ES2522042T3 - Composición de vacuna que comprende un ARN modificado con caperuza 5' - Google Patents
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Abstract
Composición de vacuna que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):**Fórmula** en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente, R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-, R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3, R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1, 2 o 3, en la que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pß del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
Description
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35
45
55
65 E10742752
28-10-2014
DESCRIPCIÓN
Composición de vacuna que comprende un ARN modificado con caperuza 5'
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al campo de la vacunación basada en ácidos nucleicos. En particular, la presente invención se refiere a la estabilización del ARN mediante modificación, en particular en el contexto de la vacunación con ARN, y proporciona una composición de vacuna que comprende un ARN que se modifica con un análogo de caperuza 5', células presentadoras de antígenos inmaduras que comprenden dicho ARN, así como métodos para inducir una respuesta inmunológica en un individuo utilizando la composición de vacuna o las células presentadoras de antígeno inmaduras según la presente invención. Además, la presente invención proporciona un método para incrementar la estabilidad del ARN en las células presentadoras de antígeno inmaduras, un método para incrementar la expresión del ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras, un método para incrementar la porción de moléculas del CMH que presentan un antígeno de interés y un método para estimular y/o activar las células efectoras inmunológicas.
Antecedentes de la invención
Las vacunas recombinantes resultan de particular importancia en la medicina humana y veterinaria para la profilaxis y la terapia de las enfermedades infecciosas y cancerosas. El objetivo de una inmunización con una vacuna recombinante es inducir una reacción inmunitaria específica contra un antígeno definido, que resulta eficaz para la prevención o la terapia de enfermedades definidas. Las vacunas recombinantes conocidas se basan en proteínas recombinantes, fragmentos de péptidos sintéticos, los virus recombinantes o los ácidos nucleicos.
Recientemente, las vacunas basadas en ADN y ARN han ganado en importancia. Se ha demostrado que la inyección intramuscular directa de ADN plasmídico resulta en una expresión duradera de los genes codificados (Wolff et al., Science 247:1465-1468, 1990). Este resultado ha sido un incentivo importante en el campo para investigar adicionalmente la aplicabilidad de los ácidos nucleicos en inmunoterapia. Inicialmente se estudiaron las vacunas basadas en ADN contra patógenos infecciosos (Cox et al., J. Virol. 67:5664-5667, 1993; Davis et al., Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851, 1993; Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 90:4156-4160, 1993). Además, se ha estudiado la aplicabilidad de los ácidos nucleicos en la terapia génica contra tumores y para la inducción de una inmunidad específicamente antitumoral (Conry et al., Cancer Res. 54:1164-1168, 1994; Conry et al., Gene Ther. 2:59-65, 1995; Spooner et al., Gene Ther. 2:173-180, 1995; Wang et al., Hum. Gene Ther. 6:407-418, 1995).
La inmunización basada en ácidos nucleicos muestra varias ventajas. Por ejemplo, la preparación de vacunas basadas en ácidos nucleicos es sencilla, relativamente económica y las vacunas basadas en ADN son estables en el almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, en particular las vacunas basadas en ADN muestran diversos riesgos potenciales de seguridad, tales como la inducción de anticuerpos anti-ADN (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 95:13981402, 1995) y la integración potencial del transgén en el genoma del huésped. Lo anterior puede conducir a la inactivación de los genes celulares, una expresión a largo plazo incontrolada del transgén, u oncogénesis, y de esta manera, generalmente no resulta aplicable a los antígenos asociados a tumor con potencial oncogénico, tales como erb-B2 (Bargmann et al., Nature 319:226-230, 1986) y p53 (Greenblatt et al., Cancer Res. 54:4855-4878, 1994).
La utilización del ARN proporciona una alternativa atractiva para evitar los potenciales riesgos de las vacunas basadas en ADN. Algunas de las ventajas de la inmunización basada en ARN son la expresión transitoria y su carácter no transformante. Además, el ARN no necesita ser transportada hasta el interior del núcleo para que se exprese el transgén y, además, no puede integrarse en el genoma del huésped. De manera similar a la inyección de ADN (Condon et al., Nat. Med. 2:1122-1128, 1996; Tang et al., Nature 356:152-154, 1992), la inyección de ARN puede resultar en una respuesta inmunológica humoral tanto celular como humoral in vivo (Hoerr et al., Eur. J. Immunol. 30:1-7, 2000; Ying et al., Nat. Med. 5:823-827, 1999).
Se han seguido dos estrategias diferentes para la inmunoterapia con ARN transcrito in vitro (ARN-IVT), las cuales han sido sometidas a ensayo con éxito en diversos modelos animales. El ARN se inyecta directamente en el paciente mediante diferentes vías de inmunización (Hoerr et al., Eur. J. Immunol. 30:1-7, 2000) o se transfectan células dendríticas con ARN-IVT utilizando métodos convencionales de transfección in vitro y seguidamente las células dendríticas transfectadas se administran en el paciente (Heiser et al., J. Immunol. 164:5508-5514, 2000). Se ha demostrado que la inmunización con células dendríticas transfectadas con ARN induce linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos de antígeno in vitro e in vivo (Su et al., Cancer Res. 63:2127-2133, 2003; Heiser et al., J. Clin. Invest. 109:409-417, 2002). Además, se ha demostrado que la inyección directa de ARN desnudo en nódulos linfáticos de animales de laboratorio (inyección intranodal) conduce a la incorporación de dicho ARN principalmente por parte de células dendríticas inmaduras, probablemente mediante un proceso denominado macropinocitosis (ver documento DE 10 2008 061 522.6). Se infiere que el ARN se traduce y que la proteína expresada es presentada sobre las moléculas de CMH sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno, induciendo una respuesta inmunológica.
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Una desventaja importante de la vacunación basada en ARN es la inestabilidad del ARN in vivo, en particular en células del sistema inmunológico. La degradación del ARN de cadena larga desde el extremo 5' es inducida en la célula por el enzima Dcp2 denominado "descaperuzante", que corta el mGDP de la cadena de ARN. De esta manera, se considera que el corte se produce entre los grupos alfa-fosfato y beta-fosfato de la caperuza del ARN.
Para inhibir el proceso de descaperuzado e incrementar de esta manera la estabilidad del ARN in vivo, se ha estudiado el efecto de los análogos de fosforotioato de caperuza sobre la estabilidad de dicho ARN. Se ha demostrado que la sustitución de un átomo de oxígeno por un átomo de azufre en el grupo beta-fosfato de la caperuza 5' resulta en la estabilización frente a Dcp2. La modificación fosforotioato de la caperuza 5' del ARN se ha combinado con una modificación de "análogos antiinversos de caperuza" (ARCA) que inhibe la integración inversa
(7,2'-O)Gpp3pG, ha sido
de la caperuza en la cadena del ARN. El análogo de caperuza resultante, es decir, m2denominado beta-S-ARCA (ver la figura 1). La sustitución de un átomo de oxígeno por un átomo de azufre en un fosfato de puente resulta en diastereómeros de fosforotioato que se denominan D1 y D2 basándose en su patrón de elución en HPLC. Resulta interesante que los dos diastereómeros difieren en su sensibilidad frente a nucleasas. Se ha demostrado que el ARN que porta el diastereómero D2 de beta-S-ARCA es prácticamente totalmente resistente frente al corte por Dcp2 (sólo un 6% de corte en comparación con ARN que ha sido sintetizado en presencia de caperuza 5' ARC no modificado), mientras que el ARN con la caperuza 5' beta-S-ARCA(D1) muestra una sensibilidad intermedia al corte con Dcp2 (71% de corte) (Grudzien-Nogalska et al., RNA 13:1745-1755, 2007). Además, los tres análogos de caperuza ARCA, beta-S-ARCA(D1) y beta-S-ARCA(D2) difieren en su afinidad de unión al factor eucariótico de inicio de traducción eIF4E. Ambos análogos de caperuza fosforotioato presentan una mayor afinidad para eIF4E que los ARN que presentan caperuzas 5' convencionales. Se ha demostrado además que la estabilidad incrementada frente al corte por Dcp2 se correlaciona con una expresión de proteínas incrementada en células HC11. En particular, se ha demostrado que los ARN que porta la caperuza beta-S-ARCA(D2) se traducen más eficientemente en las células HC11 que los ARN que portan la caperuza beta-S-ARCA(D1) (Grundzien-Nogalska et al., RNA 13:1745-1755, 2007).
Kowalska et al. (RNA 14:1119-1131, 2008) también dan a conocer análogos anticaperuza inversa con sustituciones fosforotioato y enseña que únicamente los análogos modificados en el grupo gamma-fosfato son resistentes al corte por DcpS.
En resumen, el ARN resulta especialmente adecuado para las aplicaciones clínicas. Sin embargo, la utilización del ARN en la terapia génica y la vacunación con ARN se encuentra limitada principalmente por la corta semivida del ARN, en particular en el citoplasma, lo que resulta en una expresión de proteínas baja y/o insuficiente.
De esta manera, para la vacunación con ARN resulta particularmente importante incrementar la estabilidad del ARN en las células presentadoras de antígeno. Debido a que el ARN desnudo inyectado en los nódulos linfáticos principalmente es incorporado por células presentadoras de antígeno inmaduras, en particular por células dendríticas inmaduras, resulta particularmente importante en el contexto de la vacunación con ARN incrementar la estabilidad del ARN en las células presentadoras de antígeno inmaduras. De esta manera, el objetivo de la presente invención es proporcionar ARN que resulta particularmente adecuado para la vacunación con ARN, es decir, proporcionar medios para en particular estabilizar el ARN en las células presentadoras de antígeno inmaduras. Este problema técnica se resuelve según la presente invención mediante la materia objeto de las reivindicaciones.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un ARN que ha sido modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
5 R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2, formando -O-CH2-o -CH2-O-,
10 R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
n es 1, 2ó 3,
15 en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
En una forma de realización preferida, la estructura de caperuza 5' durante la transferencia de dicho ARN al interior
20 de las células presentadoras de antígeno inmaduras es capaz de incrementar la estabilidad del ARN, incrementando la eficiencia de traducción del ARN, prolongando la traducción del ARN, incrementando la expresión total de proteínas del ARN y/o incrementando la respuesta inmunológica contra un antígeno o péptido antigénico codificado por dicho ARN en comparación con el mismo ARN sin la estructura de caperuza 5' según la fórmula (I).
25 En una forma de realización preferida, R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente y arilo sustituido opcionalmente.
En una forma de realización preferida, R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, OH, metoxi, etoxi y propoxi.
30 En una forma de realización particularmente preferida, la caperuza 5' de ARN es el diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
Preferentemente, la composición de vacuna se formula para la inyección intranodal.
35 En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula presentadora de antígeno inmadura que comprende un ARN que se encuentra modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
40 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
45 R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que R2 se encuentra unido formando -O-CH2-o -CH2-O-,
50 R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
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n es 1, 2ó 3,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del 5 átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, que comprende la etapa de administrar en dicho individuo la composición de vacuna del primer aspecto de la invención o la célula presentadora de antígeno inmadura del segundo aspecto de la invención.
10 En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la estabilidad de un ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras y/o para incrementar la expresión de un ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras, comprendiendo dicho método: proporcionar dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 20 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de
25 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 formando -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 30 n es 1, 2ó 3,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, y 35 transferir dicho ARN hasta el interior de las células presentadoras de antígeno.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la porción de moléculas del CMH que presentan un antígeno de interés sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, 40 comprendiendo dicho método:
proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende dicho antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 5 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de
10 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que R2 se encuentra unido formando -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 15 n es 1, 2o 3,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, y 20 transferir dicho ARN hasta el interior de una célula presentadora de antígeno.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para estimular y/o activar células efectoras inmunológicas, comprendiendo dicho método:
25 proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende dicho antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
35 R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que R2 se encuentra unido formando -O-CH2-o -CH2-O-,
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R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3, R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 5 nes1,2ó3, en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, y
10 transferir dicho ARN hasta el interior de células presentadoras de antígeno, y poner en contacto las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas. Poner en contacto las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas puede llevarse a
15 cabo in vitro o in vivo. En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, comprendiendo dicho método: proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico dle mismo, 20 estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido 25 opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en 30 CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que R2 se encuentra unido formando -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
35 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
n es 1, 2ó 3,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del 40 átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, y
administrar dicho ARN en dicho individuo.
En una forma de realización preferida, el ARN se administra mediante inyección intranodal.
45 En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en u n individuo, comprendiendo dicho método:
proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que 50 comprende dicho antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 5 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de
10 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que R2 se encuentra unido formando -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 15 n es 1, 2ó 3,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, y 20 transferir dicho ARN hasta el interior de células presentadoras de antígeno, y
administrar las células presentadoras de antígeno en dicho individuo.
25 Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Estructuras de dinucleótidos de caperuza 5'. Existen dos diastereómeros del análogo de caperuza de fosforotioato beta-S-ARCA debido al centro P estereogénico, que se denominan D1 y D2 según sus características de elución en HPLC de fase inversa.
30 Figura 2. Efecto de la estructura de la caperuza 5' sobre la expresión de proteínas en células dendríticas. (A) Se electroporaron células dendríticas inmaduras y maduras (CDi y CDm, respectivamente) con la misma cantidad de ARN codificante de luciferasa que había sido transcrita en presencia de diversos dinucleótidos de caperuza (tal como se indica) o en las que la caperuza 5' había sido incorporada post-transcripcionalmente utilizando el enzima de
35 adición de caperuza del virus Vaccinia (m7GpppG(p.-t.)). Se midió la actividad de luciferasa (expresada en URL) por duplicado tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas. Se muestran medias ± desviaciones estándar. (B) Las CDi y CDm se electroporaron con la misma cantidad de ARN codificante de d2eGFP que había sido preparado tal como se ha descrito en (A). Las células se recolectaron tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas y se determinó la fluorescencia de d2eGPF (expresada en IMF) mediante citometría de flujo.
40 Figura 3. Competición para la traducción entre ARN con caperuza ARCA y con caperuza beta-S-ARCA(D1). Se electroporaron células dendríticas inmaduras (CDi) con (A) cantidades crecientes de ARN codificantes de luciferasa,
o (B) las cantidades indicadas de ARNm codificantes de luciferasa y de d2eGFP, a las que se añadió una caperuza cotranscripcionalmente, de ARCA o de beta-S-ARCA(D1), tal como se indica. Se midió la actividad de luciferasa tras
45 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas. Se muestra (A) la proporción entre las actividades de luciferasa obtenidas tras la electroporación con 40 y 20 pmoles de ARN codificantes de luciferasa (± SD de dos experimentos independientes), y
(B) la actividad relativa de luciferasa, en comparación con células electroporadas con únicamente ARN codificante de luciferasa, sin ARN (que se considera 1 para ARN con caperuza, tanto de ARCA como de beta-S-ARCA(D1)).
50 Figura 4. Impacto de la caperuza 5' sobre la estabilidad de los ARNm en las células dendríticas. (A) Se electroporaron células dendríticas inmaduras (CDi) y (B) células dendríticas maduras (CDm) con cantidades iguales de ARNm codificantes de d2eGFP transcritos en presencia de diferentes análogos de caperuza tal como se indica. Se recolectaron las células tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas, y se cuantificaron los niveles de transcrito de d2eGFP
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mediante RT-PCR en tiempo real. Para cada punto temporal, se muestra la diferencia entre los ciclos umbral (Ct) de los ARN codificantes de d2eGFP y la hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT1) utilizada como control interno. Los datos se ajustaron a una curva bifásica de decrecimiento (CDi, figura 4A) o a una curva monofásica de decrecimiento (CDm, figura 4B).
Figura 5. Efecto de la estructura de la caperuza 5' sobre la expresión in vivo de proteínas. Se inyectó por vía intranodal en ratones (n=9) la misma cantidad de ARN codificante de luciferasa con ARCA o beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' (tal como se indica). Se midió la actividad de luciferasa (expresada en URL) tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas. (A) Se muestran imágenes de animales enteros en los puntos temporales indicados de un ratón representativo, en el que se había inyectado ARN de ARCA o de beta-S-ARCA(D1). Se ilustran los recuentos de fotones correspondientes a la escala de grises mostrada en la figura. (B) Medias ± errores estándar de la media medida durante el curso temporal. Se ha determinado la significancia mediante análisis estadísticos (*: P<0,005 y **: P<0,02).
Figura 6. Efecto de la estructura de la caperuza 5' sobre el cebado de novo de células T tras la inmunización intranodal con ARN. Se inmunizaron ratones (n=5) mediante inyección intranodal dos veces al día (días 0 y 3) con la misma cantidad de ARN codificante de un péptido antigénico específico que portaba ARCA o beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5'. Se determinó la frecuencia de las células CD8+ positivas para tetrámero el día 8 mediante análisis de tetrámeros. (A) Gráficos de puntos representativos de células procedentes de sangre periférica y de bazos de ratones que habían sido inmunizados con ARN de ARCA o de beta-S-ARCA(D1) (tal como se indica). (B) Número medio de células CD8+ positivas para tetrámero ± error estándar de la media (en %) medido el día 8. Se determinó la significancia utilizando análisis estadísticos (*: P<0,075).
Figura 7. Análisis de HPLC de m27,2'-OGppSpG (D1) y (D2) (es decir, beta-S-ARCA(D1) y (D2)). La HPLC analítica de una mezcla diastereomérica con una proporción molar de beta-S-ARCA(D1):(D2) de 1:3 se llevó a cabo en un aparato Agilent Technologies 1200 Series con una columna Supelcosil LC-18-T RP (5 µm, 4,6x250 mm, caudal: 1,3 ml/min) utilizando un gradiente lineal de 0% a 25% de metanol en acetato amónico 0,05 M, pH=5,9, en 15 min. La detección de UV (VWD) se llevó a cabo a 260 nm y la detección de la fluorescencia (DFL) se llevó a cabo con excitación a 280 nm y detección a 337 nm. Tiempos de retención: beta-S-ARCA(D1)=10,4 min, beta-SARCA(D2)=10,7 min.
Descripción detallada de la invención
Aunque la presente invención se describe en detalle a continuación, debe apreciarse que la presente invención no se encuentra limitada a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria, ya que estos pueden variar. También debe apreciarse que la terminología utilizada en la presente memoria está destinada al propósito de describir formas de realización particulares únicamente, y no pretende ser limitativa del alcance de la presente invención, que únicamente se encontrará limitada por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los significados comúnmente entendidos por el experto ordinario en la materia.
A continuación se describen los elementos de la presente invención. Estos elementos se presentan con formas de realización específicos; sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear formas de realización adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las formas de realización preferentes no deben interpretarse como limitativas de la presente invención a únicamente las formas de realización descritas explícitamente. La presente descripción debe entenderse que proporciona soporte y comprende formas de realización que combinan las formas de realización descritas explícitamente y cualquier número de elementos dados a conocer y/o preferentes. Además, cualesquiera permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en la presente solicitud deben consideradas dadas a conocer por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, en el caso de que en una forma de realización preferente R2 de la estructura de la caperuza 5' sea metoxi y en otra forma de realización preferente R5 de la estructura de caperuza 5' sea S, en una forma de realización preferente R2 de la estructura de la caperuza 5' será metoxi y R5 será S.
Preferentemente, los términos utilizados en la presente memoria están definidos tal como se indica en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger B. Nagel y H. Kölbl, editores, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza, 1995.
La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de técnicas químicas, bioquímicas y de ADN recombinante que se aplican en la literatura del campo (ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al., editores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).
A lo largo de la presente memoria y las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprende" y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" y "que comprenden", debe entenderse que implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números
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enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el" y "la" y referencias similares utilizadas en el contexto de descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) debe interpretarse que cubren tanto la forma singular como la forma plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria
o se contradiga claramente por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en la presente memoria meramente pretende servir como método abreviado de referencia individual a cada valor separado comprendido dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, cada valor individual se incorpora en la memoria como si se hubiese indicado individualmente en la presente memoria. Todos los métodos descritos en la presente memoria pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o de otro modo se encuentre claramente contradicho por el contexto. La utilización de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje ejemplar (por ejemplo "tal como"), proporcionado en la presente memoria pretende meramente ilustrar mejor la invención y no es limitativa del alcance de la invención de otra forma reivindicada. Ningún término en la memoria debe interpretarse como indicativo de cualquier elemento no reivindicado que resulte esencial para la práctica de la invención.
Se citan varios documentos a lo largo de todo el texto de la presente memoria. No se debe considerar nada en la presente memoria como una admisión de que la presente invención no está capacitada para antedatar a dicha publicación en virtud de invención previa.
Según la invención, la expresión "ácido nucleico" comprende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), combinaciones de las mismas, y formas modificadas de las mismas. La expresión comprende ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas recombinantemente y sintetizadas químicamente. Según la invención, puede encontrarse presente un ácido nucleico en forma de una molécula de cadena sencilla o de doble cadena y lineal o cerrada circularmente de manera covalente. Un ácido nucleico puede, según la invención, encontrarse aislado. La expresión "ácido nucleico aislado" se refiere, según la invención, a que el ácido nucleico (i) ha sido amplificado in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) ha sido producido recombinantemente mediante clonación, (iii) ha sido purificado, por ejemplo mediante corte y separación en electroforesis en gel, o (iv) se ha sintetizado, por ejemplo mediante síntesis química.
En el contexto de la presente invención, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende por lo menos un residuo ribonucleótido. El término "ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo β-D-ribofuranosilo. El término comprende ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla, ARN aislado, tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN generado recombinantemente, tal como ARN modificado que difiere de ARN natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. El término "ARNm" se refiere a "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que se genera mediante la utilización de un molde de ADN y codifica un péptido o una proteína. Típicamente, un ARNm comprende una UTR 5', una región codificante de proteína y una UTR 3'. El ARNm sólo presenta una semivida limitada en las células e in vitro. En el contexto de la presente invención, puede generarse ARNm mediante transcripción in vitro a partir de un ADN molde. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, existe una diversidad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente. En el contexto de la presente invención, el ARN, preferentemente el ARNm, se modifica con una estructura de caperuza 5'.
En una forma de realización preferida, el ARN según la invención codifica un péptido o una proteína que comprende uno o más antígenos y/o uno o más péptidos antigénicos y es capaz de expresar dicho péptido o proteína que comprende uno o más antígenos y/o uno o más péptidos antigénicos, en particular en el caso de que se transfiera al interior de una célula, tal como una célula presentadora de antígeno inmadura. El ARN también puede contener secuencias que codifiquen otras secuencias de polipéptido, tales como elementos estimuladores inmunológicos. Además, puede contener elementos que participen en la regulación de la expresión (por ejemplo secuencias UTR 5'
o 3', etc.).
El término "modificación" en el contexto del ARN utilizado en la presente invención incluye cualquier modificación de un ARN que no se encuentra naturalmente presente en dicho ARN. En particular, el término modificación se refiere a proporcionar un ARN con un análogo de caperuza 5' que presenta una estructura tal como se indica en la fórmula (I). Por ejemplo, puede obtenerse un ARN con un análogo de caperuza 5' mediante la transcripción n vitro de un ADN molde en presencia de dicho análogo de caperuza 5', en el que dicha caperuza 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripción in vitro y la caperuza 5' puede unirse al ARN post-transcripcionalmente utilizando enzimas de adición de caperuza, por ejemplo enzimas de adición de caperuza del virus Vaccinia. El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado en la presente invención, preferentemente el ARNm utilizado en la presente invención, puede ser una extensión o truncado de la cola poli(A) naturalmente presente o una alteración de las regiones 5' ó 3' no traducidas (UTR), tal como la introducción de una UTR que no esté relacionada con la región codificante de dicho ARN, preferentemente dicho ARNm, por ejemplo el intercambio de la UTR 3' existente con, o la inserción de una o más, preferentemente dos, copias de una UTR 3' derivada de un gen de globina, tal como alfa2-globina, alfa1-globina, beta-globina, preferentemente beta-globina, más preferentemente beta-globina humana.
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La expresión "caperuza 5'" se refiere a una estructura de caperuza presente en el extremo 5' de una molécula de ARNm y que consiste generalmente de un nucleótido guanosina conectado al ARNm mediante un enlace trifosfato inusual 5' a 5'. En una forma de realización, esta guanosina se encuentra metilada en la posición 7. La expresión "caperuza 5' convencional" se refiere a una caperuza 5' de ARN naturalmente presente, preferentemente a la caperuza 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, la expresión "caperuza 5'" incluye un análogo de caperuza 5' que es similar a la estructura de caperuza de ARN y se encuentra modificado de manera que presenta la capacidad de estabilizar el ARN en el caso de que se encuentre unido al mismo, preferentemente in vivo, preferentemente en células presentadoras de antígeno inmaduras, más preferentemente en células dendríticas inmaduras. La caperuza 5' utilizada en la presente invención muestra una estructura según la fórmula (I).
En el contexto de la presente invención, la expresión "composición de vacuna" se refiere a una preparación antigénica que comprende ARN. La composición de vacuna se administra en un receptor con el fin de estimular el sistema inmunológico humoral y/o celular de un individuo frente a uno o más antígenos. En el presente contexto, el ARN puede codificar el antígeno, una proteína o péptido que comprende dicho antígeno o un péptido antigénico. Una composición de vacuna en el contexto de la presente invención puede comprender además uno o más adyuvantes, diluyentes, portadores y/o excipientes, etc. y se aplica en un individuo en cualquier vía adecuada con el fin de inducir una reacción inmunológica protectora y/o terapéutica contra el antígeno.
Para la administración según la invención, en particular en forma de una composición de vacuna, el ARN puede ser ARN desnudo o puede incorporarse en un portador, por ejemplo liposomas u otras partículas para la transferencia génica y preferentemente se encuentra en forma de ARN desnudo.
Un "antígeno" según la invención cubre cualquier sustancia que inducirá una respuesta inmunológica. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). Según la presente invención, el término "antígeno" comprende cualquier molécula que comprende por lo menos un epítopo. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente tras el procesamiento, induce una reacción inmunológica, que preferentemente es específica para el antígeno. Según la presente invención, puede utilizarse cualquier antígeno adecuado, que sea candidato para una reacción inmunológica, en la que la reacción inmunológica puede ser tanto una reacción inmunológica humoral como celular. En el contexto de las formas de realización de la presente invención, el antígeno preferentemente es presentado por una célula, preferentemente una célula presentadora de antígeno, en el contexto de moléculas del CMH, que resulta en una reacción inmunológica contra el antígeno. Un antígeno preferentemente es un producto que corresponde a o se deriva de un antígeno existente naturalmente. Entre dichos antígenos existentes naturalmente pueden incluirse o pueden derivarse a partir de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. Según la presente invención, un antígeno puede corresponder a un producto natural, por ejemplo una proteína vírica o una parte de la misma.
En una forma de realización preferente, el antígeno es un antígeno tumoral, es decir, una parte de una célula tumoral que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular o el núcleo celular, en particular los que se encuentran presentes principalmente dentro de la célula o en forma de antígenos de superficie de las células tumorales. Por ejemplo, entre los antígenos tumorales se incluyen el antígeno carcinoembrionario, la α1fetoproteína, la isoferritina y la sulfoglucoproteína fetal, la α2-H-ferroproteína y la γ-ferroproteína, así como diversos antígenos tumorales víricos. Según la presente invención, un antígeno tumoral preferentemente comprende cualquier antígeno que es característico de tumores o cánceres, así como de células tumorales o de cáncer con respecto al tipo y/o nivel de expresión. En otra forma de realización, el antígeno es un antígeno vírico, tal como una ribonucleoproteína vírica o una proteína de cubierta. En particular, el antígeno debe ser presentado por moléculas del CMH, resultando en la modulación, en particular la activación, de células del sistema inmunológico, preferentemente linfocitos CD4+ y CD8+, en particular a través de la modulación de la actividad de un receptor de las células T.
En formas de realización preferentes, el antígeno es un antígeno tumoral y la presente invención implica la estimulación de una respuesta de LTC antitumoral contra las células tumorales que expresan dicho antígeno tumoral y preferentemente que presentan dicho antígeno tumoral con el CMH de clase 1.
El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficacia relativa de un antígeno en la inducción de una reacción inmunológica.
El término "patógeno" se refiere a microorganismos patogénicos y comprende virus, bacterias, hongos, organismos unicelulares y parásitos. Son ejemplos de virus patogénicos, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el citomegalovirus (CMV), el virus herpes (VHS), el virus de la hepatitis A (VHA), VHB, VHC, el virus del papiloma y el virus linfotrófico T humano (VLTH). Los organismos unicelulares comprenden plasmodios, tripanosomas, amebas, etc.
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Son ejemplos de antígenos que pueden utilizarse en la presente invención, p53, ART-4, BAGE, ss-catenina/m, BcrabL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferentemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 ó MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Plac-1, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ó RU2, SAGE, SART-1 ó SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVINA, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT, preferentemente WT-1.
"Una porción o fragmento de un antígeno" o "un péptido antigénico" según la invención preferentemente es una representación incompleta de un antígeno y es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra el antígeno.
En el presente contexto, la invención utiliza además péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de antígenos, también denominadas "péptidos antigénicos" en la presente memoria. La expresión "péptido antigénico" o "péptido antigénico derivado de un antígeno" se refiere a un oligopéptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento o péptido de un antígeno. Un péptido antigénico puede presentar cualquier longitud.
Preferentemente, los péptidos antigénicos son capaces de estimular una respuesta inmunológica, preferentemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferentemente por la presentación del antígeno. Preferentemente, un péptido antigénico es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con CMH de clase I y preferentemente es capaz de estimular una LTC sensible a antígeno. Preferentemente, los péptidos antigénicos según la invención son péptidos presentados por CMH de clase I y/o de clase II o pueden ser procesados para producir péptidos presentados por CMH de clase I y/o de clase II. Preferentemente, los péptidos antigénicos comprenden una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferentemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por CMH de clase I y/o de clase II. Preferentemente, un péptido antigénico según la invención comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente a la secuencia de aminoácidos de dicho fragmento y es procesada para producir dicho fragmento, es decir, un péptido presentado por CMH de clase I y/o de clase II derivado de un antígeno.
En el caso de que un péptido antigénico que va a presentarse directamente, es decir, sin procesamiento, en particular sin corte, presentará una longitud que resulte adecuad para la unión a una molécula del CMH, en particular a una molécula del CMH de clase I, y preferentemente presentará una longitud de entre 7 y 20 aminoácidos, más preferentemente de entre 7 y 12 aminoácidos, todavía más preferentemente de entre 8 y 11 aminoácidos, en particular de 9 ó 10 aminoácidos. Preferentemente, la secuencia de un péptido antigénico que va a presentarse directamente se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno, es decir, su secuencia se corresponde sustancialmente y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno.
En el caso de que un péptido antigénico se vaya a presentar tras el procesamiento, en particular tras el corte, el péptido producido mediante procesamiento presentará una longitud que resulte adecuada para la unión a una molécula del CMH, en particular a una molécula del CMH de clase I, y preferentemente presentará una longitud de entre 7 y 20 aminoácidos, más preferentemente de entre 7 y 12 aminoácidos, todavía más preferentemente de entre 8 y 11 aminoácidos, en particular de 9 ó 10 aminoácidos. Preferentemente, la secuencia del péptido que va a presentarse tras el procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno, es decir, su secuencia se corresponde sustancialmente y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno. De esta manera, un péptido antigénico según la invención en una forma de realización comprende una secuencia de entre 7 y 20 aminoácidos de longitud, más preferentemente de entre 7 y 12 aminoácidos, todavía más preferentemente de entre 8 y 11 aminoácidos, en particular de 9 ó 10 aminoácidos, que se corresponde sustancialmente y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno y tras el procesamiento del péptido antigénico constituye el péptido presentado. Sin embargo, el péptido antigénico puede comprender además una secuencia que se corresponde sustancialmente y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno que es incluso más largo que la secuencia anteriormente indicada. En una forma de realización, un péptido antigénico puede comprender la secuencia entera de un antígeno.
Los péptidos que presentan secuencias de aminoácidos sustancialmente correspondientes a una secuencia de un péptido presentado por el CMH de clase I pueden diferir en uno o más residuos que no resultan esenciales para el reconocimiento de RCT del péptido tal como es presentado por el CMH de clase I, o para la unión del péptido al CMH. Dichos péptidos sustancialmente correspondientes también son capaces de estimular una LCT sensible a antígeno. Los péptidos que presentan secuencias de aminoácidos diferentes de un péptido presentado en residuos que no afectan al reconocimiento de los RCT pero que mejoran la estabilidad de unión al CMH pueden mejorar la inmunogenicidad del péptido antigénico, y puede hacerse referencia a los mismos en la presente memoria como "péptidos optimizados". Mediante la utilización de los conocimientos existentes sobre qué residuos es más probable que afecten a la unión al CMH o a los RCT, puede utilizarse un enfoque racional al diseño de los péptidos sustancialmente correspondientes. Los péptidos resultantes que son funcionales se contemplan como péptidos antigénicos.
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La expresión "procesamiento de antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en fragmentos (por ejemplo la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo mediante la unión) con moléculas del CMH para la presentación por "células presentadoras de antígeno" a células T específicas.
La expresión "LTC sensibles a antígeno" se refiere a una célula T CD8+ que es sensible a un antígeno o a un péptido derivado de dicho antígeno, que es presentado con el CMH de clase I sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno.
Según la invención, la sensibilidad de las LTC puede incluir un flujo sostenido de calcio, la división celular, la producción de citoquinas, tales como IFN-γ y TNF-α, la regulación positiva de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y la eliminación citolítica específica de células diana expresantes de antígenos tumorales. La sensibilidad de las LTC también puede determinarse utilizando un informador artificial que indique con exactitud la sensibilidad de las LTC.
La expresión "inducción de una respuesta inmunológica" en el contexto de la presente invención preferentemente se refiere a la inducción de una respuesta inmunológica tanto celular como humoral. La respuesta inmunológica puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica. La respuesta inmunológica puede dirigirse contra cualquier inmunógeno o antígeno o péptido antigénico, preferentemente contra un antígeno asociado a cáncer o un antígeno asociado a un patógeno. El término "inducción" en el presente contexto puede referirse a que no se ha producido ninguna respuesta inmunológica contra un antígeno o patógeno particular antes de la inducción, pero también puede hacer referencia a que se produjo un cierto nivel de respuesta inmunológica contra un antígeno o patógeno particular antes de la inducción y después de la inducción dicha respuesta inmunológica se ha incrementado. De esta manera, "inducción de la respuesta inmunológica" en el presente contexto incluye también "incrementar la respuesta inmunológica". Preferentemente, tras inducir una respuesta inmunológica en un individuo, dicho individuo resulta protegido frente a desarrollar una enfermedad, tal como una enfermedad infecciosa o una enfermedad cancerosa o la condición de enfermedad mejora mediante la inducción de una respuesta inmunológica.
Una "respuesta inmunológica celular" o una "respuesta celular contra un antígeno" pretende incluir una respuesta celular dirigida contra células, caracterizada por la presentación de un antígeno con CMH de clase I o clase II. La respuesta celular se refiere a células denominadas células T o linfocitos T que actúan como "auxiliares" o "asesinos". Las células T auxiliares (también denominadas células T CD4+) desempeñan una función crucial al regular la respuesta inmunológica y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o LTC) eliminan las células enfermas, tales como células tumorales, evitando la producción de más células enfermas.
Los términos "vacunación" e "inmunización" se refieren al procedimiento de administrar uno o más inmunógenos o antígenos o derivados de los mismos, en particular en la forma de codificación como ARN de los mismos, tal como se describe en la presente memoria, en un individuo y estimular una respuesta inmunológica contra dicho inmunógeno o inmunógenos o antígeno o antígenos o células, caracterizada por la presentación de dicho inmunógeno o inmunógenos o antígeno o antígenos. La expresión "reacción inmunológica" se utiliza en la presente memoria en su sentido convencional y comprende la inmunidad humoral y la inmunidad celular. Una reacción inmunológica comprende una o más reacciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en desarrollar anticuerpos contra uno o más antígenos y la expansión de linfocitos T específicos de antígeno, preferentemente linfocitos T CD4+ y CD8+, más preferentemente linfocitos T CD8+, que pueden detectarse en diversos ensayos in vitro de proliferación o producción de citoquinas.
La expresión "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula presentadora de un antígeno" o "moléculas del CMH que presentan un antígeno sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno" o expresiones similares, se refiere a una célula, tal como una célula enferma, en particular una célula tumoral, o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno o un péptido antigénico, directamente o tras el procesamiento, en el contexto de moléculas del CMH, preferentemente moléculas del CMH de clase I y/o del CMH de clase II, más preferentemente moléculas del CMH de clase I.
El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica la activación de una reacción inmunológica específica. En el contexto de la presente invención, términos tales como "protege", "evita", "profiláctico", "preventivo" o "protector", se refieren a la prevención o al tratamiento o ambos, de la incidencia y/o la propagación de un tumor o de un patógeno en un individuo. Una administración profiláctica de una composición de vacuna puede proteger al receptor frente al desarrollo del crecimiento tumoral o de una infección por un patógeno. Una administración terapéutica de una composición de vacuna o la inmunoterapia pueden proteger al individuo, por ejemplo, de la diseminación o la metástasis de tumores existentes.
El término "adyuvante" se refiere a compuestos que, administrados en combinación con un antígeno o péptido antigénico en un individuo, prolongan o incrementan o aceleran la respuesta inmunológica. En el contexto de la presente invención, el ARN puede administrarse con cualesquiera adyuvantes. Se supone que los adyuvantes
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ejercen su actividad biológica mediante uno o más mecanismos, entre ellos un incremento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retardo de la liberación del antígeno, la dirección del antígeno a macrófagos, el incremento de la incorporación del antígeno, el incremento del procesamiento del antígeno, la estimulación de la liberación de citoquinas, la estimulación y activación de las células inmunológicas, tales como células B, macrófagos, células dendríticas y células T, y la activación inespecífica de células inmunológicas. Los adyuvantes constituyen un grupo heterogéneo de compuestos, tales como emulsiones de aceites (por ejemplo adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tales como alum), productos bacterianos (tales como toxina de Bordetella pertussis), liposomas y complejos inmunoestimuladores. Son ejemplos de adyuvantes, monofosforil-lípido A (MPL SmithKline Beecham); saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham, documento nº WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178186, 1997), adyuvantes incompletos de Freund, adyuvantes completos de Freund, vitamina E, montánides, alum, oligonucleótidos CpG (Krieg et al., Nature 374:546-549, 1995) y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biológicamente degradables, tales como escualeno y/o tocoferol.
Algunos términos tales como "incrementar", "potenciar" o "prolongar" preferentemente se refieren a un incremento, potenciación o prolongación en aproximadamente por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 30%, más preferentemente por lo menos 40%, más preferentemente por lo menos 50%, todavía más preferentemente por lo menos 80%, y todavía más preferentemente por lo menos 100%. Estos términos también pueden referirse a circunstancias en las que en el tiempo cero no hay señal detectable de un compuesto o condición determinada y en un punto temporal particular posterior al tiempo cero no hay una señal detectable de un compuesto o condición determinado.
Las "células presentadoras de antígeno" (CPA) son células que presentan fragmentos de péptido de antígenos proteicos asociados a moléculas del CMH sobre su superficie celular. Algunas CPA pueden activar células T específicas de antígeno. Las CPA pueden dividirse en CPA profesionales y no profesionales. Por ejemplo, las CPA profesionales comprenden células dendríticas, macrófagos, monocitos, células B, microglías, etc. En el contexto de la presente invención, las CPA preferentemente son células presentadoras de antígeno profesionales. En el contexto de la presente invención, las CPA preferentemente son inmaduras. De esta manera, en el contexto de la presente invención, las CPA preferentemente se seleccionan de entre el grupo que consiste en células dendríticas inmaduras, macrófagos inmaduros, monocitos inmaduros, microglías inmaduras y células B inmaduras, y preferentemente son células dendríticas inmaduras. Algunos subgrupos de células dendríticas inmaduras (CDi) o de células dendríticas maduras (CDm) comprenden, por ejemplo, células dendríticas mieloides (CD-my), células dendríticas plasmacitoides (CDp), células dendríticas derivadas de monocitos (CD-mo) y células dendríticas derivadas de células progenitoras hematopoyéticas (CD-hp). En una forma de realización preferente, las CPA según la presente invención son de mamífero, preferentemente humanas, de ratón o de rata.
Las células dendríticas comprenden una población celular heterogénea que presenta una morfología específica y una distribución en los tejidos ampliamente extendida. Steinman (Annu. Rev. Immunol. 9:271-296, 1991) proporciona una revisión del sistema de células dendríticas y su función en el sistema inmunológico. Las células dendríticas muestran la capacidad de sensibilizar las células T restringidas al CMH y resultan muy eficaces en la presentación de antígenos a las células T. Las expresiones "células dendríticas" o "CD" se refieren a elementos de una población diversa de tipos celulares morfológicamente similares, los cuales se localizan en tejidos linfoides o no linfoides. Las células dendríticas se derivan, por ejemplo, de células progenitoras de médula ósea hematopoyética. Estas células progenitoras inicialmente se transforman en células dendríticas inmaduras. Pueden encontrarse células dendríticas inmaduras en la sangre periférica y en sangre de cordón y en el sistema linfático, tal como el timo y los nódulos linfáticos. Estas células se caracterizan por una elevada actividad endocítica y un bajo potencial de activación de las células T. Las células dendríticas inmaduras muestrean constantemente el ambiente circundante buscando patógenos tales como virus y bacterias. Lo anterior se lleva a cabo mediante mecanismos mediados por receptores y mecanismos independientes de receptores (por ejemplo la macropinocitosis). Los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), tales como los receptores de tipo Toll (RTT) reconocen rasgos químicos específicos observados en subgrupos de patógenos. Las células dendríticas inmaduras también pueden fagocitar cantidades reducidas de membrana de las propias células vivas, en un proceso denominado mordiscado (“nibling”). Tras entrar en contacto con un antígeno presentable, resultan activadas en células dendríticas maduras. Las células dendríticas inmaduras fagocitan patógenos y degradan sus proteínas en proteínas pequeñas y tras la maduración presentan estos fragmentos en su superficie celular utilizando moléculas del CMH. Simultáneamente, regulan positivamente los receptores de superficie celular que actúan como correceptores en la activación de las células T, tales como CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) y CD40, incrementando en gran medida la capacidad de activar las células T. También regulan positivamente CCR7, un receptor quimiotáctico que induce a que la célula dendrítica viaje por el flujo sanguíneo al bazo o por el sistema linfático hasta un nódulo linfático. En éste actúan como células presentadoras de antígeno: activan las células T auxiliares y las células T asesinas, así como las células B al presentarlas con antígenos derivados del patógeno, conjuntamente con señales coestimuladoras no específicas de antígeno. Las células dendríticas son las más potentes de todas las células presentadoras de antígeno y son capaces de activar células T tanto de memoria como no expuestas. Se ha demostrado que las células dendríticas maduras activadas proporcionan las señales necesarias para la activación y proliferación de las células T. Estas señales pueden clasificarse en dos tipos. El primer tipo, que proporciona especificidad a la respuesta inmunológica, se encuentra mediado por la interacción entre el complejo de receptor de célula T/CD3 ("RCT/CD3") y un péptido antigénico
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presentado por una proteína de complejo mayor de histocompatibilidad ("CMH") de clase I o II sobre la superficie de las CPA. El segundo tipo de señal, denominado señal coestimuladora, no es ni específico de antígeno ni se encuentra restringido al CMH, y puede conducir a una respuesta de proliferación completa de células T e inducción de funciones efectoras de células T en presencia del primer tipo de señales. Esta señalización doble puede resultar, por lo tanto, en una vigorosa respuesta inmunológica. Los diferentes linajes y grados de maduración de las células dendríticas pueden distinguirse por su morfología particular, capacidad fagocítica/endocítica y su grado de expresión en superficie del CMH de clase II y la capacidad de presentar antígenos a las células T, en particular células T no expuestas. Los marcadores típicos de las células dendríticas inmaduras son: CMH II detectable, CD86 detectable y, en particular, negativo para CD83.
Típicamente, para generar células dendríticas inmaduras, en primer lugar debe purificarse o enriquecerse en los precursores monocíticos respecto a otros tipos celulares contaminantes presentes en la sangre. Lo anterior se lleva a cabo comúnmente mediante adherencia de los precursores monocíticos a una superficie plástica (poliestireno), ya que los monocitos presentan una mayor tendencia a adherirse al plástico que otras células observadas en, por ejemplo, sangre periférica, tales como linfocitos y células asesinas naturales (NK). Tras eliminar sustancialmente las células contaminantes mediante lavado vigoroso, los monocitos son cultivados con citoquinas que convierten los precursores monocíticos en células dendríticas inmaduras. Los métodos para diferenciar las células precursoras monocíticas de las células dendríticas inmaduras fueron descritos por primera vez por Sallusto y Lanzavecchia (J. Exp. Med. 179:1190-1118, 1994), quienes utilizaron las citoquinas GM-CSF e IL-4 para inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras. Aunque esta combinación de citoquinas es la utilizada más típicamente, se han descrito diversas otras combinaciones para alcanzar los mismos objetivos, tales como sustituir IL-4 por IL-13 ó IL-15. El resultado final de este procedimiento es una célula "velada", que expresa moléculas coestimuladoras de células T, así como niveles detectables de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), pero no expresa el marcador de maduración de células dendríticas CD83. Estas células son similares a las células de Langerhans de la piel, y su función fisiológica principal es capturar microorganismos invasores. Entre las variaciones de este método se incluyen diferentes métodos de purificación de los monocitos, incluyendo, por ejemplo, la filtración en flujo tangencial (FFT), o mediante la unión de anticuerpos unidos a perlas a moléculas de superficies sobre los monocitos. Las perlas con las células unidas seguidamente se concentran en una columna o sobre una superficie magnética, de manera que puedan eliminarse mediante lavado las células contaminantes, después de lo cual los monocitos son eliminados de las perlas mediante elución. En todavía otro método para obtener precursores de células dendríticas, se purifican células que expresan el marcador de células madre CD34, a partir de sangre (patente US nº 5.994.126) o de médula ósea. Estas células pueden cultivarse con la citoquina esencial GM-CSF para diferenciarse en células dendríticas inmaduras.
Estas células dendríticas aparentemente presentan características y propiedades funcionales muy similares a las de las células dendríticas inmaduras generadas a partir de monocitos. Las células dendríticas inmaduras presentan una elevada capacidad de incorporar y procesar antígenos, pero presentan una capacidad limitada de iniciar respuestas inmunológicas. La capacidad de iniciar una respuesta inmunológica se adquiere mediante maduración de las células dendríticas inmaduras. Esta maduración también se denomina capacidad de activar, o activación, de las células dendríticas. Este proceso de maduración se inicia mediante el contacto con citoquinas inductoras de la maduración, productos bacterianos o componentes víricos, y similares.
Preferentemente, las células dendríticas inmaduras son células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos, que pueden generarse in vitro a partir de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC). Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse a partir de PBMC en presencia de citoquinas tales como el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleuquina (IL-4) en ausencia de un agente de maduración tal como lipopolisacárido o factor α de necrosis tumoral (TNF-α). En una forma de realización, la célula dendrítica inmadura es una célula dendríticas inmadura derivada de monocito obtenida u obtenible mediante el cultivo de monocitos sanguíneos periféricos en presencia de una o más citoquinas, tales como GM-CSF y/o IL-4 durante por lo menos aproximadamente 3 días o por lo menos aproximadamente 7 días. Por ejemplo, la siembra de PBMC en un matraz de cultivo de tejidos permite la adherencia de los monocitos. El tratamiento de estos monocitos con IL-4 y GM-CSF conduce la diferenciación en células dendríticas inmaduras en aproximadamente una semana. El tratamiento posterior con TNF-α diferencia adicionalmente las células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras. En el contexto de la presente invención, las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse en células madre hematopoyéticas (células CD34+) o pueden purificarse a partir de un individuo mediante leucaféresis.
Las células dendríticas maduras pueden identificarse a partir de su cambio de morfología, por su no adherencia y por la presencia de uno o más marcadores. Entre dichos marcadores se incluyen, aunque sin limitación, marcadores de superficie celular, tales como CD83, CD86, CD40, CD80 y CMH de clase II. Los marcadores típicos para las células dendríticas maduras (CDm) son: CD83 es detectable y los niveles de CMH II, así como de CD86, se encuentran incrementados en comparación con las células dendríticas inmaduras (CDi). Alternativamente, la maduración puede identificarse mediante la observación o la medición de la producción de citoquinas, tales como las citoquinas proinflamatorias. Pueden recolectarse células dendríticas maduras y analizarse utilizando técnicas y dispositivos típicos de citofluorografía y separación celular, tales como el separador celular activado por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos específicos para los antígenos de superficie celular de las células dendríticas maduras se encuentran disponibles comercialmente.
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La expresión "péptido de unión al CMH" se refiere a un péptido que se une a un CMH de clase I y/o a una molécula del CMH de clase II. En el caso de los complejos de CMH de clase I/péptido, los péptidos de unión típicamente presentan una longitud de 8 a 10 aminoácidos, aunque pueden resultar eficaces péptidos más largos o más cortos. En el caso de complejos de CMH de clase II/péptido, los péptidos de unión típicamente presentan una longitud de 10 a 25 aminoácidos y en particular presentan una longitud de 13 a 18 aminoácidos, mientras que los péptidos más largos o más cortos pueden resultar eficaces. La expresión "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "CMH" incluyen las moléculas del CMH de clase I y del CMH de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del CMH son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígeno en las reacciones inmunológicas normales, en las que las proteínas o moléculas del CMH se unen a péptidos y los presentan para el reconocimiento por parte de receptores de células T.
La expresión "células efectoras inmunológicas" en el contexto de la presente invención se refiere a células que ejercen funciones efectoras durante una reacción inmunológica. Las "células efectoras inmunológicas" preferentemente son capaces de unirse a un antígeno o a una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o mediar en una respuesta inmunológica. Por ejemplo, dichas células secretan citoquinas y/o quimoquinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas y opcionalmente eliminan dichas células. Por ejemplo, las células efectoras inmunológicas comprenden células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes tumorales), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, las "células efectoras inmunológicas" son células T, preferentemente células CD4+ y/o CD8+.
Preferentemente, una "célula efectora inmunológica" reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno con cierto grado de especificidad, en particular en caso de presentarse en el contexto de moléculas del CMH, tal como sobre la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas, tales como células tumorales. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno sea sensible. En el caso de que la célula sea una célula T ayudante (célula CD4+) portadora de receptores que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno en el contexto de moléculas del CMH de clase II, dicha sensibilidad puede implicar la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (LTC) y/o células B. En el caso de que una célula sea una LTC, dicha sensibilidad puede implicar la eliminación de las células presentadas en el contexto de las moléculas del CMH de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con CMH de clase I, por ejemplo mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina. Dichas LTC que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno y que son sensibles también se denominan "LTC sensibles a antígeno" en la presente memoria. En el caso de que la célula sea una célula B, dicha sensibilidad puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.
El término "semivida" se refiere al periodo de tiempo que resulta necesario para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la semivida de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN.
Los términos "paciente", "individuo" o "animal" se refieren a mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc.; animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, etc., así como animales en cautividad, tales como animales de parques zoológicos. El término "animal" tal como se utiliza en la presente memoria también incluye seres humanos.
Según la invención, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una inflamación o lesión formada por un crecimiento anormal de células (denominadas células neoplásicas o células tumorales). La expresión "célula tumoral" se refiere a una célula anormal que crece mediante una proliferación celular incontrolada y rápida y que continúa creciendo tras cesar los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y habitualmente forman una masa diferenciada de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna.
Preferentemente, una enfermedad tumoral según la invención es una enfermedad cancerosa, es decir, una enfermedad maligna, y una célula tumoral es una célula de cáncer. Preferentemente, una enfermedad tumoral se caracteriza por células en las que un antígeno, es decir, un antígeno tumoral, se expresa o se expresa anormalmente. Preferentemente, una enfermedad tumoral o una célula tumoral se caracteriza por la presentación de un antígeno tumoral con CMH de clase I.
"Expresión anormal" se refiere según la invención a que la expresión está alterada, preferentemente incrementada, en comparación con el estado en un individuo sano. Un incremento de la expresión se refiere a un incremento de por lo menos 10%, en particular de por lo menos 20%, por lo menos 50% o por lo menos 100%. En una forma de realización, sólo se observa expresión en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se encuentra reprimida.
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Preferentemente, una enfermedad tumoral según la invención es cáncer, en el que el término "cáncer" según la invención comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer endometrial, cáncer renal, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer sanguíneo, cáncer de piel, cáncer del cerebro, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer hepático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer intestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de nódulo linfático, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer ovárico y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos. Son ejemplos de los mismos, los carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales o metástasis de los tipos o tumores de cáncer indicados anteriormente. El término "cáncer" según la invención comprende además las metástasis de cáncer.
Las composiciones según la presente invención generalmente se aplican en "cantidades farmacéuticamente aceptables" y en "preparaciones farmacéuticamente aceptables". Dichas composiciones pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, portadores y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Las "sales farmacéuticamente aceptables" comprenden, por ejemplo, sales de adición de ácidos que pueden formarse, por ejemplo, mediante la mezcla de una solución de compuestos con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Además, en el caso de que el compuesto porte una fracción ácida, entre las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas del mismo se incluyen las sales de metal alcalino (por ejemplo las sales de sodio o potasio), las sales de metal alcalino-térreo (por ejemplo las sales de calcio o magnesio) y las sales formadas con ligandos orgánicos adecuados (por ejemplo los cationes de amonio, amonio cuaternario y amina formados utilizando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo y sulfonato de arilo). Entre los ejemplos ilustrativos de sales farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, butirato, edetato de calcio, canforato, canforsulfonato, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, clavulanato, ciclopentanopropionato, digluconato, dihidrocloruro, dodecilsulfato, edetato, edisilato, estolato, esilato, etanosulfonato, formato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glutamato, glicerofosfato, glicolilarsanilato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hexilresorcinato, hidrabamina, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, hidroxinaftoato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, 2-naftalenosulfonato, napsilato, nicotinato, nitrato, sal amónica de Nmetilglucamina, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato/difosfato, picrato, pivalato, poligalacturonato, propionato, salicilato, estearato, sulfato, subacetato, succinato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietiyoduro, undecanoato, valerato y similares (ver, por ejemplo, S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19, 1977).
El término "excipiente" utilizado en la presente memoria pretende indicar todas las sustancias en una formulación farmacéutica que no son ingredientes activos, tales como, por ejemplo, portadores, ligantes, lubricantes, espesantes, agentes activos en superficie, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.
Las composiciones según la presente invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" en el contexto de la presente invención se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles que resultan adecuados para la administración en un ser humano. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo con el fin de facilitar la aplicación del componente activo. Preferentemente, los componentes portadores son líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, tales como aceite de cacahuete, aceite de haba de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerina también pueden utilizarse como compuestos portadores acuosos.
Según la presente invención, las composiciones se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que, sola o en combinación con dosis adicionales, resulta en una reacción deseada o en un efecto deseado. En el caso de la terapia de una enfermedad particular o una condición particular, la reacción deseada se refiere a la inhibición del progreso de la enfermedad. Lo anterior comprende la deceleración del progreso del a enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, La reacción deseada para una terapia de una enfermedad o de una condición también puede ser el retardo de la aparición o la inhibición de la aparición de la enfermedad o de la condición. Una cantidad eficaz de la composición según la presente invención depende de la condición o de la enfermedad, de la gravedad de la enfermedad, de los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, la condición fisiológica, la altura y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia opcionalmente acompañante, la vía de administración específica, y factores similares. En el caso de que la reacción de un paciente resulte insuficiente con una dosis inicial, pueden aplicarse dosis más altas (o dosis eficaces más altas que pueden conseguirse mediante una vía de administración más localizada). En general, para el tratamiento o para la inducción o el incremento de una reacción inmunológica en un ser humano preferentemente se formulan y se administran dosis del ARN comprendidas en el
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intervalo de entre 1 ng y 700 µg, de entre 1 ng y 500 µg, de entre 1 ng y 300 µg, de entre 1 ng y 200 µg o de entre 1 ng y 100 µg.
En el contexto de la presente invención, el término "transcripción se refiere a un proceso en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. A continuación, el ARN puede traducirse en proteína. Según la presente invención, el término "transcripción" comprende la "transcripción in vitro", en la que la expresión "transcripción in vitro" se refiere a un procedimiento en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema sin células, preferentemente utilizando los extractos celulares apropiados. Preferentemente se aplican vectores de clonación para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación generalmente han sido designados como vectores de transcripción y según la presente invención se encuentran comprendidos en el término "vector". Según la presente invención, el ARN utilizado en la presente invención puede obtenerse mediante transcripción in vitro de un ADN molde apropiado. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Son ejemplos particulares de ARN polimerasas las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferentemente, la transcripción in vitro según la invención está controlada por un promotor T7 ó SP6. Un ADN molde para la transcripción in vitro puede obtenerse mediante clonación de un ácido nucleico, en particular ADNc, y la introducción del mismo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.
El término "expresión" se utiliza en la presente memoria en su sentido más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o puede ser estable.
El término "traducción en el contexto de la presente invención se refiere a un proceso en el ribosoma en el que una cadena de ARNm controla el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para generar una proteína o un péptido.
Según la invención, el ARN debe transferirse al interior de células presentadoras de antígeno inmaduras in vitro o in vivo, por ejemplo mediante la administración de ARN en el sistema linfático, preferentemente en los nódulos linfáticos. A este respecto, se utilizan intercambiablemente en la presente memoria términos tales como "transferir" o "transfectar" y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARN, al interior de una célula. Según la presente invención, cualquier técnica que resulte adecuada para transferir ARN al interior de las células puede ser utilizada para introducir ARN en las células. Preferentemente, el ARN se transfecta en las células mediante técnicas estándares. Dichas técnicas comprenden la transfección de precipitados de fosfato de calcio de ácidos nucleicos, la transfección de ácidos nucleicos que se encuentran asociados a DEAE, la transfección o infección con virus que portan los ácidos nucleicos de interés, la electroporación, la lipofección y la microinyección. Según la presente invención, la administración de un ácido nucleico se lleva a cabo en forma de ácido nucleico desnudo o en combinación con un reactivo de administración. Preferentemente la administración de ácidos nucleicos se lleva a cabo en forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferentemente el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizadoras, tales como inhibidores de ARNasa. En una forma de realización particularmente preferente, el ARN y/o las composiciones de la presente invención se administran en forma de ARN desnudo, preferentemente mediante inyección intranodal. Según la presente invención, una técnica de transfección convencional no resulta absolutamente necesaria para introducir el ARN desnudo en las células, preferentemente células presentadoras de antígeno, preferentemente células presentadoras de antígeno inmaduras, tales como células dendríticas inmaduras, ya que en particular las células presentadoras de antígeno inmaduras tales como las células dendríticas inmaduras son capaces de incorporar ARN desnudo mediante macropinocitosis. Preferentemente, la introducción de ARN que codifica un antígeno o péptido antigénico en una célula resulta en la expresión de dicho antígeno o péptido antigénico en la célula. En formas de realización particulares, resulta preferente la administración dirigida de los ácidos nucleicos a células particulares. En dichas formas de realización, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico en una célula (por ejemplo un retrovirus o un liposoma), muestra una molécula de direccionamiento. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específica para una proteína membranal de superficie sobre la célula diana o un ligando para un receptor sobre la célula diana puede incorporarse en el portador de ácidos nucleicos o puede unirse a la misma. En el caso de que el ácido nucleico se administre mediante liposomas, pueden incorporarse en la formulación de liposomas proteínas que se unen a una proteína membranal de superficie que se asocia a endocitosis, con el fin de permitir la administración dirigida y/o la incorporación. Dichas proteínas comprenden proteínas de cápside o fragmentos de las mismas que son específicos para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas que se internalizan, proteínas con diana en una localización intracelular, etc.
Según la presente invención, el término "péptido" comprende oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente tres o más, preferentemente cuatro o más, preferentemente seis o más, preferentemente ocho o más, preferentemente diez o más, preferentemente 14 ó más, preferentemente 16 ó más, preferentemente 21 ó más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 ó 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente a péptidos con más de 100 residuos aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteína" son sinónimos y se utilizan intercambiablemente en la presente memoria.
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La expresión "porción de moléculas de CMH que presentan un antígeno de interés" se refiere a la fracción de molécula de CMH sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno que se encuentran cargadas con, es decir, se encuentran unidas a, un antígeno particular o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno, respecto a la cantidad total de moléculas de CMH sobre la superficie de la célula. En una forma de realización preferente, el ARN utilizado en la presente invención es capaz de incrementar la proporción de moléculas de CMH que presentan un antígeno de interés sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno en la que se ha transferido el ARN. Lo anterior se compara con un ARN que no porta la caperuza 5' que presenta una estructura según la fórmula (I), en particular un ARN que porta una caperuza de ARN convencional.
El término "alquilo" se refiere a una cadena de carbonos lineal o ramificada saturada. Preferentemente, la cadena comprende entre 1 y 10 átomos de carbono, es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 átomos de carbono, preferentemente entre 1 y 4 átomos de carbono, por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, tercbutilo, n-pentilo, isopentilo, sec-pentilo, neopentilo, 1,2-dimetilpropilo, isoamilo, n-hexilo, isohexilo, sec-hexilo, nheptilo, isoheptilo, n-octilo, 2-etilhexilo, n-nonilo y n-decilo. Los grupos alquilo se encuentran sustituidos opcionalmente.
El término "cicloalquilo" por sí mismo o en combinación con otros términos, representa, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas de "alquilo" con preferentemente 3 a 10 átomos de carbono, es decir, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 átomos de carbono, preferentemente 3 a 6 átomos de carbono, formando un anillo, preferentemente ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo o ciclodecilo. El término "cicloalquilo" también pretende incluir versiones bicíclicas de los mismos. En el caso de que se formen anillos bicíclicos, resulta preferente que los anillos respectivos se conecten entre sí en dos átomos de carbono contiguos; sin embargo, alternativamente los dos anillos se conectan mediante el mismo átomo de carbono, es decir, forman un sistema espiro de anillos o forman sistemas de anillos "puenteados".
Entre los ejemplos preferidos de cicloalquilo se incluyen cicloalquilo C3-C8, en particular ciclopropilo, ciclobutilo, cicloepntilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, spiro[3,3]heptilo, spiro[3,4]octilo, spiro[4,3]octilo, biciclo[4.1.0]heptilo, bicilco[3.2.0]heptilo, biciclo[2.2.1]heptilo, biciclo[2.2.2]octilo, biciclo[5.1.0]octilo y biciclo[4.2.0]octilo.
El término "alquenilo" en el contexto de la presente invención se refiere a una cadena de carbonos lineal o ramificada insaturada olefínica con uno o más dobles enlaces. Preferentemente la cadena comprende 2 a 10 átomos de carbono, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono, preferentemente 2 a 4 átomos de carbono. Por ejemplo, un alquenilo puede ser vinilo, alilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-heptenilo, 2heptenilo, 3-heptenilo, 4-heptenilo, 5-heptenilo, 6-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 4-octenilo, 5-octenilo, 6-octenilo, 7-octenilo, 1-nonenilo, 2-nonenilo, 3-nonenilo, 4-nonenilo, 5-nonenilo, 6-nonenilo, 7-nonenilo, 8-nonenilo, 1-decenilo, 2-decenilo, 3-decenilo, 4-decenilo, 5-decenilo, 6-decenilo, 7-decenilo, 8-decenilo ó 9-decenilo.
El término "alquenilo" en el contexto de la presente invención incluye además "cicloalquenilo", que se refiere a un grupo insaturado olefínico que contiene uno o más anillos con uno o más dobles enlaces. Preferentemente el anillo cicloalquenilo comprende entre 3 y 10 átomos de carbono, es decir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, por ejemplo ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclooctilo, spiro[3,3]heptenilo, spiro[3,4]octenilo, spiro[4,3]octenilo, biciclo[4.1.0]heptenilo, biciclo[3.2.0]heptenilo, biciclo[2.2.1]heptenilo, biciclo[2.2.2]octenilo, biciclo[5.1.0]octenilo o biciclo[4.2.0]octenilo.
El término "alquinilo" en el contexto de la presente invención se refiere a una cadena de carbonos lineal o ramificada insaturada con uno o más triples enlaces. Preferentemente la cadena comprende entre 2 y 10 átomos de carbono, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 átomos de carbono, preferentemente 2 a 4 átomos de carbono. Son ejemplos de alquinilo, etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4pentinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 5-hexinilo, 1-heptinilo, 2-heptinilo, 3-heptinilo, 4-heptinilo, 5heptinilo, 6-heptinilo, 1-octinilo, 2-octinilo, 3-octinilo, 4-octinilo, 5-octinilo, 6-octinilo, 7-octinilo, 1-noninilo, 2-noninilo, 3-noninilo, 4-noninilo, 5-noninilo, 6-noninilo, 7-noninilo, 8-noninilo, 1-decinilo, 2-decinilo, 3-decinilo, 4-decinilo, 5decinilo, 6-decinilo, 7-decinilo, 8-decinilo ó 9-decinilo.
El término "heterociclilo" se refiere a un grupo cicloalquilo tal como se ha definido anteriormente en el que 1 a 3 átomos de carbono en el anillo son sustituidos por los heteroátomos O, S o N.
El término "arilo" preferentemente se refiere a una estructura de anillo aromático que contiene 5 a 14 átomos de carbono, por ejemplo fenilo, indenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 1-antrilo, 2-antrilo, 9-antrilo, 1-fenantrilo, 2-fenantrilo, 3fenantrilo, 4-fenantrilo y 9-fenantrilo. Preferentemente, "arilo" se refiere a un anillo monocíclico que contiene 6 átomos de carbono o un sistema de anillos bicíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Son ejemplos preferentes fenilo o naftilo. El grupo arilo se encuentra sustituido opcionalmente.
El término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo tal como se ha definido anteriormente en el que 1 a 3 átomos de carbono en el anillo han sido sustituidos por heteroátomos O, S o N. Preferentemente el término se refiere a un anillo monocíclico aromático de cinco o seis elementos en el que 1 a 3 átomos de carbono han sido sustituidos por los
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mismos o diferentes heteroátomos O, N o S. Alternativamente, se refiere a un sistema de anillos bicíclico aromático en el que 1 a 3 átomos de carbono han sido sustituidos por los mismos o diferentes heteroátomos O, N o S. Son ejemplos preferentes, furanilo, tienilo, oxazolilo, isoxazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,2,3-oxazidazolilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, 1,2,3-triazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,2,4-triaziinilo, 1,3,5-triazinilo, 1-benzofuranilo, 2-benzofuranilo, indolilo, isoindolilo, benzotienilo, 2-benzotienilo, 1H-indazolilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, indoxazinilo, 2,1-bencisoxazolilo, benzotiazolilo, 1,2-bencisotiazolilo, 2,1-bencisotiazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, 2,3-benzodiazinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, 1,2,3-benzotriazinilo ó 1,2,4-benzotriazinilo.
El término "halo" en el contexto de la presente invención se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, preferentemente flúor.
El término "alcoxi" se refiere al grupo -OR, en el que R es alquilo, arilo o cicloalquilo y puede incluir metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, pentoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi o deciloxi.
La expresión "sustituido opcionalmente" indica que uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen con un grupo diferente del hidrógeno, tal como halógeno, alquilo, cicloalquilo, haloalquilo, amino, alquilamino, hidroxi, alcoxi, haloalcoxi, arilo y heteroarilo y similares. Los sustituyentes opcionalmente pueden sustituirse ellos mismos con sustituyentes tales como halógeno, en particular flúor.
El término "hidroxi" se refiere al grupo -OH.
El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo o cicloalquilo sustituido con uno o más halógenos (por ejemplo trifluorometilo).
El término "haloalcoxi" se refiere al grupo -OR, en el que R es alquilo, arilo o cicloalquilo sustituido con uno o más hal´goenos.
El término amino se refiere al grupo -NH2.
El término "alquilamino" se refiere al grupo -NR'R, en el que R es hidrógeno, alquilo, arilo o cicloalquilo y en el que R' es alquilo, arilo o cicloalquilo.
El término "acilamino" se refiere al grupo -NRC(O)R, en el que cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo.
El término "carbonilo" se refiere al grupo C=O, en el que el carbono puede ser parte de una cadena de alquilo o sistema de anillos.
La expresión "la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA" se refiere a que un átomo de fósforo que comprende el sustituyente R5 y que presenta un centro quiral y por lo tanto capaz de existir en cualquiera de dos configuraciones estereoquímicas posibles, se encuentra presente en predominantemente una configuración estereoquímica deseada, es decir, la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA. Puede ocurrir para el átomo Pβ del diatereómero D1 de beta-S-ARCA que se encuentre en la configuración (R) o en la configuración (S). Preferentemente más de 50 por ciento del grupo de interés presenta la configuración estereoquímica deseada, preferentemente por lo menos 75 por ciento del grupo de interés presenta la configuración estereoquímica deseada, más preferentemente por lo menos 90 por ciento del grupo de interés presenta la configuración estereoquímica deseada, todavía más preferentemente por lo menos 95 por ciento del grupo de interés presenta la configuración estereoquímica deseada, y todavía más preferentemente por lo menos 99 por ciento del grupo de interés presenta la configuración estereoquímica deseada.
El "diastereómero D1 de beta-S-ARCA" o "beta-S-ARCA(D1)" es el diastereómero de beta-S-ARCA que eluye en primer lugar en una columna de HPLC en comparación con el diastereómero D2 de beta-S-ARCA (beta-S-ARCA(D2)) y de esta manera muestra un tiempo de retención más corto. La HPLC preferentemente es una HPLC analítica. En una forma de realización, para la separación se utiliza una columna Supelcosil LC-18-T RP, preferentemente de formato 5 µm, 4,6x250 mm, en la que puede aplicarse un caudal de 1,3 ml/min. En una forma de realización, se utiliza un gradiente de metanol en acetato amónico, por ejemplo un gradiente lineal de 0% a 25% de metanol en acetato amónico 0,05 M, pH 5,9, en 15 min. Se lleva a cabo la detección de UV (VWD) a 260 nm y la detección de la fluorescencia (FLD) puede llevarse a cabo con excitación a 280 nm y detección a 337 nm.
Los presentes inventores inesperadamente han encontrado que el ARN que se modifica para contener una estructura de caperuza 5' específica, en particular una estructura de caperuza 5' fosforotioato, que muestra una configuración estereoquímica particular en el átomo de P que, al ser parte de un grupo fosforotioato y no un grupo fosfodiéster, reduce la susceptibilidad a la degradación por Dcp2, es decir, el átomo Pβ en caso de que n en la fórmula (I) sea 1, el átomo Pγ en el caso de que n en la fórmula (I) sea 2, o el átomo Pδ en el caso de que n en la
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fórmula (I) sea 3, la configuración estereoquímica particular en el átomo de P correspondiente a la configuración estereoquímica en el átomo Pβ del análogo de caperuza 5' beta-S-ARCA(D1), presenta una estabilidad incrementada y, de esta manera, también muestra una expresión incrementada, en particular en células presentadoras de antígeno inmaduras, en particular en células dendríticas inmaduras.
5 La presente invención se refiere a la modificación del ARN, preferentemente del ARNm, para incrementar la estabilidad de dicho ARN, preferentemente en células inmunológicas, más preferentemente en células inmunológicas inmaduras, todavía más preferentemente en células presentadoras de antígeno inmaduras, y todavía más preferentemente en células dendríticas inmaduras. El ARN modificado que se ha descrito en la presente
10 invención resulta particularmente útil para la vacunación con ARN.
La expresión "ARN que se modifica con una estructura de caperuza 5'" se refiere a ARN al que se ha unido una estructura de caperuza 5' de manera que resulte en un ARN modificado en el que una guanosina de la estructura de caperuza se convierte en parte del ARN y una guanosina modificada de la estructura de caperuza se une al ARN
15 mediante un enlace trifosfato 5' a 5' o un enlace trifosfato modificado. De esta manera, dicho ARN modificado puede
(7,2'-O)GppspGRNA
presentar, por ejemplo, la fórmula m2
El ARN modificado con una estructura de caperuza 5' utilizada en la presente invención presenta la estructura siguiente:
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 25 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en R2 R3
CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, preferentemente y 30 conjuntamente forman 2',3'-isopropilideno, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se une R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3, preferentemente R5 es S,
35 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, más preferentemente R4 y R6 son O,
n es 1, 2 ó 3, preferentemente n es 1 ó 2, más preferentemente n es 1,
40 en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
La caperuza 5' del ARN modificado que se utiliza en la presente invención presenta la estructura siguiente mostrada 45 en la fórmula (I):
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en R2 R3
CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, preferentemente y conjuntamente forman 2',3'-isopropilideno, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se une R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,
R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3, preferentemente R5 es S,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, más preferentemente R4 y R6 son O,
n es 1, 2 ó 3, preferentemente n es 1 ó 2, más preferentemente n es 1,
en el que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
La expresión "R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3" se refiere a que el sustituyente R6 en cada aparición se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3 y, de esta manera, puede ser igual o diferente. Por ejemplo, en el caso d que n sea 2, la estructura mostrada en la fórmula (I) comprende dos sustituyentes R6 y cada uno de estos dos sustituyentes R6 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3 de manera que el primer sustituyente R6 y el segundo sustituyente R6 en la misma fórmula pueden ser iguales o pueden ser diferentes.
Preferentemente, la caperuza 5' del ARN modificado utilizado en la presente invención al transferirse el ARN modificado al interior de células presentadoras de antígeno inmaduras es capaz de incrementar la estabilidad del ARN, incrementar la eficiencia de traducción del ARN, prolongar la traducción del ARN, incrementar la expresión de proteínas totales del ARN, y/o incrementar la respuesta inmunológica contra un antígeno codificado por dicho ARN en comparación con el mismo ARN sin la estructura de caperuza 5'. Resulta particularmente preferente que las células presentadoras de antígeno inmaduras sean células dendríticas inmaduras. El experto en la materia podrá determinar fácilmente si la caperuza 5' del ARN modificado es capaz de ejercer las funciones anteriormente indicadas, por ejemplo generando dos ARN, por ejemplo mediante transcripción in vitro, que sólo difieran en la caperuza 5', en las que uno de los ARN porte una caperuza 5' según la fórmula (I) y el otro ARN (ARN de referencia)
(i) no comprenda una caperuza 5', (ii) porte una caperuza 5' de ARNm convencional, es decir, una caperuza de metil-7-guanosina, o (iii) porte cualquier otra caperuza con la que la función de la caperuza 5' según la fórmula (I) deba compararse. Por ejemplo, el ARN de referencia puede portar una caperuza 5' que corresponde al diastereómero D2 de beta-S-ARCA. Resulta particularmente preferente que la estructura de caperuza 5' del ARN modificado utilizado en la presente invención tras la transferencia del ARN modificado al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras sea capaz de incrementar la estabilidad del ARN, incrementar la eficiencia de traducción del ARN, prolongar la traducción del ARN, incrementar la expresión de proteínas totales del ARN y/o incrementar la respuesta inmunológica contra un antígeno codificado por dicho ARN en comparación con el mismo ARN con una caperuza 5' de ARNm convencional y/o en comparación con el mismo ARN con la misma estructura de caperuza 5' pero diferente en la configuración estereoquímica en el átomo de P que porta el sustituyente R5, es decir, que corresponda a la del átomo Pβ del diastereómero D2 de beta-S-ARCA, preferentemente en comparación con el mismo ARN que presenta una caperuza 5' que corresponde al diastereómero D2 de beta-S-ARCA.
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Preferentemente, R1 se selecciona de manera que la caperuza 5' utilizada en la presente invención no inhiba la traducción del ARN portador de dicha caperuza 5'. En particular, R1 se selecciona de manera que el ARN, en particular la caperuza 5' sea reconocida por la maquinaria de inicio de traducción, preferentemente in vivo e in vitro, preferentemente la caperuza 5' es reconocida por la maquinaria eucariótica de inicio de traducción. Por ejemplo, el experto en la materia puede determinar si un ARN o una caperuza 5' de ARN es reconocido por la maquinaria eucariótica de inicio de traducción determinando la afinidad del factor eucariótico de inicio de traducción eIF4E para dicho ARN o dicha caperuza 5' del ARN.
Preferentemente, R1 se selecciona de entre el grupo de alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo metilo, etilo, propilo o butilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente y naftilmetilo sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo etenilo, propenilo o butenilo, y arilo sustituido opcionalmente. Preferentemente, R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 y arilo sustituido opcionalmente. Todavía más preferentemente, R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en metilo, etilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente y naftilmetilo sustituido opcionalmente. Preferentemente R1 es metilo.
Preferentemente, la configuración de R2 y R3 es tal que la caperuza 5' sólo puede incorporarse en una cadena de ARN en una orientación. Pasquinelli et al. (RNA J. 1:957-967, 1995) han demostrado que durante la transcripción in vitro las ARN polimerasas de bacteriófago utilizan la unidad 7-metilguanosina para el inicio de la transcripción, en la que aproximadamente 40% a 50% de los transcritos con caperuza presentan el dinucleótido de caperuza en orientación inversa (es decir, el producto de reacción inicial es Gpppm7GpN). En comparación con los ARN con una caperuza correcta, los ARN con una caperuza invertida no son funcionales con respecto a la traducción de las proteínas codificadas. De esta manera, resulta deseable incorporar la caperuza en la orientación correcta, es decir, que resulta en un ARN con una estructura esencialmente correspondiente a m7GpppGpN, etc. Se ha demostrado que la integración inversa del dinucleótido de caperuza resulta inhibida por la sustitución del grupo 2'-OH ó 3'-OH de la unidad guanosina metilada (Stepinski et al., RNA J. 7:1486-1495, 2001; Peng et al., Org. Lett. 24:161-164, 2002). Los ARN que se sintetizan en presencia de dichos "análogos de caperuza antiinversos", es decir los ARCA, se traducen más eficientemente que los ARN que han sido transcritos in vitro en presencia de la caperuza 5' convencional m7GpppG. Además, Kore et al. (J. Am. Chem. Soc., 22 de abril de 2009 [publ. elec. anterior a la impresión]) han encontrado que los análogos de caperuza de dinucleótido de ARNm modificados con ácido nucleico bloqueado (ANB) tampoco se incorporan en la orientación inversa en una cadena de ARN (Kore et al., J. Am. Chem. Soc. 131:6364-6365, 2009).
De esta manera, en una forma de realización particularmente preferente, R1 se selecciona de manera que la maquinaria eucariótica de inicio de traducción es capaz de reconocer el ARN modificado utilizado en la presente invención y se seleccionan R2 y/o R3 de manera que la caperuza no puede incorporarse en orientación inversa en una cadena de ARN.
Preferentemente, R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, OH, metoxi, etoxi y propoxi. Preferentemente, uno de entre R2 y R3 es OH, y el otro no es OH. Más preferentemente, por lo menos uno de entre R2 y R3 no es OH. Resulta particularmente preferente que, en el caso de que la estructura de anillo que comprende los sustituyentes R2 y R3 presente la configuración estereoquímica de la ribosa, por lo menos uno de entre R2 y R3 no es OH. Preferentemente el residuo que no es OH se selecciona de entre el grupo que consiste en H, halo y alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente; preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en H, F, metoxi, etoxi y propoxi, más preferentemente es metoxi. En una forma de realización preferente, en particular en el caso de que la estructura de anillo que comprende los sustituyentes R2 y R3 presente la configuración estereoquímica de la ribosa, R2 es OH y R3 es metoxi o R2 es metoxi y R3 es OH.
En una forma de realización, en el caso de que la configuración estereoquímica de la estructura de anillo que comprende los sustituyentes R2 y R3 no corresponda a la configuración estereoquímica de la ribosa, por ejemplo, corresponde a la configuración estereoquímica de la arabinosa, la xilosa o la lixosa, en particular en el caso de que la configuración estereoquímica de dicha estructura de anillo corresponda a la de la arabinosa, R2 y R3 puede ser ambos OH. Sin embargo, en la presente forma de realización también resulta posible que R2 y R3 se seleccionen tal como se ha especificado anteriormente.
En una forma de realización preferente particular, R5 es S. Preferentemente R4 y R6 se seleccionan de entre el grupo que consiste en O y S, y preferentemente son O. Preferentemente n es 1 ó 2, más preferentemente n es 1.
Posteriormente se describen formas de realización preferentes de la estructura de caperuza 5' según la fórmula (I). Debe entenderse que todas las estructuras, fórmulas y compuestos indicados posteriormente se encuentran comprendidos en la expresión "estructura de caperuza 5' según la fórmula (I)".
En una forma de realización todavía más preferente, la caperuza 5' utilizada en la presente invención corresponde al diastereómero D1 de beta-S-ARCA que presenta la estructura siguiente según la fórmula (II):
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En el presente contexto, "correspondiente a" se refiere a que la caperuza 5' es idéntica al diastereómero D1 de beta-S-ARCA o es esencialmente idéntico al diastereómero D1 de beta-S-ARCA, es decir que en una forma de
5 realización preferente pueden existir sólo diferencias menores entre la caperuza 5' del ARN utilizado en la presente invención y el diastereómero D1 de beta-S-ARCA. Por ejemplo, el sustituyente en la posición 2' de la unidad 7metilguanosina puede ser H o etoxi y/o el sustituyente en el átomo N7 de la unidad 7-metilguanosina puede ser etilo y/o el sustituyente en la posición 2' de la unidad 7-metilguanosina puede ser OH y el sustituyente en la posición 3' de la 7-metilguanosina puede ser diferente de OH, por ejemplo puede ser H o metoxi, preferentemente metoxi.
10 A continuación se dan a conocer formas de realización particularmente preferentes del ARN utilizado en la presente invención:
15 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente o naftilmetilo sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo etenilo, propenilo o butenilo, y arilo sustituido opcionalmente,
20 R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, OH, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R2 es OH, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 formando -O-CH2o -CH2-O-,
25 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O,
en el que la configuración estereoquímica del átomo Pβ corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de 30 beta-S-ARCA.
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en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente o naftilmetilo 5 sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo etenilo, propenilo o butenilo, y arilo sustituido opcionalmente,
R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, OH, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R3 es OH,
10 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O,
en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 15 de beta-S-ARCA.
en la que R3 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, OH, halo y alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente, 20 preferentemente R3 se selecciona de entre H, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R3 es H o metoxi,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O, S, Se y BH3, 25
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O y S, y más
preferentemente R4 y R6 son O,
en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 30 de beta-S-ARCA.
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en la que R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, halo y alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente, preferentemente R2 se selecciona de entre H, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R2 es H o metoxi, o R2 se 5 combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 formando -O-CH2-o CH2-O-,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
10 preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O,
en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
15 en la que R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, halo y alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente, preferentemente R2 se selecciona de entre H, OH, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R2 es OH, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 formando -O-CH2-o CH2-O-,
20 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O,
25 en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
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en la que R3 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, OH, halo y alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente, preferentemente R3 se selecciona de entre H, OH, F, metoxi, etoxi y propoxi, preferentemente R3 es OH, R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,
preferentemente R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O, en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente o naftilmetilo sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo etenilo, propenilo o butenilo, y arilo
15 sustituido opcionalmente,
R2 y R3 se seleccionan de entre el grupo que consiste en H, F, OH, metoxi, etoxi y propoxi, o R2 y R3 conjuntamente forman O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, preferentemente R2 y R3 conjuntamente forman 2',3'-isopropilideno, o R2 se
20 combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 formando -O-CH2-o CH2-O-, en el que preferentemente R2 y R3 se seleccionan de manera que la caperuza 5' no puede incorporarse en un ARN en la orientación inversa,
en el que la configuración estereoquímica del átomo de Pβ corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 25 de beta-S-ARCA.
en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo
30 metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo sustituido opcionalmente, feniletilo sustituido opcionalmente o naftilmetilo sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente, por ejemplo etenilo, propenilo o butenilo, y arilo sustituido opcionalmente,
R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, preferentemente R4 y 35 R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O y S, y más preferentemente R4 y R6 son O,
n es 1, 2 ó 3, preferentemente n es 1 ó 2, más preferentemente n es 1, y
40 en el que la configuración estereoquímica del átomo de P que porta S como sustituyente corresponde a la del átomo de Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
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Preferentemente, la estabilidad y la eficiencia de traducción del ARN utilizado en la presente invención puede modificarse adicionalmente según se requiera. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse e incrementarse la traducción del mismo mediante una o más modificaciones que presenten un efecto estabilizador y/o de incremento de la eficiencia de traducción. Dichas modificaciones se describen en, por ejemplo, el documento nº WO 2007/036366.
Por ejemplo, el ARN que presenta una secuencia poli-A no enmascarada (cola poli-A no enmascarada) se traduce más eficientemente que el ARN que presenta una secuencia de poli-A enmascarada. La expresión "secuencia poli-A" se refiere a una secuencia de residuos adenilo (A) que típicamente se encuentra situada en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia poli-A no enmascarada" se refiere a que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN finaliza con una A de la secuencia poli-A y no le siguen nucleótidos diferentes de A situados en el extremo 3', es decir, cadena abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia poli-A larga de aproximadamente 120 nucleótidos resulta en una estabilidad del transcrito y una eficiencia de traducción óptimas.
De esta manera, el ARN, preferentemente el ARNm, utilizado en la presente invención preferentemente puede comprender además una cola poli-A con una longitud de entre 10 y 500, preferentemente con una longitud de entre 30 y 300, más preferentemente con una longitud de entre 65 y 200, más preferentemente con una longitud de entre 100 y 150 nucleótidos, por ejemplo de 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 nucleótidos, preferentemente 120 nucleótidos. Preferentemente, dicha secuencia de poliA es una secuencia de poliA no enmascarada. De esta manera, preferentemente, el ARN utilizado en la presente invención tal como se ha especificado anteriormente comprende una cola poli-A no enmascarada con una longitud de entre 10 y 500, preferentemente con una longitud de entre 30 y 300, más preferentemente con una longitud de entre 65 y 200, más preferentemente con una longitud de entre 100 y 150 nucleótidos, por ejemplo de 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 nucleótidos, preferentemente de 120 nucleótidos.
Además, la incorporación de una región 3' no traducida (UTR) en la región 3' no traducida de una molécula de ARN puede resultar en un incremento de la eficiencia de traducción. Puede conseguirse un efecto sinérgico mediante la incorporación de dos o más de dichas UTR 3'. Las UTR 3' pueden ser autólogas o heterólogas respecto al ARN en el que se introducen, por ejemplo puede ser la UTR 3' del ARNm de la beta-globina. De esta manera, preferentemente, el ARN, preferentemente el ARNm utilizado en la presente invención puede comprender además una o más copias, preferentemente dos copias de la región 3' no traducida (UTR 3') del gen de la beta-globina, preferentemente del gen de la beta-globina humana.
Resulta particularmente preferente que el ARN utilizado en la presente invención se modifique mediante una combinación de las modificaciones anteriormente descritas, es decir, la incorporación de una secuencia poliA, el desenmascaramiento de una secuencia poliA y la incorporación de una o más UTR 3'.
En una forma de realización particularmente preferente, el ARN utilizado en la presente invención codifica un péptido
- o proteína que comprende un inmunógeno, antígeno o péptido antigénico. En una forma de realización, el péptido o proteína se procesa tras la expresión, proporcionando dicho inmunógeno, antígeno o péptido antigénico. En otra forma de realización, el péptido o proteína mismo es el inmunógeno, antígeno o péptido antigénico.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un ARN que presenta una estructura tal como se ha descrito anteriormente. En una forma de realización preferente, dicha composición de vacuna comprende además uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Dicha composición de vacuna puede comprender además compuestos o sustancias que son capaces de incrementar y/o proporcionar soporte a una reacción inmunológica en un individuo. Por ejemplo, la composición de vacuna de la presente invención puede comprender además un adyuvante tal como se ha indicado anteriormente o citoquinas, por ejemplo la interleuquina 12 (IL-12), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) o interleuquina 18 (IL-18). Además, la composición de vacuna según la presente invención puede comprender además sustancias estabilizadoras del ARN, tales como inhibidores de ARNasa, sales o tampones farmacéuticamente aceptables, conservantes tales como cloruro de benzalconio, clorbutanol, parabeno o timerosal, agentes humectantes, agentes emulsionantes y/o fármacos o agentes activos adicionales. En una forma de realización particularmente preferente, el ARN se encuentra presente en la composición de vacuna según la presente invención en la forma de ARN desnudo. Resulta particularmente preferente que la composición de vacuna de la presente invención se formule para la administración parenteral, por ejemplo para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intralinfática o intranodal, más preferentemente para la administración intranodal. La composición de vacuna de la invención se formula más preferentemente para la inyección en los nódulos linfáticos, preferentemente nódulos linfáticos inguinales, para la inyección en vasos linfáticos y/o en el bazo. Preferentemente, la composición de vacuna se encuentra en forma de una solución acuosa
- o no acuosa que es isotónica con la sangre del receptor, es decir, el individuo que debe vacunarse. Por ejemplo, puede utilizarse solución de Ringer, solución isotónica de cloruro sódico o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En particular, la composición de vacuna preferentemente es estéril y comprende el ARN anteriormente especificado en una cantidad terapéuticamente eficaz.
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En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula presentadora de antígeno inmadura que comprende un ARN tal como se ha indicado anteriormente. En una forma de realización preferente, la célula presentadora de antígeno inmadura se selecciona de entre el grupo que consiste en macrófagos inmaduros, monocitos inmaduros, células B inmaduras y células dendríticas inmaduras, preferentemente la célula presentadora de antígeno inmadura es una célula dendrítica inmadura. En una forma de realización particularmente preferente, la célula presentadora de antígeno inmadura según la presente invención se formula en una composición farmacéutica, dicha composición farmacéutica preferentemente resultando adecuada para inducir una respuesta inmunológica al administrarla en un individuo, en la que la respuesta inmunológica preferentemente se dirige contra la proteína o péptido codificado por el ARN o un antígeno y/o inmunógeno comprendido por la proteína o péptido codificado por el ARN presente en la célula presentadora de antígeno inmadura de la presente invención. De esta manera, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célulal presentadora de antígeno inmadura según el segundo aspecto de la presente invención.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, que comprende la etapa de administrar en dicho individuo la composición de vacuna de la presente invención o la célula presentadora de antígeno inmadura de la presente invención. Preferentemente, dicha respuesta inmunológica está dirigida específicamente contra la proteína o péptido codificado por el ARN comprendido en la composición de vacuna o la célula presentadora de antígeno inmadura de la presente invención o está dirigido específicamente contra un antígeno comprendido en dicha proteína o péptido. Dicha respuesta inmunológica puede ser terapéutica y/o protectora. Resulta particularmente preferente que dicha composición de vacuna y dichas células presentadoras de antígeno inmaduras, preferentemente células dendríticas inmaduras, se administren parenteralmente tal como se ha especificado anteriormente para el primer aspecto de la presente invención, preferentemente mediante inyección intranodal, preferentemente mediante inyección en nódulos linfáticos inguinales.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la estabilidad de un ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras y/o para incrementar la expresión de un ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras, comprendiendo dicho método proporcionar dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I) tal como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, dichas células presentadoras de antígeno inmaduras se seleccionan de entre el grupo que consiste en monocitos inmaduros, macrófagos inmaduros, células gliales inmaduras, células B inmaduras y células dendríticas inmaduras, preferentemente las células presentadoras de antígeno inmaduras son células dendríticas inmaduras. Con el fin de evaluar la estabilidad de un ARN en una célula presentadora de antígeno inmadura, el experto en la materia puede detectar la presencia del ARN estudiado o cuantificar la cantidad de ARN dentro de una célula presentadora de antígeno inmadura después de determinados puntos temporales posteriores a la introducción de dicho ARN, por ejemplo mediante la utilización de RT-PCR en tiempo real, tal como se indica en el Ejemplo 4, posteriormente en la presente memoria. La expresión de un ARN en las células presentadoras de antígeno inmaduras puede determinarse utilizando un ARN codificante de una proteína marcadora, tal como luciferasa o proteína fluorescente verde, preferentemente d2EGFP, aunque puede ser cualquier otra proteína marcadora conocida por el experto en la materia, y determinar la expresión de dicha proteína marcadora en determinados puntos temporales posteriores al a introducción del ARN tal como se indica en el Ejemplo 3, posteriormente en la presente memoria.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la porción de moléculas de CMH que presentan un antígeno de interés sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, comprendiendo dicho método proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende dicho antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I) tal como se ha indicado anteriormente y transferir dicho ARN al interior de una célula presentadora de antígeno inmadura. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, se considera que la modificación de un ARN con una estructura de caperuza según la fórmula (I) incrementa la estabilidad de dicho ARN, en particular dentro de células presentadoras de antígeno inmaduras, por ejemplo células dendríticas inmaduras. Esta estabilidad incrementada conduce a una expresión incrementada de dicho ARN y de esta manera a una acumulación de la proteína o péptido codificado por dicho ARN. Dicha proteína o péptido puede comprender un antígeno o péptido antigénico. De esta manera, tras el procesamiento de dichos antígenos proteicos
o péptidos antigénicos, pueden cargarse sobre moléculas de CMH sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno. Alternativamente, dicha proteína o péptido puede ser ella misma un antígeno o péptido antigénico y puede cargarse sobre moléculas de CMH sin procesamiento. Se parte de la premisa de que un ARN codificante de una proteína o péptido particular que comprende un antígeno o péptido antigénico que ha sido modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I) incrementa la porción/fracción de moléculas de CMH sobre la superficie celular de una célula presentadora de antígeno que presenta un péptido derivado de la proteína o péptido codificado por dicho ARN en comparación con el mismo ARN con una caperuza 5' convencional, preferentemente en comparación con el mismo ARN con una caperuza 5' ARCA, y más preferentemente en comparación con el mismo ARN con la misma estructura de caperuza 5', excepto en que la configuración estereoquímica del átomo de P que presenta el sustituyente R5 corresponde a la del átomo de Pβ de beta-S-ARCA(D2). Debido a que la densidad de moléculas de CMH que presenta un antígeno particular sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno resulta decisiva para la intensidad de la respuesta inmunológica inducida específica para dicho antígeno particular, se considera que incrementar la estabilidad de un ARN codificante de antígeno que ha sido introducido en las
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células presentadoras de antígeno conduce a una respuesta inmunológica incrementada contra dicho antígeno particular.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para estimular y/o activar las células efectoras inmunológicas, comprendiendo dicho método proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I), transferir dicho ARN al interior de células presentadoras de antígeno inmaduras, y poner en contacto las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas. Preferentemente, dichas células efectoras inmunológicas son activadas y/o estimuladas de manera específica de antígeno. Preferentemente, mediante dicho método se incrementa la cantidad de células efectoras específicas de antígeno, preferentemente células T. Preferentemente, las células presentadoras de antígeno inmaduras son células dendríticas inmaduras. En una forma de realización preferente, las células efectoras inmunológicas son células T, preferentemente células CD4+ y/o CD8+. En una forma de realización, la etapa de transferencia de dicho ARN al interior de células presentadoras de antígeno inmaduras se lleva a cabo in vitro mediante cualquier método de transferencia de ácidos nucleicos, por ejemplo un método de transfección, conocido por el experto en la materia, tal como la lipofección, la electroporación o la microinyección tal como se ha indicado anteriormente. En otra forma de realización, la etapa de transferir dicho ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras se lleva a cabo in vivo, por ejemplo mediante la administración del ARN en un individuo, preferentemente mediante administración parenteral, preferentemente mediante administración intralinfática, preferentemente mediante inyección en uno o más nódulos linfáticos, es decir, mediante inyección intranodal, mediante inyección en vasos linfáticos, o mediante inyección en el bazo. Preferentemente, dicha administración se lleva a cabo mediante inyección intranodal del ARN que preferentemente es incorporado por las células dendríticas inmaduras en el nódulo o nódulos linfáticos. El ARN administrado preferentemente se encuentra en forma de ARN desnudo. En una forma de realización, la etapa de puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas se lleva a cabo in vitro, por ejemplo en una placa de cultivo de tejidos. En otra forma de realización, la etapa de puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas se lleva a cabo in vivo. En dicha forma de realización, la etapa de transferencia del ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras puede llevarse a cabo in vitro o in vivo tal como se ha indicado anteriormente. Para la puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno en las que se ha transferido el ARN in vitro con las células efectoras inmunológicas in vivo, las células presentadoras de antígeno se administran en el individuo, preferentemente mediante administración parenteral, por ejemplo mediante inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranodal, intralinfática o intraperitoneal, preferentemente mediante inyección en el sistema linfático, tal como mediante inyección en el vaso o vasos linfáticos, el bazo y/o el nódulo o nódulos linfáticos, preferentemente el nódulo o nódulos linfáticos inguinales. En una forma de realización del sexto aspecto de la presente invención, el método puede comprender además la etapa de diferenciar las células presentadoras de antígeno inmaduras en células presentadoras de antígeno maduras tras la transferencia del ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras y antes de la puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunológicas. La etapa de diferenciación puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Por ejemplo, el ARN puede transferirse al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras, preferentemente en células dendríticas inmaduras, las células presentadoras de antígeno inmaduras se diferencian in vitro y las células presentadoras de antígeno maduras diferenciadas, preferentemente las células dendríticas maduras, se ponen en contacto con células efectoras inmunológicas in vitro o in vivo tal como se ha indicado anteriormente, preferentemente in vivo. Las células presentadoras de antígeno inmaduras en las que se transfiere el ARN in vitro pueden aislarse a partir de un individuo, por ejemplo un paciente que debe inmunizarse, o pueden diferenciarse a partir de células madre hematopoyéticas.
Una estimulación y/o activación de las células efectoras inmunológicas, en particular de células T, típicamente se asocia a la expansión, reactividad citotóxica y/o secreción de citoquinas de las células efectoras inmunológicas. De esta manera, el experto en la materia puede determinar si las células efectoras inmunológicas son estimuladas y/o activadas mediante simples ensayos in vitro, típicamente realizados utilizando células T. Dichas células T pueden ser proporcionadas por líneas de células T transformadas, tales como hibridomas de células T o células T que han sido asiladas de un mamífero, tal como un roedor, por ejemplo un ratón o una rata. Los hibridomas de células T adecuados se encuentran disponibles comercialmente o pueden generarse mediante métodos conocidos. Las células T pueden aislarse a partir de un mamífero mediante métodos conocidos (ver Shimonkevitz et al., J. Exp. Med. 158:303-316, 1983). Un diseño experimental adecuado para someter a ensayo la activación y/o la estimulación de las células T se describe, posteriormente, en las etapas (1) a (4). Las células T expresan un marcador adecuado que puede someterse a ensayo y que indica la activación de las células T o la modulación de la actividad de las células T. El hibridoma de células T murinas DO11.10 puede utilizarse con este fin, ya que dicho hibridoma expresa interleuquina-2 (IL-2) tras la activación. Las concentraciones de IL-2 pueden determinarse para verificar la activación/estimulación de las células T o para determinar si una composición es capaz de modular la actividad de dicho hibridoma de células T. Este ensayo se lleva a cabo siguiendo las etapas siguientes: (1) proporcionar células T a partir de un hibridoma de células T o mediante aislamiento a partir de un mamífero, (2) cultivo de las células T bajo condiciones que permiten la proliferación, (3) las células T proliferantes se ponen en contacto con una célula presentadora de antígeno que ha sido puesta en contacto con un antígeno o un ácido nucleico codificante del mismo, y (4) someter a ensayo las células T para un marcador, por ejemplo se determina la producción de IL-2. Las
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células que se utilizan para el ensayo se cultivan bajo condiciones que permiten la proliferación. Por ejemplo, el hibridoma de células T DO11.10 se cultiva adecuadamente a 37ºC y con 5% de CO2 en medio completo (RPMI 1640, suplementado con FBS al 10%, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 2-mercaptoetanol 5x10-5 M). Las señales de activación de las células T son proporcionadas por células presentadoras de antígeno que han sido cargadas con un péptido antigénico apropiado.
Alternativamente, la modulación de la actividad de las células T puede verificarse determinando alteraciones o la proliferación de las células T específicas de antígeno, las cuales pueden medirse, por ejemplo, mediante métodos de marcaje radioactivo conocidos. Por ejemplo, puede añadirse un nucleótido marcado a un medio de cultivo de ensayo. La incorporación de dichos nucleótidos marcados en el ADN puede servir como indicador de la proliferación de las células T. Este ensayo no es aplicable a las células T que no requieren la presentación de antígeno para su proliferación, tales como los hibridomas de células T. Este ensayo resulta útil para determinar la modulación de la actividad de las células T en el caso de las células T no transformadas que han sido aisladas a partir de un mamífero.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, comprendiendo dicho método proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, modificando dicho ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I) y administrando dicho ARN en dicho individuo. El antígeno de interés puede ser cualquier antígeno y preferentemente es tal como se ha definido anteriormente. En una forma de realización preferente, dicho ARN se administra en forma de ARN desnudo, preferentemente mediante administración parenteral, por ejemplo mediante inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranodal, intralinfática o intraperitoneal, preferentemente, mediante inyección en el sistema linfático, tal como mediante inyección en uno o más vasos linfáticos, el bazo y/o nódulo o nódulos linfáticos, preferentemente uno o más nódulos linfáticos inguinales. Preferentemente el ADN administrado se incorporado por células dendríticas inmaduras del individuo. Preferentemente la respuesta inmunológica es protectora y/o terapéutica, por ejemplo resulta útil para tratar y/o prevenir enfermedades tales como enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, comprendiendo dicho método proporcionar un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I), transferir dicho ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras, y administrar las células presentadoras de antígeno en dicho individuo. En el presente aspecto de la presente invención, el ARN se transfiere al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras in vitro mediante cualquier método de transferencia de ácidos nucleicos, por ejemplo mediante transfección, tal como lipofección, electroporación o microinyección, conocido por el experto en la materia tal como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, las células presentadoras de antígeno inmaduras son células dendríticas inmaduras. Las células presentadoras de antígeno inmaduras en las que se transfiere el ARN in vitro pueden aislarse a partir de un individuo, por ejemplo un paciente que debe inmunizarse, o pueden diferenciarse a partir de células madre hematopoyéticas, en las que las células madre hematopoyéticas pueden aislarse a partir del individuo. Las células presentadoras de antígeno inmaduras o las células madre hematopoyéticas pueden aislarse a partir del individuo mediante leucaféresis. Preferentemente, las células presentadoras de antígeno inmaduras se aíslan a partir del individuo que debe inmunizarse, el ARN se transfiere al interior de dichas células aisladas, y las células se transfieren nuevamente a dicho individuo, preferentemente mediante administración parenteral, por ejemplo mediante inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranodal, intralinfática o intraperitoneal, preferentemente mediante inyección en el sistema linfático, tal como mediante inyección en el vaso o vasos linfáticos, el bazo y/o uno o más nódulos linfáticos, preferentemente uno o más nódulos linfáticos inguinales.
La capacidad de inducir una reacción inmunológica, incluyendo la idoneidad para la vacunación contra una enfermedad diana, puede ser fácilmente determinadas mediante ensayos in vivo. Por ejemplo, una composición, por ejemplo una composición de vacuna o una composición farmacéutica, puede administrarse en un mamífero, tal como un animal de laboratorio, por ejemplo un ratón, rata, conejo, etc., y pueden extraerse muestras de sangre de dicho animal antes de la administración de la composición y en puntos temporales definidos posteriores a la administración de la composición, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 semanas después de la administración. Puede generarse suero a partir de las muestras de sangre y puede determinarse el desarrollo de anticuerpos generados tras la administración/inmunización. Por ejemplo, puede determinarse la concentración de anticuerpos. Además, pueden aislarse células T a partir de la sangre y/o el sistema linfático del mamífero, que puede someterse a ensayo para su reactividad contra el antígeno utilizado para la inmunización. Puede utilizarse cualquier sistema de lectura conocido por el experto en la materia, por ejemplo ensayo de proliferación, ensayos de secreción de citoquinas, ensayos para someter a ensayo la actividad citotóxica, o el análisis de tetrámeros, etc. Además, también puede determinarse el incremento de la reactividad inmunológica mediante la determinación el número de células T específicas de antígeno, su potencial citotóxico o su patrón de secreción de citoquinas, tal como se ha indicado anteriormente.
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Además, la presente invención proporciona el ARN descrito en la presente memoria, la composición de vacuna según el primer aspecto de la presente invención, las células presentadoras de antígeno inmaduras y la composición farmacéutica que comprende dichas células según el segundo aspecto de la presente invención para la utilización en una aplicación médica, preferentemente para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, por ejemplo
5 para la vacunación de un individuo, por ejemplo para la prevención de una enfermedad cancerosa o una enfermedad infecciosa en dicho individuo o para el tratamiento de un individuo que sufre de una enfermedad cancerosa o infecciosa.
Los métodos de la presente invención, en particular los métodos para activar y/o estimular las células efectoras
10 inmunológicas e inducir una respuesta inmunológica en un individuo, así como la composición de vacuna, las células presentadoras de antígeno inmaduras, y el ARN para la utilización en dichos métodos permiten un incremento cuantitativo de la frecuencia de linfocitos T específicos de antígeno tras la inmunización basada en ARN. Este incremento de la eficiencia puede explotarse para la inmunoterapia de los pacientes con respecto a una mejor eficiencia clínica o la reducción de la dosis de vacuna. Además, la presente invención proporciona la oportunidad
15 para amplificar ampliamente las células T específicas de antígeno a partir de células T precursoras apenas presentes. Además, el incremento de eficiencia aplicable a la presente invención se ve acompañado por una reducción de costes.
La presente invención se describe en detalle mediante figuras y ejemplos, posteriormente, que se utilizan
20 únicamente con fines ilustrativos y que no pretenden ser limitativos. Gracias a la descripción y los ejemplos, hay formas de realización adicionales que de manera similar se encuentran incluidas en la invención y que son accesibles al experto en la materia.
Ejemplos
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Ejemplo 1: generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos
Matraces de cultivo celular (150 cm2, Falcon nº 355001), medio DC (RPMI 1640 con glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales y suero AB humano
30 inactivado por calor al 10%, todos de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 1.000 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humano (GM-CSF, Essex, Luzern, Suiza) y 1.000 U/ml de IL-4 (interleuquina 4 humana, Strathmann Biotech, Hamburgo, Alemania), DPBS/EDTA (DPBS de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania con 2 ml de EDTA; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania), 15 ml y probetas de 50 ml, pipetas desechables, puntas de pipeta, tubos de FACS, centrífuga refrigerada (4ºC), hielo.
35 Procedimiento:
Día 0:
40 Se seleccionaron células positivas para CD14 utilizando anticuerpos anti-CD14 acoplados a perlas (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante y se reservaron para un análisis posterior de FACS muestras del eluido, lavado y fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (ver el Ejemplo 2). Se realizó un recuento de las células tras la elución y se llevó a cabo la centrifugación (15 min, 340 fcr) a 4ºC. Las células se resuspendieron en medio DC a una densidad de aproximadamente 1x106 células/ml (max. de 5x107 células en cada
45 matraz). Se añadieron al medio 1.000 U/ml de IL-4 y 1.000 U/ml de GM-CSF (tal como se ha descrito anteriormente).
Día +2 (opcionalmente +3):
Se extrajo un tercio del medio y se centrifugó a 4ºC (15 minutos, 340 fcr). Se añadió el mismo volumen de medio que 50 contenía 2.000 U/ml de IL-4 y 2.000 U/ml de GM-CSF.
Día +5 (opcionalmente +4):
Se extrajo un tercio del medio y se centrifugó a 4ºC (15 min, 340 fcr). Se añadió el mismo volumen de medio que 55 contenía 2.000 U/ml de IL-4 y 2.000 U/ml de GM-CSF.
Día +7:
Se extrajeron las células del fondo del matraz de cultivo de tejidos mediante pipeteado repetido. Se extrajo el medio
60 entero y el matraz se enjuagó con aproximadamente 30 ml de PBS/EDTA frío. Las células se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en 10 ml de medio DC frío. Las células se depositaron sobre hielo y se contaron. Se reservó una muestras de las células para el análisis posterior de FACS. Se ajustó la densidad de las células a 1,0x107/40 ml de medio DC y se añadieron 40 ml de medio DC a cada matraz. Se añadieron las citoquinas siguientes al medio:
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500 U/ml de IL-4 800 U/ml de GM-CSF 10 ng/ml de IL-1b 10 ng/ml de TNF-a
1.000 U/ml de IL-6 1 µg/ml de PGE2
Día +9 (opcionalmente +10):
Se extrajeron las células del matraz de cultivo de tejidos mediante enjuague suave. Se realizó un recuento de las células y se reservó una muestra para el análisis posterior de FACS (ver el Ejemplo 2). Se centrifugaron las células y se ajustó el número celular según necesidad.
Ejemplo 2: tinción de FACS:
Se extrajeron aproximadamente 2x105 células para cada tinción en un tubo de FACS. Se ajustó el volumen a 100 µl con tampón de FACS (DPBS, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, con EDTA 5 mM, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania y FCS al 5%, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Se añadieron 5 µl de α-CDx-FITC y opcionalmente 5 µl de α-CDy-PE a los tubos de FACS. Los tubos se incubaron durante 30 a 40 minutos a 4ºC en la oscuridad antes de añadir 4 ml de tampón de FACS y las muestras se centrifugaron. El sobrenadante se separó del pellet mediante aspiración y las células se resuspendieron en 400 µl de tampón de FACS y se almacenó a 4ºC.
Las PBMC se tiñeron utilizando α-CD14-FITC (BD Biosciences) y α-CD3-PE (BD Biosciences). En una tinción separada se tiñeron PBMC utilizando α-CD19-PE (BD Biosciences). La tinción se llevó a cabo los días 7 y 9. Se almacenaron las muestras celulares sobre hielo hasta la realización de las tinciones.
Ejemplo 3: ARN con un análogo específico de caperuza de fosforotioato en el extremo 5' resulta en una expresión incrementada y prolongada de proteínas en células dendríticas inmaduras
Los ARN codificantes de luciferasa han sido transcritos in vitro utilizando moldes de vector optimizados (documento nº WO 2007/036366; Holtkamp et al., Blood 108:4009-4017, 2006). Se cuantificaron espectrofotométricamente ADN de vector linearizado y se sometieron a transcripción in vitro esencialmente tal como describen Pokrovskaya y Gurevich (Pokrovskaya y Gurevich, Anal. Biochem. 220:420-423, 1994). Se añadió uno de los dinucleótidos de caperuza m 7GpppG (Darzynkiewicz et al., Nucleic Acids Res. 16:8953-8962, 1988), m7Gppppm7G, m2(7,3'-O)GpppG (denominado en lo sucesivo, ARCA) (Stepinski et al., Nucleosides Nucleotides 14:717-721, 1995; Stepinski et al.,
(7,2'-
RNA 7:1486-1495, 2001), m2(7,2'-O)GppSpG(D1) (en la presente invención denominado beta-S-ARCA(D1)) o m2O)GppSpG(D2) (en la presente invención denominado beta-S-ARCA(D2)) (Kowalska et al., RNA 14:1119-1131, 2008) a la reacción de transcripción con el fin de obtener ARN con las estructuras de caperuza 5' correspondientemente modificadas (ver también la fig. 1). En las reacciones con análogo de caperuza, GTP se encontraba presente a una concentración de 1,5 mM, mientras que el análogo de caperuza se encontraba presente a una concentración de 6,0 mM. Se encontraba presente GTP a una concentración de 7,5 mM en las reacciones sin análogo de caperuza. Al final de la reacción de transcripción, se digirió ADN de vector linearizado con 0,1 U/µl de ADNasa TURBO (Ambion, Austin/TX, USA) durante 15 minutos a 37ºC. Se purificaron los ARN a partir de dichas reacciones utilizando el kit MEGAclear (Ambion, Austin/TX, USA) siguiendo el protocolo del fabricante. Si se desea, el ARN transcrito en ausencia de un análogo de caperuza se proporciona posteriormente con una caperuza m7GpppG utilizando el enzima de adición de caperuza del virus Vaccinia (Epicentre, Madison/WI, USA) para la adición post-transcripcional de caperuza (m7GpppG(p.-t.)) siguiendo las instrucciones del fabricante, y el ARN se purificó una vez más utilizando el kit MEGAclear (Ambion, Austin/TX, USA) siguiendo el protocolo del fabricante. Los ARN preparados tal como se ha indicado anteriormente se introdujeron en células dendríticas inmaduras y maduras humanas utilizando la electroporación (con 300 V y 150 µF utilizando un aparato Gene Pulser II, Bio-Rad, München, Alemania) y la expresión de la proteína informadora luciferasa se determinó durante un curso temporal de 72 horas. Con este fin, se determinó la cantidad de proteína luciferasa tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas mediante medición de la actividad de luciferasa (que es proporcional a la cantidad de proteína, fig. 2). Mediante el análisis de expresión de la proteína codificada resulta posible determinar la eficiencia de traducción de un ARN (correspondiente a la pendiente máxima de la curva) y la estabilidad funcional del ARN (dada por el punto temporal del máximo de la curva). Además, la integral de la curva corresponde a la intensidad de la expresión entera de proteínas a lo largo del intervalo temporal observado.
La expresión más alta de proteínas totales en células dendríticas inmaduras se observó para el ARN que había sido transcrita en presencia de beta-S-ARCA(D1) (fig. 2A, panel izquierdo). Este resultado era inesperado ya que tanto en células HC11 como en sistemas de traducción in vitro el ARN con beta-S-ARCA(D2) en el extremo 5' resultó en la expresión total más fuerte (ver Antecedentes de la invención). El ARN con beta-S-ARCA(D2) en el extremo 5' resultó sólo en la segunda expresión total más alta en células dendríticas inmaduras, seguida por ARN con ARA en el extremo 5' y el ARN modificado post-transcripcionalmente.
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De acuerdo con el hecho de que m7GpppG puede incorporarse en orientación inversa durante la transcripción in vitro (de esta manera, aproximadamente la mitad del ARN que contiene una caperuza 5' es funcional para la traducción), la expresión del ARN que se había transcrito utilizando m7GpppG era claramente inferior que para los demás ARN. Mediante el efecto combinado sobre las eficiencias de traducción y la estabilidad funcional del ARN, beta-S-ARCA(D1) resulta en una expresión de proteínas totales que se encuentra incrementada en más de 13 veces en comparación con el ARN que ha sido sintetizado en presencia de m7GpppG. En comparación con el ARN con ARCA en el extremo 5' o la expresión de ARN modificado post-transcripcionalmente, la expresión a partir de ARN que presenta beta-S-ARCA(D1) se encuentra incrementada en un factor de aproximadamente 3. La expresión de proteínas totales a partir de ARNC con beta-S-ARCA(D1) se encuentra incrementada en aproximadamente 2 veces en comparación con la expresión de proteínas totales a partir de ARN con beta-S-ARCA(D2) (Tabla 1).
En comparación con el ARN con m7GpppG, las eficiencias de traducción de ARN con ARCA se encontraba incrementada aproximadamente en 2,5 veces, con beta-S-ARCA(D1) aproximadamente en 3,4 veces, con beta-S-ARCA(D2) en aproximadamente 3,5 veces y con un ARN modificado postranscripcionalmente, en aproximadamente 4,1 veces (Tabla 1).
Aparte del efecto sobre la eficiencia de traducción, las diversas estructuras de caperuza también influyen sobre la estabilidad funcional del ARN en las células dendríticas inmaduras. La expresión de proteínas a partir de ARN que ha sido transcrito en presencia de m7GpppG alcanzaba un máximo aproximadamente 8 horas después de la electroporación (Tabla 1). En contraste, el máximo de expresión de ARN con ARCA o con beta-S-ARCA(D2) se alcanzó tras 12 horas y beta-S-ARCA(D1) incrementó la estabilidad funcional de ARN todavía más, con un máximo tras más de 15 horas.
Tabla 1: impacto de la estructura de la caperuza de ARN 5' sobre la eficiencia de la traducción (proporcionada por la pendiente máxima de las curvas en la fig. 2A). El punto temporal de expresión máxima de proteínas y la expresión de proteínas totales durante el curso temporal del experimento. Para cada tipo celular (células dendríticas inmaduras y maduras [CDi y CDm, respectivamente]), la eficiencia de traducción y la señal total para células que habían sido electroporadas con ARN que había sido transcrito en presencia de m7GpppG se fijó en 1. Se proporcionan medias ± desviaciones estándar.
- Estructura de caperuza 5'
- células Eficiencia de traducción Tiempo de max. (horas) Expresión relativa de proteínas totales
- sin caperuza
- CDi 0,00 ± 0,00 n.a. 0,011 ± 0,000
- ApppG
- CDi 0,01 ± 0,00 n.a. 0,022 ± 0,001
- GpppG
- CDi 0,18 ± 0,01 11,5 ± 0,0 0,221 ± 0,001
- m 7GpppG
- CDi 1,00 ± 0,04 8,1 ± 1,1 1,000 ± 0,007
- m 7Gppppm7G
- CDi 0,20 ± 0,10 4,9 ± 0,1 0,404 ± 0,004
- ARCA
- CDi 2,52 ± 0,19 12,6 ± 0,1 4,777 ± 0,042
- beta-S-ARCA(D1)
- CDi 3,36 ± 0,09 15,4 ± 0,1 13,094 ± 0,307
- beta-S-ARCA(D2)
- CDi 3,53 ± 0,17 12,8 ± 0,0 6,570 ± 0,075
- m 7GpppG(p.-t.)
- CDi 4,12 ± 0,53 8,4 ± 1,4 4,289 ± 0,056
- sin caperuza
- CDm 0,00 ± 0,00 n.a. 0,002 ± 0,000
- ApppG
- CDm 0,01 ± 0,00 n.a. 0,008 ± 0,000
- GpppG
- CDm 0,31 ± 0,02 27,5 ± 0,5 0,593 ± 0,005
- m 7GpppG
- CDm 1,00 ± 0,05 16,0 ± 0,3 1,000 ± 0,003
- m 7Gppppm7G
- CDm 0,56 ± 0,04 6,0 ± 0,3 0,176 ± 0,001
- ARCA
- CDm 2,16 ± 0,00 17,5 ± 0,3 2,526 ± 0,015
- beta-S-ARCA(D1)
- CDm 3,05 ± 0,14 20,1 ± 0,1 3,884 ± 0,032
- beta-S-ARCA(D2)
- CDm 3,30 ± 0,03 19,4 ± 0,1 4,042 ± 0,053
- m 7GpppG(p.-t.)
- CDm 3,16 ± 0,08 17,5 ± 0,3 3,421 ± 0,010
Resulta interesante la observación de los presentes inventores de que en células dendríticas inmaduras, el ARN con la caperuza m7Gppppm7G que previamente había resultado en un incremento de la expresión en el sistema de traducción in vitro (Grudzien et al., RNA J. 10:1479-1487, 2004), resultó en una expresión en células dendríticas inmaduras que era incluso inferior a la de ARN que había sido transcrito en presencia de m7GpppG. Los ARN que se aplicaron como controles sin caperuza o con una caperuza no reconocida por la maquinaria de traducción (ApppG y GpppG) no resultaron en ningún nivel significativo de expresión.
En las células dendríticas maduras, el efecto de las diversas estructuras de ARN 5' era diferente al producido en las células dendríticas inmaduras. En primer lugar, es notable que la estabilidad funcional del ARN era generalmente superior que en células dendríticas inmaduras y sólo era marginalmente dependiente del tipo de extremo 5' del ARN. En segundo lugar, el orden con respecto a la expresión de proteínas totales difería de aquel en las células dendríticas inmaduras: ARN con beta-S-ARCA(D2) resultó en la expresión de proteínas más alta en células dendríticas maduras, seguido del ARN con beta-S-ARCA(D1), ARN modificado post-traduccionalmente y después
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ARN con ARCA en el extremo 5'. Además, la diferencia en los niveles de expresión en células dendríticas maduras no era tan pronunciado como en células dendríticas inmaduras. Lo anterior concuerda con la menor influencia de las estructuras de caperuza sobre la estabilidad funcional del ARN en las células dendríticas maduras. El ARN con m7Gppppm7G también se traducía pobremente en las células dendríticas maduras. Estos datos apoyan la suposición de que dicha caperuza sólo puede inducir a un nivel muy reducido la maquinaria de traducción in vivo, en contraste con los datos in vitro. Los ARN de control sin caperuza o con ApppG y GpppG, respectivamente, no resultaron en expresión de proteínas, tal como se esperaba.
Con el fin de confirmar que el efecto observado de las estructuras de caperuza de ARN es independiente de las proteínas codificadas por ARN, los presentes inventores repitieron los experimentos con ARN codificante de una proteína fluorescente verde (denominada d2eGFP) utilizando los mismos vectores optimizados tal como se ha indicado anteriormente para la transcripción in vitro. La cantidad de d2eGFP en diferentes puntos temporales tras la introducción de los ARN en células dendríticas inmaduras y maduras se determinó utilizando citometría de flujo y los resultados obtenidos fueron muy similares a los obtenidos con ARN codificantes de luciferasa (ver las figuras 2A y B). El ARN con beta-S-ARCA(D1) también resultó en la expresión de proteínas totales más alta en células dendríticas inmaduras (figura 2B, panel izquierdo). Tal como se observó con los ARN codificantes de luciferasa, dicho efecto era específico para las células dendríticas inmaduras. Lo anterior confirma la superioridad de beta-S-ARCA(D1) frente a la totalidad de los demás análogos de caperuza y frente a la modificación post-transcripcional con respecto a la expresión de proteínas totales en células dendríticas inmaduras. En células dendríticas maduras, los ARN con beta-s-ARCA(D2) resultaron en la expresión de proteínas totales más alta, seguido de ARN con beta-S-ARCA(D1), ARN modificado post-transcripcionalmente y después ARN con ARCA. En resumen, estos datos demuestran que la estructura de caperuza en el extremo 5' de los ARN muestra una influencia diferencia sobre la estabilidad funcional del ARN y la eficiencia de traducción en células dendríticas inmaduras y maduras. En particular, el efecto de beta-S-ARCA(D1) en células dendríticas inmaduras es único y no ha sido observado anteriormente.
Ejemplo 4: traducción preferente de ARN con beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' en células dendríticas inmaduras
Los resultados descritos indican que la eficiencia de traducción de un ARNm está influido en células dendríticas por el tipo de estructura de caperuza en su extremo 5'. Lo anterior más probablemente se debe a diferencias en la eficiencia con la que se induce la maquinaria de traducción hacia las diferentes estructuras de caperuza 5'. Para corroborar lo anterior, los presentes inventores analizaron a continuación (i) el efecto de la dosis de ARN que se utilizaba para la electroporación en células dendríticas inmaduras, e (ii) el impacto de un segundo ARN electroporado en células dendríticas inmaduras sobre la expresión de proteínas. Mediante el incremento de la cantidad de ARNm electroporado se espera que en cierto punto uno o más factores de traducción se encuentren limitados por la velocidad dentro de la célula, que en ese momento restringirá la cantidad de proteína que puede sintetizarse a partir del ARN exógeno. De manera similar, un segundo ARN competirá para la maquinaria de traducción, nuevamente influyendo sobre la eficiencia de la traducción.
Se electroporaron en células dendríticas inmaduras cantidades crecientes (20 pmoles y 40 pmoles) de ARN codificantes de luciferasa a los que se habían añadido caperuzas cotranscripcionalmente de ARCA o beta-S-ARCA(D1), y se midió la actividad de luciferasa tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas. Resulta interesante que la actividad de luciferasa medida al utilizar 40 pmoles de ARN con caperuza de ARCA se redujo relativamente a la señal obtenida con 20 pmoles de ARN con caperuza ARCA 24 horas después de la electroporación (figura 3A). En este punto temporal, el nivel de proteína luciferasa era sólo aproximadamente 1,6 veces superior al caso en que se utilizó la mitad de cantidad de ARN. Esta proporción se redujo todavía más 48 y 72 horas después de la electroporación (1,4 y 1,2 veces, respectivamente). En contraste, para el ARN con caperuza de beta-S-ARCA(D1), el nivel de proteína luciferasa fue generalmente proporcional a la cantidad de ARN utilizada para la electroporación durante todo el curso del experimento, es decir, la señal obtenida tras la electroporación de 40 pmoles de ARN fue aproximadamente el doble de alta que la señal obtenida al utilizar 20 pmoles de ARN, en cada punto temporal.
De manera similar, la coelectroporación de la misma cantidad de ARN codificante de d2eGFP (con caperuza de ARCA o beta-S-ARCA(D1)) en células dendríticas inmaduras redujo la expresión de ARN codificante de luciferasa con caperuza de ARCA pero no con caperuza de beta-S-ARCA(D1) tras 24, 48 y 72 horas en comparación con un control que había sido electroporado con sólo ARN codificante de luciferasa (figura 3B). Conjuntamente lo anterior indica que en células dendríticas inmaduras el ARN con caperuza de ARCA aparentemente no puede competir tan eficientemente para la maquinaria de traducción con ARN endógeno como ARN con caperuza de beta-S-ARCA(D1) al incrementar el nivel de ARN más allá de cierto umbral fijado más probablemente por la disponibilidad de uno o más factores de traducción limitantes. De esta manera, la incorporación de beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' proporciona ARN que se traducen preferentemente al competir con ARN endógeno u otro ARN exógeno.
Ejemplo 5: estabilización de ARN por análogos de fosforotioato de caperuza en células dendríticas inmaduras
Los datos mostrados en la figura 2 indica que el tipo de caperuza 5' no sólo influye sobre la eficiencia de traducción, sino también sobre la estabilidad funcional del ARNm en las células dendríticas. Para contrastar lo anterior, los
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presentes inventores determinaron las estabilidades absolutas de ARN con las diversas estructuras de caperuza 5' en células dendríticas. La estabilidad absoluta la proporciona la semivida del ARN.
Las células dendríticas inmaduras y maduras humanas se electroporaron con ARN codificantes de d2eGFP a las que se había proporcionado un análogo de caperuza cotranscripcionalmente o post-transcripcionalmente utilizando los enzimas de adición de caperuza del virus Vaccinia. Una porción de las células se recolectó tras 2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas y se determinó la cantidad de ARN codificante de d2eGFP relativamente a un ARN endógeno (el ARN codificante de hipoxantina fosforibosiltransferasa) utilizando RT-PCR en tiempo real (fig. 4). Los valores determinados se utilizaron para calcular la semivida de los ARN (Tabla 2). Como control de la electroporación y de al expresión de las proteínas, se determinó la cantidad de d2eGFP tras 24 horas utilizando la cuantificación mediante citometría de flujo, en la que se midió el mismo orden que en los experimentos anteriormente descritos.
Tabla 2: estabilidad de los ARN con diferentes estructuras de caperuza en células dendríticas inmaduras (CDi) y en células dendríticas maduras (CDm). Medias ± desviaciones estándar.
- Estructura de caperuza 5'
- células Semivida del ARNm (h) (2 a 8 h después de la electroporación) Semivida del ARNm (h) (24 a 72 h después de la electroporación) células Semivida del ARN (h) (2 a 72 h después de la electroporación)
- Sin caperuza
- CDi 1,41 ± 0,02 n.a. CDm 10,36 ± 0,18
- ApppG
- CDi 5,98 ± 0,49 14,06 ± 1,43 CDm 15,30 ± 0,64
- GpppG
- CDi 4,82 ± 0,71 24,45 ± 4,40 CDm 14,64 ± 0,32
- m 7GpppG
- CDi 5,82 ± 1,46 16,10 ± 1,83 CDm 13,11 ± 0,82
- m 7Gppppm7G
- CDi 2,37 ± 0,09 19,37 ± 0,34 CDm 11,88 ± 0,39
- ARCA
- CDi 5,47 ± 0,87 15,50 ± 1,57 CDm 13,63 ± 0,55
- beta-S-ARCA(D1)
- CDi 8,27 ± 1,15 27,00 ± 2,85 CDm 13,94 ± 0,82
- beta-S-ARCA(D2)
- CDi 6,72 ± 1,48 18,09 ± 0,81 CDm 14,20 ± 0,89
- m 7GpppG(p.-t.)
- CDi 6,11 ± 0,33 15,60 ± 7,24 CDm 13,27 ± 0,28
Resulta interesante la observación de los presentes inventores de que todos los ARN en células dendríticas inmaduras de una cinética de degradación en dos etapas del ARN, con la excepción del ARN sin caperuza, que ya se había degradado prácticamente por completo tras 8 horas (fig. 4A y Tabla 2). En las primeras 8 horas tras la electroporación, se habían degradado los ARN más rápidamente que en la etapa de degradación posterior hasta el final de los experimentos.
El ARN con beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' era el ARN más estable en las células dendríticas inmaduras tanto durante la etapa de degradación temprana como durante la etapa de degradación tardía (con semividas de aproximadamente 8 y 27 horas, respectivamente; fig. 4A y Tabla 2). Lo anterior resulta inesperado ya que en los estudios in vitro beta-S-ARCA(D2) mostró la mejor protección frente a la degradación por el enzima descaperuzante Dep2. La mayoría de los ARN con una caperuza mostraron semividas del orden de 5 a 7 horas en la etapa de degradación temprana y de entre 15 y 18 horas en la etapa de degradación tardía, respectivamente. Lo anterior implica que en efecto beta-S-ARCA(D1) muestra un efecto claro sobre la estabilización del ARN, en particular durante la etapa de degradación tardía. Sin embargo, la mayoría de las otras estructuras de ARN 5' sólo mostraron un efecto menor sobre la estabilidad absoluta del ARN. Una excepción era m7GppppGm7G. El ARN con esta caperuza en el extremo 5' era el ARN más inestable, con una semivida inferior a 2,5 horas durante las primeras 8 horas posteriores a la electroporación. Resulta interesante que el ARN con m7GppppGm7G todavía presente en la célula 8 horas después de la electroporación era tan estable como los otros ARN, con una semivida de aproximadamente 20 horas.
En contraste con las células dendríticas inmaduras, la degradación del ARN en las células dendríticas maduras sigue una cinética uniforme durante la totalidad del curso temporal estudiado (fig. 4B y Tabla 2). En comparación con la cinética de degradación inicial en las células dendríticas inmaduras, el ARN era claramente más estable en las células dendríticas maduras y mostraba semividas que eran comparables a las d la etapa de degradación tardía en células dendríticas inmaduras. Tal como ya se ha observado en las células dendríticas inmaduras, la estabilidad absoluta sólo es marginalmente dependiente de la estructura de la caperuza, ya que todos los ARN con una caperuza presentaban semividas similares, de entre 13 y 15 horas (con la excepción del ARN con m7Gppppm7G en el extremo 5', que mostró una semivida inferior a 12 horas). Incluso el ARN sin caperuza era bastante estable en células dendríticas maduras con una semivida superior a 10 horas. Las semividas comparables de los ARN están de acuerdo con las estabilidades funcionales comparables del ARN en las células dendríticas maduras (ver la Tabla 1).
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En resumen, el presente experimento demuestra que el factor decisivo para la intensidad y la duración de la expresión de proteínas del ARN con diversas estructuras de caperuza 5' en las células dendríticas maduras es la eficiencia de traducción.
Ejemplo 6: expresión incrementada del ARN con beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' tras la inyección en los nódulos linfáticos de ratones
Recientemente los presentes inventores pudieron demostrar que la inyección de ARN en los nódulos linfáticos (inyección intranodal) es el enfoque más prometedor para obtener una respuesta inmunológica contra el antígeno codificado (documento nº DE 10 2008 061 522.6). El ARN administrado de esta manera es incorporado principalmente por las células dendríticas inmaduras. De esta manera, los presentes inventores investigaron si la expresión más fuerte de proteínas también se observaba en los nódulos linfáticos para el ARN con beta-S-ARCA(D1) que para los ARN con otras estructuras de caperuza (analizadas ejemplarmente para ARCA aplicado por los presentes inventores en los estudios anteriores).
Los ARN codificantes de luciferasa (tal como se ha indicado anteriormente) que habían sido transcritos en presencia de ARCA o de beta-S-ARCA(D1) se inyectaron en los nódulos linfáticos inguinales de ratones. Tras la incorporación del ARN por las células de los nódulos linfáticos y la traducción de la luciferasa codificada, se cuantificó la expresión de proteínas mediante la medición de la actividad de luciferasa utilizando imágenes in vivo. Se administró i.p. en ratones una solución acuosa de D-luciferina (Promega, Mannheim, Alemania; 150 mg/kg de peso corporal). Los animales se anestesiaron con isoflurona y se introdujeron en la cámara oscura de un sistema de captación de imágenes IVIS Lumina (Xenogen, Rüsselsheim, Alemania). Veinticinco minutos después de la inyección de luciferina, se cuantificaron los fotones emitidos durante un tiempo de integración de 1 min. Se utilizaron imágenes en escala de grises de los ratones como referencia sobre la que se superpuso la señal de bioluminiscencia en forma de imagen en escala de pseudocolor (negro=menos intenso; blanco=más intenso) mediante la utilización de software Living Image (Xenogen). Para cuantificar la bioluminiscencia, se dibujaron las regiones de interés (RI) y se midió el flujo total (fotones/s, p/s) en las RI. Se restó la bioluminiscencia de fondo de una región no emisora de señal, de los valores de bioluminiscencia respectivos para cada animal.
De acuerdo con los resultados en células dendríticas inmaduras aisladas, los presentes inventores observaron que la expresión de proteínas del ARN con beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5' era más elevada en cada punto temporal (2, 4, 8, 24, 48 y 72 horas tras la aplicación intranodal del ARN) que la del ARN con ARCA en el extremo 5' (fig. 5). Durante la totalidad del curso temporal la expresión (dada por la integral de la curva) se encontraba incrementada en aproximadamente 8 veces. Por lo tanto, los presentes inventores pudieron demostraron por primera vez que con beta-S-ARCA(D1) la expresión de proteínas en los nódulos linfáticos y, de esta manera, principalmente en las células dendríticas inmaduras resistentes en los mismos, resulta incrementada en intensidad y duración.
Ejemplo 7: cebado de novo incrementado de las células T tras la vacunación con ARN con beta-S-ARCA(D1) en el extremo 5'
La fusión del antígeno a un péptido líder amino-terminal y una señal de tráfico de CMH de clase I carboxi-terminal resultó en una presentación de antígeno incrementada de los epítopos del CMH de clase I y de clase II (Kreiter et al.,
J. Immunol. 180:309-318, 2008). La inyección intranodal de ARN con ARCA codificante de un antígeno respectivamente modificado y que incluías las optimizaciones anteriormente indicadas con respecto a la secuencia de poli(A) y de la UTR de la beta-globina permitió el cebado de novo de células T no expuestas (documento nº DE 10 2008 061 522.6). Los presentes inventores investigaron si el cebado de novo podía incrementarse adicionalmente mediante la utilización de beta-S-ARCA(D1).
Se inmunizaron ratones mediante la inyección intranodal de ARN desnudo dos veces al día (el día 0 y el día 3) que codificaba un antígeno específico con las modificaciones anteriormente indicadas. El día 8 se determinó la frecuencia de células T específicas de antígeno en sangre periférica y en el bazo utilizando tinción de tetrámeros. Tal como se muestra en la fig. 6, aproximadamente 5% de las células T CD8+ en la sangre periférica y aproximadamente 6% de las células T CD8+ en el bazo eran positivas para tetrámeros tras la inmunización por duplicado con ARN con ARCA. Mediante la utilización de ARN con beta-S-ARCA(D1), se observaron más de 12% y 13% de células T CD8+ positivas para tetrámeros en sangre periférica y bazo, respectivamente. Lo anterior demuestra por primera vez que beta-S-ARCA(D1) conduce a una expresión incrementada ya prolongada de las proteínas a partir del ARN que porta la caperuza de beta-S-ARCA(D1), que seguidamente resulta en una respuesta inmunológica incrementada (medida como cebado de novo de células T), incluso en el contexto de un antígeno que ha sido optimizado con respecto al procesamiento y transporte de los complejos de CMH de clase I y de clase II y utilizando un ADN molde para la preparación de un ARN de estabilidad y eficiencia de traducción superiores.
Ejemplo 8: análisis de HPLC de m27,2'-OGppSpG (D1) y (D2) (es decir, beta-S-ARCA(D1) y (D2))
Se llevó a cabo un análisis de HPLC analítica de una mezcla diastereomérica de m27,2'-OGppSpG (D1) y (D2) (es decir beta-S-ARCA(D1) y (D2)) en una proporción molar de aproximadamente 1:3 en un aparato Agilent Technologies 1200 Series con una columna Supelcosil LC-18-T RP (5 µm, 4,6x250 mm, caudal: 1,3 ml/min)
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utilizando un gradiente lineal de 0% a 25% de metanol en acetato amónico 0,05 M, pH=5,9, en 15 min. Se llevó a cabo la detección de UV (VWD) a 260 nm y se llevó a cabo la detección de la fluorescencia (FLD) con excitación a 280 nm y detección a 337 nm. Tiempos de retención: m27,2'-OGppSpG (D1)=10,4 min, m27,2'-O-GppSpG (D2)=10,7 min (fig. 7).
Claims (13)
- E1074275228-10-2014REIVINDICACIONES1. Composición de vacuna que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
imagen1 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 10 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de15 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 20 n es 1, 2o 3,en la que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA. 25 - 2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que la estructura de caperuza 5' tras la transferencia de dicho ARN al interior de unas células presentadoras de antígeno inmaduras puede incrementar la estabilidad del ARN, incrementar la eficiencia de traducción del ARN, prolongar la traducción del ARN, incrementar la expresión de proteínas total del ARN y/o incrementar la respuesta inmunológica contra un antígeno o péptido antigénico30 codificado por dicho ARN cuando se compara con el mismo ARN sin la estructura de caperuza 5' según la fórmula (I).
- 3. Composición de vacuna según la reivindicación 1 o 2, en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consisteen alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente y arilo sustituido opcionalmente. 35
- 4. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, OH, metoxi, etoxi y propoxi.
- 5. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la caperuza 5' del ARN es el 40 diastereómero D1 de beta-S-ARCA.
- 6. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es formulada para la inyección intranodal.45 7. Célula presentadora de antígeno inmadura que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):E1074275228-10-2014
imagen2 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 5 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de10 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 15 n es 1, 2o 3,en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA. 20 - 8. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o célula presentadora de antígeno inmadura según la reivindicación 7 para la utilización en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo.25 9. ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
imagen3 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido 30 opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en 35 CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,E1074275228-10-2014R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,n es 1, 2o 3,5 en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.para la utilización en un método para incrementar la estabilidad de un ARN en unas células presentadoras de10 antígeno inmaduras y/o para incrementar la expresión de un ARN en unas células presentadoras de antígeno inmaduras, comprendiendo dicho método: transferir dicho ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras. - 10. ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende dicho15 antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):
imagen4 20 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido25 opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3, 30 R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,n es 1, 2o 3,35 en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.para la utilización en un método para incrementar la porción de moléculas de CMH que presentan un antígeno de interés sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, comprendiendo dicho método: transferir dicho 40 ARN al interior de una célula presentadora de antígeno inmadura. - 11. ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):45E1074275228-10-2014
imagen5 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido 5 opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de10 hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, 15 n es 1, 2o 3,en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, para la utilización en un método para estimular y/o activar las 20 células efectoras inmunitarias, comprendiendo dicho método:transferir dicho ARN al interior de unas células presentadoras de antígeno inmaduras, yponer en contacto las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunitarias. 25 -
- 12.
- ARN para la utilización según la reivindicación 11, en el que la puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunitarias se lleva a cabo in vitro o in vivo.
-
- 13.
- ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un
30 antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):imagen6 35 en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,E1074275228-10-2014R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2-o -CH2-O-,5 R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,10 nes1,2o3,en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pβ del diastereómero D1 de beta-S-ARCA,15 para la utilización en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo. -
- 14.
- ARN para la utilización según la reivindicación 13, que se administra mediante inyección intranodal.
-
- 15.
- Célula presentadora de antígeno inmadura según la reivindicación 7, para la utilización en un método para
20 inducir una respuesta inmunitaria en un individuo, en la que dicho ARN ha sido transferido al interior de dichas células presentadoras de antígeno inmaduras.
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