, tal como una jeringa para inyección u otro dispositivo tal como se describe en el presente documento y es conocido de los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, los kits pueden incluir una cantidad de dosis (por ejemplo, tal como se usa en el tratamiento
o diagnóstico) de un liposoma vacío, o formulación farmacéutica de la misma, como se divulga en el presente documento. Los kits pueden comprender además un envase adecuado y/o las instrucciones para utilizar la composición. Los kits también pueden comprender un medio para administrar la administración, o formulación farmacéutica de la misma, tal como una jeringa para inyección u otro dispositivo tal como se describe en el presente documento y es conocido de los expertos en la materia. Adicionalmente, en determinadas realizaciones, el kit puede contener una dosis independiente del fármaco o compuesto marcado a incorporar al liposoma vacío.
Adicionalmente, la composición que comprende lípidos, o su formulación farmacéutica se puede ensamblar en la forma de kits. El kit proporciona la composición que comprende lípidos, o formulación farmacéutica de la misma, así como los reactivos para preparar una composición para administración. La composición puede estar en forma seca o en forma liofilizada, o en solución, especialmente en una solución estéril. Cuando la composición está en una forma seca, el reactivo puede comprender un diluyente farmacéuticamente aceptable para preparar una formulación líquida. Dichos diluyentes incluyen los conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, soluciones de azúcar, por ejemplo, dextrosa, sacarosa, etc. En determinadas realizaciones, los kits pueden incluir soluciones de azúcar de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 18 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente 3 % a aproximadamente 6 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 12 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 18 %, o aproximadamente 20 % de azúcar. En determinadas realizaciones, la solución puede ser una solución de dextrosa (por ejemplo, aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 % de dextrosa, etc.). En determinadas realizaciones, la composición que comprende lípidos puede ser, por ejemplo, un liposoma dirigido, liposoma vacío, mezcla lípida, o composición que comprende liposomas (que contiene opcionalmente fármaco o compuesto marcado).
El kit puede también contener un dispositivo para administración o para dispersar las composiciones, incluyendo, pero sin limitarse a la jeringa, pipeta, u otro dispositivo conocido de los expertos. Cuando está en forma húmeda, la composición se puede almacenar en una ampolla u otro recipiente estéril precintado, incluyendo los conocidos de las personas expertas en la materia.
Los kits pueden incluir otros compuestos terapéuticos para su uso junto con los compuestos descritos en el presente documento. En una realización, los agentes terapéuticos son otros agentes anticancerosos. Estos agentes pueden proporcionarse de forma independiente, o mezclarse con los compuestos descritos en este documento, con la condición de que dicho mezclado no reduzca la eficacia del agente terapéutico adicional de las composiciones y formulaciones descritas en el presente documento. Análogamente, los kits pueden incluir agentes adicionales para tratamiento auxiliar. Por ejemplo, agentes para reducir los efectos adversos del fármaco (por ejemplo, agentes antieméticos, agentes antialopecia, agentes inmunopotenciadores, etc.).
Los kits incluirán las instrucciones adecuadas para la preparación y administración de la composición, efectos secundarios de las composiciones, y cualquier otra información relevante. Las instrucciones pueden estar en cualquier formato adecuado incluyendo, pero sin limitación, papel impreso, videocinta, disco legible por ordenador, o disco óptico.
También se describen en el presente documento kits para tratar un individuo que padece o es susceptible a las condiciones descritas en el presente documento, que comprende un primer recipiente que comprende una cantidad de dosificación de una composición que contiene lípido o sus formulaciones tal como se describe en el presente documento, e instrucciones para su uso. El recipiente puede ser cualquiera de los conocidos en la materia y adecuado para el almacenamiento y la administración de formulaciones intravenosas. En determinadas realizaciones, el kit comprende adicionalmente un segundo recipiente que comprende un vehículo, diluyente, adyuvante farmacéuticamente aceptable, etc. para la preparación de la composición a administrar al individuo.
También se proporcionan kits que contienen suficientes dosis de las composiciones o formulaciones de la misma tal como se describe en el presente documento para proporcionar tratamiento eficaz para un individuo durante un periodo de tiempo prolongado, tal como una semana, 2 semanas, 3, semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses o más.
Los kits también incluyen múltiples dosis de la composición que comprende lípidos o sus formulaciones e instrucciones para su uso y envasado en cantidad suficiente para su almacenamiento y uso en farmacias, por ejemplo, farmacias de hospital y farmacias de composición.
Ejemplos
La presente invención se describe adicionalmente por referencia a los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1: Ensayo de citotoxicidad para el oxalilplatino
Se preparó una solución de oxaliplatino (/-OHP) disolviendo oxaliplatino en una solución de sacarosa al 9 % (sacarosa/agua destilada) a una concentración de 8 mg/ml. La viabilidad celular se determinó usando un kit para ensayo de la citotoxicidad comercialmente disponible (kit WST-1), Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón).
Células AsPC-1 (proporcionadas por el Dr. Hironobu Yanagie del Research Center for Advanced Science and Technology, Universidad de Tokyo, Japón) cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10 % (suero de feto de ternera; SIGMA, EE.UU.) se trataron con concentraciones de soluciones de /-OHP [200 x (1/2)(0-10) nM] a 37 ºC en CO2 al 5 % durante 48 horas. Después, el medio se eliminó y un sustrato (WST-1, Cell Counting Kit, Dojindo Laboratories, Japón) se añadió a las células que se incubaron a 37 ºC en CO2 al 5 % durante 2 horas para revelar el producto coloreado. El color revelado se midió a una absorbancia de 450 nm (longitud de onda de referencia: 620 nm) de un Immuno Mini NJ-2300 (Cosmo Bio Co., Ltd., Japón).
Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se descubrió que la citotoxicidad de /-OHP era DL50 > 8 µg/ml.
Ejemplo 2: Determinación del número de receptores de transferrina sobre la superficie celular
Líneas celulares de leucocitos humanos normales y derivadas de tumores malignos humanos (K562, MKN45P y HL60) se utilizaron en el experimento y se obtuvieron de la siguiente forma: K562:TKG0210 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Department, Aging and Cancer, Universidad Tohoku, Japón); MKN45P: Dr. Hisae Iinuma, Facultad de medicina de la Universidad de Teikyo, Japón; HL60:TKG0345 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Department, Aging and Cancer, Universidad Tohoku, Japón).
El número de receptores de Tf (transferrina) sobre la superficie celular se determinó, cada uno de ellos, mediante análisis Scatchard (Comp. Biochem. Physiol., 116 B, 137-160 (1949), usando Microsoft Excel). Una solución de Tf
125125
marcada con I (Na-I (Perkin Elmer Japan Co., Ltd., Japón) y h-Tf (T-4132, SIGMA, EE.UU.) se combinaron con el método yodógeno (Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 319-325 (1984)) se añadió a cada cultivo celular a
(0-9)
diferentes concentraciones a partir de [300 x (1/2)nM] a 4 ºC y se incubaron durante 1 hora.
La concentración de Tf marcada con 125I se determinó mediante el ensayo de cuantificación de proteínas según el método de Lowry (J. Biol. Chem., 193, 265-270 (1951)) y se midió la radioactividad usando un contador gamma (Auto Well Gamma System ARC-300, Aloka Co., Ltd., Japón]. En resumen, la solución se centrifugó para precipitar las células, y la fracción celular se lavó con PBS enfriado en hielo (180 x g (gravedad), durante 3 min, lo que se repitió 3 veces, seguido por la medición de la radioactividad con un contador gamma para determinar la concentración de Tf unida a la superficie celular. El número de células se determinó mediante el ensayo de cuantificación de proteínas usando el método de Lowry (J. Biol. Chem., 193, 265-270 (1951)).
Para cada punto de datos, se determinó la concentración de Tf no unida restando la concentración de Tf unida de la concentración conocida de Tf unida. Se trazó el diagrama de Scatchard realizando una representación gráfica de la concentración de Tf unida en el eje horizontal y el cociente entre la concentración de Tf unida y la concentración de Tf no unida en el eje vertical. El número de la Tf unida (es decir, el número de receptores) se determinó a partir de la intersección del gráfico con el eje x, como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80 2263-2266 (1983); J. Cell Physiol., 132, 492:-500 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 92 3318-3322 (1995); J. Pharm. Sci., 84, 216:-220 (1995); Eur. J. Biochem., 186, 367:-373 (1989); J. Biol., Chem., 258, 4715-4724 (1983).
El número de 125I-Tf unido a la superficie celular para los diferentes tipos de células se muestra en la Fig. 7. Se determinó que el número de receptores de transferrina (Tf) de la superficie celular de las líneas celulares derivadas de los tumores malignos humanos era significativamente mayor que los de los leucocitos normales.
Ejemplo 3: Preparación de NHS-NG-DOPE
Una masa de 200 mg de NG-DOPE (Avanti Polar Lipids, Inc., EE.UU.) (nº cat. 870242, PM 880,13)) se pesó en un matraz cónico con dos patas. Se añadieron al matraz 39,2 mg de NHS (Sigma, EE.UU., PM = 115,09). A continuación, se añadieron 5 ml de cloroformo/acetato de etilo (1: 1 (v/v), Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) y se agitó circularmente para comenzar la disolución de NG-DOPE y NHS. Se observó una ligera turbidez.
Tras el mezclado inicial, se añadió una barrita agitadora al conjunto del matraz (globo lleno de nitrógeno gaseoso) para insuflar suavemente nitrógeno gaseoso en una pata del matraz y se precintó con un tapón de caucho. La agitación bajo atmósfera de nitrógeno se llevó a cabo usando una barrita agitadora y una placa agitadora. La segunda pata se precintó con un tubo. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente (20 -23 ºC). La mezcla se agitó durante 5-10 minutos. Se dejó al lado una muestra de 20 µl de la mezcla de reacción lípido + NHS para su uso como control TLC.
En un matraz independiente, una solución de DCC (99 %, Aldrich, EE.UU., PM: 206,33 g/mol) se preparó disolviendo 70 mg de DCC en 5 ml de acetato de etilo. El DCC se disolvió rápidamente en el disolvente para conseguir una solución trasparente. La solución de DCC así preparada (aproximadamente 5 ml) se añadió a continuación gota a gota a la mezcla de reacción lípido/NHS durante un periodo de 10 -15 minutos. La mezcla de reacción se volvió más turbia tras la adición del DCC.
Se llevó a cabo la TLC sobre el control (lípido/NHS) y sobre la alícuota de lípido/NHS/DCC a tiempo 0 para referencia, de la siguiente forma. Se utilizó una muestra de 50 µg (2,5 µl de 20 mg/ml) para manchar una placa TLC (lámina de aluminio -gel de sílice 60F254 de EM Science (Gibbstown, NJ, EE.UU.) (nº cat. SP05554M, se secó y a continuación se colocó en la cámara de revelado en el que se dejó que el disolvente (70 % de cloroformo, 28 % de metanol, 2 % de agua) migrara. El frente del disolvente se marcó y a continuación la placa TLC se sumergió en molibdato de amonio (molibdato de amonio al 5 % en H2SO4 al 10 %) y se deshidrató con un desecante.
La mezcla de reacción lípido/NHS/DCC se agitó bajo flujo de nitrógeno y se controló la formación de producto (Fr 0,3 0,4) con el tiempo.
Después de 18 horas, la conversión de NHS-NG-DOPE no era completa después de 18 horas, y se añadió más cantidad de NHS (26 mg en 2 ml de acetato de etilo) y DCC (47 mg en 1 ml de acetato de etilo). El progreso de la reacción se volvió a ensayar mediante TLC a T = 20 h.
Se dejó continuar la reacción durante el fin de semana a temperatura ambiente con flujo de nitrógeno y agitación (protegido de la luz). Parte de los materiales de partida quedaban antes de la purificación.
Purificación: Las mezclas de reacción se enfriaron en hielo durante ∼30 minutos. La mezcla de reacción enfriada se filtró a continuación a través de un embudo Buckner y a continuación se lavó 3 veces con 2 x 5 ml de cloroformo. Todos los líquidos obtenidos se recogieron y secaron mediante evaporación rotatoria. Se obtuvo una pasta semisólida tras la evaporación. A continuación la pasta se volvió a suspender en 2 -3 ml de cloroformo.
Se preparó el gel para la purificación de la pasta suspendida utilizando sílice (malla 400) 4 g -hidratado en cloroformo. El gel de sílice se empaquetó en una columna de 1 cm x 28 cm con una llave de paso. El tamaño aproximado del lecho era de 1 cm x 14 cm. Se equilibró la columna con cloroformo (envasado por gravedad).
La muestra se cargó en una columna de gel de sílice equilibrada (pero no se secó). Se añadieron 10 ml de cloroformo a la columna (5 x 2 ml). Se recogieron fracciones de 5 x 2 ml. El caudal era función de la gravedad, pero se recogieron fracciones de 5 x 10 ml en 10 -20 min y se designaron como fracciones 1 -5.
A continuación, se añadieron 50 ml de cloroformo/metanol (90/10, vol/vol) a la columna (5 x 10 ml). Y se recogieron fracciones de 5 x 10 ml y se designaron como fracciones 6 -10.
Tras la recogida de las fracciones 6-10, un volumen de 100 ml de cloroformo/metanol (5/1(v/v)) se añadió a la columna (10 x 10 ml). Y se recogieron fracciones adicionales 10 x 10 ml se recogieron y designaron fracciones 11 -15.
Se evaluaron las fracciones 6-15 (alícuotas de 5 µl ) mediante TLC como se ha descrito anteriormente.
Tras la TLC de las fracciones 6-15, las fracciones 7-11 se combinaron y secaron utilizando evaporación rotatoria. El producto final obtenido tras la evaporación fue de 130 mg (rendimiento del 65 %), tal como se ha determinado mediante TLC frente al producto de reacción sin purificar y mediante la comparación con un producto patrón (NHS-NG-DOPE) obtenido de NOF (Japón).
Ejemplo 4: Preparación de NHS-NG-DOPE
NG-DOPE (200 mg) preparado y purificado con antelación) (NOF Corporation Japón) y NHS (N-hidroxisulfosuccinimida; 34 mg) se pesaron y colocaron en un matraz cónico de 5 ml con 2 aberturas. Una abertura se precintó con un tapón de caucho y se añadió una barra de agitación a través de la abertura restante.
A continuación el matraz se colocó a vacío y se rellenó con nitrógeno gaseoso que fluía suavemente (repetir las tres veces). A continuación, el matraz se mantuvo bajo atmósfera de nitrógeno utilizando un globo de nitrógeno.
Tras colocarlo bajo atmósfera de nitrógeno, se añadieron al matraz 2,5 ml de cloroformo seco, a continuación se agitó utilizando la barrita agitadora y la placa de agitación. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos y se usó la agitación para disolver los materiales de partida. Se dejó al lado una muestra de 20 µl de lípido + NHS para su uso como control/seguimiento de la reacción mediante TLC.
A continuación se preparó una solución de 61 mg de DCC (1,3-diciclohexilcarbodiimida) disuelta en 2,5 ml de cloroformo seco (transparente, disuelta rápidamente). La solución de DCC se añadió gota a gota a la mezcla de lípidos/NHS durante un periodo de 15 minutos. La solución se volvió turbia tras la adición de DCC.
En el momento 0, se llevó a cabo una TLC (cloroformo al 70 %, 30 % de metanol, 5 % de agua) en lípidos/NHS y lípidos/NHS/DCC para vigilar la reacción manchando 50 mg de cloroformo sobre la placa de TLC, y dejando secar, colocándose a continuación en la cámara de reacción (cloroformo al 70 %, 30 % de metanol, 5 % de agua) para migrar.
La mezcla de reacción continuó con agitación bajo atmósfera de nitrógeno y se vigiló la formación del producto (Rf 0,3 -0,4) con el tiempo.
Se dejó continuar la reacción en un periodo de tiempo de 2-3 días a temperatura ambiente con flujo de nitrógeno y agitación.
La mezcla de reacción se filtró a continuación a través de un embudo Buckner y a continuación se lavó dos veces con 2 x 5 ml de cloroformo. La solución completa se recogió y secó mediante evaporación rotatoria. Se obtuvo una pasta semisólida.
La pasta semisólida se volvió a suspender en 2 x 3 ml de cloroformo, y a continuación se filtró y secó. Este procedimiento se repitió tres veces. Finalmente, después de tres veces, el producto se volvió a suspender en 2 x 3 ml de cloroformo.
Se preparó una columna de gel de sílice mezclando sílice en cloroformo que se introdujo a continuación en una columna de 1 cm x 28 cm con una llave de paso. El tamaño aproximado del lecho de la columna era de 1 cm x 14 cm. Se equilibró la columna con cloroformo (envasado por gravedad).
Las muestras se cargaron en una columna de gel de sílice equilibrada (pero no seca). Después, se añadieron 100 ml de cloroformo a la columna y se recogieron alícuotas en fracciones de 100 ml. El caudal era función de la gravedad. (Fracción 1)
Fracción 1. Se añadieron 100 ml de cloroformo/metanol (90/10, vol/vol) a la columna. Se recogieron fracciones de 100 ml. (Fracción 2)
Se añadieron 200 ml de cloroformo/metanol (50/10, vol/vol) a la columna (20 x 10 ml). Se recogieron fracciones de 20 x 10 ml. (Fracción 3 -23).
Se evaluaron las fracciones 1 a 23 usando alícuotas de 5 ml mediante TLC.
Se combinaron las fracciones 9 a 22 y se secaron hasta una película fina utilizando evaporación rotatoria y liofilización. El peso final de NHS-NG-DOPE procedente de estas fracciones fue de 61,9 mg (rendimiento del 27,9 %).
Ejemplo 5: Preparación de la mezcla lípida (NG-DOPE:Tf-NGDOPE:DMPC:CH)
583 mg de DMPC (NOF corporation, Japón), 299 mg de colesterol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) y 75,7 mg de NG-DOPE (NOF corporation, Japón) se mezclaron y disolvieron en t-BuOH (10 v/p frente a lípidos (10 ml)) a 45-50 ºC.
La solución resultante se vertió en un vial y se congeló durante aproximadamente 8 horas en una estantería a -40 ºC. Se despresurizaron a aproximadamente 0,1 mm de Hg (13,33 Pa) y se mantuvo a presión reducida durante 2 días aumentando la temperatura desde -40 ºC a 25 ºC por etapas, a partir de dicho procedimiento se obtuvo una mezcla lípida liofilizada.
Un polvo de la mezcla lípida liofilizada como el obtenido anteriormente se mezcló con 20 mg Tf-NG-DOPE en polvo (como el preparado en el Ejemplo 29) y se congeló. Se obtuvo de esta manera un polvo homogéneo de la mezcla lípida, con una relación lipídica de 50:45:5 (DMPC:Chol:NG-DOPE+Tf-NG-DOPE).
Ejemplo 6: Preparación de la composición que comprende liposomas
Se prepararon mezclas de lípidos de acuerdo con los ejemplos anteriores con los componentes que se detallan a continuación:
Entrada 1: DMPC/Chol/NG-DOPE (155 mg/79,4 mg/16,1 mg)
Entrada 2 DMPC/Chol/NG-DOPE (155 mg/79,4 mg/16,1 mg)
Entrada 3: DMPC/Chol/NG-DOPE/NHS-NG-DOPE (152 mg/77,9 mg/15,8 mg/4,38 mg)
Entrada 4: DMPC/Chol/NG-DOPE/NHS-NG-DOPE(152 mg/77,9 mg/15,8 mg/4,38 mg)
Entrada 5: :DMPC/Chol/NG-DOPE/Tf-NG-DOPE(148 mg/76,0 mg/15,4 mg/4,8 mg)
Entrada 6: :DMPC/Chol/NG-DOPE/Tf-NG-DOPE(148 mg/76,0 mg/15,4 mg/4,8 mg) Cada una de las entradas 1, 3 y 5 se hidrataron y se agitaron con 300 mM de solución acuosa de sacarosa (20 v/p frente a lípidos (5 ml) (se añadieron 5 ml de solución de sacarosa (20 v/p) a la mezcla lípida seca y se agitaron) durante 30 min. a 40-45 ºC. Cada una de las entradas 2, 4 y 6 se hidrataron y se agitaron con una solución acuosa de /-OHP (8 mg /-OHP/ml, 20 v/p frente a lípidos (5 ml) en una solución de sacarosa 300 mM) durante 30 min. a 40-45 ºC. Se obtuvo de esta manera una mezcla que contenía liposomas.
Se determinó el diámetro de los liposomas mediante QELS y los resultados se muestran en la Fig. 8. Los liposomas presentes en la mezcla que contiene liposomas tienen un diámetro medio de 500-2.000 nm y tienen una amplia distribución de tamaños alrededor de 100-10.000 nm.
Ejemplo 7: Preparación del liposoma (NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH) que contiene oxaliplatino
La composición del liposoma era de la siguiente forma:
Dimiristoil fosfatidilcolina (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina : DMPC) (NOF Corporation, Japón) Colesterol (CH) (Solvay Pharmaceuticals B.V., Países Bajos) sal sódica de la N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (N-glutaril-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina : DOPE-CO-(CH2)3-COOH; representada a partir de ahora en el presente documento como NG-DOPE) (NOF Corporation, Japón) Sal sódica de la Succ-N-glutaril-dioleoil fosfatidil etanolamina (N-(succinimidil-glutaril)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina: DOPE-CO-(CH2)3 -CO-OSu; representada a partir de ahora en el presente documento como NHS-NG-DOPE) (NOF Corporation, Japón) DMPC:CH:NG-DOPE:NHS-NG-DOPE = 50:45:4:1 (m/m).
Como la fase acuosa, se utilizó una solución acuosa de /-OHP (8 mg/ml, en una solución de sacarosa 300 mM).
Una mezcla de DMPC, CH, NG-DOPE y NHS-NG-DOPE (a la relación molar de 50:45:4:1) se disolvió en 4 en v/p (frente a un peso total de lípidos) de etanol caliente/t-butanol/t-butanol/disolvente acuoso. La solución lipídica se inyectó en una solución de sacarosa 300 mM que contenía aproximadamente 8 mg/ml /-OHP at aproximadamente 45 ºC, de tal manera que la concentración del disolvente llegó a ser aproximadamente un 14 % en v/v.
La suspensión se pasó a través de una extrusora que se superpuso sobre cinco piezas de filtro de 100 nm (Nº de Cat. 112105, Whatman plc, Reino Unido) a una presión de aproximadamente 200-800 psi (1,38-5,52 MPa) a aproximadamente 45 ºC. De esta forma se obtuvieron liposomas, que tenían un diámetro promedio próximo a 100 nm. El diámetro de los liposomas se determinó con QELS.
6 l de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,9), 6 l de solución de transferrina (Nº de Cat. 4455, Selorogicals, GA, EE.UU.) (20 mg/ml), y 18 l de suspensión de liposomas se mezclaron y agitaron a 30 ºC durante 15-60 min. Esto dio como resultado una mezcla de reacción que contenía 4 mg/ml de transferrina y 20 mg/ml de lípidos.
Se llevó a cabo el análisis cuantitativo de la transferrina mediante ensayos con ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el vendedor.
Se investigó el aumento del peso molecular tras la incorporación de la transferrina mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio). Se llevó a cabo el análisis de NG-DOPE mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con el detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD2000, Alltech, MD, EE.UU.) utilizando una columna de gel de sílice (columna de gel de sílice YMC PVA, 4,6 x 250 mm, 5 µm).
Ejemplo 8: Preparación del liposoma (NG-DSPE:TF-NG-DSPE:DSPC:CH) que contiene oxaliplatino
La composición del liposoma era de la siguiente forma:
Diestearoil fosfatidilcolina (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina : DSPC) Colesterol (CH) Sal sódica de la N-glutaril-diestearoil fosfatidil etanolamina (N-glutaril-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina: DSPE-(CH2)3-COOH; representada a partir de ahora en el presente documento por NG-DSPE) DSPC:CH:NG-DSPE = 2:1:0,2 (mol/mol).
Como la fase acuosa, se utilizó una solución acuosa de /-OHP (8 mg/ml, en una solución de sacarosa al 9 %), tal como se describe en el Ejemplo 1.
Una mezcla de DSPC (MC8080, NOF, Japón), colesterol (038-03005, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) y NG-DSPE (Dr. Kazuo Maruyama, Universidad de Teikyo, Facultad de Farmacia, Japón) a la relación de 2:1:0,2 (m/m) se disolvió en cloroformo e isopropil éter.
Se añadió a la solución resultante, una solución de /-OHP (en una solución de sacarosa al 9 %), y la mezcla resultante se sonicó durante aproximadamente 15-30 minutos. A continuación se evaporó la solución mediante evaporación rotatoria a 60 ºC para eliminar el disolvente y se repitió cinco veces la congelación/descongelación. La suspensión se congeló (sumergiéndose en un baño de hielo seco/acetona) y se descongeló (dejando reposar e inmersión en agua caliente). Esto se repitió cinco veces.
Después, el producto resultante se dimensionó a 60 ºC usando filtros EXTRUDER (dos veces a 400 nm y a continuación cinco veces a 100 nm), (LipexTM Extruder, Modelo Nº T-001, Northern Lipids Inc., Canadá) y se ultracentrifugó (200.000 x g, 60 min, aproximadamente 4 ºC). Se volvió a suspender el precipitado en una solución de sacarosa al 9 % o de tampón MES (pH 5,5) (tampón MES. Nº de Cat. 345-01625, Dojindo Laboratories, Japón) para obtener el liposoma /-OHP-NG-DSPE:DSPC:CH encapsulado.
Posteriormente, el liposoma/-OHP-NG-DSPE:DSPC:CH encapsulado se derivatizó con transferrina (Tf). Al liposoma /-OHP-NG-DSPE encapsulado obtenido de esta manera, y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC; Nº de Cat. 22980, Pierce Biotechnology, Inc., EE.UU.) (en una cantidad de 2,7 % con respecto al peso del lípido) y se añadieron N-hidroxisulfosuccinimida (S-NHS; 038-0432, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) (en una cantidad de 7,3 % con respecto al peso del lípido), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después, a la solución resultante, se añadió transferrina (Tf) (en una cantidad de 20 % con respecto al peso del lípido; (Nº de Cat. T4132, SIGMA, EE.UU) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron una solución de transferrina (Tf) 1 mM en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (en una cantidad del 20 % con respecto al volumen de la mezcla de reacción total) y PBS 1 mM (en una cantidad del 20 % con respecto al volumen de la mezcla de reacción total), y se agitó la solución resultante durante 1 hora.
A la apoforma obtenida de esta manera del liposoma Tf-NG-DSPE, 10-40 equiv. (frente a transferrina) de citrato de hierro-citrato de sodio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) se añadieron a la suspensión que se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución resultante se ultrafiltró como anteriormente. A continuación el precipitado se volvió a suspender en una solución de sacarosa al 9 %, por lo cual se obtuvo una holoforma del liposoma Tf-NG-DSPE. La solución se ultrafiltró (200.000 x g, 60 min, aproximadamente 4 ºC) y a continuación el precipitado se volvió a suspender en una solución de sacarosa al 9 %.
Se llevó a cabo el análisis cuantitativo de la transferrina mediante ensayos con ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del vendedor (Nº de Cat. 23227, BCA™ Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology, Inc., EE.UU.).
Se investigó el aumento en el peso molecular mediante SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio). Se llevó a cabo el análisis de NG_DSPE mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD2000, Alltech, MD, EE.UU.) utilizando una columna de gel de sílice (columna de gel de sílice YMC PVA, 4,6 x 250 mm, 5 µm).
Ejemplo 9: Preparación de liposomas PEGilados que contienen oxaliplatino
Siguiendo el protocolo experimental en el Ejemplo 8, se prepararon liposomas DSPC:colesterol:DSPE-PEG(2K)-OMe:DSPE-PEG(3,4K)-COOH (liposomas Tf-PEG). En estos liposomas, la relación de componentes fue de la siguiente forma: DSPC:colesterol:DSPE-PEG(2K)-OMe:DSPE-PEG(3,4K)-COOH = 2:1:0,16:0,03.
Este liposoma contenía 6 % en moles de PEG-lípidos y 1 % en moles de PEG-COOH-lípidos, y Tf se une al liposoma a través de PEG-COOH.
Se prepararon también mediante el método del Ejemplo 8 los liposomas Tf/PEG-DSPE (liposomas Tf/PEG-NG-DSPE).
En estos liposomas, la relación de componentes fue de la siguiente forma: DSPC:colesterol:DSPE-PEG(2K)-OMe:NG-DSPE = 2:1:0,16:0,03.
Este liposoma se derivatizó con PEG, y Tf se unió al liposoma a través de NG-DSPE. Se pueden producir también liposomas derivatizados con PEG mediante los métodos descritos en las solicitudes publicadas solicitudes de patente estadounidense Nos 2003/0224037 y 2004/0022842.
Ejemplo 10: Preparación de liposomas vacíos
Una mezcla de DMPC, Chol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón), NG-DOPE (NOF Corporation, Japón) y NHS-NG-DOPE (NOF Corporation, Japón) (a la relación molar de 50:45:4:1; 410 g de DMPC, 211 g de Chol, 43 g de NG-DOPE y 12 g de NHS-NG-DOPE, respectivamente) se disolvió en 4 v/p (frente al peso de lípidos totales de disolvente de etanol caliente/t-butanol/agua. Se incubó la suspensión resultante con un volumen de 20 l a 45 ºC con agitación y se pasó a través de una extrusora (Stevested Machinery & Engineering Ltd., Canadá) que se superpuso con cinco apilamientos de filtros de 100 nm de policarbonato (Nº Cat. 112105, Whatman plc, Reino Unido) a una presión de aproximadamente 200-800 psi (1,38 MPa -5,52 MPa) a aproximadamente 45 ºC. Se obtuvieron de esta manera liposomas que tenían un diámetro medio próximo a 100 nm. Se determinó el diámetro del liposoma mediante QELS.
La suspensión de liposomas, tampón de PBS (pH 7,9) y solución de PBS de transferrina (Nº de Cat. 4455, Selorogicals, GA, EE.UU) (pH 7,0) se mezclaron a la relación de 3:1:1 (v/v), a continuación se agitaron durante 15-60 min. a 30 ºC. Se obtuvieron de esta manera aproximadamente 6 l de liposomas vacíos.
20 g (aproximadamente 19 ml) de una solución de liposomas se vertieron en un vial y se congelaron durante aproximadamente 8 horas en una estantería a -40 ºC. se despresurizaron a aproximadamente 0,1 mm de Hg (13,33 Pa) y se mantuvieron a presión reducida durante 2 días aumentando la temperatura desde -40 ºC a 25 ºC por etapas en el periodo de 2 días. A la finalización de este procedimiento se obtuvieron de esta manera 3,5 g de liposomas vacíos liofilizados. Los liposomas se almacenaron posteriormente a 4 ºC.
Ejemplo 11: Encapsulación de oxaliplatino en liposomas vacíos previamente preparados
Una solución acuosa de /-OHP (8 mg/ml, en una solución de sacarosa 300 mM) se añadió a aproximadamente 3,5 g de liposomas vacíos liofilizados y se rehidrató mediante agitación durante 2 horas a 40 ºC. Tras agitar, se separó el -OHP liposomial del -OHP libre mediante fraccionamiento usando Sephadex G-25 (01 x 45 cm). El liposoma /-OHP y el /-OHP exento se controlaron mediante VIS a 600 nm y UV a 210 nm respectivamente.
Se midieron la cantidad de /-OHP y colesterol. Se calculó la concentración de /-OHP para el caso de la condensación de la fracción liposómica hasta la concentración de colesterol original final, se midió el rendimiento de /-OHP mediante comparación de la concentración de /-OHP de liposomas y la concentración de alimentación de /-OHP.
La concentración de /-OHP para el caso de condensación de la fracción liposómica hasta la concentración de colesterol original fue de 210 µg/ml. Y el rendimiento de /-OHP fue del 2,6 %.
Esto indica que se encapsularon 210 µg/ml de /-OHP en el liposoma vacío liofilizado.
Ejemplo 12: Comparación de los niveles de liposomas en sangre y órganos
Se llevó a cabo un estudio comparativo para evaluar la retención en sangre y la acumulación de composiciones de liposomas modificados con Tf encapsulados con /-OHP en ratones que tenían tumores. Se utilizaron ratones machos BALB/c de 5 semanas de edad como modelo animal, y se utilizaron células Colon 26 (derivadas de cáncer de colon de ratón) como células tumorales. Las células se obtuvieron del Laboratorio de Biofarmacia, Facultad de farmacia de la Universidad de Teikyo, Japón.
Células Colon 26 (2 x 106 células) subcultivadas in vitro se implantaron por vía subcutánea en la región dorsal de los ratones. Se utilizó un ratón que tenía un tumor con un diámetro de aproximadamente 8 a 10 mm (tras 8 a 10 días de crecimiento en promedio) como el ratón que tenía cáncer de colon. Se inyectó una solución de cada uno de los liposomas preparado en los Ejemplos 5 y 6 o bien /-OHP (8 mg/ml en una solución de sacarosa al 9 %) en la vena de la cola. Se ajustó la concentración de oxaliplatino a 5 mg /-OHP/ kg de peso corporal en cada caso. Como liposomas, se usaron los liposomas, liposoma Tf-NG-DSPE ((■); Ejemplo 5), liposoma Tf/PEG-NG-DSPE ((A); Ejemplo 6) y liposoma Tf-PEG-DSPE ((♦); Ejemplo 6).
Se recogieron sangre, plasma, hígado, bazo, riñón, corazón, pulmón y tejidos tumorales de 3 ratones en cada punto temporal para cada grupo a las 1, 3, 6, 24, 48 y 72 horas después de la administración. Se determinó la concentración de Pt en la sangre, en cada órgano y tejidos tumorales utilizando absorción atómica (AA), y se calculó la concentración de /-OHP que se registró como la relación (%) a la dosis. En la Fig. 9 se muestran las concentraciones en sangre.
El liposoma Tf-NG-DSPE mostró sustancialmente la misma retención en sangre hasta 3 horas después de la administración en comparación con el liposoma Tf-PEG-DSPE y el liposoma Tf/PEG-NG-DSPE. Sin embargo, después de 6 horas, el liposoma Tf-NG-DSPE mostró alguna retención en sangre, pero desapareció más rápidamente de la sangre en comparación con los liposomas PEG. Se muestran en la Fig. 10 las concentraciones en los tejidos tumorales. El liposoma Tf-NG-DSPE mostró sustancialmente la misma acumulación en los tejidos tumorales que el liposoma Tf-PEG-DSPE y el liposoma Tf/PEG-DSPE, a pesar de retenerse a una concentración más baja en la sangre en el tiempo.
En relación con los anteriores resultados, se ha encontrado que se precisa un tiempo de retención de aproximadamente 6 horas en sangre tras la administración, y suministrar una concentración suficiente de un fármaco a un tejido tumoral a un nivel significativo o mayor en ratones. Se considera que un tiempo de retención en la sangre más largo que este puede aumentar la posibilidad de producir un efecto adverso en un tejido normal.
Ejemplo 13: Preparación de liposomas diagnósticos y acumulación de 125I en tejido tumoral
Se prepararon liposomas de la misma manera que en el Ejemplo 7 con la excepción de que liposomas de [125I]-Tiraminil inulina (en solución de PBS) sustituyeron /-OHP y se obtuvieron liposomas de DMPC/CH/NG-DOPE/Tf-NG-DOPE/[125I]-Tiraminil insulina. Se obtuvieron los componentes lipídicos también como se describe en el Ejemplo 7. Se prepararon dos formulaciones de liposomas con los componentes que se muestran a continuación. El liposoma que carecía de Tf-NG-DOPE sirvió como control de la distribución del liposoma no dirigido. Liposoma dirigido: DMPC/CH/NG-DOPE/Tf-NG-DOPE (63,3/31,7/4/1 (m/m)) Liposoma no dirigido (control): DMPC/CH/NG-DOPE (63,3/31,7/5 (m/m))
125125
I se unió a tiraminil inulina combinando Na-I (PerkinElmer Japan Co., Ltd., Japón) y tiraminil inulina (Dr. Kazuo Maruyama, Universidad de Teikyo, Facultad de Farmacia, Japón) utilizando el método yodógeno (Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 319-325 (1984). Se obtuvo de esta manera 125I-Tiraminil inulina. A continuación se encapsuló una solución de 125I-Tiraminil inulina /PBS(-) a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en el liposoma tal como se ha descrito en el Ejemplo 7.
100 ml of de cada una de las soluciones de los liposomas se inyectaron en la vena de la cola de ratones que tenían los cánceres de colon de murino descritos en el Ejemplo 12. Se recogieron el tejido tumoral y el de la cola de cinco ratones en cada punto temporal para cada grupo a las 1,6, 24 y 48 horas después de la administración. Se midió el peso del tejido tumoral y la radioactividad (unidad: cpm) en el tejido tumoral y la cola utilizando un contador gamma (Aloka Auto Gamma System ARC-300, Japón). Se evaluaron los resultado como la cantidad de distribución en el tejido tumoral (% de dosis/g-tumor) = [(valor de cuenta en el tejido tumoral) -(valor de b.g.)] x 100 /[(valor de cuenta de Std.) -(valor de cuenta en la cola)] / (peso de tejido tumoral (g)). La semivida radioactiva de 125I es aproximadamente de 60 días.
La radioactividad de 100 ml de la solución administrada (estándar: Std.) se definió como el 100 % y el valor de cuentas de un tubo de ensayo vacío se definió como el valor del antecedente (b.g.). Los resultados se muestran en la Fig. 11. Como resulta evidente de la Fig. 11, el liposoma modificado con Tf muestra una elevada acumulación en un tejido tumoral, mientras que liposomas no dirigidos no muestran una elevada acumulación. Estos resultados demuestran que los liposomas que encapsulan un compuesto radioactivo son útiles para la detección de un tejido tumoral.
Ejemplo 14: Comparación de los efectos antitumorales de liposomas
Se llevó a cabo un estudio comparativo para evaluar los efectos antitumorales en ratones que tenían cáncer de colon Colon 26 entre composiciones de liposomas modificados con Tf encapsulados con /-OHP (liposomas Tf-PEG preparados en el Ejemplo 9, liposomas Tf-NG-DSPE:NG-DSPE:DSPC:CH preparados como en el Ejemplo 8, liposomas Tf/PEG-NG-DSPE preparados como en el Ejemplo 9; 9 ratones en cada grupo) y para cada una de las composiciones de liposomas a las cuales no se une la transferrina a ((-)TF; 6 ratones en cada grupo).
Se prepararon ratones que tenían tumores de la misma manera que en el Ejemplo 12. Como control se usó una solución de /-OHP (8 mg/ml en una solución de sacarosa al 9 %). La fecha en la que se administró /-OHP a las dosis de 5 mg/kg se definió como la fecha de inicio, y en el día 4, /-OHP se administró a una dosis de 5 mg/kg de nuevo. El tamaño del tumor en el día 0 se definió como 1, y el tamaño se mostró como un cociente basado en su tamaño inicial. El tamaño del tumor se midió el día 0, 2, 5, 7, 10, 13, 15, 18 y 21, y se controlaron los días de supervivencia.
Los resultados se muestran en la Fig. 12.
Como puede observarse en la Fig. 12, las composiciones de liposomas a las cuales se unió la transferrina presentaron un efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral. Por otra parte, las composiciones de liposomas a las cuales no se unió la transferrina tuvieron un efecto inhibidor más débil sobre el crecimiento tumoral en comparación con el de las composiciones de liposomas a las cuales se unió la transferrina . De los resultados representados en las Figuras 9 y 10, se ha encontrado que son necesarias y suficientes aproximadamente 6 horas de tiempo de retención en sangre tras la administración para un liposoma al cual se une la transferrina para que tenga un efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral y para hacer que la concentración de un fármaco que se acumula en un tejido tumoral sea significativa y tenga sustancialmente el mismo nivel. Se considera que un tiempo de retención en la sangre más largo que este puede aumentar la posibilidad de producir un efecto adverso en un tejido normal.
Ejemplo 15: Optimización del contenido de NG-DSPE
Para determinar la relación de mezcla óptima de NG-DSPE en un liposoma se investigó en ratones normales a retención en sangre de NG-DSPE en la que no se había encapsulado un agente anticanceroso. Se prepararon composiciones de liposomas en las que no se había encapsulado un agente anticanceroso de la misma manera que en el Ejemplo 8, pero utilizando como fase acuosa agua en vez de una solución de /-OHP, con cantidades diferentes de NG-DSPE.
La cantidad molar total de los componentes lípidos totales que constituyen un liposoma se define como el 100 % y se muestran los contenidos de NG-DSPE como la relación (% en moles) de NG-DSPE a los componentes lípidos totales.
Además, se preparó también un liposoma que contenía un 6 % en moles de MPB lípido (MPB-DSPE) o PDP lípido (PDP-DSPE) como el constituyente lípido. Se obtuvo el liposoma MPB formando un liposoma mediante unión de maleimida-fenilbutirato (MPB) al grupo amino de la etanolamina del lípido, y uniendo Tf al liposoma a través de MPB (870013(16:0), Avanti Polar Lipids, Inc, EE.UU.). El liposoma PDP (870205(16:0, Avanti Polar Lipids, Inc, EE.UU.) se obtuvo formando un liposoma mediante la unión del propionato de 2-piridiltio (PDP) al grupo amino de la etanolamina del lípido, y uniendo Tf al liposoma a través de PDP.
En el experimento, se usaron 105 ratones (machos ICR, de 6 semanas de edad) (Tokyo Laboratory Animal Science Co., Ltd., Japón). Como trazador, 125I se unió a tiraminil-inulina, (preparado como se describe en el Ejemplo 13) y esta solución de inulina a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml se encapsuló en el liposoma. Se midió el peso de la sangre y órganos recogidos para cada caso y se midió la radioactividad (unidad: cpm (del marcador de liposomas usando un contador gamma (Aloka Auto Gamma System ARC-300, Japón). Además, se midió la radioactividad de cada solución administrada (100 ml) en la vena de la cola. La radioactividad de 100 ml de la solución administrada (estándar: Std.) se definió como 100 %, y el valor (% de la dosis) de cada órgano se expresó como un porcentaje. Se estimó que la cantidad de sangre total era un 7,3 % del peso corporal, y la cantidad de liposomas en sangre se expresó como la cantidad en la sangre total. El valor de cuenta de un tubo de ensayo vacío se definió como el valor de fondo (b.g.), y cuyo valor se resta del valor de cuenta de cada muestra.
Cantidad de distribución en la sangre (%) = [(valor de cuenta de la sangre) -(valor de b.g.)] x (peso corporal de ratón (g)) x 0,073 x 100 / [(valor de cuenta de Std.) -(valor de cuenta de la cola) x (peso de la sangre (g))].
Los resultados se muestran en la Fig. 13. Con respecto a la concentración en sangre después de 6 horas, los liposomas NG-DSPE muestran una elevada retención en sangre cuando el contenido en lípidos es el 3 % en moles o mayor. Como para la maleimida-liposoma (MPB 6 %), la retención en sangre fue baja.
Ejemplo 16: Efecto de Tf y del ácido dicarboxílico sobre la retención en sangre
Para investigar los efectos de la presencia o ausencia de la transferrina unida a liposoma y de los tipos de ácidos dicarboxílicos (por ejemplo, glutarilo, succinilo, etc.), se examinó en ratones normales la retención en sangre de un liposoma unido a transferrina en el que un agente anticanceroso no se ha encapsulado. El método experimental fue el mismo que se ha descrito en el Ejemplo 15.
Se preparó un liposoma que contenía ácido succínico en vez de ácido glutárico.
Se preparó NG-DSPE (glutárico) de la siguiente forma. En la oscuridad bajo atmósfera de nitrógeno, DSPE (ME-8080, NOF Corporation, Japón) se suspendió en cloroformo deshidratado de 10 veces el volumen de DSPE. Después, se añadieron 1,3 cantidades equivalentes de trietilamina (208-02643, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón), y se añadió una solución de cloroformo deshidratado en ácido glutárico anhidro (G0071, Tokyo Chemical Industry, Japón) (disuelta en cloroformo deshidratado del mismo volumen que DSPE) gota a gota a temperatura ambiente. Después de que se completara, la solución se hizo reaccionar a 30 ºC durante 2 horas manteniendo la agitación.
Después, la solución de reacción se lavó 3 veces con un tampón acetato (pH 4,5), y la capa orgánica se deshidrató con sulfato de magnesio y se filtró mediante filtración por succión con un aspirador de flujo de agua. Después, el filtrado se concentró a presión reducida a 30 ºC. Cuando se volvió oleoso (aproximadamente 2 veces el volumen de DSPE), se añadió metanol para formar cristales, y a continuación se filtró. Se disolvió de nuevo en cloroformo, y este procedimiento se repitió dos veces. Después, el cristal se secó a presión reducida a temperatura ambiente, por lo cual se obtuvo un producto diana como un cristal de color blanco. Se preparó el liposoma NG-DSPE mediante el mismo método que en el Ejemplo 8.
Los resultados se muestran en la Fig. 14. El liposoma al cual se une la transferrina a través del ácido dicarboxílico (NG-DSPE: N-glutaril-distearoil fosfatidil etanolamina, NS-DSPE: N-succinil-distearoil fosfatidil etanolamina) muestra una elevada retención en sangre. Sin embargo, en el caso del liposoma al cual se une la transferrina a través de un enlace S-S mediante maleimida (MPB), la retención en sangre fue más baja incluso aunque se unió el mismo ligando, la transferrina.
Ejemplo 17: Análisis electroforético de liposomas
Como ejemplo de métodos analíticos para caracterizar los liposomas, se muestra un ejemplo de electroforesis. Los liposomas se disolvieron y se desnaturalizaron a 95 ºC durante 5 min en un tampón de muestra que contenía 2,5 % de SDS y 5 % de 2-mercaptoetanol. Utilizando aproximadamente 7,5 % a 10 % de gel de poliacrilamida (Funakoshi, Easy gel (II), gel precolado Japón), Se aplicaron 5 µl de cada muestra sobre el gel, y se llevó a cabo la electroforesis a corriente constante de 20 mA durante 1 a 2 horas.
Tras la electroforesis, el gel se tiñó de plata con un kit de tinción de plata (Wako Pure Chemical Industries, Silver Staining II Kit Wako, Japón). En la Fig. 15 se muestran los resultados de los siguientes liposomas: banda 6 (transferrina-N-glutaril-diestearoil fosfatidil etanolamina-liposoma (liposoma Tf-NG-DSPE)); banda
(transferrina-polietilenglicol-diestearoil fosfatidil etanolamina-Liposoma (Tf-PEG-DSPE liposoma)). Bandas 1-4, contienen h-apo-Tf (240 ng), h-apo-Tf(120 ng), h-apo-Tf (60 ng), y h-apo-Tf (30 ng), respectivamente.
En el caso del ejemplo comparativo, El liposoma Tf-PEG-DSPE, como el polietilenglicol tiene alguna distribución de pesos moleculares, apareció una imagen de electroforesis complicada con varias bandas. En el caso del liposoma Tf-NG-DSPE, apareció una única banda, que es mucho más fácil de analizar y aumenta la capacidad de purificar el liposoma. Estos resultados indican que, para la composición de liposomas descrita en el presente documento, un método de ensayo analítico es más simple que para una composición de liposomas derivatizada con PEG.
Ejemplo 18: Efecto de PE libre en las composiciones de liposomas
Para investigar los efectos de la presencia de fosfatidil etanolamina libre (sin-NG-PE) en un liposoma, se midió la capacidad de unión de Tf para el liposoma Tf-NG-DSPE y se preparó un liposoma añadiendo diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPE) (sin NG presente). Se preparó el liposoma Tf-NG-DSPE a partir de DSPC (64 partes), CH (32 partes) y NG-DSPE (4 partes), y se preparó el liposoma Tf-NG-DSPE + DSPE a partir de DSPC (64 partes), CH (32 partes), NG-DSPE (4 partes) y DSPE (10 partes) de la misma manera que en el Ejemplo 8.
Posteriormente, Tf se unió a NG-DSPE utilizando 10 cantidades equivalentes de NHS y ECD/HCl y 0,05 cantidades equivalentes de Tf. Después, las muestras de liposomas en cantidad correspondiente a 1 mg de lípidos se separaron mediante SDS-PAGE, y se visualizaron las bandas mediante la tinción de plata como se describe en el Ejemplo 17.
Los resultados se muestran en la Fig. 16. Se ha descubierto que, en el caso de los liposomas NG-DSPE + DSPE a los cuales se ha añadido un 10 % en moles de DSPE, la cantidad unida de Tf fue significativamente baja en comparación con la del liposoma NG-DSPE que no contenía sin NG-DSPE. Es probable que esto sea debido a que el grupo amino de Tf y el grupo amino de DSPE compiten entre sí en la reacción en el que Tf se une al grupo carboxilo de NG-DSPE.
Ejemplo 19: Comparación de los niveles de liposomas en sangre y órganos
Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 12, se compararon los niveles de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (Tf-NG-DOPE:NG-DOPE) (preparados como en el Ejemplo 7) y de los liposomas Tf-PEG-DSPE (preparados como en el Ejemplo 9) en sangre y tumores. Los resultados de la cantidad de liposomas retenidos en sangre se representan gráficamente en la Fig. 17 y la cantidad de liposomas detectados en tumores se muestran en la Fig. 18.
Los resultados de las Figs. 17 y 18 muestran que, aunque los liposomas Tf-NG-DOPE: NG-DOPE muestran una acumulación más baja en sangre (Fig. 17) que los liposomas Tf-PEG-DSPE, pueden suministrar una mayor cantidad de oxaliplatino al tumor (Fig. 18). La acumulación más baja de liposomas en la sangre reduce probablemente los efectos sistémicos adversos del oxaliplatino.
Ejemplo 20: Comparación de efectos antitumorales de liposomas en ratones que tienen tumores Colon 26
Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 14, se comparó el efecto de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) y de los liposomas Tf-PEG-DSPE (preparados como en el Ejemplo 9) en tumores Colon 26 en ratones. En la Tabla 19 se representan gráficamente los resultados.
Como puede observarse en la Fig. 19, ambos liposomas muestran una inhibición del crecimiento tumoral en comparación con la solución de oxaliplatino, sin embargo, tal como se ha señalado en el Ejemplo 19, la acumulación de menos cantidad de lNG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH en sangre (plasma) significa probablemente que estos liposomas serán mejor tolerados por los individuos a los cuales se administran.
Ejemplo 21: Efectos antitumorales de liposomas en el modelo de tumor de colon xenoinjertado HCT-116
La eficacia antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) cuando se administran contra xenoinjertos de tumores de colon HCT-116 humanos implantados por vía subcutánea. El ensayo se llevó a cabo en el Southern Research Institute, AL, EE.UU.] en ratones machos NCr-nu atímicos (02/A/08F17T9, Frederick Cancer Research and Development Center, MD, EE.UU.; 50 ratones), con oxaliplatino usado como compuesto de referencia. En la Fig. 20 se resume la actividad antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH.
Los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH se administraron por vía intravenosa (i.v.) cada cuatro días durante cuatro inyecciones (q4d x 4) como dosis de 15 y 10 mg/kg/por inyección. Se administró oxaliplatino en el mismo calendario a una dosis de 15 mg/kg/por inyección. Los grupos de control que recibieron vehículo (aproximadamente 10,3 % de sacarosa) y liposomas vacíos se inyectaron en el mismo calendario.
El volumen tumoral medio para el modelo de tumor de colon HCT-116 tras el tratamiento con liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DM-PC:CH cada 4 días fue del 28,9 % del volumen tumoral de control para el grupo tratado con 15 mg/kg y de 35,9 % del volumen tumoral de control para el grupo tratado con 10 mg/kg. La actividad antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH se comparó también con el oxaliplatino no liposómico en el modelo HCT-116, en el que los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH mostraron una eficacia mayor en términos de volumen tumoral relativo, cuando se administra a 15 mg/kg (28,9 % del volumen tumoral de control) cada cuatro días (4x). El oxaliplatino no liposómico administrado a 15 mg/kg cada cuatro días (4x) dio como resultado un 39,3 % del volumen tumoral de control.
Ejemplo 22: Efectos antitumorales de liposomas en el modelo de tumor de colon xenoinjertado HT-29
La eficacia antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) cuando se administran contra xenoinjertos de tumores de colon HT-29 humanos implantados por vía subcutánea. Se llevó a cabo el ensayo en los Panapharm Laboratories Co., Ltd., Japón en ratones hembra atímicos BALB/cA Jcl-nu (CLEA Japón, Inc., Japón; 50 ratones) y los resultados se resumen en la Fig. 21. Grupos de 4 ratones recibieron liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a las dosis de 6,7, 10 o 15 mg/kg, o el vehículo control. El vehículo y los grupos tratados con 6,7 y 10 mg/kg recibieron inyecciones en los días 10, 14 y 19 y el grupo tratado con 15 mg/kg recibió inyecciones en los días 10 y 14.
El volumen medio del tumor para el modelo de tumor de colon HT-29, tras el tratamiento con liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DM-PC:CH fue del 66,3 % del volumen tumoral de control para el grupo tratado con 6,7 mg/kg y de 39,5 % del volumen tumoral de control para el grupo tratado con 10 mg/kg (valor p ≤ 0,01).
Ejemplo 23: Efectos antitumorales de los liposomas en un modelo de tumor gástrico MKN45 xenoinjertado
La eficacia antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) cuando se administran frente a xenoinjertos de tumores gástricos MKN45 humanos implantados por vía subcutánea. Se llevó a cabo el ensayo en los Panapharm Laboratories Co., Ltd., Japón, en ratones macho atímicos BALB/cA Jcl-nu (CLEA Japan, Inc., Japón; 50 ratones); el ensayo fue analizado y se resume en la Fig. 22.
Grupos de 4 ratones recibieron liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a las dosis de 6,7, 10 o 15 mg/kg, o el vehículo control. El vehículo y los grupos tratados con 6,7 y 10 mg/kg recibieron inyecciones en los días 7, 12 y 24 y el grupo tratado con 15 mg/kg recibió inyecciones en los días 7 y 24. El volumen tumoral medio para el modelo de tumor MKN45 gástrico tras el tratamiento con los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH fue un 65,4 % del volumen tumoral del control para el grupo de 6,7 mg/kg (valor p ≤ 0.05), 49,6 % del volumen tumoral del control para el grupo de 10 mg/kg (valor p ≤ 0,01), y 48,5 % del volumen tumoral del control para el grupo de 15 mg/kg (valor p ≤ 0,01; administrado cada 17 días).
Ejemplo 24: Efectos antitumorales de liposomas en un modelo de tumor de colon COLO 205 xenoinjertado
La eficacia antitumoral de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) cuando se administran contra xenoinjertos de tumores de colon COLO 205 humanos implantados por vía subcutánea. Se llevó a cabo el ensayo en el Southern Research Institute, AL, EE.UU. en ratones machos NCr-nu atímicos (01/A/09F3T8, Federic Cancer Research and Development Center, MD, EE.UU.) con oxaliplatino en solución usado como compuesto de referencia, que fue estudiado y se resume en la Fig. 23.
Los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH se administraron por vía intravenosa (i.v.) cada cuatro días a 40 ratones en tres inyecciones (q4d x 3) a dosis de 10 y 5 mg/kg/por inyección. Se administró oxaliplatino a una dosis de 5 mg/kg/inyección en el mismo calendario. Se inyectó el grupo del control en el mismo calendario. Se volvieron a tratar los tumores en estadíos avanzados comenzando en el día 47 para todos los grupos.
Se administraron liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH en días alternos en dos inyecciones a las dosis de 15 y 10 mg/kg/inyección seguido por tratamiento en días alternos durante seis inyecciones a dosis de 4 y 2 mg/kg/inyección, respectivamente. Se administró oxaliplatino en el mismo calendario a las dosis de 10 y 2 mg/kg/inyección. El grupo del control se trató en el mismo calendario.
El volumen medio del tumor para el modelo de tumor de colon COLO 205 tras el tratamiento con liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH administrados inicialmente a dosis de 10 y 5 mg/kg, con un tratamiento posterior en estadío avanzado, tumor anteriormente tratado con liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a las dosis de 15 y 10 mg/kg, seguido por los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH a las dosis de 4 y 2 mg/kg utilizando diversos calendarios de tratamiento, fue de entre 53,2 % y 69,5 % del volumen tumoral del control (valor p ≤ 0,05 o 0,01).
Ejemplo 25: Encapsulación de oxaliplatino en liposomas dirigidos
Para medir la proporción de oxaliplatino encapsulado en liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (Tf-NG-DOPE:NG-DOPE) preparados como en el Ejemplo 7, se utilizó el siguiente procedimiento.
Se determinó la extensión de la encapsulación pasando una alícuota de la muestra con un corte de pesos moleculares por debajo de 3.000 MWCO (corte de pesos moleculares) mediante columna de centrifugación (columna con membrana de ultrafiltración con celulosa con un 30K MWCO, Nº de Cat. 42410, Millipore Corp., EE.UU) y midiendo la concentración de oxaliplatino en el eluyente utilizando HPLC con elución isocrática de acetonitrilo al 1 % en una
5 solución acuosa de ácido fosfórico diluido (pH 3,0).
Se determinó el nivel del oxaliplatino tras la filtración de membrana utilizando el análisis de HPLC para cuantificar los niveles del fármaco encapsulado. Las eficacias de atrapamiento de los 3 lotes, preparados como en el Ejemplo 7, fueron mayores del 98 % (véase la Tabla 1).
10
Tabla 1 La relación de encapsulación del oxaliplatino en el liposoma
Lote
I II III
% de encapsulación
98,8 99,6 99,1
Ejemplo 26: pH de los liposomas dirigidos
15 Se puede determinar el pH de los liposomas dirigidos colocando los liposomas en agua destilada y midiéndola con un pH-metro normalizado como se describe a continuación.
Se determinó el pH de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH (preparados como en el Ejemplo 7) mediante el pH-metro (VWR Modelo 8000), con un electrodo cargado con un gel de Ag/AgCl. Los valores del pH para 4 lotes de 20 liposomas variaron entre pH 7,17-7,23, como se muestra en la Tabla 2 siguiente.
Tabla 2 pH de liposoma
Lote
1 2 3 4
pH
7,17 7,17 7,23 7,20
Se resume la apariencia de los liposomas a pH variables en la Tabla 3. Estos resultados indican que un pH bajo 25 conduce a la agregación, sedimentación, y precipitación, que puede deberse a la protonación de NG-DOPE y Tf seguida por la agregación de la bicapa y la desnaturalización de la transferrina.
Tabla 3 Estado de los liposomas a diversos valores de pH
pH
Observaciones
7,19
líquidos, translúcidos, rosa claro
6,98
líquidos, translúcidos, sin cambios en comparación a sin adición, rosa claro
6,83
líquidos, translúcidos, sin cambios en comparación a sin adición, rosa claro
6,37
líquidos, pequeños precipitados blancos tras la adición, transparentes en un minuto en comparación a sin adición, rosa claro
5,53
líquidos, precipitados blancos tras la adición, transparentes en un minuto, pero es ligeramente más turbio, color ligeramente blanco
5,07
líquidos, precipitados blancos pequeños, turbios, color blanco
4,33
Mayor viscosidad, cantidad significativa de precipitados blancos, muy turbio, color blanco
3,72
Muy viscoso, la muestra no se mueve cuando se voltea el tubo de microcentrífuga, color blanco de arriba a abajo, opaco, color blanco
30 Ejemplo 27: Identificación de transferrina conjugada y modelo de SDS-PAGE de transferrina en liposomas dirigidos
Este estudio se llevó a cabo para confirmar la conjugación de transferrina a NG-DOPE en los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DM-PC:CH preparados como en el Ejemplo 7. Cuando se conjuga la transferrina con 35 NG-DOPE, en este método, el complejo muestra un peso molecular mayor que la transferrina no conjugada.
Los liposomas se disolvieron y se desnaturalizaron a 95 ºC durante 5 min en un tampón de muestra que contenía 2,5 % de SDS y 5 % de 2-mercaptoetanol. A continuación se aplicaron las muestras a un gel de poliacrilamida con un gradiente del 5-10 % y a continuación se sometieron a electroforesis en presencia de SDS. Se visualizaron las bandas
40 de la proteína migrada utilizando un coloide G azul brillante (B2025, SIGMA, EE.UU.).
Se detectó la transferrina en el liposoma como transferrina conjugada con NG-DOPE, que mostró un peso molecular mayor que el de la transferrina intacta (véase la Fig. 24). Se detectó una banda menor con un peso molecular menor como la transferrina libre.
45 Se calculó la relación de la transferrina libre a la transferrina conjugada con NG-DOPE en el SDS-PAGE (Fig. 24) como el área del pico utilizando el software Scion Image (públicamente disponible en www.microsoft.com.DirectX). La relación de Tf libre a Tf total en los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH fue aproximadamente de 4,7 %.
Ejemplo 28: Análisis de la presión osmótica
La presión osmótica a una temperatura dada depende de la sacarosa y de las sales tales como cloruro de sodio y tampón fosfato. No depende del soluto, sino de la densidad iónica total y del tamaño de las moléculas en la solución. La presión osmótica normal se puede medir usando un instrumento conocido como osmómetro, que mide la presión osmótica en unidades de presión adecuadas.
Se midió la presión osmótica de los liposomas NG-DOPE:Tf-NG-DOPE:DMPC:CH preparados como en el Ejemplo 7 a temperatura ambiente utilizando un osmómetro (Vapro Vapor Pressure Osmometer Model5520, Wescor, Inc., EE.UU.). Los valores de la osmolalidad para las 3 preparaciones variaron desde 360 -370 mOsm/kg, tal como se notifica en la Tabla 4.
Tabla 4 Presión de osmolaridad
Lote
A B C
Osmolalidad (mOsm/Kg)
360 370 368
Ejemplo 29: Aislamiento de Tf-NG-DOPE
Se añadieron 900 ml de EtOH a 100 ml de liposomas vacíos (DMPC/Chol/NG-DOPE/Tf-NG-DOPE) (preparados como en el Ejemplo 10 antes de la liofilización) y se agitaron completamente. A continuación la mezcla se centrifugó (9.000 rpm, 10 min, 20 ºC; CF16RX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japón) y se obtuvo un aglomerado.
A continuación se añadieron 100 ml de EtOH a este aglomerado y se agitaron completamente. La mezcla se centrifugó
(9.000 rpm, 10 min, 20 ºC; CF16RX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japón) de nuevo y se obtuvo un aglomerado blanquecino (naranja claro). Se repitió una vez más este procedimiento de lavado.
El aglomerado obtenido anteriormente se secó con N2 gas durante 30 min. A continuación se disolvió el material seco en 10 ml de agua destilada y se pasó a través de un filtro estéril (0,22 µm) (Millipore Corp., EE.UU.).
El filtrado se vertió en un vial y se congeló durante aproximadamente 8 horas en una estantería a -40 ºC. Se despresurizó la muestra a aproximadamente 0.1 mm de Hg (13,33 Pa) y se mantuvo a presión reducida durante 2 días aumentando la temperatura desde -40 ºC a 25 ºC por etapas. Aproximadamente 444 mg de Tf-NG-DOPE (aproximadamente 45 % de contenido de transferrina del liposoma vacío se obtuvieron de esta manera.
Ejemplo 30: Preparación de Tf-NG-DSPE
200 µl de NHS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) en solución acuosa (0,1 mol/l), 200 µl de una solución acuosa de EDC (clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japón) (0,25 mol/l) y 1 ml de NG-DSPE (2 mmol/l) que contenía un 2 % (p/v) de OG (n-octil-D-glucopiranósido) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón) en 50 mmol/l de tampón MES (pH 5.5) se mezclaron y agitaron durante 10 minutos.
Se eliminaron los reactivos Surplus mediante una columna de Sephadex G-15 (1,5 cm x 20 cm, 0,1 % (p/v) de OG en 50 mmol/l de tampón HEPES (pH 8,0), GE Healthcare BioSciences Corp., USA) y se sometieron a fraccionamiento durante aproximadamente 1 ml/tubo.
Se añadieron 5 ml de una solución acuosa de transferrina al 1 % (Sigma, EE.UU ) gota a gota a las fracciones que contenían NG-DSPE y se agitaron suavemente durante 20 horas a 4 ºC. La identificación fue mediante la determinación de MS de cada fracción.
A continuación se fraccionó el producto de la reacción a aproximadamente 1,7 ml/tubo mediante una columna TOYOPEARL HW-55S (1,5 cm x 45 cm, NaCl al 0,9 %, Tosoh Bioscience LLC, EE.UU.). Se estimó Tf-NG-DSPE mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS) y SDS-PAGE con tinción CBB (Azul Brillante de Coomasie, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón).

Claims (92)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un liposoma dirigido que comprende:
    5 uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, un fármaco encapsulado o compuesto marcado y, al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
    10 en el que la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; en el que el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en el que:
    15 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
    imagen1
    y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3,
    imagen2
    en la que: 25
    125 6
    R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol o
    30 fosfatidilcolina de huevo, en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3, en las que:
    imagen3
    imagen4
    12345 6
    R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10;
    y en el que el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
  2. 2.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fosfatidilcolina incluye un resto de un ácido graso saturado.
  3. 3.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC.
  4. 4.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el liposoma comprende DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, POPC y colesterol o DPPC y colesterol.
  5. 5.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el liposoma comprende DMPC y colesterol.
  6. 6.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que m y p son cada uno de manera independiente, un número entero de 2 a 4.
  7. 7.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 6, en el que m y p son iguales.
  8. 8.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que m y p son 3.
    125 6
  9. 9. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo.
    12
  10. 11. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que R, R, Ry R
  11. 10. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que RR5 y R6 son iguales.
    y R son iguales, y
    1
    2 5 6
    son iguales.
    125 6
  12. 12. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R, R, Ry Rson oleoílo.
    125 6
  13. 13.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y p son 3.
  14. 14.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la fosfatidilcolina es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol.
  15. 15.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar y un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
  16. 16.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico y una cadena de azúcar.
  17. 17.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ligando de direccionamiento es transferrina.
  18. 18.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la transferrina es una holoforma pero no una apoforma.
  19. 19.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la transferrina es una holoforma.
    125 6
  20. 20.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, la fosfatidilcolina es DMPC y el al menos un lípido adicional es colesterol.
  21. 21.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el diámetro promedio del liposoma es de 50 nm a 250 nm.
  22. 22.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que está presente el fármaco.
  23. 23.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un agente anticanceroso.
  24. 24.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un agente citotóxico.
  25. 25.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un compuesto de platino.
  26. 26.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el compuesto de platino es biplatino, cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, zeniplatino, enloplatino, lobaplatino o espiroplatino.
  27. 27.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es oxaliplatino.
    125 6
  28. 28.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fármaco es oxaliplatino; R, R, Ry Rson oleoílo; m y p son 3; el ligando de direccionamiento es transferrina; la fosfatidilcolina es DMPC; y el al menos un lípido adicional es colesterol.
  29. 29.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con las reivindicaciones 27 o 28, en el que el oxaliplatino se disuelve en una solución acuosa de un azúcar seleccionado de trehalosa, maltosa, sacarosa, manosa, lactosa, manitol, glicerol y dextrosa.
  30. 30.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el azúcar está a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 por ciento de azúcar (v/v).
  31. 31.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en el que la concentración de oxaliplatino es de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml en el liposoma.
  32. 32.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un inhibidor de la topoisomerasa
    I.
  33. 33. Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el inhibidor de la topoisomerasa I es topotecán
    o irinotecan.
  34. 34.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un alcaloide de la vinca.
  35. 35.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 34, en el que el alcaloide de la vinca es vincristina, vinblastina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina o vindesina.
  36. 36.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un ácido nucleico.
  37. 37.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 36, en el que el ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido o una ribozima.
  38. 38.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un agente alquilante.
  39. 39.
    Un liposoma dirigido de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fármaco es un taxano, un antagonista metabólico, un antibiótico antitumoral, un fármaco para tratamiento hormonal o un fármaco para una diana molecular.
    5 40. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en donde el liposoma no comprende un lípido catiónico.
  40. 41. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en donde el liposoma no
    comprende un lípido aniónico. 10
  41. 42. Un método de preparar un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, que comprende las etapas de:
    (a) mezclar:
    15 el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida;
    20
    (b)
    añadiendo el fármaco o el compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
    (c)
    formando un liposoma.
  42. 43. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende además una etapa de: 25
    (d) purificar el liposoma de la etapa (c).
  43. 44. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 42 o 43, en el que el fármaco de la etapa (b) está en solución
    acuosa antes de la mezcla. 30
  44. 45. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en el que la etapa (c) comprende sonicación, agitación o extrusión.
  45. 46. Un método de preparar un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, que 35 comprende las etapas de:
    (a) mezclar:
    el uno o más fosfolípidos,
    40 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida, en donde el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
    45
    imagen5
    en la que:
    R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y 50 n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    (b)
    añadiendo el fármaco o el compuesto marcado a la mezcla lípida formada en la etapa (a);
    (c)
    formando un liposoma; y,
    (d)
    uniendo un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con 55 ácido N-(ω)-dicarboxílico.
  46. 47. Un método de acuerdo con la reivindicación 46, que comprende además una etapa de:
    (e) purificar el liposoma de la etapa (d).
    5 48. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 46 o 47, en el que el fármaco de la etapa (b) está en solución acuosa antes de la mezcla.
  47. 49. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 48, en el que la etapa (c) comprende
    sonicación, agitación o extrusión. 10
  48. 50. Una formulación farmacéutica que comprende un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 y uno o más portadores, excipientes, diluyentes, estabilizantes o conservantes farmacéuticamente aceptables.
    15 51. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  49. 52. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde el liposoma dirigido
    comprende un fármaco, y el fármaco es un agente anticanceroso, para uso en un método de tratamiento del cáncer. 20
  50. 53. Uso de un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde el liposoma dirigido comprende un fármaco, y el fármaco es un agente anticanceroso, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
    25 54. Un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, 40, y 41, en donde el liposoma dirigido comprende un compuesto marcado, para uso en un método diagnóstico.
  51. 55. Uso de un liposoma dirigido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, 40, y 41, en donde el
    liposoma dirigido comprende un compuesto marcado, en la fabricación de un agente diagnóstico. 30
  52. 56. Un liposoma vacío que comprende:
    uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico,
    35 una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en donde la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende
    40 un ligando de direccionamiento unido a una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento; en donde el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en donde:
    45 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
    imagen6
    y
    la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 50 3,
    imagen7
    en la que:
    12 5 6
    R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y 5 m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    y en donde el liposoma no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o
    fosfatidilcolina de huevo,
    en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a fosfatidil etanolamina, fosfatidil 10 etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados
    por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
    imagen8
    12 345 6
    20 R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10;
    y en donde el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
    25 57. Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en el que la fosfatidilcolina incluye un resto de un ácido graso saturado.
  53. 58.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en el que la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC.
  54. 59.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el liposoma comprende DMPC y colesterol, DSPC y colesterol, POPC y colesterol o DPPC y colesterol.
  55. 60.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el liposoma comprende DMPC y colesterol.
  56. 61.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 60, en el que m y p son cada uno independientemente, un número entero de 2 a 4.
  57. 62.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 61, en el que m y p son iguales.
  58. 63.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 62, en el que m y p son 3.
    125 6
  59. 64. Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 63, en el que R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, oleoílo, estearoílo, palmitoílo o miristoílo.
    12
  60. 66. Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 64, en el que R, R, Ry R
  61. 65. Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 64, en el que R
    y R son iguales, y
    R5 y R6 son iguales.
    1
    2 5 6
    son iguales.
    125 6
  62. 67. Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 63, en el que R, R, Ry Rson oleoílo.
    125 6
  63. 68.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en el que R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo, y m y p son 3.
  64. 69.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 68, en el que la fosfatidilcolina es DMPC o DSPC, y el al menos un lípido adicional es colesterol.
  65. 70.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 69, en el que el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico, una cadena de azúcar y un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
  66. 71.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 69, en el que el ligando de direccionamiento se selecciona a partir de transferrina, ácido fólico, ácido hialurónico y una cadena de azúcar.
  67. 72.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 69, en el que el ligando de direccionamiento es transferrina.
  68. 73.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 72, en el que la transferrina es una holoforma pero no una apoforma.
  69. 74.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 72, en el que la transferrina es una holoforma.
    125 6
  70. 75.
    Un liposoma vacío de acuerdo con la reivindicación 56, en el que R, R, Ry Rson oleoílo, m y p son 3, el ligando de direccionamiento es transferrina, la fosfatidilcolina es DMPC y el al menos un lípido adicional es colesterol.
  71. 76.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 75, en donde el diámetro promedio del liposoma es de 50 nm a 250 nm.
  72. 77.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, en donde el liposoma no comprende un lípido catiónico.
  73. 78.
    Un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, en donde el liposoma no comprende un lípido aniónico.
  74. 79.
    Un método de preparar un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 78, que comprende las etapas de:
    (a) mezclar:
    el uno o más fosfolípidos,
    la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
    5
    (b) formar un liposoma.
  75. 80. Un método de acuerdo con la reivindicación 79, que comprende además una etapa de:
    10 (c) purificar el liposoma de la etapa (b).
  76. 81. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 79 u 80, en el que la etapa (c) comprende sonicación, agitación o extrusión.
    15 82. Un método de preparar un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 78, que comprende las etapas de:
    (a) mezclar:
    20 el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida,
    25 en donde el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
    imagen9
    30 en la que: R3 y R4 son cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y n es, de manera independiente, un número entero de 1 a 10; 35 (b) formar un liposoma; y,
    (c) unir un ligando de direccionamiento al éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico para formar una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento.
    40 83. Un método de acuerdo con la reivindicación 82, que comprende además una etapa de
    (d) purificar el liposoma de la etapa (c).
  77. 84. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 82 u 83, en el que la etapa (c) comprende sonicación, agitación o 45 extrusión.
  78. 85. Un método para preparar una composición de liposomas terapéuticos, que comprende la etapa de:
    (a) encapsular un fármaco en un liposoma vacío de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 78. 50
  79. 86. Una mezcla lípida que comprende una mezcla de:
    uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, 55 un éster de succinimidilo de fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y, al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
    en donde: la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
    imagen10
    5y en donde el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
    imagen11
    10 en la que:
    123 4
    R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    15 y en donde la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol, o fosfatidilcolina de huevo, en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por
    20 las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3, en la que:
    imagen12
    imagen13
    123 45 6
    5 R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10.
  80. 87. Una mezcla lípida de acuerdo con la reivindicación 86, en la que:
    10 la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y n son 3;
    123 4
    R,R,R yRsoniguales;y
    123 4
    R, R, R y Rson oleoílo o estearoílo.
    15 88. Un método para preparar una mezcla lípida de acuerdo con las reivindicaciones 86 u 87, que comprende la etapa de:
    mezclar:
    20 el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico.
  81. 89. Una mezcla lípida que comprende una mezcla de:
    25 uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y,
    30 al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en donde la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento;
    35 en donde el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en donde:
    la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
    imagen14
    y la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 3, en la que:
    imagen15
    125 6
    5 R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    y en donde la mezcla no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol o fosfatidilcolina de huevo,
    10 en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3,
    imagen16
    en las que: 20
    12345 6
    R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10;
    y en donde el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto. 25
  82. 90. Una mezcla lípida de acuerdo con la reivindicación 89, en la que:
    la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y p son 3;
    123 4
    5 R,R,RyRsoniguales;
    123 4
    R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo; y el ligando de direccionamiento es transferrina.
  83. 91. Un método para preparar una mezcla lípida de acuerdo con las reivindicaciones 89 o 90, que comprende la etapa 10 de:
    mezclar:
    el uno o más fosfolípidos, 15 la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, y
    la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de
    direccionamiento.
  84. 92. Una composición que contiene liposomas que comprende liposomas que comprenden: 20
    uno o más fosfolípidos, en donde el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina,
    una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico,
    un éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico y,
    al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol,
    25 en la que:
    la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1,
    imagen17
    30 y en la que el éster de succinimidilo de la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representado por la Fórmula 2,
    imagen18
    35 en la que:
    123 4
    R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y m y n son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    40 y en donde la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol o fosfatidilcolina de huevo, en donde el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados
    45 por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3, en las que:
    imagen19
    12345 6
    R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10.
  85. 93. Una composición que contiene liposomas de acuerdo con la reivindicación 92, en la que:
    la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y n son 3;
    123 4
    R,R,RyRsoniguales;y
    123 4
    R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo.
  86. 94.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 92 o 93, que comprende además un fármaco, en donde el fármaco es oxaliplatino.
  87. 95.
    Un método de preparación de una composición que contiene liposomas de acuerdo con la reivindicación 92, que comprende las etapas de:
    (a)
    mezclar:
    el uno o más lípidos fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
    (b)
    añadir el fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
    (c)
    formar una composición que contiene liposomas.
  88. 96. Una composición que contiene liposomas que comprende liposomas que comprenden:
    uno o más fosfolípidos, en el que el uno o más fosfolípidos es una fosfatidilcolina, una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico,
    5 una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y, al menos un lípido adicional, en donde el al menos un lípido adicional es colesterol o un derivado de colesterol, en donde la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento comprende un
    10 ligando de direccionamiento unido a una segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico; en donde el factor de direccionamiento está presente en una cantidad de 10 a 50 µg por mg de lípido; y en la que:
    la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 1, 15
    imagen20
    y
    la segunda fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico está representada por la Fórmula 20 3,
    imagen21
    en la que: 25
    125 6
    R, R, Ry Rson cada uno, de manera independiente, un grupo acilo, y y p son, de manera independiente, un número entero de 1 a 10;
    y en donde la composición no comprende una fosfatidil etanolamina no derivatizada, polietilenglicol o
    30 fosfatidilcolina de huevo, en el que el término "fosfatidil etanolamina no derivatizada" se refiere a una fosfatidil etanolamina, fosfatidil etanolamina(s) semisintética(s), fosfatidil etanolamina(s) sintética(s) y/o sus derivados que no están abarcados por las siguientes Fórmula 1, Fórmula 2 o Fórmula 3, en las que:
    imagen22
    imagen23
    12345 6
    R, R, R, R, Ry Rson cada uno de forma independiente un grupo acilo, y m, n, y p son independientemente un número entero de 1 a 10;
    y en donde el ligando de direccionamiento no es un anticuerpo intacto.
  89. 97. Una composición que contiene liposomas de acuerdo con la reivindicación 96, en la que:
    la fosfatidilcolina es DMPC, DSPC, POPC o DPPC; m y p son 3;
    125 6
    R,R,RyRsoniguales;
    125 6
    R, R, Ry Rson oleoílo o estearoílo; y el ligando de direccionamiento es transferrina.
  90. 98.
    Una composición que contiene liposomas de acuerdo con las reivindicaciones 96 o 97, que comprende además un fármaco, en donde el fármaco es oxaliplatino.
  91. 99.
    Un método de preparación de una composición que contiene liposomas de acuerdo con las reivindicaciones 96 o 97, que comprende las etapas de:
    (a)
    mezclar:
    el uno o más fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento y, el al menos un lípido adicional, para formar una mezcla lípida; y
    (b)
    añadir un disolvente a la mezcla formada en la etapa (a) para formar una composición que contiene liposomas.
  92. 100. Un método de preparación de una composición que contiene liposomas de acuerdo con la reivindicación 98, que comprende las etapas de:
    (a) mezclar:
    el uno o más lípidos fosfolípidos, la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico, el éster de succinimidilo de una fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico o la fosfatidil etanolamina derivatizada con ácido N-(ω)-dicarboxílico modificada con un factor de direccionamiento, y el al menos un lípido adicional,
    para formar una mezcla lípida; y
    (b)
    añadir el fármaco a la mezcla lípida formada en la etapa (a); y,
    (c)
    formar una composición que contiene liposomas.
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