ES2425781T3 - Análogos de CAP de ARNm - Google Patents
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Abstract
Uno o más de los siguientes compuestos, o un estereoisómero de uno o más de los siguientes compuestos, omezclas de estereoisómeros de uno o más de los siguientes compuestos, o una sal o sales de cualquiera de ellos:**Fórmula** 1donde Y1, Y2, Y3 y Y4 se seleccionan del grupo que consiste en O, BH3 y Se; los diversos grupos Yi pueden seriguales o diferentes, donde i es 1, 2, 3 ó 4; y al menos un Yi es BH3 o Se; n es 0 ó 1; R se selecciona del grupo que consiste en:**Fórmula** R3 y R4 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH3 y OCH2CH3; y R3 y R4 pueden ser iguales odiferentes. W se selecciona del grupo que consiste en: **Fórmula** R1 y R2 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH3 u OCH2CH3; y R1 y R2 pueden ser iguales odiferentes; y X se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo, bencilo sustituido, metilennaftilo ymetilennaftilo sustituido.
Description
El desarrollo de esta invención fue subvencionado parcialmente por el gobierno de los Estados Unidos de América bajo el subsidio número R01GM20818 otorgado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de la Salud (National Institute of General Medical Sciences of the National lnstitutes of Health). El gobierno de los Estados Unidos de América posee determinados derechos sobre esta invención.
El desarrollo de esta invención fue subvencionado parcialmente por el gobierno de Polonia bajo el subsidio número PBZ-MNiSW-07/1/2007 otorgado por el Proyecto Nacional de Apoyo a las Ciencias 2008-2010.
Esta invención se refiere a los nuevos análogos de caperuza de dinucleótidos y sus usos, las moléculas de ARN que contienen estos análogos, el uso de estos análogos en la síntesis de ARN, el uso de estos análogos en la síntesis de péptidos y proteínas, el uso de estos análogos para inhibir la traducción y otros usos.
El ácido ribonucleico (ARN) es un polímero lineal de cadena sencilla de nucleótidos. Cada unidad de nucleótido contiene una base nitrogenada, un azúcar de ribosa y un grupo fosfato. Existen diferentes tipos de moléculas de ARN. Las moléculas de ARN mensajero (ARNm) son aquellas cuya secuencia de nucleótidos determina la composición aminoácida de las proteínas. En eucariotes, los extremos 5' de la mayoría de los ARNm están bloqueados, o "encaperuzados" con un nucleótido modificado de guanina. La caperuza contiene un enlace 5'-5' de trifosfato entre dos nucleósidos y un grupo 7-metilo en un anillo de guanina distal a la cadena polimérica de ARN. Otras formas del ARN también llevan caperuza, por ejemplo, los pequeños ARNnucleares (ARNpn). El uso de caperuzas en el ARN regula las actividades moleculares intracelulares, incluidas la estabilidad del ARN y la eficiencia de la traducción.
La capacidad de sintetizar in vitro moléculas de ARN con caperuza es útil porque permite la preparación de moléculas de ARN que funcionarán correctamente en una variedad de aplicaciones biológicas. Estas aplicaciones incluyen tanto aplicaciones en la investigación como en la producción comercial de polipéptidos, por ejemplo la producción de polipéptidos en un sistema acelular de traducción que contiene un aminoácido "no natural" en un lugar específico, o la producción de polipéptidos en células cultivadas que requieren la modificación posttraduccional de la actividad o estabilidad. Debido a que las moléculas con caperuza de ARN son más estables y se enlazan más fácilmente a la maquinaria celular traduccional, la traducción de los ARN con caperuza continúa durante un período considerablemente más largo que en el caso de los ARN sin caperuza, lo que tiene como resultado una producción mayor de proteínas.
El método usado con mayor frecuencia para la preparación in vitro de ARN con caperuza es la transcripción de una plantilla de ADN con una polimerasa de ARN bacteriano o bacteriófago en presencia de los cuatro trifosfatos de ribonucleósido y un dinucleótido bloqueado como m7G(5')ppp(5')G (también conocido como m7GpppG). La polimerasa de ARN inicia la transcripción con un ataque nucleofílico por el 3'-OH del grupo Guo de m7GpppG sobre el a-fosfato del siguiente trifosfato de nucleósido en la plantilla, produciendo el producto intermedio m7GpppGpN. La formación del producto competidor iniciado por GTP pppGpN se suprime al definir el cociente molar entre m7GpppG y GTP como de 5 a 10 en la mezcla de reacción de transcripción. Los ARNm con caperuza en 5' producidos con m7GpppG pueden adoptar una de las siguientes dos formas: una que contiene el análogo con caperuza incorporado en la orientación correcta hacia el frente [m7G(5')ppp(5')GpNp...] y otra que contiene el análogo en la posición inversa [G(5')ppp(5')m7GpNp...]. La maquinaria traduccional de la célula no reconoce a éste último como un ARNm con caperuza y disminuye la eficiencia de traducción de las preparaciones sintéticas de ARNm. Este problema puede evitarse mediante el uso de análogos de caperuza que poseen modificaciones O-metilo o desoxi en la posición C2' ó C3' de m7GuO. Véase J. Stepinski et al., "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG y 7-methyl(3'-deoxy)GpppG", RNA, vol. 7, págs. 1.486
1.495 (2001); y J. Jemielity et al., "Novel "anti-reverse" cap analogues with superior translational properties", RNA, vol. 9, págs. 1108-1122 (2003). Estos análogos de caperuza se incorporan a los transcriptos de ARN exclusivamente en la orientación hacia el frente y por lo tanto se conocen como "análogos de caperuza anti-inversos" (ARCA, por sus siglas en inglés). En un lisado de reticulocito de conejo (LRC), los ARNm con caperuza de ARCA poseen eficiencias traduccionales que son dos veces más altas que las de los transcriptos con caperuza de m7GpppG (Stepinski et al., 2001). En células mamíferas cultivadas, los ARNm con caperuza de ARCA se traducen entre 2 y 2,5 veces más eficientemente que los que llevan caperuza de m7GpppG. Véase E. Grudzien et al., "Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs", J. Biol. Chem., vol. 281, págs. 1.857-1.867 (2006).
La cantidad de proteína producida a partir de ARNm sintéticos introducidos a células mamíferas cultivadas está limitada por la degradación natural del ARNm. Una ruta in viva para la degradación del ARNm se inicia con la
eliminación del bloqueo del ARNm. Esta eliminación está catalizada por una pirofosfatasa heterodimérica, que contiene una subunidad reguladora (Dcp1) y una subunidad catalítica (Dcp2). La subunidad catalítica se escinde entre los grupos fosfato a y � del puente trifosfato.
E. Grudzien et al. (2006) describieron un análogo de caperuza, m27,3'-OGppCH2pG, en donde el átomo de oxígeno fue reemplazado con un grupo metileno entre los grupos a y 13 de fosfato. Los ARNm con caperuza de este análogo fueron resistentes a la hidrólisis con Dcp2 recombinante humano in vitro. Cuando se introducen a células cultivadas, los ARNm con caperuza del análogo m27,3'-OGppCH2pG fueron más estables que los que llevan caperuza de m27,3'-OGpppG. Sin embargo, el ARNm con caperuza de m27,3'-OGppCH2pG posee una eficiencia traduccional general más baja, posiblemente debido a que m27,3'-OGppCH2pG tiene una afinidad de enlace más baja por elF4E que la del m27,3'-OGpppG. El factor de iniciación de la traducción eucariótica elF4E participa en llevar el ARNm con caperuza al ribosoma para la traducción.
J. Kowalska et al., "Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to elF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS", RNA, vol. 14, págs. 1.119-1.131 (2008), describió las síntesis de tres ARCA en donde uno de los tres átomos de O no enlazantes en la cadena de trifosfato se reemplazó con un átomo de S. Cada uno de estos análogos de fosforotioato (también conocidos como S-ARCA) se sintetizó como una mezcla de diaestereoisómeros que pueden separarse cromatográficamente para producir diaestereoisómeros puros. La afinidad de enlace de los análogos de caperuza de fosforotioato al elF4E fue igual o, en algunos casos, superior a la del m7GpppG.
E. Grudzien et al., "Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells", RNA, vol. 13, págs. 1.745-1.755 (2007), demostraron que los ARNm bloqueados con S-ARCA modificados en el �-fosfato fueron resistentes a la hidrólisis con Dcp2 recombinante humano in vitro. Asimismo, el ARNm bloqueado con un diaesteroisómero � S-ARCA tiene una vida media más larga cuando se introduce a células mamíferas que la del ARNm correspondiente bloqueado con ARCA, y además presenta una mayor eficiencia traduccional en las células. Probablemente, la primera de estas propiedades se debe a la resistencia del � S-ARCA a la hidrólisis por Dcp2, y probablemente la segunda propiedad se debe la mayor afinidad de �-S-ARCA por elF4E.
Otro uso de los análogos sintéticos de caperuza de ARNm es inhibir la traducción dependiente de la caperuza mediante la competencia con el ARNm con caperuza por enlace a elF4E. Véase A. Cai et al., "Quantitative assessment of mRNA cap analogues as inhibitors of in vitro translation", Biochemistry, vol. 38, págs. 8.538-8.547 (1999); y E. Grudzien et al., "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency", RNA, vol. 10, págs. 1.479-1.487 (2004).
La capacidad de los análogos de caperuza de inhibir la traducción posee una importancia terapéutica potencial. Muchos tipos de células de cáncer sobreexpresan elF4E, lo que puede ocasionar una expresión mayor de las proteínas que promueven la oncogénesis y metástasis. Véase A De Benedetti et al., "elF-4E expression and its role in malignancies and matastases", Oncogene, vol. 23, págs. 3.189-3.199 (2004). la reducción de la expresión de elF4E con ARNsi, oligonucleótidos anti-sentido, o un represor especifico de elF4E podría inhibir el crecimiento de un tumor y la oncogénesis. Véase J.R. Graff et al., "Therapeutic suppression of translation initiation factor elF4E expression reduces tumor growth without toxicity", J. Clin. lnvestigation, vol. 117, págs. 2.638-2.648 (2007); y T. Herbert, "Rapid induction of apoptosis by peptides that bind initiation factor elF4E", Curr. Biol., vol. 10, págs. 793-796 (2000). Además, la actividad traduccional de elF4E puede suprimirse saturando las células con análogos de caperuza competidores traduccionalmente deficientes.
Algunos análogos de caperuza sintéticos son inhibidores específicos de la actividad de elF4E y por lo tanto, son potencialmente útiles como agentes para el tratamiento de oncogénesis y metástasis, inmunosupresión en el trasplante de órganos y otras condiciones médicas. Sin embargo, estos usos potenciales de los análogos de caperuza nunca han sido previamente demostrados in vivo, en parte debido a la inestabilidad de los análogos de caperuza en condiciones intracelulares.
J. Kowalska et al. (2008) demostraron que los y-S-ARCA son fuertes inhibidores de la traducción en un sistema acelular, posiblemente debido a su alta afinidad de enlace con elF4E. los análogos y-modificados son resistentes a la hidrólisis por la enzima humana DcpS, que es una pirofosfatasa secuestrante responsable de la degradación de este tipo de compuesto.
Otras modificaciones pueden ayudar a proteger el ARNm con caperuza contra la degradación enzimática. Un ejemplo es una modificación con boranofosfato, en donde uno de los átomos no enlazantes de O se reemplaza con un grupo borano (BH3) (ocasionalmente llamados análogos de BH3). Otro ejemplo es una modificación con fosforoselenoato, en donde uno de los átomos no enlazantes de O se reemplaza con un átomo de selenio (ocasionalmente llamados análogos de Se). Los grupos fosforotioato, boranofosfato y fosforoselenoato reemplazan los átomos de oxígeno y comparten algunas propiedades químicas y bioquímicas. Sin embargo, también existen diferencias entre estos grupos. Por ejemplo, las longitudes de la cadena P-X difieren (donde X denota S, Se o BH3), los radios de Van der Waals de los grupos X difieren, y la afinidad de dichos grupos X por varios cationes divalentes y otros cationes metálicos difiere. Estas propiedades químicas diversas alteran las actividades biológicas de los análogos de caperuza con estos grupos, incluidas sus interacciones con las proteínas de enlace de caperuza y su susceptibilidad a la degradación enzimática.
Los mononucleótidos de boranofosfato y los dinucleótidos de polifosfato boranofosfato fueron revisados por P. Li et al., "Nucleoside and oligonucleoside boranophosphates: chemistry and properties", Chem. Rev., vol. 107, págs. 4.746-4.796 (2007).
Los análogos del dinucleósido de polifosfato boranofosfato se describen en la solicitud de patente publicada US2006/0287271, al igual que su uso contra enfermedades moduladas por los receptores P2Y, por ejemplo la diabetes tipo 2 y el cáncer.
Los análogos de nucleótidos de boranofosfato presentan similitudes con los análogos de fosforotioato debido a los ángulos de enlace, valores de pK8, y P-diaestereoisomeria similares. Sin embargo, en algunos casos son hasta 10 veces más resistentes a la hidrólisis enzimática que sus fosforotioatos homólogos. También son más lipofílicos que los fosforotioatos, lo que podría ayudarles a penetrar las membranas celulares y alcanzar la maquinaria traduccional intracelular. Los análogos de boranofosfato también pueden usarse en la terapia de captura neutrónica de boro (TCNB). Véase B.R. Shaw et al., "Reading, Writing and Modulating Genetic Information with Boranophosphate Mimics of Nucleotides, DNA and RNA", Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 1201, págs. 23-29 (2003); y J. Summers et al., "Boranophosphates as Mimics of Natural Phosphodiesters in DNA", Current Medicinal Chemistry, vol. 8, págs. 1.147
1.155 (2001).
K. Misiura et al., "Synthesis of nucleoside a-thiotriphosphates via an oxathiaphospholane approach", Org. Lett., vol. 7, págs. 2.217-2.220 (2005); P. Li et al., "Synthesis of a-P-modified nucleoside diphosphates with ethylendiamine", J. Am. Chem. Soc., vol. 127, págs. 16.782-16.783 (2005); N. Carrasco et al., "Enzimatic synthesis of phosphoroselenoate DNA using thymidine 5'-(a-P-seleno)triphosphate and DNA polymerase for x-ray crystallography via MAD", J. Am. Chem. Soc., vol. 126, págs. 448-449 (2004) y N. Carrasco et al., "Efficient enzima tic synthesis of phosphoroselenoate RNA by using adenosine 5'-(a-P-seleno)triphosphate", Angew. Chem. Int. Ed., vol. 45, págs. 9497 (2006), describieron los análogos fosforoselenoato de di- y tri-fosfatos de nucleósidos modificados en la posición
a. Sin embargo, hasta donde los inventores saben, no existen informes previos de análogos de polifosfato de nucleósido modificados en cualquier posición aparte de la posición a, ni de polifosfatos de dinucleósidos modificados en cualquier posición.
Los análogos de nucleótidos de fosforoselenoato son parecidos a los fosforotioatos y boranofosfatos debido a sus ángulos de enlace, valores de pKa, p-diaestereoisomeria y resistencia a la degradación enzimática similares. Los fosforoselenoatos pueden ser muy útiles en la cristalografía de los ácidos nucleicos ya que puede usarse Se en la técnica de dispersión anómala múltiple (MAD). Véase J. Wilds et al., "Selenium-assisted nucleic acid crystallography: use of phosphoroselenoatos for MAD phasing of a DNA structure", J. Am. Chem. Soc., vol. 124, págs. 14.910-14.916 (2002); N. Carrasco et al., (2004); N. Carrasco et al., (2006); y P. S. Pallan et al., "Selenium modification of nucleic acids: preparation of phosphoroselenoate derivatives for crystallographic phasing of nucleic a cid structures", Nat. Protoc., vol. 2, págs. 640-646 (2007).
Véase también nuestro trabajo sobre análogos de caperuza de ARNm anti-inverso descritos en la Patente estadounidense nº 7.074.596, así como la solicitud de patente internacional publicada WO 2008/157688.
Hemos descubierto una nueva clase de análogos de caperuza de dinucleótidos. Los análogos nuevos de caperuza de dinucleótidos se modificaron en diversas posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato. Los análogos nuevos poseen una gran utilidad como reactivos en la preparación de ARNm con caperuza. Han aumentado la estabilidad tanto in vitro como in vivo. Pueden usarse como inhibidores de la traducción dependiente de la caperuza. Opcionalmente, el grupo boranofosfato o fosforoselenoato tiene un grupo 2'-O ó 3'O-alquilo, preferentemente un grupo metilo, produciéndose análogos llamados BH3-ARCAs o Se-ARCAs. Los ARCAs pueden modificarse con grupos a-, �- o y-boranofosfato o fosforoselenoato. La selección del tipo y ubicación de la modificación modulan la actividad de proteínas que reconocen la caperuza durante la síntesis, el procesamiento, la exportación nucleo-citoplásmica y la degradación del ARNm.
En la Tabla 1 se enumeran varios análogos de BH3 y de Se que han sido o serán sintetizados y caracterizados mediante métodos químicos, biofísicos, bioquímicos y biológico moleculares. Los compuestos que son especialmente favorables en las caperuzas del ARNm incluyen �-BH3-ARCAs y �-Se-ARCAs. Los compuestos que son especialmente favorables como inhibidores de la traducción incluyen los análogos �- y y-BH3 y los análogos y-Se.
Tabla 1
Análogos de BH3 y Se
En los siguientes párrafos se describen los diversos aspectos y realizaciones de la invención.
Uno o más de los siguientes compuestos, o un estereoisómero de uno o más de los siguientes compuestos, o 15 mezclas de estereoisómeros de uno o más de los siguientes compuestos, o una sal o sales de cualquiera de ellos:
donde Y1, Y2, Y3 e Y4 se seleccionan del grupo formado por O, BH3 y Se; los diversos grupos Y1 pueden ser iguales
o diferentes, mientras que i es 1, 2, 3 ó 4; y al menos un Y1 es BH3 o Se.
n es 0 ó 1;
R se selecciona del grupo formado por:
R3 y R4 se seleccionan del grupo formado por H, OH, OCH3 y OCH2CH3; y R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes; 20 W se selecciona del grupo formado por:
R1 y R2 se seleccionan del grupo formado por H, OH, OCH3, u OCH2CH3; y R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes; y
X se selecciona del grupo formado por metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo, bencilo sustituido, metilen-naftilo, y 30 metilen-naftilo substituido.
Un compuesto como el descrito, donde Y1, Y2, Y3 e Y4 se seleccionan del grupo formado por O, Se y BH3; los diversos grupos Y1 pueden ser iguales o diferentes, mientras que i es 1, 2, 3, ó 4; y al menos un Y1 es BH3 o Se.
35 Un compuesto como el descrito, donde R se selecciona del grupo formado por Un compuesto como el descrito, donde W es
R2 es OH; R1 es H u OCH3; X es metilo; yn = 0; y sólo uno de Y1, Y2 e Y3 es BH3 o Se.
10 Un compuesto como el descrito, donde, si n = 0, entonces Y2 o Y3 es BH3 o Se, y donde, si n = 1, entonces Y2, Y3 o Y4 es BH3 o Se. Una molécula de ARN cuyo extremo 5' incorpora un compuesto como el descrito.
15 Una molécula de ARN cuyo extremo 5' incorpora un compuesto como el descrito. Una molécula de ARN como se describe, donde R se selecciona del grupo formado por:
20 Un método de síntesis, in vitro o in vivo, de una molécula de ARN como se describe, y dicho método comprende hacer reaccionar ATP, CTP, UTP y GTP, una composición como la antes mencionada, y una plantilla de polinucleótido en presencia de ARN poli me rasa, bajo condiciones adecuadas para la transcripción por la ARN polimerasa de la plantilla de polinucleótido para producir una copia del ARN; donde algunas de las copias de ARN
25 incorporarán el compuesto para formar una molécula de ARN como se describe.
Un método de síntesis de una proteína o péptido in vitro, donde dicho método comprende la traducción de una molécula de ARN como se describe en un sistema acelular de síntesis de proteína, donde la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierta, bajo condiciones adecuadas para la traducción del marco de lectura abierta
30 de la molécula de ARN en la proteína o péptido codificado por el marco de lectura abierto.
Un método de síntesis de una proteína o péptido in vivo o en células cultivadas, donde dicho método comprende la traducción de una molécula de ARN como se describe en un sistema in vivo o en células cultivadas, donde la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierta, bajo condiciones adecuadas para la traducción del marco
35 de lectura abierta de la molécula de ARN en la proteína o péptido codificado por el marco de lectura abierto.
Un compuesto como el descrito para el uso en un método de inhibición total o parcial de la traducción del ARN en la proteína o péptido en un sistema que traduce el ARN en una proteína o péptido.
40 Un compuesto como el descrito para el uso en un método como el descrito, donde el sistema es un sistema nativo de traducción del ARN de un organismo vivo.
Una composición como la descrita, donde R1 es OCH3; R2 es OH; R3 es OH; R4 es OH; n es 0; Y1 es O; Y2 es Se; Y3 es O; W es
y R es
10 La Figura 1 muestra una síntesis de análogos de caperuza con un grupo boranofosfato en la posición a del puente del 5',5'-trifosfato.
La Figura 2 muestra una síntesis de análogos de caperuza con un grupo boranofosfato en la posición � del puente del 5',5'-trifosfato.
La Figura 3 muestra una síntesis de m7GppBH3pm7G (método II).
La Figura 4 muestra una síntesis de m7,2'-OGppBH3pG.
20 La Figura 5 muestra una síntesis de m7,2'-OGppSepG. La Figura 6 muestra una síntesis de m7GpSeppG. La Figura 7 muestra las eficiencias traduccionales relativas in vitro del ARNm de luciferasa de luciérnaga bloqueado
25 con ApppG (análogo de caperuza no funcional), m7GpppG, m7,3-OGpppG, los análogos de caperuza de boranofosfato
m7GppBH3pG (mezcla diaestereomérica 1:1) y m7GppBH3pm7G.
La Figura 8 muestra la inhibición de la traducción in vitro del ARNm de luciferasa por los análogos de caperuza de
boranofosfato.
La Figura 9 muestra la inhibición de la traducción in vitro del ARNm de luciferasa por los análogos de caperuza de boranofosfato incubados en lisado de reticulocito de conejo durante 60 m in antes de iniciarse la traducción.
La Figura 10 muestra las eficiencias traduccionales in vitro del ARNm de luciferasa de luciérnaga bloqueado con 35 ApppG, m7GpppG, m27,3-OGpppG, y los análogos de caperuza de fosforoselenoato m27,2'-OGppSepG (D1) y (D2).
La Figura 11 muestra la inhibición de la traducción in vitro del ARNm de luciferasa por los análogos de caperuza de fosforoselenoato.
40 La Figura 12 muestra la inhibición de la traducción in vitro del ARNm de luciferasa por los análogos de caperuza de fosforoselenoato incubados en lisado de reticulocito de conejo durante 60 min antes de iniciarse la traducción.
La Figura 13 muestra las eficiencias traduccionales relativas in vitro del ARNm de luciferasa de luciérnaga que posee una cola A31 poli-A, con caperuza en 5' con varios análogos.
La Figura 14 muestra mediciones de la estabilidad de los ARNm de luciferasa bloqueados con varios análogos y con una cola poli(A) de 60 bases en células cultivadas HeLa después de la nucleoporación.
La Figura 15 muestra la eficiencia traduccional de los ARNm de luciferasa bloqueados con diversos análogos y con una cola poli(A) de 60-nt en células cultivadas HeLa después de la nucleoporación.
Síntesis y aislamiento de los análogos de caperuza
La síntesis química de los análogos de caperuza de boranofosfato y fosforoselenoato fue una modificación de los esquemas sintéticos indicados para otros análogos. Véase M. Kadkura et al., "Efficient synthesis of y-methyl-cappedguanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCI2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions", Tetrahedron Lett., vol. 38. págs. 8.359-8.362 (1997); J. Stepinski et al. (2001); M. Kalek et al., "Enzymatically stable 5' mRNA cap analogs", Biorg. Med. Chem., vol. 14, págs. 3.223-3.230 (2006); y J. Kowalska et al. (2008).
Se convierte un mononucleótido a un derivado reactivo de imidazolida, que después se acopla a otro mononucleótido en DMF en presencia de un exceso de ZnCI2. El ZnCI2 potencia significativamente la solubilidad de los reactivos en disolventes orgánicos, inhibe la hidrólisis de los derivados de imidazolida y acelera la velocidad de reacción. También podrán emplearse otros cloruros metálicos tales como MnCI2, CdCI2 o MgCI2 para mediar la formación del enlace pirofosfato, pero generalmente son menos eficientes que el ZnCI2. Véase M. Kadokura et al., "Efficient synthesis of y-methyl-capped-guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCI2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions", Tetrahedron Lett, vol. 38. págs. 8.359-8.362 (1997).
Un esquema sintético similar en términos generales se empleó para sintetizar análogos de caperuza que contenían enlaces fosfato-boranofosfato y fosfato-fosforoselenoato. Sin embargo, para los análogos de boranofosfato, los mejores resultados se obtuvieron usando MgCI2 en lugar de ZnCI2 como el mediador de acoplamiento. En presencia de ZnCI2 también ocurrieron reacciones de acoplamiento, pero estuvieron acompañadas de reacciones secundarias significativas relacionadas con la ruptura del enlace P-BH3 bajo las condiciones ácidas producidas por el ZnCI2.
En la Figura 1 se muestra la síntesis de análogos modificados en la posición a.. Inicialmente desarrollamos un método de síntesis del producto intermedio guanosina 5'-boranofosfato. Guanosina 5'-(H-fosfonato) fue sililado con N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA). El producto intermedio resultante, bis(trimetilsilil)fosfito, fue boronado por tratamiento con un complejo BH3·SMe2, sin aislarse. La desililación y purificación posteriores por cromatografía de intercambio iónico produjeron el compuesto deseado, guanosina-5' -boranofosfato, con un rendimiento de ~30%. Para obtener el análogo de caperuza m7GpppBH3G, o su ARCA equivalente, m7,2'-OGpppBH3G, se acopló guanosina 5'-boranofosfato con el derivado de imidazolida de m7GDP o de m7,2'-OGDP, respectivamente, en una mezcla de DMF/agua al 9:1 en presencia de un exceso de MgCI2. En los dos casos, el resultado fue una mezcla de dos Pdiaestereoisómeros que después se separaron por HPlC en fase inversa (FI). los diaestereoisómeros se llamaron D1 y D2, de acuerdo con su orden de elución en la columna de HPLC Fl.
En la Figura 2 se muestra la síntesis de análogos modificados en la posición �. la sal boranofosfato trietilamonio se obtuvo mediante una modificación del procedimiento de V. Nahum et al., "Boranophosphate salts as an excellent mimic of phosphate salts: preparation, characterization, and properties", Eur. J. Inorg. Chem., vol. 20, págs. 4.124
4.131 (2004). En el procedimiento original, el tris(trimetilsilil)fosfito se boronó con el complejo BH3·SMe2. La destilación posterior en metanol en presencia de una base apropiada (por ejemplo, amoniaco, tributilamina, etc.), seguida de la evaporación a sequedad, produjo el boranofosfato como la sal correspondiente (amonio, tributilamonio, etc.). Sin embargo, el producto estaba contaminado con la sal del ácido fosfónico (hasta un 20%). Probablemente esta contaminación se debió a la hidrólisis parcial de tris(trimetilsilil)fosfito a bis(trimetilsilil)fosfito bajo condiciones de reacción que no eran perfectamente anhidras (el compuesto bis no paso por una boronación posterior). Solucionamos este problema añadiendo un exceso del reactivo de sililación (BSA) a la mezcla de reacción, lo que inhibió la formación de bis(trimetilsilil)fosfito. La sal boranofosfato trietilamonio obtenida de esta manera se acopló con un exceso del derivado guanosina monofosfato imidazolida para producir un diguanosina 5',5"-(2-boranotrifosfato) simétrico (GppBH3pG, Figura 2).
Posteriormente, este compuesto se trató con yoduro de metilo en DMSO para introducir un grupo metilo en la posición N7 de la guanosina. La reacción produjo una mezcla de análogos de caperuza monometilados y dimetilados (m7GppBH3pG y m 7GppBH3pm7G). La relación entre estos productos puede controlarse ajustando las condiciones de reacción. En presencia de un exceso de ~4X del yoduro de metilo, se formó m7GppBH3pG como el producto principal (rendimiento de ~70%). Con un exceso de ~8X-10X de yoduro de metilo, el producto predominante fue m7GppBH3pm7G (~50%). Sin embargo, una ruta preferida para obtener este último producto fue el acoplamiento de boranofosfato con un derivado de 7-metilguanosina imidazolida, lo que nos permitió aislar el producto con un rendimiento del 34%, pero en una síntesis de un solo paso. Véase la Figura 3.
72'-O
Inicialmente, al tratar de obtener el producto intermedio 7,2'-O-dimetilguanosina 5'-(2-boranodifosfato) (m2 GDP�BH3), útil en la síntesis de �-BH3-ARCAs (m27,2'-OGppBH3pG), se tuvo poco éxito. Acoplamos m27,2'-OGMP-Im y un exceso de sal de boronafosfato trietilamonio en presencia de MgCI2. Aunque al hacerse un análisis por MS ESI(-) de los productos de acoplamiento se demostró que se había formado el producto deseado, no fue posible aislarlo en cantidades suficientes. El compuesto puede sufrir una hidrólisis relativamente rápida en soluciones acuosas, haciendo que la separación por cromatografía de intercambio iónico sea prácticamente imposible. Por esta razón, desarrollamos una síntesis alternativa de m27,2'-OGppBH3pG, mediante la reacción de m27,2'-OGMP-Im con boranofosfato en exceso en presencia de MgCI2 para producir m27,2'-OGDP�BH3, que después, sin aislarse, se acopló con GMP-Im en exceso. Véase la Figura 4.
En la Figura 5 se muestra la síntesis de m27,2'-OGppSepG. Se preparó el selenofosfato (PSeO3-3) mediante una modificación del método descrito en R. Glass et al., "Selenophosphate", Meth. Enzymol., vol. 252, págs. 309-315 (1995). Se trató trimetilsilil fosfito con selenio en piridina para producir trimetilsilil selenofosfato, que entonces se desililizó con metanol en presencia de trietilamina para producir la sal de seleno fosfatotrietilamonio. Este compuesto se acopló con el derivado imidazolida de 7,2'-O-dimetilguanosina 5'-monofosfato (m27,2'-OGMP-Im) para producir 7,2'O-dimetilguanosina 5'-O-(2-selenodifosfato) (m27,2'-OGDP�Se). Se empleó ZnCl2, anhidro para mediar la reacción de acoplamiento; el ZnCI2 aumentó dramáticamente la solubilidad de los reactivos en DMF, y también aceleró la velocidad de reacción. La reacción fue muy rápida; fundamentalmente después de 15 min, usando HPLC Fl, se
7,2'-OGDP�Se
observó una conversión del 100% de m27,2'-OGMP-Im a m27,2'-OGDP� Se. El m2 es inestable en soluciones acuosas ácidas (hidrolizándose a m27,2'-OGMP), y sólo moderadamente estable en soluciones neutras o básicas. Por esto, se tuvo cuidado en mantener el pH a 7 o más durante la purificación de m27,2'-OGDP�Se, lo que permite el aislamiento del producto con un rendimiento del 80% después de la cromatografía de intercambio iónico. Después, el m27,2'-OGDP�Se se acopló con el derivado imidazolida de GMP en presencia de un exceso de ZnCI2. En el HPLC Fl se observaron dos picos, que corresponden a dos diaestereoisómeros de m27,2'-OGppSepG, que se designaron D1 y D2 según su orden de elución. Sin embargo, el acoplamiento se realizó lentamente, y la desaparición completa del m27,2'-OGDP�Se tardó unos dos días. El tiempo de reacción extendido permitió una hidrólisis parcial de m27,2'-OGDP�Se a m27,2'-OGMP y sólo un rendimiento de reacción moderado (conversión del 40% por HPLC, aislamiento del 25%). La mezcla diaestereomérica de m27,2'-OGppSepG después de aislarse por cromatografía de intercambio iónico se resolvió con éxito en los diaestereoisómeros puros por HPLC Fl. Los productos se caracterizaron mediante espectrometría de masa, 1H RMN y 31P RMN para confirmar las estructuras y homogeneidad. Los isómeros D1 y D2 de m27,2'-OGppSepG son estables en solución acuosa, no se hidrolizan u oxidan apreciativamente, y pueden almacenarse como sólidos, protegidos de la humedad a -20ºC, durante al menos tres meses.
También se han producido y serán producidos otros análogos de BH3- y Se- mediante reacciones generalmente análogas a las indicadas en las Figuras 1-6.
Ejemplo 1
Procedimientos generales para el aislamiento y la caracterización de análogos de caperuza.
Los nucleótidos intermedios se separaron usando cromatografía de intercambio iónico usando una columna DEAE-Sephadex A-2S (forma HCO3) con un gradiente lineal de bicarbonato de trietilamonio (TEAB) en agua desionizada. Después de la evaporación bajo presión reducida con la adición de etanol, los productos intermedios se aislaron, como por ejemplo las sales de trietilamonio. Los productos finales (análogos de caperuza) se separaron adicionalmente mediante HPLC Fl semi-preparativa y, después de la liofilización repetida, se aislaron como sales de amonio. El HPLC analítico se llevó a cabo con un equipo Agilent Technologies 1200 Series, usando una columna Supelcosil LC-18-T RP (4,6 x 250 mm, velocidad de flujo 1,3 ml/min) con un gradiente lineal de 0%-25% de m etanol en tampón de acetato de amonio 0,05M (pH 5,9). Los compuestos de elución se detectaron usando un detector UVvis (a 260 nm), y un detector fluorescente (excitación a 280 nm y emisión a 337 nm). Se hizo la HPLC semi-preparativa usando el equipo Waters 600E Multisolvent Delivery System y una columna Waters Discovery RP Amide C16 en fase inversa (21,2 mm x 250 mm, velocidad de flujo 5,0 ml/min) con un gradiente lineal de metanol en un tampón de acetato de amonio 0,05M (pH 5,9) y detección de UV a 260 nm. Se registraron los espectros de 1H y31P RMN a 25ºC usando un espectrómetro Varían UNITY-plus a 399,94 M Hz y 161,90 M Hz, respectivamente. Se determinaron los desplazamientos químicos en el 1H RMN relativos a sodio 3-trimetilsilil-[2,2,3,3-D4]-propionato (TSP) en D2O como patrón interno. Se determinaron los desplazamientos químicos en el 31P RMN relativos al ácido fosfórico 20% en D2O como patrón externo. Se determinaron los desplazamientos químicos 31P RMN con relación a ácido fosforoso al 20% en D2O como el patrón externo. Los espectros de masa en modo de ión negativo por electrospray [(ESI MS(-)] se obtuvieron con un espectrómetro Micromass QToF 1MS. Los disolventes y otros reactivos se compraron en Sigma-Aldrich, y se usaron sin tratamiento adicional alguno, a menos que se indique lo contrario. El acetonitrilo y la acetona se destilaron sobre P2O5 y se almacenaron sobre mallas moleculares 4 Å antes de usarse. GMP y GDP se convirtieron en sales de trietilamonio con una resina de intercambio iónico Dowex 50 WX8. Se prepararon m27,2'-OGMP y m27,2'-OGDP en la forma especificada anteriormente por J. Jemielity et al. (2003).
Ejemplo 2
Procedimiento general para la síntesis de derivados de nucleótido imidazolida.
GMP-Im, m27,2'-OGMP-Im, GDP-Im y m27,2'-OGDP-Im se prepararon en la forma descrita por T. Mukaiyama et al., "Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylating reagents", M. Bull. Chem. Soc. Jpn., vol. 44, pág. 2.284 (1971). El nucleótido (1 equiv., sal TEA), imidazol (8 equiv.) y 2,2'-ditiodipiridina (3 equiv.) se mezclaron en DMF (~2,5 ml/100 mg de nucleótido). Se añadieron trietilamina (2 equiv.) y trifenilfosfina (3 equiv.), y la mezcla se agitó durante 6-8 h. Se precipitó el producto de la mezcla de reacción con una solución de NaClO4 anhidro (1 equiv. por carga negativa) en acetona anhidra (~8 ml por ml de DMF). Después de enfriar a 4ºC, se filtró el precipitado, se lavó repetidamente con acetona anhidra fría, y se secó al vacío bajo P4O10. Los rendimientos fueron de 80%-100%.
Ejemplo 3
Guanosina 5'-(H-fosfonato).
Esta preparación fue la descrita por M. Yoshikawa et al., "Studies of phosphorylation. IV. The phosphorylation of nucleosides with phosphorus trihalide". Bull. Chem. Soc. Jpn., vol. 43, págs. 456-461 (1970). 2',3'-O,O-isopropilideno guanosina (1,3 g, 4,0 mmol) se suspendió en 19,5 ml de trimetilfosfato y se enfrió a 0ºC sobre hielo. Se añadió PCI3 (1,06 ml, 12,1 mmol), y la mezcla se agitó a 0ºC durante 1 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (80 ml), se ajustó el pH ~1,5 con NaHCO3 sólido y se calentó a 7D'C durante 1 h. Se dejó que la temperatura de la solución llegase a temperatura ambiente, se ajustó a pH ~6 con NaHCO3, se diluyó con 80 ml de agua, y se hizo la cromatografía usando un equipo DEAE Sephadex con un gradiente de 0-0,9M de TEAB. Se recolectaron las fracciones que eluyen a 0,6-0,65M de TEAB, y que contenían ~3,0 mmol de producto, se evaporaron y secaron en un desecador al vacío sobre P2O5. Esto produjo 1,34 g de la sal guanosina 5'-(H-fosfonato)trietilamonio (rendimiento del 75%). ESI MS (-) m/z: 346,08 (calc. para C10H13N5O7P: 346,06). 1H RMN 5 (ppm): 8,08 (1H, s, H8); 6,73 (1H, d, J=640 Hz, H-P); 5,93 (1H, d, J=5,4 Hz, H1'); 4,77 (1H, t, J=~5,4 Hz); 4,48 (1H, t, J=3,2 Hz); 4,32 (1H, m, H4'); 4,11 (2H, m, H5' y H5"). 31P RMN 5 (ppm): 7,07 (1P, dt, J=640 Hz, J=6,0 Hz).
Ejemplo 4
Guanosina 5'-O-boranofosfato, sal de trietilamonio.
Guanosina 5'-(H-fosfonato) (1,03 g, 2,3 mmol) se puso en un matraz de fondo redondo y se suspendió en 30 ml de acetonitrilo anhidro. Se selló el matraz con un septo de goma y se purgó con argón durante 30 min. Se inyectó N,Obistrimetilsililacetamida (11,3 ml, 46 mmol) con una jeringa, y la mezcla se agitó vigorosamente hasta obtenerse una solución transparente, y entonces se agitó durante 30 min más. La solución se enfrió en un baño de hielo, y se añadió una solución de complejo BH3·SMe2 2 M en THF (5, 7 ml, 11,5 mmol). Después de 5 min, se sacó el matraz del baño de hielo, y se continúo la agitación durante 30 min más. Se evaporó la solución a presión reducida hasta obtener un residuo oleaginoso, que se puso nuevamente en un baño de hielo, se trató con 60 ml de metanol y 3 ml de amoniaco 2M en etanol, y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La solución se evaporó a sequedad bajo presión reducida, se disolvió en 100 ml de agua y se extrajo una vez con 20 ml de éter dietílico. Se eliminó el éter de la capa acuosa bajo presión reducida. Se separaron los productos usando un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-0,9 M de TEAB. Las fracciones que contenían 13,200 unidades de densidad óptica de producto se evaporaron a sequedad, se disolvieron en agua, y se liofilizaron para obtener 410 mg de la sal guanosina 5'O-boranofosfato trietilamonio (32%): ESI MS (-) m/z: 360,13 (calc. para C10H16N5O7P11B: 360,09). 1H RMN 5 (ppm): 8,17 (1H, s, H8); 5,82 (1H, d, J=6,0 Hz, H1); 4,74 (1H, t, H2'); 4,47 (1H, t, H3'); 4,32 (1H, m, H4'); 4,03 (2H, m, H5' y H5"). 31P RMN 5 (ppm): 79,05 (1P, ~qq, J=158 Hz, 1=22,5 Hz).
Ejemplo 5
Síntesis de m7GpppBH3G.
A una mezcla de GMPBH3 (50 mg, 0,089 mmol, sal TEA) y m7GDP-Im (100 mg, 0,18 mmol, sal de sodio) en 2,5 ml de DMF/H2O (9:1) se añadió MgCI3 anhidro (110 mg, 1,16 mmol) poco a poco, y la mezcla se agitó vigorosamente hasta la disolución de todos los reactivos. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, y transcurrido ese tiempo, se detuvo la reacción añadiendo EDTA (430 mg, 1,16 mmol) en 25 ml de agua con el pH ajustado a ~6 mediante la adición de NaHCO3 sólido. Los productos se separaron en un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,2M de TEAB. Se obtuvo una mezcla diaestereoisómera de m7GpppBH3G (685 unidades de densidad óptica). Los diaestereoisómeros se resolvieron mediante HPLC semi-preparativo y se liofilizaron tres veces. El rendimiento después de la separación por HPLC fue 13,4 mg de m7GpppBH3G (D1) y 7,3 mg de m7GpppBH3G (D2) (18% y 9,8%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 799,22 (calc. para C21H31N10O17P3B: 799,12). D1: 1H RMN 5 (ppm): 8,93 (1H, s, H8, m7G); 7,99 (1H, s, H8 G); 5,79 (1H, d, J=3,2 Hz, H1', m7G); 5,73 (1H, d, J=6,0 Hz, H1' G); 4,59 (1H, ~t, H2' G); 4,48 (1H, dd, J=4,4 Hz, J=3,2 Hz, H2' m7G); 4,40 (1H, m, H3, G); 4,37 (1H, m, H3' m7G); 4,27 (3H, m superpuesto, H4', H5', H5"); 4,13 (3H, m superpuesto, H4', H5', H5"); 3,95 (3H, s, CH3); 0,34 (3H, m ancho, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 84,07 (1P, m, Pa (PBH3)); -11,29 (1P, d, J=19,4 Hz, Py); -22,95 (1P, dd, J=19,4 Hz, J=30,0 Hz, P ). D2: 1H RMN 5 (ppm): 8,87 (1H, s, H8, m7G); 7,95 (1H, s, H8 G); 5,79 (1H, d, J=2 Hz, H1', m7G); 5,68 (1H, d, J=5,4 Hz, H1' G); 4,62 (1H, ~t, H2' G); 4,50 (1H, ~t, H2' m7G); 4,41 (1H, m, H3', G); 4,37 (1H, m, H3' m 7G); 4,25 (3H, m superpuesto, H4', H5', H5"); 4,15 (3H, m superpuesto, H4', H5', H5"); 3,93 (3H, s, CH,); 0,34 (3H, m ancho, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 84,0 (1P, m, Pa (PBH3)); -11,38 (1P, s, Py); -22,88 (1P, s, P ).
Ejemplo 6
7,2'-OGpppBH3G.
m2
A una mezcla de GMPBH3 (30 mg, 0,053 mmol, sal TEA) y m27,2'-OGDP-Im {60 mg, 0,11 mmol, sal de sodio) en 1,5 ml de DMF/H2O (9:1) se añadió MgCI2 anhidro (80 mg, 0,85 mmol) poco a poco, y la mezcla se agitó vigorosamente hasta la disolución de todos los reactivos. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 días, y transcurrido ese tiempo, se detuvo la reacción añadiendo EDTA (320 mg, 0,85 mmol) en 25 ml de agua con el pH ajustado a ~6 mediante la adición de NaHCO3 sólido. Los productos se separaron en un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,2M de TEAB. Se obtuvo una mezcla diaestereoisómera de m27,2'-OGpppBH3G (520 unidades de densidad óptica). Los diaestereoisómeros se resolvieron mediante H PLC semi-preparativo y se liofilizaron tres veces. El rendimiento después de la separación por HPLC fue 6,1 mg de m27,2'-OGpppBH3G (D1) y 3,7 mg de m27,2'-OGpppBH3G (D2) (13,4% y 8,0%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 813,1S (calc. para C22H33N10O17P311B: 813,13). D1: 1H RMN 5 (ppm): 9,03 (1H, s, H8, m7G); 8,09 (1H, s, H8G); 5,95 (1H, d, J=2,7 Hz, H1', m7G); 5,84 (1H, d, J=6,0 Hz, H1'G); 4,70 (1H, dd, J=6,0 Hz, J=5,1 Hz, H2' G); 4,56 (1H, ~t, H3' m7G); 4,50 (1H, dd, J=3,5 Hz, 5,1 Hz, H3', G); 4,41 (1H, m, H5' G); 4,34 (2H, m superpuesto, H4', m7G, H4' G); 4,27 (2H, m superpuesto, H2', m7G, H5" G); 4,24 (2H, m, H5', H5", m7G); 4,08 (3H, s, N-CH3), 3,60 (3H, s, O-CH3); 0.40 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 83,7 (1P, m, Pa (PBH3)), -11,30 (1P, d, J=19,5 Hz, Py); · 22,91 (1P, dd, J=19,5 Hz, J=30,0 Hz, P ). D2: 1H RMN 5 (ppm): 8,98 (1H, s, H8, m 7G); 8,06 (1H, s, H8G); 5,96 (1H, d, J=2,7 Hz, H1', m7G); 5,79 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,61 (1H, ~t, H2' G); 4,50 (1H, ~t, H3' m7G); 4,45 (1H, dd, J=3,5 Hz, 5,1 Hz, H3' G); 4,34 (2H, m (superpuesto), H4' m7G, H'5 G); 4,26 (3H, m (superpuesto), H2', m7G, H4', H5" G); 4,20 (2H, m, H5', H5", m7G); 4,06 (3H, s, N-CH3); 3,61 (3H, s, O-CH3); 0,40 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 83,7 (1P, m, Pa (PBH3)); ·11,41 (1P, d, J=19,0 Hz, Py); -22,87 (1P, dd, J=19,0 Hz, J=32,0 Hz, P ).
Ejemplo 7
Sal Boranofosfato trietilamonio.
Esta sal se preparó usando una modificación del procedimiento de V. Nahum et al., "Boranophosphate salts asan Excellent Mimic of Phosphate Salts: Preparation, Characterization, and Properties", J. Inorg. Chem., vol. 20, págs. 4.124-4.131 (2004). Se puso tris(trimetilsilil)fosfito (600 111, 1,8 mmol) en un matraz de fondo redondo que contenía 5 ml de acetonitrilo anhidro. Se selló el matraz con un septo de goma y se purgó con argón durante 30 min. Se inyectó N,O-bistrimetilsililacetamida (1,5 ml, 5,4 mmol) con una jeringa. Después de 30min, la solución se enfrió en un baño de hielo, y se añadió una solución de complejo BH3·SMe2 2 M en THF (1,35 ml). Después de 5 min, se sacó el matraz del baño de hielo, y se continúo la agitación durante 30 min. Se evaporó la solución a presión reducida hasta obtener un residuo oleaginoso, que se puso nuevamente en un baño de hielo, se trató con 20 ml de metanol y 0,5 ml de trietilamina, y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. la solución se evaporó a sequedad y el residuo se secó sobre P2O5. El rendimiento de [HN(CH2CH3)3]2HPO3BH3 fue 530 mg (17,8 mmol) (97%, contaminado con acetamida). Esta sal de boronofosfato trietilamonio se almacenó a 4ºC, y se usó en esta forma en reacciones hechas posteriormente. 1H RMN 5 (ppm): 0,33 (~dq, JB-H=87,8 Hz, JP-H=22,3 Hz). 31P RMN 5 (ppm): 84,3 (~qq, JP-B=147 Hz, JP-H=22,3 Hz).
Ejemplo 8
GppBH3pG.
El derivado imidazolida de GMP (GMP-Im) (200 mg, 0,46 mmol, sal de sodio) y la sal de boranofosfato trietilamonio obtenida previamente (70 mg, 0,23 mmol) se suspendieron en 4 ml de DMF, y se añadió poco a poco MgCI2 anhidro. Después de 1 h se detuvo la reacción añadiendo EDTA (1,48 mg, 4 mmol) en 40 ml de agua, y se ajustó el pH a ~6 añadiendo NaHCO3 sólido. Se separó el producto con un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,2M de TEAB. Después de la evaporación, se obtuvieron 165 mg (4.000 unidades de densidad óptica a 260 nm) de la sal GppBH3pG trietilamonio (rendimiento del 65%). ESI MS (-) m/z: 785,12 (calc. para C20H29N10O17P3B: 785,10). 1H RMN 5 (ppm): 8,11 (1H, s, H8 GA'); 8,09 (1H, s, H8 GB); 5,84 (2H, d, J=S,2 Hz, H1' GAB), 4,69 (2H, ~t, J=5,1 Hz, H2' GAB); 4,50 (1H, ~t, H3' GAóB); 4,49 (1H, ~t, H3' GAóB ); 4,31 (2H, m, H4' GGAB); 4,24 (4H, m, H5' GAB, H5" GAB). 31P RMN 5 (ppm): 75,10 (1P, m, P (PBH3)), -11,20 (1PA', ~dt, J=30,2 Hz, J=5 Hz), -11,28 (1PB', ~dt, J=30,2 Hz, J=5 Hz). *A y B denotan señales de los núcleos diaestereoisómeros.
Ejemplo 9
m7GppBH3pG.
Se disolvió GppBH3pG (35 mg, sal TEA) en 1,5 ml de DMSO, y se añadieron 20 μl de yoduro de metilo. Después de 4 h, se detuvo la reacción añadiendo 15 ml de agua y se ajustó el PH a ~7 con NaHCO3 sólido. Se separaron los productos con un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,2M de TEAB. Se recogió una mezcla diaesteroisomérica de m7GppBH3pG (550 unidades de densidad óptica) y se evaporó el disolvente. A continuación, el producto se disolvió en una pequeña cantidad de agua y se convirtió a la sal de sodio en una resina Dowex. los diaestereoisómeros se resolvieron posteriormente usando HPLC semi-preparativa, y se liofilizaron tres veces. los rendimientos después de la separación por HPLC fueron 10,2 mg de m7GppBH3pG (D1) y 9,8 mg de m7GppBH3pG (D2) como las sales de NH; (37,2% y 35,6%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 799,13 (calc. para C21H31N10O17P3B: 799,12). D1: 1H RMN 5 (ppm): 8,02 (1H, s, H8G); 5,89 (1H, d, J=3,0 Hz, H8 m7G); 5,80 (1H, d, l=6,2 Hz, H8G), 4,68 (1H, ~t, H2'G); 4,51 (1H, ~t, H2' m7G); 4,50 (1H, ~t, H3'G); 4,42 (1H, ~t, H3' G); 4,35 (3H, m (superpuesto), H4' H5', H5" G); 4,22 (3H, m (superpuesto), H4', H5', H5", m7G); 4,06 (3H, s, CH3); 0,53 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 75,1 (1P, m, P (PBH3)), -11,3 (2P, ~d, JPa-P )=30,7 Hz, Pa y Py). D2: 1H RMN 5 (ppm): 8,04 (1H, s, H8G); 5,92 (1H, d, J=3,0 Hz, H8 m7G); 582 (1H, d, J=6,2 Hz, H8G), 4,68 (1H, ~t, H2'G); 4,51 (1H, ~t, H2' m7G); 4,50 (1H, ~t, H3'G); 4,42 (1H, ~t, H3' G); 4,35 (3H, m (superpuesto), H4' H5', H5" G); 4,22 (3H, m (superpuesto), H4', H5', H5", m 7G); 4,06 (3H, s, CH3); 0,53 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 75,13 (1P, m, P (PBH3)), -11,31 (2P, ~d, JPa-P )=30,7 Hz, Py y Pa).
Ejemplo 10
m7GppBH3pm7G (Método I).
GppBH3pG (50 mg, 800 unidades de densidad óptica, sal TEA) se disolvieron en 1,0 ml de DMSO, y se añadieron 30 μl de yoduro de metilo. Después de 2 h, se añadieron 30 μl más de yoduro de metilo. Después de 2 h, se detuvo la reacción añadiendo 15 ml de agua y se ajustó el pH a ~7 con NaHCO3 sólido. Se separaron los productos usando un equipo DEAE Sephadex con un gradiente de 0-1,2M de TEAB. Se recolectó m7GppBH3pm7G (200 unidades de densidad óptica), se evaporó y se convirtió en la sal de sodio sobre una resina Dowex. Finalmente, el producto se precipitó con etanol y se secó sobre P2O5. El rendimiento fue 22 mg de m7GppBH3pm7G (sal de sodio) (54%). ESI MS (-) m/z: 813,10 (calc. para C22H33N10O17P311B: 813,13). 1H RMN 5 (ppm): 9,02 (2H, s, H8 m7G); 6,04 (2H, d, J=3,7 Hz, H2'G); 4,67 (2H, ~t, H2' m7G), 4,53 (2H, ~t, H3' m7G); 4,40 (2H, m, H4' m7G); 4,36 (2H, m, H5' m7G); 4,23 (2H, m, H5" m7G); 4,13 (6H, s, CH3); 0,44 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 74,90 (1P, m, P (PBH3)), -11,33 (1PA', ~d, JPa-P =31,0 Hz); -11,36 (1PB , ~d, JPa-P =31,0 Hz). *A y B denotan señales de los núcleos diaestereoisómeros.
Ejemplo 11
m7GppBH3pm7G (Método II).
El derivado imidazolida de m7GMP (m7GMP-Im) (225 mg, 0,5 mmol, sal de sodio) y la sal boranofosfato trietilamonio (75 mg, 0,25 mmol, sal de sodio) se suspendieron en 4 ml de DMF, y se añadió poco a poco MgCI2 anhidro (380 mg, 4 mmol). Después de 1 h se detuvo la reacción añadiendo EDTA (1,48 mg, 4 mmol) en 40 ml de agua, y se ajustó el pH a ~6 añadiendo NaHCO3 sólido. Se separó el producto usando un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,1 M de TEAB. Después de evaporar el disolvente, se disolvió el producto en una pequeña cantidad de agua y se convirtió a la sal de sodio en una resina Dowex. Después de precipitarse con etanol y secarse sobre P2O5, se obtuvieron 150 mg de la sal de sodio de m7GppBH3pm7G (rendimiento del 34%). (La información sobre el espectro se da bajo la descripción del Método I dado anteriormente).
Ejemplo 12
7,2'-OGppBH3pG.
m2
A una suspens1on de m27,2'-OGMP-Im (15 mg, 0,03 mmol, sal de sodio) y la sal boranofosfato trietilamonio (30 mg, 0,1 mmol) en 0,5 ml de DMF, se añadió poco a poco MgCI2 (40 mg, 0,4 mmol) y se agitó la mezcla hasta la disolución de los reactivos (1-2 min). Se añadieron GMP-Im (40 mg, 0,09 mmol) y MgCI2 (40 mg) a la mezcla de reacción. La reacción se detuvo después de 5 h añadiendo EDTA (0,8 mmol) en 10 ml de agua, y se ajustó el pH a ~6 con NaHCO3 sólido. Se separaron los productos usando H PLC semi-preparativo y se liofilizaron tres veces. Los rendimientos fueron 5,1 mg de m27,2'-OGppBH3pG (D1) y 4,8 mg de m27,2'-OGppBH3pG (D2) como las sales de NH4+ (18% y 17%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 813,14 (calc. para C22H33N10O17P311B: 813,13). D1: 1H RMN 5 (ppm): 9,04 (1H, s, H8 m7G); 8,10 (1H, s, H8 G); 5,97 (1H, d, J=2,9 Hz, H1', m7G), 5,80 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,70 (1H, ~t, H2' G); 4,56 (1H, ~t, H3' m7G); 4,50 (1H, ~t Hz, H3' G); 4,41 (1H, m, H5' G); 4,34 (2H, m, superpuesto, H4', m7G, H4' G); 4,27 (2H', m (superpuesto, H2', m7G, H5" G); 4,24 (2H, m, H5', H5", m7G); 4,08 (3H, s, N-CH3); 3,59 (3H, s, OCH3); 0,45 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 75,12 (1P m, P (PBH3)), -11,09 (2P, ~d, JPa-P ) =30,7 Hz, Pa y Py). D2: 1H RMN 5 (ppm): 9,00 (1H, s, H8 m7G); 8,08 (1H, s, H8G); 5,96 (1H, d, J=2,9 Hz, H1' m7G), 5,81 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,70 (1H, ~t, H2' G); 4,55 (1H, ~t, H3' m 7G); 4,48 (1H, ~t, H3' G); 4,40 (2H, m superpuesto, H4' m7G H5' G); 4,30 (3H, m (superpuesto), H2', m7G H4' G, H5" G); 4,25 (2H, m, H5', H5" m7G); 4,07 (3H, s, N-CH3); 3,62 (3H, s, O-CH3); 0,45 (3H, m, BH3). 31P RMN 5 (ppm): 75,12 (1P, m, P (PBH3)), -11,11 (2P, ~d, JPa-P =30,7 Hz, Pa y Py).
Ejemplo 13
Sal selenofosfato trietilamonio.
Usando una jeringa se añadió gota a gota una suspensión de selenio (160 mg, 2 mmol) en piridina (1 ml) a una solución sellada con un septo y en la que se estaba burbujeando argón de tris(trimetilsililfosfito) (600 μl, 1,8 mmol) en CH3CN anhidro (20 ml). La solución resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min, y después se evaporó a sequedad. Se añadió entonces una solución de trietilamina (500 μl, 3,6 mmol) en MeOH (20 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminó el disolvente bajo presión reducida y el residuo se re-evaporó dos veces con metanol. El producto, obtenido como un residuo oleaginoso, amarillento, se usó sin tratamiento adicional alguno en la siguiente reacción.
Ejemplo 14
7,2'-O-dimetilguanosina 5'-O-(2-selenodifosfato) (m27,2'-OGDP�Se).
A una suspensión de 7,2'-O-dimetilguanosina 5'-O-fosfato imidazolida (250 mg, 0,43 mmol) y sal selenofosfato trietilamonio (preparada a partir de 600 μl de (Me3SiO)3P) en 5 ml de DMF, se añadió ZnCI2 (590 mg, 4,30 mmol) y la mezcla se agitó vigorosamente hasta la disolución de todos los reactivos (3 min). Se agitó la solución obtenida durante 20 min a temperatura ambiente y la reacción se detuvo entonces añadiendo una solución de EDTA disódico (1,6 g, 4,30 mmol) y 800 mg de NaHCO3 en 300 ml de agua. Se ajustó el pH a ~7 con la cantidad necesaria de NaHCO3. Se aisló el producto con un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,0M de TEAB. El rendimiento fue 254 mg (0,35 mmol) de m27,2'-OGDP�Se como la sal de TEA (81%). ESI MS (-) m/z: 553,85 (calc. para C12H18N5O10P280Se: 533,97).
Ejemplo 15
7,2'-OGppSepG.
m2
m27,2'-OGDP�Se (250 mg, 0,35 mmol) y GMP-Im (250 mg, 0,50 mmol) se suspendieron en 5 ml de DMF, y se añadió ZnCI2 anhidro (480 mg, 3,5 mmol). La solución obtenida se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se detuvo añadiendo EDTA disódico (1,3 g, 3,5 mmol) en 100 ml de agua, y se neutralizó con NaHCO3 sólido. Los productos se aislaron con un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-1,2M de TEAB. Finalmente, los diaestereoisómeros se separaron por HPLC semi-preparativo y se liofilizaron tres veces. Los rendimientos fueron 40 mg (0,045 mmol) de m27,2'-OGppSepG (D1) y 35 mg (0,040 mmol) de m27,2'-OGppSepG (D2) como las sales de NH4+ (13% y 11%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 878,99 (calc. para C22H30N10O17P380Se: 879,02). D1: 1H RMN 5 (ppm): 9,0Z (1H, s, H8 m 7G); 8,04 (1H, s, H8G); 5,97 (1H, d, J=2,4 Hz, H1' m7G); 5,81 (1H, d, J=6,3 Hz, H1' G); 4,69 (1H, ~t, H2' G), 4,55 (1H, ~t, H3' m7G); 4,54 (1H, ~t, H3' G), 4,43 (1H, m, H5' G), 4,32 (2H, m superpuesto, H4' G, H5" G); 4,26 (4H, m superpuesto, H2' m7G, H4' m7G, H5' m7G, H5" m7G); 4,06 (3H, s, N-CH3); 3,59 {3H, s, O-CH3).31P RMN 5 (ppm): 17,4 (1P, ~t, J=29,6 Hz, P (PBH3)); -12,4 (2P, ~d, J=29,6 Hz, Pa y Py). D2: 1H RMN 5 (ppm): 9,01 (1H, s, H8 m7G); 8,03 (1H, s, H8G); 5,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H1' m7G); 5,79 (1H, d, J=6,1 Hz' H1' G); 4,68 (1H, ~t, H2' G), 4,56 (1H, ~t, H3' m7G); 4,50 (1H, ~t, H3' G), 4,41 (1H, m, H5' G), 4,32 (3H, m superpuesto, H4' G, H5" G); 4,26 (3H, m superpuesto, H4' m7G, H5' m 7G, H5" m7G); 4,07 (3H, s, N-CH3); 3,58 (3H, s, O-CH3); 0,45 (3H, m, BH,). 31P RMN 5 (ppm): 17,4 (1P, ~t, J=29,6 Hz, P (PBH3)); -12,4 (ZP, ~d, J=29,6 Hz, Pa y Py).
Ejemplo 16
7-metilguanosina 5'-O-(H-fosfonato).
A guanosina 5'-O-(H-fosfonato) (260 mg, 0,65 mmol) disuelta en DMSO (10 ml) se añadió yoduro de metilo (322 μg, 5,2 mmol), y la solución se agitó durante 3 h en un matraz tapado. La reacción se detuvo diluyendo con 200 ml de agua y la mezcla de reacción se extrajo tres veces con éter. El éster restante se eliminó de la capa acuosa bajo presión reducida, y se aisló el producto con un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-0,7M de TEAB. Después de la evaporación y secado sobre P2O5, se obtuvieron 200 mg (0,43 mmol) de producto como una sal de trietilamonio (66%). ESI MS (-) m/z: 360,06 (calc. para C11H15N5O7P1: 360,07).
Ejemplo 17
7-metilguanosina 5'-O-fosforoselenoato (m7GMPSe, sal de trietilamonio).
En un matraz de fondo redondo se puso 7-metilguanosina 5'-(H-fosfonato) (200 mg, 0,43 mmol) y se suspendió en 20 ml de acetonitrilo anhidro. Se selló el matraz con un septo de goma y se purgó con argón durante 30 min. Se inyectó N,O-bistrimetilsililacetamida (11,3 ml, 46 mmol) con una jeringa. La mezcla se agitó vigorosamente hasta obtenerse una solución transparente, y entonces se agitó durante 30 min más. Se añadió entonces selenio (40 mg, 0,5 mmol) en piridina (0,5 ml) y se continuó agitando durante 30 min más. Se evaporó la solución a presión reducida hasta obtener un residuo oleaginoso, se añadió una solución de trietilamina (60 μl, 0,43 mmol) en metanol (40 ml), y la mezcla obtenida se agitó durante 2 h. Se evaporó la solución y el producto se disolvió en 100 ml de agua, y se filtró usando papel filtro. El producto se aisló usando un equipo DEAE Sephadex con un gradiente 0-0,9 M de TEAB. Después de la evaporación y liofilización, las fracciones produjeron 93 mg de la sal 7-metilguanosina 5'O-fosforoselenoato trietilamonio (45%). ESI MS (-) m/z: 439,97 (calc. para C11H15N5O7P80Se: 439,98).
Ejemplo 18
m7GpSeppG.
A una suspensión de m7GMPSe (10 mg, 0,021 mmol) y GDP-Im (15 mg, 0,027 mmol) en DMF (0,8 ml) se añadió ZnCI2 anhidro (30 mg, 0,22 mmol). Se mantuvo la reacción a temperatura ambiente durante 2 días, y se detuvo entonces añadiendo 90 mg de EDTA disódico en 10 ml de agua y se neutralizó con NaHCO3. Se separaron los diaestereoisómeros por HPLC Fl. Los rendimientos fueron 2 mg de m7GpSeppG (D1) y 2,5 mg de m7GpSeppG (D2) como las sales de NH4+ (10% y 13%, respectivamente). ESI MS (-) m/z: 865,02 (calc. para C21H28N10O17P380 Se: 865,00).
Ejemplo 19
Medición de las afinidades de enlace de elF4E.
Se llevaron a cabo las mediciones de titulación por fluorescencia usando un espectrofluorómetro LS-50B ó LS-55 (Perkin Elmer Co.) a 20,0 ± 0,2ºC en 50 mM HEPES/KOH (pH 7,2) 0,5 mM EDTA, y 1 mM DTT, con la fuerza iónica ajustada a 150 mM mediante la adición de KCI. Se añadieron diversas soluciones de análogos de caperuza, de concentración cada vez mayor, como alícuotas de 11 μl a 1,4 ml de soluciones de proteína de 0,1 ó 0,2 μM. Se midieron las intensidades de la fluorescencia con excitación a 280 nm ó 295 nm con un ancho de banda de 2,2 nm, y detección a 337 nm con un ancho de banda de 4 nm y un filtro de corte a 290 nm. Se corrigieron los datos en cuanto a la dilución de la muestra y efectos del filtro interno. Se determinaron las constantes de asociación en el equilibrio (Kas) ajustando la dependencia teórica de la intensidad de la fluorescencia sobre la concentración de análogo de caperuza con los datos experimentales, como se describe en A. Niedžwiecka et al., "Biophysycal studies of elF4E cap-binding protein: recognition of mRNA 5' cap structure and synthetic fragments of elF4G and 4E-BP1 proteins", J. Mol. Biol., vol. 312, págs. 615-635 (2002). Se permitió que la concentración de proteína fuese un parámetro libre en la ecuación de equilibrio, para determinar la cantidad de proteína "activa". La Kas final se calculó como el promedio ponderado de tres a diez titulaciones independientes, con los factores de ponderación tomados como los valores recíprocos de los cuadrados de las desviaciones estándar numéricas. Se realizó el análisis de regresión por mínimos cuadrados no lineal usando ORGIN 6,0 (Microcal Software lnc., EE.UU.).
Ejemplo 20
Ensayo de la susceptibilidad a DcpS.
Se expresó DcpS humano en Escherichia coli, como se describe en L. Cohen et al., "Nematode m7GpppG y m32,2,7GpppG decapping: activities in Ascaris embryos and characterization of C. elegans scavenger DcpS", RNA, vol. 10, págs. 1.609-1.624 (2004). Se almacenó a -80ºC una solución de 15 μm de la proteína en tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía KCI 50 nM, EDTA 0,2 mM, DTI 1 mM, PMSF 0,5 mM y glicerol 20% hasta su uso. Se hicieron reacciones enzimáticas a 30°C en 500 μl de Tris-HCI 50 mM, pH 7,9, que contenía MgCI2 20 mM y (NH4)2SO4 60 mM. Se trató una solución de 40 μM del análogo de caperuza seleccionado con 5,0 μl de DcpS durante 120 min. A los 10, 30, 60, y 120 min, se obtuvo una muestra de 100 μl de la mezcla de reacción y se desactivó por incubación a 90ºC durante 2 min. Se analizaron las muestras sin tratamiento adicional alguno usando HPLC Fl analítico con un gradiente lineal de metanol en KH2PO4 0,1 M, pH 6,0. de 0-50% durante 15 min.
Ejemplo 21
Síntesis de ARNm con caperuza de análogos de BH3 y Se. Método I (para análogos de m7GppBH3G (mezcla D1/D2) y m7GppBH3pm7G).
Se sintetizó una plantilla de ADN para la transcripción in vitro usando PCR del plásmido 5P6p-5'UTR �-globin-LUCiferasa. La plantilla contenía el promotor SP6 seguido por la secuencia 5'-UTR de ARNm de �-globina de conejo y la región de codificación completa de la luciferasa de luciérnaga. Una mezcla de reacción de transcripción típica in vitro (50 μl) contenía tampón de transcripción SP6 (Fermentas, no. cat. EP0131), 2 μg de plantilla de ADN, 2 U/μl inhibidor de la ribonucleasa RiboLock (Fermentas), 2 mM de cada uno de los siguientes: ATP, CTP, y UTP, GTP 0,1 mM, y análogo de caperuza del dinucleótido 1 mM. Se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 5 min antes de añadir la polimerasa SP6 ARN (Fermentas) hasta una concentración final de 2 U/μl. Después de 30 min de incubación a 37ºC, se añadió GTP hasta una concentración final de 1 mM, y se continuó la reacción durante 90 min más. Las mezclas de reacción se trataron con 1U de DNasa RQ1 (RNAse-free, Promega) por μg de plantilla de ADN en tampón de transcripción a 37ºC durante 20 min. Se purificaron los transcriptos de ARN sobre columnas Sephadex G-S0 tratadas con DEPC (Pharmacia). La integridad de los transcriptos se confirmó por electroforesis sobre un gel de agarosa 1%, no desnaturalizante. Se determinaron las concentraciones espectrofotométricamente. Los transcriptos se almacenaron a 80ºC hasta su uso.
Ejemplo 21
Síntesis de ARNm con caperuza de análogos BH3 y Se. Método II (para análogos de m27,2'-OGppBH3pG (D1) y
7,2'-OGppBH3p7,2'-OGppSepG
m27G) (D2), m27,2'-OGpppBH3G (D1), m27,2'-OGpppBH3pG (D2), m27,2'-OGppSepG (D1) y m2(D2), m27GPPBH3pG (D1), m27GPPBH3pm7G, m27,2'-OGppSpG (D1) y m27,2'-OGppSpG (D2)).
Se sintetizaron in vitro ARNm de luciferasa poliadenilada, en caperuza mediante PCR a partir de una plantilla de ADNds que contenía el promotor SP6, la secuencia 5'-UTR de ARNm de �-globina de conejo y la región de codificación completa de la luciferasa de luciérnaga y 31 residuos de adenosina. Una mezcla de reacción de transcripción típica (40 μl) contenía tampón de transcripción SP6 (Fermentas), 0,7 μg de plantilla de ADN, 1 U/μl inhibidor de la ribonucleasa RiboLock (Fermentas), 0,5 mM de cada uno de los siguientes: ATP, CTP, y UTP, GTP 0,1 mM, y análogo de caperuza del dinucleótido 0,5 mM. Se incubó la mezcla de reacción a 3TC durante 5 min antes de añadir la polimerasa SP6 ARN (Fermentas) hasta una concentración final de 1 U/μl, y se continuó la incubación durante 45 mina 37ºC. La mezcla de reacción se trató con DNasa como en el Método l. Se purificaron los transcriptos de ARN sobre columnas NucAway (Ambion). La integridad de los transcriptos y la cuantificación se realizaron como en el Método l.
Ejemplo 22
Eficiencia de la traducción de ARNm con caperuza en un sistema in vitro.
Se empleó un sistema de lisado de reticulocito de conejo tratado con una nucleasa de micrococo (Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System, Promega) para la traducción in vitro. Las reacciones de traducción se hicieron con 10 μl durante 60 min a 30ºC. Una mezcla típica de reacción contuvo 40% de lisado de reticulocito, los 20 aminoácidos "estándar" (0,01 mM de cada uno), MgCI2 (1,2 mM), acetato de potasio (170 mM) y ARNm (cinco concentraciones diferentes de cada concentración del transcripto, entre 0,25 y 4 μg/ml). Se midió la actividad de la luciferasa con un luminómetro (Glomax, Promega). Se usó regresión lineal para el ajuste de los datos (actividad de luciferasa vs. transcripto de ARNm) y la eficiencia traduccional se definió como la pendiente de esta línea. Las eficiencias traduccionales relativas de los ARNm de ensayo se compararon con la del ARNm de luciferasa con caperuza de m7GpppG, habiéndose definido este último como 1,0.
Ejemplo 23
Inhibición de la traducción dependiente de la caperuza in vitro mediante análogos de BH3.
Se hicieron las reacciones de traducción in vitro con 12,5 μl durante 60 min a 30ºC bajo condiciones favorables para la traducción dependiente de la caperuza. En algunos casos, la mezcla de reacción se incubó durante 60 min a 30ºC antes de añadir el análogo de caperuza de dinucleótido (inhibidor) y ARNm de luciferasa con caperuza de m27,3'-OGpppG para iniciar la traducción. En otros casos, para analizar la estabilidad biológica, se incubó el análogo de caperuza en la mezcla de traducción durante 60 min a 30ºC antes de añadir el ARNm de luciferasa para iniciar la traducción. Una mezcla de reacción típica contuvo 56% de lisado de reticulocito, los 20 aminoácidos "estándar" (0,01 mM de cada uno). MgCI2 (1,2 mM), acetato de potasio (170 mM). inhibidor de ribonucleasa RiboLock (0,32 U/μl), solución de análogo de caperuza (1/10 del volumen total de reacción) y ARNm de luciferasa con caperuza de m27,3'-OGpppG. El transcripto no fue poliadenilado, sino que contenía un 3'-UTR de 59 bases. Se hicieron reacciones con concentraciones del análogo de caperuza entre 0,12 y 100 μM. Se midió la actividad de la luciferasa usando un luminómetro. A partir de las mediciones calculamos los valores Cl50, definidos como la concentración del análogo de caperuza que produjo una inhibición del 50%. Se usó el programa OriginPro8 para el ajuste de la curva con la ecuación qLUC = Z/(1+1/CI50) + N, donde qLUC es la actividad de la luciferasa sintetizada en presencia del análogo de
5 caperuza, Z es la actividad de la luciferasa sintetizada en ausencia del análogo de caperuza, N es la actividad de la luciferasa sintetizada de manera independiente de la caperuza, e I es la concentración del análogo de caperuza. En la Tabla 2 se muestran los datos.
Tabla 2
Caracterización biofísica y bioquímica de los análogos de BH3
Ejemplo 24
- -
5 Resultados de la caracterización biofísica y bioquímica de los análogos de BH3 y Se-.
Se determinaron las afinidades de enlace de elF4E eucariótico por los diversos análogos de caperuza usando
extinción por fluorescencia. Esta prueba biofísica permite predecir la eficacia potencial de los análogos de caperuza
en la traducción. Se espera que los que poseen afinidades más altas hacia elF4E que el análogo de caperuza sin 10 modificar (m7GpppG) serán reconocidos mejor por la maquinaria traduccional, produciendo eficiencias
traduccionales más altas. También se espera que compitan más efectivamente con el ARNm sin modificar cuando
se usan dinucleótidos sin caperuza para inhibir la traducción. Véase en general E. Grudzien-Nogalska et al.,
"Synthesis of anti-reverse cap analogs (ARCAs) and their applications in mRNA translation and stability", Methods
Enzymol., vol. 431, págs. 203-227 (2007). Los resultados demostraron que las constantes de asociación para todos 15 los análogos de BH3 y Se estudiados fueron similares o superiores a los de sus homólogos sin modificar. Véanse las
Tablas 2 y 3.
20 Tabla 3
Caracterización biofísica y bioquímica de los análogos de Se
Ejemplo 25
5 Eficiencias traduccionales de los ARNm con caperuza de análogos de BH3 y Se.
Se determinaron las eficiencias traduccionales mediante traducción in vitro. Generalmente, se encontró que los ARNm con caperuza de los nuevos análogos poseen eficiencias traduccionales más altas que los ARNm con caperuza de los compuestos madre sin modificar (Tablas 4 y 5). Especialmente, se observaron eficiencias
10 traduccionales altas con los análogos que fueron incorporados al ARNm exclusivamente en la orientación correcta (BH3-ARCAs, Se-ARCAs y m7GppBH3pm7G).
Tabla 4
15 Eficiencia traduccional in vitro de ARNm de luciferasa con caperuza de análogos de caperuza de boranofosfato de dinucleótido
Tabla 5
Eficiencia traduccional in vitro de ARNm de luciferasa que contiene una cola poli-A de 31 bases y con caperuza de análogos de caperuza de boranofosfato o fosforoselenoato
Ejemplo 26
10 Susceptibilidad de los nuevos análogos a la degradación con DcpS.
También se determinó esta susceptibilidad. Inesperadamente, se descubrió que todos los análogos �-BH3 son resistentes a la hidrólisis con DcpS (Tabla 2). Ya que J. Kowalska et al. (2008) habían demostrado que los análogos de caperuza �-fosforotioato correspondientes son todos susceptibles al DcpS, este resultado indica que las
15 diferentes modificaciones de fosfato en la misma posición del puente de trifosfato pueden tener diferentes consecuencias químicas. En comparación, con los análogos de Se, sólo los modificados en la posición y fueron resistentes a DcpS (Tabla 3).
Ejemplo 27
Los análogos de BH3 como inhibidores de la traducción in vitro dependiente de la caperuza.
Se hicieron dos tipos de experimentos. En uno de ellos (condición A) se añadió un análogo de caperuza al sistema de traducción conjuntamente con ARNm de luciferasa. En el otro (condición B), se incubó el análogo de caperuza en el sistema de traducción durante 60 min antes de añadir ARNm. En los dos tipos de experimentos, se encontró que los análogos de BH3 y Se son inhibidores fuertes de la traducción (Tablas 2 y 3). Asimismo, en comparación con m7GpppG, la incubación de algunos de estos análogos no empeoran sus propiedades inhibidoras, lo que se supone es un reflejo de su resistencia al ataque con pirofosfatasa. Existe una correlación entre la resistencia a la hidrólisis con DcpS y la estabilidad de los análogos en el sistema de traducción.
Ejemplo 28
Medición de la eficiencia traduccional y la degradación de ARNm en células Hela cultivadas.
Se empleó nucleoporación para transportar el ARN a las células Hela con un Nucleofector II (Amaxa Biosystems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se introdujo un microgramo de ARN en 106 células en la Solución V del Nucleofector, usando el programa T-024.
Para la medición de la síntesis de luciferasa, las células se dividieron en varios tubos Eppendorf, se pusieron a baño María a 37ºC, y se agitaron. Para la extracción de proteína, 2 x 105 células fueron lisadas en 200 μl de Reactivo de Lisado de Cultivo Celular de Luciferasa (Promega). Se determinó la actividad de la luciferasa de los extractos celulares siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.
Para determinar la estabilidad del ARNm, se distribuyeron las células en platos de cultivo celular de 35 mm y se pusieron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO2. Se cosecharon las células en diversos puntos de tiempo y se lavaron dos veces con PBS. Para la extracción de ARN citoplásmico, 2 x 105 células fueron lisadas en 175 μl de Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 140 mM, MgCI2 1,5 mM , lgepal (Sigma) 0,5% (v/v) y ditiotreitol 1 mM. Los ARN se purificaron adicionalmente usando el mini equipo RNeasy® y se analizaron usando PCR en tiempo real. Se hizo la transcripción inversa usando 400 ng de ARN en mezclas de reacción de 20 μl que contenían MgCI2 5,5 mM, 500 μM de cada dNTP, 2,5 μM de hexámeros aleatorios, 0,2 unidades de inhibidor ARNasa, y 0,8 unidades de transcriptasa inversa MultiScribe (Applied Biosystems). Las mezclas de reacción se incubaron a 25ºC durante 10 min, 48ºC durante 30 min y 95ºC durante 5 min. Se hizo el PCR cuantitativo en tiempo real con cebadores específicos diseñados para cada ARNm con la herramienta Beacon Designer (Bio-Rad). Los niveles de ARNm de luciferasa se determinaron usando PCR empleando cebadores diseñados para amplificar las bases 226-398 del extremo 5'. Los niveles de GAPDH ARNm de ratón se determinaron (como control) siguiendo el mismo método, y en las mismas muestras de ARN usando cebadores específicos para el GAPDH de ratón. La amplificación y detección se hicieron con el sistema de detección PCR en tiempo real iCycler IQ con mezclas de reacción de 25 μl que contenían 5 μl de la mezcla de reacción de transcripción (50 ng) de ADNc), 12,5 μl de IQ SYBRgreen Supermix, y 0,3 mM de cebadores (Bio-Rad). Las condiciones de incubación fueron 3 min a 95ºC para la activación de la polimerasa, seguida de 40 ciclos, cada uno de 15 s a 95ºC y 1 min a 60ºC. Se calcularon los niveles de ARNm de luciferasa usando el método de curva estándar absoluta como se describe en el Boletín del Usuario No. 2 del Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7700. Después, se normalizó el ARNm de luciferasa comparándose con el nivel determinado de GAPDH ARNm de ratón en cada muestra, lo que es un indicador del total de ARN celular purificado en un extracto celular. El ARNm de luciferasa restante en cada punto de tiempo se convirtió a un porcentaje del ARN presente en el tiempo cero, y se graficaron los resultados como Log10([ARN]) vs. tiempo para determinar t1/2. Los resultados se muestran en la Figura 14.
Se determinaron las eficiencias traduccionales de diversos ARNm de luciferasa normalizando la velocidad de síntesis de la luciferasa a la concentración de ARNm de luciferasa presente en las células en el tiempo cero. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Uno o más de los siguientes compuestos, o un estereoisómero de uno o más de los siguientes compuestos, o mezclas de estereoisómeros de uno o más de los siguientes compuestos, o una sal o sales de cualquiera de ellos:10 donde Y1, Y2, Y3 y Y4 se seleccionan del grupo que consiste en O, BH3 y Se; los diversos grupos Yi pueden ser iguales o diferentes, donde i es 1, 2, 3 ó 4; y al menos un Yi es BH3 o Se; n es 0 ó 1; 15 R se selecciona del grupo que consiste en:R3 y R4 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH3 y OCH2CH3; y R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes.25 W se selecciona del grupo que consiste en:30 R1 y R2 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH3 u OCH2CH3; y R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes; yX se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, butilo, bencilo, bencilo sustituido, metilennaftilo y metilennaftilo sustituido.
- 2. Un compuesto como el indicado en la reivindicación 1; donde Y1, Y2, Y3 y Y4 se seleccionan del grupo que consiste en O, Se y BH3; los diversos grupos Y, pueden ser iguales o diferentes, donde i es 1,2,3, ó 4; y al menos un Yi es BH3 o Se;
- 3. Un compuesto como el indicado en la reivindicación 2, donde R se selecciona del grupo que consiste en:
- 4. Un compuesto como el indicado en la reivindicación 2, donde W es:R2 es OH; R1 es H u OCH3; X es metilo, yn = 0; y sólo uno entre Y1, Y2 y Y3 es BH3 o Se.
-
- 5.
- Un compuesto como el indicado en la reivindicación 2, donde, si n = 0, entonces Y2 o Y3 es BH, o Se, y donde, si n = 1, entonces Y2, Y3 o Y4 es BH 3 o Se.
-
- 6.
- Una molécula de ARN cuyo extremo 5' incorpora un compuesto como el indicado en la reivindicación 2.
-
- 7.
- Una molécula de ARN cuyo extremo 5' incorpora un compuesto como el indicado en la reivindicación 5.
-
- 8.
- Una molécula de ARN como la indicada en la reivindicación 7, donde R se selecciona del grupo que consiste en:
-
- 9.
- Un método de síntesis, in vitro o in vivo, de una molécula de ARN como la indicada en la reivindicación 6, donde
30 dicho método comprende la reacción de ATP, CTP, UTP y GTP, una composición como la indicada, y una plantilla de polinucleótido en presencia de ARN polimerasa, bajo condiciones que conduzcan a la transcripción por el ARN polimerasa de la plantilla de polinucleótido en una copia del ARN; por lo cual algunas de las copias de ARN incorporarán el compuesto para formar una molécula de ARN como la indicada en la reivindicación 6.35 10. Un método de síntesis de una proteína o péptido in vitro, donde dicho método comprende la traducción de una molécula de ARN como la indicada en la reivindicación 6 en un sistema acelular de síntesis de proteína, donde la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, bajo condiciones adecuadas para la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN en la proteína o péptido codificado por el marco de lectura abierto. -
- 11.
- Un método de síntesis de una proteína o péptido in vivo o en células cultivadas, donde dicho método comprende la traducción de una molécula de ARN como la indicada en la reivindicación 6 in vivo o en células cultivadas, donde la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, bajo condiciones adecuadas para la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN en la proteína o péptido codificado por el marco de lectura abierto.
-
- 12.
- Un compuesto como el indicado en la reivindicación 2 para el uso en un método de inhibición total o parcial de la traducción del ARN en una proteína o péptido en un sistema que traduce el ARN en una proteína o péptido.
- 13. Un compuesto como el indicado en la reivindicación 2 para el uso en un método como el indicado en la 10 reivindicación 12, donde el sistema es un sistema nativo de traducción del ARN de un organismo vivo.
- 14. Una composición como la indicada en la reivindicación 2; donde R1 es OCH3; R2 es OH; R3 es OH; R4 es OH; n es O; Y1 es O; Y2 es Se; Y3 es O; W esy R es
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