ES2394344T5

ES2394344T5 - Empleo de lactoferrina bovina para tratar la inflamación destructiva de una membrana mucosa

Info

Publication number: ES2394344T5
Application number: ES06724054.9T
Authority: ES
Inventors: Piera Valenti; Rosalba Paesano
Original assignee: Progine Farmaceutici SRL
Current assignee: Progine Farmaceutici SRL
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2016-05-05
Anticipated expiration: 2026-04-05
Also published as: EP1959988A1; CN101325965B; US20090156484A1; EP1959988B2; US9050323B2; EP1959988B1; PL1959988T3; ITMI20052351A1; CN101325965A; DK1959988T3; ES2394344T3; WO2007065482A1

Description

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DESCRIPCION

Empleo de lactoferrina bovina para tratar la inflamacion destructiva de una membrana mucosa Campo tecnico

La presente invencion hace referencia a un nuevo uso farmaceutico de lactoferrina bovina segun la reivindicacion 1. Antecedentes de la invencion

Las membranas mucosas humanas, generalmente colonizadas por bacterias comensales, son el habitat que esta mas expuesto a la agresion de microorganismos patogenos y virus. En situaciones fisiologicas, las secreciones mucosas, constituidas por diversas protemas y peptidos de inmunidad natural, aseguran la proteccion contra el ataque microbiano y vmco. La respuesta inflamatoria es un mecanismo de defensa fundamental contra infecciones que esta implementado por el huesped, pero en algunas condiciones puede hacerse tan intensa que llega a ser danina. En tales casos, la inmunotolerancia del huesped respecto de los microorganismos comensales se convierte en una respuesta inmune adaptativa contra patogenos, que crea una inflamacion que es denominada "destructiva" porque esta siempre acompanada por un dano significativo a las celulas del huesped. Por lo tanto, el equilibrio entre la inflamacion fisiologica y la inflamacion destructiva, junto con los mecanismos reguladores que limitan la respuesta inflamatoria y restablecen, cuando es necesario, la homeostasis de la inflamacion (inflamacion fisiologica), son esenciales, porque aseguran la inhibicion de fenomenos destructivos que podnan, por ejemplo, combinarse con dano causado por trastornos infecciosos ya en progreso, y las membranas mucosas mismas, danadas y careciendo de factores no anticuerpos de inmunidad natural, podnan volverse mas susceptibles a la aparicion de cualquier infeccion. La aparicion de una inflamacion patologica y destructiva puede ser causada por la persistencia de un estimulo que el cuerpo reconoce como extrano y tiende a eliminar sin exito. Casos tfpicos son, por ejemplo, inflamaciones destructivas despues de embarazos mas o menos patologicos, y especialmente despues de infecciones vmcas, micosis o infecciones causadas por bacterias (tanto gram positivas como gram negativas) que estan localizadas intracelularmente o que, una vez se han adherido a las celulas del cuerpo, sintetizan y se cubren con una capa mas o menos gruesa de polisacaridos, que junto con los microorganismos constituye la llamada biopelfcula, que se sabe que es impermeable a agentes bactericidas y bacteriostaticos normales.

Un trastorno adicional comun e importante de la inflamacion destructiva esta constituido por estados mas o menos graves de hipoferremia y/o anemia. Durante la inflamacion hay de hecho una transferencia gradual de hierro libre desde la circulacion a los tejidos, aumentando considerablemente la concentracion fisiologica de hierro libre en el nivel de la membrana mucosa (aproximadamente 10-18 M), Este hecho tiene varias consecuencias daninas para el cuerpo, incluyendo (i) una sobreproduccion, a nivel del tejido, de especies reactivas de oxfgeno, sobre todo superoxidos (mediante la reaccion Fenton inducida por hierro), y (ii) un aumento en la produccion de citoquinas proinflamatorias. Ademas, se ha demostrado que un aumento del hierro que esta disponible o libre en el nivel de las membranas mucosas facilita la proliferacion y diseminacion microbiana y vmca, puesto que muchos patogenos muestran tanto crecimiento como virulencia inducida por hierro. Finalmente, la presencia de infecciones de las membranas mucosas de la cavidad oral (por ejemplo parodontopatfas), del intestino (enteritidis) o del epitelio vaginal en progreso, a su vez provoca sangrado y una mayor retirada del hierro de la circulacion; estos factores aumentan la sobrecarga de hierro en los tejidos (hasta el punto de crear estados de anemia cronica causados por infecciones y las consiguientes inflamaciones), en una especie de retroalimentacion positiva. Todo lo anterior explica por que la aparicion de una flogosis destructiva a nivel de las membranas mucosas esta a menudo asociada con estados patologicos de hipoferremia y/o anemia y/o infecciones que afectan a dichas membranas mucosas, hasta el punto en el que los roles de causa y consecuencia entre los diversos trastornos son diffciles de distinguir.

Actualmente, los estados de inflamacion cronica posiblemente asociados con hipoferremia, anemia, e infecciones agudas o cronicas son tratados administrando sustancias que son espedficas para cada smtoma, tales como antibioticos, antivirales, antiinflamatorios o terapias basadas en hierro, de esta forma requiriendo la combinacion de cocteles de medicamentos si dos o mas de estas complicaciones estan presentes simultaneamente. Sin embargo, no hay medicamentos capaces de tener un efecto terapeutico apreciable en mas de un componente simultaneamente.

El documento EP 730868 A muestra el uso de lactoferrina para el tratamiento o prevencion de la inflamacion oral tal como estomatitis aftosa y gingivitis.

El documento EP 559425 A muestra el uso de lactoferrina para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas oportunistas asociadas con infeccion por Lentivirus.

El documento US 5.834.424 muestra el uso de una transferrina, tal como lactoferrina, para inhibir la penetracion de Streptococcus pyogenes o Staphylococcus aitreus en membranas mucosas.

El documento US 6.455.687 muestra la clonacion y expresion de lactoferrina humana usando tecnicas de ADN recombinante y el uso de tal lactoferrina humana para el tratamiento y prevencion de infecciones oportunistas.

El documento US 2002/016289 muestra el uso de lactoferrina humana recombinante para tratar y/o prevenir

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infecciones causadas por enteropatogenos tales como H. pylori.

El objetivo de la presente invencion es, por lo tanto, proveer una sustancia para usar en el tratamiento de la inflamacion destructiva que afecte a membranas mucosas asociada con infecciones agudas o cronicas y opcionalmente asociada con estados de hipoferremia y/o anemia.

Dentro del ambito de este objetivo, un objeto es proveer un compuesto para tratar las indicaciones terapeuticas mencionadas anteriormente que permita conseguir un efecto particularmente efectivo y potente.

Explicacion de la invencion

En un aspecto, la presente invencion concierne la lactoferrina bovina para el uso en el tratamiento de inflamacion destructiva (patologica) que afecta a membranas mucosas asociada con infeccion aguda o cronica, y opcionalmente asociada con estados de hipoferremia y/o anemia,

en el que las membranas mucosas estan seleccionadas de una o mas de entre membranas mucosas vaginales, anales o de la cavidad orofarmgea y la lactoferrina bovina es para uso topico cuando la inflamacion destructiva (patologica) no esta asociada con hipoferremia y/o anemia, y combinada con el uso oral de lactoferrina bovina cuando la inflamacion destructiva (patologica) esta asociada con hipoferremia y/o anemia,

o en el que las membranas mucosas son membranas mucosas intestinales y la lactoferrina bovina es para uso oral cuando la inflamacion destructiva (patologica) esta asociada con hipoferremia y/o anemia.

Se entiende que cualquier caractenstica mencionada haciendo referencia solamente a uno de los aspectos de la invencion, pero que tambien pueda referirse a otros aspectos, debe considerarse igualmente valida con referencia a estos ultimos aspectos incluso si no se repite explfcitamente.

Descripcion de las realizaciones preferidas

Los diversos aspectos de la presente invencion derivan de observaciones sorprendentes hechas por el solicitante, segun las cuales la administracion topica y/o oral de lactoferrina bovina es capaz de conseguir simultaneamente una serie de efectos, incluyendo:

i) una accion bacteriostatica/fungistatica y bactericida/fungicida, puesto que la lactoferrina bovina secuestra el hierro, impidiendo el crecimiento microbiano y su diseminacion y al mismo tiempo tiene una accion contra los virus, impidiendo las interacciones tempranas virus-celula huesped;

ii) el restablecimiento de la homeostasis de la inflamacion, puesto que la lactoferrina bovina,

- por un lado reduce la expresion y smtesis de citoquinas proinflamatorias, sobre todo interleuquina-1 p, interleuquina-6, interleuquina-8, TNT-a y NF-kB, cuya sobreproduccion es una caractenstica y senal distintiva de inflamacion destructiva. Hay por lo tanto una consiguiente proteccion contra el dano celular y un aumento de las defensas naturales del huesped,

- por otro lado, secuestra hierro libre, bloqueando la sobreproduccion de especies activas de oxfgeno, que tambien estan involucradas en la activacion de citoquinas proinflamatorias;

iii) restablecimiento de la homeostasis del hierro, puesto que la lactoferrina bovina, al inhibir la expresion y smtesis de IL-6 y consiguientemente de hepcidina, permite a la ferroportina devolver a la circulacion el hierro que se ha acumulado en los tejidos. La accion positiva realizada con la liberacion del hierro de los tejidos tambien tiene como una consecuencia importante la reduccion (factor de prevencion) de la susceptibilidad de dichos tejidos a ser atacados por infecciones microbianas, micoticas y vmcas,

iv) una accion positiva sobre el restablecimiento de los valores fisiologicos de sideremia y hemoglobina, solucionando, gracias al efecto ya mencionado sobre la transferencia del hierro de los tejidos a la circulacion, estados de hipoferremia y/o anemia asociados con infecciones microbianas y vmcas y con fenomenos inflamatorios que son una consecuencia o no de infecciones.

Hace tiempo que se conoce la actividad antibacteriana y la actividad bactericida de la lactoferrina, asf como de las transferrinas en general. Recientemente tambien se ha destacado su capacidad de inhibir la adhesion microbiana y la penetracion de bacterias patogenicas conocidas como bacterias intracelulares facultativas. Ademas, la capacidad de la lactoferrina para inhibir las etapas tempranas de una infeccion vmca ha sido demostrada extensivamente. Sin embargo nunca se habfa demostrado o sugerido que la lactoferrina bovina podna ser utilizada para boquear fenomenos de flogosis destructiva (inhibiendo la produccion de superoxidos y citoquinas proinflamatorias), eliminando simultaneamente la sobrecarga de hierro en las membranas mucosas, que es una causa de la proliferacion y diseminacion microbiana y de estados de anemia e hipoferremia a menudo asociados con la inflamacion destructiva misma. Aunque no deseamos estar limitados por cualquier teona cientffica espedfica, se cree que las acciones coordinadas realizadas por la lactoferrina bovina cuando se usa segun la invencion pueden ser atribuibles a la accion dual de secuestro de hierro libre y a la inhibicion de la smtesis de citoquinas

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proinflamatorias, especialmente IL-6, sin excluir la caractenstica capacidad de la lactoferrina (una glicoprotema muy cationica) de unirse a cualquier componente que tenga una carga negativa que este presente en la superficie de microorganismos, virus y celulas huesped. El primer efecto lleva a una reduccion de la formacion de especies reactivas de oxfgeno, que contribuyen a la aparicion de una inflamacion destructiva, mientras que el segundo efecto conlleva una reduccion paralela de smtesis de hepcidina mediante una reduccion paralela de interleuquina-6 y de otras citoquinas proinflamatorias. La hepcidina tiene un papel inhibidor en la actividad de la ferroportina, que es una protema cuya tarea es llevar hierro desde el interior hacia el exterior de las celulas. Por lo tanto, cuando la hepcidina esta ausente o expresada apenas porque la interleuquina-6 vuelve a la expresion normal y a los niveles de smtesis normales, la ferroportina es libre de la union con la hepcidina y puede transportar el hierro desde los tejidos a la circulacion. Al restablecer en primer lugar una respuesta inmune fisiologica y eliminar el hierro necesario para el crecimiento y la diseminacion microbiana, la invencion es una ayuda valida en el tratamiento tambien de infecciones que actualmente son diffciles de erradicar, tales como las causadas por patogenos (bacterias, virus u hongos) que estan protegidos por una biopelmula o estan localizados en areas intracelulares que son apenas accesibles o nada accesibles a los medicamentos.

La expresion "inflamacion (o flogosis) destructiva (o patologica)" se utiliza para designar una inflamacion en respuesta a patogenos caracterizada por la sobreproduccion de interleuquina-1 p, interleuquina-6, interleuquina-8, TNF-a y NF-kB cuya inflamacion provoca dano a las celulas del huesped. La verificacion de la aparicion de esta afeccion y su distincion respecto de una inflamacion no destructiva son aspectos que se encuentran dentro del conocimiento de los expertos en la tecnica.

La expresion "hipoferremia y/o anemia asociada con inflamacion destructiva" significa preferiblemente que los estados de hipoferremia y anemia, individualmente o como un todo, son causados por una inflamacion destructiva que afecta a las membranas mucosas. La expresion "trastornos infecciosos agudos y cronicos o infecciones asociadas con inflamacion destructiva" significa preferiblemente que esas infecciones causan una inflamacion destructiva. La expresion "causa inflamacion destructiva" significa preferiblemente que las infecciones causadas por patogenos o bacterias comensales que se han vuelto patogenos ocasionales son un factor de riesgo aumentado para la aparicion de flogosis destructiva y pueden persistir o recurrir o volverse cronicos tambien como consecuencia de la aparicion de la inflamacion destructiva. Gracias a las propiedades peculiares y ventajosas de la lactoferrina bovina, es particularmente ventajoso utilizar la invencion para tratar inflamacion destructiva, hipoferremia, anemia e infecciones agudas o cronicas en situaciones en las que todos estos componentes estan presentes simultaneamente.

La expresion "tratar la inflamacion destructiva" significa reducir la gravedad o frecuencia de los smtomas de esta afeccion, de sus causas o de sus consecuencias. En particular, significa reducir y mantener a valores fisiologicos la produccion de interleuquina-1 p, interleuquina-6, interleuquina-8, TNF-a y NF-kB y hepcidina. Debena senalarse que no hay intencion de describir o reivindicar un efecto inmimosupresor, sino solo un efecto de control de la homeostasis del proceso inflamatorio respecto de la inflamacion destructiva y no contra una inflamacion fisiologica normal, donde la expresion "inflamacion fisiologica normal" designa un proceso inflamatorio que no conlleva la sobreproduccion de las citoquinas proinflamatorias mencionadas anteriormente.

La expresion "tratar la hipoferremia y la anemia" significa restablecer los niveles fisiologicos de sideremia y cantidad de hemoglobina en circulacion.

La expresion "infecciones agudas o cronicas" designa trastornos infecciosos que afectan a las membranas mucosas y estan causados por patogenos intracelulares (bacterias o virus), microorganismos que se han adherido o estan protegidos dentro de una biopelmula. No se hace referencia sin embargo al tipo de patogeno (bacteria, virus, hongo o protozoo). Preferiblemente, las infecciones son una o mas de entre gingivitis, parodontopatfas, infecciones micoticas e infecciones vmcas en general, infecciones recurrentes causadas por microorganismos que se sabe que estan dentro de una biopelmula y microorganismos que se sabe que tienen una localizacion intracelular facultativa u obligatoria, como en el caso de los virus.

Las expresiones "restablecimiento de la homeostasis de hierro" o “restablecimiento del metabolismo del hierro" significa restablecer una distribucion fisiologica de la cantidad de hierro entre tejidos y circulacion, asf como restablecer la operacion fisiologica de los sistemas naturales destinados a mantener esta distribucion.

La expresion "membranas mucosas" designa preferiblemente una o mas de entre las membranas mucosas intestinales, vaginales, anales y membranas mucosas de la cavidad orofarmgea. Si el uso es topico, las membranas mucosas son una o mas de entre las membranas mucosas vaginales, membranas mucosas anales y membranas mucosas de la cavidad orofarmgea,

Las expresiones "administracion topica" o "topicamente" o "medicamento para administracion topica" designan una administracion local de lactoferrina bovina en una o mas de entre la cavidad orofaringea, la cavidad vaginal y la cavidad anal. Aunque es tecnicamente posible en la actualidad conseguir la administracion topica tambien mediante administracion oral (en la que, por lo tanto, la lactoferrina bovina no es absorbida sino que actua solo localmente en la membrana mucosa intestinal), en la presente invencion una forma farmaceutica enteral no debena entenderse como "para administracion topica". Por lo tanto, el tratamiento de las membranas mucosas intestinales tiene lugar

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siempre y solo mediante una administracion oral que combina un efecto topico y un efecto sistemico.

Las expresiones "administracion oral", "oralmente" o "medicamento para la administracion oral" designan la administracion oral sistemica y topica que por lo tanto permite tanto la absorcion sistemica de la lactoferrina bovina como su actividad local. La lactoferrina bovina administrada mediante un medicamento oral por lo tanto conlleva tanto un efecto topico local en las membranas mucosas intestinales como un efecto sistemico en todas las membranas mucosas del cuerpo despues de su absorcion gastrointestinal.

Tal y como se describe en detalle a continuacion, independientemente de la membrana mucosa involucrada, en el caso de inflamacion destructiva asociada con hipoferremia y/o anemia, el uso de la lactoferrina bovina tiene lugar segun un modo dual topico y oral. Por supuesto, el tratamiento de las membranas mucosas intestinales no requiere un modo de administracion dual.

El termino "transferrinas" designa una clase de glicoprotemas que estan presentes en la naturaleza y estan caracterizadas por la presencia de dos sitios de union para el hierro (III) y por una elevada homologfa de secuencia entre los diversos miembros de la clase. Moleculas que pertenecen a la clase de transferrinas son lactoferrina, serotransferrina y ovotransferrina.

Sorprendentemente, se ha descubierto que el efecto sobre la flogosis obtenido con la lactoferrina bovina puede conseguirse para cualquier grado de saturacion de los sitios de union para el hierro (III), esten completamente libres (forma "apo" de lactoferrina, grado de saturacion de sitios de hierro igual a 0%), parcialmente ya ocupados o completamente ya saturados (forma "holo" de lactoferrina, grado de saturacion de sitios de hierro igual a 100%). En cualquier caso, debena senalarse que hay una dependencia entre la actividad mostrada y el porcentaje de saturacion (pero no entre la actividad y la cantidad total de hierro contenido), en que cuanto mayor sea la presencia de lactoferrina bovina a un grado inferior de saturacion, mayor la actividad conseguible. Sin embargo, una lactoferrina bovina completamente saturada (100% de grado de saturacion) no muestra un efecto terapeutico apreciable sobre la inhibicion de superoxidos, que como se ha mencionado son una de las causas de la inflamacion destructiva. La capacidad reducida de la lactoferrina bovina saturada de hierro 100% para inhibir la expresion y smtesis de las citoquinas proinflamatorias es debida a esta funcion ausente. Tambien se entiende que la lactoferrina bovina utilizable en la invencion puede tener cualquier grado de saturacion de los sitios de union de hierro en el intervalo de entre 0% de saturacion hasta 100% de saturacion, preferiblemente desde 0% (incluyendo este lfmite) hasta 100% (excluyendo este lfmite), mas preferiblemente desde 0% hasta 20% (incluyendo estos lfmites) de saturacion. Es posible utilizar una lactoferrina bovina que tenga un grado espedfico de saturacion o una mezcla de lactoferrinas bovinas con diferentes grados de saturacion. Es particularmente preferido utilizar lactoferrina bovina que tenga un bajo grado de saturacion. Tambien se entiende que los sitios de union para hierro pueden ser ocupados en cualquier grado de saturacion por Fe (III) y/o opcionalmente, con diferentes cineticas y afinidades, por uno o mas de otros metales de transicion que tengan propiedades qrnmicas y ffsicas similares. Estos metales pueden ser por ejemplo uno o mas de entre Zn, Cu, Mn.

El termino "lactoferrina" designa tanto la protema nativa intacta como la protema recombinante intacta, asf como los fragmentos de la protema intacta (nativa o recombinante) que pueden obtenerse mediante su digestion enzimatica o qrnmica. La lactoferrina, altamente preservada en las diversas especies, es una glicoprotema constituida por 692 aminoacidos en la forma humana, con un punto isoelectrico de aproximadamente 9, un peso molecular de aproximadamente 80 kDa, con tres potenciales sitios de glicosilacion. Puede unir reversiblemente dos atomos de Fe (III) por molecula con elevada afinidad (Kd«10-20M) (esta capacidad de formar enlaces con el hierro tambien se mantiene en los lobulos y en los diversos fragmentos descritos anteriormente). La lactoferrina esta presente por ejemplo en la leche y en todas las secreciones humanas y en granulos de neutrofilos. La ventaja de utilizar lactoferrina en vez de otras transferrinas surge de la capacidad de la lactoferrina para formar enlaces con el hierro con una mayor afinidad y a que forma enlaces incluso a valores de pH acidos, que tienen lugar en sitios de infeccion. La lactoferrina puede ser producida en grandes cantidades mediante extraccion de la leche de vaca. En la presente invencion y en los ensayos que se describiran en la presente patente, se utiliza la lactoferrina bovina. Se entiende que la lactoferrina bovina puede ser natural (obtenida mediante extraccion), producida por metodos recombinantes, o una mezcla de los dos tipos. Todos los preparados de lactoferrina bovina, a pesar de tener un grado diferente de saturacion, excepto para la forma completamente saturada con hierro, han mostrado la misma eficacia para inhibir la expresion y la smtesis de las citoquinas inflamatorias como para restablecer la homeostasis de hierro; ademas, el preparado 100% saturado presenta una baja actividad para eliminar el hierro de los tejidos.

Sorprendentemente, tambien se ha descubierto que las mismas propiedades mostradas por la lactoferrina bovina intacta tambien pueden conseguirse utilizando partes individuales de la misma, que pueden ser obtenidas mediante la digestion enzimatica de la protema entera. Por esta razon, se entiende que el uso de la lactoferrina bovina tal y como se define anteriormente puede ser remplazado por el uso de uno o mas de sus fragmentos que pueden obtenerse mediante la digestion enzimatica y la purificacion. Fragmentos preferidos son lobulo N y lobulo C y partes de dichos lobulos, por ejemplo fragmentos aa 86-258 MW 20 KDa y aa 285-692 MW 47 KDa. La expresion "lobulo N" designa la fraccion que tiene un peso molecular (MW) de aproximadamente 33 KDa, que corresponde al fragmento de 1 a 280 y parte de dicho lobulo con un peso molecular de aproximadamente 20 KDa, que corresponde al fragmento del aminoacido 86 a 258 de la lactoferrina intacta digerida enzimaticamente y luego purificada. La expresion "lobulo C" designa la fraccion que tiene un peso molecular de aproximadamente 38 KDa, que se

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corresponde con el fragmento 345-692, y otra fraccion que tiene un peso molecular de 47 KDa, que se corresponde con el fragmento de 285 a 692 de la lactoferrina intacta digerida enzimaticamente y subsiguientemente purificada.

La expresion "composicion o medicamento que comprende lactoferrina bovina" designa una composicion o medicamento que tiene lactoferrina bovina, tal y como se define anteriormente, como su ingrediente activo unico, principal (en terminos de porcentaje por peso o volumen) o minoritario (en terminos de porcentaje por peso o volumen). La lactoferrina bovina puede utilizarse en cualquier forma farmaceutica conocida lfquida, semisolida o solida, para su administracion topica y oral, opcionalmente en combinacion con excipientes o vetuculos farmaceuticamente aceptables. Tambien se entiende que si se requiriera, la lactoferrina bovina puede ser utilizada tambien en asociacion con uno o mas medicamentos convencionales que tengan una actividad antiinflamatoria, antibacteriana (tanto bacteriostatica como bactericida), antiviral, antimicotica, basada en el hierro. Sorprendentemente, se ha descubierto que la administracion topica de la lactoferrina bovina ha conseguido una mayor actividad en los componentes de la inflamacion destructiva y de las infecciones agudas o cronicas, mientras que se ha descubierto que es menos activa en resolver estados de hipoferremia y anemia asociados con inflamacion destructiva. La administracion oral de la lactoferrina bovina sin embargo ha mostrado una marcada actividad tambien en el restablecimiento de la homeostasis del hierro (por lo tanto en resolver estados de hipoferremia y anemia). Por esta razon, el uso topico de la lactoferrina bovina segun la invencion es combinado ventajosamente con su uso oral para obtener un efecto maximo tambien en estados de hipoferremia y anemia asociados con inflamacion destructiva. Formas farmaceuticas preferidas para la administracion topica se seleccionan entre polvos anhidros liofilizados para su uso directo (por ejemplo, polvos liofilizados para espolvorear), disoluciones de base acuosa extemporaneas o listas para usar (por ejemplo, disoluciones para enjuagues o lavados), geles, cremas, comprimidos para disolver en la boca, comprimidos vaginales, pastas de dientes, chicles, productos liofilizados para congelar. La forma farmaceutica de producto liofilizado para ser distribuido directamente en las membranas mucosas orales o vaginales es la forma que ha demostrado la mayor eficacia. Por orden de preferencia decreciente es seguido por comprimidos, cremas o geles y disoluciones extemporaneas. En cuanto a las formas farmaceuticas para la administracion oral, se ha encontrado que todas las formas farmaceuticas conocidas actualmente para ingerir son eficaces. Sin embargo, los mejores resultados en cuanto a resolver infecciones intestinales y tratar hipoferremia y anemia se han obtenido con capsulas o comprimidos que contienen la lactoferrina bovina y, en un grado ligeramente inferior, con lactoferrina bovina disuelta en el momento de su uso en una disolucion acuosa.

Tambien se describe un preparado combinado para la administracion simultanea, secuencial o separada, que comprende como sus componentes activos una primera composicion farmaceutica para administracion topica que comprende lactoferrina bovina, y una segunda composicion farmaceutica para la administracion oral que comprende lactoferrina bovina. Entre las ventajas conseguidas por el preparado segun la invencion esta la ventaja de simultaneamente resolver estados de inflamacion destructiva que ocurren junto con hipoferremia y anemia. Productos y composiciones conocidos actualmente (incluyendo composiciones normales de transferrina no formuladas como un preparado combinado para uso topico y oral) son incapaces de conseguir tal efecto simultaneamente.

Las dos composiciones del preparado pueden ser definidas mediante las mismas caractensticas requeridas y opcionales indicadas en cuanto a las formas farmaceuticas para la administracion topica y/o oral descritas anteriormente en el contexto del uso de la lactoferrina bovina.

Con el fin de obtener un efecto apreciable en todos los componentes de las infecciones agudas o cronicas, inflamacion destructiva, hipoferremia y anemia, es altamente ventajoso seguir el regimen de dosis descrito a continuacion.

Si la primera composicion (topica) esta en una forma solida de dosis unica (por ejemplo tabletas, pastillas y comprimidos vaginales), preferiblemente la cantidad total de lactoferrina bovina administrada esta en el intervalo de 100 mg a 400 mg de lactoferrina bovina al dfa, ventajosamente durante una semana. Tambien se prefiere el mismo intervalo en el caso de composiciones farmaceuticas solidas de dosis multiples (por ejemplo, polvo liofilizado que se ha de recoger en cada caso). Se puede elegir si se administra lactoferrina bovina una vez al dfa o se distribuye en multiples aplicaciones al dfa. Ejemplos preferidos de la primera composicion para la administracion topica son tabletas, pastillas y comprimidos que comprenden de 50 mg a 200 mg de lactoferrina bovina que se administran dos veces al dfa durante una semana, comprimidos vaginales que comprenden de 50 mg a 200 mg de lactoferrina bovina para disolver dos veces al dfa durante una semana, lactoferrina liofilizada para dispersar in situ dos veces al dfa en una cantidad igual a 50-200 mg por aplicacion, durante una semana, lactoferrina liofilizada para congelar y utilizar para masajear las encfas varias veces al dfa en una cantidad igual a 10-30 mg por aplicacion.

Si la primera composicion esta en forma liquida o semisolida de dosis multiple (por ejemplo, una disolucion para enjuagues, geles, cremas), la cantidad de lactoferrina bovina contenida en ella esta comprendida ventajosamente en el intervalo 0,1-10% peso/volumen de la composicion. Es ventajoso permanecer, en este caso tambien, dentro del intervalo de 100-400 mg de lactoferrina bovina al dfa, ventajosamente durante una semana, indicada anteriormente para las composiciones solidas.

Si la segunda composicion (oral) esta en forma solida y de dosis unica (por ejemplo comprimidos), preferiblemente la cantidad total de lactoferrina bovina que se administra esta en el intervalo de 50 mg a 200 mg al dfa, ventajosamente

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durante un mes, mas preferiblemente igual a 200 mg al dfa, ventajosamente durante un mes. Por ejemplo es posible administrar dos veces al dfa polvo anhidro liofilizado que contenga 100 mg de lactoferrina bovina cada uno, durante un mes.

Tambien es ventajoso para la administracion de la primera y segunda composiciones tal y como se define anteriormente que sea fuera de las comidas.

Las cantidades y los tiempos de las dosis indicadas anteriormente (definidas en conjunto como "regfmenes de dosis"), incluyendo los ejemplos espedficos de composiciones topicas y orales, han de ser considerados aspectos validos y preferidos tambien con relacion al uso farmaceutico de lactoferrina bovina y a los correspondientes medicamentos descritos anteriormente.

A modo de ejemplo, la efectividad in vitro de la lactoferrina bovina en el tratamiento de las gingivitis, gingivoestomatitis vmca y parodontopatfas se describe ahora utilizando cultivos de fibroblastos gingivales afectados por bacterias de placa supragingival, por tipo Herpesvirus 1 y bacterias anaerobicas Gram-negativas de placa subgingival, asociados con parodontopatias. La adicion de la lactoferrina bovina reduce la elevada expresion y smtesis de citoquinas proinflamatorias producidas por celulas epiteliales infectadas e inhibe la produccion de superoxidos, que en particular activan NF-kB, que a su vez induce la cascada de citoquinas proinflamatorias. La falta de activacion de NF-kB de este modo impide el dano celular y la consiguiente diseminacion de infecciones microbianas y vmcas. En ensayos in vivo la eficacia de la lactoferrina bovina administrada topicamente y oralmente en el caso de hipoferremia y anemia, para tratar gingivitis, gingivoestomatitis vmca y parodontopatfas es evaluada no solo por un examen objetivo local, sino tambien por parametros clmicos, tales como la concentracion de citoquinas proinflamatorias y hepcidina en la sangre o de esta ultima tambien en la orina, y por parametros hematologicos, con atencion particular a los valores de sideremia y hemoglobina antes y despues del tratamiento. In vivo, la inflamacion reducida debida a la lactoferrina bovina permite a la lactoferrina bovina tambien ser capaz, mediante protemas que modulan la entrada y salida de hierro hacia y desde las celulas (ferroportinas), de quitar el hierro de los tejidos y transferirlo a la circulacion, impidiendo en los tejidos la formacion de superoxidos y al mismo tiempo inhibiendo la replicacion microbiana y restableciendo en la circulacion los valores de sideremia y hemoglobina. Ademas, de nuevo a modo de ejemplo, la eficacia de la lactoferrina bovina para tratar infecciones micoticas de Candida albicam es ilustrada, utilizando cultivos in vitro de fibroblastos como un modelo de micosis orales y utilizando cultivos in vitro de celulas HeLa (derivadas de carcinoma uterino), tambien infectadas por Candida albicans, como modelo de micosis vaginales. En ambos tipos de infeccion, la adicion de la lactoferrina bovina inhibe poderosamente la expresion y la smtesis de la interleuquina-6 por las celulas cultivadas. In vivo, la inflamacion reducida permite a la lactoferrina bovina, mediante protemas que modulan la entrada y salida de hierro hacia y desde las celulas, ser capaz tambien de quitar cl hierro de los tejidos, impidiendo la formacion de superoxidos y al mismo tiempo inhibiendo la replicacion microbiana. En estas infecciones micoticas tambien, en caso de hipoferremia y anemia graves, la administracion topica combinada con la administracion oral en el tratamiento de infecciones gingivales o vaginales de membranas mucosas por mycetes es evaluada no solo con un examen objetivo local sino tambien con parametros clmicos, tales como la concentracion de citoquinas proinflamatorias y hepcidina en la sangre o de esta ultima tambien en la orina, y por parametros hematologicos, con atencion particular a los valores de sideremia y hemoglobina antes y despues del tratamiento.

Ademas, de nuevo a modo de ejemplo, la eficacia de la lactoferrina bovina para tratar infecciones intestinales se ilustra utilizando bacterias intracelulares facultativas tales como Salmonella spp., que infectan cultivos in vitro de celulas intestinales como un modelo de enteritis microbiana. La presencia de la lactoferrina bovina en cultivos celulares infectados inhibe poderosamente la expresion y la smtesis de citoquinas proinflamatorias producida por celulas epiteliales infectadas y de especies de oxfgeno reactivas. La inflamacion reducida permite a la lactoferrina bovina, mediante protemas que modulan la entrada y salida de hierro hacia y desde las celulas, tambien ser capaz de quitar el hierro de los tejidos, impidiendo la formacion de superoxidos, que tambien activan NF-kB. La falta de activacion de NF-kB, que a su vez induce la cascada de citoquinas proinflamatorias, por parte de la lactoferrina bovina, que impide la formacion de superoxidos, de hecho impide el dano celular y consiguiente replicacion microbiana y diseminacion de la infeccion.

En ensayos in vivo, la eficacia de la lactoferrina bovina administrada oralmente para tratar enteritis es evaluada no solo por un examen objetivo, sino tambien mediante parametros clmicos, tales como la concentracion de citoquinas proinflamatorias y de hepcidina en sangre o de esta ultima tambien en la orina, y por parametros hematologicos, con atencion particular a los valores de sideremia y de hemoglobina antes y despues del tratamiento.

El uso de la lactoferrina bovina en la terapia de patologfas infecciosas e inflamatorias de las membranas mucosas humanas, incluyendo membranas mucosas intestinales, vaginales y de la cavidad oral, con particular referencia a gingivitis, infecciones micoticas y vmcas, y parodontopatfas, y la capacidad de aumentar la sideremia y la hemoglobina, son solo algunas de las posibles aplicaciones terapeuticas de la actividad de simultaneamente inhibir la expresion y smtesis de las citoquinas proinflamatorias, produccion de superoxidos y, mediante el transporte de hierro de los tejidos a la circulacion, de restablecer los valores normales de sideremia y hemoglobina descritos en la presente patente. Estas propiedades de la lactoferrina bovina de hecho permiten su uso para tratar muchas otras inflamaciones agudas y recurrentes e infecciones que afecten a las membranas mucosas.

Los ejemplos dados en la presente memoria muestran que la actividad terapeutica con respecto a trastornos infecciosos e inflamatorios de las membranas mucosas posefda por la lactoferrina bovina puede ser utilizada contra trastornos infecciosos e inflamatorios que afecten a las membranas mucosas humanas, incluyendo membranas mucosas intestinales, vaginales y orales, con particular referencia a trastornos seleccionados de entre gingivitis, 5 infecciones micoticas y vmcas, parodontopatias, hipoferremia, anemia y otros trastornos agudos y recurrentes, y puede ser considerada extremadamente ventajosa con respecto a tratamientos actualmente en uso, por ejemplo porque esta caracterizada por el hecho de la falta de toxicidad y porque es la unica sustancia capaz de realizar simultaneamente multiples funciones combinadas, que comprenden especialmente la homeostasis de hierro y de la inflamacion destructiva. En particular, la lactoferrina bovina, al inhibir la smtesis de la interleuquina- 6, 10 consiguientemente impide la smtesis de la hepcidina, modulada por la interleuquina-6, restableciendo la accion de la ferroportina, que de otra forma es inhibida por la hepcidina, cuya actividad permite el transporte de hierro de los tejidos a la circulacion, restableciendo los valores fisiologicos de sideremia y hemoglobina, que es fundamental tanto para la salud del huesped como para la terapia de los trastornos de las membranas mucosas. Ademas, en el caso del tratamiento de parodontopatfas, la lactoferrina bovina sustituye, con una elevada tasa de exito terapeutico, una 15 tecnica cara e invasiva tal como la eliminacion quirurgica de la placa subgingival, que soluciona el problema solo durante periodos breves, despues de los cuales aparecen repetidas recafdas infecciosas e inflamatorias hasta la completa perdida del acoplamiento del diente y la perdida parcial del hueso.

Otras caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes de mejor modo a partir de la descripcion de las siguientes realizaciones preferidas, entendidas meramente a modo de ejemplo no limitador.

20 Como ya se ha mencionado anteriormente, en los ensayos descritos a continuacion se utilizo lactoferrina bovina.

Ejemplo 1

Actividad de la lactoferrina en gingivitis. El regimen experimental utilizado consiste en:

Microorganismos: los microorganismos fueron obtenidos inoculando directamente una placa tomada de un paciente afectado por gingivitis y utilizada a una concentracion microbiana de varios generos microbianos de 107 25 microorganismos/ml.

Monocapa celular: fibroblastos gingivales fueron cultivados hasta que se obtuvo una monocapa semiconfluente de 105 celulas/ml.

Infeccion de la monocapa celular: la monocapa de fibroblastos gingivales fue inoculada con 107 bacterias/ml de placa con el fin de tener una multiplicidad microbiana de infeccion de 100:1 en ausencia o presencia de 60 (xg/ml de 30 lactoferrina bovina saturada en hierro a 15-30% e incubada durante 2 horas a 37°C.

Dosis de expresion de citoquinas: el sobrenadante de la monocapa fue recogido y centrifugado con el fin de eliminar las bacterias. Tras centrifugado repetido, el sobrenadante sin bacteria fue congelado a -20°C para el analisis de la produccion de cualquier citoquina inducida por la infeccion. La monocapa fue sin embargo repetidamente lavada con PBS sin Ca2+y Mg2+con el fin de eliminar tanto las bacterias como cualquier rastro de lactoferrina, en las condiciones 35 en las que fue anadida y lisada con el fin de extraer el ARN de los fibroblastos y probarlos en cuanto a expresion de genes en comparacion con los extrafdos de las celulas no infectadas o celulas infectadas en ausencia de lactoferrina, mediante un Microarray.

Dosis de la produccion de citoquinas expresadas: el sobrenadante conservado se utilizo para dosificar las citoquinas producidas mediante un ensayo enzimatico inmune (ELISA), espedfico para cada una de las citoquinas que se 40 quenan someter a ensayo.

Ensayo superoxido

La produccion de las especies reactivas de oxfgeno se mide anadiendo ferricitocromo c a las celulas epiteliales en cultivo. El ensayo se baso en la reduccion de ferricitocromo c.

Los resultados de los experimentos se resumen a continuacion:

45 Entre los 300 genes que fueron analizados, la infeccion de la monocapa indujo una mayor expresion de genes respecto a las celulas no infectadas en aproximadamente una o dos veces solo para la interleuquina 6, interleuquina 8 y TNF-a. La adicion de lactoferrina redujo la expresion de estas citoquinas, devolviendolas a un valor de expresion normal. El analisis cuantitativo de la smtesis de interleuquina 6, interleuquina 8 y TNF-a confirmo los datos relacionados con la expresion de genes de dichas citoquinas proinflamatorias, tal y como se muestra en la tabla 1.

50 Tabla 1: Expresion y smtesis de la interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8) y TNF-a en fibroblastos gingivales que estan infectados o no con placa supragingival en ausencia o presencia de lactoferrina (60 (xg/ml).

5

10

15

20

25

30

35

40

: Sin lactoferrina Con lactoferrina

: IL-6 IL-8 TNF-a IL-6 IL-8 TNF-a

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 1,5 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0

Smtesis en celulas no infectadas (pg/ml): 90 2.100 22 90 2.100 22

Smtesis en celulas infectadas (pg/ml): 190 4.100 40 105 1.900 29

El valor 1,0 relacionado en la tabla hace referencia a expresion de genes normal, mientras todos los valores > 1,0 indican sobreexpresion de genes. El ligero aumento en la expresion y produccion de IL-6, IL-8 y TNF-a es un indicador de inflamacion fisiologica y esta justificado por el hecho de que la placa es un grupo de bacterias que normalmente colonizan la superficie del diente. La adicion de lactoferrina disminuye tanto la expresion como la smtesis de dichas citoquinas proinflamatorias, deteniendo el proceso inflamatorio que podna evolucionar, danando las celulas.

En cuanto a la produccion de las especies reactivas de oxfgeno, se ha notado una reduccion en la excrecion de superoxidos por celulas infectadas con las bacterias contenidas en la placa en presencia de lactoferrina respecto de las celulas infectadas en ausencia de la glicoprotema. En estos experimented, se anadieron iones de hierro al medio de cultivo a concentraciones en el intervalo de 10 a 100 [xM, es decir, igual a los que ocurren en membranas mucosas en situaciones patologicas.

Correlacion con ensayos in vivo

Entre las tres citoquinas proinflamatorias, es necesario destacar la importancia de la IL-6. En pacientes con gingivitis u otras formas inflamatorias, un aumento de IL-6 en la saliva ha sido determinado respecto de la saliva de pacientes sanos. Tras una semana de tratamiento con 100 mg de lactoferrina en forma liofilizada, aplicada a las membranas mucosas de los arcos dentales mediante el cepillado dos veces al dfa despues de una meticulosa limpieza dental, el valor de IL-6 disminuyo y la inflamacion y el sangrado desaparecieron.

Si los pacientes no mostraban valores alterados de sideremia y hemoglobina, la lactoferrina no se administro oralmente; de otra forma, estos valores volvieron a ser normales tras un mes de tratamiento con 100 mg de 15-30% lactoferrina saturada dos veces al dfa.

Ejemplo 2

La actividad de la lactoferrina en parodontopatfas. El regimen experimental usado consistio en lo siguiente:

Microorganismos: Prevotella intermedia o una placa subgingival, aislada en estricta anaerobiosis de un paciente afectado por parodontopatias, se utilizo con una concentracion de 107 bacterias/ml.

Monocapa celular: fibroblastos gingivales fueron cultivados hasta que se consiguio una monocapa semiconfluente de 105 celulas/ml.

Infeccion de la monocapa celular: la monocapa de fibroblastos gingivales fue inoculada con 107 bacterias/ml de Prevotella intermedia o de bacterias anaerobicas Gram-negativas de la placa subgingival con el fin de tener una multiplicidad de infeccion microbiana de 100:1 en ausencia o presencia de 60 pg/ml de lactoferrina bovina saturada en hierro a 15-30% e incubada durante 4 h a 37°C.

Dosis de expresion de citoquinas: el sobrenadante de la monocapa que fue sometida a infeccion durante 4 h fue recogido y centrifugado con el fin de eliminar las bacterias. Tras repetidos centrifugados, el sobrenadante libre de bacterias se congelo a -20°C para el analisis de la produccion de cualquier citoquina inducida por la infeccion. La monocapa sin embargo fue lavada repetidamente con PBS sin Ca2+y Mg2+ con el fin de eliminar tanto la bacteria como cualquier rastro de lactoferrina, en las condiciones en las que habfan sido anadidas y lisadas con el fin de extraer el ARN de los fibroblastos y probarlos, para expresion de genes, en comparacion con los extrafdos de celulas que no fueron infectadas o fueron infectadas en ausencia de lactoferrina, mediante un Microarray.

Dosis de produccion de citoquinas expresadas: el sobrenadante conservado se utilizo para dosificar las citoquinas producidas mediante un ensayo enzimatico inmune (ELISA) espedfico para cada citoquina que se quena someter a ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

40

Ensayo superoxido

La produccion de especies reactivas de oxfgeno fue medida anadiendo ferricitocromo c a las celulas epiteliales en cultivo. En ensayo se baso en la reduccion de ferricitocromo c.

Los resultados de los experimented se resumen a continuacion:

Entre los 300 genes analizados, la infeccion de la monocapa celular con Prevotella intermedia y con placa subgingival indujo una expresion de genes que fue aproximadamente de 3 a 10 veces mayor que la no infectada por la interleuquina 1-a, interleuquina 1- p, para la interleuquina 6, interleuquina 8, GR01, gR02, GR03, TNF-a, NF-kB, NF-kBIA.

La adicion de la lactoferrina redujo la expresion de todas estas citoquinas, devolviendolas a valores de expresion normales, excepto la IL-8, que aunque se redujo considerablemente aun permaneda sobreexpresada. El analisis cuantitativo de la smtesis, informado solo para las citoquinas mas importantes tales como la interleuquina 1- p, interleuquina 6, interleuquina 8, y TNF-a, confirma los datos relacionados con la expresion de genes de estas citoquinas proinflamatorias, tal y como se informa en la tabla 2.

Tabla 2: Expresion y smtesis de interleuquina 113 (IL-113), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8) y de TNF-a en fibroblastos gingivales infectados o no con Prevotella intermedia en ausencia o presencia de lactoferrina (60 ng/ml).

: Sin lactoferrina Con lactoferritia

: IL-13 IL-6 IL-8 TNF-a IL-13 IL-6 IL-8 TNF-a

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 3,0 9,1 9,5 5,4 0,7 0,4 3,5 1,0

Smtesis en celulas no infectadas: 1.000 90 2.100 22 1.000 90 2.100 22

Smtesis en celulas infectadas: 5.000 900 10.000 120 900 80 5.800 18

El valor 1,0 dado en la tabla hace referencia a una expresion de genes normal, mientras que todos los valores > 1,0 indican sobreexpresion de genes. La expresion y produccion de Gel-1 (3, IL-6, IL-8 y TNF-a por fibroblastos infectados con Prevotella intermed^a es mayor que los observados en la infeccion de fibroblastos gingivales con bacterias de placa. Estos datos indican que la capacidad de penetrar dentro de las celulas del huesped es posefda solo por bacterias anaerobicas Gram-negativas, asociadas con parodontopatfas, tales como Prevotella intermed^a, y no por bacterias adhesivas y no invasivas que inducen gingivitis, causa una respuesta inflamatoria mucho mayor, que puede ser considerada destructiva, tal y como se demuestra cuando las bacterias permanecen in vitro durante mas de 4 h dentro de las celulas. La adicion de lactoferrina reduce considerablemente no solo la expresion y la smtesis de la IL-6, IL-8, y TNF-a, sino tambien de la interleuquina 1-a, interleuquina 1 p, GR01, GR02, GR03, NF-Kb y NF-kBIA, confirmando su gran importancia para devolver los valores de las citoquinas proinflamatorias a valores normales, excepto para IL-8, que podna ser una senal de la permanencia de las bacterias dentro de las celulas huesped. Datos similares se han obtenido utilizando como agente infeccioso las bacterias anaerobicas Gram- negativas que estan presentes en la placa subgingival.

La produccion de superoxidos por las celulas epiteliales es considerable cuando las bacterias entran en la celula en ausencia de lactoferrina, pero es inhibida por la presencia de lactoferrina.

Correlacion con ensayos in vivo

En el fluido crevicular de pacientes con parodontopatias, un aumento de la concentracion de IL-1 p, IL-6 y hierro se observo respecto de pacientes sanos. Tras un tratamiento de un mes con 100 mg de lactoferrina en forma liofilizada, aplicada a las membranas mucosas de los arcos dentales mediante el cepillado dos veces al dfa despues de una limpieza dental meticulosa, el valor de IL-113, IL-6 y de hierro en el fluido crevicular disminuyo junto con la desaparicion del sangrado, de abscesos subgingivales, de inflamacion y el acoplamiento del diente fue restablecido empezando en la tercera semana de tratamiento. Si los pacientes no mostraban valores alterados de sideremia y hemoglobina, no se realizo la administracion oral de lactoferrina; de otra forma, se realizo el tratamiento con 100 mg de lactoferrina saturada a 15-30% dos veces al dfa durante un mes. Tras un mes de esta terapia oral, estos valores

retornaron a lo normal, junto con un descenso de la concentracion de IL-6 y hepcidina en sangre o de hepcidina en orina respecto a antes del tratamiento.

Ejemplo 3

La actividad de la lactoferrina en infecciones debidas al Herpesvirus tipo 1 asociado con parodontopatfas y herpes 5 labial y debido a Herpesvirus tipo 2 asociado con herpes genital. El regimen experimental utilizado consistio en lo siguiente:

Virus

Los ensayos se realizaron utilizando Herpesvirus tipos 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2).

Infeccion vmca de la monocapa.

10 La monocapa celular (fibroblastos o HeLa) fue incubada a 4°C durante 1 h en ausencia o presencia de 500 (xg/ml de lactoferrina con HSV-1 o HSV-2. Despues de que pasara este periodo, la monocapa fue colocada a 37°C.

Dosis de produccion de interleuquina 6

El sobrenadante de los cultivos se sometio a ensayo para determinar la produccion de interleuquina 6 mediante el ensayo de enzima inmune especifico (ELISA)

15 Los resultados de los experimentos estan resumidos a continuacion:

La infeccion de las monocapas con HSV-1 o HSV-2 indujo una mayor secrecion de interleuquina 6 respecto de las no infectadas. La adicion de la lactoferrina redujo considerablemente la expresion y smtesis de las citoquinas inflamatorias y en particular de la interleuquina 6, tal y como esta relacionado en la Tabla 3.

Tabla 3: Expresion y smtesis de interleuquina 6 (IL-6) en fibroblastos gingivales o en celulas HeLa infectadas o no 20 con Herpesvirus tipo 1 y 2.

: Sin lactoferrina Con lactoferrina

: IL-6 IL-6

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 2,5 1,0

Smtesis en celulas no infectadas (pg/ml): 90 90

Smtesis en celulas infectadas (pg/ml)___________________________: 320 110

El valor 1,0 dado en la tabla hace referencia a una expresion de genes normal, mientras que todos los valores >1,0 indican una sobreexpresion de genes. Los datos obtenidos con HSV-1 o HSV-2 son similares.

Correlacion con ensayos in vivo

25 Despues del tratamiento de un mes con 100 mg de lactoferrina en forma liofilizada, aplicada a los arcos dentales mediante cepillado o en la lesion labial o genital dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa, el valor de las citoquinas proinflamatorias, incluyendo IL-6, y de la concentracion de hierro se redujo junto, en el caso de trastornos de la cavidad oral, con la desaparicion de sangrado, de abcesos subgingivales, de la inflamacion destructiva, que puede conllevar la perdida del acoplamiento del diente; mientras que en el caso del herpes labial o genital, la lesion 30 y la correspondiente inflamacion desaparecieron tras 4 o 7 dfas de tratamiento. Si los pacientes no mostraban valores alterados de sideremia y hemoglobina, no se realizo la administracion oral de lactoferrina. En el caso de pacientes con muchas recafdas, se observaron hipoferremia, anemia y valores elevados de IL-6 y hepcidina. En estos casos, se realizo un tratamiento con 100 mg de lactoferrina saturada a 15-30% dos veces al dfa durante un mes. Despues de un mes de la terapia descrita, dichos valores volvieron a ser normales, junto con una reduccion en 35 la concentracion de IL-6 y hepcidina en sangre o de hepcidina en orina respecto a antes del tratamiento.

Ejemplo 4

Actividad de la lactoferrina en micosis de la cavidad oral. El regimen experimental utilizado consistio en lo siguiente:

Microorganismos: una cepa de Candida albicans, aislada clmicamente, fue utilizada con una concentracion igual a 107celulas/ml.

40 Mocapa celular: fibroblastos gingivales fueron cultivados hasta que se obtuvo una monocapa semiconfluente de 105 celulas/ml.

5

10

15

20

25

30

35

40

Infeccion de la monocapa celular: la monocapa de fibroblastos gingivales fue inoculada con 107 C. albicans/ml con el fin de tener una multiplicidad de infeccion igual a 100:1 en ausencia o presencia de 60 pg/ml de lactoferrina bovina saturada en hierro a 15-30% e incubada durante 2 h a 37°C.

Dosis de la expresion de citoquinas: el sobrenadante de la monocapa fue recogido y centrifugado con el fin de eliminar las celulas de C. albicans. Despues de repetidas centrifugaciones, el sobrenadante sin C. albicans fue congelado a -20°C para el analisis de la produccion de cualquier citoquina inducida por la infeccion. La monocapa sin embargo se lavo repetidamente con PBS sin Ca2+ y Mg2+ con el fin de eliminar tanto C. albicans como cualquier rastro de lactoferrina, en las condiciones en la que fue anadida, y lisada con el fin de extraer los ARN de los fibroblastos con el fin de someterlos a ensayo, para expresion de genes, en comparacion con los extrafdos de las celulas infectadas o no infectadas en ausencia de lactoferrina mediante un Microarray.

Dosis de produccion de citoquinas expresadas: el sobrenadante conservado se utilizo para dosificar las citoquinas producidas mediante un ensayo enzimatico inmune (ELISA) espedfico para cada citoquina que se va a someter a ensayo.

Ensayo de los superoxidos

La produccion de las especies reactivas de oxfgeno fue medida mediante la adicion de ferricitocromo c a las celulas epiteliales en cultivo. El ensayo esta basado en la reduccion de ferricitocromo c.

Los resultados de los experimentos estan resumidos a continuacion:

Entre los 300 genes analizados, la infeccion de la monocapa indujo expresion de genes que respecto de las celulas no infectadas fue aproximadamente 2 veces mayor solo por la interleuquina 6. La adicion de la lactoferrina redujo la expresion de IL-6, devolviendola a su valor normal de expresion. Los analisis cuantitativos de la smtesis de la interleuquina 6 confirmaron los datos relacionados con la expresion de genes de dicha citoquina proinflamatoria, tal y como estan relacionados en la tabla 4.

Tabla 4: Expresion y smtesis de la interleuquina 6 (IL-6) en fibroblastos gingivales infectados o no con C. albicans en ausencia o presencia de lactoferrina (60(xg/ml).

: Sin lactoferrina Con lactoferrina

: IL-6 IL-6

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 2,0 1,0

Smtesis en celulas no infetadas (pg/ml): 90 90

Smtesis en celulas infetadas (pg/ml): 240 130

El valor 1,0 dado en la tabla hace referencia a una expresion de genes normal, mientras que todos los valores > 1,0 indican una sobreexpresion de genes. Los valores de la expresion y produccion de IL-6 son mayores que los observados en la infeccion de fibroblastos gingivales con bacterias contenidas en placa. La adicion de lactoferrina, tambien en infecciones debidas a Candida albicans, reduce tanto la expresion como la sintesis de IL-6.

En cuanto a la produccion de especies reactivas de oxfgeno, una reduccion de la excrecion de superoxidos fue observada por parte de las celulas infectadas con Candida albicans en presencia de lactoferrina respecto de las infectadas de nuevo con Candida albicans en ausencia de la glicoprotema.

Correlacion con ensayos in vivo

En la saliva de pacientes afectados por la infeccion con Candida albicans, IL-6 esta presente en una concentracion mayor que la observada en la saliva de pacientes sanos. Despues de una semana de tratamiento con 100 mg de lactoferrina en forma liofilizada, aplicada a los arcos dentales mediante cepillado, dos veces al dfa despues de una limpieza dental meticulosa, el valor de IL-6 disminuyo junto con la desaparicion de la inflamacion y de la infeccion.

Si los pacientes no mostraron valores alterados de sideremia y hemoglobina, no se realizo la administracion oral de la lactoferrina; de otra forma, se realizo la administracion oral de 100 mg de lactoferrina saturada a 15-30% dos veces al dfa durante un mes, obteniendo el restablecimiento de los valores fisiologicos de sideremia y hemoglobina.

5

10

15

20

25

30

35

Actividad de lactoferrina en micosis vaginales. El regimen experimental usado consistio en lo siguiente:

Microorganismos: una cepa de Candida albicans, aislada de un paciente afectado por vaginitis, fue utilizada con una concentration de 107 celulas/ml.

Monocapa celular: celulas HeLa derivadas de carcinoma uterino fueron cultivadas hasta que se obtuvo una monocapa semiconfluente de 105 celulas/ml.

Infeccion de la monocapa celular: la monocapa de fibroblastos gingivales fue inoculada con 107 C. albicans/ml con el fin de tener una multiplicidad de infeccion de 100:1 en ausencia o presencia de 60 (xg/ml de lactoferrina bovina saturada en hierro a 15-30% e incubada durante 2 h a 37°C.

Dosis de la expresion de citoquinas: el sobrenadante de la monocapa fue recogido y centrifugado con el fin de eliminar las celulas de C. albicans. Despues de repetidas centrifugaciones, el sobrenadante sin C. albicans fue congelado a -20°C para el analisis de la produccion de cualquier citoquina inducida por la infeccion. La monocapa sin embargo se lavo repetidamente con PBS sin Ca2+ y Mg2+ con el fin de eliminar tanto el C. albicans como cualquier rastro de lactoferrina, en las condiciones en la que fue anadida y lisada con el fin de extraer los ARN de las celulas HeLa con el fin de someterlos a ensayo, en cuanto su expresion de genes, en comparacion con los extrafdos de las celulas infectadas en ausencia de lactoferrina, mediante un Microarray.

Dosis de produccion de las citoquinas expresadas: el sobrenadante conservado se utilizo para dosificar las citoquinas producidas mediante un ensayo enzimatico inmune (ELISA) espedfico para cada citoquina que se va a someter a ensayo.

Ensayo de los superoxidos

La produccion de las especies reactivas de oxfgeno fue medida mediante la adicion de ferricitocromo c a las celulas epiteliales en cultivo. El ensayo fue basado en la reduccion de ferricitocromo c.

Los resultados de los experimentos estan resumidos a continuacion:

Entre los 300 genes analizados, la infeccion de la monocapa indujo una expresion de genes que comparada con las celulas no infectadas fue aproximadamente dos veces mayor solo para la interleuquina 6. La adicion de la lactoferrina redujo la expresion de IL-6, devolviendola a un valor de expresion normal. El analisis cuantitativo de la smtesis de interleuquina 6 confirmo los datos relacionados de la expresion de genes de dicha citoquina proinflamatoria, tal y como esta relacionado en la tabla 5.

Tabla 5: Expresion y smtesis de la interleuquina 6 (IL-6) por celulas HeLa infectadas o no con C. albicans en ausencia o en presencia de lactoferrina (500 (xg/ml).

: Sin lactoferrina Con lactoferrina

: IL-6 IL-6

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 2,0 1,0

Smtesis en celulas no infectadas (pg/ml).: 90 90

Smtesis en celulas infectadas (pg/ml).: 200 95

El valor 1,0 dado en la tabla hace referencia a una expresion de genes normal, mientras que todos los valores > 1,0 indican una sobreexpresion de genes. La adicion de lactoferrina, en celulas infectadas con Candida albicans, reduce tanto la expresion como la smtesis de IL-6.

En cuanto a la produccion de especies reactivas de oxfgeno, una reduccion de la excrecion de superoxidos por las celulas infectadas con Candida albicans en presencia de lactoferrina fue observada con respecto a las infectadas, de nuevo con Candida albicans, en ausencia de la protema.

Correlacion con los ensayos in vivo

5

10

15

20

25

30

35

En las secreciones vaginales de pacientes afectados por infecciones vaginales apoyada por Candida albicans, IL-6 esta presente en una concentracion mayor que la observada en pacientes sanos. Despues de un tratamiento de una semana con 100 mg de lactoferrina en forma liofilizada, aplicada en la vagina dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa, el valor de IL-6 en la secrecion vaginal disminuyo, y la inflamacion y la infeccion desaparecieron. Si los pacientes no mostraron valores alterados de sideremia y hemoglobina, la administracion oral de lactoferrina no fue realizada; de otra forma la administracion oral de 100 mg de laetoferrina saturada a 15-30% se realizo dos veces al dfa durante 1 mes, obteniendo el restablecimiento de los valores fisiologicos de sideremia y hemoglobina.

Ejemplo 6

Actividad de la lactoferrina en enteritidis. El regimen experimental utilizado consistio en lo siguiente:

Microorganismos: una cepa de Salmonella typhi, aislada clmicamente, fue utilizada a una concentracion de 107 celulas/ml.

Monocapa celular: celulas intestinales, CaCo-2, fueron cultivadas hasta obtener una monocapa semiconfluente de 105 celulas/ml.

Infeccion de la monocapa celular: la monocapa de celulas intestinales fue inoculada con 107 S. typhi/ml con el fin de tener una multiplicidad de infeccion de 100:1 en ausencia o presencia de 60 (xg/ml de lactoferrina bovina saturada en hierro a 15-30% e incubada durante 2 h a 37°C.

Dosis de la expresion de citoquinas: el sobrenadante de la monocapa fue recogido y centrifugado con el fin de eliminar las celulas de S. typhi. Despues de repetidas centrifugaciones, el sobrenadante sin S. typhi fue congelado a -20°C para el analisis de la produccion de cualquier citoquina inducida por la infeccion. La monocapa sin embargo se lavo repetidamente con PBS sin Ca2+ y Mg2+ con el fin de eliminar tanto la S. typhi como cualquier rastro de lactoferrina, en las condiciones en las que fue anadida, y lisada con el fin de extraer los ARN de las celulas CaCo-2 con el fin de someterlas a ensayo, para expresion de genes, en comparacion con las extrafdas de las celulas infectadas en ausencia de lactoferrina mediante un Microarray.

Ensayo de los superoxidos

La produccion de las especies reactivas de oxfgeno fue medida anadiendo ferricitocromo c a las celulas epiteliales cultivadas. El ensayo esta basado en la reduccion de ferricitocromo c.

Los resultados de los experimentos estan resumidos a continuacion:

Entre los 300 genes analizados, la infeccion de la monocapa indujo expresion de genes, que comparada con las celulas no infectadas, fue aproximadamente dos veces mayor solo para la interleuquina 6. La adicion de lactoferrina redujo la expresion de IL-6, devolviendola a un valor de expresion normal. El analisis cuantitativo de la smtesis de interleuquina 6 confirmo los datos relacionados con la expresion de genes de esta citoquina proinflamatoria, tal y como esta relacionado en la tabla 6.

Tabla 6: Expresion y smtesis de interleuquina 1 p interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8) y TNF-a en celulas intestinales infectadas o no con Salmonella typhi en ausencia o presencia de lactoferrina (60 (xg/ml).

: Sin lactoferrina Con lactoferrina

IL-1R: IL-6 IL-8 TNF-a IL-113 IL-6 IL-8 TNF-a

Expresion en celulas no infectadas: 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Expresion en celulas infectadas: 3,0 8,1 9,2 5,0 0,9 0,5 3,0 1,0

Smtesis en celulas no infectadas: 1.000 90 2.100 22 1.000 90 2.100 22

Smtesis en celulas infectadas (pg/ml): 4.500 850 9.000 120 800 80 3.800 15

5

10

15

20

25

30

35

Capsulas para la administracion oral en el tratamiento de hipoferremia y anemia.

Cualquiera que sea la causa de los estados de hipoferremia y anemia, la administradon durante un mes de una capsula que contiene 100 mg de lactoferrina dos veces al dfa restablecio los valores normales de sideremia y hemoglobina. Los datos cuantitativos resultantes estan resumidos en la tabla 7 y pueden ser atribuidos a todos los tratamientos in vivo, a los que hacen referencia a los ejemplos 1, 2, 3, 4, 5 y 6.

Tabla 7: Valores medios de hemoglobina y sideremia de 150 pacientes, antes y despues del tratamiento con 100 mg de lactoferrina 2 veces al dfa.

Antes del tratamiento: Despues del tratamiento con lactoferrina


: 100 mg, 2 veces al dfa

Hemoglobina g/dl: Sideremia (xg/ml Hemoglobina g/dl Sideremia (xg/ml

intervalo y valores
intervalo y valores
intervalo y valores
intervalo y valores

medios
medios
medios
medios

10,1-11,9: 25-64 12,2- 80-130


: 13,5

11,0: 44,5 105,0


: 12,8

Ademas, los valores de hepcidina y de IL-6 evaluados despues de una administradon de lactoferrina durante un mes fueron menores que aquellos anteriores a la terapia. En particular, la hepcidina disminuyo de 160 ng/ml a 100 ng/ml en sangre, y de 1000 ng/mg de creatinina al dfa a 10 ng/mg de creatinina al dfa en orina. En cuanto a IL-6, despues de un mes de tratamiento con lactoferrina, su concentracion en sangre disminuyo de 7,5 en hombres y 5,4 pg/ml en mujeres a aproximadamente 2,4 y 1,2 pg/ml respectivamente.

Ejemplo 8

Producto liofilizado para uso oral. Uso: deposicion de 100 mg de lactoferrina en las membranas mucosas de la cavidad oral dos veces al dfa despues de una higiene oral meticulosa.

Ingrediente activo: 100 mg de lactoferrina liofilizada

Excipientes: bicarbonato sodico 25 mg

citrato sodico 25 mg

Ejemplo 9

Producto liofilizado para uso vaginal. Uso: deposicion de 100 mg de lactoferrina en las membranas mucosas vaginales dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa.

Ingrediente activo: 100 mg de lactoferrina liofilizada.

Ejemplo 10

Disolucion para uso oral. Uso: un enjuague de aproximadamente 10-15 ml dos veces al dfa despues de una higiene oral meticulosa.

Composicion para 100 ml:

Ingrediente activo: disolucion en agua o en disolventes usados normalmente para disoluciones orales que contienen 1% de lactoferrina que se disuelve en el momento de su uso.

Ejemplo 11

Disolucion para uso vaginal. Uso: un lavado de aproximadamente 20-25 ml dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa.

Composicion para 100 ml:

5

10

15

20

25

30

35

Ingrediente activo: disolucion en agua o en disolventes usados normalmente para disoluciones vaginales que contienen 1% de lactoferrina que se disuelve en el momento de su uso.

Ejemplo 12

Gel o crema para uso oral. Uso: aplicacion dos veces al dfa despues de una higiene oral meticulosa.

Composicion para 100 g

Ingrediente activo: se incorpora lactoferrina con una concentracion de 1% en la crema o el gel.

Excipientes: Comun a todos los geles o cremas para aplicacion en membranas mucosas.

Ejemplo 13

Gel o crema para uso vaginal. Uso: aplicacion dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa.

Composicion para 100 g:

Excipientes: comun a todos los geles o cremas para aplicacion en la mucosa vaginal.

Ejemplo 14

Comprimidos para uso topico. Uso: un comprimido para disolver en la boca dos veces al dfa despues de una higiene oral meticulosa.

Composicion para 300 mg:

Ingrediente activo: 100 mg de lactoferrina

Excipientes: benzoato sodico 150 mg

esencia de menta 50 mg

Ejemplo 15

Comprimidos vaginales. Uso: un comprimido para aplicar en la vagina dos veces al dfa despues de una higiene meticulosa.

Composicion para 300 mg:

Ingrediente activo: 100 mg de lactoferrina Excipientes: benzoato sodico 150 mg

bicarbonato sodico 50 mg

Ejemplo 16

Pasta de dientes: Uso: al menos dos veces al dfa.

Composicion para 100 mg Ingrediente activo: 500 mg de lactoferrina

Excipientes: comun a todas las pastas de dientes, mas 50 mg de bicarbonato sodico y 50 mg de citrato sodico. Ejemplo 17

Chicle. Uso: 1 chicle para masticar despues de cada comida Ingrediente activo: 500 mg de lactoferrina Excipientes: goma base 400

citrato sodico bicarbonato sodico hidroxibenzoato

5

10

15

20

25

30

esencias

Producto liofilizado para disolver en agua y congelar. Uso: masaje de las endas dos o mas veces al dfa.

Composicion para 10 ml:

Ingrediente activo. 20 mg de lactoferrina Excipientes: esencias 5 mg Ejemplo 19

Capsulas para tragar. Uso: 1 capsula dos veces al dfa fuera de las comidas.

Composicion por capsula:

Ingrediente activo: 100 mg de lactoferrina Excipientes: bicarbonato sodico 25 mg

Los ejemplos dados anteriormente demuestran la capacidad de la lactoferrina bovina para inhibir la expresion y la smtesis de las citoquinas proinflamatorias por fibroblastos gingivales infectados con bacterias contenidas en una placa, tomadas de un paciente, junto con la actividad de proteger las celulas contra el dano causado por superoxidos, segun un modelo experimental que es descrito, repetible y reproducible. Los ejemplos dados anteriormente demuestran tambien la capacidad de la lactoferrina bovina para inhibir la expresion y la smtesis de las citoquinas proinflamatorias por fibroblastos gingivales infectados con Prevotella intermedia o bacterias anaerobicas Gram-negativas presentes en la placa subgingival, junto con la actividad de proteger las celulas contra danos causados por superoxidos, segun un modelo experimental que es descrito, repetible y reproducible. Los ejemplos dados anteriormente tambien demuestran la capacidad de la lactoferrina bovina para inhibir la expresion y la smtesis de las citoquinas proinflamatorias por fibroblastos gingivales o por celulas HeLa infectadas con Candida albicans, junto con la actividad de proteger las celulas contra danos causados por superoxidos, segun un modelo experimental que es descrito, repetible y reproducible. Los ejemplos dados anteriormente demuestran tambien la capacidad de la lactoferrina bovina para inhibir la expresion y la smtesis de las citoquinas proinflamatorias por parte de las celulas intestinales infectadas con Salmonella spp, junto con la actividad de proteger las celulas contra danos causados por superoxidos, segun un modelo experimental que es descrito repetible y reproducible. En los ensayos in vivo, en todos los casos en los que se encontraron hipoferremia y anemia en la infeccion e inflamacion de las membranas mucosas, antes y despues de la administracion oral de lactoferrina bovina durante al menos un mes, el analisis de IL-6 y de hepcidina en sangre o en orina fue realizado junto con el analisis de los valores hematologicos, para demostrar la eficacia del invento para restablecer la homeostasis del hierro en circulacion y depositado en tejidos.

Aunque en el texto solo se han descrito algunas de las realizaciones preferidas de la invencion, el experto en la tecnica entendera inmediatamente que en cualquier caso es posible obtener otras realizaciones igualmente ventajosas y preferidas.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Lactoferrina bovina para usar en el tratamiento de inflamacion destructiva (patologica) que afecta a membranas mucosas asociada con infeccion aguda o cronica, y opcionalmente asociada con estados de hipoferremia y/o anemia, en donde las membranas mucosas se seleccionan de entre una o mas de membranas mucosas vaginales, anales o de la cavidad orofarmgea y la lactoferrina bovina es para uso topico cuando la inflamacion destructiva (patologica) no esta asociada con hipoferremia y/o anemia, y combinada con el uso oral de lactoferrina bovina cuando la inflamacion destructiva (patologica) esta asociada con hipoferremia y/o anemia, o en donde las membranas mucosas son membranas mucosas intestinales y la lactoferrina bovina es para su uso oral cuando la inflamacion destructiva (patologica) esta asociada con hipoferremia y/o anemia.
2. La lactoferrina bovina para usar segun la reivindicacion 1, en donde el tratamiento comprende obtener simultaneamente los siguientes efectos:

i) una accion bacteriostatica/fungistatica, bactericida/fungicida y una accion que bloquea interacciones tempranas virus-celulas huesped para infecciones vmcas,

ii) restablecimiento de la homeostasis de la inflamacion,

iii) restablecimiento de la homeostasis de hierro,

iv) restablecimiento de los valores fisiologicos de sideremia y hemoglobina.
3. La lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde las infecciones agudas o cronicas asociadas con inflamacion destructiva (patologica) estan seleccionadas de entre una o mas de infecciones micoticas y vmcas en general, infecciones recurrentes causadas por microorganismos presentes en forma adherida, agregada o de biopelfcula y microorganismos que tienen una localizacion intracelular facultativa u obligatoria.
4. La lactoferrina bovina para usar segun la reivindicacion 3, en donde las infecciones agudas o cronicas asociadas con inflamacion destructiva (patologica) se seleccionan de entre una o mas de gingivitis, gingivoestomatitis vmca y parodontopatias.
5. La lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el tratamiento hace referencia a estados en los que la inflamacion destructiva (patologica), hipoferremia, anemia e infecciones agudas o cronicas estan presentes simultaneamente.
6. La lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el tratamiento de la hipoferremia y/o anemia comprende restablecer una distribucion fisiologica de la cantidad de hierro entre tejidos y circulacion.
7. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde la lactoferrina tiene un grado de saturacion de los sitios de union para hierro (III) en el intervalo desde 0% de saturacion hasta 100% de saturacion, preferiblemente desde 0% (limite incluido) hasta 100% (limite no incluido), mas preferiblemente desde 0% hasta 20% (limites incluidos) de saturacion.
8. Lactoferrina bovina para usar segun la reivindicacion 7, en donde el grado de saturacion se obtiene con uno o mas de Fe(III), Zn, Cu y Mn.
9. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde la lactoferrina se selecciona entre uno o mas de lactoferrina nativa intacta, lactoferrina recombinante intacta, lobulo N, lobulo C, secuencia comprendida entre aa 86 y 258 de lactoferrina intacta, y secuencia comprendida entre aa 285 y 692 de lactoferrina intacta.
10. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el uso topico se obtiene mediante polvos anhidros liofilizados para usar directamente en membranas mucosas.
11. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el uso oral se obtiene mediante capsulas o comprimidos que contienen lactoferrina.
12. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el uso topico de la lactoferrina es tal que se administra una cantidad total de lactoferrina en el intervalo entre 100 mg y 400 mg al dfa, durante una semana.
13. Lactoferrina bovina para usar segun la reivindicacion 12, en donde el uso topico tiene lugar mediante polvo liofilizado que se dispersa sobre las membranas mucosas dos veces al dfa en una cantidad igual a 50-200 mg por aplicacion, durante una semana.
14. Lactoferrina bovina para usar segun la reivindicacion 12, en donde el uso topico tiene lugar mediante una forma Ifquida o semisolida de dosis multiple que comprende lactoferrina en el intervalo de 0,1% - 10% peso/volumen total de composicion.
15. Lactoferrina bovina para usar segun una o mas de las anteriores reivindicaciones, en donde el uso oral de la 5 lactoferrina es tal que se administra una cantidad total de lactofeirina de entre 50 y 200 mg al dfa, durante un mes,

preferiblemente igual a 200 mg al dfa, durante un mes.