PT2461833E

PT2461833E - Composição de vacina compreendendo arn modificado com remate a 5'

Info

Publication number: PT2461833E
Application number: PT107427528T
Authority: PT
Inventors: Ugur Sahin; Joanna Kowalska; Andreas Kuhn; Jacek Jemielity
Original assignee: Univ Warszawski; Biontech Ag; Tron Translationale Onkologie An Der Universitetsmedizin Der Johannes Gutenberg Uni Mainz Gemeinnetz
Priority date: 2009-08-05
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2015-01-02
Also published as: DK2461833T3; EP2461833B1; US9295717B2; JP5799014B2; AU2010281042A1; JP6306127B2; JP6042481B2; AU2010281042B2; JP2013501014A; EP2281579A1; SI2461833T1; EP2461833A1; CA2768600A1; HK1167107A1; JP2015180631A; JP2017061507A; WO2011015347A1; US20120195917A1; JP2018127462A; CA2768600C

Description

DESCRIÇÃO "Composição de vacina compreendendo ARN modificado com remate a 5'"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção está no campo da vacinação à base de ácido nucleico. Em particular, a presente invenção refere-se à estabilização de ARN por modificação, em particular no contexto da vacinação com ARN, e proporciona uma composição de vacina compreendendo um ARN que está modificado com um análogo de remate a 5', a células apresentadoras de antigénio imaturas compreendendo esse ARN, assim como a métodos para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo utilizando a composição de vacina ou as células apresentadoras de antigénio imaturas de acordo com a presente invenção. Além disso, a presente invenção proporciona um método para aumentar a estabilidade de ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas, um método para aumentar a expressão de ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas, um método para aumentar a porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse, e um método para estimular e/ou activar células efectoras imunitárias.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO

As vacinas recombinantes têm particular importância em medicina humana e veterinária para profilaxia e terapia de doenças infecciosas e cancerosas. É o objectivo de uma imunização com uma vacina recombinante induzir uma reacção imunitária específica contra um antigénio definido, que é eficaz na prevenção ou na terapia de doenças definidas. As vacinas recombinantes conhecidas são baseadas em proteínas recombinantes, fragmentos peptídicos sintéticos, vírus recombinantes ou ácidos nucleicos.

Recentemente, as vacinas à base de ADN e ARN ganharam mais importância. Foi mostrado que a injecção intramuscular directa de ADN plasmídico resulta numa expressão duradoura dos genes codificados (Wolff et al., 1990, Science, 247: 1465-1468) . Esta constatação constituiu um importante incentivo no campo para adicionalmente investigar a aplicabilidade de ácidos nucleicos em imunoterapia. Inicialmente foram estudadas vacinas à base de ADN contra patogénios infecciosos (Cox et al., 1993, J. Virol. 67: 5664-5667; Davis et al. , 1993, Hum. Mol. Genet. 2: 1847-1851; Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1749; Wang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 4156-4160) . Além disso, foi estudada a aplicabilidade de ácidos nucleicos em terapia génica contra tumores e para indução de uma imunidade antitumoral especifica (Conry et al., 1994, Cancer Res. 54: 1164-1168; Conry et al., 1995, Gene Ther. 2: 59-65; Spooner et al., 1995, Gene Ther. 2: 173-180; Wang et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6: 407-418). A imunização à base de ácido nucleico exibe um número de vantagens. Por exemplo, o fabrico de vacinas à base de ácido nucleico é simples, relativamente pouco dispendioso, e as vacinas à base de ADN são estáveis para armazenagem a longo prazo. Contudo, em particular, as vacinas à base de ADN exibem uma variedade de riscos potenciais de segurança tais como a indução de anticorpos anti-ADN (Gilkeson et al. , 1995, J. Clin. Invest. 95: 1398-1402) e potencial integração do transgene no genoma do hospedeiro. Isto pode conduzir à inactivação de genes celulares, uma expressão incontrolável de longo prazo do transgene, ou oncogénese, e desse modo, geralmente não é aplicável para antigénios associados a tumores com potencial oncogénico tais como erb-B2 (Bargmann et al., 1986, Nature 319: 226-230) e p53 (Greenblatt et al., 1994, Cancer Res. 54: 4855-4878) . A utilização de ARN proporciona uma alternativa atractiva para contornar os riscos potenciais das vacinas à base de ADN. Algumas das vantagens da imunização à base de ARN são a expressão transiente e o carácter não transformante. Além disso, o ARN não tem que ser transportado para o núcleo para que o transgene seja expresso, e além do mais, não pode ser integrado no genoma do hospedeiro. Similar à injecção de ADN (Condon et al., 1996, Nat. Med. 2: 1122-1128; Tang et al., 1992, Nature 356: 152-154), a injecção de ARN pode resultar in vivo numa resposta imunitária tanto celular como humoral (Hoerr et al. , 2000, Eur. J. Immunol. 30: 1-7; Ying et al., 1999, Nat. Med. 5: 823-827).

Foram seguidas duas estratégias diferentes para imunoterapia com ARN transcrito in vitro (IVT-RNA), tendo ambas sido testadas com sucesso em vários modelos animais. Ou o ARN é injectado directamente no paciente por diferentes vias de imunização (Hoerr et ai., 2000, Eur. J. Immunol. 30: 1-7) ou células dendriticas são transfectadas com IVT-RNA utilizando métodos convencionais de transfecção in vitro e depois as células dendriticas transfectadas são administradas ao paciente (Heiser et ai., 2000, J. Immunol. 164: 5508-5514). Foi mostrado que a imunização com células dendriticas transfectadas com ARN induz linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o antigénio in vitro e in vivo (Su et ai., 2003, Cancer Res. 63: 2127-2133; Heiser et ai., 2002, J. Clin. Invest. 109: 409-417). Além disso, foi mostrado que a injecção directa de ARN nu nos nódulos linfáticos de animais de laboratório (injecção intranodal) conduz à assimilação do referido ARN principalmente por células dendriticas imaturas, provavelmente através de um processo denominado macropinocitose (cf. DE 10 2008 061 522.6) . Assume-se que o ARN é traduzido e a proteína expressa é apresentada nas moléculas do MHC sobre a superfície das células apresentadoras de antigénio para eliciar uma resposta imunitária.

Uma desvantagem principal da vacinação à base de ARN é a instabilidade do ARN in vivo, em particular nas células do sistema imunitário. A degradação de ARN de cadeia longa na extremidade 5' é induzida na célula pela denominada enzima de "descapeamento" (em inglês "decapping") Dcp2 que cliva m7GDP da cadeia do ARN. Assim, assume-se que a clivagem ocorre entre os grupos alfa- e beta-fosfato do remate (ou capa) do ARN.

Para inibir o processo de descapeamento e desse modo aumentar a estabilidade do ARN in vivo, foi estudado o efeito de análogos fosforotioato de remates sobre a estabilidade do referido ARN. Foi mostrado que a substituição de um átomo de oxigénio por um átomo de enxofre no grupo beta-fosfato do remate ou capa a 5' ("5'-cap") resulta na estabilização contra a Dcp2. A modificação com f osf orotioato do remate a 5' do ARN foi combinada com uma modificação com análogo do remate anti-inverso (ARCA do inglês "anti-reverse cap analog") que inibe a integração inversa do remate numa cadeia de ARN. O resultante análogo do remate, i.e., m2(7,2 ,_0) GppspG, foi denominado beta-S-

ARCA (cf. Fig. 1). A substituição de um átomo de oxigénio por um átomo de enxofre num fosfato de ponte resulta em diastereoisómeros fosforotioato que são designados Dl e D2 com base no seu padrão de eluição em HPLC. De forma interessante, os dois diastereoisómeros diferem em sensibilidade contra nucleases. Foi mostrado que o ARN portador do diastereoisómero D2 de beta-S-ARCA é quase totalmente resistente contra a clivagem por Dcp2 (apenas 6% de clivagem comparada com ARN que foi sintetizado na presença do remate a 5' não modificado ARCA), enquanto o ARN com o remate a 5' beta-S-ARCA (Dl) exibe uma sensibilidade intermédia à clivagem por Dcp2 (71% de clivagem) (Grudzien - Nogalska et al. , 2007, RNA 13: 1745 - 1755) . Além disso, os três análogos do remate ARCA, beta-S-ARCA(Dl) e beta-S-ARCA(D2) diferem na sua afinidade de ligação para com o factor de iniciação da tradução eucariota eIF4E. Ambos os análogos do remate com fosforotioato possuem superior afinidade para com eIF4E relativamente aos ARN possuindo remates a 5' convencionais. Foi ainda mostrado que a estabilidade aumentada contra a clivagem por Dcp2 se correlaciona com uma expressão aumentada de proteínas em células HC11. Em particular, foi mostrado que ARN portadores do remate beta-S-ARCA(D2) são mais eficientemente traduzidos em células HC11 do que ARN portadores do remate beta-S-ARCA(Dl) (Grudzien - Nogalska et al., 2007, RNA 13: 1745 - 1755) .

Kowalska et al. (2008, RNA 14: 1119-1131) também divulgam análogos de remate anti-inversos com substituições de fosforotioato e ensinam que apenas análogos modificados no grupo gama-fosfato são resistentes a clivagem por Dcp2.

Em resumo, o ARN está especialmente bem adequado para aplicações clínicas. Contudo, a utilização de ARN em terapia génica e vacinação com ARN está principalmente limitada pela curta vida do ARN, em particular no citoplasma, que resulta em expressão baixa e/ou insuficiente de proteínas.

Assim, para a vacinação com ARN tem particular importância aumentar a estabilidade do ARN em células apresentadoras de antigénio. Como o ARN nu injectado nos nódulos linfáticos é principalmente assimilado por células apresentadoras de antigénio imaturas, em particular por células dendríticas imaturas, tem particular importância no contexto da vacinação com ARN aumentar a estabilidade do ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas. Assim, constitui o objecto da presente invenção proporcionar ARN que é particularmente adequado para vacinação com ARN, i.e., proporcionar meios para estabilizar particularmente o ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas. Este problema técnico é resolvido de acordo com a presente invenção pela matéria objecto das reivindicações.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo um ARN que está modificado com uma estrutura de remate a 5' ("5 '-cap") de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-0-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2, ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

Numa concretização preferida, a estrutura de remate a 5', após transferência do referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, é capaz e aumentar a estabilidade do ARN, aumentando eficientemente a tradução do ARN, prolongando a tradução do ARN, aumentando a expressão total de proteínas do ARN e/ou aumentando a resposta imunitária contra um antigénio ou um péptido antigénico codificados pelo referido ARN, comparativamente com o mesmo ARN sem a estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I).

Numa concretização preferida, R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído e arilo opcionalmente substituído.

Numa concretização preferida, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, F, OH, metoxi, etoxi e propoxi.

Numa concretização particularmente preferida, o remate a 5' do ARN é o diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

Preferivelmente, a composição de vacina é formulada para injecção intranodal.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma célula apresentadora de antigénio imatura compreendendo um ARN que está modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 é combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-0-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2, ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

Num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo o passo de administração ao referido indivíduo da composição de vacina do primeiro aspecto da invenção ou da célula apresentadora de antigénio imatura do segundo aspecto da invenção.

Num quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a estabilidade de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas e/ou para aumentar a expressão de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas, o referido método compreendendo: proporcionar o referido ARN com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituído, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R5 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, e transferir o referido ARN para as células apresentadoras de antigénio imaturas.

Num quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio, o referido método compreendendo: proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo o referido antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3. R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo B que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, e transferir o referido ARN para uma célula apresentadora de antigénio imatura.

Num sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método para estimular e/ou activar células efectoras imunitárias, o referido método compreendendo: proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, transferir o referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, e fazer contactar as células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias. 0 contacto das células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias pode ser realizado in vitro ou in vi vo.

Num sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um método para indução de uma resposta imunitária num indivíduo, o referido método compreendendo: proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3), e 0(0¾) 2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, e administrar o referido ARN ao referido indivíduo.

Numa concretização preferida, o ARN é administrado por injecção intranodal.

Num oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um método para indução de uma resposta imunitária num indivíduo, o referido método compreendendo: proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3), e 0(0¾) 2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, transferir o referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, e administrar as células apresentadoras de antigénio ao referido indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Estruturas de dinucleótidos de remate a 5'. Existem dois diastereoisómeros do análogo de remate com fosforotioato beta-S-ARCA devido ao centro estereogénico P, que são designados Dl e D2 de acordo com as suas características de eluição em HPLC de fase inversa.

Figura 2. Efeito da estrutura de remate a 5' sobre a expressão de proteínas em células dendríticas. (A) Células dendríticas imaturas e maduras (iDC e mDC, respectivamente) foram electroporadas com a mesma quantidade de ARN que codifica luciferase que tinha sido transcrito na presença de vários dinucleótidos de remate (como indicado) ou em que o remate a 5' tinha sido incorporado após a transcrição utilizando a enzima de capeamento do vírus vaccinia (m7GpppG(p.-t.)) . A actividade da luciferase (dada em RLU) foi medida em duplicado após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas. É apresentada a média ± desvio padrão. (B) iDC e mDC foram electroporadas com a mesma quantidade de ARN que codifica d2eGFP que tinha sido preparado como descrito em (A) . As células foram colhidas após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas e a fluorescência de d2eGFP (dada em MFI) foi determinada utilizando citometria de fluxo.

Figura 3. Competição para tradução entre os ARN com remate ARCA e beta-S-ARCA (Dl) . Células dendríticas imaturas (iDC) foram electroporadas com (A) quantidades crescentes de ARN que codificam luciferase ou (B) as quantidades indicadas de ARNm que codificam luciferase e d2eGFP, que foram rematados em simultâneo com a transcrição com ARCA ou com beta-S-ARCA(Dl) , conforme indicado. A actividade da luciferase foi medida após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas. É apresentada (A) a razão entre as actividades de luciferase obtidas após electroporação com 40 e 20 pmol de ARN que codificam luciferase (± DP de duas experiências independentes), e (B) a actividade relativa da luciferase comparativamente com células electroporadas com apenas ARN que codifica luciferase sem ARN (considerado 1 para ambos os ARN, rematado com ARCA e com beta-S-ARCA(Dl)).

Figura 4. Impacto do remate a 5' sobre a estabilidade de ARNm em células dendriticas. (A) Células dendriticas imaturas (iDC) e (B) células dendriticas maduras (mDC) foram electroporadas com iguais quantidades de ARNm que codificam d2eGFP transcritos na presença de diferentes análogos de remates conforme indicado. As células foram colhidas após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas, e os níveis de transcrito de d2eGFP foram quantificados por RT-PCR em tempo real. Para cada ponto temporal, mostra-se a diferença entre os ciclos limiar (Ct) de ARN que codificam d2eGFP e hipoxantina-fosforribosiltransferase (HPRT1) utilizado como controlo interno. Os dados foram ajustados a um decaimento bifásico (iDC; Figura 4A) , ou a um decaimento monofásico (mDC; Figura 4B).

Figura 5. Efeito da estrutura do remate a 5' sobre a expressão de proteínas in vivo. Ratinhos (n = 9) foram injectados por via intranodal com a mesma quantidade de ARN que codifica luciferase com ARCA ou beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' (como indicado). A actividade de luciferase (dada em RLU) foi medida após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas. (A) Mostram-se imagens de animais inteiros nos pontos temporais indicados de um ratinho representativo, que foi injectado com ARN com ARCA ou beta-S-ARCA(Dl). Estão ilustradas as contagens fotónicas correspondentes a uma escala de cinzentos mostrada na figura. (B) Média ± erro padrão da média medida ao longo do tempo. A significância foi determinada utilizando análises estatísticas (* : P < 0,005 e ** : P < 0,02).

Figura 6. Efeito da estrutura de remate a 5' sobre a sensibilização de novo de células T após imunização intranodal com ARN. Ratinhos (n = 5) foram imunizados por injecção intranodal duas vezes por dia (dia 0 e dia 3) com a mesma quantidade de ARN que codifica um péptido antigénico específico possuidor de ARCA ou de beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5'. A frequência de células CD8+ positivas para o tetrâmero foi determinada no dia 8 utilizando análise do tetrâmero. (A) Os gráficos de pontos representativos de células do sangue periférico e do baço de ratinhos que foram imunizados com ARN com ARCA ou beta-S-ARCA(Dl) (conforme indicado). (B) Número médio de células CD8+ positivas para o tetrâmero ± erro padrão da média (em %) conforme medido no dia 8. A significância foi determinada utilizando análises estatísticas (*: P < 0,075) .

Figura 7. Análise por HPLC de m27'2'~°GppspG (Dl) e (D2) (i.e., beta-S-ARCA (Dl) e (D2)). Foi realizada HPLC analítica de uma mistura diastereomérica com uma razão molar de beta-S-ARCA (Dl) : (D2) de 1:3 num aparelho Agilent Technologies 1200 Series com uma coluna Supelcosil LC-18-T RP (5 pm, 4,6 x 250 mm, caudal: 1,3 ml/min) utilizando um gradiente linear de 0-25% de metanol em acetato de amónio 0,05 M, pH = 5,9, em 15 min. Realizou-se a detecção de UV (VWD) a 260 nm e realizou-se a detecção de florescência (FLD) com excitação a 280 nm e detecção a 337 nm. Tempos de retenção: beta-S-ARCA(Dl) = 10,4 min, beta-S-ARCA(D2) = 10,7 min.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Embora a presente invenção seja descrita em detalhe adiante, deve entender-se que a presente invenção não está limitada às metodologias, protocolos e reagentes particulares aqui descritos pois estes podem variar. Deve também entender-se que a terminologia aqui utilizada tem como finalidade apenas descrever concretizações particulares, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que são normalmente entendidos por uma pessoa competente na matéria.

No que se segue, serão descritos os elementos da presente invenção. Estes elementos estão enumerados com concretizações específicas, contudo, deverá entender-se que podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar concretizações adicionais. Os exemplos e concretizações preferidas variadamente descritos não deverão ser entendidos como limitantes da presente invenção apenas às concretizações explicitamente descritas. A presente descrição deverá ser entendida como suportando e abrangendo concretizações que combinam as concretizações explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos no presente pedido deverão ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido a menos que o contexto indique o contrário. Por exemplo, se numa concretização preferida R2 da estrutura de remate a 5' é metoxi e em outra concretização preferida R5 da estrutura de remate a 5' é S, então numa concretização preferida, R2 da estrutura de remate a 5' é metoxi e R5 é S.

Preferivelmente, os termos aqui utilizados são definidos como descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, e H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça, (1995). A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica e técnicas de ADN recombinante que estão explicadas na literatura da área (cf. , e.g., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

Em toda a presente descrição e nas reivindicações que se seguem, a menos que o contexto o requeira de outro modo, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um membro indicado, um número inteiro ou passo ou grupo de membros, números inteiros ou passos mas não a exclusão de qualquer outro membro, número inteiro ou passo ou grupo de membros, números inteiros ou passos. Os termos "um", "uma", "o" e "a", e referências similares utilizados no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser entendidos cobrindo tanto o singular como o plural, a menos que aqui indicado em contrário ou claramente contrariado pelo contexto. A indicação de gamas de valores é aqui meramente destinada a servir como um método abreviado para referir individualmente cada valor em separado que caia na gama. A menos que aqui indicado em contrário, cada valor individual é incorporado no fascículo como se fosse aqui individualmente indicado. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados por qualquer ordem adequada a menos que aqui indicado em contrário ou de outro modo claramente contrariado pelo contexto. A utilização de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (e.g., "tal como"), aqui proporcionados destina-se meramente a mais bem ilustrar a invenção e não coloca qualquer limitação ao âmbito da invenção reivindicada. Nenhuma linguagem no fascículo deverá ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial à prática da invenção. Vários documentos são citados ao longo de todo o texto do presente fascículo. Nada aqui deve ser entendido como uma admissão de que a invenção não é elegível para antecipar essa divulgação em virtude de invenção anterior.

De acordo com a invenção, a expressão "ácido nucleico" compreende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), suas combinações, e suas formas modificadas. A expressão compreende moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm, produzidas recombinantemente e quimicamente sintetizadas. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode estar presente sob a forma de uma molécula de cadeia simples ou de cadeia dupla e linear ou circular covalentemente fechada. Um ácido nucleico pode, de acordo com a invenção, estar isolado. A expressão "ácido nucleico isolado" significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucleico (i) foi amplificado in vitro, por exemplo através da reacção em cadeia pela polimerase (PCR), (ii) foi produzido recombinantemente por clonagem, (iii) foi purificado, por exemplo, por clivagem e separação por electroforese em gel, ou (iv) foi sintetizado, por exemplo, por síntese química.

No contexto da presente invenção, o termo "ARN" refere-se a uma molécula que compreende pelo menos um resíduo de ribonucleótido. "Ribonucleótido" refere-se a um nucleótido com um grupo hidroxilo na posição 2' de um grupo -D-ribofuranosilo. 0 termo compreende ARN de cadeia dupla, ARN de cadeia simples, ARN isolado tal como ARN parcialmente ou completamente purificado, ARN essencialmente puro, ARN sintético, ARN gerado recombinantemente tal como ARN modificado que difere do ARN de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. 0 termo "ARNm" significa "ARN mensageiro" e refere-se a um "transcrito" que é gerado utilizando um molde de ADN e codifica um péptido ou uma proteína. Tipicamente, um ARNm compreende uma 5'-UTR, uma região codificante da proteína e uma 3'-UTR. 0 ARNm apenas possui semivida limitada em células e in vitro. No contexto da presente invenção, um ARNm pode ser gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de ADN. A metodologia de transcrição in vitro é conhecida dos peritos. Por exemplo, existe uma variedade de kits de transcrição in vitro comercialmente disponíveis. No contexto da presente invenção, o ARN, preferivelmente o ARNm, está modificado com uma estrutura de remate a 5'.

Numa concretização preferida, o ARN de acordo com a invenção codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um ou mais antigénios e/ou um ou mais péptidos antigénicos e é capaz de expressar os referidos péptido ou proteína compreendendo um ou mais antigénios e/ou um ou mais péptidos antigénicos, em particular se transferido para uma célula tal como uma célula apresentadora de antigénio imatura. 0 ARN pode também conter sequências que codificam outras sequências polipeptídicas tais como elementos estimulantes imunitários. Além disso, pode conter elementos que participam na regulação da expressão (por exemplo, sequências 5'- ou 3'-UTR, etc.). 0 termo "modificação", no contexto do ARN utilizado na presente invenção, inclui qualquer modificação de um ARN que não está naturalmente presente no referido ARN. Em particular, o termo modificação refere-se a proporcionar a um ARN um análogo de remate a 5' possuindo uma estrutura como estabelecida na fórmula (I). Por exemplo, proporcionar a um ARN um análogo de remate a 5' pode ser conseguido por transcrição in vitro de um molde de ADN na presença do referido análogo de remate a 5', em que o referido remate a 5' é incorporado simultaneamente com a transcrição na cadeia de ARN gerada, ou o ARN pode ser gerado, por exemplo, por transcrição in vitro, e o remate a 5' pode ser ligado ao ARN após a transcrição utilizando enzimas de remate (ou capeamento, em inglês "capping"), por exemplo, enzimas de capeamento do vírus vaccinia. 0 ARN pode compreender outras modificações. Por exemplo, uma outra modificação do ARN utilizado na presente invenção, preferivelmente do ARNm utilizado na presente invenção, pode ser uma extensão ou uma truncagem da cauda poli(A) de ocorrência natural ou uma alteração das regiões não traduzidas (UTR) a 5' ou a 3' tais como uma introdução de uma UTR que não está relacionada com a região de codificação do referido ARN, preferivelmente o referido ARNm, por exemplo, a troca da 3'-UTR existente por, ou a inserção de uma ou mais, preferivelmente duas, cópias de uma 3'-UTR derivada de um gene de globina, tal como alfa2-globina, alfal-globina, beta-globina, preferivelmente beta-globina, mais preferivelmente beta-globina humana.

Os termos "remate a 5'" ou "capa a 5'" (em inglês "5'-cap") referem-se a uma estrutura de remate que se encontra na extremidade 5' de uma molécula de ARNm e geralmente consiste num nucleótido de guanosina ligado ao ARNm através de uma ligação trifosfato invulgar de 5' para 5'. Numa concretização, esta guanosina está metilada na posição 7. A expressão "remate a 5' convencional" refere-se a um remate a 5' de ARN de ocorrência natural, preferivelmente ao remate 7-metilguanosina (m7G). No contexto da presente invenção, o termo "remate a 5'" inclui um análogo de remate a 5' que se assemelha à estrutura de remate de ARN e está modificado de forma a ter a capacidade de estabilizar o ARN quando a este ligado, preferivelmente in vivo, preferivelmente em células apresentadoras de antigénio imaturas, o mais preferivelmente em células dendriticas imaturas. 0 remate a 5' utilizado na presente invenção exibe uma estrutura de acordo com a fórmula (I).

No contexto da presente invenção, a expressão "composição de vacina" refere-se a uma preparação antigénica que compreende ARN. A composição de vacina é administrada a um beneficiário de forma a estimular o sistema imunitário humoral e/ou celular de um indivíduo contra um ou mais antigénios. Neste contexto, o ARN pode codificar o antigénio, uma proteína ou um péptido compreendendo o referido antigénio ou um péptido antigénico. Uma composição de vacina no contexto da presente invenção pode ainda compreender um ou mais adjuvantes, diluentes, transportadores e/ou excipientes, etc., e é aplicado a um indivíduo por qualquer via adequada de forma a eliciar uma reacção imunitária protectiva e/ou terapêutica contra o antigénio.

Para administração de acordo com a invenção, em particular, na forma de uma composição de vacina, o ARN pode ser ARN nu ou pode ser incorporado num transportador, por exemplo, lipossomas ou outras partículas para transferência génica, e está preferivelmente na forma de ARN nu.

Um "antigénio" de acordo com a invenção cobre qualquer substância que vá eliciar uma resposta imunitária. Em particular, um "antigénio" refere-se a qualquer substância que reaja especificamente com anticorpos ou linfócitos T (células T). De acordo com a presente invenção, o termo "antigénio" compreende qualquer molécula que compreenda pelo menos um epítopo. Preferivelmente, um antigénio no contexto da presente invenção é uma molécula que, opcionalmente após processamento, induz uma reacção imunitária, que é preferivelmente específica para o antigénio. De acordo com a presente invenção pode ser utilizado qualquer antigénio adequado, que seja um candidato para uma reacção imunitária, em que a reacção imunitária pode ser tanto uma reacção imunitária humoral como celular. No contexto das concretizações da presente invenção, o antigénio é preferivelmente apresentado por uma célula, preferivelmente por uma célula apresentadora de antigénio, no contexto de moléculas do MHC, que resulte numa reacção imunitária contra o antigénio. Um antigénio é preferivelmente um produto que corresponde a, ou é derivado de um antigénio de ocorrência natural. Estes antigénios de ocorrência natural podem incluir ou podem ser derivados de alergénios, vírus, bactérias, fungos, parasitas e outros agentes infecciosos e patogénios ou um antigénio pode também ser um antigénio tumoral. De acordo com a presente invenção, um antigénio pode corresponder a um produto de ocorrência natural, por exemplo, uma proteína virai, ou uma sua parte.

Numa concretização preferida, o antigénio é um antigénio tumoral, i.e., uma parte de uma célula tumoral que pode ser derivada do citoplasma, da superfície celular ou do núcleo celular, em particular aqueles que ocorrem principalmente intracelularmente ou como antigénios de superfície de células tumorais. Por exemplo, os antigénios tumorais incluem o antigénio carcinoembrionário, 1-fetoproteína, isoferritina e sulfoglicoproteína fetal, 2-H-ferroproteína e -fetoproteína, assim como vários antigénios de vírus tumorais. De acordo com a presente invenção, um antigénio tumoral preferivelmente compreende qualquer antigénio que é característico de tumores ou cancros assim como de células tumorais ou cancerosas em relação ao tipo e/ou nível de expressão. Em outra concretização, o antigénio é um antigénio virai tal como uma ribonucleoproteína ou uma proteína do revestimento virai. Em particular, o antigénio deverá ser apresentado por moléculas do MHC que resultam em modulação, em particular activação de células do sistema imunitário, preferivelmente linfócitos CD4+ e CD8+, em particular através da modulação da actividade de um receptor de células T.

Em concretizações preferidas, o antigénio é um antigénio tumoral e a presente invenção envolve a estimulação de uma resposta antitumoral de CTL contra células tumorais que expressam esse antigénio tumoral e preferivelmente apresentando esse antigénio tumoral com o MHC de classe I. 0 termo "imunogenicidade" refere-se à efectividade relativa de um antigénio para induzir uma reacção imunitária. 0 termo "patogénio" refere-se a microorganismos patogénicos e compreende virus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e parasitas. São exemplos de virus patogénicos o virus da imunodeficiência humana (HIV), o citomegalovirus (CMV), o virus do herpes (HSV), o virus da hepatite A (HAV), HBV, HCV, o papilomavirus, e o virus linfotrófico T humano (HTLV). Os organismos unicelulares compreendem plasmódios tripanossomas, amibas, etc.

Os exemplos de antigénios que podem ser utilizados na presente invenção são p53, ART-4, BAGE, ss-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, GaplOO, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ou hTRT) , LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferivelmente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ou MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor BCR-abL, Plac-1, Pml/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RUI ou RU2, SAGE, SART-1 ou SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE e WT, preferivelmente WT-1. "Uma porção ou fragmento de um antigénio" ou "um péptido antigénico", de acordo com a invenção, é preferivelmente uma representação incompleta de um antigénio e é capaz de eliciar uma resposta imunitária contra o antigénio.

Neste contexto, a invenção também faz uso de péptidos compreendendo sequências de aminoácidos derivadas de antigénios, também aqui denominados "péptidos antigénicos". Por "péptido antigénico", ou "péptido antigénico derivado de um antigénio" entenda-se um oligopéptido ou um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que substancialmente corresponde à sequência de aminoácidos de um fragmento ou péptido de um antigénio. Um péptido antigénico pode ser de qualquer comprimento.

Preferivelmente, os péptidos antigénicos são capazes de estimular uma resposta imunitária, preferivelmente uma resposta celular contra o antigénio ou células caracterizadas pela expressão do antigénio e preferivelmente pela apresentação do antigénio. Preferivelmente, um péptido antigénico é capaz de estimular uma resposta celular contra uma célula caracterizada pela apresentação de um antigénio com o MHC de classe I e preferivelmente é capaz de estimular CTL responsivos ao antigénio. Preferivelmente, os péptidos antigénicos de acordo com a invenção são péptidos apresentados pelo MHC de classe I e/ou de classe II ou podem ser processados para produzir péptidos apresentados pelo MHC de classe I e/ou de classe II. Preferivelmente, os péptidos antigénicos compreendem uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de um antigénio. Preferivelmente, o referido fragmento de um antigénio é um péptido apresentado pelo MHC de classe I e/ou de classe II. Preferivelmente, um péptido antigénico de acordo com a invenção compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos deste fragmento e é processado para produzir esse fragmento, i.e., um péptido apresentado pelo MHC de classe I e/ou de classe II derivado de um antigénio.

Se um péptido antigénico vai ser apresentado directamente, i.e., sem processamento, em particular sem clivagem, possui um comprimento que é adequado para ligação a uma molécula do MHC, em particular uma molécula do MHC de classe I, e preferivelmente tem 7-20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 7-12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 8-11 aminoácidos de comprimento, em particular 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. Preferivelmente a sequência de um péptido antigénico que vai ser apresentado directamente é derivada da sequência de aminoácidos de um antigénio, i.e., a sua sequência corresponde substancialmente e é preferivelmente completamente idêntica a um fragmento de um antigénio.

Se um péptido antigénico vai ser apresentado após processamento, em particular após clivagem, o péptido produzido por processamento tem um comprimento que é adequado para ligação a uma molécula do MHC, em particular uma molécula do MHC de classe I, e preferivelmente tem 7-20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 7-12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 8-11 aminoácidos de comprimento, em particular 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. Preferivelmente, a sequência do péptido que vai ser apresentado após processamento é derivada da sequência de aminoácidos de um antigénio, i.e., a sua sequência substancialmente corresponde e é preferivelmente completamente idêntica a um fragmento de um antigénio. Assim, um péptido antigénico de acordo com a invenção numa concretização compreende uma sequência de 7-20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 7-12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 8-11 aminoácidos de comprimento, em particular 9 ou 10 aminoácidos de comprimento, que substancialmente corresponde e é preferivelmente completamente idêntica a um fragmento de um antigénio e após processamento do péptido antigénico constitui o péptido apresentado. Contudo, o péptido antigénico pode também compreender uma sequência que substancialmente corresponde e preferivelmente é completamente idêntica a um fragmento de um antigénio que é ainda mais longo do que a sequência acima indicada. Numa concretização, um péptido antigénico pode compreender a totalidade da sequência de um antigénio.

Os péptidos que possuem sequências de aminoácidos substancialmente correspondentes a uma sequência de um péptido que é apresentado pelo MHC de classe I podem diferir em um ou mais resíduos que não são essenciais para o reconhecimento pelo TCR do péptido como apresentado pelo MHC de classe I, ou para a ligação do péptido ao MHC. Estes péptidos substancialmente correspondentes são também capazes de estimular um CTL responsivo ao antigénio. Os péptidos possuindo sequências de aminoácidos que diferem de um péptido apresentado em resíduos que não afectam o reconhecimento pelo TCR mas melhoram a estabilidade da ligação ao MHC podem melhorar a imunogenicidade do péptido antigénico, e podem ser referidos aqui como "péptido optimizado". Utilizando conhecimento existente sobre qual destes resíduos pode mais provavelmente afectar a ligação quer ao MHC quer ao TCR, pode ser empregue uma abordagem racional ao desenho de péptidos substancialmente correspondentes. Os péptidos resultantes que são funcionais estão contemplados como péptidos antigénicos. 0 "processamento de antigénios" refere-se à degradação de um antigénio em fragmentos (e.g., a degradação de uma proteína em péptidos) e à associação de um ou mais destes fragmentos (e.g., através de ligação) a moléculas do MHC para apresentação por "células apresentadoras de antigénio" a células T específicas.

Por "CTL responsivo ao antigénio" entenda-se uma célula T CD8+ que é responsiva a um antigénio ou a um péptido derivado do referido antigénio, que é apresentado com o MHC de classe I sobre a superfície de células apresentadoras de antigénio.

De acordo com a invenção, a responsividade dos CTL pode incluir fluxo sustentado de cálcio, divisão celular, produção de citóquinas tais como IFN- e TNF- , supra-regulação de marcadores de activação tais como CD44 e CD69, e morte citolítica específica de células alvo que expressam o antigénio tumoral. A responsividade dos CTL pode também ser determinada utilizando um repórter artificial que indica com exactidão a responsividade dos CTL. A expressão "indução de uma resposta imunitária" no contexto da presente invenção refere-se preferivelmente à indução de uma resposta imunitária celular assim como humoral. A resposta imunitária pode ser protectora/ preventiva/ profiláctica e/ou terapêutica. A resposta imunitária pode ser dirigida contra qualquer imunogénio ou antigénio ou péptido antigénico, preferivelmente contra um antigénio associado a cancro ou um antigénio associado a patogénios. "Indução" neste contexto pode significar que não havia resposta imunitária contra um antigénio ou patogénio particulares antes da indução, mas pode também significar que havia um certo nível de resposta imunitária contra um antigénio ou patogénio particulares antes da indução e após a indução a referida resposta imunitária é melhorada. Assim, "indução da resposta imunitária" neste contexto também inclui "melhoria da resposta imunitária". Preferivelmente, após a indução de uma resposta imunitária num indivíduo, o referido indivíduo está protegido contra o desenvolvimento de uma doença tal como uma doença infecciosa ou uma doença cancerosa ou a condição de doença é melhorada pela indução de uma resposta imunitária.

Numa "resposta imunitária celular" ou uma "resposta celular contra um antigénio" pretende-se incluir uma resposta celular dirigida a células caracterizadas pela apresentação de um antigénio com o MHC de classe I ou de classe II. A resposta celular refere-se a células denominadas células T ou linfócitos T que actuam como 'auxiliares' ou 'assassinas'. As células T auxiliares (também denominadas células T CD4+) desempenham um papel central regulando a resposta imunitária e as células assassinas (também denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ ou CTL) matam células doentes tais como células tumorais, prevenindo a produção de mais células doentes.

Os termos "vacinação" e "imunização" referem-se ao procedimento de administração de um ou mais imunogénio(s) ou antigénio (s) ou seus derivados, em particular na forma de ARN que os codifica, como aqui descrito, a um indivíduo e estimulação de uma resposta imunitária contra os referidos um ou mais imunogénio(s) ou antigénio(s) ou células caracterizadas pela apresentação dos referidos um ou mais imunogénio(s) ou antigénio(s). A expressão "reacção imunitária" é aqui utilizada com o seu significado convencional e compreende imunidade humoral e celular. Uma reacção imunitária compreende uma ou mais reacções seleccionadas do grupo que consiste no desenvolvimento de anticorpos contra um ou mais antigénios e na expansão de linfócitos T específicos para o antigénio, preferivelmente linfócitos T CD4+ e CD8+, mais preferivelmente linfócitos T CD8+, que podem ser detectados em vários testes de proliferação ou produção de citóquinas in vitro.

Por "célula caracterizada pela apresentação de um antigénio" ou "célula apresentadora de um antigénio" ou "moléculas do MHC que apresentam um antigénio sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio" ou expressões similares, entenda-se uma célula tal como uma célula doente, em particular uma célula tumoral, ou uma célula apresentadora de antigénio que apresenta o antigénio ou um péptido antigénico, directamente ou após processamento, no contexto de moléculas do MHC, preferivelmente moléculas do MHC de classe I e/ou do MHC de classe II, o mais preferivelmente moléculas do MHC de classe I. 0 termo "imunoterapia" refere-se a um tratamento que envolve a activação de uma reacção imunitária especifica. No contexto da presente invenção, termos como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" ou "protector", referem-se à prevenção ou tratamento, ou ambos, da ocorrência e/ou da propagação de um tumor ou de um patogénio num indivíduo. Uma administração profiláctica de uma composição de vacina pode proteger o beneficiário contra o desenvolvimento de crescimento tumoral ou de uma infecção por um patogénio. Uma administração terapêutica de uma composição de vacina ou imunoterapia podem proteger o indivíduo, por exemplo, contra a disseminação ou a metástase de tumores existentes. 0 termo "adjuvante" refere-se a compostos que, quando administrados em combinação com um antigénio ou um péptido antigénico a um indivíduo, prolongam ou melhoram ou aceleram a resposta imunitária. No contexto da presente invenção, ARN pode ser administrado com quaisquer adjuvantes. Assume-se que os adjuvantes exercem a sua actividade biológica através de um ou mais mecanismos, incluindo um aumento da superfície do antigénio, um prolongamento da retenção do antigénio no corpo, um retardamento da libertação do antigénio, direccionamento do antigénio para macrófagos, aumento da assimilação do antigénio, melhoramento do processamento do antigénio, estimulação da libertação de citóquinas, estimulação e activação de células imunitárias tais como células B, macrófagos, células dendríticas, células T e activação inespecífica de células imunitárias. Os adjuvantes compreendem um grupo heterogéneo de compostos tais como emulsões em óleo (e.g., adjuvantes de Freund), compostos minerais (tais como alúmen), produtos bacterianos (tais como toxina de Bordetella pertussis) , lipossomas e complexos imunoestimulantes. São exemplos de adjuvantes o monofosforil-lípido-A (MPL SmithKline Beecham). As saponinas como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline

Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 e QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adjuvantes incompletos de Freund, adjuvantes completos de Freund, vitamina E, montanide, alúmen, oligonucleótidos CpG (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), e várias emulsões de água-em-óleo que são preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis tais como esqualeno e/ou tocoferol.

Os termos tais como "aumento", "melhoramento" ou "prolongamento", preferivelmente referem-se a um aumento, melhoramento ou prolongamento de cerca de pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, e o mais preferivelmente pelo menos 100%. Estes termos podem também referir-se a circunstâncias, em que no tempo zero não há nenhum sinal detectável de um determinado composto ou condição e num ponto temporal particular posterior ao tempo zero há um sinal detectável de um determinado composto ou condição. "Células apresentadoras de antigénio" (APC) são células que apresentam fragmentos peptídicos de proteínas antigénicas em associação com moléculas do MHC sobre a sua superfície celular. Algumas APC podem activar células T específicas do antigénio. As APC podem ser divididas em APC profissionais e não profissionais. Por exemplo, as APC profissionais compreendem células dendríticas, macrófagos, monócitos, células B, microglia, etc. No contexto da presente invenção, as APC são preferivelmente células apresentadoras de antigénio profissionais. No contexto da presente invenção, as APC são preferivelmente imaturas. Assim, no contexto da presente invenção, as APC são preferivelmente seleccionadas do grupo que consiste em células dendríticas imaturas, macrófagos imaturos, monócitos imaturos, microglia imatura, e células B imaturas, e são preferivelmente células dendríticas imaturas. Subconjuntos de células dendríticas imaturas (iDC) ou células dendríticas maduras (mDC) compreendem, e.g., células dendríticas mielóides (my-DC), células dendríticas plasmacitóides (pDC), células dendríticas derivadas de monócitos (mo-DC) e células dendríticas derivadas de células progenitoras hematopoiéticas (hp-DC). Numa concretização preferida, as APC de acordo com a presente invenção são de mamífero, preferivelmente humanas, de ratinho ou de rato.

As células dendríticas compreendem uma população heterogénea de células possuindo uma morfologia específica e uma distribuição nos tecidos amplamente disseminada. Steinman (1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 271-296) proporcionam uma revisão sobre o sistema de células dendríticas e o seu papel no sistema imunitário. As células dendríticas exibem a capacidade de sensibilizar células T restritas pelo MHC e são muito eficazes na apresentação de antigénios a células T. Os termos "células dendríticas" ou "DC" referem-se a membros de uma população diversa de tipos de células morfologicamente similares, que estão localizadas em tecidos linfóides ou não linfóides. As células dendríticas são e.g. derivadas de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea. Estas células progenitoras inicialmente transformam-se em células dendríticas imaturas. As células dendríticas imaturas podem ser encontradas no sangue periférico e no sangue do cordão e no sistema linfático tal como no timo e nos nódulos linfáticos. Estas células são caracterizadas por elevada actividade endocítica e baixo potencial de activação de células T. As células dendríticas imaturas amostram constantemente o ambiente circundante quanto a patogénios tais como vírus e bactérias. Isto é realizado tanto através de mecanismos mediados por receptores como de mecanismos independentes de receptores (e.g. macropinocitose) . Receptores de reconhecimento de padrões (PRR, do inglês "Pattern recognition receptor") tais como os receptores do tipo Toll (TLR, do inglês "toll-like receptor") reconhecem assinaturas químicas específicas encontradas em subconjuntos de patogénios. As células dendríticas imaturas podem também fagocitar pequenas quantidades de membrana das próprias células vivas, num processo denominado "nibbling". Uma vez que tenham entrado em contacto com um antigénio apresentável, ficam activadas em células dendríticas maduras. As células dendríticas imaturas fagocitam patogénios e degradam as suas proteínas em pequenos pedaços e por maturação apresentam esses fragmentos na sua superfície celular utilizando moléculas do MHC. Simultaneamente, supra-regulam receptores da superfície celular que actuam como co-receptores na activação de células T tais como CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) e CD40, aumentando grandemente a capacidade de activar células T. Também supra-regulam o CCR7, um receptor quimiotáctico que induz a célula dendrítica a viajar através da corrente sanguínea para o baço ou através do sistema linfático para um nódulo linfático. Ai actuam como células apresentadoras de antigénio: activam células T auxiliares e células T assassinas assim como células B por apresentando-se com antigénios derivados do patogénio, juntamente com sinais co-estimulantes não específicos do antigénio. As células dendriticas são as mais potentes de todas as células apresentadoras de antigénio e são capazes de activar tanto células T com memória como naive. Mostrou-se que activadas, as células dendriticas maduras proporcionam os sinais necessários para a activação e a proliferação de células T. Estes sinais podem ser categorizados em dois tipos. 0 primeiro tipo, que dá especificidade à resposta imunitária, é mediado através da interacção entre o complexo receptor de células T/CD3 ("TCR/CD3") e um péptido antigénico apresentado por uma proteína do complexo principal de histocompatibilidade ("MHC") de classe I ou II sobre a superfície de APC. 0 segundo tipo de sinal, denominado um sinal co-estimulante, não é específico do antigénio nem restrito pelo MHC, e pode conduzir a uma resposta de proliferação completa de células T e indução de funções efectoras de células T na presença do primeiro tipo de sinais. Esta sinalização dupla pode, portanto, resultar numa resposta imunitária vigorosa. As diferentes linhagens e graus de maturação de células dendriticas podem ser distinguidos pela sua morfologia particular, capacidade fagocítica/ endocítica, e pelo seu grau de expressão de superfície de MHC de classe II e pela capacidade de apresentar antigénios a células T, em particular a células T naive. Os marcadores típicos para células dendriticas imaturas são: MHC II é detectável, CD86 é detectável, e em particular CD83 é negativo.

Tipicamente, para gerar células dendriticas imaturas, é necessário primeiro purificar ou enriquecer os precursores monocíticos a partir de outros tipos de células contaminantes presentes no sangue. Isto é vulgarmente realizado através da aderência dos precursores monocíticos a uma superfície de plástico (poliestireno), pois os monócitos têm uma maior tendência para aderir ao plástico do que outras células encontradas em, por exemplo, sangue periférico, tais como linfócitos e células assassinas naturais (NK) . Após remover substancialmente as células contaminantes por lavagem vigorosa, os monócitos são cultivados com citóquinas que convertem os precursores monocíticos em células dendríticas imaturas. Os métodos para diferenciação das células precursoras monocíticas em células dendríticas imaturas foram pela primeira vez descritos por Sallusto e Lanzavecchia (J. Exp. Med., 179:1109-1118, 1994), que utilizaram as citóquinas GM-CSF e IL-4 para induzir a diferenciação dos monócitos em células dendríticas imaturas. Embora esta combinação de citóquinas seja mais tipicamente utilizada, várias outras combinações foram descritas para cumprir os mesmos objectivos, tais como substituir IL-4 por IL-13 ou IL-15. O resultado final deste processo é uma célula "velada", que expressa moléculas co-estimulantes de células T, assim como níveis detectáveis de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), mas não expressa o marcador de maturação de células dendríticas CD83. Estas células são similares às células de Langerhans na pele, e a sua principal função fisiológica é capturar microorganismos invasores. As variações a este método incluem diferentes métodos de purificação dos monócitos, incluindo, por exemplo, filtração de fluxo tangencial (TFF), ou por ligação de anticorpos ligados a contas a moléculas de superfície nos monócitos. As contas com as células ligadas são depois concentradas numa coluna, ou numa superfície magnética, de modo que as células contaminantes podem ser lavadas, após o que os monócitos são eluídos das contas. Em ainda outro método para obter precursores de células dendríticas, são purificadas células que expressam o marcador de 'células estaminais CD34, a partir do sangue (Pat. U.S. 5,994,126) ou da medula óssea. Estas células podem ser cultivadas com a citóquina essencial GM-CSF para se diferenciarem em células dendríticas imaturas.

Estas células dendríticas aparentemente têm características e propriedades funcionais muito similares às células dendríticas imaturas geradas a partir de monócitos. As células dendríticas imaturas têm uma elevada capacidade de assimilação e processamento do antigénio, mas têm uma capacidade limitada para iniciar respostas imunitárias. A capacidade para iniciar uma resposta imunitária é adquirida por maturação das células dendríticas imaturas. Esta maturação é também referida como activação das células dendríticas. O processo de maturação é iniciado através do contacto com citóquinas indutoras de maturação, produtos bacterianos ou componentes virais, e similares.

Preferivelmente, as células dendríticas imaturas são células dendríticas imaturas derivadas de monócitos que podem ser geradas in vitro a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas a partir de PBMC na presença de citóquinas tais como o factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina (IL-4) na ausência de um agente de maturação tal como lipopolissacárido ou factor de necrose tumoral- (TNF- ). Numa concretização, a célula dendrítica imatura é uma célula dendrítica imatura derivada de monócitos obtida ou obtenível por cultura de monócitos de sangue periférico na presença de uma ou mais citóquinas tais como GM-CSF e/ou IL-4 durante pelo menos cerca de 3 dias ou pelo menos cerca de 7 dias. Por exemplo, o plaqueamento de PBMC num balão de cultura de tecidos permite a aderência de monócitos. 0 tratamento destes monócitos com IL-4 e GM-CSF conduz a diferenciação em células dendríticas imaturas em cerca de uma semana. 0 subsequente tratamento com TNF- diferencia adicionalmente as células dendríticas imaturas em células dendríticas maduras. No contexto da presente invenção, as células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas a partir de células estaminais hematopoiéticas (células CD34+) ou podem ser purificadas a partir de um indivíduo utilizando leucaferese.

As células dendríticas maduras podem ser identificadas pela sua alteração de morfologia, pela sua não aderência, e pela presença de um ou mais marcadores. Estes marcadores incluem, mas não se lhes limitando, marcadores da superfície celular tais como CD83, CD86, CD40, CD80 e MHC de classe II. Os marcadores típicos para células dendríticas maduras (mDC) são: CD83 é detectável e níveis de MHC II assim como de CD86 estão aumentados comparativamente com células dendríticas imaturas (iDC) . Alternativamente, a maturação pode ser identificada observando ou medindo a produção de citóquinas, tais como citóquinas pró-inflamatórias. As células dendríticas maduras podem ser recolhidas e analisadas utilizando citofluorografia típica e técnicas e dispositivos de selecção de células, tal como selecção de células activada por fluorescência (FACS, do inglês "fluorescence activated cell sorter") . Anticorpos específicos para antigénios da superfície celular de células dendriticas maduras estão comercialmente disponíveis. A expressão "péptido de ligação ao MHC" refere-se a um péptido que se liga a uma molécula do MHC de classe I e/ou do MHC de classe II. No caso de complexos MHC de classe I/péptido, os péptidos de ligação têm tipicamente 8-10 aminoácidos de comprimento embora possam ser eficazes péptidos mais longos ou mais curtos. No caso de complexos MHC de classe II/péptido, os péptidos de ligação têm tipicamente 10-25 aminoácidos de comprimento e têm em particular 13-18 aminoácidos de comprimento, embora possam ser eficazes péptidos mais longos e mais curtos. A expressão "complexo de histocompatibilidade maduro" e a abreviatura "MHC" incluem moléculas do MHC de classe I e do MHC de classe II e refere-se a um complexo de genes que ocorre em todos os vertebrados. As proteínas ou moléculas do MHC são importantes para a sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antigénio em reacções imunitárias normais, em que as proteínas ou moléculas do MHC se ligam a péptidos e os apresentam para reconhecimento por receptores de células T. A expressão "células efectoras imunitárias", no contexto da presente invenção, refere-se a células que exercem funções efectoras durante uma reacção imunitária. As "células efectoras imunitárias" preferivelmente são capazes de se ligar a um antigénio ou a uma célula caracterizada por apresentação de um antigénio e mediar uma resposta imunitária. Por exemplo, estas células segregam citóquinas e/ou quimioquinas, matam micróbios, segregam anticorpos, reconhecem células infectadas ou cancerosas, e opcionalmente eliminam essas células. Por exemplo, as células efectoras imunitárias compreendem células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes tumorais), células B, células assassinas naturais, neutrófilos, macrófagos e células dendriticas. Preferivelmente, no contexto da presente invenção, "células efectoras imunitárias" são células T, preferivelmente células CD4+ e/ou CD8+.

Preferivelmente, uma "célula efectora imunitária" reconhece um antigénio ou um péptido antigénico derivado do referido antigénio com algum grau de especificidade, em particular se apresentado no contexto de moléculas do MHC tal como na superfície de células apresentadoras de antigénio ou células doentes tais como células tumorais. Preferivelmente, o referido reconhecimento permite a célula que reconhece um antigénio ou um péptido antigénico derivado do referido antigénio seja responsiva. Se a célula é uma célula T auxiliar (célula T CD4+) portadora de receptores que reconhecem um antigénio ou um péptido antigénico derivado do referido antigénio no contexto de moléculas do MHC de classe II, essa responsividade pode envolver a libertação de citóquinas e/ou a activação de linfócitos CD8+ (CTL) e/ou células B. Se a célula é um CTL essa responsividade pode envolver a eliminação de células apresentadas no contexto de moléculas do MHC de classe I, i.e., células caracterizadas pela apresentação de um antigénio com o MHC de classe I, por exemplo, através de apoptose ou lise celular mediada por perforina. Estes CTL que reconhecem um antigénio ou um péptido antigénico derivado do referido antigénio e são responsivos são também aqui denominados "CTL responsivos ao antigénio". Se a célula é uma célula B essa responsividade pode envolver a libertação de imunoglobulinas. 0 termo "semivida" refere-se ao período de tempo que é necessário para eliminar metade da actividade, da quantidade ou do número de moléculas. No contexto da presente invenção, a semivida de um ARN é indicativa da estabilidade do referido ARN.

Os termos "paciente", "indivíduo" ou "animal" referem-se a mamíferos. Por exemplo, mamíferos, no contexto da presente invenção, são seres humanos, primatas não humanos, animais domesticados tais como cães, gatos, ovelhas, gado-vacum, cabras, porcos, cavalos, etc., animais de laboratório tais como ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, etc. assim como animais em cativeiro tais como animais de jardins zoológicos. 0 termo "animal", como aqui se utiliza, também inclui seres humanos.

De acordo com a invenção, os termos "tumor" ou "doença tumoral" referem-se a um intumescimento ou uma lesão formados por um crescimento anormal de células (denominadas células neoplásicas ou células tumorais). Por "célula tumoral" entenda-se uma célula anormal que cresce através de uma proliferação celular rápida, descontrolada, e continua a crescer após os estímulos que iniciaram o novo crescimento terem cessado. Os tumores apresentam ausência parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e usualmente formam uma massa de tecido distinta, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.

Preferivelmente, uma doença tumoral de acordo com a invenção é uma doença cancerosa, i.e., uma doença maligna, e uma célula tumoral é uma célula cancerosa. Preferivelmente, uma doença tumoral é caracterizada por células em que um antigénio, i.e., um antigénio tumoral, é expresso ou anormalmente expresso. Preferivelmente, uma doença tumoral ou uma célula tumoral são caracterizadas pela apresentação de um antigénio tumoral com o MHC de classe I. "Expressão anormal" significa, de acordo com a invenção, que a expressão está alterada, preferivelmente aumentada, comparativamente com o seu estado num indivíduo saudável. Um aumento na expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Numa concretização, a expressão é apenas encontrada num tecido doente, enquanto a expressão num tecido saudável é reprimida.

Preferivelmente, uma doença tumoral de acordo com a invenção é cancro, em que o termo "cancro", de acordo com a invenção, compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cancro rectal, cancro endometrial, cancro renal, cancro supra-renal, cancro da tiróide, cancro sanguíneo, cancro da pele, cancro do cérebro, cancro cervical, cancro intestinal, cancro do fígado, cancro do cólon, cancro do estômago, cancro do intestino, cancro da cabeça e pescoço, cancro gastrointestinal, cancro dos nódulos linfáticos, cancro do esófago, cancro colorrectal, cancro do pâncreas, cancro do ouvido, nariz e garganta (ONG), cancro da mama, cancro da próstata, cancro do útero, cancro ovariano e cancro do pulmão e suas metástases. Os seus exemplos são carcinomas do pulmão, carcinomas da mama, carcinomas da próstata, carcinomas do cólon, carcinomas de células renais, carcinomas cervicais, ou metástases dos tipos de cancro ou tumores descritos acima. O termo "cancro", de acordo com a invenção, também compreende metástases de cancro.

As composições de acordo com a presente invenção são geralmente aplicadas em "quantidades farmaceuticamente aceitáveis" e em "preparações farmaceuticamente aceitáveis". Estas composições podem conter sais, tampões, agentes conservantes, transportadores e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Os "sais farmaceuticamente aceitáveis" compreendem, por exemplo, sais de adição de ácido que podem, por exemplo, ser formados por mistura de uma solução de compostos com uma solução de um ácido farmaceuticamente aceitável tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzóico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico ou ácido fosfórico. Além disso, quando o composto possui uma porção ácida, os seus sais farmaceuticamente aceitáveis adequados podem incluir sais de metais alcalinos (e.g., sais de sódio ou potássio); sais de metais alcalino-terrosos (e.g., sais de cálcio ou magnésio); e sais formados com ligandos orgânicos adequados (e.g., catiões de amónio, amónio quaternário e amina formados utilizando contra-aniões tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilsulfonato e arilsulfonato). Os exemplos ilustrativos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se lhes limitando, acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bissulfato, bitartarato, borato, brometo, butirato, edetato de cálcio, canforato, canforsulfonato, camsilato, carbonato, cloreto, citrato, clavulanato, ciclopentanopropionato, digluconato, dicloridrato, dodecilsulfato, edetato, edisilato, estolato, esilato, etanossulfonato, formiato, fumarato, gluceptato, gluco-heptonato, gluconato, glutamato, glicerofosfato, glicolilarsanilato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromidrato, cloridrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, hidroxinaftoato, iodeto, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, laurilsulfato, malate, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanossulfonato, metilsulfato, mucato, 2-naftalenossulfonato, napsilato, nicotinato, nitrato, sal de amónio de N-metilglucamina, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato/difosfato, picrato, pivalato, poligalacturonato, propionato, salicilato, estearato, sulfato, subacetato, succinato, tanato, tartarato, teoclato, tosilato, trietiodeto, undecanoato, valerato, e similares (veja-se, por exemplo, S.M. Berge et al. , "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)) .

Com o termo "excipiente", quando aqui utilizado, pretende-se indicar todas as substâncias numa formulação farmacêutica que não são ingredientes activos tais como, e.g., transportadores, aglutinantes, lubrificantes, espessantes, agentes superficialmente activos, conservantes, emulsionantes, tampões, agentes aromatizantes ou corantes.

As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um transportador farmaceuticamente aceitável. A expressão "transportador farmaceuticamente aceitável", no contexto da presente invenção, refere-se a um ou mais enchimentos ou diluentes, sólidos ou líquidos, compatíveis, que são adequados para uma administração a um ser humano. 0 termo "transportador" refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, que está combinado com um componente activo de modo a facilitar a aplicação do componente activo. Preferivelmente, os componentes transportadores são líquidos estéreis tais como água ou óleos, incluindo aqueles que são derivados de óleo mineral, animais ou plantas, tais como óleo de amendoim, óleo de feijão de soja, óleo de sésamo, óleo de girassol, etc. As soluções de sais e dextrose aquosa e glicerina podem também ser utilizadas como compostos transportadores aquosos.

De acordo com a presente invenção, as composições são administradas numa quantidade terapeuticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que - sozinha ou em combinação com mais dosagens - resulta numa reacção pretendida ou num efeito pretendido. No caso da terapia de uma doença particular ou de uma condição particular, a reacção pretendida refere-se à inibição da progressão da doença. Isto compreende a desaceleração da progressão da doença, em particular uma ruptura da progressão da doença. A reacção pretendida para uma terapia de uma doença ou de uma condição pode também ser o retardamento da ocorrência ou a inibição da ocorrência da doença ou da condição. Uma quantidade eficaz da composição de acordo com a presente invenção depende da condição ou da doença, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo a idade, a condição fisiológica, altura e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia opcionalmente simultânea, da via de administração especifica, e factores similares. No caso de a reacção de um paciente ser insuficiente com uma dosagem inicial, podem ser aplicadas dosagens maiores (ou dosagens mais eficazes que podem ser conseguidas através de uma via de administração mais localizada). Em geral, para um tratamento ou para uma indução ou aumento de uma reacção imunitária num ser humano são formuladas e administradas preferivelmente dosagens do ARN na gama de 1 ng a 700 pg, 1 ng a 500 pg, 1 ng a 300 pg, 1 ng a 200 pg ou 1 ng a 100 pg.

No contexto da presente invenção, o termo "transcrição" refere-se a um processo, em que o código genético numa sequência de ADN é transcrito para ARN. Subsequentemente, o ARN pode ser traduzido numa proteína. De acordo com a presente invenção, o termo "transcrição" compreende "transcrição in vitro", em que o termo "transcrição in vitro" refere-se a um processo em que ARN, em particular ARNm, é sintetizado in vitro num sistema isento de células, preferivelmente utilizando extractos celulares apropriados. Preferivelmente, são aplicados vectores de clonagem para a geração de transcritos. Estes vectores de clonagem são geralmente designados por vectores de transcrição e, de acordo com a presente invenção, estão abrangidos no termo "vector". De acordo com a presente invenção, o ARN utilizado na presente invenção pode ser obtido por transcrição in vitro de um molde de ADN apropriado. O promotor para controlo da transcrição pode ser qualquer promotor para qualquer ARN-polimerase. São exemplos particulares de ARN-polimerases as ARN-polimerases de T7, T3 e SP6. Preferivelmente, a transcrição in vitro de acordo com a invenção é controlada por um promotor de T7 ou SP6. Um molde de ADN para transcrição in vitro pode ser obtido por clonagem de um ácido nucleico, em particular ADNc, e sua introdução num vector apropriado para transcrição in vitro. O ADNc pode ser obtido por transcrição inversa de ARN. O termo "expressão" é aqui utilizado no seu sentido mais lato e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteína. Com respeito ao ARN, o termo "expressão" ou "tradução" refere-se em particular á produção de péptidos ou proteínas. A expressão pode ser transiente ou pode ser estável. 0 termo "tradução", no contexto da presente invenção, refere-se a um processo no ribossoma em que uma cadeia de ARNm controla a montagem de uma sequência de aminoácidos para gerar uma proteína ou um péptido.

De acordo com a invenção, ARN será transferido para células apresentadoras de antigénio imaturas quer in vitro quer in vivo, e.g., por administração de ARN no sistema linfático, preferivelmente nos nódulos linfáticos. A este respeito, termos como "transferir" ou "transfectar" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se à introdução de ácidos nucleicos, em particular ácidos nucleicos exógenos ou heterólogos, em particular ARN, numa célula. De acordo com a presente invenção, qualquer técnica que seja adequada para transferir ARN para células pode ser utilizada para introduzir o ARN em células. Preferivelmente, o ARN é transfectado para células através de técnicas padrão. Estas técnicas compreendem a transfecção de precipitados de ácido nucleico com fosfato de cálcio, a transfecção de ácidos nucleicos que estão associados a DEAE, a transfecção ou infecção com vírus que são portadores dos ácidos nucleicos de interesse, a electroporação, a lipofecção e a micro-injecção. De acordo com a presente invenção, a administração de um ácido nucleico é conseguida quer sob a forma de ácido nucleico nu quer em combinação com um reaqente de administração. Preferivelmente, a administração de ácidos nucleicos é na forma de ácidos nucleicos nus. Preferivelmente, o ARN é administrado em combinação com substâncias estabilizantes tais como inibidores de ARNase. Numa concretização particularmente preferida, o ARN e/ou as composições da presente invenção, são administrados sob a forma de ARN nu preferivelmente por injecção intranodal. De acordo com a presente invenção, não é absolutamente necessária uma técnica convencional de transfecção para introduzir o ARN nu em células, preferivelmente em células apresentadoras de antigénio, preferivelmente células apresentadoras de antigénio imaturas, preferivelmente células dendríticas imaturas, pois, em particular células apresentadoras de antigénio imaturas como as células dendríticas imaturas, são capazes de assimilar o ARN nu por macropinocitose. Preferivelmente, a introdução de ARN que codifica um antigénio ou um péptido antigénico numa célula resulta na expressão do referido antigénio ou péptido antigénico na célula. Em concretizações particulares, prefere-se o direccionamento dos ácidos nucleicos para células particulares. Nestas concretizações, um transportador que é aplicado para a administração do ácido nucleico a uma célula (por exemplo, um retrovirus ou um lipossoma), exibe uma molécula de direccionamento. Por exemplo, uma molécula tal como um anticorpo que é especifico para uma proteína da membrana da superfície na célula alvo ou um ligando para um receptor na célula alvo, podem ser incorporados no transportador de ácido nucleico ou podem estar a ele ligados. No caso do ácido nucleico ser administrado através de lipossomas, as proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície que está associada a endocitose podem ser incorporadas na formulação de lipossomas de modo a permitir o direccionamento e/ou a assimilação. Essas proteínas abrangem proteínas da cápside ou seus fragmentos que são específicas para um tipo de células particular, anticorpos contra proteínas que são internalizadas, proteínas que têm como alvo uma localização intracelular, etc.

De acordo com a presente invenção, o termo "péptido" compreende oligo- e polipéptidos e refere-se a substâncias compreendendo dois ou mais, preferivelmente três ou mais, preferivelmente quatro ou mais, preferivelmente seis ou mais, preferivelmente oito ou mais, preferivelmente dez ou mais, preferivelmente 14 ou mais, preferivelmente 16 ou mais, preferivelmente 21 ou mais e até preferivelmente 8, 10, 20, 30, 40, ou 50, em particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por ligações peptídicas. O termo "proteína" refere-se a grandes péptidos, preferivelmente a péptidos com mais do que 100 resíduos de aminoácido, mas em geral os termos "péptidos" e "proteínas" são sinónimos e são utilizados aqui indiferentemente. A expressão "porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse" refere-se à fracção de moléculas do MHC sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio que estão carregadas com, i.e., estão ligadas a, um antigénio particular ou um péptido antigénico derivado do referido antigénio relativamente à quantidade total de moléculas do MHC sobre a superfície da célula. Numa concretização preferida, o ARN utilizado na presente invenção é capaz de aumentar a porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio para a qual o ARN foi transferido. Isto é em comparação com um ARN que não é portador do remate a 5' possuindo a estrutura de acordo com a fórmula (I), em particular, um ARN que é portador de um remate de ARN convencional. 0 termo "alquilo" refere-se a uma cadeia de carbonos saturada, linear ou ramificada. Preferivelmente, a cadeia compreende de 1 a 10 átomos de carbono, i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 4 átomos de carbono, e.g., metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo, iso-pentilo, sec-pentilo, neo-pentilo, 1,2-dimetilpropilo, iso-amilo, n-hexilo, iso-hexilo, sec-hexilo, n-heptilo, iso-heptilo, n-octilo, 2-etil-hexilo, n-nonilo e n-decilo. Os grupos alquilo estão opcionalmente substituídos. O termo "cicloalquilo", por si só ou em combinação com outros termos, representa, a menos que indicado em contrário, versões cíclicas de "alquilo" com preferivelmente 3 a 10 átomos de carbono, i. e., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos de carbono, preferivelmente 3 a 6 átomos de carbono, formando uma anel, preferivelmente ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclo-octilo, ciclononilo ou ciclodecilo. No termo "cicloalquilo" pretende-se também incluir as suas versões bicíclicas. Se foram formados anéis bicíclicos prefere-se que os respectivos anéis estejam ligados mutuamente em dois átomos de carbono adjacentes, contudo, alternativamente, os dois anéis estão ligados através do mesmo átomo de carbono, i. e. , formam um sistema de anel espiro ou formam sistemas de anel "em ponte". Os exemplos preferidos de cicloalquilo incluem cicloalquilo C3-C8, em particular ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclo-octilo, espiro[3,3]-heptilo, espiro[3,4]octilo, espiro[4,3]octilo, biciclo [4.1.0]-heptilo, biciclo[3.2.0 ] -heptilo, biciclo[2.2.1]-heptilo, biciclo[2.2.2]octilo, biciclo[5.1.0]octilo e biciclo[4.2.0]octilo. O termo "alcenilo", no contexto da presente invenção, refere-se a uma cadeia de carbonos insaturada olefínica, linear ou ramificada, com uma ou mais ligações duplas. Preferivelmente, a cadeia compreende de 2 a 10 átomos de carbono, i.e., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de carbono, preferivelmente 2 a 4 átomos de carbono. Por exemplo, um alcenilo pode ser vinilo, alilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1- hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 4-heptenilo, 5-heptenilo, 6-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 4-octenilo, 5-octenilo, 6-octenilo, 7-octenilo, 1-nonenilo, 2-nonenilo, 3-nonenilo, 4-nonenilo, 5-nonenilo, 6-nonenilo, 7-nonenilo, 8-nonenilo, 1-decenilo, 2-decenilo, 3-decenilo, 4-decenilo, 5-decenilo, 6-decenilo, 7-decenilo, 8-decenilo ou 9-decenilo. O termo "alcenilo", no contexto da presente invenção, também inclui "cicloalcenilo" que se refere a um grupo olefinico insaturado contendo um ou mais anéis com uma ou mais ligações duplas. Preferivelmente o anel cicloalcenilo compreende de 3 a 10 átomos de carbono, i. e., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, e.g., ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclo-hexenilo, ciclo-heptenilo, ciclo-octilo, espiro[3,3]-heptenilo, espiro[3,4]octenilo, espiro[4,3]octenilo, biciclo [ 4.1.0] -heptenilo, biciclo[3.2.0]-heptenilo, biciclo-[2.2.1]-heptenilo, biciclo[2.2.2]octenilo, biciclo[5.1.0]-octenilo ou biciclo[4.2.0]octenilo. O termo "alcinilo" no contexto da presente invenção refere-se a uma cadeia de carbonos insaturada linear ou ramificada com uma ou mais ligações triplas. Preferivelmente, a cadeia compreende de 2 a 10 átomos de carbono, i.e., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de carbono, preferivelmente 2 a 4 átomos de carbono. Os exemplos de alcinilo são etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 5-hexinilo, 1-heptinilo, 2-heptinilo, 3-heptinilo, 4-heptinilo, 5-heptinilo, 6-heptinilo, 1-octinilo, 2- octinilo, 3-octinilo, 4-octinilo, 5-octinilo, 6-octinilo, 7-octinilo, 1-nonililo, 2-noninilo, 3-noninilo, 4-noninilo, 5-noninilo, 6-noninilo, 7-noninilo, 8-noninilo, 1-decinilo, 2-decinilo, 3-decinilo, 4-decinilo, 5-decinilo, 6-decinilo, 7-decinilo, 8-decinilo ou 9-decinilo. O termo "heterociclilo" significa um grupo cicloalquilo como definido acima em que 1 a 3 átomos de carbono no anel estão substituídos por heteroátomos de 0, S, ou N. 0 termo "arilo" preferivelmente refere-se a uma estrutura de anel aromática contendo 5 a 14 átomos de carbono, por exemplo, fenilo, indenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 1-antrilo, 2-antrilo, 9-antrilo, 1-fenantrilo, 2-fenantrilo, 3-fenantrilo, 4-fenantrilo e 9-fenantrilo. Preferivelmente, "arilo" refere-se a um anel monocíclico contendo 6 átomos de carbono ou um sistema de anel aromático bicíclico contendo 10 átomos de carbono. Os exemplos preferidos são fenilo ou naftilo. 0 grupo arilo está opcionalmente substituído. 0 termo "heteroarilo" significa um grupo arilo como definido acima em que 1 a 3 átomos de carbono no anel estão substituídos por heteroátomos de 0, S ou N. Preferivelmente o termo refere-se a um anel monocíclico aromático de cinco ou seis membros em que 1 a 3 átomos de carbono estão substituídos pelo mesmo ou por diferentes heteroátomos de 0, N ou S. Alternativamente, significa um sistema de anel aromático bicíclico em que 1 a 3 átomos de carbono estão substituídos pelo mesmo ou por diferentes heteroátomos de 0, N, ou S. Os exemplos preferidos são furanilo, tienilo, oxazolilo, isoxazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, 1,2,3-triazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,5- tiadiazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,2,4-triazinilo, 1,3,5-triazinilo, 1-benzofuranilo, 2-benzofuranilo, indolilo, isoindolilo, benzotienilo, 2-benzotienilo, lH-indazolilo, benzimidazolilo, benzoxazolilo, indoxazinilo, 2,1-benzisoxazolilo, benzotiazolilo, 1,2-benzisotiazolilo, 2,1-benzisotiazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, 2,3- benzodiazinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, 1,2,3- benzotriazinilo ou 1,2,4-benzotriazinilo. 0 termo "halogéneo" no contexto da presente invenção significa fluoro, cloro, bromo ou iodo, preferivelmente fluoro. 0 termo "alcoxi" refere-se ao grupo -0R, onde R é alquilo, arilo ou cicloalquilo e pode incluir metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, pentoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi ou deciloxi. A expressão "opcionalmente substituído" indica que um ou mais átomos de hidrogénio estão substituídos por um grupo diferente de hidrogénio tal como halogéneo, alquilo, cicloalquilo, halogenoalquilo, amino, alquilamino, hidroxi, alcoxi, halogenoalcoxi, arilo e heteroarilo e similares. Os substituintes opcionais podem, eles próprios, estar substituídos com substituintes tais como halogéneo, em particular fluoro. 0 termo "hidroxi" refere-se ao grupo -OH. 0 termo "halogenoalquilo" refere-se a um grupo alquilo ou cicloalquilo substituído com um ou mais halogéneos (e.g., trifluorometilo). 0 termo "halogenoalcoxi" refere-se ao grupo -OR, onde R é alquilo, arilo ou cicloalquilo substituídos com um ou mais halogéneos. 0 termo amino refere-se ao grupo -NH2. 0 termo "alquilamino" refere-se ao grupo -NR'R onde R é hidrogénio, alquilo, arilo ou cicloalquilo e onde R' é alquilo, arilo ou cicloalquilo. 0 termo "acilamino" refere-se ao grupo -NRC(0)R onde cada R é independentemente hidrogénio, alquilo, arilo ou heteroarilo. 0 termo "carbonilo" refere-se ao grupo C=0 em que o carbono pode fazer parte de uma cadeia alquilo ou de um sistema de anel. A frase "a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA" significa que um átomo de fósforo compreendendo o substituinte R5 e possuindo um centro quiral, e portanto susceptível de existir em qualquer uma de duas configurações estereoquímicas, está presente em predominantemente uma configuração estereoquímica pretendida, i . e., a do átomo P do diastereoisómero D1 de beta-S-ARCA. Como pode ser o caso do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA este pode estar na configuração (R) ou na configuração (S). Preferivelmente, mais de 50 porcento do grupo de interesse tem a configuração estereoquimica pretendida, preferivelmente pelo menos 75 porcento do grupo de interesse tem a configuração estereoquimica pretendida, mais preferivelmente pelo menos 90 porcento do grupo de interesse tem a configuração estereoquimica pretendida, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 porcento do grupo de interesse tem a configuração estereoquimica pretendida, e o mais preferivelmente pelo menos 99 porcento do grupo de interesse tem a configuração estereoquimica pretendida. O "diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA" ou "beta-S-ARCA (Dl)" é o diastereoisómero de beta-S-ARCA que elui primeiro numa coluna de HPLC comparativamente com o diastereoisómero D2 de beta-S-ARCA (beta-S-ARCA(D2)) e desse modo exibe um menor tempo de retenção. A HPLC preferivelmente é uma HPLC analítica. Numa concretização, utiliza-se uma coluna Supelcosil LC-18-T RP, preferivelmente com o formato: 5 pm, 4, 6 x 250 mm para a separação, onde se pode aplicar um caudal de 1,3 ml/min. Numa concretização, utiliza-se um gradiente de metanol em acetato de amónio, por exemplo, um gradiente linear de 0-25% de metanol em acetato de amónio 0,05 M, pH = 5,9, em 15 min. Pode-se realizar detecção de UV (VWD) a 260 nm e pode-se realizar detecção de fluorescência (FLD) com excitação a 280 nm e detecção a 337 nm.

Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que o ARN que está modificado de forma a conter uma estrutura de remate a 5' especifica, em particular uma estrutura de remate a 5' com fosforotioato, que exibe uma configuração estereoquimica particular no átomo P que quando faz parte de um grupo fosforotioato e não de um grupo fosfodiéster diminui a susceptibilidade à degradação por Dcp2, i.e., o átomo P se n na fórmula (I) é 1, o átomo P se n na fórmula (I) é 2, ou o átomo P se n na fórmula (I) é 3, a configuração estereoquimica particular no átomo P correspondente à configuração estereoquimica no átomo P do análogo de remate a 5' beta-S-ARCA (Dl), possui estabilidade aumentada e portanto também exibe expressão aumentada, em particular em células apresentadoras de antigénio imaturas, particularmente em células dendríticas imaturas. A presente invenção refere-se à modificação de ARN, preferivelmente ARNm, para aumentar a estabilidade do referido ARN, preferivelmente em células imunitárias, mais preferivelmente em células imunitárias imaturas, ainda mais preferivelmente em células apresentadoras de antigénio imaturas, e o mais preferivelmente em células dendriticas imaturas. 0 ARN modificado descrito na presente invenção é particularmente útil para vacinação com ARN. "ARN que está modificado com uma estrutura de remate a 5'" significa ARN ao qual está ligada uma estrutura de remate a 5' de modo a resultar um ARN modificado em que uma guanosina da estrutura de remate se torna parte do ARN e uma guanosina modificada da estrutura de remate está ligada ao ARN através de uma ligação trifosfato 5' para 5' ou uma ligação trifosfato modificada. Assim, esse ARN modificado pode ter, por exemplo, a fórmula m2(7'2 ’~0) GppspGRNA. 0 ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' utilizado na presente invenção tem a seguinte estrutura:

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam O-X-O, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e 0(0¾) 2 opcionalmente substituídos, preferivelmente R2 e R3, em conjunto, formam 2',3'-isopropilideno, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, preferivelmente R5 é S, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente entre 0 e S, mais preferivelmente R4 e R6 são 0, n é 1, 2 ou 3, preferivelmente n é 1 ou 2, mais preferivelmente n é 1, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA. 0 remate a 5' do ARN modificado utilizado na presente invenção possui a seguinte estrutura apresentada na fórmula (I) :

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alciniloopcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam O-X-O, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e 0(0¾¾ opcionalmente substituídos, preferivelmente R2 e R3, em conjunto, formam 2',3'-isopropilideno, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, preferivelmente R5 é S, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são independentemente seleccionados entre 0 e S, mais preferivelmente R4 e R6 são 0, n é 1, 2 ou 3, preferivelmente n é 1 ou 2, mais preferivelmente n é 1, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA. A frase "R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3" significa que o substituinte R5 em cada ocorrência é independentemente seleccionado do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, e assim, pode ser o mesmo ou diferente. Por exemplo, se n é 2 a estrutura apresentada na fórmula (I) compreende dois substituintes R6 e cada um destes dois substituintes R6 é independentemente seleccionado do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3 de modo que o primeiro substituinte R6 e o segundo substituinte R6 na mesma fórmula podem ser iguais ou podem ser diferentes.

Preferivelmente, o remate a 5' do ARN modificado utilizado na presente invenção, após transferência do ARN modificado para células apresentadoras de antigénio imaturas, é capaz de aumentar a estabilidade do ARN, aumentar a eficiência da tradução do ARN, prolongar a tradução do ARN, aumentar a expressão total de proteínas do ARN, e/ou aumentar a resposta imunitária contra um antigénio codificado pelo referido ARN, quando comparado com o mesmo ARN sem a estrutura de remate a 5'. Prefere-se particularmente que as células apresentadoras de antigénio imaturas sejam células dendríticas imaturas. Um perito pode prontamente determinar se o remate a 5' do ARN modificado é capaz de exercer as funções anteriores, por exemplo, gerando dois ARN, e.g., por transcrição in vitro, que apenas diferem no remate a 5', em que um dos ARN possui um remate a 5' de acordo com a fórmula (I) e o outro ARN (ARN de referência) (i) não compreende um remate a 5', (ii) possui um remate a 5' de ARNm convencional, i.e., um remate metil-7-guanosina, ou (iii) possui qualquer outro remate com o qual a função do remate a 5' de acordo com a fórmula (I) deverá ser comparada. Por exemplo, o ARN de referência pode ser possuidor de um remate a 5' que corresponde ao diastereoisómero D2 de beta-S-ARCA. Prefere-se particularmente que a estrutura de remate a 5' do ARN modificado utilizado na presente invenção, após transferência do ARN modificado para células apresentadoras de antigénio imaturas, seja capaz de aumentar a estabilidade do ARN, aumentar a eficiência da tradução do ARN, prolongar a tradução do ARN, aumentar a expressão total de proteínas do ARN e/ou aumentar a resposta imunitária contra um antigénio codificado pelo referido ARN quando comparado com o mesmo ARN possuindo um remate a 5' de ARNm convencional e/ou quando comparado com o mesmo ARN possuindo a mesma estrutura de remate a 5' mas diferindo na configuração estereoquímica no átomo P portador do substituinte R5, i.e. que corresponde à do átomo P do diastereoisómero D2 de beta-S-ARCA, preferivelmente quando comparado com o mesmo ARN possuindo um remate a 5' que corresponde ao diastereoisómero D2 de beta-S-ARCA.

Preferivelmente, R1 é seleccionado de modo a que o remate a 5' utilizado na presente invenção não iniba a tradução do ARN que possui o referido remate a 5'. Em particular, R1 é seleccionado de modo a que ao ARN, em particular o remate a 5', seja reconhecido pela maquinaria de iniciação da tradução, preferivelmente in vivo e in vitro, preferivelmente o remate a 5' é reconhecido pela maquinaria de iniciação da tradução eucariota. Por exemplo, um perito pode determinar se um ARN ou um remate a 5 ' de ARN é reconhecido pela maquinaria de iniciação da tradução eucariota determinando a afinidade do factor de iniciação da tradução eucariota eIF4E pelo referido ARN ou pelo referido remate a 5' de ARN.

Preferivelmente, R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, e.g., metilo, etilo, propilo ou butilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído e naftilmetilo opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído, e.g., etenilo, propenilo ou butenilo, e arilo opcionalmente substituído. Preferivelmente, R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 e arilo opcionalmente substituído. Ainda mais preferivelmente, R1 é seleccionado do grupo que consiste em metilo, etilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído, e naftilmetilo opcionalmente substituído. Preferivelmente, R1 é metilo.

Preferivelmente, a configuração de R2 e R3 é tal que o remate a 5' apenas pode ser incorporado numa cadeia de ARN numa orientação. Pasquinelli et al. (1995, RNA J. 1: 957-967) demonstraram que durante a transcrição in vitro as ARN-polimerases bacteriofágicas utilizam a unidade 7-metilguanosina para iniciação da transcrição pelo que cerca de 40-50% dos transcritos com remate possuem o remate dinucleotídico numa orientação inversa (i.e., o produto da reacção inicial é Gpppm7GpN) . Comparativamente com os ARN com um remate correcto os ARN com um remate inverso não são funcionais relativamente à tradução das proteínas codificadas. Assim, é desejável incorporar o remate na orientação correcta, i.e., resultando um ARN com uma estrutura essencialmente correspondente a m7GpppGpN, etc. Foi demonstrado que a integração inversa do remate dinucleotídico é inibida pela substituição de qualquer dos grupos 2'- ou 3'-OH da unidade guanosina metilada (Stepinski et ai., 2001; RNA J. 7:1486-1495; Peng et al., 2002; Org. Lett. 24:161-164) . Os ARN que são sintetizados na presença destes "análogos de remate anti-inverso", i.e., ARCA, são traduzidos mais eficientemente do que ARN que foram transcritos in vitro na presença do remate a 5' convencional m7GpppG. Além disso, Kore et al. (J. Am. Chem. Soc. 2009 Apr 22. [Epub antecipada à versão impressa]) verificaram que análogos de remate de ARNm dinucleotídicos modificados com ácido nucleico bloqueado (LNA) também não são incorporados na orientação inversa numa cadeia de ARN (Kore et al. 2009, J. Am. Chem. Soc. 131:6364-6365) .

Assim, numa concretização particularmente preferida, R1 é seleccionado de modo a que a maquinaria de iniciação da tradução eucariota seja capaz de reconhecer o ARN modificado utilizado na presente invenção e R2 e/ou R3 são seleccionados de modo a que o remate não possa ser incorporado na orientação inversa numa cadeia de ARN.

Preferivelmente, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, F, OH, metoxi, etoxi e propoxi. Preferivelmente, um de R2 e R3 é OH, e o outro não é OH. Mais preferivelmente, pelo menos um de R2 e R3 não é OH. Prefere-se particularmente que quando a estrutura de anel compreendendo os substituintes R2 e R3 possui a configuração estereoquimica de ribose, pelo menos um de R2 e R3 não seja OH. Preferivelmente o resíduo que não é OH é seleccionado do grupo que consiste em H, halogéneo, e alcoxi C1-C10 opcionalmente substituído, preferivelmente é seleccionado do grupo que consiste em H, F, metoxi, etoxi e propoxi, mais preferivelmente é metoxi. Numa concretização preferida, em particular quando a estrutura de anel compreendendo os substituintes R2 e R3 possui a configuração estereoquimica de ribose, R2 é OH e R3 é metoxi ou R2 é metoxi e R3 é OH.

Numa concretização, quando a configuração estereoquimica da estrutura de anel compreendendo os substituintes R2 e R3 não corresponde à configuração estereoquimica de ribose, por exemplo, corresponde à configuração estereoquimica de arabinose, xilose ou lixose, em particular quando a configuração estereoquimica da referida estrutura de anel corresponde à de arabinose, R2 e R3 podem ambos ser OH. Contudo, nesta concretização, é também possível que R2 e R3 sejam seleccionados como especificado acima.

Numa concretização preferida particular, R5 é S. Preferivelmente, R4 e R6 são seleccionados do grupo que consiste em 0 e S, e são preferivelmente 0. Preferivelmente, n é 1 ou 2, mais preferivelmente n é 1. São descritas adiante concretizações preferidas da estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I) . Deve entender-se que todas as estruturas, fórmulas e compostos descritos adiante estão abrangidos pela expressão "estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I)".

Na concretização mais preferida, o remate a 5' utilizado na presente invenção corresponde ao diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA possuindo a seguinte estrutura de acordo com a fórmula (II):

Neste contexto, "correspondente a" significa que o remate a 5' é idêntico ao diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, ou é essencialmente idêntico ao diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, significando que numa concretização preferida apenas podem existir diferenças mínimas entre o remate a 5' do ARN utilizado na presente invenção e o diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA. Por exemplo, o substituinte na posição 2' da unidade 7-metilguanosina pode ser H ou etoxi e/ou o substituinte no átomo N7 da unidade 7-metilguanosina pode ser etilo, e/ou o substituinte na posição 2' da unidade 7-metilguanosina pode ser OH e o substituinte na posição 3' da 7-metilguanosina pode ser diferente de OH, por exemplo, pode ser H ou metoxi, preferivelmente metoxi.

No que se segue, são divulgadas concretizações particularmente preferidas do ARN utilizado na presente invenção:

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, e.g., metilo, etilo, propilo, butilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído, ou naftilmetilo opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído, e.g., etenilo, propenilo ou butenilo, e arilo opcionalmente substituído, R2 é seleccionado do grupo que consiste em H, OH, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R2 é OH, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, e.g., metilo, etilo, propilo, butilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído, ou naftilmetilo opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído, e.g., etenilo, propenilo ou butenilo, e arilo opcionalmente substituído, R3 é seleccionado do grupo que consiste em H, OH, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R3 é OH, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R3 é seleccionado do grupo que consiste em H, halogéneo, e alcoxi C1-C10 opcionalmente substituído, preferivelmente R3 é seleccionado entre H, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R3 é H ou metoxi, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R2 é seleccionado do grupo que consiste em H, halogéneo, e alcoxi C1-C10 opcionalmente substituído, preferivelmente R2 é seleccionado entre H, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R2 é H ou metoxi, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -O-CH2- ou -CH2-O-, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R2 é seleccionado do grupo que consiste em H, OH, halogéneo, e alcoxi C1-C10 opcionalmente substituído, preferivelmente R2 é seleccionado entre H, OH, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R2 é OH, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R3 é seleccionado do grupo que consiste em H, OH, halogéneo, e alcoxi C1-C10 opcionalmente substituído, preferivelmente R3 é seleccionado entre H, OH, F, metoxi, etoxi e propoxi, preferivelmente R3 é OH, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, e.g., metilo, etilo, propilo, butilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído, ou naftilmetilo opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído, e.g., etenilo, propenilo ou butenilo, e arilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, F, OH, metoxi, etoxi e propoxi, ou R2 e R3 , em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, preferivelmente R2 e R3 foram em conjunto 2' ,3' — isopropilideno, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2-ou -CH2-O-, em que preferivelmente R2 e R3 são seleccionados de modo a que o remate a 5' não possa ser incorporado num ARN na orientação inversa, em que a configuração estereoquímica no átomo P corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, e.g., metilo, etilo, propilo, butilo, benzilo opcionalmente substituído, feniletilo opcionalmente substituído, ou naftilmetilo opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído, e.g., etenilo, propenilo ou butenilo, e arilo opcionalmente substituído, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, preferivelmente R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0 e S, e o mais preferivelmente R4 e R6 são 0, n é 1, 2 ou 3, preferivelmente n é 1 ou 2, mais preferivelmente n é 1, e em que a configuração estereoquímica no átomo P que possui S como substituinte corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.

Preferivelmente, a estabilidade e a eficiência da tradução do ARN utilizado na presente invenção podem ser adicionalmente modificadas conforme necessário. Por exemplo, o ARN pode ser estabilizado e a sua tradução aumentada através de uma ou mais modificações possuindo um efeito de estabilização e/ou aumentador da eficiência da tradução. Estas modificações estão, por exemplo, descritas em WO 2007/036366.

Por exemplo, o ARN possuindo uma sequência poli-A não mascarada (cauda poli-A não mascarada) é traduzido mais eficientemente do que ARN possuindo uma sequência poli-A mascarada. A expressão "sequência poli-A" refere-se a uma sequência de resíduos adenilo (A) que tipicamente está localizada na extremidade 3' de uma molécula de ARN e "sequência poli-A não mascarada" significa que a sequência poli-A na extremidade 3' de uma molécula de ARN termina com uma A da sequência poli-A e não é seguida por nucleótidos que não A localizados na extremidade 3', i.e., a jusante, da sequência poli-A. Além disso, uma sequência poli-A longa de cerca de 120 nucleótidos resulta em estabilidade do transcrito e eficiência da tradução óptimas.

Assim, o ARN, preferivelmente o ARNm utilizado na presente invenção, pode preferivelmente compreender adicionalmente uma cauda poli-A possuindo um comprimento de 10 a 500, preferivelmente possuindo um comprimento de 30 a 300, mais preferivelmente possuindo um comprimento de 65 a 200, mais preferivelmente possuindo um comprimento de 100 a 150 nucleótidos, e.g., 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 nucleótidos, preferivelmente 120 nucleótidos. Preferivelmente, a referida sequência poli-A é uma sequência poli-A não mascarada. Assim, preferivelmente, o ARN utilizado na presente invenção como especificado acima compreende uma cauda poli-A não mascarada possuindo um comprimento de 10 a 500, preferivelmente possuindo um comprimento de 30 a 300, mais preferivelmente possuindo um comprimento de 65 a 200, mais preferivelmente possuindo um comprimento de 100 a 150 nucleótidos, e.g., 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 nucleótidos, preferivelmente 120 nucleótidos.

Em adição, a incorporação de uma região não traduzida a 3' (3'-UTR) na região não traduzida a 3' de uma molécula de ARN pode resultar numa melhoria da eficiência da tradução. Pode ser conseguido um efeito sinérgico através da incorporação de duas ou mais destas 3'-UTR. As 3'-UTR podem ser autólogas ou heterólogas para o ARN no qual estão introduzidas. Por exemplo, pode ser a 3'-UTR do ARNm da beta-globina. Assim, preferivelmente, o ARN, preferivelmente o ARNm utilizado na presente invenção, pode adicionalmente compreender uma ou mais cópias, preferivelmente duas cópias da região não traduzida a 3' (3'-UTR) do gene da beta-globina, preferivelmente do gene da beta-globina humana.

Prefere-se particularmente que o ARN utilizado na presente invenção seja modificado através de uma combinação das modificações descritas acima, i.e., incorporação de uma sequência poli-A, desmascaramento de uma sequência poli-A, e incorporação de uma ou mais 3'-UTR.

Numa concretização particularmente preferida, o ARN utilizado na presente invenção codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um imunogénio, um antigénio ou um péptido antigénico. Numa concretização, o péptido ou a proteína são processados após expressão para proporcionar o referido imunogénio, antigénio ou péptido antigénico. Em outra concretização, o péptido ou a proteína, eles próprios, são o imunogénio, o antigénio ou o péptido antigénico.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo um ARN possuindo uma estrutura como descrito acima. Numa concretização preferida, a referida composição de vacina compreende ainda um ou mais transportadores, excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. A referida composição de vacina pode ainda compreender compostos ou substâncias que são capazes de melhorar e/ou suportar uma reacção imunitária num indivíduo. Por exemplo, a composição de vacina da presente invenção pode ainda compreender um adjuvante como descrito acima ou citóquinas, por exemplo, interleucina-12 (IL-12), factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), ou interleucina-18 (IL-18). Além disso, a composição de vacina de acordo com a presente invenção pode ainda compreender substâncias estabilizantes de ARN tais como inibidores de ARNase, sais ou tampões farmaceuticamente aceitáveis, conservantes tais como cloreto de benzalcónio, clorbutanol, parabeno ou timerosal, agentes molhantes, agentes emulsionantes e/ou fármacos ou agentes activos adicionais. Numa concretização particularmente preferida, o ARN está presente na composição de vacina de acordo com a presente invenção na forma de ARN nu. Prefere-se particularmente que a composição de vacina da presente invenção seja formulada para administração parentérica, por exemplo, para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intralinfática ou intranodal, o mais preferivelmente para administração intranodal. A composição de vacina da invenção é, o mais preferivelmente, formulada para injecção nos nódulos linfáticos, preferivelmente nos nódulos linfáticos inguinais, para injecção em vasos linfáticos e/ou no baço. Preferivelmente, a composição de vacina está na forma de uma solução aquosa ou não aquosa que é isotónica com o sangue do beneficiário, i.e., o indivíduo a vacinar. Por exemplo, pode-se utilizar solução de Ringer, solução de cloreto de sódio isotónica, ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em particular, a composição de vacina é preferivelmente estéril e compreende o ARN acima especificado numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma célula apresentadora de antigénio imatura compreendendo um ARN como especificado acima. Numa concretização preferida, a célula apresentadora de antigénio imatura é seleccionada do grupo que consiste em macrófagos imaturos, monócitos imaturos, células B imaturas e células dendriticas imaturas, preferivelmente a célula apresentadora de antigénio imatura é uma célula dendritica imatura. Numa concretização particularmente preferida, a célula apresentadora de antigénio imatura de acordo com a presente invenção é formulada numa composição farmacêutica, sendo a referida composição farmacêutica preferivelmente adequada para eliciar uma resposta imunitária quando administrada a um indivíduo, em que a resposta imunitária é preferivelmente dirigida contra a proteína ou o péptido codificados pelo ARN ou um antigénio e/ou um imunogénio constituídos pela proteína ou o péptido codificados pelo ARN presente na célula apresentadora de antigénio imatura da presente invenção. Assim, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma célula apresentadora de antigénio imatura de acordo com o segundo aspecto da presente invenção.

Num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo o passo de administração ao referido indivíduo da composição de vacina da presente invenção ou da célula apresentadora de antigénio imatura da presente invenção. Preferivelmente, a referida resposta imunitária é especificamente dirigida contra a proteína ou o péptido codificados pelo ARN compreendido na composição de vacina ou na célula apresentadora de antigénio imatura da presente invenção ou é especificamente dirigida contra um antigénio constituído pela referida proteína ou péptido. A referida resposta imunitária pode ser terapêutica e/ou protectora. Prefere-se particularmente que a referida composição de vacina e as referidas células apresentadoras de antigénio imaturas, preferivelmente células dendriticas imaturas, sejam administradas parentericamente como especificado acima para o primeiro aspecto da presente invenção, preferivelmente por injecção intranodal, preferivelmente por injecção em nódulos linfáticos inguinais.

Num quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a estabilidade de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas e/ou para aumentar a expressão de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas, o referido método compreendendo proporcionar ao referido ARN uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I) como especificado acima. Preferivelmente, as referidas células apresentadoras de antigénio imaturas são seleccionadas do grupo que consiste em monócitos imaturos, macrófagos imaturos, células gliais imaturas, células B imaturas e células dendriticas imaturas, preferivelmente as células apresentadoras de antigénio imaturas são células dendriticas imaturas. De modo a avaliar a estabilidade de um ARN numa célula apresentadora de antigénio imatura, o perito pode detectar a presença do ARN estudado ou quantificar a quantidade de ARN no interior de uma célula apresentadora de antigénio imatura após determinados pontos temporais após introdução do referido ARN, por exemplo, utilizando RT-PCR em tempo real como estabelecido no Exemplo 4 adiante. A expressão de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas pode ser determinada utilizando um ARN que codifica uma proteína marcadora tal como luciferase ou proteína verde fluorescente, preferivelmente d2EGFP, mas pode ser qualquer outra proteína marcadora conhecida dos peritos, e determinando a expressão da referida proteína marcadora em determinados pontos temporais após introdução do ARN como estabelecido no Exemplo 3 adiante.

Nu quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio, o referido método compreendendo proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo o referido antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I) como especificado acima e transferir o referido ARN para uma célula apresentadora de antigénio imatura. Sem vínculo a qualquer teoria, assume-se que a modificação de um ARN com uma estrutura de remate de acordo com a fórmula (I) aumenta a estabilidade do referido ARN, em particular no interior de células apresentadoras de antigénio imaturas, por exemplo, células dendriticas imaturas. Esta estabilidade acrescida conduz a uma expressão aumentada do referido ARN e assim a uma acumulação da proteína ou do péptido codificados pelo referido ARN. A referida proteína ou péptido podem compreender um antigénio ou um péptido antigénico. Assim, após processamento da referida proteína, antigénios ou péptidos antigénicos podem ser carregados em moléculas do MHC sobre a superfície da célula apresentadora de antigénio. Alternativamente, a referida proteína ou péptido podem ser, eles próprios, um antigénio ou um péptido antigénico e podem ser carregados sobre moléculas do MHC sem processamento. Assume-se que um ARN que codifica uma proteína ou um péptido particulares compreendendo um antigénio ou péptido antigénico, que foi modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I), aumenta a porção/fracção de moléculas do MHC sobre a superfície celular de uma célula apresentadora de antigénio que apresentam um péptido derivado da proteína ou do péptido codificados pelo referido ARN, comparativamente com o mesmo ARN possuindo um remate a 5' convencional, preferivelmente comparativamente com o mesmo ARN possuindo um remate a 5' ARCA, e mais preferivelmente comparativamente com o mesmo ARN possuindo a mesma estrutura de remate a 5', excepto que a configuração estereoquímica no átomo P possuindo o substituinte R5 corresponde à do átomo P de beta-S-ARCA (D2) . Como a densidade de moléculas do MHC que apresentam um antigénio particular sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio é decisiva para a intensidade da resposta imunitária induzida específica para o referido antigénio particular, assume-se que aumentar a estabilidade de um ARN que codifica um antigénio que foi introduzido em células apresentadoras de antigénio conduz a uma resposta imunitária aumentada contra o referido antigénio particular.

Num sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método para estimulação e/ou activação de células efectoras imunitárias, o referido método compreendendo proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I), transferir o referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, e colocar em contacto as células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias. Preferivelmente, as referidas células efectoras imunitárias são activadas e/ou estimuladas de modo especifico do antigénio. Preferivelmente, através deste método, a quantidade de células efectoras especificas para o antigénio, preferivelmente células T, é aumentada. Preferivelmente, as células apresentadoras de antigénio imaturas são células dendriticas imaturas. Numa concretização preferida, as células efectoras imunitárias são células T, preferivelmente células CD4+ e/ou CD8+. Numa concretização, o passo de transferência do referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas é realizada in vitro através de qualquer método de transferência de ácido nucleico, e.g., um método de transfecção, conhecido dos peritos tais como lipofecção, electroporação ou micro-injecção, como descrito acima. Em outra concretização, o passo de transferência do referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas é realizada in vivo, por exemplo, por administração do ARN a um indivíduo, preferivelmente por administração parentérica, preferivelmente por administração intralinfática, preferivelmente por injecção em nódulo(s) linfático(s), i.e.r por injecção intranodal, por injecção em vasos linfáticos, ou por injecção no baço. Preferivelmente, a referida administração é por injecção intranodal do ARN que é preferivelmente tomado por células dendriticas imaturas no (s) nódulo(s) linfático (s) . 0 ARN administrado está preferivelmente na forma de ARN nu. Numa concretização, o passo de contacto das células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias é realizado in vitro, por exemplo, num prato de cultura de tecidos. Em outra concretização, o passo de contacto das células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias é realizado in vivo. Nesta concretização, o passo de transferência do ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas pode ser realizado in vitro ou in vivo como descrito acima. Para o contacto das células apresentadoras de antigénio para as quais o ARN foi transferido in vitro com células efectoras imunitárias in vivo, as células apresentadoras de antigénio são administradas a um indivíduo, preferivelmente por administração parentérica, por exemplo, por injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranodal, intralinfática ou intraperitoneal, preferivelmente por injecção no sistema linfático tal como por injecção em vasos(s) linfático(s), no baço e/ou em nódulo(s) linfático (s), preferivelmente nódulo(s) linfático(s) inguinal(ais). Numa concretização do sexto aspecto da presente invenção, o método pode ainda compreender o passo de diferenciação das células apresentadoras de antigénio imaturas em células apresentadoras de antigénio maduras após transferência do ARN para as células apresentadoras de antigénio imaturas e antes do contacto das células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias. 0 passo de diferenciação pode ser realizado in vitro ou in vivo. Por exemplo, o ARN pode ser transferido para as células apresentadoras de antigénio imaturas, preferivelmente para células dendriticas imaturas, as células apresentadoras de antigénio imaturas são diferenciadas in vitro, e as células apresentadoras de antigénio maduras diferenciadas, preferivelmente as células dendriticas maduras, são colocadas em contacto com células efectoras imunitárias in vitro ou in vivo como descrito acima, preferivelmente in vivo. As células apresentadoras de antigénio imaturas para as quais o ARN é transferido in vitro podem ser isoladas de um indivíduo, por exemplo um paciente a imunizar, ou podem ser diferenciadas de células estaminais hematopoiéticas. A estimulação e/ou activação de células efectoras imunitárias, em particular de células T, está tipicamente associada à expansão, reactividade citotóxica e/ou secreção citóquina das células efectoras imunitárias. Assim, o perito pode determinar se as células efectoras imunitárias são estimuladas e/ou activadas através de testes simples in vitro, tipicamente realizados utilizando células T. Estas células T podem ser proporcionadas por linhas de células T transformadas tais como hibridomas de células T ou células T que foram isoladas de um mamífero tal como de um roedor, e.g., um ratinho ou um rato. Os hibridomas de células T adequados estão comercialmente disponíveis ou podem ser gerados por métodos conhecidos. As células T podem ser isoladas de um mamífero por métodos conhecidos (cf. Shimonkevitz et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 303-316). Um cenário experimental adequado para testar a activação e/ou estimulação de células T é descrito adiante nos passos (1) a (4) . As células T expressam um marcador adequado que pode ser testado e que indica activação de células T ou modulação da actividade de células T. O hibridoma de células T murinas DO11.10 pode ser utilizado para esta finalidade, uma vez que o referido hibridoma expressa interleucina-2 (IL-2) após activação. As concentrações de IL-2 podem ser determinadas para verificar a activação/estimulação de células T ou para determinar se uma composição é capaz de modular a actividade do referido hibridoma de células T. Este teste é realizado através dos passos seguintes: (1) Proporcionar células T a partir de um hibridoma de células T ou por isolamento a partir de um mamífero, (2) Cultivar as células T sob condições que permitam a proliferação, (3) as células T em proliferação são colocadas em contacto com uma célula apresentadora de antigénio que tinha sido colocada em contacto com um antigénio ou um ácido nucleico que o codifica portanto, e (4) testar as células T quanto a um marcador, por exemplo, é determinada a produção de IL-2. As células que são utilizadas para o teste são cultivadas sob condições que permitem a proliferação. Por exemplo, o hibridoma de células T DO11.10 é adequadamente cultivado a 37°C e 5% de CO2 em meio completo (RPMI 1640, suplementado com FBS a 10%, penicilina/estreptomicina, L-glutamina e 2-mercaptoetanol 5 x lCh5 M) . Os sinais de activação de células T são proporcionados por células apresentadoras de antigénio que foram carregadas com um péptido antigénico apropriado.

Alternativamente, a modulação da actividade de células T pode ser verificada determinando alterações ou a proliferação de células T específicas para o antigénio, que podem ser medidas, por exemplo, através de métodos conhecidos de radiomarcação. Por exemplo, um nucleótido marcado pode ser adicionado a um meio de cultura de teste. A incorporação destes nucleótidos marcados no ADN pode servir como indicador da proliferação de células T. Este teste não é aplicável a células T que não requerem apresentação de antigénio para a sua proliferação tais como hibridomas de células T. Este teste é útil para determinar a modulação da actividade de células T no caso de células T não transformadas que foram isoladas de um mamífero.

Num sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo, o referido método compreendendo proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I), e administrar o referido ARN ao referido indivíduo. O antigénio de interesse pode ser qualquer antigénio e é preferivelmente como definido acima. Numa concretização preferida, o referido ARN é administrado na forma de ARN nu, preferivelmente por administração parentérica, por exemplo, por injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranodal, intralinfática ou intraperitoneal, preferivelmente por injecção no sistema linfático tal como por injecção em vaso(s) linfático(s) , no baço e/ou em nódulo(s) linfático(s) , preferivelmente nódulo(s) linfático(s) inguinal(ais). Preferivelmente, o ARN administrado é tomado por células dendriticas imaturas do indivíduo. Preferivelmente, a resposta imunitária é protectora e/ou terapêutica, por exemplo, é útil para tratar e/ou prevenir doenças tais como doenças cancerosas ou doenças infecciosas.

Num oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo, o referido método compreendendo proporcionar um ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I), transferir o referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, e administrar as células apresentadoras de antigénio ao referido indivíduo. Neste aspecto da presente invenção, o ARN é transferido para células apresentadoras de antigénio imaturas in vitro através de qualquer método de transferência de ácido nucleico, e.g., transfecção tal como lipofecção, electroporação ou micro-injecção, conhecido do perito como descrito acima. Preferivelmente, as células apresentadoras de antigénio imaturas são células dendriticas imaturas. As células apresentadoras de antigénio imaturas para quais o ARN é transferido in vitro podem ser isoladas de um indivíduo, por exemplo, um paciente a imunizar, ou podem ser diferenciadas a partir de células estaminais hematopoiéticas, em que as células estaminais hematopoiéticas podem ser isoladas do indivíduo. As células apresentadoras de antigénio imaturas ou as células estaminais hematopoiéticas podem ser isoladas do indivíduo por leucaferese. Preferivelmente, as células apresentadoras de antigénio imaturas são células dendriticas imaturas. Preferivelmente, as células apresentadoras de antigénio imaturas são isoladas do indivíduo a imunizar, o ARN é transferido para as referidas células isoladas, e as células são transferidas novamente para o referido indivíduo, preferivelmente por administração parentérica, por exemplo, por injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranodal, intralinfática ou intraperitoneal, preferivelmente por injecção no sistema linfático tal como por injecção em vaso (s) linfático (s), no baço e/ou em nódulo(s) linfático (s), preferivelmente nódulo(s) linfático (s) inguinal(ais) . A capacidade para induzir uma reacção imunitária, incluindo a adequabilidade para vacinação contra uma doença alvo, pode ser prontamente determinada por testes in vivo. Por exemplo, uma composição, e.g., uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica, pode ser administrada a um mamífero tal como um animal de laboratório, e.g., um ratinho, um rato, coelho, etc., e podem ser colhidas amostras de sangue do referido animal antes da administração da composição e em pontos temporais definidos após a administração da composição, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 semanas após a administração. Pode ser gerado soro a partir das amostras de sangue e pode ser determinado o desenvolvimento de anticorpos gerados após administração/imunização. Por exemplo, pode ser determinada a concentração de anticorpos. Além disso, podem ser isoladas células T, do sangue e/ou do sistema linfático do mamífero, que podem ser testadas quanto á sua reactividade contra o antigénio utilizado para a imunização. Qualquer sistema de leitura que seja conhecido do perito pode ser utilizado, por exemplo, podem ser utilizados ensaios de proliferação, ensaios de secreção de citóquinas, ensaios para testar a actividade citotóxica, ou análise de tetrâmeros, etc.. Além disso, o aumento de reactividade imunitária pode também ser determinado determinando o número de células T específicas para o antigénio, o seu potencial citotóxico, ou o seu padrão de secreção de citóquinas como estabelecido acima.

Além disso, a presente invenção proporciona o ARN aqui descrito, a composição de vacina de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, as células apresentadoras de antigénio imaturas e a composição farmacêutica compreendendo as referidas células de acordo com o segundo aspecto da presente invenção para utilização numa aplicação médica, preferivelmente para induzir uma resposta imunitária num indivíduo, e.g., para vacinação de um indivíduo, por exemplo, para prevenção de uma doença cancerosa ou de uma doença infecciosa no referido indivíduo ou para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença cancerosa ou infecciosa.

Os métodos da presente invenção, em particular, os métodos para activação e/ou estimulação de células efectoras imunitárias e indução de uma resposta imunitária num indivíduo assim como a composição de vacina, as células apresentadoras de antigénio imaturas, e o ARN para utilização nos referidos métodos, permitem um aumento quantitativo da frequência de linfócitos T específicos para o antigénio após a imunização à base de ARN. Este aumento na eficiência pode ser explorado para imunoterapia de pacientes em relação a uma melhor eficiência clínica ou redução da dosagem da vacina. Além disso, a presente invenção proporciona a oportunidade de vastamente amplificar células T específicas para o antigénio a partir de células T precursoras pouco presentes. Além do mais, o aumento na eficiência ao aplicar a presente invenção é acompanhado por redução de custos. A presente invenção é descrita em detalhe pelas figuras e exemplos adiante, que são utilizados apenas para fins de ilustração e não se pretendem limitantes. Devido á descrição e aos exemplos, outras concretizações que são do mesmo modo incluídas na invenção são acessíveis ao técnico especialista.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos

Balões de cultura celular (150 cm2, Falcon N.2 355001), meio DC (RPMI 1640 com glutamina 2 mM, penicilina a 100 U/ml, estreptomicina a 100 pg/ml, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais e soro AB humano inactivado por calor a 10%; todos de Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos humano a 1000 U/ml (GM-CSF, Essex, Luzern, Suíça) e IL-4 a 1000 U/ml (Interleucina 4 humana, Strathmann Biotech, Hamburg, Alemanha), DPBS/EDTA (DPBS de Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha, com 2 ml de EDTA; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha), tubos de reacção de 15 ml e de 50 ml, pipetas descartáveis, pontas de pipeta, tubos de FACS, centrífuga de arrefecimento (4°C), gelo.

Procedimento:

Dia 0: Células positivas para CD14 foram seleccionadas utilizando anticorpos anti-CD14 acoplados a contas (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante e amostras do eluato, fluxo que atravessou, e a fracção de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram mantidos para posterior análise FACS (cf. Exemplo 2). As células foram contadas após eluição e realizou-se a centrifugação (15 minutos, 340 rcf) a 4°C. as células foram ressuspensas em meio DC a uma densidade de cerca de lxlO6 células/ml (máx. 5xl07 células por balão). Adicionaram-se ao meio 1000 U/ml de IL-4 e 1000 U/ml de GM-CSF (como descrito acima).

Dia +2 (opcionalmente +3)

Removeu-se um terço do meio e centrifugou-se a 4°C (15 minutos, 340 rcf) . Adicionou-se o mesmo volume de meio contendo 2000 U/ml de IL-4 e 2000 U/ml de GM-CSF.

Dia +5 (opcionalmente +4):

Dia +7:

Removeram-se as células do fundo do balão de cultura de tecidos pipetando repetidamente para cima e para baixo. Removeu-se a totalidade do meio e enxaguou-se o balão com cerca de 30 ml de PBS/EDTA frio. Colheram-se as células por centrifugação e ressuspenderam-se em 10 ml de meio DC frio. Colocaram-se as células sobre gelo e contaram-se. Manteve-se a amostra das células para posterior análise FACS. A densidade das células foi ajustada a 1,0 xl07/40 ml com meio DC e adicionaram-se 40 ml de meio DC por balão. Adicionaram-se as seguintes citóquinas ao meio:

500 U/ml de IL-4 800 U/ml de GM-CSF 10 ng/ml de IL-lb 10 ng/ml de TNF-a 1000 U/ml de IL-6 1 pg/ml de PGE2

Dia +9 (opcionalmente +10):

Removeram-se as células do balão de cultura de tecidos por enxaguamento suave. Contaram-se as células e manteve-se a amostra para posterior análise FACS (cf. Exemplo 2). As células foram centrifugadas e o número de células foi ajustado conforme necessário.

Exemplo 2: Coloração em FACS:

Tomaram-se cerca de 2xl05 células para cada coloração num tubo de FACS. Ajustou-se o volume para 100 μ com tampão de FACS (DPBS, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha, com EDTA 5 mM, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha, e FCS a 5%, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Adicionaram-se 5 μΐ de -CDx-FITC e opcionalmente 5 μΐ de -CDy-PE aos tubos de FACS. Incubaram-se os tubos durante 30 a 40 minutos a 4°C no escuro antes de se adicionarem 4 ml de tampão de FACS e as amostras serem centrifugadas. Aspirou-se o sobrenadante ressuspenderam-se a pelete celular e as células em 400 μΐ de tampão de FACS e armazenou-se a 4°C.

As PBMC foram coradas utilizando -CD14-FITC (BD

Biosciences) e -CD3-PE (BD Biosciences). Numa coloração

separada coraram-se as PBMC utilizando -CD19-PE (BD

Biosciences) . A coloração foi realizada no dia 7 e no dia 9. As amostras de células foram armazenadas em gelo até ser realizada a coloração.

Exemplo 3: ARN com um análogo de remate com fosforotioato específico na extremidade 5' resulta numa expressão de proteínas aumentada e prolongada em células dendríticas imaturas

Os ARN que codificam para luciferase foram transcritos in vitro utilizando moldes de vector optimizados (Τί02007/036366; Holtkamp et ai., 2006, Blood 108: 4009-4017,). Os ADN do vector linearizados foram quantificados espectrofotometricamente e submetidos a transcrição in vitro essencialmente como descrito por Pokrovskaya e Gurevich fPokrovskava & Gurevich, 1994, Anal. Biochem. 220: 420-423,). Um dos dinucleótidos de remate m7GpppG (Darzynkiewicz et al. , 1988, Nucleic Acids Res. 16: 8953-8962,), m7Gppppm7G, m2(7,3 '~0) GpppG (designado doravante por ARCA) (Stepinski et al. , 1995, Nucleosides Nucleotides 14: 717-721, Stepinski et al. , 2001, RNA 1: 1486-1495,), m2(7'2’-°) GppspG (Dl) (na presente invenção denominado beta-S-ARCA (Dl) ) ou irpuu'-0)GppspG(D2) (na presente invenção denominado beta-S-ARCA(D2)) (Kowalska et al., 2008, RNA 14:1119-1131,) foi adicionado à reacção de transcrição para obter ARN com a estrutura de remate a 5' modificada de modo correspondente (cf. também Fig. 1). Nas reacções com análogo de remate, estava presente GTP a 1,5 mM, enquanto o análogo de remate estava presente a 6,0 mM. Estava presente GTP a 7,5 mM nas reacções sem análogo de remate. No final da reacção de transcrição, o ADN do vector linearizado foi digerido com ADNase TURBO a 0,1 U/μΙ (Ambion, Austin/TX, EUA) durante 15 minutos a 37°C. Purificaram-se os ARN a partir destas reacções utilizando o Kit MEGAclear (Ambion, Austin/TX, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Se desejado, proporcionou-se subsequentemente ao ARN, transcrito na ausência de um análogo de remate, um remate de m7GpppG utilizando a enzima de capeamento do virus vaccinia (Epicentre, Madison/WI, EUA) para capeamento (remate) pós-transcrição (m7GpppG (p.-t.)) de acordo com as instruções do fabricante, e purificou-se o ARN uma vez mais utilizando o Kit MEGAclear (Ambion, Austin/TX, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Os ARN preparados como descrito acima foram introduzidos em células dendriticas humanas imaturas e maduras utilizando electroporação (com 300 V e 150 pF utilizando um Gene Pulser II, Bio-Rad, Munchen, Alemanha) e determinou-se a expressão da proteína repórter luciferase durante um período de tempo de 72 horas. Para este fim, determinou-se a quantidade de proteína luciferase após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas medindo a actividade da luciferase (que é proporcional à quantidade da proteína; Fig. 2). Pela análise da expressão da proteína codificada, é possível determinar a eficiência da tradução de um ARN (correspondente ao declive máximo da curva) e a estabilidade do ARN funcional (dada pelo ponto temporal do máximo da curva). Além disso, o integral da curva corresponde à intensidade da totalidade da expressão de proteínas ao longo da gama de tempo observada. A expressão de proteína total mais elevada em células dendrlticas imaturas foi observada para ARN que tinha sido transcrito na presença de beta-S-ARCA(Dl) (Fig. 2A; painel da esquerda). Este resultado foi inesperado porque tanto em células HC11 como em sistemas de tradução in vitro o ARN com beta-S-ARCA (D2) na extremidade 5' resultou na mais forte expressão total (cf. Anterioridade da invenção) . 0 ARN com beta-S-ARCA (D2) na extremidade 5' resultou apenas na segunda melhor expressão total em células dendrlticas imaturas e é seguido pelo ARN com ARCA na extremidade 5' e ARN modificado pós-transcrição.

De acordo com o facto de m7GpppG poder ser incorporado na orientação inversa durante a transcrição in vitro (portanto, cerca de metade do ARN contendo um remate a 5' é funcional para tradução) a expressão de ARN que foi transcrito utilizando m7GpppG é claramente inferior à dos outros ARN. Através do efeito combinado sobre as eficiências de tradução e a estabilidade de ARN funcional, o beta-S-ARCA(Dl) resulta numa expressão de proteína total que está aumentada em mais do que 13 vezes comparativamente com ARN que foi sintetizado na presença de m7GpppG. Comparativamente com ARN com ARCA na extremidade 5' ou ARN modificado pós-transcrição, a expressão de ARN possuindo beta-S-ARCA(Dl) é aumentada de um factor de cerca de 3. A expressão total de proteína a partir de ARN com beta-S-ARCA(Dl) é aumentada cerca de 2 vezes comparativamente com a expressão total de proteína a partir de ARN com beta-S-ARCA (D2) (Tabela D ·

Em comparação com ARN com m7GpppG as eficiências da tradução de ARN com ARCA é aumentada cerca de 2,5 vezes, com beta-S-ARCA(Dl) cerca de 3,4 vezes, com beta-S-ARCA(D2) cerca de 3,5 vezes e com um ARN modificado pós-transcrição cerca de 4,1 vezes (Tabela 1) .

Para além do efeito sobre a eficiência da tradução, as várias estruturas de remate também influenciam a estabilidade do ARN funcional em células dendrlticas imaturas. A expressão de proteínas de ARN que foi transcrito na presença de m7GpppG exibe o seu máximo cerca de 8 horas após a electroporação (Tabela 1). Em contraste, o máximo de expressão de ARN com ARCA ou beta-S-ARCA (D2) é após 12 horas e beta-S-ARCA (Dl) aumenta a estabilidade do ARN funcional ainda mais com um máximo após mais do que 15 horas.

Tabela 1: Impacto da estrutura de remate a 5' do ARN sobre a eficiência da tradução (dada pelo declive máximo das curvas na Fig. 2A) . 0 ponto temporal de expressão máxima de proteína, e a expressão total de proteína ao longo de todo o período da experiência. Para cada tipo de célula (células dendríticas imaturas e maduras [iDC e mDC, respectivamente]) a eficiência da tradução e o sinal total para células que foram electroporadas com ARN que foi transcrito na presença de m7GpppG foi considerado 1. São apresentadas as médias ± desvio padrão.

Curiosamente, observámos em células dendríticas imaturas que o ARN com o remate m7Gppppm7G que anteriormente resultou num aumento da expressão no sistema de tradução in vitro (Grudzien et ai., 2004, RNA J. 10: 1479-1487), resulta numa expressão em células dendríticas imaturas que é ainda mais baixa do que a de ARN que tinha sido transcrito na presença de m7GpppG. Os ARN que foram aplicados como controlos sem remate ou com um remate que não é reconhecido pela maquinaria de tradução (ApppG e GpppG) não resultam em nenhuma expressão significativa.

Em células dendríticas maduras o efeito das várias estruturas a 5 ' do ARN é diferente do que em células dendríticas imaturas. Primeiro, é perceptível que a estabilidade do ARN funcional é geralmente maior do que em células dendríticas imaturas e é apenas marginalmente dependente do tipo de extremidade 5' do ARN. Em segundo lugar, a ordem relativamente à expressão de proteína total difere da ordem em células dendríticas imaturas: ARN com beta-S-ARCA(D2) resulta na expressão mais elevada de proteínas em células dendríticas maduras seguido por ARN com beta-S-ARCA(Dl) , ARN modificado pós-transcrição, e depois ARN com ARCA na extremidade 5'. Além disso, a diferença nos níveis de expressão em células dendríticas maduras não é tão pronunciado como em células dendríticas imaturas. Isto está de acordo com a menor influência de estruturas de remate sobre a estabilidade de ARN funcional em células dendríticas maduras. O ARN com m7Gppppm7G é também fracamente traduzido em células dendríticas maduras. Estes resultados suportam o pressuposto de que este remate apenas pode recrutar fracamente a maquinaria de tradução in vivo ao contrário dos resultados in vitro. Os ARN de controlo sem remate ou com ApppG e GpppG, respectivamente, não resultam em expressão de proteínas como esperado.

Para confirmar que o efeito observado das estruturas de remate do ARN é independente da proteína codificada pelo ARN, repetimos as experiências com ARN que codifica uma proteína verde fluorescente (designado d2eGFP) utilizando os mesmos vectores optimizados descritos acima para a transcrição in vitro. A quantidade de d2eGFP em diferentes pontos temporais após introdução dos ARN em células dendríticas imaturas e maduras foi determinada utilizando citometria de fluxo e os resultados obtidos foram muito similares aos obtidos com os ARN que codificam luciferase (cf. Fig. 2A e B). O ARN com beta-S-ARCA (Dl) também resultou na mais elevada expressão de proteína total em células dendríticas imaturas (Fig. 2B; painel da esquerda). Como observado com os ARN que codificam luciferase, este efeito é especifico para células dendriticas imaturas. Isto confirma a superioridade de beta-S-ARCA(Dl) versus todos os outros análogos de remate e versus a modificação pós-transcrição relativamente à expressão de proteína total em células dendriticas imaturas. Em células dendriticas maduras, os ARN com beta-S-ARCA(D2) resultaram na mais elevada expressão de proteína total, seguidos pelo ARN com beta-S-ARCA(Dl) , o ARN modificado pós-transcrição e depois o ARN com ARCA. Em resumo, estes resultados mostram que a estrutura de remate na extremidade 5' dos ARN exibe uma influência diferente sobre a estabilidade do ARN funcional e a eficiência da tradução em células dendriticas imaturas e maduras. Em particular, o efeito de beta-S-ARCA(Dl) em células dendriticas imaturas é único e não tinha sido anteriormente observado.

Exemplo 4: Tradução preferencial dos ARN com beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' em células dendriticas imaturas

Os resultados descritos até aqui indicam que a eficiência de tradução de um ARNm é influenciada em células dendriticas pelo tipo da estrutura de remate na sua extremidade 5'. Isto deve-se muito provavelmente a diferenças na eficiência a que a maquinaria da tradução é recrutada para as diferentes estruturas de remate a 5'. Para corroborar isto, analisámos em seguida (i) o efeito da dose de ARN que é utilizada para electroporação em células dendriticas imaturas, e (ii) o impacto de um segundo ARN co-electroporado em células dendriticas imaturas sobre a expressão de proteínas. Aumentando a quantidade do ARNm electroporado, é de esperar que em algum ponto um ou mais factor (es) de tradução se tornem limitantes da velocidade na célula, o que irá então restringir a quantidade de proteína que pode ser sintetizada a partir do ARN exógeno. Similarmente, um segundo ARN irá competir pela maquinaria de tradução, influenciando novamente a eficiência da tradução.

Quantidades crescentes (20 pmol e 40 pmol) de ARN que codificam a luciferase rematados em co-transcrição com ARCA ou beta-S-ARCA(Dl) foram electroporadas em células dendriticas imaturas, e a actividade da luciferase foi medida após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas. De modo interessante, a actividade da luciferase medida utilizando 40 pmol de ARN rematado com ARCA diminuiu relativamente ao sinal obtido com 20 pmol de ARN rematado com ARCA 24 horas após a electroporação (Figura 3A). Neste ponto temporal, o nível de proteína luciferase era apenas cerca de 1,6 vezes superior a quando se utilizou metade da quantidade de ARN. A razão diminuiu ainda mais 48 e 72 horas após a electroporação (1,4 vezes e 1,2 vezes, respectivamente). Pelo contrário, para ARN rematado com beta-S-ARCA(Dl) o nível de proteína luciferase foi geralmente proporcional à quantidade de ARN que foi utilizada para a electroporação ao longo de todo o decorrer da experiência, i.e. o sinal obtido após electroporação de 40 pmol de ARN foi cerca de duas vezes superior ao sinal de quando se utilizaram 20 pmol de ARN para cada ponto temporal.

Comparavelmente, a co-electroporação da mesma quantidade de ARN que codifica d2eGFP (rematado com ARCA ou com beta-S-ARCA(Dl)) em células dendríticas imaturas diminuiu a expressão de ARN que codifica luciferase rematado com ARCA mas não do rematado com beta-S-ARCA (Dl) , após 24, 48 e 72 horas comparativamente com um controlo que foi electroporado com apenas ARN que codifica para luciferase (Figura 3B) . No seu conjunto isto indica que em células dendríticas imaturas o ARN rematado com ARCA pode aparentemente não competir tão eficientemente pela maquinaria da tradução com ARN endógeno quanto o ARN rematado com beta-S-ARCA(Dl), quando o nível de ARN aumenta para além de um determinado limiar estabelecido muito provavelmente pela disponibilidade de um ou mais factor (es) limitantes da tradução. Assim, a incorporação de beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' origina ARN que são preferencialmente traduzidos quando competem com ARN endógeno ou outro ARN exógeno.

Exemplo 5: Estabilização de ARN por análogos de remate de fosforotioato em células dendríticas imaturas

Os resultados apresentados na Figura 2 indicam que o tipo de remate a 5' influencia não apenas a eficiência da tradução, como também a estabilidade do ARNm funcional em células dendríticas. Para substanciar isto, determinámos as estabilidades absolutas de ARN com as várias estruturas de remate a 5' em células dendríticas. A estabilidade absoluta é dada pela semivida do ARN. Células dendríticas humanas imaturas e maduras foram electroporadas com ARN que codificam d2eGFP que tinha sido proporcionado, co-transcrição ou pós-transcrição, um análogo de remate, utilizando as enzimas de capeamento do vírus vaccinia. Uma porção das células foi colhida após 2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas, e a quantidade de ARN que codifica d2eGFP foi determinada relativamente a um ARN endógeno (o ARN que codifica hipoxantina-fosforribosiltransferase) utilizando RT-PCR em tempo real (Fig. 4) . Utilizaram-se os valores determinados para calcular a semivida dos ARN (Tabela 2). Como controlo para a electroporação e expressão de proteínas determinou-se a quantidade de d2eGFP após 24 horas utilizando quantificação por citometria de fluxo, em que foi assegurada a mesma ordem que nas experiências descritas acima.

Tabela 2: Estabilidade dos ARN com diferentes estruturas de remate em células dendríticas imaturas (iDC) e células dendríticas maduras (mDC). Média ± desvio padrão.

De forma interessante, observámos para todos os ARN em células dendríticas imaturas uma cinética de degradação de bifásica do ARN, com a excepção do ARN sem remate, que foi quase completamente degradado logo após 8 horas (Fig. 4A e Tabela 2). Nas primeiras 8 horas após a electroporação os ARN foram degradados mais rapidamente em comparação com a subsequente fase de degradação até ao final das experiências. 0 ARN com beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' é o ARN mais estável em células dendríticas imaturas tanto durante a fase de degradação precoce como durante a fase de degradação tardia (com semividas de cerca de 8 e 27 horas, respectivamente; Fig. 4A e Tabela 2). Isto é inesperado pois nos estudos in vitro o beta-S-ARCA (D2) exibiu a melhor protecção contra a degradação pela enzima de descapeamento Dcp2. A maioria dos ARN com um remate exibiu semividas na gama de 5 a 7 horas na fase de degradação precoce e entre 15 e 18 horas na fase de degradação tardia, respectivamente. Isto significa que de facto o beta-S-ARCA (Dl) exibe um claro efeito sobre a estabilização de ARN -em particular durante a fase de degradação tardia. A maioria das outras estruturas de ARN a 5', contudo, apenas exibiram um efeito mínimo sobre a estabilidade absoluta do ARN. Uma excepção é o m7GppppGm7G. 0 ARN com este remate na extremidade 5' é o ARN mais instável com uma semivida inferior a 2,5 horas durante as primeiras 8 horas após a electroporação. 0 ARN com m7GppppGm7G que está ainda presente na célula 8 horas após a electroporação é, curiosamente, tão estável como os outros ARN com uma semivida de cerca de 20 horas.

Pelo contrário, para células dendríticas imaturas, a degradação do ARN em células dendríticas maduras segue uma cinética uniforme ao longo de todo o decorrer de tempo estudado (Fig. 4B e Tabela 2) . Comparativamente com a cinética de degradação inicial em células dendríticas imaturas, o ARN foi claramente mais estável em células dendríticas maduras e exibiu semividas que eram comparáveis às da fase de degradação tardia em células dendríticas imaturas. Como foi já observado em células dendríticas imaturas, a estabilidade absoluta é apenas marginalmente dependente da estrutura de remate, uma vez que todos os ARN com um remate possuem semividas similares entre 13 e 15 horas (com a excepção de ARN com m7Gppppm7G na extremidade 5' que exibiu uma semivida inferior a 12 horas). Atá o ARN sem remate é bastante estável em células dendríticas maduras com uma semivida de mais de 10 horas. As semividas comparáveis dos ARN estão de acordo com as estabilidades de ARN funcional comparáveis em células dendríticas maduras (cf. Tabela 1).

Em resumo, esta experiência mostra que o factor decisivo para a intensidade e a duração da expressão de proteínas de ARN com várias estruturas de remate a 5' em células dendríticas maduras é a eficiência da tradução.

Exemplo 6: Expressão aumentada de ARN com beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' após injecção nos nódulos linfáticos de ratinhos

Recentemente, pudemos mostrar que a injecção de ARN em nódulos linfáticos (injecção intranodal) é a abordagem mais promissora para obter uma resposta imunitária contra o antigénio codificado (DE 10 2008 061 522.6) . O ARN que é administrado desta maneira é principalmente assimilado por células dendríticas imaturas. Assim, investigámos se é também observada uma expressão de proteínas mais forte em nódulos linfáticos para ARN com beta-S-ARCA(Dl) comparativamente com ARN com outras estruturas de remate (analisado exemplificativamente para ARCA que aplicámos nos estudos anteriores). ARN que codificam luciferase (como descrito acima) que ou foram transcritos na presença de ARCA ou de beta-S-ARCA(Dl)) foram injectados nos nódulos linfáticos inguinais de ratinhos. Após assimilação do ARN pelas células dos nódulos linfáticos e tradução da luciferase codificada, quantificou-se a expressão de proteínas por medição da actividade da luciferase utilizando imagiologia in vivo. Administrou-se i.p. uma solução aquosa de D-luciferina (Promega, Mannheim, Alemanha; 150 mg/kg de peso corporal) nos ratinhos. Anestesiaram-se os animais com isofluorano e colocaram-se na câmara à prova de luz de um sistema de imagiologia IVIS Lumina (Xenogen, Russelsheim, Alemanha). Passados 25 min após a injecção de luciferina, quantificaram-se os fotões emitidos durante um tempo de integração de 1 min. Utilizaram-se imagens em escala de cinzentos de ratinhos como referência sobre as quais foi sobreposto o sinal de bioluminescência sob a forma de uma imagem em escala de pseudo-cor (preto = menos intenso; branco = mais intenso) empregando o software Living Image (Xenogen). Para quantificar a bioluminescência, as regiões de interesse (ROI) foram retiradas e foi medido o fluxo total (fotões/s, p/s) em ROI. A bioluminescência de fundo de uma região não emissora de sinal no animal foi subtraída dos valores de bioluminescência respectivos para cada animal.

De acordo com os resultados em células dendríticas imaturas isoladas observámos que a expressão de proteínas de ARN com beta-S-ARCA (Dl) na extremidade 5' foi superior em cada ponto temporal (2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas após aplicação intranodal do ARN) á do ARN com ARCA na extremidade 5' (Fig. 5). Ao longo de todo o decorrer de tempo a expressão (dada pelo integral da curva) foi aumentada em cerca de 8 vezes. Portanto, pudemos mostrar pela primeira vez que através do beta-S-ARCA(Dl) a expressão de proteínas em nódulos linfáticos, e assim, principalmente nas células dendríticas imaturas aí residentes, é melhorada em intensidade e em duração.

Exemplo 7: Sensibilização de células T de novo aumentada após vacinação utilizando ARN com beta-S-ARCA(Dl) na extremidade 5' A fusão do antigénio com um péptido de comando amino-terminal e um sinal de tráfego de MHC de classe I carboxi-terminal resulta numa apresentação de antigénio aumentada de epítopos de MHC de classe I e classe II (Kreiter et al., 2008, J. Immunol. 180: 309-318) . A injecção intranodal de ARN com ARCA que codifica um antigénio respectivamente modificado e incluindo as optimizações acima descritas em relação à sequência poli (A) e UTR de beta-globina, permite a sensibilização de novo de células T naive (DE 10 2008 061 522.6). Investigámos se a sensibilização de novo pode ser adicionalmente aumentada utilizando beta-S-ARCA(Dl).

Ratinhos foram imunizados por injecção intranodal de ARN nu duas vezes por dia (no dia 0 e no dia 3) que codifica um antigénio específico com as modificações anteriores. No dia 8 a frequência de células T específicas do antigénio no sangue periférico e no baço foi determinada utilizando coloração com tetrâmero. Como mostrado na Fig. 6, cerca de 5% das células T CD8+ no sangue periférico e cerca de 6% das células T CD8+ no baço foram positivas para o tetrâmero após imunização duplicada com ARN com ARCA. Utilizando ARN com beta-S-ARCA (Dl) foram medidas mais de 12% e 13% células T CD8+ positivas para o tetrâmero no sangue periférico e no baço, respectivamente. Isto demonstra pela primeira vez que o beta-S-ARCA(Dl) conduz a uma expressão de proteínas aumentada e prolongada a partir do ARN portador do remate beta-S-ARCA (Dl) que depois resulta numa resposta imunitária melhorada (medida como sensibilização de novo de células T), mesmo no contexto de um antigénio que foi optimizado em relação ao processamento e transporte para complexos do MHC de classe I e classe II e utilizando um molde de ADN para a preparação de um ARN com superior estabilidade e eficiência de tradução.

Exemplo 8: Análise por HPLC de m27'2~°GppspG (Dl) e (D2) (i.e., beta-S-ARCA(Dl) e (D2)).

Foi realizada a análise por HPLC analítica de uma mistura diastereomérica de m27'2 ’~°GppspG (Dl) e (D2) (i.e., beta-S- ARCA (Dl) e (D2)) numa razão molar de cerca de 1:3, num instrumento Agilent Technologies 1200 Series com uma coluna Supelcosil LC-18-T RP (5 pm, 4,6 x 250 mm, caudal: 1,3 ml/min) utilizando um gradiente linear de 0-25% de metanol em acetato de amónio 0,05 M, pH = 5,9, em 15 min. A detecção de UV (VWD) foi realizada a 260 nm e a detecção de florescência (FLD) foi realizada com excitação a 280 nm e detecção a 337 nm. Tempos de retenção: m27'2’~°GppspG (Dl) = 10,4 min, m27'2’~°GppspG (D2) = 10,7 min (Fig. 7) .

Lisboa, 2014-12-18

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina compreendendo um ARN que está modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R1 e R2 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH e alcoxi opcionalmente substituído, ou R1 e R2, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R1 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-0-, R3 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R5 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R3 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA. 1 Composição de vacina da reivindicação 1, em que a 2 estrutura de remate a 5' , após transferência do referido ARN 3 aumentar a estabilidade do ARN, aumentar a eficiência da 4 para células apresentadoras de antigénio imaturas, é capaz de 5 tradução do ARN, prolongar a tradução do ARN, aumentar a expressão total de proteínas do ARN e/ou aumentar a resposta imunitária contra um antigénio ou um péptido antigénico codificados pelo referido ARN comparativamente com o mesmo ARN sem a estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I).
3. Composição de vacina da reivindicação 1 ou 2, em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo C1-C4 opcionalmente substituído, alcenilo C2-C4 opcionalmente substituído e arilo opcionalmente substituído.
4. Composição de vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, F, OH, metoxi, etoxi e propoxi.
5. Composição de vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o remate a 5' do ARN é o diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.
6. Composição de vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que é formulada para injecção intranodal.
7. Célula apresentadora de antigénio imatura compreendendo um ARN que está modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-0-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende 0 substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA.
8. Composição de vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou célula apresentadora de antigénio imatura da reivindicação 7, para utilização num método para eliciar uma resposta imunitária num indivíduo.
9. ARN com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquimica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, para utilização num método para aumentar a estabilidade de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas e/ou para aumentar a expressão de um ARN em células apresentadoras de antigénio imaturas, o referido método compreendendo: transferir o referido ARN para as células apresentadoras de antigénio imaturas.
10. ARN compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo o referido antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I):

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, para utilização num método para aumentar a porção de moléculas do MHC que apresentam um antigénio de interesse sobre a superfície de uma célula apresentadora de antigénio, o referido método compreendendo: transferir o referido ARN para uma célula apresentadora de antigénio imatura.
11. ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I) :

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e 0(0¾) 2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, para utilização num método para estimular e/ou activar células efectoras imunitárias, o referido método compreendendo: transferir o referido ARN para células apresentadoras de antigénio imaturas, e fazer contactar as células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias.
12. ARN para a utilização da reivindicação 11, em que o contacto das células apresentadoras de antigénio com as células efectoras imunitárias é realizado in vitro ou in vivo.
13. ARN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um péptido ou uma proteína compreendendo um antigénio de interesse ou um seu péptido antigénico, estando o referido ARN modificado com uma estrutura de remate a 5' de acordo com a fórmula (I) :

em que R1 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, cicloalquilo opcionalmente substituído, heterociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído e heteroarilo opcionalmente substituído, R2 e R3 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em H, halogéneo, OH, e alcoxi opcionalmente substituído, ou R2 e R3, em conjunto, formam 0-X-0, em que X é seleccionado do grupo que consiste em CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) e C(CH3)2 opcionalmente substituídos, ou R2 está combinado com o átomo de hidrogénio na posição 4 ' do anel ao qual R2 está ligado para formar -0-CH2- ou -CH2-O-, R5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Se e BH3, R4 e R6 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em 0, S, Se e BH3, n é 1, 2 ou 3, em que a configuração estereoquímica no átomo P que compreende o substituinte R5 corresponde à do átomo P do diastereoisómero Dl de beta-S-ARCA, para utilização num método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo.
14. ARN para a utilização da reivindicação 13, que é administrado por injecção intranodal.
15. Célula apresentadora de antigénio imatura da reivindicação 7 para utilização num método para indução de uma resposta imunitária num indivíduo, em que o referido ARN foi transferido para as referidas células apresentadoras de antigénio imaturas. Lisboa, 2014-12-18