ES2453380T3 - Composiciones y utilizaciones dirigidas hacia la huntingtina - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido antisentido modificado químicamente con 17 a 35 nucleótidos que comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] La enfermedad de Huntington (EH) es un desorden neurodegenerativo causado por la mutación del gen de la huntingtina. La alteración de este único gen ampliamente expresado tiene como resultado un desorden progresivo y neurodegenerativo con un gran número de síntomas característicos. La enfermedad de Huntington es un desorden autosómico dominante que comienza en la mediana edad, aunque se han documentado casos de inicio desde la infancia hasta pasados los 70 años de edad. Una edad de inicio temprana se asocia con la herencia paterna, siendo el 70 % de los casos de enfermedad juvenil heredados del padre. Los síntomas tienen un componente emocional, motor y cognitivo. La corea es una característica específica del desorden motor y se define como los movimientos espontáneos excesivos irregulares en el tiempo, aleatorios y abruptos. Puede ser casi imperceptible o severa. Otras anomalías frecuentemente observadas incluyen distonía, rigidez, bradiquinesia, disfunción oculomotora y temblor. Los trastornos del movimiento voluntario incluyen descoordinación motora, disartria y disfagia. Los trastornos emocionales habituales incluyen depresión e irritabilidad, y el componente cognitivo incluye demencia subcortical (Mangiarini et al., 1996, Cell 87 : 493 – 506). Los cambios en cerebros con EH son numerosos e incluyen pérdida neuronal y gliosis, particularmente en el córtex y en el cuerpo estriado (Vonsattel and DiFiglia. 1998. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 369 – 384).

[0002] La mutación de la EH es una expansión de CAG que tiene como resultado la expansión de un tracto de la poliglutamina en la proteína de la huntingtina, una proteína 350 kDa de función desconocida (Huntington Disease Collaborative Research Group, 1993, Cell. 72: 971 – 83). Se ha descubierto que el tamaño normal y expandido del alelo de la EH son repeticiones CAG6 – 37 y CAG35 – 121, respectivamente. Las secuencias más largas repetidas se asocian con un comienzo más temprano de la enfermedad. Se desconoce el mecanismo por el cual la expansión da lugar a la patología. Sin embargo, la ausencia de un fenotipo de EH borrado en individuos para una copia de huntingtina, o el aumento de la severidad de la enfermedad en estos homocigóticos para la expansión sugiere que la mutación no da lugar a una pérdida de funciones (Trottier et al., 1995, Nature Med., 10: 104 – 110). Se han implicado la desregulación transcripcional y la pérdida de funciones de las proteínas coactivadoras transcripcionales en la patogénesis de la EH. Se ha demostrado específicamente que la huntingtina mutante afecta la transcripción dependiente del activador en los estados tempranos de la patogénesis de la EH (Dunah et al., 2002. Science 296: 2238 – 2243). El perfil genético de la sangre humana identificó 322 ARNs mensajeros que mostraban una expresión significativamente alterada en muestras de sangre con EH en comparación a muestras de individuos normales o presintomáticos. La expresión de los genes marcadores estaba, de igual manera, sustancialmente alterada en las muestras de cerebro extraídas del caudado con EH post mórtem, lo que sugirió que el aumento de genes en las muestras de sangre refleja mecanismos de la enfermedad hallados en el cerebro. El control de la expresión de genes puede proporcionar un método sensible y cuantificativo de controlar la progresión de la enfermedad, especialmente en estadios tempranos de la enfermedad tanto en modelos animales como en pacientes humanos (Borovecki et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11023 – 11028).

[0003] Se admitió la identificación del gen para el desarrollo de la enfermedad en modelos animales, incluyendo ratones transgénicos que portaban formas mutadas del gen humano o murino. Los modelos incluyen ratones con un fragmento del gen humano, normalmente el primer o los dos primeros exones, que contienen la expansión de glutamina, además del gen murino no alterado de tipo salvaje y endógeno; ratones con la huntingtina humana completa con una región de repetición expandida de glutamina, de nuevo con el gen endógeno murino; y ratones con repeticiones CAG patógeno insertadas en la región de repetición de CAG. Todos los modelos tienen, al menos, algunas características compartidas con la enfermedad humana. En estos ratones se probaron numerosos agentes terapéuticos diferentes para la prevención, la mejora y el tratamiento de la EH (véase, por ejemplo, Hersch y Ferrante, 2004. NeuroRx. 1:298 – 306) utilizando numerosos criterios. Se espera que los compuestos funcionen mediante diversos mecanismos diferentes que incluyen la inhibición de la transcripción, la inhibición de caspasas, la inhibición de histona deacetilasa, antioxidantes, la inhibición / antioxidante de la huntingtina, antioxidante / bioenergético, antiexcitotóxico y antiapoptótico.

[0004] Numerosos autores han informado de que la represión del transgén de la huntingtina mutante en modelos animales con EH reduce los síntomas asociados a la enfermedad, (véase, por ejemplo, Díaz – Hernández et al., (2005. J. Neurosci. 25: 9773 – 81). Wang et al., (2005. Neurosci. Res. 53: 241 – 9) revelando que los ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) dirigidos contra el gen de la huntingtina en el modelo murino R6 / 2 inhibió la expresión de huntingtina transgénica y prolongó significativamente la longevidad, mejorando la función motora y reduciendo la pérdida de peso corporal.

[0005] Machida et al., (2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343: 190 – 7) informaron de que la liberación de ARN de interferencia (ARNi) mediada por virus adeno – asociado recombinante (rAAV) en el cuerpo estriado de un modelos murinos con EH mejoró las alteraciones neuropatológicas asociadas a la EH, como la acumulación de proteínas insolubles y la disminución de la expresión de DARPP – 32. Lo que es más importante, los autores declaran que los agregados neuronales en el cuerpo estriado se redujeron tras las transducción del ARNi en los

animales en comparación a los del momento de la transducción del ARNi.

[0006] Harper et al., (2005. PNAS 102: 5820 – 25) encontraron que el ARNi dirigido a la huntingtina reducía el ARNm de la huntingtina y la expresión de proteínas en cultivos celulares y en un modelo murino con EH. Los autores declaran que el silenciamiento génico de la huntingtina mejoró las alteraciones neuropatológicas y de comportamiento asociadas a la EH.

[0007] Rodrigues – Lebron et al.,, (2005. Mol. Ther. 12: 618 – 33) declararon que la transferencia genética de ARNi viral adeno – asociado recombinante serotipo 5 (rAAV5) para suprimir los niveles de huntingtina mutante estriada en el ratón transgénico R6 / 1 con EH tuvo como resultado niveles reducidos de ARNm de huntingtina y de proteínas. La reducción de la huntingtina fue concomitante a la reducción del tamaño y el número de inclusiones neuronales intranucleares y otros marcadores de la EH, y dio como resultado un comienzo retrasado del clasping en cola y extremidades en el fenotipo mostrado por los ratones R6 / 1.

[0008] Nguyen et al., (2005. PNAS, 102: 11840 – 45) utilizaron un compuesto de clioquinol de unión a metales para tratar las células PC12 que expresaban el gen de la huntingtina mutante y se halló una acumulación reducida de proteínas mutantes. El tratamiento con clioquinol en el ratón modelo R6 / 2 con EH dio como resultado fenotipos patológicos y de comportamiento mejorados, incluyendo la disminución de acumulación de agregados de huntingtina, disminución de atrofia estriada, mejora en la prueba del Rotarod, reducción de la pérdida de peso, normalización de los niveles de glucosa e insulina en sangre y prolongación de la esperanza de vida, apoyando la conclusión de que la reducción de proteínas de huntingtina mutante es terapéutica para la EH.

[0009] Haque et al., (Experimental Neurology, Vol. 144, 1997, págs 139 – 146) describen una terapia génica antisentido para enfermedades neurodegenerativas.

[0010] Nellemann et al., (Molecular and cellular neurosciences, Vol. 16, 2000, págs 313 – 323) revelan la inhibición de la síntesis de huntingtina por oligodesoxinucleótidos antisentido.

[0011] Boado et al., (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 294, 2000, págs 239 – 243) revelan la reducción mediada por antisentido del gen de la huntingtina humana.

[0012] En base a estos y otros estudios, cualquier experto en la disciplina reconocerá que reducir la expresión del gen mutante de la huntingtina será terapéutico para la EH.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0013] La invención presenta un oligonucleótido antisentido químicamente modificado de 17 a 35 nucleótidos de longitud que comprende, al menos, 17 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleótida de SEC ID Nº 118.

[0014] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido de la invención, o una sal, éster, sal de dicho éster o un profármaco farmacéuticamente aceptable y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0015] La invención también proporciona un oligonucleótido antisentido de la invención una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de la Enfermedad de Huntington.

[0016] La invención también proporciona un oligonucleótido antisentido o una composición farmacéutica de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar la Enfermedad de Huntington.

RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

[0017] Una realización de la divulgación es un oligonucleótido antisentido de 12 a 35 nucleótidos de longitud que comprende, al menos, 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleótida seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 46 – 357. En una realización preferente, la secuencia nucleótida se selecciona del grupo formado por las SECs ID Nº: 50, 93, 100, 105, 110, 125, 137, 345, 346 y 353. En otra realización, el oligonucleótido antisentido tiene, al menos, el 95 % o 100 % de complementariedad a la SEC ID Nº 4. En otra realización, el oligonucleótido antisentido tiene, al menos, un enlace, un grupo azúcar o nucleobase. En otra realización, el oligonucleótido antisentido comprende un oligonucleótido quimérico que tiene un segmento hueco localizado entre los segmentos laminares 5' y 3', y en algunas realizaciones, el segmento hueco del oligonucleótido quimérico se compone de 2' – desoxinucleótidos y los segmentos laminares se componen de nucleótidos con los grupos azúcar modificados. En otras realizaciones, el grupo azúcar modificado es 2' – Ome o un ácido nucleico bicíclico. En una realización preferente, el segmento hueco del oligonucleótido quimérico consiste en diez 2' – desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados con 2' – O – metoximetil, y en otra realización preferida, dicho oligonucleótido antisentido tiene 20 nucleótidos de longitud.

[0018] En otra realización, cada enlace internucleósido del oligonucleótido antisentido es un ligamiento

fosforotioato internucleósido. [0019] En otra realización, cada citosina del oligonucleótido antisentido es 5 – metilcitosina.

[0020] En otra realización, el oligonucleótido antisentido tiene de 17 a 25 nucleótidos de longitud. En otra realización, el oligonucleótido antisentido tiene de 19 a 23 nucleótidos de longitud. En otra realización, el oligonucleótido antisentido tiene 20 nucleótidos de longitud.

[0021] Otra realización de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende cualquier oligonucleótido antisentido descrito en la presente y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0022] Otra realización es un método para tratar un individuo con riego de sufrir o que ya sufre la Enfermedad de Huntington (EH) comprendiendo la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un compuesto antisentido de 12 a 35 nucleobases de longitud que tiene, al menos, el 90 % de complementariedad con los nucleótidos 1650 – 1704, 1807 – 1874, 3183 – 3228, 4010 – 4087, 4265 – 4288, 4553 – 4608, 5781 – 5820 y 6793 – 6796 de la SEC ID Nº 4, en la que la administración trata al individuo. En algunas realizaciones, la administración comprende la vía intratecal, intracerebroventricular o intraparenquimal. En algunas realizaciones, la administración comprende la administración en el líquido cefalorraquídeo del individuo mediante infusión intratecal. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la mejora de uno o más indicadores de la EH. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la prolongación del tiempo de supervivencia del individuo. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende el retraso de inicio de la EH. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido tiene, al menos, el 95 % o el 100 % de complementariedad con los nucleótidos 1650 – 1704, 1807 – 1874, 3183 – 3228, 4010 – 4087, 4265 – 4288, 4553 – 4608, 8781 – 5820 y 6793 – 6796 de la SEC ID Nº 4.

[0023] En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene, al menos, un enlace internucleósido modificado, un grupo azúcar o nucleobase. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende un oligonucleótido quimérico que tiene un segmento hueco localizado entre los segmentos laminares 5' y 3'. En algunas realizaciones, el segmento hueco del oligonucleótido quimérico se compone de 2' – desoxinucleótidos, el grupo azúcar modificado es 2' – OMe o un ácido nucleico bicíclico. En algunas realizaciones, el segmento hueco del oligonucleótido quimérico consiste en diez 2' – desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados por 2' – O – metoxietil. En algunas realizaciones, cada enlace internucleósido es un enlace internucleósido fosforotioato. En algunas realizaciones, cada citosina es 5 – metilcitosina. En algunas realizaciones, el compuesto comprende de 17 a 25 nucleótidos, en otros de 19 a 23 nucleótidos, en otros 20 nucleótidos.

[0024] En algunas realizaciones, el método comprende, además, la selección de un individuo que padece la EH. En algunas realizaciones, el método comprende, además, elegir a un individuo susceptible de padecer la EH.

[0025] Otra realización es un método para tratar un individuo con riesgo de padecer o que padece actualmente la enfermedad de Huntington (EH), comprendiendo la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica compuesta de un oligonucleótido antisentido de 12 a 35 nucleótidos que incluye, al menos, 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleótida seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 46 – 357. En algunas realizaciones, la secuencia nucleótida se selecciona del grupo formado por las SECs ID Nº 50, 93, 100, 105, 110, 125, 137, 345, 346 y 353.

[0026] Otra realización es la utilización de cualquier compuesto u oligonucleótido antisentido descrito en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la EH. Una realización es la utilización de un oligonucleótido antisentido de 12 a 35 nucleótidos que comprende, al menos, 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleótida seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 46 – 357 en la preparación de un medicamiento para el tratamiento de la EH. Otra realización es la utilización de un oligonucleótido antisentido de 12 a 35 nucleótidos que comprende, al menos, 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleótida seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 50, 93, 100, 105, 110, 125, 137, 345, 346 y 353 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la EH. En otra realización, el tratamiento de la EH es el retraso de la progresión de la EH en un individuo que padece la EH. En otra realización, el tratamiento de la EH es la prevención del comienzo de la EH en un individuo susceptible. En otra realización, el tratamiento de la EH comprende la prolongación del tiempo de supervivencia del individuo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Resumen

[0027] La enfermedad de Huntington es una enfermedad progresiva y neurodegenerativa causada por la mutación de un gen único ampliamente expresado, la huntingtina. La mutación es una expansión de una región de repetición CAG, en la que una expansión mayor tiene como resultado una severidad mucho mayor de la enfermedad y una edad de inicio de la enfermedad más temprana. La mutación conlleva una variedad de síntomas motores, emocionales y cognitivos, y supone la formación de agregados de huntingtina en el cerebro. La ausencia de un

fenotipo para la supresión de un gen único, y un incremento en la severidad de la enfermedad en individuos vehículos de dos copias mutadas del gen de la huntingtina sugiere que la mutación no tiene como resultado la pérdida de funciones.

[0028] La tecnología antisentido proporciona un mecanismo para el desarrollo de agentes terapéuticos para una variedad de enfermedades, incluyendo la Enfermedad de Huntington. El principio subyacente de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido, que se hibridiza a un ácido nucleico diana, modula las actividades de expresión génica como la transcripción o la traducción. Esta especificidad de secuencia hace a los compuestos antisentido extremadamente atractivos como herramientas para la validación diana y la funcionalización génica, así como terapias para modular selectivamente la expresión de genes involucrados en la enfermedad.

[0029] La presente invención se dirige a los compuestos antisentido, especialmente a los ácidos nucleicos y a los oligómeros de tipo ácido nucleico, que se dirigen a un ácido nucleico que codifica la huntingtina y que regula la expresión de esta. En una realización preferente, el compuesto antisentido se dirige a la huntingtina humana (SECs ID Nº 1 – 5 y 45). También se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden los compuestos de la invención. Dichos métodos emplean compuestos antisentido que regulan la expresión de la huntingtina.

Terapia

[0030] Se describen en la presente métodos para el tratamiento de un individuo que padece la enfermedad de Huntington (EH). El tratamiento incluye el retraso de la progresión de la enfermedad en un individuo que padece la enfermedad de Huntington (EH) así como el retraso del comienzo de la EH en un individuo susceptible. En algunas realizaciones, dichos métodos de tratamiento comprenden la administración al líquido cerebroespinal de un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que incluye un compuesto antisentido o un oligonucleótido dirigido a la huntingtina. Dichos métodos de tratamiento comprende, además, la prolongación del tiempo de supervivencia de un individuo que padece la EH o prolonga el tiempo de supervivencia de un individuo susceptible de la EH. El retraso de la progresión de la enfermedad se indica por la falta de un cambio mensurable en, o una mejora de, uno o más indicadores de la EH, incluyendo marcadores moleculares o síntomas de la enfermedad. El retraso del comienzo de la EH se indica por la falta de presentación clínica de indicadores de la EH.

[0031] La presente invención utiliza compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos antisentidos, para su utilización en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican la huntingtina, modulando finalmente la cantidad de proteína de huntingtina producida. Una forma apropiada de modulación es inhibir las moléculas de ácido nucleico que codifican la huntingtina, que se demuestra por la reducción en los niveles de ácidos nucleicos que codifican la huntingtina. En consecuencia, se describen en la presente compuestos antisentido, incluyendo oligonucleótidos antisentido, para su utilización inhibiendo la expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican la huntingtina, es decir, reduciendo los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican la huntingtina. Los términos “ácido nucleico diana” y “molécula de ácido nucleico que codifica la huntingtina” utilizados en la presente se emplean para facilitar la inclusión de ADN que codifica la huntingtina, ARN (incluyendo pre – ARNm y ARNm o partes de los mismos) transcritos a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN. Los oligonucleótidos antisentido que se hibridizan y modulan la expresión de uno o más ácidos nucleicos que codifican la huntingtina se consideran “dirigidos a la huntingtina”. Los oligonucleótdios antisentido de la presente invención no distinguen necesariamente entre ácidos nucleicos diana de la huntingtina de tipo salvaje y ácidos nucleicos diana de la huntingtina mutante. Es deseable clínicamente reducir los niveles de ácidos nucleicos diana de la huntingtina mutante, sin añadir efectos adversos debidos a la reducción de los niveles de ácidos nucleicos diana de huntingtina de tipo salvaje.

[0032] En una realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % al exón 30 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 4010 – 4087 de la SEC ID Nº 4. Por tanto, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4010 – 4087 de la SEC ID Nº 4. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 99, 100, 101 o 102.

[0033] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4028 – 4146 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen aquellos que comprenden una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 99, 100, 101, 102 o 103.

[0034] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4538 – 4615 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen aquellos que comprenden una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 109, 110, 111 o 112.

[0035] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % al exón 34 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 4553 – 4608 de la SEC ID Nº 4. Por tanto, en esta realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4553 -4608 de la SEC ID Nº4. Esta realización incluye los oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada de las

SECs ID Nº 110 o 112.

[0036] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 5781 – 5820 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 123, 124 o 125.

[0037] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % al exón 42 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 5722 -5863 de la SEC ID Nº 4. Por tanto, en esta realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 5722 -5863 de la SEC ID Nº4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 123, 124 o 125.

[0038] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 6763 -6796 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 136, 137 o 138.

[0039] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % al exón 48 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 6560 -6773 de la SEC ID Nº 4 y al exón 49 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 6774 – 6919 de la SEC ID Nº 4. En consecuencia, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 6560 – 6919 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido incluyen una secuencia seleccionada de las SECs ID Nº 134, 135, 136, 137, 138 o 151.

[0040] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 3183 -3253 de la SEC ID Nº 4. En una realización, los oligonucleótidos antisentido comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 90, 91, 92, 93 y 94. En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 3183 -3228 de la SEC ID Nº 4. Este aspecto incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 90, 91, 92 o 93.

[0041] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a una región que comprende tanto el exón 23 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 3019 -3211 de la SEC ID Nº 4 como el exón 24 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 3212 -3288 de la SEC ID Nº 4. Por tanto, en una realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 3091 – 3288 de la SEC ID Nº 4. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 90, 91, 92, 93 o 94.

[0042] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4265 -4288 de la SEC ID Nº 4. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 104 o 105.

[0043] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % al exón 31 de la SEC ID Nº 4, que incluye los nucleótidos 4088 -4311 de la SEC ID Nº 4. Por tanto, en una realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 4088 – 4311 de la SEC ID Nº 4. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 103, 104 o 105.

[0044] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1607 -1704 de la SEC ID Nº 45. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348 o 349. En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1607 -1704 de la SEC ID Nº 45. Este aspecto incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348 o 349.

[0045] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1807 -1874 de la SEC ID Nº 45. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 351, 352, 353, 354, 355, 356 o 357.

[0046] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 985 -1580 de la SEC ID Nº 45. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, o 54.

[0047] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1079 -1459 de la SEC ID Nº 45. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 48, 49, 50, 51, 52 o 53.

[0048] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1055 -1477 de la SEC ID Nº 45. Esta región comprende una pluralidad de repeticiones de CAG. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 338, 48, 49, 50, 51, 52 o 53.

[0049] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 90 % a los nucleótidos 1019 -1542 de la SEC ID Nº 45. Esta realización incluye oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 48, 49, 50, 51, 52, 53, o 54.

[0050] En otra realización, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 95 % a una región nucleótida citada en la presente. En otras realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son complementarios en, al menos, el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % a una región nucleótida citada en la presente.

[0051] “Individuo que padece la Enfermedad de Huntington (EH)” utilizado en la presente es un individuo que ha recibido de un profesional de la salud, como un médico, un diagnóstico para EH. Son bien conocidos en la disciplina los análisis de diagnóstico relevantes y se comprende que incluyen, sin limitación, análisis genético para determinar la presencia de una mutación en el gen de la huntingtina, examen neurológico y escáner cerebral. Los análisis genéticos para las mutaciones del gen de la huntingtina es un análisis diagnóstico exacto para determinar la presencia de la EH.

[0052] Se entiende que un “individuo susceptible de padecer la Enfermedad de Huntington (EH)” abarca un individuo que, según análisis genéticos y / historial familiar, es probable que desarrolle la EH. El análisis genético para las mutaciones del gen de la huntingtina es un análisis de diagnóstico particularmente preciso para determinar la susceptibilidad a la EH. Los indicadores de la EH pueden también emplearse en la identificación de un individuo susceptible de padecer la EH.

[0053] Para que la inhibición antisentido de la huntingtina tenga efectos clínicamente deseables, es beneficioso liberar un oligonucleótido antisentido dirigido a la huntingtina del sistema nervioso central (SNC) de un individuo, y, en particular, a las regiones del SNC afectadas por la EH. Puesto que la barrera hematoencefálica es, por lo general, impermeable a oligonucleótidos antisentido administrados sistémicamente, un método preferente de proporcionar los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la huntingtina de los tejidos del SNC es la administración de los oligonucleótidos antisentido directamente en el líquido cerebroespinal (LCE). Las vías de administración al LCE y al cerebro incluyen la vía intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV) e intraparenquimal. La administración IT o ICV puede lograrse mediante el uso de bombas implantados quirúrgicamente que infusionan un agente terapéutico en el líquido cerebroespinal. La administración intraparenquimal puede lograrse mediante la implantación quirúrgica de un catéter en el cerebro. Los términos “liberación en el LCE” y “administración en el LCE” incluyen la infusión IT o ICV de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la huntingtina mediante el uso de una bomba de infusión. En algunas realizaciones, la infusión IT es una manera apropiada de liberar en el LCE. En otras realizaciones, el oligonucleótido antisentido se infusiona continuamente en el LCE durante el curso del tratamiento; dicha administración se denomina “infusión continua” o, en el caso de la infusión IT, “infusión IT continua”. También se contempla la infusión intraparenquimal continua utilizando una bomba.

[0054] En algunas realizaciones, se emplea una bomba de infusión como, por ejemplo, la bomba Medtronic SyncroMed®, para liberar los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la huntingtina al SNC. La bomba SyncroMed® se implanta quirúrgicamente según los procedimientos establecidos por el fabricante. La bomba contiene un depósito para contener una solución farmacológica, que se bombeo a una dosis programada en un catéter implantado quirúrgicamente. Para la administración por vía intratecal de un fármaco, el catéter se implanta intratecalmente mediante cirugía. En el contexto de los métodos descritos en la presente, el fármaco es la cmoposición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido a la huntingtina.

[0055] Una “composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido” se utiliza en la presente para referirse a una composición que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido a la huntingtina en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, un diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato. Como se describe en la presente, un Número ISIS representa la sal nonadecasódica del oligonucleótido antisentido que tiene la secuencia nucleobase descrita, en la que los nucleósidos 1 a 5 y 16 a 20 tienen grupos azúcar 2' -= -metoximetil, los nucleósidos 6 a 15 son 2' – desoxinucleótidos, cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5 – metilcitosina.

[0056] Una “cantidad terapéuticamente efectiva” utilizada en la presente es una cantidad de un compuesto que presenta un beneficio terapéutico en un individuo. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a la huntingtina, como un oligonucleótido antisentido, en una cantidad que ralentiza o previene la progresión de la EH, o previene o retrasa el comiendo de la EH. En una realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de oligonucleótido antisentido tendrá como resultado la mejora, la prevención o la ralentización del empeoramiento de uno o más indicadores o síntomas de la EH, como los descritos en la presenta. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido antisentido dirigido a la

huntingtina oscila entre los 8 mg y los 12 mg de oligonucleótido antisentido. En otras realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido antisentido dirigido a la huntingtina es de 10 mg. El término “tratar” utilizado en la presente en referencia a un paciente con la EH incluye la administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención.

[0057] “Ralentizar la progresión de la enfermedad” utilizado en la presente se refiere a la prevención de, o al retraso de, un cambio clínicamente indeseable en uno o más parámetros clínicos en un paciente que sufre la EH, como los descritos en la presente. Se encuentra dentro de las habilidades de un médico la identificación de la ralentización de la progresión de la enfermedad en un individuo que padece la EH, utilizando una o más de los análisis de evaluación descritos en la presente. Además, cabe destacar que un médico puede realizar al individuo análisis de diagnóstico diferentes a los descritos en la presente para evaluar la velocidad de progresión de la enfermedad en un individuo con la EH.

[0058] “Retrasar el comienzo de la EH” utilizado en la presente se refiere a retrasar cambios indeseables en uno o más indicadores de la EH que anteriormente eran negativos para la EH. Un médico puede utilizar el historial familiar de EH para determinar la edad aproximada de comienzo de la EH en un individuo susceptible de padecer EH para determinar si el comienzo de la EH se ha retrasado.

[0059] “Indicadores de EH” utilizado en la presente son parámetros empleados por un profesional de la medicina, como un médico, para diagnosticar o medir la progresión de la EH e incluyen, sin limitación, análisis genéticos, auditivos, movimientos oculares, fuerza, coordinación, corea (movimientos rápidos, bruscos o involuntarios), sensación, reflejos, equilibrio, movimiento, estado mental, demencia, trastorno de personalidad, historial familiar, pérdida de peso y degeneración del núcleo caudado. La degeneración del núcleo caudado se establece mediante técnicas de escáner cerebral como la resonancia magnética (RM) o la tomografía computarizada (TC).

[0060] Una “mejora en un indicador de EH” utilizada en la presente se refiere a la ausencia de un cambio no deseable, o la presencia de un cambio deseable en un o más indicadores de EH. En una realización, una mejora en un indicador de EH se prueba por la ausencia de un cambio medible en uno o más indicadores de EH. En otra realización, una mejora en un indicador de EH se prueba por un cambio deseable en uno o más indicadores de EH.

[0061] Una ralentización de la progresión de la enfermedad puede comprender un incremente del tiempo de supervivencia en un individuo que padece la EH. Un “incremento del tiempo de supervivencia” se refiere al incremento de la supervivencia de un individuo que padece la EH, respecto al tiempo de supervivencia aproximado basado en la progresión de la EH y / o en el historial familia de EH. Un médico puede utilizar uno o más análisis de evaluación aproximados descritos en la presente para predecir el tiempo de supervivencia aproximado de un individuo que padece la EH. Un médico también puede utilizar el historial familiar de un individuo que padece la EH para predecir el tiempo de supervivencia.

[0062] Los compuestos antisentido dirigidos a la huntingtina pueden emplearse para modular la expresión de la huntingtina en un animal, como un humano, incluyendo humanos que padecen o son susceptibles de padecer la EH. En una realización, los compuestos antisentido inhiben, efectivamente, los niveles o la función de la huntingtina del ARN. Debido a la reducción de huntingtina, los niveles de ARNm pueden permitir la alteración de los productos de expresión de proteína de la huntingtina, también pueden medirse alteraciones resultantes. Los compuestos antisentido de la presente invención puede, efectivamente, inhibir el nivel o la función de la huntingtina en el ARN o se consideran los productos de expresión de proteína un compuesto antisentido activo. En una realización, los compuestos antisentido de la invención inhiben la expresión de la huntingtina causando una reducción del ARN de, al menos, el 10 %, de, al menos, el 20 %, de, al menos, el 25 %, de, al menos, el 30 %, de, al menos, el 40 %, de, al menos, el 50 %, de, al menos, el 60 %, de, al menos, el 70 %, de, al menos, el 75 %, de, al menos, el 80 %, de, al menos, el 85 %, de, al menos, el 90 %, de, al menos, el 95 %, de, al menos, el 98 %, de, al menos, el 99 %, o del 100 %.

[0063] La reducción de la expresión de huntingtina puede medirse en un fluido corporal, en un tejido o en un órgano del animal. Son conocidos en la disciplina los métodos para obtener muestras para su análisis, como de los fluidos corporales o los tejidos, así como los métodos de preparación de las muestras para permitir su análisis. También son conocidos en la disciplina los métodos para el análisis del ARN y de los niveles de proteína anteriormente citados. Según los métodos clínicos rutinarios conocidos en la disciplina, los efectos del tratamiento utilizando los compuestos de la invención pueden evaluarse midiendo biomarcadores asociados a la expresión del gen diana en los fluidos, los tejidos o los órganos anteriormente mencionados, extraídos de un animal que ha estado en contacto con uno o más compuestos de la invención. Los biomarcadores de la huntingtina incluyen de manera no limitante la acumulación de inclusiones neuronales positivas de huntingtina, la pérdida de ciertos tejidos neuronales, etc.

[0064] Además, la respuesta sistémica de un sujeto al tratamiento puede evaluarse controlando clínicamente medidas relevantes que incluyen de manera no limitante: transaminasas del hígado, bilirrubina, albúmina, nitrógeno de la urea sanguínea, creatina y otros marcadores de la función del riñón y el hígado; interleucinas, factores de necrosis de tumor, moléculas de adhesión intracelular, proteína C – reactiva y otros marcadores de inflamación.

[0065] También se contemplan métodos por los que los fluidos corporales, órganos o tejidos han estado en contacto con una cantidad efectiva de uno o más compuestos o composiciones antisentido de la invención. Los fluidos corporales, órganos o tejidos pueden estar en contacto con uno o más compuestos de la invención dando como resultado la modulación de la expresión de huntingtina en las células de los fluidos corporales, los órganos o los tejidos. Una cantidad efectiva puede determinarse controlando el efecto modulador del compuesto o composición antisentido en ácidos nucleicos diana o en sus productos mediante los métodos rutinarios de los expertos en la disciplina. También se contemplan los métodos de tratamiento ex vivo en los que las células o tejidos se aíslan de un sujeto, se ponen en contacto con una cantidad efectiva de compuesto o composición antisentido y se reintroducen en el sujeto mediante procedimientos conocidos por los expertos en la disciplina.

[0066] En una realización, se presentan los usos de un compuesto de un oligonucleótido aislado de ARN bicatenario en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión o sobreexpresión de huntingtina. Por tanto, se describe en la presente el uso de un oligonucleótido aislado de ARN bicatenario dirigido a la huntingtina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno por los métodos descritos anteriormente.

Composiciones farmacéuticas

[0067] Los compuestos antisentido dirigidos a la huntingtina pueden emplearse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes aceptables son bien conocidos por los expertos en la disciplina. La selección de un diluyente

o de un vehículo se basa en un número de factores entre los que se incluye, de manera no limitante, la solubilidad del compuesto y la vía de administración. Estas consideraciones son bien conocidas por los expertos en la disciplina. En un aspecto, los compuestos antisentido de la presente invención inhiben la expresión de la huntingtina.

[0068] También pueden emplearse compuestos antisentido dirigidos a la huntingtina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la expresión de la huntingtina. En una realización, la enfermedad o el trastorno es la enfermedad de Huntington.

[0069] Los compuestos antisentido de la presente invención incluyen cualquier sal, ester o sales de los mismo farmacéuticamente aceptable, o cualquier equivalente químico funcional que, hasta su administración en un animal, incluyendo humanos, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se aproxima a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos oligoméricos de la presente invención, a sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y a otros bioequivalentes.

[0070] El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en forma inactiva o menos activa que se convierte en forma activa (es decir, un fármaco) en el cuerpo o las células por la acción de enzimas endógenas u otros químicos y / o condiciones. En particular, las versiones de profármacos de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados de SATE [(S – acetil – 2 – tioetil) fosfato] según los métodos descritos en las patentes WO 93 / 24510 o WO 94 / 26764.

[0071] El término “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que mantienen la actividad biológica deseada del compuesto padre y no confieren efectos toxicológicos al mismo. La sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son apropiados y bien aceptados para su administración terapéutica a humanos. En otra realización también se proporcionan sales de sodio de compuestos de ARN bicatenario.

Formulaciones

[0072] Los compuestos oligoméricos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse a otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas por receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para asistir en la distribución y / o la absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación dichas formulaciones para asistir en la distribución y / o absorción incluyen de manera no limitante las patentes U. S.:5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575 y 5,595,756.

[0073] La presente invención también incluye composiciones y fórmulas farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de diferentes maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y de la zona que se quiere tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo de manera no limitante las membranas oftálmicas y mucosas, incluyendo la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo por inhalación o insuflación de polvos

o aerosoles, incluyendo por nebulizador (intratecal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o

instramuscular; o intracraneal, por ejemplo la administración intratecal o intraventricular. Los sitios de administración son bien conocidos por los expertos en la disciplina. Los oligonucleótidos con, al menos, una modificación 2' – O – metoxietil se creen adecuados para su administración oral.

[0074] Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosis única, pueden prepararse según las técnicas convencionales ya conocidas en la industria farmacéutica. Estas técnicas incluyen la fase de asociar los principios activos con los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos y, a continuación, si es necesario, dando forma al producto.

[0075] En algunas realizaciones, las composiciones para administración no parenteral incluyen una o más modificaciones de los oligonucleótidos naturales (es decir, oligonucleótidos desoxirribosil de fosfodiéster completo o ribosil de fosfodiéster completo). Estas modificaciones pueden incrementar la afinidad de unión, la estabilidad de la nucleasa, la permeabilidad celular o tisular, la distribución tisular u otras propiedades biológicas o farmacocinéticas.

[0076] Las composiciones orales para administración no parenteral de compuestos oligoméricos pueden formularse en forma de dosis múltiples como, por ejemplo, tabletas, cápsulas, jarabes líquidos, cápsulas blandas, supositorios y enemas. El término “administración alimentaria” abarca, por ejemplo, la administración oral, rectal, endoscópica y sublingual / bucal. Estas composiciones para compuestos oligoméricos orales pueden denominarse “potenciadores de penetración en la mucosa”.

[0077] Los compuestos oligoméricos, como los oligonucleótidos, pueden administrarse oralmente en forma de granular, incluyendo, por ejemplo, partículas secas en aerosol, o complejadas para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen en profundidas en la patente U. S. 6,287,860. Las formulaciones orales para oligonucleótidos y sus preparaciones se describen detalladamente en las solicitudes de patentes de Estados Unidos 09 / 108,673 (presentada el 1 de julio de 1998), 09 / 315,298 (presentada el 20 de mayo de 1999) y 10 / 071,822, presentada el 8 de febrero de 2002.

[0078] En una realización, las composiciones de compuestos oligoméricos orales comprenden, al menos, un miembro del grupo formado por surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y surfactantes no quelantes. Dichas fórmulas son bien conocidas por los expertos en la disciplina.

[0079] Un “vehículo farmacéutico” o “excipiente” puede ser un solvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos en un animal ya conocido en la disciplina. El excipiente puede ser líquido o sólido cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada, y se selecciona, cuando se sabe la vía de administración, de manera que presente el volumen, la consistencia, etc. deseados.

[0080] Las composiciones oligoméricas orales puede, además, contener otros componentes adjuntos encontrados convencionalmente en las composiciones farmacéuticas a niveles de uso establecidos.

[0081] Los expertos en la disciplina reconocerán que las fórmulas se diseñan de manera rutinaria según sus vías de administración.

Combinaciones

[0082] Las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos oligoméricos. En otra realización relacionada, las composiciones de la presente invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. Pueden utilizarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Compuestos

[0083] El término “compuesto oligomérico” se refiere a una estructura polimérica capaz de hibridarse a una región de una molécula de ácido nucleico. Este término incluye oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos y combinaciones quiméricas de los mismos. Los compuestos oligoméricos se preparan lineales de manera rutinaria, pero pueden unirse o prepararse circulares. Además, son ya conocidas en la disciplina las estructuras ramificadas. Un “compuesto antisentido” o “compuesto oligomérico antisentido” se refiere a un compuesto oligomérico que es parcialmente complementario a, al menos, la región de una molécula de ácido nucleico que se hibrida y que modula (incrementa o disminuye) su expresión. En consecuencia, dado que todos los compuestos antisentido pueden llamarse compuestos oligoméricos, no todos los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. Algunos ejemplos de compuestos oligoméricos incluyen cebadores, sondas, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía

externa (EGS), splicers alternativos y siRNAs. De este modo, estos compuestos pueden introducirse en forma monocatenaria, bicatenaria, circular, ramificada u horquillas y pueden contener elementos estructurales como bultos

o lazos internos o terminales. Los compuestos oligoméricos bicatenarios pueden ser dos hebra hibridizadas para formar compuestos bicatenarios o una hebra única con complementariedad suficiente para permitir su hibridación y la formación de un compuesto bicatenario parcial o total. Los compuestos de la presente invención no son catalíticos.

[0084] Un “oligonucleótido antisentido” es un compuesto antisentido que es un oligómero con base de ácido nucleico, pero no incluye dúplex de siRNA. En una realización preferente, y en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, el “oligonucleótido antisentido” puede ser una molécula de ácido nucleico de hebra única. Un oligonucleótido antisentido puede modificarse químicamente.

[0085] Los compuestos antisentido comprende de unos 12 a unos 35 nucleótidos enlazados. Estos representan los compuestos antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

o 35 nucleótidos de longitud.

[0086] En una realización, los compuestos antisentido tienen de 15 a 39 nucleótidos de longitud, como se ejemplifica anteriormente.

[0087] En una realización, los compuestos antisentido tienen de 17 a 25 nucleótidos de longitud, como se ejemplifica en la presente.

[0088] En una realización, los compuestos antisentido tienen 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos enlazados de longitud, o, de manera alternativa, los compuestos oligoméricos oscilan entre los 19 y los 24 nucleótidos.

[0089] En una realización, los compuestos antisentido tienen 21, 22, 23 o 24 nucleótidos enlazados de longitud, o, de manera alternativa, los compuestos oligoméricos oscilan entre los 21 y los 24 nucleótidos.

[0090] En una realización, los compuestos antisentido tienen 20 nucleótidos de longitud.

[0091] En una realización de la invención, los compuestos antisentido bicatenarios incluyen los ARNs pequeños de interferencia (siRNAs). El término “siRNA” utilizado en la presente se define como un compuesto bicatenario que tiene una primera y una segunda hebra, cada una con una parte central y dos partes terminales independientes. La parte central de la primera hebra es complementaria a la parte central de la segunda hebra, permitiendo la hibridación de las hebras. Las partes terminales son independientes y, opcionalmente, complementarias. Los extremos de las hebras pueden modificar añadiendo una o más nucleobases naturales o modificadas para formar un saliente. En algunos ejemplos no limitantes, la primera hebra del siRNA es antisentido al ácido nucleico diana, mientras la segunda hebra es complementaria a la primera hebra. Una vez que la hebra antisentido se designa para dirigirse a un ácido nucleico diana en particular, puede designarse entonces la hebra sentido del siRNA y sintetizarse como complemento de la hebra antisentido y cualquiera hebra puede contener modificaciones o adiciones en sus extremos. Por ejemplo, en una realización, ambas hebras del dúplex de siRNA serían complementarias a las nucleobases centrales, teniendo cada una salientes en uno o ambos extermos. Es posible que un extremo de un dúplex esté despuntado y el otro tenga nucleobases salientes. En una realización, el número de nucleobases salientes es de 1 a 6 en el extremo 3' de cada hebra del dúplex despuntada. En otra realización, el número de nucleobases salientes es de 1 a 6 en el extremo 3' terminal de solo una de las hebras del dúplex. En otra realización, el número de nucleobases salientes es de 1 a 6 en uno o ambos extremos 5' terminal de las hebras del dúplex. En otra realización, el número de nucleobases salientes es cero.

[0092] En una realización de la invención, los compuestos antisentido bicatenarios son siRNAs canónicos. El término “siRNA canónico” utilizado en la presente se define como un compuesto oligomérico bicatenario que tiene una primera hebra y una segunda hebra, cada una de 21 nucleobases con ambas hebras complementarias en 19 nucleobases y que tienen en sus extremos 3' terminal un dímero desoxitimidina (dTdT) que en el compuesto bicatenario actúa como saliente en el extremo 3'.

[0093] Cada hebra del dúplex de siRNA puede tener de 12 a 35 nucleobases. En una realización preferente, cada hebra del dúplex de siRNA es de 17 a 25 nucleobases. La parte central complementaria puede ser de 12 a 35 nucleobases. En una realización preferente, la parte central complementaria es de 17 a 25 nucleobases. Cabe señalar que cada hebra del dúplex de siRNA y la parte central complementaria pueden ser de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 35 nucleobases. Las partes terminales pueden ser de 1 a 6 nucleobases. Cabe señalar que las partes terminales pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleobases. Los siRNAs también puede no tener partes terminales. Las dos hebras de un siRNA pueden enlazarse internamente dejando libres los extremos 3' o 5' terminal, o pueden enlazarse para formar una estructura en horquilla continua o lazo. La estructura en horquilla puede contener un saliente en cada extremo 5' o 3' terminal, produciendo una extensión del carácter de hebra única.

[0094] En otra realización, los compuestos antisentido bicatenarios son siRNAs con extremos despuntados. El

término “siRNA con extremos despuntados” utilizado en la presente se define como un siRNA que no tiene salientes terminales. Es decir, al menos un extremo del compuesto bicatenario está despuntado. Lo siRNAs, ya sean canónicos o despuntados, actúan para obtener enzimas de ARNasa bicatenario y desencadena el reclutamiento o activación del mecanismo del ARNi antisentido. En otra realización, se contemplan los compuestos de ARNi de hebra única (ssARNi) que actúan a través del mecanismo del ARNi antisentido.

[0095] Pueden realizarse otras modificaciones a los compuestos bicatenarios y pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos terminales, a las posiciones de nucleobases seleccionadas, a los grupos azúcar o a uno de los enlaces internucleósidos. De manera alternativa, las dos hebras puede enlazarse mediante un grupo que no es ácido nucleico o un grupo de enlace. Cuando se forma a partir de una hebra única, los compuestos puede tomar la forma de una molécula de tipo horquilla complementaria que se dobla en sí misma para formar un dúplex. Por lo tanto, los compuestos puede ser bicatenario parcial o totalmente. Cuando se forma a partir de dos hebras, o una hebra única que toma la forma de una molécula de tipo horquilla complementaria que se dobla en sí misma para formar un dúplex, las dos hebras (o regiones que forman dúplex monocatenarios) son complementarias cuando el par de bases en el modelo de Watson -Crick.

[0096] Los compuestos antisentido según la presente invención pueden comprender un compuesto antisentido complementario de 12 a 35 nucleobases (es decir, de unos 12 a unos 35 nucleósidos unidos). En otras palabras, un compuesto compuesto antisentido monocatenario de la invención comprende de 12 a 35 nucleobases, y un compuesto antisentido bicatenario de la invención (como un siRNA, por ejemplo) comprende dos hebras, cada una de 12 a 35 nucleobases. Las partes antisentido están incluidas en los compuestos antisentido de la invención (sean de de hebra única o de bicatenario y en, al menos, una hebra). La “parte antisentido” es la parte del compuesto antisentido designada para funcionar gracias a uno de los mecanismos antisentido anteriormente mencionados. Cualquier experto en la disciplina entenderá que esto incluye partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nucleobases.

[0097] Los compuestos antisentido descritos en la presente tienen partes antisentido de 12 a 35 nucleobases. Cabe señalar que la parte antisentido puede ser de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nucleobases.

[0098] Se consideran también compuestos antisentido adecuados los compuestos antisentido de 12 a 35 nucleobases que comprenden una extensión de, al menos, 8, preferiblemente, al menos, 12 y más preferiblemente, al menos 17 nucleobases consecutivas seleccionadas de los compuestos antisentido ilustrativos. También se consideran compuestos antisentido apropiados los compuestos antisentido de 12 a 35 nucleobases que comprenden una extensión de, al menos, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 nucleobases seleccionadas de los compuestos antisentido ilustrativos.

[0099] Los compuestos antisentido de la invención incluyen secuencias de compuesto antisentido que comprenden, al menos, las 8 (o de 9 a 19) nucleobases consecutivas del extremo 5' terminal de uno de los compuestos antisentido ilustrativos (siendo las nucleobases restantes una extensión consecutiva del mismo antisentido que comienza inmediatamente aguas arriba del extremo 5' terminal del compuesto antisentido específicamente hibridizable al ácido nucleico diana y que continúa hasta que el antisentido contiene de 12 a 35 nucleobases). Se representan otros compuestos antisentidos mediante secuencias de compuesto antisentido que comprenden, al menos, las 8 (o de 9 a 19) nucleobases consecutivas del extremo terminal de uno de los compuestos antisentido (siendo las nucleobases restantes una extensión consecutiva del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente aguas abajo del extremo 3' terminal del compuesto antisentido hibridizable específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta que el compuesto antisentido contiene de 12 a 35 nucleobases). Cabe señalar que los compuestos antisentido pueden representarse por secuencias de compuesto antisentido que comprende, al menos, 8 (o de 9 a 19) nucleobases consecutivas de una parte interna de la secuencia de un compuesto ilustrativo, y pueden extenderse en una o ambas direcciones hasta que el antisentido contenga de 12 a 35 nucleobases.

[0100] Cualquier experto en la disciplina equipado con los compuestos antisentido ilustrados en la presente será capaz de, sin excesiva experimentación, identificar otros compuestos antisentido.

Modificaciones químicas

[0101] Como se conoce en la disciplina, un nucleósido es una combinación base – azúcar. Esta parte base del nucleósido es, normalmente, una base heterocíclica (a veces referidas como una “nucleobase” o, simplemente, como una “base”). Las dos clases más comunes de bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen, además, un grupo fosfato convalentemente unido al grupo azúcar del nucleósido. Para los otros nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse a la parte 2', 3' o 5' azúcar hidroxilo. En los oligonucleótidos en formación, los grupos fosfato se unen covalentemente a los nucleósidos adyacentes para formar un compuesto polimérico lineal. Uno por uno, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal puede unirse, además, para formar un compuesto circular. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad en las nucleobases internas y pueden, además, plegarse

para producir un compuesto bicatenario parcial o totalmente. En los oligonucleótidos, los grupos fosfato se utilizan para formar el segmento principal del internucleósido del oligonucleótido. El enlace normal o segmento principal del ARN y del ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.

Enlaces internucleósidos modificados

[0102] Los compuestos oligoméricos pueden comprender enlaces internucleósidos modificados, por ejemplo, enlaces internucleósidos naturales. Como se define en la presente especificación, los oligonucleótidos con enlaces internucleósidos modificados incluyen enlaces internucleósidos que conservan un átomo de fósforo y enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Para los objetivos de la presente especificación, y como se encuentra, a veces, en la disciplina, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su segmento principal internucleósida también pueden considerarse oligonucleósidos.

[0103] Los compuesto oligoméricos, incluyendo compuestos antisentido y oligonucleótidos antisentido, pueden tener uno o más enlaces internucleósidos modificados. Los segmentos principales de los oligonucleótidos modificados que contiene un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilofosfotriésteres, fosfonatos metilo y alquilo, incluyendo fosfonatos 3' – alquileno, fosfonatos 5' – alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo fosforamidato 3' – amino y aminoalquilofosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilofosfonatos, tionoalquilofosfotriésteres, fosfonoacetato y tiofosfonoacetato (véanse Sheehan et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31 (14), 4109 – 4118 y Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 940 – 950), selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces 3' – 5' normales, análogos de estos unidos a 2' – 5' y con polaridad invertida en los que uno o más enlaces internucleótidos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos que tienen polaridad invertida comprenden un enlace único 3' a 3' en el enlace internucleótido 3', es decir, un residuo nucleósido invertido único que puede ser abásico (la nucleobase no está o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También se incluyen diversas sales, sales combinadas y formas libres de ácido.

[0104] Se ha mostrado que los N3' – P5' – fosforamidatos muestran una alta afinidad hacia una hebra de ARN complementario y resistencia a la nucleasa (Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143 – 3144). Se han estudiado los N3' – P5' – fosforamidatos con cierto éxito para reducir in vivo la expresión del gen c – myc (Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 3966 – 3971; y Faira et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 40 – 44). [0105] En algunas realizaciones, los compuestos oligoméricos pueden tener uno o más enlaces internucleósidos fosforotioato y / o heteroátomo, en particular – CH2 –NH –O –CH2, – CH2 – N (CH3) – O – CH2 – (conocido como un segmento principal metileno (metilimino) o MMI), – CH2 – ON (CH3) – CH2, – CH2 –N (CH3) – N(CH3) – CH2 –y – O – N(CH3) – CH2 –CH2 – (en el que el enlace internucleótido fosfodiéster nativo se representa como – O – P (=O) (OH) –O – CH2–).

[0106] Algunos segmentos principales oligonucleótidos que no incluyen un átomo de fósforo tienen segmentos principales que se forman por enlaces alquilos o cicloalquilos de cadena corta, enlaces internucleósidos de heteroátomos mezclados y alquilos o cicloalquilos o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen lo que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de un grupo azúcar de un nucleósido); segmento principal siloxano; segmento principal sulfuro, sulfóxido y sulfona; segmento principal formacetilo y tioformacetilo; segmento principal metileno formacetilo y tioformacetilo; segmento principal riboacetilo; segmento principal con alqueno; segmento principal sulfamato; segmento principal metileneimino y metilenehidracino; segmento principal sulfonatos y sulfonamidos; segmento principal amida; y otros con componentes N, O, S y CH2 combinados.

Azúcares modificados

[0107] Los compuestos oligoméricos pueden también contener una o más grupos azúcar sustituidos. Los compuestos apropiados pueden comprender uno de los siguientes en posición 2': OH; F; O –, S – o N – alquilo; O -, S – o N – alquenilo; O –, S – o N – alquinilo; o O – alquilo – O – alquilo, en el que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden sustituirse, o no, por alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10. También son apropiados O ((CH2)n O) m CH3, O(CH2)n OCH3, O(CH2)n NH2, O(CH2)n CH3, O(CH2)n ONH2, y O(CH2)n ON ((CH2)n CH3)2, donde n y m son de 1 a 10. Otros oligonucleótidos comprenden uno de los siguientes en posición 2': C1 a C10 alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O – alcarilo u O – aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sirilo sustituido, un grupo de excisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes con propiedades similares. Una modificaicón incluye 2' – metoxietoxi (2' – O –CH2 CH2 OCH3, también conocido como 2' – O – (2 – metoxietilo) o 2' – MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486 – 504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación incluye 2' – dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O (CH2)2 ON (CH3)2, también conocido como 2' – DMAOE, como se describe en los ejemplos citados a continuación, y 2' – dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la disciplina como 2' – dimetil – amino – etoxietilo o 2' – DMAEOE), es decir, 2' – O – (CH2)2 –O –(CH2)2 – N (CH3)2, también descrito en los ejemplos citados a continuación.

[0108] Otras modificaciones incluyen 2' – metoxi (2' – O – CH3), 2' – aminopropoxi (2' – OCH2 CH2 CH2 NH2), 2' – alilo (2' -CH2 – CH = CH2), 2' – O – alilo (2' – O -CH2 – CH = CH2) y 2' – flúor (2' – F). La modificación 2' puede estar en posición arabino (arriba) o ribo (abajo). Una modificación 2' arabino es 2' – F. También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el nucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o los oligonucleótido unidos 2' – 5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los compuestos antisentido también pueden tener miméticos de azúcar como grupos ciclobutilo en lugar de azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de Estado Unidos que enseñan la preparación de estas estructuras de azúcar modificadas incluyen, de manera no limitante, las patentes U. S.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 5,700,920; y 6,147,200.

[0109] Otra modificación incluye grupos de azúcar bicíclicos denominadas “ácidos nucleicos bicíclicos” o “BNAs” en los que el grupo 2' – hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo se une al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar para formar un grupo de azúcar bicíclico (revisada en Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558 – 561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1 – 7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239 – 243; véanse también las patentes U. S. 6,268,490 y 6,670,461). El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2) que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', o puede ser un grupo etileno. El isómero alfa – L del grupo de ácido nucleico bicíclico en el que el enlace es un grupo metileno, es un grupo azúcar adicional modificado. Otro grupo azúcar bicíclica que se ha preparado y estudiado tiene el puente desde el grupo 3' – hidroxilo mediante un grupo metileno único hasta el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar que forma un enlace de 3' – C, 4' – C – oximetileno (véase la patente U. S. 6,043,060).

Miméticos de oligonucleótidos

[0110] Otro grupo de compuestos oligoméricos incluye miméticos de oligonucleótidos. El término “mimético” aplicado a los oligonucleótidos incluye los compuestos oligoméricos en los que el anillo furanosa o el anillo furanosa y el enlace internucleótido se reemplazan por nuevos grupos y el reemplazo del anillo furanosa también se denomina en la disciplina como un sustituto de azúcar. La parte base heterocíclica o una parte base heterocíclica modificada se mantiene para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Los miméticos de oligonucleótidos incluyen compuestos de ácido nucleico peptídico (PNA) (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 – 1500), compuestos basados en morfolino (véase, por ejemplo, la patente U. S. 5,034,506), ácidos nucleicos ciclohexenos (CeNa). En los oligonucleótidos ANCe (Wang et. al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595 – 8602), y ácidos nucleicos fosfonomonoéster.

Nucleobases modificadas y alternadas

[0111] Los compuestos oligoméricos pueden asimismo incluir nucleobases (a menudo denominadas bases heterocíclica o simplemente “bases”), modificaciones o sustituciones. Tal y como se utiliza en el presente documento, nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina, adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina tiamina (T), citosina (C) y uracilo (U). Una “sustitución” es el reemplazo de una base no modificada o natural con otra base no modificada o natural. Las nucleobases “modificadas” se refieren a otras nucleobases sintéticas y naturales como 5 – metilcitosina (5 – me –C), 5 – hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2 – aminoadenina, aminoadenina, 6 – metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2 – propilo, y otros derivados de alquilo de adenina y guanina 2 – tiouracilo, 2 – tiotimina y 2 – tiocitosina, 5 – halouracilo y citosina, 5 – propinil (-C ≡ C – CH3) uracilo y citosina, y otros derivados de alquinilo de las bases de pirimidina, 6 – azouracilo, citosina y tiamina, 5 – uracilo (pseudouracilo), 4 – tiouracilo, 8 – halo, 8 – amino, 8 tiol, 8 – tioalquilo, 8 – hidroxi y otras 8 – adeninas y guaninas sustituidas, 5 – halo, particularmente 5 – bromo, 5 – trifluorometil y otros 5 – uracilos y citosinas sustituidos, 7 – metilguanina y 7 – metiladenina, 2 – F – adenina, 2 – aminoadenina, 8 – azaguanina y 8 – azaadenina, 7 – desazaguanina y 7 – desazaadenina, 3 – desazaguanina y 3 – desazaadenina. Las nucleobases modificadas incluyen asimismo pirimidinas tricíclicas como la fenoxazina citidina (1H – dirimido (5,4 – b)(1, 4) benzoxazina – 2(3H -ona), fenotiazina citidina (por ejemplo, 9 – (2 – aminoetoxi) – H -pirimido (5, 4 – b)(1, 4)benzoxazina – 2(3H) -ona), carbazol -citidina (2H – dirimido (4, 5 – b) indol – 2 -ona), piridoindol citidina (H pirido (3’, 2’ : 4, 5) pirrol (2, 3 – d) pirimidina – 2 -ona). Las nucleobases modificadas pueden asimismo incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se sustituye con otros heterociclos, por ejemplo, 7 – desazaadenina, 7 – desazaguanosina, 2 – aminopiridina y 2 – piridona. Algunas modificaciones de nucleobases incrementan la afinidad de unión de los compuestos de la invención. Estas incluyen 5 – pirimidinas sustituidas, 6 – azapirimidinas y purinas N – 2, N – 6 y O – 6 sustituidas, incluyendo 2 – aminopropiladenina, 5 – propiniluracilo y 5 – propinilcitosina; las sustituciones de 5 – metilcitosina ha demostrado incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico por 0,6 – 1,2 ºC y actualmente son sustituciones de bases adecuadas, incluso más particularmente, cuando se combinan con modificaciones de 2´ -O – metoxietil -azúcar. Se comprende que la modificación de la base no implica tales modificaciones químicas para producir sustituciones en una secuencia de ácido nucleico.

[0112] Los compuestos oligoméricos de la presente invención incluyen asimismo compuestos heterocíclicos policíclicos en lugar de uno o más restos de bases heterocíclicas de origen natural. Se han citado anteriormente un número de compuestos heterocíclicos tricíclicos. Estos compuestos se utilizan habitualmente en aplicaciones antisentido para incrementar las propiedades de unión de la hebra modificada en una hebra diana. Las

modificaciones más estudiadas se dirigen hacia las guanosinas, que en el presente documento se han denominado como G – abrazaderas o análogos de citidina.

Conjugados

[0113] Los compuestos oligoméricos pueden enlazarse químicamente a uno o más restos o conjugados que mejoran las propiedades del compuesto oligomérico como la actividad, la distribución celular o la captación celular. Estos restos o conjugados pueden asimismo incluir grupos de conjugado covalentemente unidos a grupos funcionales como los grupos hidroxilos primarios o secundarios. Los grupos de conjugado de la invención incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupo de conjugado adicionales incluyen colesterol, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, fluoresceínas, rodaminas, curaminas y colorantes. Grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de la invención, incluyen grupos que mejoran la captación, mejoran la resistencia a la degradación y / o fortalecen la hibridación específica en la secuencia con el ácido nucleico diana. Grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran las captación, distribución, metabolismo o excreción de los compuestos de la presente invención.

[0114] Los compuestos pueden asimismo modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que están unidos generalmente a uno o ambos extremo terminales de un compuesto oligomérico para mejorar las propiedades tales como por ejemplo, la estabilidad nucleasa. Están incluidos en los grupos estabilizadores estructuras en capuchón. Por “estructura en capuchón o grupo capuchón del extremo terminal” se refiere a las modificaciones químicas en las que se han incorporado a cualquier extremo terminal de los oligonucleótidos. Estas modificaciones de extremos terminales protegen los compuestos oligoméricos que tienen moléculas de ácido nucleico terminales de la degradación de exonucleasa, y pueden mejorar la distribución y / o localización en una célula. La cofia puede estar presente en los extremos terminales 5´ (5´ -cofia) o en los extremos terminales 3´ (3´ cofia) o pueden estar presentes en ambos extremos terminales de una única hebra, o en uno o más extremos terminales de ambas hebras de un compuesto bicatenario. Esta estructura de cofia no debe confundirse con la metilguanosina invertida “ 5´ cofia” presente en el extremo 5´ Terminal de las moléculas de ARNm nativas.

[0115] En ejemplos no limitantes, el 5´ -cofia incluye un residuo (resto) abásico invertido, un nucleótido 4´, 5´ metileno; nucleótido 1-(beta-D -eritrofuranosil), nucleótido 4’ -tio, nucleótido carbocíclico; nucleótido 1, 5 anhidrohexitol; nucleótidos -L; nucleótidos alfa; nucleótido de base modificada; unión fosforoditioato; nucleótido treo -pentofuranosil; nucleótido acíclico 3’, 4’ -seco; nucleótido acíclico 3, 4 -dihidroxibutil; riucleótido acíclico 3, 5 dihidroxipentil, grupo nucleótido 3’ -3’-invertido; grupo abásico 3’ -3’ – invertido ; grupo nucleótido abásico 3’ -2’ – ; grupo abásico 3’ -2 ’-invertido; 1, 4 – butanodiol fosfato; 3’ -fosforamidato; hexilfosfato; aminohexilfosfato; 3’ fosfato; 3’ -fosforotioato; fosforoditioato; o grupo de metilfosfonato enlazado o no enlazado. Para los constructos de siRNA, el extremo 5’-Terminal (5’ cofia) está comúnmente, aunque no se limita, en 5’ -hidroxil o 5’ -fosfato. [0116] Estructuras de 3´ cofia particularmente adecuadas incluyen, por ejemplo nucleótido 4’, 5 ’-metileno; nucleótido 1 -(beta – D -eritrofuranosil); nucleótido 4’ -tio, nucleótido carbocíclico; 5’ – amino -alquil fosfato; 1, 3 – diamina – 2 -propil fosfato, 3 – aminopropil fosfato; 6 – aminohexil fosfato; 1, 2 -aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; nucleótido 1,5 -anhidrohexitol; nucleótido -L; nucleótido alfa; nucleótido de base modificada; fosforoditioato; nucleótido treo – pentofuranosil; nucleótido acíclico 3’, 4 ’ -seco; nucleótido 3, 4 – dihidroxibutil; nucleótido 3, 5 – dihidroxipentil, grupo nucleótido 5’ -5 ’ – invertido; grupo abásico 5’ -5 ’-invertido; 5’ -fosforamidato; 5’ fosforotioato; 1, 4 -butanodiol fosfato; 5’ -amina; 5´ -fosforamidato enlazado o no enlazado, fosforotioato y / o fosforoditioato, metilfosfonato y grupos 5’ -mercapto (para más información, véase Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925).

1. Compuestos quiméricos

[0117] No es necesario que todas las posiciones en un compuesto oligomérico dado estén uniformemente modificadas, y, de hecho, una de las modificaciones citadas anteriormente pueden ser incorporadas a un único compuesto o incluso a un único nucleósido en un compuesto oligomérico.

[0118] La presente invención incluye además compuestos oligoméricos que son compuestos quiméricos. Compuestos oligoméricos “quiméricos” o “quimeras”, en el contexto de esta invención, son compuestos de única hebra o bicatenarios como los oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una comprende al menos una unidad de monómero, es decir; un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos son una forma de compuesto oligomérico. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región que está modificada con el fin de conferir al oligonucleótido una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, un aumento de la captación celular, una alteración de carga, un aumento de la estabilidad y / o aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para RNasas u otras enzimas. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN: ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado el clivaje de la diana de ARN cuando se une por un compuesto oligomérico como ADN, mejorando así en gran medida, la eficiencia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. El

clivaje de los híbridos ARN : ARN pueden, de manera similar, realizarse a través de las acciones de endorribonucleasas, como la RNasa III o RNasa L que escinde tanto el ARN celular y como el viral. Los productos de clivaje de la diana de ARN pueden ser detectados rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, mediante técnicas asociadas de hibridación de ácidos nucleicos conocidas ya en la disciplina.

[0119] Los compuestos oligoméricos quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos, oligonucleótidos miméticos, o regiones o partes de los mismos. Dichos compuestos se han denominado también en la técnica como híbridos o gapmers. Las patentes representativas de Estados Unidos que muestran la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, las patentes de U.S.: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.

[0120] Un "gapmer" se define como un compuesto oligomérico, en general, un oligonucleótido que tiene una región 2' -desoxioligonucleótida flanqueada por segmentos no desoxioligonucleótidos. La región central se conoce como "hueco". Los segmentos flanqueados se conocen como "alas”. Si bien no se desea estar ligado por la teoría, el hueco del gapmer presenta un sustrato reconocible por la RNasa H cuando se une al ARN diana, mientras que las alas no proporcionan dicho sustrato, pero pueden conferir otras propiedades como la contribución de la estabilidad dúplex o los efectos farmacocinéticos ventajosos. Cada ala puede estar formada por uno o más monómeros no desoxioligonucleótidos (si una de las láminas no tiene ningún monómero no desoxioligonucleótido, se describe un "hemimer"). En una realización, el gapmer es un hueco de diez desoxinucleótidos flanqueados por cinco alas no desoxinucleótidas. Esto se denomina gapmer 5 – 10 -5. Otras configuraciones son reconocidas fácilmente por los expertos en la disciplina. En una realización, las alas comprenden nucleótidos modificados 2' -MOE. En otra realización, el gapmer tiene un segmento principal de fosforotioato. En otra realización, el gapmer tiene alas de 2'-MOE y un segmento principal de fosforotioato. Se reconocen fácilmente otras modificaciones adecuadas por los expertos en la disciplina.

Síntesis del oligómero

[0121] La oligomerización de nucleósidos modificados y no modificados se puede realizar de forma rutinaria según los procedimientos de la literatura para el ADN (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) y / o ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 57075713).

[0122] Los compuestos oligoméricos pueden hacerse conveniente y rutinariamente a través de la técnica ya conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis es vendido por varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la disciplina puede emplearse adicional o alternativamente. Es ya conocido el uso de técnicas similares para la preparación de oligonucleótidos como los fosforotioatos y derivados alquilados.

Síntesis de oligonucleótidos

[0123] Dependiendo de la síntesis, los compuestos oligoméricos y fosforamiditas se realizan por métodos ya conocidos por los expertos en la disciplina. La oligomerización de nucleósidos modificados y no modificados se lleva a cabo según los procedimientos de la literatura para compuestos como ADN (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)y / o compuestos como ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713) Alternativamente, los oligómeros pueden ser adquiridos en diversas empresas de síntesis de oligonucleótidos tales como, por ejemplo, Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO).

[0124] Independientemente del protocolo utilizado en particular, los compuestos oligoméricos utilizados según esta invención pueden realizarse conveniente y rutinariamente mediante la técnica ya conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis es vendido por varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la técnica puede emplearse adicional o alternativamente (incluyendo la síntesis en fase de solución).

[0125] Los métodos de aislamiento y el análisis de oligonucleótidos son ya conocidos en la técnica. Un formato de placa de 96 pocillos es particularmente útil para la síntesis, el aislamiento y el análisis de oligonucleótidos para aplicaciones a pequeña escala.

Hibridación

[0126] "Hibridación" se refiere al apareamiento de hebras complementarias de los compuestos oligómeros. Aunque no se limita a un mecanismo en particular, el mecanismo más común de apareamiento implica enlaces de hidrógeno que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson -Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso entre nucleósidos o bases nucleotídicas complementarias (nucleobases) de las hebras de los compuestos oligoméricos.

Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede ocurrir en diversas circunstancias.

[0127] Un compuesto oligomérico es hibridable específicamente cuando hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico en secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que los ensayos se realizan en el caso de ensayos in vitro.

[0128] "Condiciones severas de hibridación" o "condiciones severas" se refieren a las condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará en su secuencia diana, aunque en un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias, y "condiciones severas" en las que los compuestos oligoméricos se hibridan en una secuencia diana determinada por naturaleza y composición de los compuestos oligoméricos, y los ensayos en los que se están investigando.

Complementariedad

[0129] "Complementariedad", tal y como se utiliza en el presente docuemnto, se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso entre dos nucleobases en una o dos hebras del compuesto oligomérico. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico diana, la posición de unión de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que está en una posición complementaria. El compuesto oligomérico y además el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí. Por lo tanto, "hibridar específicamente" y "complementario" son términos utilizados para indicar un grado suficiente de apareamiento o complementariedad precisos sobre un número suficiente de nucleobases de manera que la unión estable y específica tiene lugar entre el compuesto oligomérico y un ácido nucleico diana.

[0130] Tal y como se utiliza en el presente documento, un oligonucleótido antisentido es “completamente complementario” al ácido nucleico diana cuando cada nucleobase del oligonucleótido antisentido sea capaz de someterse a un apareamiento de bases precisas con igual número de nucleobases en el ácido nucleico diana. Se entiende en la disciplina que la secuencia del nucleótido antisentido no tiene que ser completamente complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser activo en la inhibición de la actividad del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones hay posiciones “no complementarias”, denominadas también “malapareamientos”, entre el oligonucleótido antisentido y el ácido nucleico diana, tales posiciones no complementarias pueden ser toleradas entre el oligonucleótido antisentido y el ácido nucleico diana siempre que el oligonucleótido antisentido siga siendo específicamente hibridable con el ácido nucleico diana. Por ejemplo, como se ha demostrado en el presente documento, 387916 tiene una nucleobase no complementaria con respecto a la huntingtina de ratón, es capaz de reducir los niveles de ARNm de la huntingtina de ratón in vitro e in vivo. Una “nucleobase no complementaria” se refiere a una nucleobase de un oligonucleótido antisentido que es incapaz de someterse a un apareamiento de bases precisas con una nucleobase en una correspondiente posición en el ácido nucleico diana. Tal y como se ha utilizado en el presente documento, son intercambiables los términos “no complementario” y “malapareamiento”. En algunas realizaciones de oligonucleótidos antisentido que no tienen más de tres nucleobases no complementarias con respecto al ácido nucleico que codifica la huntingtina, se consideran “complementarias” al ácido nucleico que codifica la huntingtina. En otras realizaciones, los oligonucleótidos antisentido no contienen más de dos nucleobases no complementarias con respecto al ácido nucleico que codifica la huntingtina. Además, en otras realizaciones, los oligonucleótidos antisentido no contienen más de una nucleobase no complementaria con respecto al ácido nucleico que codifica la huntingtina.

[0131] La posición de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5 -Terminal´ o en el extremo 3´-Terminal del oligonucleótido antisentido. Alternativamente, la nucleobase no complementaria puede estar en una posición interna en el oligonucleótido antisentido. Cuando estás presentes dos o más nucleobases no complementarias, puede ser contiguas (es decir; ligadas) o no contiguas.

[0132] En otras realizaciones de la invención, los oligonucleótidos antisentido comprenden al menos un 90 % de complementariedad de secuencia en un ácido nucleico diana de la huntingtina. En otras realizaciones de la invención, los oligonucleótidos antisentido comprenden al menos un 95 % de complementariedad de secuencia en un ácido nucleico diana de la huntingtina. Asimismo, en otras realizaciones de la invención, los oligonucleótidos antisentido comprenden al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de complementariedad de secuencia en un ácido nucleico diana de la huntingtina.

[0133] Se muestran a continuación, ejemplos de oligonucleótidos que tienen malapareamientos o menos de un 100 % de complementariedad de secuencia en la Tabla I en la que el malapareamiento se designa por la letra X en la secuencia.

Tabla 1

Isis Nº

SEC ID Nº Secuencia (5´ a 3´) X es

387902

105 CGCCTGCACCATGTTCCTCA

358

CGXCTGCACCATGTTCCTCA A o T

359

CGCCXGCACCATGTTCCTCA C o G

360

CGCCTGCACCAXGTTCCTCA C o G

361

CGCCTGCACCATGTTCXTCA A o T

388816

345 GCCGTAGCCTGGGACCCGCC

362

GCXGTAGCCTGGGACCCGCC A o T

363

GCCGTAGCXTGGGXCCCGCC C o G

364

GCCGTAGCCTGGGACCCXCC A o T

365

GCCGTAGCCTGGGACCCGCX A o T

387916

125 TCTCTATTGCACATTCCAAG

366

TCXCTATTGCACATTCCAAG C o G

367

TCTCTATXGCACATTCCAAG C o G

368

TCTCTATTGCAXATTCCAAG A o T

369

TCTCTATTGCACATTCXAAG A o T

Identidad

[0134] Los compuestos oligoméricos, o una parte de los mismos, pueden tener un porcentaje de identidad definido en una SEC ID Nº, o un compuesto que tiene un número ISIS específico. Esta identidad se puede encontrar a largo

25 de todo el compuesto oligomérico, o en una parte del compuesto oligomérico (por ejemplo, las nucleobases 1 – 20 de un 27 – mer puede compararse a un 20 – mer para determinar el porcentaje de identidad del compuesto oligomérico en la SEC ID Nº). Será comprensible para aquellos expertos en la disciplina que un oligonucleótido no necesita tener una secuencia idéntica a las descritas en el presente documento para funcionar de manera similar en los oligonucleótidos descritos en el presente documento. Las versiones reducidas (es decir; eliminadas, y por lo tanto, no idénticas) de los oligonucleótidos mostrados en el presente documento, se encuentran en el alcance de la invención. El porcentaje de identidad se calcula según el número de bases que son idénticas a la SEC ID Nº o al compuesto al que se está comparando. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí, dispersas a lo largo del oligonucleótido, o ambas.

35 [0135] Por ejemplo, un 16 – mer que tiene la misma secuencia como nucleobases 2 – 17 de un 20 – mer, es un 80 % idéntico al 20 – mer. Alternativamente, un 20 – mer que contiene cuatro nucleobases no idéntical al 20 – mer es asimismo un 80 % idéntico al 20 – mer. Un 14 – mer que tiene la misma secuencia como nucleobases 1 – 14 de un 18 – mer, es un 78 % idéntico al 18 – mer. Los expertos en la disciplina podrán realizar dichos cálculos.

[0136] El porcentaje de identidad se base en el porcentaje de nucleobases de la secuencia original presente en una parte de la secuencia modificada. Por lo tanto, un oligonucleótido de 30 nucleobases comprende una secuencia completa de la SEC ID Nº de 20 nucleobases que tendrían una parte del 100 % de identidad con la SEC ID Nº de 20 nucleobases, mientras que comprenda además un parte adicional de 10 nucleobases. En el contexto de la invención, la longitud completa de la secuencia modificada puede constituirse como una única parte.

45 [0137] Es bien conocido por aquellos en la disciplina que es posible aumentar o disminuir la longitud de un oligonucleótido antisentido y / o introducir bases de malapareamiento sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309. 1992), se probaron una serie de oligómeros de 13 – 25 nucleobases por su capacidad para inducir el clivaje de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos de 25 nucleobases con 8 u 11 bases de malapareamiento próximas a los extremos del oligonucleótido fueron capaces de dirigir específicamente el clivaje del ARNm diana, aunque en menor medida que el oligonucleótido que no contenía los malapareamientos. De igual modo, el clivaje específico en la diana se logró utilizando un oligómero de 13 nucleobases, incluyendo aquellas con 1 0 3 malapareamientos. En Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358.1988), se probó una serie de oligonucelótidos en tándem de 14 nucleobases, y

55 oligonucleótidos de 28 y 42 nucleobases que comprendían la secuencia de dos o tres oligonucleótidos en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de la DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos de 14 nucleobases solo fueron capaces de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos de 28 o 42 nucleobases. Curiosamente, una mezcla de oligonucleótidos en tándem de 14 nucleobases fue tan eficaz en la traducción de la inhibición como en los oligonucleótidos de 28 nucleobases dirigidos hacia la misma región.

Acidos nucleicos diana

[0138] “Dirigir” un compuesto oligomérico hacia una molécula de ácido nucleico diana puede ser un proceso con

65 múltiples etapas. El proceso comienza generalmente con la identificación de un ácido nucleico diana cuya expresión es modulada. Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos “ácido nucleico diana” y “ácido nucleico

que codifica la huntingtina” incluye el ADN que codifica la huntingtina, el ARN (incluyendo pre – ARNm y ARNm) transcrito a partir del ADN, y ADNc derivado de dicho ARN. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión se asocia a un trastorno particular o estado de enfermedad, o a una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. Tal y como se ha descrito en el presente documento, el ácido nucleico diana codifica la huntingtina.

2. Regiones, segmentos y sitios diana

[0139] El proceso de targeting incluye además, por lo general, la determinación de, al menos, una región, un segmento o un sitio diana en el ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido, así como el efecto deseado, por ejemplo, dando lugar a la modulación de la expresión. La “región” se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Las regiones diana incluyen, pero no se limitan a, las secuencias contiguas de nucleótidos, regiones de inicio o terminación de traducción, regiones codificadoras, marcos abiertos de lectura, intrones, exones, regiones 3´ no traducidas (3´ UTR), y regiones 5´ no traducidas (5´ UTR). En las regiones de los ácidos nucleicos diana está los segmentos diana. Tal y como se utiliza en el presente documento, un “segmento diana” se refiere a una secuencia de un ácido nucleico diana de la huntingtina a las que son complementarios uno o más oligonucleótidos antisentido. El término “ 5´ sitio diana” se define como la nucleobase 5' de un segmento diana para el que es complementario un oligonucleótido antisentido. Asimismo, un “3´ sitio diana” se define como la nucleobase 3' de un segmento diana para el que es complementario un oligonucleótido antisentido.

3. Variantes

[0140] También se conoce en la disciplina que los transcritos alternativos de ARN pueden producirse en la misma región genómica de ADN. Estos transcritos alternativos se conocen generalmente como “variantes”. Más específicamente como “variantes pre – ARNm”, son transcritos producidos en el mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos en el mismo ADN genómico ya sea en su posición de inicio o de parada y contienen secuencias intrónicas y exónicas. Las variantes pueden dar como resultado variantes de ARNm que incluyen, pero no se limitan a aquellas con sitios de corte y empalme alternativos o codones alternativos de inicio o terminación. Las variantes en las secuencias de ARNm y genómicas pueden dar como resultado la enfermedad. Los oligonucleótidos de dichas variantes se encuentran en el alcance de la presente invención.

4. Nombres y sinónimos diana

[0141] Según la presente invención son composiciones y procedimientos para modular la expresión de genes aquellos que se presentan en la Tabla 2. Los nombres de los genes diana son aquellos enumerados en la Tabla 2, así como los números de acceso GENBANK® utilizados para designar compuestos oligoméricos dirigidos a cada gen.

Tabla 2

Secuencias y nombres de gen diana

Especie

Genbank # SEC ID Nº

Humano

AB209506.1 1

Humano

BE378835.1 2

Humano

L12392.1 3

Humano

NM_002111.5 4

Humano

nucleótidos 462000 a 634000 de NT_006081.17 5

Ratón

AK042204.1 6

Ratón

AK049546.1 7

Ratón

L23312.1 8

Ratón

L23313.1 9

Ratón

NM_010414.1 10

Ratón

nucleótidos 2036000 a 2190000 de NT_039302.4 11

Ratón

NM_010414.1 (isoforma corta de ratón) * 44

Humano

corte circundante al exón 1 en los sitios de Ecori y Sacl genómicos, CAG expandido que dan lugar a 130 gln en esta región 45

* NM_010414.1 (isoforma corta de ratón) ampliada con la secuencia genómica de ratón para crear transcritos ortólogos a la isoforma larga de humano (NM_002111.5). Gran parte de esta extensión se apoya en ESTs de ratón, aunque la mayoría del extremo 3´ se apoya en la homología de ARNm humano.

Modulación de la expresión diana

[0142] La modulación de la expresión de un ácido nucleico diana puede lograrse alterando cualquier número de las funciones del ácido nucleico (ADN o ARN). “Modulación” se refiere a una alteración de la función, por ejemplo, bien un incremento (estimulación o inducción), bien una disminución (inhibición o reducción) en la expresión. Otro ejemplo de modulación de la expresión puede incluir la alteración de la selección del sitio de corte y empalme del

proceso de pre – ARNm. “Expresión” incluye todas las funciones por las que la información codificada del gen se convierten en estructuras presentes y operan en una célula. Estas estructuras incluyen los productos de transcripción y traducción. “Modulación de la expresión” se refiere a la alteración de dichas funciones. Para modular las funciones de ADN puede incluirse la replicación y la transcripción. La replicación y la transcripción, por ejemplo, pueden ser una plantilla celular endógena, un vector, un constructo de plásmido o cualquier otra forma. Para modular las funciones del ARN pueden incluirse funciones de traslación que incluyen, pero no se limitan a la traslación de ARN a un sitio de traducción de proteína, translación de ARN a sitios en las células que se encuentran distantes del sitio de síntesis de ARN y la traducción de la proteína a partir de ARN. Las funciones de procesamiento de ARN que pueden modularse, incluyen pero no se limitan al splicing de ARN para producir una o más especies de ARN, al capping de ARN, a la maduración en 3´ de la actividad catalítica y del ARN o la formación del complejo que implica al ARN que puede ser involucrado en, o facilitado por el ARN. La modulación de la expresión puede dar como resultado el aumento del nivel de una o más especies de ácido nucleico o la disminución del nivel de una o más especies de ácido nucleico, ya sea en un nivel de estado estacionario temporal o neto. El resultado de dicha interferencia con la función de ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de la HUNTINGTINAα. De este modo, en una realización de la modulación de la expresión puede significar el aumento o disminución en los niveles de proteína o en ARN diana. En otra realización de la modulación de la expresión puede causar el aumento o disminución de uno o más productos de corte y empalme del ARN o un cambio en la proporción de dos o más productos de corte y empalme.

Células cultivadas

[0143] El efecto de los compuestos oligoméricos de la presente invención en la expresión de ácido nucleico diana puede comprobarse en cualquier variedad de tipos celulares siempre y cuando el ácido nucleico diana esté presente en niveles mensurables. El efecto de los componentes oligoméricos de la presente invención en la expresión del ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria utilizando, por ejemplo, un análisis por Northern blot o PCR. Las líneas celulares se derivan de los tejidos y tipos celulares normales y de células asociadas a diversos trastornos (por ejemplo, trastornos hiperproliferativos). Las líneas celulares derivadas de los tejidos y especies múltiples se pueden obtener de la colección americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA), y son ya conocidas para los expertos en la disciplina. Las células primarias o aquellas células que se aíslan a partir de un animal y no se someten a cultivo continuo, pueden prepararse según los procedimientos conocidos en la disciplina u obtenerse a partir de diversos proveedores comerciales. Además, las células primarias incluyen aquellas obtenidas a partir de los sujetos humanos donantes en un contexto clínico (es decir; donantes de sangre, pacientes quirúrgicos).

[0144] Las células aisladas de los pacientes con Huntington se utilizan también para probar los efectos de los componentes antisentido dirigidos hacia la huntingtina. En dichas células, el gen mutante de la huntingtina puede presentarse en forma heterocigótica u homocigótica. Dichas células están disponibles en el Human Genetic Cell Repository del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), donde se incluyen ejemplos de fibroblastos con número de depósito GMO4281 o GMO4478. Las células de los pacientes con Huntington se cultivan según los procedimientos recomendados por el proveedor.

[0145] Los efectos farmacológicos de la inhibición antisentido de la huntingtina pueden evaluarse en la líneas celulares aisladas de las células neuronales que expresan cualquier forma mutante o de tipo salvaje del gen de la huntingtina. Las formas mutantes de la huntingtina se asocian con fenotipos particulares y los efectos en estos fenotipos se evalúan tras la inhibición antisentido de la huntingtina. Un ejemplo de dichas células son las células estriadas establecidas a partir de ratones con HdhQ111 activada que soportan 111 repeticiones CAG insertadas en el locus de la huntingtina del ratón. El establecimiento de las líneas celulares estriadas aisladas de los ratones HdhQ111 ha sido descrito por Trettel et al. (Human Mol. Genet., 2000, 9, 2799 – 2809). Las líneas celulares estriadas establecidas de los ratones que soportan el gen de la huntingtina de tipo salvaje se utilizan en estudios comparativos.

Ensayo de la modulación de la expresión

[0146] La modulación de la expresión de la huntingtina puede analizarse con diversas formas conocidas en la disciplina. Los niveles de ARNm de la huntingtina pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, el análisis de Nothern blot, PCR (reacción en cadena de la polimerasa competitiva) o PCR en tiempo real. Los análisis de ARN pueden realizarse en ARN celular total o poli (A) + ARNm por procedimientos ya conocidos en la disciplina. Los procedimientos de aislamiento de ARN se muestran en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1 -4-2-9 y 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

[0147] El análisis de Nothern es común en la disciplina y se muestra en, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISMTM 7700 disponible comercialmente en PE – Applied Biosystems, Foster City, CA, y se utiliza según las instrucciones del fabricante. El procedimiento de análisis de la modulación de los niveles de ARN no es una limitación de la presente invención.

[0148] Los niveles de una proteína codificada por la huntingtina pueden cuantificarse de diversas formas ya conocidas en la disciplina, como la inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunoblotting), ELISA o células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una proteína codificada por la huntingtina pueden identificarse y obtenerse a partir de diversas fuentes como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmungham, MI).

Segmentos diana validados

[0149] Las ubicaciones en el ácido nucleico diana a las que los compuestos oligoméricos activos se hibridan se denominan en adelante como “segmentos diana validados”. En una realización, un segmento diana validado incluye al menos una parte de 8 nucleobases de una región diana. En otra realización, un segmento diana validado incluye al menos una parte de 12 nucleobases de una región diana a la que se dirige un compuesto oligomérico activo. Si bien no se desea estar ligado a la teoría, actualmente se cree que estos segmentos diana representan partes de un ácido nucleico diana accesibles para la hibridación.

[0150] Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 o al menos 12 nucleobases consecutivas del extremo 5´ -Terminal de un segmento diana validado (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente aguas arriba del extremo 5´ -Terminal del segmento diana y continúa hasta el ADN o ARN que contiene entre 12 y 35 nucleobases). Segmentos diana validados similares se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 o al menos 12 nucleobases consecutivas del extremo 3´ -Terminal de un segmento diana validado (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente aguas abajo del extremo 3´ -Terminal del segmento diana y continúa hasta el ADN o ARN que contiene entre 12 y 35 nucleobases). Se entiende también que un segmento diana oligomérico validado puede representarse por las secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 o al menos 12 nucleobases consecutivas a partir de una parte interna de la secuencia del segmento diana validado y pueden extenderse en cualquiera o ambas direcciones hasta el oligonucleótido que contiene entre 12 y 35 nucleobases.

Cribado para compuestos moduladores

[0151] En otra realización, los segmentos diana validados identificados en el presente documento pueden utilizarse en una pantalla para compuestos adicionales que modulan la expresión de la huntingtina. “Moduladores” son aquellos compuestos que modulan la expresión de la huntingtina y que comprenden al menos una parte de 8 nucleobases complementaria al segmento diana validado. El método de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana validado de una molécula de ácido nucleico que codifica la huntingtina con uno o más moduladores candidatos y la selección de uno o más candidatos moduladores que alteran la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la huntingtina. Una vez que se muestre que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la huntingtina, el modulador puede utilizarse además en estudios de investigación de la función de la huntingtina o utilizarse como investigación, diagnóstico o agente terapéutico. Los segmentos diana validados pueden combinarse con una segunda hebra descrita en el presente documento para formar oligonucleótidos bicatenarios estabilizados (dúplex) para utilizarse como investigación, diagnóstico o agente terapéutico.

Estudio in vivo de compuestos antisentido dirigidos a la huntingtina

[0152] Los compuestos antisentido dirigidos hacia la huntingtina se prueban en modelos experimentales animales. En una realización, los compuestos antisentido se dirigen solo al gen de la huntingtina humana. Dichos compuestos antisentido tienen, por ejemplo, menos de cuatro mal apareamientos en la huntingtina humana y cuatro o más mal apareamientos en la huntingtina no humana. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen tanto a la huntingtina humana como a la huntingtina no humana. Dichos compuestos antisentido tienen, por ejemplo, menos de cuatro mal apareamientos en la huntingtina humana y menos de cuatro mal apareamientos en la huntingtina no humana.

Animales normales

[0153] Los animales normales de tipo salvaje pueden utilizarse para realizar estudios de toxicidad de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina. Los compuestos antisentido se administran sistemáticamente (por ejemplo, por inyección intraperitoneal) en dosis de 25, 50, 75 o 100 mg / kg. Los animales se controlan por cualquier cambio clínico, incluyendo los cambios en el peso corporal. Se recoge periódicamente suero, por ejemplo cada semana o cada dos semanas durante el periodo de dosificación y se somete a análisis utilizando un analizador clínico para detectar cualquier cambio en los perfiles séricos químicos. Al final del estudio, los animales se sacrifican. La sangre se recoge y se analiza para el recuento de glóbulos blancos, plaquetas y química sérica. Se determina el peso de los órganos principales y se realizan análisis histológicos en bazo, hígado, riñón y páncreas.

Modelos con Huntington

[0154] Los compuestos antisentido dirigidos hacia la huntingtina pueden probarse en modelos no humanos experimentales con Huntington. Se han desarrollado y caracterizado numerosos modelos no humanos.

[0155] El modelo de ratón transgénico R6 / 2 ha integrado a su genoma 1 kilobase del gen de la huntingtina humana, incluyendo el exón 1 – 5´ UTR y los primeros 262 pares de bases del intrón I (Mangiarin L. et al., Cell, 1996, 87, 493-506). Este transgén tiene 144 repeticiones CAG. El transgén codifica aproximadamente el 3 % de la región N – Terminal de la proteína huntingtina, expresión que se impulsa por el promotor de la huntingtina humana. Los niveles de expresión de esta versión truncada de la proteína huntingtina humana es aproximadamente el 75 % de los niveles de la proteína huntingtina del ratón endógeno. Los ratones transgénicos R6 / 2 exhiben síntomas de Huntington humana y disfunción cerebral.

[0156] Los ratones transgénicos YAC128 albergan un cromosoma artificial de levadura (YAC) que transporta el gen de la huntingtina, incluyendo la región promotora y las 128 repeticiones CAG (Hodgson J. G. et al., Human Mol. Genet., 1998, 5, 1875). Este YAC expresa todo salvo el exón 1 del gen humano. Estos ratones transgénicos no expresan huntingtina endógena de ratón.

[0157] El gen de la huntingtina endógena de ratón de los ratones Q111 tiene 111 repeticiones CAG insertadas en el exón 1 del gen (Wheeler V. C. et al., Human Mol. Genet., 8, 115-122).

[0158] En los ratones transgénicos Q150, la repetición CAG en el exón 1 del gen de la huntingtina de ratón de tipo salvaje se sustituye con 150 repeticiones CAG (Li C. H. et al., Human Mol. Genet., 2001, 10, 137).

[0159] Los compuestos antisentido dirigidos hacia la huntingtina se administran en el modelo experimental no humano, por ejemplo en ratones transgénicos utilizados como modelos de la enfermedad de Huntington.

[0160] Los compuestos antisentido pueden administrarse directamente en el sistema nervioso central del animal experimental, por ejemplo a través de la vía de administración intracerebroventricular (ICV), intratecal (IT) o intraparenquimatosa. Las dosis de los compuestos antisentido administradas pueden ser de 25, 50, 75 o 100 ug / día, y la administración puede llevarse a cabo a través de la infusión continua utilizando una bomba osmótica implantada quirúrgicamente (por ejemplo, una mini bomba Alzet). 0.25, 0.5, or1 uL / hora. Cada dosis se administra en grupos de 4 a 6 animales. Los grupos de control de animales pueden recibir la infusión de solución salina o la infusión de un compuesto antisentido que tiene una secuencia no dirigida a cualquier gen conocido.

[0161] Los animales son tratados durantes varias semanas, por ejemplo, 1, 2, 4, o 8 semanas. Los animales se controlan por los cambios clínicos, incluyendo los cambios en el peso corporal. Al final del periodo de tratamiento, los animales se sacrifican. Los cerebros se diseccionan en tres regiones: prosencéfalo, ganglio basal y cerebelo. Las regiones cerebrales se someten a evaluación histológica, incluyendo tinción hematoxilina / eosina, tinción GFAP (para evaluar la activación de células gliales) y tinción FluoroJ (para evaluar los cambios neurodegenerativos). Los niveles de ARNm de la huntingtina se miden por PCR en tiempo real y los niveles de proteína huntingtina se miden por inmunoblotting (transferencia Western).

[0162] Puede evaluarse la duración de la acción de los compuestos dirigidos hacia la huntingtina. Para estos análisis, los animales se dosifican durante 2, 4, 6 o 8 semanas con compuestos antisentidos dirigidos hacia la huntingtina. Al final del periodo de dosificación, las bombas osmóticas se retiran y los animales se sacrifican tras 0, 1, 2, 4, 6, o 8 semanas tras la finalización de la dosificación. Los cerebros se diseccionan en tres regiones: prosencéfalo, ganglio basal y cerebelo. Las regiones cerebrales se someten a evaluación histológica, incluyendo tinción hematoxilina / eosina, tinción GFAP (para evaluar la activación de células gliales) y tinción FluoroJ (para evaluar los cambios neurodegenerativos). Los niveles de ARNm de la huntingtina se miden por PCR en tiempo real y los niveles de proteína huntingtina se miden por inmunoblotting (transferencia Western).

Kits, reactivos y diagnósticos de investigación

[0163] Los compuestos oligoméricos de la presente invención pueden utilizarse para diagnósticos, kits y reactivos de investigación. Además, los compuestos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con especificidad, se utilizan a menudo por los expertos en la disciplina para obtener la función de genes particulares o para distinguir entre las funciones de varios miembros de una vía biológica.

[0164] Para la utilización en kits y diagnósticos, los compuestos oligoméricos de la presente invención, ya sea solo

o en combinación con otros compuestos o agentes terapéuticos, pueden utilizarse como herramientos en análisis diferencial y / o combinatorio para obtener patrones de expresión de un complemento parcial o entero de los genes expresados en las células y tejidos.

[0165] Como ejemplo no limitante, los patrones de expresión en las células o tejidos tratados con uno o más compuestos o composiciones de la presente invención se comparan con las células o tejidos de control no tratados con compuestos, y los patrones producidos se analizan para los niveles diferenciales de la expresión génica cuando

se refieran, por ejemplo, a la asociación de la enfermedad, vía de señalización, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan a los patrones de expresión. Por ejemplo, los patrones de expresión génica pueden identificarse por análisis de microarrays.

Divulgación no limitante

[0166] Mientras que se han descrito ciertos compuestos, composiciones y procedimientos de la presente invención con especificidad según algunas realizaciones, los siguientes ejemplos solo sirven para ilustrar los compuestos de la invención y no pretenden limitarse a la misma.

Ejemplo 1

Inhibición antisentido de la huntingtina en células cultivadas

[0167] El efecto de los compuestos oligoméricos en la expresión de ácido nucleico diana se probó en células cultivadas, por ejemplo células A549 o fibroblastos de pacientes con EH para los compuestos dirigidos hacia la huntingtina humana y en células b. END para compuestos dirigidos hacia la huntingtina de ratón.

[0168] Cuando las células alcanzaron una confluencia del 65 – 75 %, el reactivo de transfección LIPOFECTIN® se utilizó para introducir los oligonucleótidos en las células. Otros procedimientos de transfección son ya conocidos por los expertos en la disciplina. El procedimiento de cribado no es una limitación de la presente invención.

[0169] Los oligonucleótidos se mezclaron con LIPOFECTIN® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio sérico reducido OPTI – MEM® -1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para conseguir una concentración deseada de oligonucleótidos y una concentración LIPOFECTIN® de 2,5 o 3 μg / mL por 100 nM de oligonucleótidos. Esta mezcla de transfección se incubó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 100 μL de OPTI – MEM® -1 y se trataron con 130 μL de mezcla de transfección. Las células se trataron y los datos se obtuvieron por duplicado o triplicado. Tras 4 – 7 horas de tratamiento a 37 ºC, el medio que contiene la mezcla de transfección se volvió a colocar con un medio de cultivo fresco. Las células se recogieron 16 – 24 horas después del tratamiento de oligonucleótidos.

[0170] Para las otras cámaras de cultivo de placas de 96 pocillos, las células pueden tratarse de manera similar utilizando volúmenes adecuados de medio y oligonucleótidos.

Ejemplo 2

Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de la huntingtina [0171] La cuantificación de los niveles de ARNm de la huntingtina se llevó a cabo por la PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE -Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante.

[0172] Tras el aislamiento de las células o tejidos, el ARN se sometió a la reacción de transcriptasa inversa secuencial (RT) y PCR en tiempo real, las dos se realizaron en el mismo pocillo. Los reactivos de RT y PCR se obtuvieron por Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). La RT y la PCR en tiempo real se llevaron a cabo en el mismo mediante la adición de 20 μL de un cóctel de PCR (2,5 x tampón de PCR sin MgCl2, 6.6 mM MgCl2, 375 μM de cada dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada cebador directo e inverso, 125 nM de sonda, 4 Unidades de inhibidor de RNAsa, 1,25 Unidades de PLATINUM® Taq, 5 Unidades de transcriptasa inversa MuLV y 2,5 x dye ROX) a placas de 96 pocillos que contienen 30 μL de solución de ARN total (20 – 200 ng). La reacción de RT se llevó a cabo mediante la incubación durante 30 minutos a 48 ºC. Tras una incubación de 10 minutos a 95 ºC para activar el PLATINUM® Taq, se realizaron 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95 ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido por 60 ºC durante 1,5 minutos (hibridación / extensión).

[0173] Las cantidades diana génicas obtenidas por RT, PCR en tiempo real se normalizaron utilizando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantificó por RT, PCR en tiempo real al ejecutarse simultáneamente con la diana por multiplexación o por separado. El ARN total se cuantificó utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) según las instrucciones del fabricante.

[0174] Las sondas y los cebadores para su utilización en PCR en tiempo real se designaron para hibridar secuencias específicas en la diana. Los cebadores, las sondas y las secuencias de ácido nucleico diana a las que se hibridan se presentan en la Tabla 3. Las sondas de PCR específicas en la diana tienen FAM covalentemente unido al extremo 5´ -Terminal y TAMRA o MGB covalentemente unido al extremo 3´ -Terminal, en el que FAM es un colorante fluorescente y TAMRA o MGB es un colorante inhibidor de la fluorescencia.

Tabla 3

Cebadores y sondas específicas en diana génica para su utilización en PCR en tiempo real

Especies

SEC ID Nº diana Descripción de secuencia Secuencia (5´ a 3´) SEC ID Nº

Humano

4 Cebador directo CTCCGTCCGGTAGACATGCT 38

Humano

4 Cebador inverso GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG 39

Humano

4 Sonda TGAGCAC’TGTTCAACTGTGGATATCGGGA 40

Ratón

10 Cebador directo CAGAGCTGGTCAACCGTATCC 41

Ratón

10 Cebador inverso GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA 42

Ratón

10 Sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAAC 43

15 Ejemplo 3

Inhibición antisentido del gen de la huntingtina

Huntingtina humana

20 [0175] Los oligonucleótidos antisentido se designaron para dirigirse a las diferentes regiones del gen de la huntingtina humana utilizando secuencias publicadas citadas en la Tabla 2. Las secuencias y las correspondientes SEC ID Nº se muestran en la Tabla 4. Todos los compuestos en la Tabla 4 son oligonucleótidos quiméricos (“gapmers”) de 20 nucleótidos compuestos de una región central “hueca” que consta de 10 2´ -desoxinucleótidos

25 flanqueados a ambos lados (5´ y 3´) por “alas” de cinco nucleótidos. Las alas se componen de nucleótidos de 2´ -O

– (metoxietil), también conocidos como nucleótidos 2´ -MOE. Los enlaces de internucleósidos (segmento principal) son fosforotioatos a través del oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5 – metilcitidinas.

[0176] Los oligonucleótidos antisentido se analizaron por su efecto en los niveles de ARNm de la huntingtina en

30 las células A549 por PCR cuantitativa en tiempo real tal y como se describe en otros ejemplos del presente documento. Los datos presentados en la Tabla 4 representan el porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina en relación con las células no tratadas. Los datos son las medias de los experimentos en las que las células cultivadas se trataron con los oligonucleótidos antisentido revelados.

35 [0177] Si el nivel de ARNm de la huntingtina en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido era igual o mayor a las células del control, el porcentaje de inhibición se expresa como inhibición cero. Si está presente, “N.D” indica “no determinado”. Las regiones diana a las que se inhiben estos oligonucleótidos antisentido se denominan en el presente documento “segmentos diana validados”.

40 Tabla 4

65 15

Inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina por los oligonucléotidos quiméricos que tienen alas de 2´ -MOE y huecos desoxi

ISIS #

SEC ID Nº diana 5´ sitio diana Secuencia (5´ a 3´) Porcentaje de inhibición SEC ID Nº

388224

4 33 CAGGTAAAAGCAGAACCTGA 0 46

387865

4 155 GCCTTCATCAGCTTTTCCAG 65 47

388829

4 193 GCTGCTGCTGCTGCTGGAAG 46 48

388830

4 194 TGCTGCTGCTGCTGCTGCTG 46 49

388833

4 195 CTGCTGCTGTTGCTGCTGCT 62 50

388831

4 195 CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT 56 51

388832

4 196 GCTGCTGCTGCTGCTGCTGC 36 52

388834

4 198 TGGCGGCTGCTGCTGCTGCT 62 53

388835

4 259 GCGGCGGCGGCGGTGGCGGC 52 54

387866

4 432 ATGATTCACACGGTCTTTCT 76 55

387867

4 489 AAATTCTGGAGAATTTCTGA 31 56

387868

4 497 AGTTTCTGAAATTCTGGAGA 58 57

387869

4 608 GAATCCATCAAAGCTTTGAT 53 58

387870

4 621 CCTTGGAAGATTAGAATCCA 45 59

387871

4 709 GAGCCAGCTCAGCAAACCTC 65 60

387872

4 718 GAACCAGGTGAGCCAGCTCA 37 61

387873

4 749 TTCACCAGGTAAGGCCTGCA 33 62

55 15

387874

4 821 ACAGCTGCAGCCAAGGTCTC 60 63

387875

4 845 CCAAAAGAAGCCATAATTTT 63 64

387876

4 876 AACCTTAATTTCATTGTCAT 75 65

388225

4 1000 GTAGCCAACTATAGAAATAT 53 66

388226

4 1005 ATTTAGTAGCCAACTATAGA 26 67

387877

4 1170 AGAGACTTCCATTTCTTTCC 81 68

387878

4 1176 AGAAGGAGAGACTTCCATTT 41 69

387879

4 1184 TGCTCTGCAGAAGGAGAGAC 46 70

387880

4 1201 CATAAACCTGGACAAGCTGC 79 71

387881

4 1208 GTCAGTTCATAAACCTGGAC 72 72

387882

4 1241 ACATTGTGGTCTTGGTGCTG 51 73

387883

4 1460 AAGAGCACTTTGCCTTTTTG 66 74

388227

4 1596 TGCTGACCCTGGAGTGGAAA 78 75

388228

4 1666 TGGCCAGATCCACTGAGTCC 30 76

387884

4 1775 TCATTCAGGTCCATGGCAGG 61 77

387885

4 1782 GGTCCCATCATTCAGGTCCA 68 78

387886

4 1876 CTAACACAATTTCAGAACTG 73 79

388229

4 1990 TGGAAGAGTTCCTGAAGGCC 29 80

388230

4 2022 GTTTTTCAATAAATGTGCCT 58 81

388231

4 2034 GCAGTGACTCATGTTTTTCA 60 82

388232

4 2039 TGCCTGCAGTGACTCATGTT 37 83

388233

4 2346 GTCAAGAGGAACTTTATAGA 55 84

387887

4 2400 ATCGATGTAGTTCAAGATGT 29 85

387888

4 2447 GTCCCACAGAGAATGGCAGT 73 86

388234

4 2677 TGATCAGCTGCAGTCCTAAC 1 87

387889

4 2820 TGTATAATGATGAGCCCCTC 76 88

387890

4 2971 GATCAGCTTGTCCTTGGTCA 81 89

388235

4 3183 TCTGGTGGTTGATGTGATTA 63 90

388236

4 3190 TGAGTGCTCTGGTGGTTGAT 26 91

387891

4 3203 CAGCATCCAAATGTGAGTGC 82 92

387892

4 3209 GCTTCACAGCATCCAAATGT 89 93

388237

4 3234 GAAGGCAGTGGAAAGAAGAC 62 94

387893

4 3641 AGAGAAGGCAAGGCTGCCTT 60 95

387894

4 3649 GGTTTGTTAGAGAAGGCAAG 63 96

387895

4 3851 ACATCATGCAGTTTGAGGTA 68 97

387896

4 3860 GCTTTCAGGACATCATGCAG 51 98

387897

4 4028 AAGCAGGATTTCAGGTATCC 78 99

387898

4 4036 CTCGACTAAAGCAGGATTTC 90 100

387899

4 4055 ACAGTTGCCATCATTGGTTC 67 101

388238

4 4069 ATTGTTGAACACAAACAGTT 50 102

387900

4 4127 TTGGAAGATAAGCCATCAAA 82 103

387901

4 4265 TGCACCATGTTCCTCAGGCT 79 104

387902

4 4269 CGCCTGCACCATGTTCCTCA 90 105

387903

4 4380 AATAGCATTCTTATCTGCAC 84 106

387904

4 4392 AATGTGATTATGAATAGCAT 64 107

388239

4 4458 TAACTGCACACATGTTGTAG 54 108

387905

4 4538 AACACCTGATCTGAATCCAG 78 109

388240

4 4558 GTTTCAATACAAAGCCAATA 78 110

387906

4 4586 AACTGGCCCACTTCAATGTA 78 111

387907

4 4596 TGATTCCCTGAACTGGCCCA 77 112

387908

4 4682 TTAGGAATTCCAATGATCTG 76 113

387909

4 4688 ATGATTTTAGGAATTCCAAT 77 114

387910

4 4715 CTGGCCATGATGCCATCACA 86 115

387911

4 4724 TTCCTTCCACTGGCCATGAT 77 116

387912

4 4805 GCATCAGCTTTATTTGTTCC 70 117

388241

4 4856 CTCAGTAACATTGACACCAC 71 118

388242

4 4868 TACTGGATGAGTCTCAGTAA 49 119

55 15

387913

4 4875 CTGATGGTACTGGATGAGTC 59 120

387914

4 4913 TGGCACTGCTGCAGGACAAG 71 121

387915

4 5219 TCCTGAATACGAGAAAGAAC 86 122

388243

4 5781 TTTGGCTGCCAAGTCAGAAT 52 123

388244

4 5787 TCCAAGTTTGGCTGCCAAGT 48 124

387916

4 5801 TCTCTATTGCACATTCCAAG 91 125

387917

4 5850 CTGACAGACATAATCACAGA 61 126

387918

4 5911 TGATCAGATCTTGAATGTGA 41 127

387919

4 6005 CGAGACTGAATTGCCTGGAT 59 128

387920

4 6296 GAATAGAGCCTTTGGTGTCT 56 129

388245

4 6333 GTCTTGCATGGTGGAGAGAC 39 130

387921

4 6466 AATCTGACCTGGTCCAACAC 65 131

387922

4 6476 AGCAGTGCAGAATCTGACCT 53 132

387923

4 6488 TCTGCACCTTCCAGCAGTGC 62 133

388246

4 6600 ACCAGAAATTTCACTCATCC 50 134

388247

4 6606 CTGGCCACCAGAAATTTCAC 21 135

388248

4 6763 CAGCATCCCCAAACAGATCA 65 136

388249

4 6769 ACAGTGCAGCATCCCCAAAC 72 137

388250

4 6777 GGACTGATACAGTGCAGCAT 65 138

387924

4 6860 TTCTCAGGAGGAAGGTGCAA 61 139

387925

4 6930 CTGCTCATGGATCAAATGCC 78 140

388251

4 7177 GTGTGTTTGGATCTACTTCC 67 141

388252

4 7199 GCAGTGATATACTTAGGATT 46 142

388253

4 7208 TCACAGGCTGCAGTGATATA 29 143

388254

4 7312 TGATGTTCCTGAGCAATGGC 51 144

388255

4 7383 TCCAAGCTTCCACACCAGTG 67 145

387926

4 7489 TGTTGATGCGGTAGATGAAC 29 146

387927

4 7556 GTCACCAGGACACCAAGGAG 70 147

387928

4 7709 TCCAAGCAGCTTACAGCTGG 69 148

388256

4 7816 TTGAAACCATTGCTTGAATC 64 149

388257

4 7855 ATGCCTGATATAAATGATGG 52 150

387942

4 7932 GTTGATCTGCAGCAGCAGCT 39 151

387929

4 7988 GAGTGTATGGACACCTGGCC 49 152

387930

4 8005 TGTTCCCCAGCCACACGGAG 85 153

387931

4 8363 GTGGCAGGCACCAGGTACTG 65 154

388258

4 8655 ATAGTTCTCAATGAGGTAAA 72 155

387932

4 8757 ACAGTGGTAAATGATGGAGG 41 156

387933

4 8903 ATGCAGGTGAGCATCAGGCC 29 157

387934

4 8910 TGTGTACATGCAGGTGAGCA 37 158

388259

4 9036 AGGAAAGCCTTTCCTGATCC 31 159

387935

4 9149 TATGGCTGCTGGTTGGACAG 57 160

387936

4 9240 CAGCATGACCCAGTCCCGGA 63 161

387937

4 9243 GGACAGCATGACCCAGTCCC 68 162

387938

4 9368 CCCATCCTGCTGATGACATG 69 163

387939

4 9407 ACCAGGCAGAAAAGGTTCAC 63 164

387940

4 9555 TCAGCAGGTGGTGACCTTGT 64 165

388260

4 9714 TCTGCCACATGGCAGAGACA 25 166

388261

4 9724 AAAGAGCACTTCTGCCACAT 56 167

388262

4 9735 GCCACTGCCACAAAGAGCAC 60 168

388263

4 9763 CACCAGGACTGCAGACACTC 65 169

388264

4 9785 TGGAAGGCCTCAGGCTCAGC 65 170

388265

4 9831 GGACCTGGTCACCCACATGG 22 171

388266

4 9863 GGCAACAACCAGCAGGTGAC 54 172

388267

4 9871 TGCAACCTGGCAACAACCAG 32 173

388268

4 9889 CCCAGATGCAAGAGCAGCTG 65 174

388269

4 9921 AACAGCCAGCCTGCAGGAGG 25 175

388270

4 9946 TCTACTGCAGGACAGCAGAG 20 176

55 5

388271

4 9973 TGTTCCCAAAGCCTGCTCAC 43 177

388272

4 9982 CCAGGCCAGTGTTCCCAAAG 41 178

388273

4 9988 GGAGACCCAGGCCAGTGTTC 44 179

388274

4 10047 AGCACAGGCCATGGCATCTG 43 180

388275

4 10054 CTGGCCCAGCACAGGCCATG 33 181

387941

4 10133 ACTGATATAATTAAATTTTA 0 182

388276

4 10274 GGCTATGCCAGTGGCTACAG 29 183

388277

4 10329 TGTGAATGCATAAACAGGAA 61 184

388278

4 10579 CTAGCAAGGAACAGGAGTGG 15 185

388279

4 10639 CCATGGAGCAGCAGGTCCCA 28 186

388280

4 10647 GCATGCATCCATGGAGCAGC 31 187

388281

4 10726 ACTAACAGTGCCAAGACACC 45 188

388282

4 10923 CCATTTTAATGACTTGGCTC 60 189

388283

4 11023 AGGAAGCAGAGCCCCTGCCT 48 190

388284

4 11150 GGCAGCACCTGCACAGAGTT 57 191

388285

4 11225 GCATACAAGTCCACATCTCA 54 192

388286

4 11293 CATACAGGCCTGGCAGAGGC 49 193

388287

4 11449 AAGAATGGTGATTTTCTTAC 46 194

388288

4 11637 TCTAGCCAGGAACAACATCT 47 195

388289

4 11646 ATGTAAACATCTAGCCAGGA 24 196

388290

4 11854 AATGAGCTCATATTCATCTC 20 197

388291

4 12076 GAATGAGCCCTGCCCTGACC 38 198

388292

4 12081 GCAATGAATGAGCCCTGCCC 57 199

388293

4 12122 AGCTGATATGGAGACCATCT 35 200

388294

4 12177 GGTGCTTGCCACAGATTTTT 65 201

388295

4 12324 TGCATTGCCAAACAATTCTA 57 202

388296

4 12409 TTGGCAGCTGGAAACATCAC 52 203

388297

4 12873 TCCAAGTCTACCCTGGCCAG 40 204

388298

4 13044 GTTGCCTTCAGTTGTCATGC 34 205

388299

4 13050 TTCCAGGTTGCCTTCAGTTG 59 206

388300

4 13167 CAGTTACCACCCAGATTGCA 46 207

388301

4 13251 GAGACCTGGACAAGGAGGCC 30 208

388842

5 3535 TGTAATTACAGAATTTGTAT 60 209

388852

5 16048 ACATTCCATGAATTCCATTT 43 210

388846

5 17007 GTTAATTTAGAGAAAATTCA 1 211

388845

5 24805 CAGAAGCATCCAAACCAGTA 40 212

388844

5 31595 CAAGAGGGTTGCATAGAAAC 17 213

388848

5 41489 CAAAGTATAAACAGTTTGAG 32 214

388839

5 41869 CCCAGTGCAGTTCACATTCA 54 215

388859

5 46461 TATTATAAAATACATGTTTC 26 216

388856

5 58668 ATTAGAGATTCATCATATTG 46 217

388857

5 59960 GGTATGGAAAGGTTCAACAT 58 218

388858

5 64678 TGGAAGGTGAGGGACAAAAA 57 219

388862

5 71659 AGCAGAAACAAGTATTCCAT 56 220

388853

5 86173 CAAATTCACATAGGGTTGGT 60 221

388860

5 97067 ACATGAGCAATGAAGGACAG 48 222

388840

5 98221 GCAATGTGTGATTTACCACA 67 223

388850

5 118154 ACCACATCATAATTTGTCAT 41 224

388855

5 120499 ATTATTTAAGAAGTACCCAC 36 225

388861

5 121068 TGCCCCAAAAAGTGGAACCA 55 226

388847

5 126660 ACATTTCCAAGAGGTTTTGA 48 227

388854

5 128596 TCAGCCCCAATTTGTAGCAG 59 228

388841

5 140692 GACATAAAGTTTAGAGGTAT 50 229

388843

5 142578 GAAGGACCCACAGAGGTTTG 53 230

388851

5 146457 TGAAAAGGAAGTGACATCAT 17 231

388849

5 165574 CAGTGTCAGGAGAAGCCCAG 46 232

388785

45 713 AGGTTCTGCCTCACACAGCA 57 311

388786

45 718 CCCGCAGGTTCTGCCTCACA 33 312

388787

45 740 AGGGAACCAGCCCGCCCCTG 56 313

388788

45 745 TGGCCAGGGAACCAGCCCGC 47 314

388789

45 750 ATGGCTGGCCAGGGAACCAG 25 315

388790

45 755 TGCCAATGGCTGGCCAGGGA 7 316

388791

45 777 GACAGCCCTAGCCTGCGGAC 19 317

388792

45 781 GATTGACAGCCCTAGCCTGC 0 318

388793

45 785 GCATGATTGACAGCCCTAGC 9 319

388794

45 885 ATCTTGGACCCGTCCCGGCA 63 320

388795

45 890 CGTCCATCTTGGACCCGTCC 53 321

388796

45 896 AGCGGCCGTCCATCTTGGAC 45 322

388797

45 902 AACCTGAGCGGCCGTCCATC 54 323

388798

45 906 GCAGAACCTGAGCGGCCGTC 62 324

388799

45 910 AAAAGCAGAACCTGAGCGGC 56 325

388800

45 913 GGTAAAAGCAGAACCTGAGC 36 326

388801

45 920 GGCCGCAGGTAAAAGCAGAA 65 327

388802

45 926 GCTCTGGGCCGCAGGTAAAA 64 328

388803

45 985 AGTCCCCGGAGGCCTCGGGC 56 329

388804

45 993 GGCACGGCAGTCCCCGGAGG 57 330

388805

45 1019 AGGGTCGCCATGGCGGTCTC 35 331

388806

45 1025 TTTTCCAGGGTCGCCATGGC 33 332

388807

45 1030 TCAGCTTTTCCAGGGTCGCC 63 333

388808

45 1034 TTCATCAGCTTTTCCAGGGT 54 334

388809

45 1040 AAGGCCTTCATCAGCTTTTC 48 335

388810

45 1045 ACTCGAAGGCCTTCATCAGC 57 336

388811

45 1050 GAGGGACTCGAAGGCCTTCA 51 337

388812

45 1056 GGACTTGAGGGACTCGAAGG 62 338

388836

45 1494 CTGAGGAAGCTGAGGAGGCG 45 339

388837

45 1511 TGTGCCTGCGGCGGCGGCTG 61 340

388838

45 1523 GGCAGCAGCGGCTGTGCCTG 53 341

388813

45 1607 CAAACTCACGGTCGGTGCAG 58 342

388814

45 1614 GCGGGCCCAAACTCACGGTC 51 343

388815

45 1623 GGAGCTGCAGCGGGCCCAAA 39 344

388816

45 1650 GCCGTAGCCTGGGACCCGCC 77 345

388817

45 1670 GCAGGGTTACCGCCATCCCC 70 346

388818

45 1675 AGGCTGCAGGGTTACCGCCA 66 347

388819

45 1680 CCCGCAGGCTGCAGGGTTAC 53 348

388820

45 1685 GCCGGCCCGCAGGCTGCAGG 49 349

388821

45 1773 AAGGCCTCGCCCCAGGAGGG 46 350

388822

45 1807 AGACCCAAGTGAGGGAGCGG 65 351

388823

45 1813 AAGGGAAGACCCAAGTGAGG 44 352

388824

45 1817 GGACAAGGGAAGACCCAAGT 68 353

388825

45 1825 TCGCGAGAGGACAAGGGAAG 24 354

388826

45 1830 TCCCCTCGCGAGAGGACAAG 59 355

388827

45 1850 GGCCCCAACAAGGCTCTGCC 58 356

388828

45 1855 GGACAGGCCCCAACAAGGCT 61 357

55 Huntingtina de ratón

[0178] Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse hacia las diferentes regiones del gen de la huntingtina de ratón utilizando las secuencias publicadas citadas en la Tabla 2. Las secuencias y sus correspondientes SEC ID Nº se muestran en la Tabla 5. Todos los componentes de la Tabla 5 son oligonucleótidos quiméricos (“gapmers”) de 20 nucleótidos compuestos de una región central “hueca” que consta de 10 2´ desoxinucleótidos flanqueados a ambos lados (5´ y 3´) por “alas” de cinco nucleótidos. Las alas se componen de nucleótidos de 2´ -O – (metoxietilo), también conocidos como nucleótidos 2´ -MOE. Los enlaces de internucleósidos (segmento principal) son fosforotioatos a través del oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5 – metilcitidinas.

65 [0179] Los oligonucleótidos antisentido se analizaron por PCR cuantitativa en tiempo real por su efecto en los

niveles de ARNm de la huntingtina en las células b. END como se describe en otros ejemplos del presente documento. Los datos presentados en la Tabla 5 representan el porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina con respecto a las células no tratadas. Los datos son las medias de los experimentos en los que las células cultivadas se trataron con los oligonucleótidos antisentido revelados. 5 [0180] Si el nivel de ARNm de la huntingtina en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido era igual o mayor a las células del control, el porcentaje de inhibición se expresa como inhibición cero. Si está presente, “N.D” indica “no determinado”. Las regiones diana a las que se inhiben estos oligonucleótidos antisentido se denominan en el presente documento “segmentos diana validados”. 10

Tabla 5

65 15

Inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina por los oligonucléotidos quiméricos que tienen alas de 2´ -MOE y huecos desoxi

Nº ISIS

SEC ID Nº diana sitio diana 5' Secuencia (5´ a 3´) Porcentaje de inhibición SEC ID Nº

387869

8 517 GAATCCATCAAAGCTTTGAT 46 58

387884

8 1684 TCATTCAGGTCCATGGCAGG 54 77

387913

8 4787 CTGATGGTACTGGATGAGTC 32 120

387865

10 177 GCCTTCATCAGCTTTTCCAG 35 47

387866

10 394 ATGATTCACACGGTCTTTCT 38 55

387867

10 451 AAATTCTGGAGAATTTCTGA 22 56

387868

10 459 AGTTTCTGAAATTCTGGAGA 39 57

387870

10 583 CCTTGGAAGATTAGAATCCA 41 59

387871

10 671 GAGCCAGCTCAGCAAACCTC 34 60

387872

10 680 GAACCAGGTGAGCCAGCTCA 23 61

387874

10 783 ACAGCTGCAGCCAAGGTCTC 52 63

387875

10 807 CCAAAAGAAGCCATAATTTT 19 64

387876

10 838 AACCTTAATTTCATTGTCAT 42 65

387877

10 1132 AGAGACTTCCATTTCTTTCC 51 68

387878

10 1138 AGAAGGAGAGACTTCCATTT 24 69

387879

10 1146 TGCTCTGCAGAAGGAGAGAC 17 70

387880

10 1163 CATAAACCTGGACAAGCTGC 34 71

387882

10 1203 ACATTGTGGTCTTGGTGCTG 70 73

387883

10 1422 AAGAGCACTTTGCCTTTTTG 52 74

387885

10 1744 GGTCCCATCATTCAGGTCCA 44 78

387887

10 2365 ATCGATGTAGTTCAAGATGT 39 85

387888

10 2412 GTCCCACAGAGAATGGCAGT 31 86

387889

10 2785 TGTATAATGATGAGCCCCTC 48 88

387890

10 2936 GATCAGCTTGTCCTTGGTCA 55 89

387891

10 3168 CAGCATCCAAATGTGAGTGC 52 92

387892

10 3174 GCTTCACAGCATCCAAATGT 46 93

387893

10 3606 AGAGAAGGCAAGGCTGCCTT 46 95

387894

10 3614 GGTTTGTTAGAGAAGGCAAG 43 96

387895

10 3816 ACATCATGCAGTTTGAGGTA 57 97

387896

10 3825 GCTTTCAGGACATCATGCAG 38 98

387897

10 3993 AAGCAGGATTTCAGGTATCC 60 99

387898

10 4001 CTCGACTAAAGCAGGATTTC 48 100

387899

10 4020 ACAGTTGCCATCATTGGTTC 35 101

387900

10 4092 TTGGAAGATAAGCCATCAAA 41 103

387901

10 4230 TGCACTATGTTCCTCAGGCT 64 104

387902

10 4234 CGCCTGCACCATGTTCCTCA 47 105

387903

10 4345 AATAGCATTCTTATCTGCAC 46 106

387904

10 4357 AATGTGATTATGAATAGCAT 25 107

387905

10 4503 AACACCTGATCTGAATCCAG 29 109

387906

10 4551 AACTGGCCCACTTCAATGTA 64 111

387908

10 4647 TTAGGAATTCCAATGATCTG 74 113

387909

10 4653 ATGATTTTAGGAATTCCAAT 28 114

55 15

387909

10 4653 ATGATTTTAGGAATTCCAAT 28 114

387910

10 4680 CTGGCCATGATGCCATCACA 27 115

387911

10 4689 TTCCTTCCACTGGCCATGAT 38 116

387912

10 4770 GCATCAGCTTTATTTGTTCC 45 117

387914

10 4878 TGGCACTGCTGCAGGACAAG 73 121

387915

10 5184 TCCTGAATACGAGAAAGAAC 8 122

387916

10 5763 TCTCTATTGCACATTCCAAG 59 125

387917

10 5812 CTGACAGACATAATCACAGA 55 126

387918

10 5873 TGATCAGATCTTGAATGTGA 69 127

387919

10 5967 CGAGACTGAATTGCCTGGAT 73 128

387920

10 6258 GAATAGAGCCTTTGGTGTCT 53 129

387921

10 6428 AATCTGACCTGGTCCAACAC 4 131

387922

10 6438 AGCAGTGCAGAATCTGACCT 16 132

387924

10 6822 TTCTCAGGAGGAAGGTGCAA 26 139

387925

10 6892 CTGCTCATGGATCAAATGCC 43 140

387926

10 7445 TGTTGATGCGGTAGATGAAC 8 146

387927

10 7512 GTCACCAGGACACCAAGGAG 47 147

387928

10 7665 TCCAAGCAGCTTACAGCTGG 31 148

387942

10 7888 GTTGATCTGCAGCAGCAGCT 54 151

387930

10 7961 TGTTCCCCAGCCACACGGAG 53 153

387931

10 8319 GTGGCAGGCACCAGGTACTG 62 154

387932

10 8713 ACAGTGGTAAATGATGGAGG 51 156

387933

10 8859 ATGCAGGTGAGCATCAGGCC 64 157

387934

10 8866 TGTGTACATGCAGGTGAGCA 45 158

387935

10 9105 TATGGCTGCTGGTTGGACAG 43 160

387936

10 9196 CAGCATGACCCAGTCCCGGA 53 161

387937

10 9199 GGACAGCATGACCCAGTCCC 34 162

387938

10 9324 CCCATCCTGCTGATGACATG 41 163

387939

10 9363 ACCAGGCAGAAAAGGTTCAC 28 164

387940

10 9511 TCAGCAGGTGGTGACCTTGT 54 165

387941

10 10042 ACTGATATAATTAAATTTTA 3 182

387873

11 39021 TTCACCAGGTAAGGCCTGCA 28 62

387881

11 46216 GTCAGTTCATAAACCTGGAC 57 72

387886

11 52829 CTAACACAATTTCAGAACTG 25 79

388535

11 64098 GATAAAACACCTTGTTAATG 0 233

388536

11 74028 GGAGCAGTACCTTATAGTTG 0 234

388467

11 85701 ATAGCTGCTGCACACAGACA 37 235

387907

11 90911 TGATTCCCTGAACTGGCCCA 77 112

388534

11 90914 GCATCAGTACCTGAACTGGC 18 236

388532

11 116664 GAGTGGTTGGCTAATGTTGA 26 237

387923

11 119259 TCTGCACCTTCCAGCAGTGC 25 133

387929

11 138172 GAGTGTATGGACACCTGGCC 64 152

388533

11 142848 CAGTTTTGTCCTGGATACAA 0 238

388459

44 962 GGAGCCAGTTGTAGAAGTAC 4 239

388460

44 1284 CCTGGTGTGGTCAGTGCTTG 39 240

388461

44 1306 CAGAGTGAGCTGCCCAAGCC 18 241

388462

44 1317 TCTTCTTGAACCAGAGTGAG 29 242

388463

44 1948 GTTTCTGAAAACATCTGAGA 13 243

388464

44 1998 CTATGGCCCATTCTTTCCAA 33 244

388465

44 2642 TAAGCAGTTGTAATCCCAAG 7 245

388466

44 3690 GGACTCATTGGAGTAGAAGC 34 246

388468

44 5944 AAGACCACTAGCTGCAGAAT 29 247

388469

44 6735 TGGTATGATGTGGTATCACC 53 248

388470

44 6855 GTCATTACCACAAACTTCAC 20 249

388471

44 7145 GACTGAGGTTTTGTATATCT 19 250

388472

44 7269 ACAATGTTCTTCAGCACAGC 24 251

388473

44 8515 CAGCAGATAGTCACTAACAA 20 252

388474

44 9228 ACTGGAGTTCTTTGTGTGAA 25 253

388475

44 9519 GGCACTACTCAGCAGGTGGT 49 254

388476

44 9532 CTTTTGTCCCACAGGCACTA 20 255

388477

44 9630 CTTGACACAAGTGGAAGCCT 15 256

388478

44 9676 GCATAGCCCTCATTGCAAAG 40 257

388479

44 9691 TAGTGCATGTTCCCTGCATA 45 258

388480

44 9701 AACCCCAACATAGTGCATGT 16 259

388481

44 9770 AAGACAAACACCTGGTCAAC 13 260

388482

44 9855 AACCATCTGGCAAGAGCTAG 23 261

388483

44 9924 TGTGGCAGGTATGCCTACTG 14 262

388484

44 9932 GACACTGGTGTGGCAGGTAT 36 263

388485

44 10102 CTTGCCAAGTCACACACTTT 19 264

388486

44 10135 ACTTCCATAAACTTTGTCAC 7 265

388487

44 10181 GACTGAGTAGCTACAGGAGA 40 266

388488

44 10275 TGCTGGCTTAATGGAATGCA 34 267

388489

44 10315 GGATTCTCACACAGGCAGTC 39 268

388490

44 10330 GTTAGGCCACAGGCAGGATT 30 269

388491

44 10348 CAGTTTTTCAGTTCCTCAGT 51 270

388492

44 10370 TTATAACTCTAACAGTGGAA 24 271

388493

44 10460 CTAGGAGAGTGCATCAACAC 38 272

388494

44 10480 TTTCTACCCAGGCTGAGAGA 30 273

388495

44 10550 CTACAGTGCAGGTCAGCCAC 42 274

388496

44 10582 CATCCACAATGGTCAGCTGG 30 275

388497

44 10616 CCCAACCATGCAGAAGATAC 17 276

388498

44 10634 GGTCAGCACTTCTCAGGTCC 50 277

388499

44 10950 TTAACATGACCTGGTTACTC 27 278

388500

44 10988 CCCAAACCAAGCCAGGAAAT 19 279

388501

44 11020 CTTGGTCATATAGTCAAACA 43 280

388502

44 11140 TAATCACAGGCTGCAAGCTC 28 281

388503

44 11170 AAGCAATCCATGGACTGAAG 52 282

388504

44 11211 GTCATGATGGAAAGATAGAG 35 283

388505

44 11240 AACCTTGCATCCCAGCAGCA 12 284

388506

44 11300 GGCAGATAGGAGGAGAGTCA 19 285

388507

44 11407 GGTGAATTTCTTTCATTAAA 53 286

388508

44 11525 TTGGACCAACCTCAGAGTGT 45 287

388509

44 11560 GTAATCAGGCCTGCACCATG 41 288

388510

44 11575 CATCTACCATGAGGAGTAAT 15 289

388511

44 11611 AATGGCTCTAGATTTTATAT 33 290

388512

44 11678 TTCTGATCACACTAAACAAG 31 291

388513

44 11750 CTAGGTTGTGGCACCCATGA 47 292

388514

44 11766 GTACCCAGGTGCATCTCTAG 52 293

388515

44 11890 TGTATGTGGCAGTTGCAAGA 51 294

388516

44 11940 ACTTTTAAAAATTGAGTCCC 17 295

388517

44 12054 TTAAATAAAGCTTGGAAATC 8 296

388518

44 12132 TGACAGTACCACCATGGAAA 27 297

388519

44 12176 GTGCATTGCCAAAAGTTCTA 41 298

388520

44 12248 AAGTCACCTACATGTCAAGG 22 299

388521

44 12262 ACTTGGCAGTGGCTAAGTCA 21 300

388522

44 12377 GTTAGGATTGGTCCCTTCCC 18 301

388523

44 12527 GACCAATTCTGCAGCCCCAC 28 302

388524

44 12648 CCATGATCCTAGTGCTCAAT 42 303

388525

44 12696 CCACATACCAATCCCTGGAG 38 304

388526

44 12726 CCAGCATCAGCAGCTCAGTG 40 305

388527

44 12756 TTTCCCAACCATGATATCCT 7 306

388528

44 12846 CCCTGAACCTTGATATCATC 2 307

388529

44 12971 TGCAGATAGGTCTCTGCCAC 16 308

388530

44 13020 TACAGCAGCAAGGCTTGGAC 29 309

388531

44 13100 GGAAATGGACAGCCAGGTCT 44 310

Los números Isis 387865-387942 se dirigen tanto a la huntingtina humana como a la de ratón.

5 Ejemplo 4

Inhibición antisentido de la huntingtina humana en células A549

[0181] Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido para realizar pruebas adicionales en células A549. Las células en placas de multipocillos se trataron con varias cantidades de oligonucleótidos antisentido seleccionados como se indica en la siguiente tabla (n = 6 tratamientos por oligonucleótido antisentido). Una vez finalizado el periodo de tratamiento, se aisló el ARN a partir de las células, y los niveles de ARN de la huntingtina humana en cada pocillo de cultivo de células individuales se midió por PCR cuantitativa en tiempo real. Los datos presentados en la siguiente tabla (Tabla 6) representan la media del porcentaje de inhibición para cada oligonucleótido

15 antisentido (n = 6 tratamientos), en relación con las células no tratadas. Se probó también los oligonucleótidos de control con secuencias aleatorias de nucleótidos que no se dirigen a ningún gen conocido.

Tabla 6

Dosis de respuesta de la inhibición de la huntingtina humana en células A549

Nº Isis

6.25 nM 12.5 nM 25 nM 50 nM 100 nM 200 nM

387892

97 91 77 68 45 28

387898

85 86 69 47 35 21

387902

91 104 67 47 23 9

387916

88 100 100 51 32 19

388227

86 92 114 80 69 58

388240

117 126 83 65 24 22

388249

101 100 106 54 35 24

388816

101 132 77 59 38 26

388817

92 97 84 69 50 30

388824

78 87 85 69 41 27

388833

81 82 68 65 47 41

Control #1

115 102 96 77 71 57

[0182] Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina redujeron los niveles de ARNm de la huntingtina en células A549. Los oligonucleótidos de control no fueron capaces de inhibir eficazmente los niveles de ARNm de la huntingtina, en particular en bajas dosis. Las regiones diana a las que estos oligonicleótidos antisentido inhibitorios son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos

45 diana validados”.

Ejemplo 5

Inhibición antisentido de la huntingtina humana en células de pacientes con EH

GMO4281

[0183] Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido para realizar pruebas adicionales en los fibroblastos GMO4281 originados en un paciente con EH. Las células en placas de multipocillos se trataron con varias

55 cantidades de oligonucleótidos antisentido seleccionados como se indica en la siguiente tabla (n = 6 tratamientos por oligonucleótido antisentido). Se probó también los oligonucleótidos de control que tienen secuencias aleatorias de nucleótidos que no se dirigen a ningún gen conocido.

[0184] Una vez finalizado el periodo de tratamiento, se aisló ARN a partir de las células, y los niveles de ARN de la huntingtina humana en cada pocillo de cultivo de células individuales se midió por PCR cuantitativa en tiempo real. Los datos presentados en la siguiente tabla representan la media del nivel de ARNm de la huntingtina (n = 6) en relación con las células no tratadas, es decir; los datos se expresan como el porcentaje de los niveles de ARNm de la huntingtina en las células de control. El porcentaje de control inferior a 100 indica una reducción en los niveles de ARNm de la huntingtina, mientras que el control superior a 100 indica un aumento en los niveles de ARNm de la

65 huntingtina. El porcentaje de inhibición puede calcularse restando el porcentaje de control a partir de 100.

Tabla 7

Dosis de respuesta de inhibición de la huntingtina humana en fibroblastos GMO4281

Concentración del tratamiento con oligonucleótidos

Nº ISIS

9.375 nM 18.75 nM 37.5 nM 75.0 nM 150.0 nM 300.0 nM

387892

77 55 47 33 22 21

387898

77 61 49 25 17 13

387902

87 58 52 27 17 13

387916

104 75 50 25 14 12

388240

81 74 57 26 17 16

388249

96 74 55 32 18 14

388816

86 61 48 26 14 12

388817

84 76 51 35 26 18

388824

86 78 59 38 24 20

388833

84 79 60 33 19 13

Control #1

99 95 106 67 63 48

Control #2

100 102 88 77 64 49

Células GMO4478

[0185] Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina para realizar pruebas adicionales en células GMO4478, que son fibroblastos derivados de un paciente con EH. La prueba se realizó según el método utilizado para las células GMO4281. Los resultados se muestran en la siguiente tabla como la media del porcentaje de inhibición con respecto a las células no tratadas.

Tabla 8

Dosis de respuesta de inhibición de la huntingtina humana en fibroblastos GMO4478

Concentración del tratamiento con oligonucleótidos

Nº ISIS

9.375 nM 18.75 nM 37.5 nM 75.0 nM 150.0 nM

387892

45 29 17 10 7

387898

50 27 9 2 2

387902

40 22 9 3 2

387916

60 39 18 6 3

388240

60 34 16 5 6

388249

78 56 34 13 7

388816

75 48 26 8 7

388817

70 52 37 38 32

388824

65 42 21 9 8

388833

43 31 16 7 3

Control #1

95 88 73 58 48

Control #2

101 94 90 64 56

55 [0186] Cada uno de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina humana redujeron eficazmente los niveles de ARNm de la huntingtina en los fibroblastos GMO4478 y GMO4281. Los oligonucleótidos de control no fueron capaces de inhibir eficazmente los niveles de ARNm de la huntingtina, en particular en bajas dosis.

[0187] La potencia de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina se resumen en la Tabla 9. La potencia se ilustra como IC50, que es la concentración a la que se observa un 50 % de reducción en los niveles de ARNm de la huntingtina. Esta tabla indica también que la secuencia de la huntingtina a la que son complementarios los oligonucleótidos, así como el correspondiente 5´ sitio diana ´. Se muestran también las características particulares de la región de la secuencia de la huntingtina a la que son complementarios los oligonucleótidos. 65 Además, se indica la especie del gen de la huntingtina a la que se dirigen los oligonucleótidos antisentido. Las regiones diana a la que son complementarios estos oligonucleótidos antisentido inhibitorios se denominan en el

presente documento “segmentos diana validados”.

Tabla 9

Resumen de los oligonucleótidos antisentido potentes dirigidos a la huntingtina

Nº ISIS

IC50 SEC ID Nº diana sitio diana 5' Especificidad del ácido nucleico diana Región diana en el gen de la huntingtina humana

A549

GM04281 GM04478

387892

84 32 5 4 3209 Humano -Ratón Exón 23: exón 24

387898

47 31 8 4 4036 Humano – Ratón -Rata Exón 30

387902

39 35 5 4 4269 Humano -Ratón Exón 31

387916

61 42 13 4 5801 Humano -Rata Exón 42

388240

63 39 12 4 4558 Humano; > 4 mm para roedores Exón 34

388249

63 45 24 4 6769 Humano; > 5 mm para roedores Exón 48: exón 49

388816

-69 34 19 45 1650 Inserción dianas R6 / 2; > 5 mm para ratón Intrón 1

388817

98 48 25 45 1670 Inserción dianas R6 / 2 >5 mm para ratón Intrón 1

388824

81 50 15 45 1817 Inserción dianas R6 / 2 >5 mm para ratón Intrón 1

388833

103 48 5 45 1128 Región repetición CAG dianas Exón 1

[0188] Como los oligonucleótidos antisentido redujeron los niveles de ARNm de la huntingtina en las células aisladas de los pacientes con EH, los oligonucleótidos antisentido son agentes terapéuticos candidatos para reducir los niveles de ARNm de la huntingtina in vivo. En una realización, los oligonucleótidos antisentido, han demostrado 45 potencia in vitro, se prueban además en modelos experimentales animales, incluyendo modelos experimentales de Huntington, para identificar los oligonucleótidos antisentido que pueden reducir el ARNm de la huntingtina en humanos. Según una realización, los oligonucleótidos antisentido se administran en cantidades terapéuticamente eficaces a humanos para el tratamiento o mejora de la enfermedad de Huntington. En otra realización, los oligonucleótidos se administran en cantidades terapéuticamente eficaces para retrasar la aparición de la enfermedad

50 de Huntington.

Ejemplo 6

Inhibición antisentido de la huntingtina en líneas celulares neuronales

55 [0189] Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido dirigidos a la huntingtina para realizar pruebas adicionales en líneas celulares neuronales de la huntingtina. Las líneas celulares estriadas de ratón con la huntingtina de tipo salvaje, STEHhQ7/7 (Q7/7), y la huntingtina mutante, STEHhQ111/111 (Q111/111), se transfectaron con diversas dosis de oligos 387902 y 387916, que oscilan entre 0,05 μM y 10 μM. Se utilizó una

60 pulsación de 200 V de 2 mseg en una cubeta de 2 mm para la transfección de electroporación. Se electroporaron un millón de células ante la cantidad indicada de oligonucleótidos. Tras la electroporación, las células se colocaron en placas a una densidad de 5 x 104 células por pocillo, Los resultados se presentan en la Tabla 10 como el porcentaje del ARNm de la huntingtina en comparación al no control de oligo, cada concentración se realizó por triplicado.

Tabla 10 Inhibición de la huntingtina en líneas celulares neuronales en ratón

Q7 / 7

Q111 / 111

[Oligo]μM

387902 % mHtt 387916 % mHtt 387902 % mHtt 387916 % mHtt

0

100,0 100,0 100,0 100,0

0,675

85,9 36,5 156,4 59,3

1,25

50,2 34,5 103,4 31,4

3

31,4 11,0 38,9 18,8

5

12,2 1,6 16,5 6,4

10

5,5 2,7 6,8 3,1

[0190] En estudios posteriores, las células se evaluaron para la respuesta fenotípica midiendo la actividad caspasa utilizando el estudio comercial Homogeneous Caspase-3 / 7 de Promega Apo -ONE®. En resumen, las células se colocaron en placas y se transfectaron con Lipofectin® al día siguiente. Tras 48 horas, el medio se cambió a DMEM libre de suero durante 24 horas antes del ensayo de caspasa.

Ejemplo 7

Inhibición antisentido in vivo de la huntingtina

[0191] Para evaluar los efectos de la inhibición antisentido de un gen en el sistema nervioso central, es beneficioso entregar directamente los oligonicleótidos antisentido al sistema nervioso central, por ejemplo, a través de la administración intracerebroventricular (ICV), intratecal (IT) o intraparenquimatosa. Para evaluar los efectos de la inhibición antisentido de la huntingtina en el sistema nervioso central de animales, los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina se administraron a los ratones a través de la administración por vía ICV. [0192] Los números ISIS 387902, 387916, 387918, 388249, 388503, 388509, y 388816 se seleccionaron para una prueba in vivo. Los ratones tratados con solución salina se utilizaron como animales de control. Cada tratamiento o grupo de control incluyó a cuatro animales. Aquellos implantados quirúrgicamente con mini bombas de Alzet se les infusionaron continuamente oligonucleótidos antisentido a ratones con una dosis de 100 ug / día durante dos semanas. Durante el periodo de tratamiento, los ratones se controlaron por cualquier cambio clínico, como cambios corporales. Al final del periodo de tratamiento, los ratones se sacrificaron y se aislaron los órganos principales. El ARN se preparó a partir de los tejidos del cerebro y del hígado y se sometieron a un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real para medir la reducción de los niveles de ARNm de la huntingtina en ratón. [0193] Cada oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina redujo los niveles de ARNm de la huntingtina en el cerebro del ratón, tal y como se muestra en la siguiente tabla. También se muestran las especies de ácido nucleico de la huntingtina a la que se dirige cada oligonucleótido antisentido. Los niveles de ARNm de la huntingtina en ratones representan la media para cada grupo de tratamiento y se expresan como porcentaje de control de solución salina (% de control de solución salina).

Tabla 11

Inhibición antisentido in vivo de la huntingtina de ratón

Nº ISIS

SEC ID Nº Especies diana de ácido nucleico de la huntingtina Niveles de ARNm de la huntingtina, % de control de solución salina

387902

Humano, ratón 37%

387916

Humano, rata (único mal apareamiento en ratón) 32%

387918

Humano, ratón, rata 35%

388503

Ratón 30%

388509

Ratón 34%

[0194] Cada uno de los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 11 redujo los niveles de ARNm de la huntingtina en el cerebro de ratón tras el periodo de infusión de ICV. Además, el número ISIS 387916, que tiene un mal apareamiento en la huntingtina de ratón, fue capaz de reducir los niveles de ARNm de la huntingtina de ratón in vivo.

Ejemplo 8

Inhibición antisentido in vivo en modelos con Huntington

[0195] Para evaluar los efectos de la inhibición antisentido de la huntingtina en el sistema nervioso central de un modelo animal con EH, los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia la huntingtina se administraron en ratones transgénicos R6 / 2 a través de la administración por vía ICV.

[0196] Los números ISIS 387902, 387916, 387918, 388249, 388503, 388509, y 388816 se seleccionaron para una prueba in vivo. Los ratones tratados con solución salina se utilizaron como animales de control. Cada tratamiento o

grupo de control incluyó a cuatro animales. Aquellos implantados quirúrgicamente con mini bombas de Alzet se les infusionaron continuamente oligonucleótidos antisentido a ratones con una dosis de 100 ug / día durante dos semanas. Durante el periodo de tratamiento, los ratones se controlaron por cualquier cambio clínico, como cambios corporales, así como comportamientos fenotípicos relacionados con el transgén de la huntingtina. Al final del periodo de tratamiento, los ratones se sacrificaron y se aislaron los órganos principales. El ARN se preparó a partir de los tejidos del cerebro y del hígado y se sometieron a un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real para medir la reducción de los niveles de ARNm de la huntingtina en el ratón. La expresión de la proteína huntingtina en el tejido se midió también utilizando técnicas de transferencia Western.

Ejemplo 9

Administración de oligonucleótidos antisentido en individuos que padecen la enfermedad de Huntington

[0197] En el presente documento se proporcionan métodos de tratamiento a individuos que padecen la enfermedad de Huntington (EH). Dichos métodos comprenden la administración en el líquido cefalorraquídeo o en el tejido cerebral del individuo de una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina. La administración de la composición farmacéutica en el líquido cefalorraquídeo permite el contacto del oligonucleótido antisentido con las células de los tejidos del sistema nervioso central, incluyendo los tejidos afectados por EH.

[0198] Los individuos que padecen EH reciben un diagnóstico de EH de un médico. La evaluación del médico incluye pruebas genéticas del gen de EH y un examen neurológico.

[0199] Una bomba implantada quirúrgicamente (por ejemplo, una bomba Medtronic SyncroMed® II) se utiliza para administrar una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina en el líquido cefalorraquídeo o cerebro de un individuo que padece EH. La bomba se implanta quirúrgicamente por los procedimientos descritos por el fabricante. El fármaco se retiene en el depósito de la bomba y se bombea con una dosis programada preferiblemente en un catéter que se implanta quirúrgicamente por vía intratecal.

[0200] El depósito se carga con una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina. La composición farmacéutica se administra en el líquido cefalorraquídeo. En algunas realizaciones, la cantidad de oligonucleótidos antisentido infundidos es de 10 mg. La administración tiene una duración de al menos 28 días. Los individuos son controlados por un profesional médico que evalúa los indicadores de EH. Es clínicamente deseable para la administración reducir o detener la progresión de EH, o prevenir o atrasar el empeoramiento, o la mejora de un síntoma o marcador de EH.

Ejemplo 10

Administración de oligonucleótidos antisentido en individuos susceptibles de padecer la enfermedad de Huntington

[0201] En el presente documento se proporcionan métodos para prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad de Huntington (EH) en individuos susceptibles de padecer EH. Dichos métidos comprenden la administración en el líquido cefalorraquídeo o en el tejido cerebral del individuo de una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina. La administración de la composición farmacéutica en el líquido cefalorraquídeo permite el contacto del oligonucleótido antisentido con las células de los tejidos del sistema nervioso central, incluyendo los tejidos afectados por EH.

[0202] Los individuos susceptibles de padecer EH son identificados por un médico tras haber realizado pruebas genéticas del gen de EH y un examen neurológico.

[0203] Una bomba implantada quirúrgicamente (por ejemplo, una bomba Medtronic SyncroMed® II) se utiliza para administrar una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina en el líquido cefalorraquídeo o cerebro de un individuo susceptible de padecer EH. La bomba se implanta quirúrgicamente por los procedimientos descritos por el fabricante. El fármaco se retiene en el depósito de la bomba y se bombea con una dosis programada preferiblemente en un catéter que se implanta quirúrgicamente por vía intratecal.

[0204] El depósito se carga con una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido dirigido hacia la huntingtina. La composición farmacéutica se administra con una cantidad que produce una infusión entre 8 mg y 12 mg del oligonucleótido antisentido en el líquido cefalorraquídeo. En algunas realizaciones, la cantidad de oligonucleótidos antisentido infundidos es de 10 mg. La administración tiene una duración de al menos 28 días. Los individuos son controlados por un profesional médico que evalúa los indicadores de EH. Es clínicamente deseable para la administración prevenir o retrasar la aparición de los síntomas de EH.

LISTADO SECUENCIAL

[0205]

5 <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Susan M. Freier

<120> COMPOSICIONES Y UTILIZACIONES DIRIGIDAS HACIA LA HUNTINGTINA

<130> RTS-0838WO

<150> 60/762,954

<151> 2006-01-26 10 <150> 60/836,290

<151> 2006-08-07

<160> 369

<210> 1 15 <211> 11155

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 916

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 10348

<212> DNA

<213> Homo sapiens 35 <400> 3

<210> 4

<211> 13495

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 172001

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 3059

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 6 <210> 7

<211> 1375

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 7 <210> 8

<211> 9992

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> 3103

<223> nisa, c, g, or t

<400> 8

<210> 9

<211> 8552

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> 3103

<223> nisa, c, g, or t

210> 10

<211> 10081

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

<210> 11

<211> 154001

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 12 cgtgtgtctg tgctagtccc 20

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 13 ggcaacgtga acaggtccaa 20

<210> 14

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 14 gcccattgct ggacatgc 18

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 15 agcccattgc tggacatgca 20

<210> 16

<211> 20

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 16 ttgtcccagt cccaggcctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 17 ctttccgttg gacccctggg 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 18 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20

<210> 19

<211> 20

<212 > ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 19 atccaagtgc tactgtagta 20

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 1-20

<223> nisa, c, g, or t

<400> 20 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 21 gccctccatg ctggcacagg 20

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 22 agcaaaagat caatccgtta 20

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 23 tacagaaggc tgggccttga 20

<210> 24 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 24 atgcattctg cccccaagga 20

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 25 caacggattt ggtcgtattg g 21

<210> 26

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 26 ggcaacaata tccactttac cagagt 26

<210> 27

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 27 cgcctggtca ccagggctgc t 21

<210> 28

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 28 gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 29

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 29 gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 30 caagcttccc gttctcagcc 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 31 tggaatcata ttggaacatg 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 32 ggcaaattca acggcacagt 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 33 gggtctcgct cctggaagat 20

<210> 34

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 34 aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27

<210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 35 tgttctagag acagccgcat ctt 23

<210> 36

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 36 caccgacctt caccatcttg t 21

<210> 37

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 37 ttgtgcagtg ccagcctcgt ctca 24

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 38 ctccgtccgg tagacatgct 20

<210> 39

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 39 ggaaatcaga accctcaaaa tgg 23

<210> 40

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Sonda

<400> 40 tgagcactgt tcaactgtgg atatcggga 29

<210> 41

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 41 cagagctggt caaccgtatc c 21

<210> 42

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 42 ggcttaaaca gggagccaaa a 21

<210> 43

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 43 acttcatgat gagctcggag ttcaac 26

<210> 44

<211> 13210

<212> ADN

<400> 44

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 46 caggtaaaag cagaacctga 20

<210> 47

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 47 gccttcatca gcttttccag 20

<210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico,

<400> 48 gctgctgctg ctgctggaag 20

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 49 tgctgctgct gctgctgctg 20

<210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 50 ctgctgctgt tgctgctgct 20

<210> 51

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 5L ctgctgctgc tgctgctgct 20

<210> 52

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 52 gctgctgctg ctgctgctgc 20

<210> 53

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 53 tggcggctgc tgctgctgct 20

<210> 54

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 54 gcggcggcgg cggtggcggc 20

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 55 atgattcaca cggtctttct 20

<210> 56

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 56 aaattctgga gaatttctga 20

<210> 57

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 57 agtttctgaa attctggaga 20

<210> 58

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 58 gaatccatca aagctttgat 20

<210> 59

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 59 ccttggaaga ttagaatcca 20

<210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 60 gagccagctc agcaaacctc 20

<210> 61

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 61 gaaccaggtg agccagctca 20

<210> 62

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 62 ttcaccaggt aaggcctgca 20

<210> 63

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 63 acagctgcag ccaaggtctc 20

<210> 64

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 64 ccaaaagaag ccataatttt 20

<210> 65

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 65 aaccttaatt tcattgtcat 20

<210> 66

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 66 gtagccaact atagaaatat 20

<210> 67

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 67 atttagtagc caactataga 20

<210> 68

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 68 agagacttcc atttctttcc 20

<210> 69

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 69 agaaggagag acttccattt 20

<210> 70

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 70 tgctctgcag aaggagagac 20

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 71 cataaacctg gacaagctgc 20

<210> 72

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 72 gtcagttcat aaacctggac 20

<210> 73

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 73 acattgtggt cttggtgctg 20

<210> 74

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 74 aagagcactt tgcctttttg 20

<210> 75

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 75 tgctgaccct ggagtggaaa 20

<210> 76

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 76 tggccagatc cactgagtcc 20

<210> 77

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 77 tcattcaggt ccatggcagg 20

<210> 78

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 78 ggtcccatca ttcaggtcca 20

<210> 79

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 79 ctaacacaat ttcagaactg 20

<210> 80

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 80 tggaagagtt cctgaaggcc 20

<210> 81

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 81 gtttttcaat aaatgtgcct 20

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 82 gcagtgactc atgtttttca 20

<210> 83

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 83 tgcctgcagt gactcatgtt 20

<210> 84

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 84 gtcaagagga actttataga 20

<210> 85

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 85 atcgatgtag ttcaagatgt 20

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 86 gtcccacaga gaatggcagt 20

<210> 87

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 87 tgatcagctg cagtcctaac 20

<210> 88

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 88 tgtataatga tgagcccctc 20

<210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 89 gatcagcttg tccttggtca 20

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 90 tctggtggtt gatgtgatta 20

<210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 91 tgagtgctct ggtggttgat 20

<210> 92

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 92 cagcatccaa atgtgagtgc 20

<210> 93

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 93 gcttcacagc atccaaatgt 20

<210> 94

<211> 20

<212> ADN c213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 94 gaaggcagtg gaaagaagac 20

<210> 95

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 95 agagaaggca aggctgcctt 20

<210> 96

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 96 ggtttgttag agaaggcaag 20

<210> 97

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 97 acatcatgca gtttgaggta 20

<210> 98

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 98 gctttcagga catcatgcag 20

<210> 99

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 99 aagcaggatt tcaggtatcc 20

<210> 100

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 100 ctcgactaaa gcaggatttc 20

<210> 101

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 101 acagttgcca tcattggttc 20

<210> 102

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 102 attgttgaac acaaacagtt 20

<210> 103

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 103 ttggaagata agccatcaaa 20

<210> 104

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 104 tgcaccatgt tcctcaggct 20

<210> 105

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 105 cgcctgcacc atgttcctca 20

<210> 106

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 106 aatagcattc ttatctgcac 20

<210> 107

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 107 aatgtgatta tgaatagcat 20

<210> 108

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 108 taactgcaca catgttgtag 20

<210> 109

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 109 aacacctgat ctgaatccag 20

<210> 110

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 110 gtttcaatac aaagccaata 20

<210> 111

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 111 aactggccca cttcaatgta 20

<210> 112

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 112 tgattccctg aactggccca 20

<210> 113

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 113 ttaggaattc caatgatctg 20

<210> 114

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 114 atgattttag gaattccaat 20

<210> 115

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 115 ctggccatga tgccatcaca 20

<210> 116

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 116 ttccttccac tggccatgat 20

<210> 117

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 117 gcatcagctt tatttgttcc 20

<210> 118

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 118 ctcagtaaca ttgacaccac 20

<210> 119

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 119 tactggatga gtctcagtaa 20

<210> 120

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial c220> ’

<223> Compuesto oligomérico

<400> 120 ctgatggtac tggatgagtc 20

<210> 121

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 121 tggcactgct gcaggacaag 20

<210> 122

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 122 tcctgaatac gagaaagaac 20

<210> 123

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 123 tttggctgcc aagtcagaat 20

<210> 124

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 124 tccaagtttg gctgccaagt 20

<210> 125

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 125 tctctattgc acattccaag 20

<210> 126

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 126 ctgacagaca taatcacaga 20

<210> 127

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 127 tgatcagatc ttgaatgtga 20

<210> 128

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 128 cgagactgaa ttgcctggat 20

<210> 129

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 129 gaatagagcc tttggtgtct 20

<210> 130

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 130 gtcttgcatg gtggagagac 20

<210> 131

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 131 aatctgacct ggtccaacac 20

<210> 132

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 132 agcagtgcag aatctgacct 20

<210> 133

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 133 tctgcacctt ccagcagtgc 20

<210> 134

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 134 accagaaatt tcactcatcc 20

<210> 135

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 135 ctggccacca gaaatttcac 20

<210> 136

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 136 cagcatcccc aaacagatca 20

<210> 137

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 137 acagtgcagc atccccaaac 20

<210> 138

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 138 ggactgatac agtgcagcat 20

<210> 139

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 139 ttctcaggag gaaggtgcaa 20

<210> 140

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 140 ctgctcatgg atcaaatgcc 20

<210> 141

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 141 gtgtgtttgg atctacttcc 20

<210> 142

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 142 gcagtgatat acttaggatt 20

<210> 143

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 143 tcacaggctg cagtgatata 20

<210> 144

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 144 tgatgttcct gagcaatggc 20

<210> 145

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 145 tccaagcttc cacaccagtg 20

<210> 146

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 146 tgttgatgcg gtagatgaac 20

<210> 147

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 147 gtcaccagga caccaaggag 20

<210> 148

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 148 tccaagcagc ttacagctgg 20

<210> 149

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 149 ttgaaaccat tgcttgaatc 20

<210> 150

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 150 atgcctgata taaatgatgg 20

<210> 151

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 151 gttgatctgc agcagcagct 20

<210> 152

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 152 gagtgtatgg acacctggcc 20

<210> 153

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 153 tgttccccag ccacacggag 20

<210> 154

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 154 gtggcaggca ccaggtactg 20

<210> 155

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 155 atagttctca atgaggtaaa 20

<210> 156

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 156 acagtggtaa atgatggagg 20

<210> 157

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 157 atgcaggtga gcatcaggcc 20

<210> 158

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 158 tgtgtacatg caggtgagca 20

<210> 159

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 159 aggaaagcct ttcctgatcc 20

<210> 160

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 160 tatggctgct ggttggacag 20

<210> 161

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 161 cagcatgacc cagtcccgga 20

<210> 162

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 162 ggacagcatg acccagtccc 20

<210> 163

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 163 cccatcctgc tgatgacatg 20

<210> 164

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 164 accaggcaga aaaggttcac 20

<210> 165

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 165 tcagcaggtg gtgaccttgt 20

<210> 166

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 166 tctgccacat ggcagagaca 20

<210> 167

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 167 aaagagcact tctgccacat 20

<210> 168

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 168 gccactgcca caaagagcac 20

<210> 169

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 169 caccaggact gcagacactc 20

<210> 170

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 170 tggaaggcct caggctcagc 20

<210> 171

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 171 ggacctggtc acccacatgg 20

<210> 172

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 172 ggcaacaacc agcaggtgac 20

<210> 173

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 173 tgcaacctgg caacaaccag 20

<210> 174

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 174 cccagatgca agagcagctg 20

<210> 175

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 175 aacagccagc ctgcaggagg 20

<210> 176

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 176 tctactgcag gacagcagag 20

<210> 177

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 177 tgttcccaaa gcctgctcac 20

<210> 178

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 178 ccaggccagt gttcccaaag 20

<210> 179

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 179 ggagacccag gccagtgttc 20

<210> 180

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 180 agcacaggcc atggcatctg 20

<210> 181

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 181 ctggcccagc acaggccatg 20

<210> 182

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 182 actgatataa ttaaatttta 20

<210> 183

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 183 ggctatgcca gtggctacag 20

<210> 184

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 184 tgtgaatgca taaacaggaa 20

<210> 185

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 185 ctagcaagga acaggagtgg 20

<210> 186

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 186 ccatggagca gcaggtccca 20

<210> 187

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 187 gcatgcatcc atggagcagc 20

<210> 188

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 188 actaacagtg ccaagacacc 20

<210> 189

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 189 ccattttaat gacttggctc 20

<210> 190

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 190 aggaagcaga gcccctgcct 20

<210> 191

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 191 ggcagcacct gcacagagtt 20

<210> 192

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 192 gcatacaagt ccacatctca 20

<210> 193

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 193 catacaggcc tggcagaggc 20

<210> 194

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 194 aagaatggtg attttcttac 20

<210> 195

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 195 tctagccagg aacaacatct 20

<210> 196

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 196 atgtaaacat ctagccagga 20

<210> 197

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 197 aatgagctca tattcatctc 20

<210> 198

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 198 gaatgagccc tgccctgacc 20

<210> 199

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 199 gcaatgaatg agccctgccc 20

<210> 200

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 200 agctgatatg gagaccatct 20

<210> 201

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 201 ggtgcttgcc acagattttt 20

<210> 202

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 202 tgcattgcca aacaattcta 20

<210> 203

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 203 ttggcagctg gaaacatcac 20

<210> 204

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 204 tccaagtcta ccctggccag 20

<210> 205

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 205 gttgccttca gttgtcatgc 20

<210> 206

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 206 ttccaggttg ccttcagttg 20

<210> 207

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 207 cagttaccac ccagattgca 20

<210> 208

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 208 gagacctgga caaggaggcc 20

<210> 209

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 209 tgtaattaca gaatttgtat 20

<210> 210

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 210 acattccatg aattccattt 20

<210> 211

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 211 gttaatttag agaaaattca 20

<210> 212

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 212 cagaagcatc caaaccagta 20

<210> 213

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 213 caagagggtt gcatagaaac 20

<210> 214

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 214 caaagtataa acagtttgag 20

<210> 215

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 215 cccagtgcag ttcacattca 20

<210> 216

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 216 tattataaaa tacatgtttc 20

<210> 217

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 217 attagagatt catcatattg 20

<210> 218

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 218 ggtatggaaa ggttcaacat 20

<210> 219

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 219 tggaaggtga gggacaaaaa 20

<210> 220

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 220 agcagaaaca agtattccat 20

<210> 221

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 221 caaattcaca tagggttggt 20

<210> 222

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 222 acatgagcaa tgaaggacag 20

<210> 223

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 223 gcaatgtgtg atttaccaca 20

<210> 224

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 224 accacatcat aatttgtcat 20

<210> 225

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 225 attatttaag aagtacccac 20

<210> 226

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 226 tgccccaaaa agtggaacca 20

<210> 227

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 227 acatttccaa gaggttttga 20

<210> 228

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 228 tcagccccaa tttgtagcag 20

<210> 229

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 229 gacataaagt ttagaggtat 20

<210> 230

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 230 gaaggaccca cagaggtttg 20

<210> 231

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 231 tgaaaaggaa gtgacatcat 20

<210> 232

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 232 cagtgtcagg agaagcccag 20

<210> 233

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 233 , gataaaacac cttgttaatg 20

<210> 234

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 234 ggagcagtac cttatagttg 20

<210> 235

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 235 atagctgctg cacacagaca 20

<210> 236

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 236 gcatcagtac ctgaactggc 20

<210> 237

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 237 gagtggttgg ctaatgttga 20

<210> 238

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 238 cagttttgtc ctggatacaa 20

<210> 239

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 239 ggagccagtt gtagaagtac 20

<210> 240

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 240 cctggtgtgg tcagtgcttg 20

<210> 241

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 241 cagagtgagc tgcccaagcc 20

<210> 242

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 242 tcttcttgaa ccagagtgag 20

<210> 243

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 243 gtttctgaaa acatctgaga 20

<210> 244

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 244 ctatggccca ttctttccaa 20

<210> 245

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 245 taagcagttg taatcccaag 20

<210> 246

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 246 ggactcattg gagtagaagc 20

<210> 247

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 247 aagaccacta gctgcagaat 20

<210> 248

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 248 tggtatgatg tggtatcacc 20

<210> 249

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 249 gtcattacca caaacttcac 20

<210> 250

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 250 gactgaggtt ttgtatatct 20

<210> 251

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 251 acaatgttct tcagcacagc 20

<210> 252

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 252 cagcagatag tcactaacaa 20

<210> 253

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 253 actggagttc tttgtgtgaa 20

<210> 254

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 254 ggcactactc agcaggtggt 20

<210> 255

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 255 cttttgtccc acaggcacta 20

<210> 256

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 256 cttgacacaa gtggaagcct 20

<210> 257

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 257 gcatagccct cattgcaaag 20

<210> 258

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 258 tagtgcatgt tccctgcata 20

<210> 259

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 259 aaccccaaca tagtgcatgt 20

<210> 260

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 260 aagacaaaca cctggtcaac 20

<210> 261

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 261 aaccatctgg caagagctag 20

<210> 262

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 262 tgtggcaggt atgcctactg 20

<210> 263

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 263 gacactggtg tggcaggtat 20

<210> 264

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 264 cttgccaagt cacacacttt 20

<210> 265

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 265 acttccataa actttgtcac 20

<210> 266

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 266 gactgagtag ctacaggaga 20

<210> 267

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 267 tgctggctta atggaatgca 20

<210> 268

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 268 ggattctcac acaggcagtc 20

<210> 269

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 269 gttaggccac aggcaggatt 20

<210> 270

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 270 cagtttttca gttcctcagt 20

<210> 271

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 271 ttataactct aacagtggaa 20

<210> 272

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 272 ctaggagagt gcatcaacac 20

<210> 273

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 273 tttctaccca ggctgagaga 20

<210> 274

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 274 ctacagtgca ggtcagccac 20

<210> 275

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 275 catccacaat ggtcagctgg 20

<210> 276

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 276 cccaaccatg cagaagatac 20

<210> 277

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 277 ggtcagcact tctcaggtcc 20

<210> 278

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 278 ttaacatgac ctggttactc 20

<210> 279

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 279 cccaaaccaa gccaggaaat 20

<210> 280

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 280 cttggtcata tagtcaaaca 20

<210> 281

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 281 taatcacagg ctgcaagctc 20

<210> 282

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 282 aagcaatcca tggactgaag 20

<210> 283

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 283 gtcatgatgg aaagatagag 20

<210> 284

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 284 aaccttgcat cccagcagca 20

<210> 285

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 285 ggcagatagg aggagagtca 20

<210> 286

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 286 ggtgaatttc tttcattaaa 20

<210> 287

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 287 ttggaccaac ctcagagtgt 20

<210> 288

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 288 gtaatcaggc ctgcaccatg 20

<210> 289

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 289 catctaccat gaggagtaat 20

<210> 290

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 290 aatggctcta gattttatat 20

<210> 291

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 291 ttctgatcac actaaacaag 20

<210> 292

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 292 ctaggttgtg gcacccatga 20

<210> 293

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 293 gtacccaggt gcatctctag 20

<210> 294

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 294 tgtatgtggc agttgcaaga 20

<210> 295

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 295 acttttaaaa attgagtccc 20

<210> 296

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 296 ttaaataaag cttggaaatc 20

<210> 297

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 297 tgacagtacc accatggaaa 20

<210> 298

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 298 gtgcattgcc aaaagttcta 20

<210> 299

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 299 aagtcaccta catgtcaagg 20

<210> 300

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 300 acttggcagt ggctaagtca 20

<210> 301

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 301 gttaggattg gtcccttccc 20

<210> 302

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 302 gaccaattct gcagccccac 20

<210> 303

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 303 ccatgatcct agtgctcaat 20

<210> 304

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 304 ccacatacca atccctggag 20

<210> 305

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 305 ccagcatcag cagctcagtg 20

<210> 306

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 306 tttcccaacc atgatatcct 20

<210> 307

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 307 ccctgaacct tgatatcatc 20

<210> 308

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 308 tgcagatagg tctctgccac 20

<210> 309

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 309 tacagcagca aggcttggac 20

<210> 310

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 310 ggaaatggac agccaggtct 20

<210> 311

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 311 aggttctgcc tcacacagca 20

<210> 312

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 312 cccgcaggtt ctgcctcaca 20

<210> 313

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 313 agggaaccag cccgcccctg 20

<210> 314

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 314 tggccaggga accagcccgc 20

<210> 315

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 315 atggctggcc agggaaccag 20

<210> 316

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 316 tgccaatggc tggccaggga 20

<210> 317

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 317 gacagcccta gcctgcggac 20

<210> 318

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 318 gattgacagc cctagcctgc 20

<210> 319

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 319 gcatgattga cagccctagc 20

<210> 320

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 320 atcttggacc cgtcccggca 20

<210> 321

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 321 cgtccatctt ggacccgtcc 20

<210> 322

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 322 agcggccgtc catcttggac 20

<210> 323

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 323 aacctgagcg gccgtccatc 20

<210> 324

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 324 gcagaacctg agcggccgtc 20

<210> 325

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 325 aaaagcagaa cctgagcggc 20

<210> 326

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 326 ggtaaaagca gaacctgagc 20

<210> 327

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 327 ggccgcaggt aaaagcagaa 20

<210> 328

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 328 gctctgggcc gcaggtaaaa 20

<210> 329

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 329 agtccccgga ggcctcgggc 20

<210> 330

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico <400> 330 ggcacggcag tccccggagg 20

<210> 331

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 331 agggtcgcca tggcggtctc 20

<210> 332

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 332 ttttccaggg tcgccatggc 20

<210> 333

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 333 tcagcttttc cagggtcgcc 20

<210> 334

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 334 ttcatcagct tttccagggt 20

<210> 335

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 335 aaggccttca tcagcttttc 20

<210> 336

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 336 actcgaaggc cttcatcagc 20

<210> 337

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 337 gagggactcg aaggccttca 20

<210> 338

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 338 ggacttgagg gactcgaagg 20

<210> 339

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 339 ctgaggaagc tgaggaggcg 20

<210> 340

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 340 tgtgcctgcg gcggcggctg 20

<210> 341

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 341 ggcagcagcg gctgtgcctg 20

<210> 342

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 342 caaactcacg gtcggtgcag 20

<210> 343

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 343 gcgggcccaa actcacggtc 20

<210> 344

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 344 ggagctgcag cgggcccaaa 20

<210> 345

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 345 gccgtagcct gggacccgcc 20

<210> 346

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 346 gcagggttac cgccatcccc 20

<210> 347

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 347 aggctgcagg gttaccgcca 20

<210> 348

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 348 cccgcaggct gcagggttac 20

<210> 349

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 349 gccggcccgc aggctgcagg 20

<210> 350

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 350 aaggcctcgc cccaggaggg 20

<210> 351

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 351 agacccaagt gagggagcgg 20

<210> 352

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 352 aagggaagac ccaagtgagg 20

<210> 353

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 353 ggacaaggga agacccaagt 20

<210> 354

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 354 tcgcgagagg acaagggaag 20

<210> 355

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 355 tcccctcgcg agaggacaag 20

<210> 356

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 356 ggccccaaca aggctctgcc 20

<210> 357

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<400> 357 ggacaggccc caacaaggct 20

<210> 358

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 3

<223> n = A or T

<400> 358 cgnctgcacc atgttcctca 20

<210> 359

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 5

<223> n = C or G

<400> 359 cgccngcacc atgttcctca 20

<210> 360

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 12

<223> n = C or G

<400> 360 cgcctgcacc angttcctca 20

<210> 361

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 17

<223> n = A or T <400> 361 cgcctgcacc atgttcntca 20

<210> 362

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 3

<223> n = A or T

<400> 362 gcngtagcct gggacccgcc 20

<210> 363

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 9, 14

<223> n = C or G

<400> 363 gccgtagcnt gggncccgcc 20

<210> 364

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 18

<223> n = A or T

<400> 364 gccgtagcct gggacccncc 20

<210> 365

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 20

<223> n = A or T

<400> 365 gccgtagcct gggacccgcn 20

<210> 366

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 3

<223> n = C or G

<400> 366 tcnctattgc acattccaag 20

<210> 367

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 8

<223> n = C or G

<400> 367 tctctatngc acattccaag 20

<210> 368

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_feature

<222> 12

<223> n = A or T

<400> 368 tctctattgc anattccaag 20

<210> 369 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Compuesto oligomérico

<220>

<221> misc_Feature

<222> 17

<223> n = A or T

<400> 369 tctctattgc acattcnaag 20

Claims (16)

1. Reivindicaciones

   1.

   Un oligonucleótido antisentido modificado químicamente con 17 a 35 nucleótidos que comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

2. 2.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico monocatenario.

3. 3.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho oligonucleótido es 100 % complementario a la SEC ID Nº 4.

4. 4.

   El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleósido modificado, un grupo azúcar modificado y /

   o una nucleobase modificada.

5. 5.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4, en el que cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido es un enlace internucleósido de fosforotioato y / o en el que cada citosina del oligonucleótido antisentido es una 5 – metilcitosina.

6. 6.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4 o 5, en el que dicho oligonucleótido comprende al menos un resto de azúcar modificado que es un azúcar bicíclico o un azúcar que comprende 2´ -O – metoxietil.

7. 7.

   El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 4 – 6, en el que dicho oligonucleótido comprende un segmento hueco que comprende 2´ -desoxinucleótidos colocados entre los segmentos de alas 5´ y 3´, en el que los segmentos de alas comprenden nucleótidos que tienen restos de azúcar modificado.

8. 8.

   El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, en el que el segmento hueco consiste en diez 2´ desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados con 2´ -O – metoxietil.

9. 9.

   El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 8 que tiene 20 nucleótidos.

10. 10.

    El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 8, en el que dicho oligonucleótido antisentido comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

11. 11.

    El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 10, en el que el oligonucleótido antisentido es de 20 nucleótidos y comprende un oligonucleótido quimérico que tiene un segmento hueco colocado entre los segmentos laminares 5´ y 3´, en el que el segmento hueco consiste en diez 2´ desoxinucleótidos y cada segmento laminar consiste en cinco nucleótidos modificados con 2´ -O – metoxietil y en el que el oligonucleótido antisentido consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 118.

12. 12.

    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 11, en el que cada enlace internucleósido de dicho oligonucleótido es un enlace internucleósido de fosforotioato y / o en el que cada citosina del olinucleótido antisentido es una 5 – metilcitosina.

13. 13.

    Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o comprende una sal farmacéuticamente aceptable, éster, sal de dicho éster o profármaco del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

14. 14.

    El oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o una composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su utilización en el tratamiento contra la enfermedad de Huntington.

15. 15.

    El oligonucleótido antisentido o composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su utilización en el tratamiento contra la enfermedad de Huntington en seres humanos mediante la administración en el sistema nervioso central (SNC) de un individuo, por ejemplo a través de la administración de un oligonucleótido antisentido directamente en el líquido cefalorraquídeo (CSF).

16. 16.

    La utilización de un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la enfermedad de Huntington.