IT201700002411A1

IT201700002411A1 - Preparazione farmaceutica per il trattamento dell’ipoferremia e dell’anemia sideropenica

Info

Publication number: IT201700002411A1
Application number: IT102017000002411A
Authority: IT
Inventors: Marco Mastrodonato
Original assignee: Bmg Pharma S R L
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2018-07-11

Description

“PREPARAZIONE FARMACEUTICA PER IL TRATTAMENTO DELL’IPOFERREMIA E DELL’ANEMIA SIDEROPENICA”

Campo tecnico dell’invenzione

Il ferro è un elemento essenziale per le cellule viventi, tuttavia, può anche essere tossico quando presenti in eccesso a causa della sua capacità di generare specie reattive dell'ossigeno (ROS), quali anioni superossido e radicali idrossilici.

Dei radicali idrossilici sono note le capacità di danneggiare un numero di componenti cellulari, tra cui: DNA, proteine e lipidi di membrana.

Tutti gli organismi viventi, pertanto, hanno sviluppato strategie che permettono l'acquisizione ed il “deposito” di ferro elementare in una forma prontamente disponibile e non tossica.

A questo proposito, la lattoferrina (Lf) è presente nelle secrezioni mentre la transferrina (Tf) è presente nel siero, affinché una corretta concentrazione di ferro libero (10<-18>M) sia mantenuta nei fluidi evitandone la precipitazione, l’induzione di ROS e la colonizzazione microbica.

Il ferro corporeo totale (50 mg/Kg), corrispondente a circa 3 g nelle donne e 4 g negli uomini ed è principalmente compresa nell'emoglobina, mioglobina e citocromi (2-2,7 g) e in vari enzimi.

Ogni giorno 20 mg di ferro, derivanti principalmente dalla lisi degli eritrociti senescenti, sono utilizzati per la sintesi de novo dell’eme.

L'omeostasi del ferro sistemico è strettamente regolata attraverso il suo assorbimento e stoccaggio.

L’assorbimento di quasi tutto il ferro alimentare (1-2 mg al giorno) avviene nel duodeno prossimale e comprende le seguenti fasi: (i) riduzione del ferro dallo stato ferrico (III) allo stato ferroso (II); (ii) l'assorbimento apicale da parte degli enterociti seguito da trafficking transcellulare; e (iii) efflusso basolaterale attraverso il trasportatore del ferro ferroso ferroportina (FPN).

Il destino del ferro assorbita dagli enterociti può essere sia di immagazzinamento, come la ferritina, seguito da escrezione attraverso le feci o per trasferimento di plasma.

Una volta in circolazione il ferro si lega alla transferrina (Tf) e viene trasportato presso i tessuri di utilizzo (precursori degli eritroidi) e di immagazzinamento (epatociti).

L’assorbimento eccessivo causa sovraccarico di ferro nei tessuti parenchimali, mentre un basso assorbimento di ferro porta ad una carenza plasmatica di ferro, che si manifesta come ipoferremia (carenza di ferro o Iron Definciency –ID-) e anemia da carenza di ferro o anemia sideropenica (Iron Definciency Anaemia –IDA-).

L’ID è la carenza nutrizionale più comune, che colpisce circa due miliardi di persone in tutto il mondo, identificata dalla Organizzazione Mondiale della Sanità come uno dei 10 fattori di rischio per la malattia, disabilità e morte.

In gravidanza, sia l’ID sia l’IDA rappresenta un elevato fattore di rischio per la salute materna ed infantile, che può includere un parto prematuro, un ritardo di crescita fetale, un basso peso alla nascita o una minore salute neonatale inferiore.

Tal complicanze della gravidanza si pensa si verifichino come conseguenza di un aumento delle richieste di ferro, in relazione all’aumento di volume del sangue e dello sviluppo della placenta.

Sono note tre possibili modalità per prevenire e controllare lo sviluppo dell’ID e dell’IDA.

Questi comprendono: la diversificazione della dieta, la fortificazione degli alimenti e la supplementazione individuale.

In ogni caso, il trattamento preferito di queste patologie consiste nella somministrazione orale di ferro solfato ferroso.

La grande quantità di solfato ferroso da somministrare ai soggetti che soffrono di ID o ISA è dovuta alla scarsa biodisponibilità del ferro inorganico; inoltre, la somministrazione orale di ferro solfato causa molti problemi, tra cui disturbi gastrointestinali, nausea, vomito, diarrea, costipazione, e, a volte, un aumento della suscettibilità alle infezioni.

Omeostasi sistemica del ferro

A differenza dell’omeostasi cellulare del ferro, la regolamentazione sistemica del ferro comporta meccanismi complessi che solo recentemente hanno iniziato ad essere caratterizzati.

Differenti tipi di cellule sono in possesso di modalità distinte per l'acquisizione del ferro, mentre un solo percorso è comune l'esportazione di ferro nel sangue. Per quanto riguarda i diversi tipi di cellule, gli enterociti duodenali sono coinvolti nell'acquisizione del ferro dalla dieta, gli epatociti sono il deposito principale di ferro, i macrofagi riciclano il ferro dalla lisi dei globuli rossi senescenti, e, infine, il sinciziotrofoblasto placentare è impegnato nel trasporto del ferro dalla madre al feto attraverso la placenta.

Gli epatociti, le cellule placentari ed i macrofagi importano il ferro legato alla Tf dalla circolazione utilizzando TFRs, mentre gli enterociti possono acquisire il ferro presente negli alimenti come eme o ferro elementare.

L’eme viene importato nell’intestino da meccanismi sconosciuti, mentre il ferro elementare Fe (III) viene convertito dalla parte apicale delle cellule duodenali a Fe (II) da una ferroriduttasi (citocromo B duodenale, DCYTB) e trasportato nelle cellule da DMT1. È stato dimostrato che il DMT1 è necessaria per il trasporto del ferro intestinale e di altri metalli bivalenti (zinco, manganese, cobalto, cadmio, rame, nichel) o per il suo rilascio ai precursori degli eritroidi, mentre non è cruciale per il trasferimento di ferro materno al feto attraverso la placenta. Il ferro assorbito dal DMT1 entra nel citoplasma degli enterociti dove può essere immagazzinato nella ferritina o esportato nel plasma dall'esportatore ferro basolaterale FPN. Questa proteina, l'unico esportatore noto del ferro cellulare dai tessuti al sangue, è stato trovato in tutti i tipi cellulari che sono coinvolti nella esportazione di ferro, comprese le cellule duodenali, gli epatociti, i macrofagi e le cellule placentari.

La delezione tessuto-specifica del gene FPN provoca un accumulo di ferro negli enterociti, epatociti e soprattutto nei macrofagi, che richiedono FPN per riciclare efficacemente il ferro dagli eritrociti lisati.

Il FPN ha un peso molecolare di 67 kDa e 12 domini transmembrana e sembra funzionare come dimero.

La sintesi di FPN è modulata da meccanismi trascrizionali e post-trascrizionali.

IRE/IRP regolano l’mRNA FPN

Il FPN trasporta il Fe (II), che viene convertito in Fe (III) da una ossidasi multirame, comprese ceruloplasmina ed epaestina, utilizzando ossigeno come accettore di elettroni.

In assenza di una ferrossidasi, il ferro non viene esportato attraverso FPN. È un dato di fatto, soggetti portatori di mutazioni nel gene della ceruloplasmina mostrano un sovraccarico di ferro nei tessuti parenchimali e, in assenza di epaestina, il ferro rimane all'interno della mucosa.

Un altro componente chiave del metabolismo del ferro sistemica è la epcidina, un ormone peptidico circolante sintetizzato dagli epatociti e secreta nel plasma e nelle urine.

E’ stato riportato che l’mRNA dell’epcidina è anche presente nel cuore, pancreas e nelle cellule ematopoietiche, anche se la rilevanza biologica di questa espressione non è chiarita.

La forma attiva di epcidina, derivata da un precursore 84 aminoacidi, è un peptide di 25 aminoacidi contenente otto residui cisteina.

L'epcidina umana bioattiva è un peptide di 25 aminoacidi prima identificati nelle urine umane e nel plasma. L'urina contiene anche forme minori 20 e 22-ammino-acidi troncate all'estremità N-terminale.

L'epcidina regola l'ingresso di ferro nel plasma attraverso FPN.

L’epcidina, legandosi all’FPN, provoca la sua fosforilazione, internalizzazione e la degradazione nei lisosomi, impedendo così l'esportazione di ferro e la valorizzazione del ferro citosolico immagazzinato nella ferritina. Pertanto, l’aumentata espressione di epcidina porta a IDA.

L'espressione di epcidina può essere regolata in diversi modi; condizioni di ipossia diminuiscono l’espressione di epcidina, con conseguente aumento delle esportazioni di ferro nel plasma.

Inoltre, la produzione di epcidina è anche soppressa quando i depositi di ferro sono bassi, e di conseguenza, il FPN viene espresso sulle membrane basolaterali degli enterociti consentendo il trasporto del ferro nel plasma.

Al contrario, quando i depositi di ferro sono adeguati o alti o anche quando il ferro orale o parenterale è alto, il fegato produce epcidina, che circola all'intestino tenue ostacolando così l'esportazione di ferro per la circolazione.

Allo stesso modo, nei macrofagi il riciclo di globuli rossi senescenti, la degradazione dell’FPN indotta dall’epcidina risulta nell’intrappolamento di ferro da parte dei macrofagi.

Inoltre, l’epcidina può essere notevolmente indotta dallo stato infiammatorio.

In particolare, l’interleuchina-6 (IL-6) e probabilmente altre citochine, inducono la trascrizione del gene dell’epcidina negli epatociti.

L’attivazione trascrizionale si verifica in risposta al legame del trasduttore di segnale e dell’attivatore di trascrizione-3 (STAT3) al promotore del gene dell’epcidina.

Una maggiore espressione del gene dell’epcidina e la conseguente diminuzione dei livelli di FPN risultano in una concentrazione plasmatica ridotta di ferro.

L’ipoferremia in questo caso è caratterizzata da ritenzione di ferro nella mucosa intestinale e nei macrofagi. L'incapacità di esportare il ferro porta ad una diminuzione del pool di transferrina serica Fe (III) e ad una eritropoiesi ferro-limitata.

Infatti, il ferro e l'infiammazione sono stati entrambi indicati sopprimere l'espressione dell’mRNA di FPN indipendentemente dall’epcidina.

Pertanto, la disregolazione di epcidina, FPN, ceruplasmina o epaestina risultano in un insieme di disordini del ferro. Nei disturbi infiammatori enelle infezioni, l’up-regolazione dell’epcidina IL-6 indotta e la down-regolazione della ferroportina contribuiscono allo sviluppo di anemia di infiammazione, caratterizzata da ipoferremia e anemia nonostante adeguate riserve di ferro.

Considerati insieme questi dati, una terapia efficace per curare l’ipoferremia e l’anemia da carenza di ferro devono modulare l’epcidina e l’espressione di ferroportina.

Si indica con ipoferremia uno stato di carenza di ferro con bassi valori di ferro totale sierico (30 mg/dl o meno) e di ferritina sierica (12 ng/ml o meno), mentre si indica con anemia sideropenica una condizione in cui per il numero di globuli rossi (<4.000.000) e concentrazione di emoglobina (11 g/dl o meno).

Ipoferremia e anemia sideropenica in gravidanza La gravidanza è caratterizzata da un fabbisogno incrementato di ferro, come sopra detto a causa di un incremento del volume di sangue e dello sviluppo dell'unità feto-placentare.

L’ipoferremia e l’anemia sono condizioni ancora prevalenti tra le donne incinte nei Paesi in via di sviluppo e nei Paesi industrializzati, e rappresentano un importante fattore di rischio per la salute materna e infantile.

Il grado di ID fetale, tuttavia, non è sempre così grave come quella in madre; il trasferimento di ferro dalla madre al feto è supportato da un sostanziale aumento nell'assorbimento del ferro materno durante la gravidanza ed è regolato dalla placenta.

La maggior parte del trasferimento di ferro per il feto si verifica dopo la 30a settimana di gestazione e probabilmente coinvolge l’espressione placentare di quelle proteine note per essere in grado di mediare l'omeostasi del ferro sistemico.

Il sinciziotrofoblasto placentare acquisisce il ferro ferrico legato alla transferrina a livello della membrana apicale attraverso il TFR-1, la cui sintesi aumenta nelle donne in gravidanza che soffrono di ID e IDA.

L’FPN si trova sulla basale membrana placentare fetale esposta, coerentemente con l’unidirezionalità madre-feto del trasporto del ferro.

La ferritina è fortemente espressa nello stroma e contribuisce ad accumulo di ferro nei tessuti fetali.

Al contrario, la ferritina sierica materna di solito diminuisce notevolmente tra la 12° e la 25° settimana di gestazione, probabilmente come risultato dell’utilizzazione del ferro per l'espansione della massa dei globuli rossi materni.

In concomitanza con la maggiore trasporto del ferro placentare-fetale, controllata da epcidina fetale, si osserva anche un aumento dell'espressione di FPN placentare.

Pertanto, analogamente alla regolazione del ferro nell’omeostasi sistemica, alti livelli di epcidina potrebbero indurre l’internalizzazione e la degradazione placentare di FPN, diminuendo così il trasporto di ferro al feto.

È stato riportato che l’epcidina aumenta la sintesi durante l'infiammazione, principalmente per effetto stimolatorio della IL-6 sul promotore dell’epcidina.

Un’aumentata produzione di epcidina porta ad una diminuzione del livello di ferro nel plasma, contribuendo così all’ipoferremia e all’induzione dell’anemia.

Da un altro punto di vista, sono stati confrontati i livelli di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, sintetizzate dalle cellule del sangue periferico in casi di gravidanze non complicate e in casi di aborto spontaneo ricorrente non spiegabile.

E’ stato osservato che nelle donne che hanno avuto aborti spontanei ricorrenti inspiegabili avevano un aumento significativo dei livelli di citochine proinfiammatorie rispetto alle donne con gravidanze normali in fasi simili della gravidanza.

Inoltre, è stato dimostrato che livelli significativamente più elevati di IL-6 (0-77 pg/ml) sono presenti nel plasma delle pazienti con preeclampsia rispetto alle donne sane in gravidanza (0-19 pg/ml).

Nel complesso, questi dati suggeriscono fortemente che l'aumentata espressione di citochine pro-infiammatorie, tra cui l'IL-6, che si verificano durante la gravidanza potrebbe svolgere un ruolo nella creazione di disturbi dell'omeostasi del ferro sistemici, quali l’ID e l’IDA.

Alla luce di queste osservazioni, il trattamento di ID e IDA durante la gravidanza e dopo il parto dovrebbe essere completamente riconsiderato tenendo conto non solo del maggiore volume di sangue e dello sviluppo dell’unità di placentare fetale, ma anche il ruolo fondamentale dei fattori che regolano il trasporto di ferro dai tessuti al sangue (FPN e epcidina).

Lattoferrina

La lattoferrina (Lf) è una glicoproteina che appartiene alla famiglia transferrina, sintetizzata dalle ghiandole esocrine e dai neutrofili nei siti infezioni e infiammazioni.

E’ presente in tutte le secrezioni umane quali le lacrime, la saliva, le secrezioni seminali e vaginali, ed il latte (nei mammiferi), in cui raggiunge la più alta concentrazione corrispondente a (12 mg/ml).

Analogamente alla transferrina, la lattoferrina è una proteina bi-lobata in grado di chelare due ioni di ferro per molecola ad alta affinità (Kd W10/20 M).

Diversamente dalla transferrina, che rilascia ferro a pH 6,5, la lattoferrina mantiene il ferro a pH inferiore a 4, pH tipico di siti di infezione e di infiammazione.

La concentrazione di ferro libero nei fluidi e nei tessuti corporei non può superare 10<-18>M, al fine di evitare la precipitazione di questo metallo nella forma di idrossidi insolubili, impedire la formazione di specie reattive dell'ossigeno ed inibire la crescita microbica.

Negli esseri umani, la lattoferrina controlla la concentrazione di ferro nei fluidi e nei tessuti corporei, mentre la transferrina controlla il ferro nel siero attraverso la sua capacità di chelare due ioni ferrici per molecola.

La lattoferrina è una proteina cationica con punto isoelettrico (PI)> 9,0, mentre la transferrina ha un PI circa 6,0.

In vivo, in condizioni fisiologiche, la lattoferrina, essendo satura di ferro circa del 20%, è in grado di chelare il ferro ferrico.

In condizioni patologiche (emorragia, danno cellulare, inibizione del trasporto del ferro dai tessuti al sangue etc., sovraccarico di ferro nella secrezione e nei tessuti etc) la concentrazione di ferro in secrezione e nei tessuti aumenta e la lattoferrina chela il ferro saturandosi.

Se la concentrazione di ferro è molto elevata e la lattoferrina è satura, il ferro libero resta disponibile.

Riassunto dell’invenzione

La presente invenzione si basa sull’aver sorprendentemente trovato che l’associazione fra lattoferrina e ferro, particolarmente nella forma microincapsulata, può svolgere un ruolo importante nel trattamento dell’ID e dell’IDA.

Oggetto dell’invenzione

Un primo oggetto dell’invenzione è rappresentato da una preparazione farmaceutica comprendente lattoferrina e ferro in associazione.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, la composizione descritta trova impiego per uso medico e, in un aspetto preferito dell’invenzione, nel trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro.

In un aspetto particolare, il trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro è diretto a donne in gravidanza.

Tale ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro (IDA) possono essere inoltre associate ad una condizione infiammatoria.

In un ulteriore oggetto, l’invenzione descrive un metodo per il trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro comprendente la somministrazione della preparazione dell’invenzione.

Breve descrizione delle figure

La figura 1 mostra l’inter-ruolo della lattoferrina con proteine chiave dell'omeostasi del ferro sistemico;

la figura 2 mostra il percorso della lattoferrina una volta assorbita;

le figure 3, 4 e 5 riportano i dati di evidenze sperimentali menzionate nella descrizione della presente invenzione.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

In accordo con il primo oggetto dell’invenzione è descritta una preparazione farmaceutica comprendente lattoferrina e ferro in associazione.

In particolare, per gli scopi della presente invenzione, la lattoferrina è presente in una quantità di circa 50-500 mg e preferibilmente di circa 150-250 mg, essendo 200 mg un dosaggio ancor più preferito.

La lattoferrina compresa nella preparazione dell’invenzione è preferibilmente preparata per liofilizzazione.

Secondo un aspetto preferito, per gli scopi della presente invenzione, la lattoferrina dell’invenzione di origine bovina (Blf).

Secondo un aspetto particolare, la lattoferrina dell’invenzione è in forma microincapsulata.

Preferibilmente, nella forma microincapsulata, la lattoferrina è presente in una concentrazione di circa il 30-50% (peso/peso) ed ancor più preferibilmente di circa il 40% (peso/peso).

Per quanto concerne il ferro, questo è compreso preferibilmente in una quantità di circa 200-400 mg ed ancor più preferibilmente di 300-325 mg (ferro biodisponibile: 30 mg).

Secondo un aspetto preferito, il ferro è preferibilmente microincapsulato.

In un aspetto dell’invenzione, il ferro è nella forma Fe (II) o (III) ed è preferibilmente sotto forma di sale pirofosfato, fumarato o solfato; più preferibilmente è nella forma Fe (III) come ad esempio il sale pirofosfato.

Secondo un aspetto particolare, il ferro della preparazione dell’invenzione è in forma microincapsulata.

Con il termine microincapsulato si intende che la lattoferrina e/o il ferro sono incapsulati in un materiale opportuno.

Tale materiale è preferibilmente impermeabile all’umidità e all’aria ed è ancor più preferibilmente scelto nel gruppo che comprende: cere, grassi, polimeri e composti resinosi.

I materiali sopra indicati possono essere di origine animale o vegetale.

In particolare tale materiale ha preferibilmente un punto di fusione inferiore a circa 70-75°C.

Ad esempio, tale materiale può essere rappresentato da cera d’api, cera carnauba, cera candellilla, shellac; acido laurico, acido caprico, acido miristico, acido stearico, glicerildistearato, glicerilmonostearato, glicerilstearato, esteri acido behenico, glicerina dibehenato, acido palmitico, stearina, olio di semi di cotone, stearina, olio di soia, olio di palma idrogenato, grassi idrogenati dell’olio di cocco esterificati con PEG; alginati, etc.

In un aspetto preferito dell’invenzione, la microincapsulazione è ottenuta grazie all’impiego di gomma arabica, lecitina (es. lecitina di girasole, lecitina di soia), amido modificato, grassi.

La microincapsulazione può portare ad un rapporto lattoferrina/rivestimento di circa 1:3 in peso (25% lattoferrina, 75% rivestimento).

Non si esclude, inoltre, che l’incapsulazione possa produrre un effetto di rilascio prolungato della lattoferrina dalla preparazione dell’invenzione.

L’incapsulazione è ottenuta preferibilmente secondo una tecnica del gruppo che comprende: coating, spray-chilling coating, tecniche a letto fluido.

Alternativamente all’incapsulazione, è possibile che la lattoferrina e/o il ferro siano nella forma liposomale.

In un aspetto dell’invenzione, la preparazione descritta comprende ulteriormente carnosina.

La preparazione dell’invenzione, inoltre, comprenderà uno o più veicolanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili e adatti agli scopi dell’invenzione.

Secondo la presente invenzione, la preparazione descritta è impiegata per uso medico.

In particolare, l’uso medico riguarda il trattamento di stati caratterizzati dalla carenza di ferro nel sangue.

Tali stati includono, in particolare: l’ipoferremia e l’anemia da carenza di ferro (IDA).

Secondo un aspetto preferito, il soggetto affetto da tali condizioni è una donna e, ancora più preferibilmente, una donna in gravidanza.

In un aspetto ulteriore, lo stato di carenza di ferro nel sangue e accompagnato da uno stato infiammatorio.

Secondo un aspetto preferito, tale stato infiammatorio è caratterizzato da valori sierici dell’interleuchina 6 (IL-6) IL-6 maggiore di circa 19 pg/ml e preferibilmente compreso fra circa 19 e 77 pg/ml.

In un aspetto ulteriore dell’invenzione, il soggetto che può assumere la preparazione dell’invenzione è un soggetto dializzato.

In aspetti ulteriori, il soggetto soffre di patologie infettive croniche scelte nel gruppo che comprende: HIV, epatite C o è conseguente alla fibrosi cistica; oppure è un soggetto che soffre di diabete o di ipertensione.

In un ulteriore aspetto, il soggetto a cui è destinata la preparazione dell’invenzione è un soggetto non allergico al latte vaccino.

La preparazione dell’invenzione può essere assunta uno o due volte, preferibilmente due volte al giorno fra i pasti principali.

In un ulteriore oggetto, la presente invenzione descrive un metodo per il trattamento di stadi caratterizzati da carenze di ferro nel sangue comprendente la fase di somministrare la preparazione dell’invenzione secondo uno o più degli aspetti sopra dettagliati.

ESEMPIO 1

Un primo studio è stato condotto per confrontare l'efficacia della somministrazione orale di 520 mg/die di solfato ferroso (terapia tradizionale) con quella esercitata dalla lattoferrina (100 mg 2 volte al giorno, prima dei pasti), in donne incinta affette da ID o IDA.

Allo studio sono ammesse donne di età compresa fra 20 e 35 anni, senza gravi patologie concomitanti e in trimestri differenti di gravidanze fisiologiche affette da ID o IDA (i soggetti hanno fornito il consenso informato).

Le principali patologie concomitanti come le gravidanze patologiche

Pazienti: nel corso di un periodo di studio di 12 mesi, 300 soggetti affetti da ID o IDA sono stati inizialmente arruolati. 31 soggetti sono stati esclusi o persi per l'analisi, 4 spostati o sono stati persi al follow-up dopo 30 giorni di supplementazione di ferro per via orale, 3 hanno avuto aborti spontanei e 3 sono stati esclusi per altri motivi.

Pertanto, delle 300 donne iniziali, le 259 sono state divise in tre gruppi:

GRUPPO A: gruppo di controllo. 54 le donne che rifiutano la supplementazione di ferro per via orale.

GRUPPO B: 98 donne riceventi somministrazione orale di 520 mg di solfato ferroso 1 volta al giorno GRUPPO C: 107 donne riceventi per via orale 1 capsula di 100 mg di lattoferrina, due volte al giorno prima dei pasti.

Tenendo conto le seguenti definizioni:

Ipoferremia: ferro sierico totale corrispondente a 30 µg/dl o meno.

Anemia: emoglobina corrispondente a 11 g/dl o meno.

Risultati

In tutte le donne incinte arruolate, l'emoglobina ed il ferro totale nel siero sono riportati come media e valori mediani, al momento dell'iscrizione (tempo 0) e dopo 30 giorni (Tabella 1).

Nelle donne a 12-17 settimane di gravidanza che rifiutano il trattamento, la mancanza di supplementazione di ferro non ha influenzato significativamente i valori di emoglobina e ferro sierico totale, mentre una significativa diminuzione dell’emoglobina e dei valori totali sierici del ferro è stata osservata nelle donne a 18-31 settimane di gravidanza (P <0.01).

In tutte le donne trattate, l'emoglobina e valori totali di ferro del siero, hanno mostrato un aumento significativo (P <0,01) dopo 30 giorni di trattamento, indipendentemente dalla settimana di gravidanza.

Tuttavia, nelle donne in gravidanza riceventi solfato ferroso, l'aumento di emoglobina e ferro sierico totale valori medi (0,9 g/dl e 8,0 mg/dl, rispettivamente) è stato inferiore a quello osservato in donne riceventi lattoferrina (1,5 g/dl e 54,2 mg/dl, rispettivamente).

Tabella 1

t0 dopo 30 ggvalore medio valore medio

20

18-A 11,2 36,5 10,6 26,5

23 20 (10,7- (30- (10,5- (25-

24-11,0 38,5 10,2 23,0 31

14 (10,9- (33- (10,0- (20-11,2) 44) 10,4) 26) 12-10,3 40,0 11,2 52,5 17

31 (10,0- (33- (11,0- (45-10,7) 47) 11,5) 60) 18

B<23>10,8 52,0 11,9 63,0

32 (10,2- (48- (11,9- (58-

24-11,248,5 11,9 59,0

31

35 (10,7- (33- (11,5- (48-11,8) 64) 12,3) 70)

12-11,0 44,5 12,8 110,0

17

38 (10,1- (25- (12,2- (80-

11,9) 64) 13,5) 140)

C 18-11,2 46,5 12,5 93,0

23

27 (10,7- (27- (12,0- (70-

11,8) 65) 13,0) 116)

24-11,1 47,0 12,8 97,5

31

42 (10,6- (30- (12,8- (85-

11,7) 64) 13,0) 110)

Per valutare la significatività dei dati ottenuti, i valori di differenza sono stati calcolati sottraendo i valori mediani di emoglobina e ferro totale nel siero, dopo 30 giorni, con o senza trattamento, da quelle rilevate al tempo 0 (Tabella 2).

La differenza nei valori di emoglobina e ferro sierico totale nelle donne in gravidanza trattate con solfato ferroso o lattoferrina erano significativamente più alti di quelli osservati nelle donne in gravidanza non trattate (Tabella 2).

La differenza nei valori di ferro sierico totale ottenuta nel gruppo trattato con lattoferrina rispetto al gruppo trattato con ferro solfato era significativa, mentre quelli per l’emoglobina non hanno raggiunto significatività (Tabella 2).

Valori differenziali medi (intervallo)

soggetti emoglobina ferro totale (g/dl) serico (µg/dl) -0,4 -10,2

GRUPPO A (0 - -0,8) (-0,5 - -15,5)

0,9 8,0

GRUPPO B (0,7 – 1,1) (10,5 – 12,5)

1,5 54,2

GRUPPO C (1,3 – 1,8) (46,5 – 65,5)

P values:

(a) versus <0,01 <0,01

(b) versus 0,02 <0,01

ESEMPIO 2

Un secondo studio clinico è stato condotto per saggiare l'efficacia della somministrazione orale di lattoferrina (100 mg 2 volte al giorno, prima dei pasti), nelle donne incinta che soffrono di ID o IDA, dall'inizio dell’ipoferremia e anemia sideropenica, fino alla fine dello studio.

Allo studio sono ammesse donne di età compresa fra 20 e 39 anni, senza gravi patologie concomitanti e in trimestri differenti di gravidanze fisiologiche affette da ID o IDA (i soggetti hanno fornito il consenso informato).

PAZIENTI: 90 donne incinte che soffrono di ipoferremia e carenza di ferro sono state trattate con la somministrazione orale di lattoferrina (100 mg 2 volte al giorno, prima dei pasti).

Nessuno donna incinta è stata esclusa da questo studio clinico.

Tenendo conto le seguenti definizioni:

Ipoferremia: ferro sierico totale corrispondente a 30 mg/dl o meno

Anemia: emoglobina corrispondente a 11 g/dl o meno.

Ferritina sierica corrispondente a 12 ng/ml o meno.

Numero di globuli rossi <4.000.000

Al termine, il numero di globuli rossi, la concentrazione di emoglobina, ferro sierico totale, ferritina sierica e la percentuale di ematocrito sono riassunti nella Tabella 3, che riporta i valori ematologici di 90 donne in gravidanza trattate con lattoferrina per os dall'inizio dell’ID e IDA fino al termine.

Globuli Emoglobina Ferro Ferritina Ematocrito rossi g/dl serico serica % (X 10<3>) valori medi totale ng/dl valori medi valori medi µg/dl valori medi

4255 12,5 110 33,5 38

ESEMPIO 3

Un terzo studio clinico è stato condotto per confrontare l'efficacia della somministrazione orale di lattoferrina (100 mg 2 volte al giorno, prima dei pasti), nelle donne incinta che soffrono di ID o IDA, con quella esercitata da 520 mg/die di solfato ferroso, che controllano tutti i valori ematologici.

I pazienti hanno fornito il proprio consenso informato.

Tenendo conto le seguenti definizioni:

Ipoferremia: ferro sierico totale corrispondente a 30 mg/dl o meno

Anemia: emoglobina corrispondente a 11 g/dl o meno.

Ferritina sierica corrispondente a 12 ng/ml o meno.

Numero di globuli rossi <4.000.000

PAZIENTI: 143 donne incinte che soffrono di ipoferremia e anemia da carenza di ferro sono state trattate con la somministrazione orale di solfato ferroso. 8 donne gravide sono state escluse per effetti collaterali durante la somministrazione orale di solfato ferroso; pertanto, di 143 donne in gravidanza, 135 appartenevano ai gruppi:

Gruppo 1: 33 donne incinte che rifiutano la supplementazione di ferro per via orale (gruppo di controllo).

Gruppo 2: 50 donne hanno ricevuto per somministrazione orale 520 mg di solfato ferroso una volta al giorno.

Gruppo 3: 52 donne hanno ricevuto per via orale 1 capsula da 100 mg di lattoferrina, due volte al giorno prima dei pasti

I dati ottenuti sono riassunti come valori medi e mediani del numero di globuli rossi, la concentrazione di emoglobina, ferro totale siero e ferritina sierica in Tabella 4 (si veda la tabella di figura 3). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test ANOVA.

ESEMPIO 4

Un quarto studio clinico è stato condotto per ottenere ulteriori informazioni sul ruolo di lattoferrina per os nell'influenzare l’omeostasi a livello sistemico del ferro.

Per questo scopo, l'efficacia della somministrazione orale di lattoferrina (100 mg 2 volte al giorno, prima dei pasti), in donne incinta che soffrono di ID o IDA è stata confrontata con quella esercitata dalla somministrazione orale di 520 mg/die di solfato ferroso, controllando tutti i valori ematologici e la concentrazione sierica di IL-6 prima e dopo 30 giorni di trattamenti.

Il gruppo di controllo era costituito da donne in gravidanza che rifiutano qualsiasi tipo di terapia Allo studio sono ammesse 143 donne di età compresa fra 20 e 39 anni, senza gravi patologie concomitanti e in trimestri differenti di gravidanze fisiologiche affette da ID o IDA (i soggetti hanno fornito il consenso informato).

Ipoferremia e anemia sono definite rispettivamente da:

1. ferro sierico totale corrispondente a 30 mg/dl o meno

2. La ferritina sierica corrispondente a 12 ng/ml o meno

3. Numero di globuli rossi <4.000.000

4. L'emoglobina corrispondente a 11 g/dl o meno I pazienti sono stati divisi in tre gruppi: Gruppo 1: 33 donne incinte che rifiutano la supplementazione di ferro per via orale (gruppo di controllo).

Gruppo 2: 60 donne che ricevono per via orale 1 capsula 100 mg di lattoferrina, due volte al giorno prima dei pasti.

Gruppo 3: 50 donne che ricevono per via orale 520 mg di solfato ferroso una volta al giorno

I valori medi del numero di globuli rossi, della concentrazione di emoglobina, ferro sierico totale e di ferritina sierica sono riportati per tutti i gruppi nella Tabella di Figura 4 (l'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test ANOVA).

Come mostrato nella tabella di figura 4, tutti i parametri ematologici sono significativamente aumentati (P<0.001) dopo 30 giorni di somministrazione orale di lattoferrina, mentre il trattamento con solfato ferroso per os risulta inefficace.

Riguardo la concentrazione serica di IL-6 , in primo luogo, è stato dimostrato che dopo 30 giorni di trattamento lattoferrina la sua concentrazione diminuisce, mentre dopo la somministrazione di solfato ferroso aumenta significativamente (si veda la Tabella della figura 5).

Inoltre, i dati dimostrano che alti livelli di IL-6 sono correlati a bassi valori di ferro sierico totale e ferritina sierica, mentre la diminuzione di IL-6, indotta dal trattamento con lattoferrina, è strettamente associata con il significativo aumento del ferro sierico totale e della ferritina sierica (si veda la Tabella di figura 5).

ESEMPIO 5

Un quinto studio clinico è stato condotto per ottenere dati sul ruolo della lattoferrina per os in donne non incinta che soffrono di ID o IDA rispetto ai valori osservati con la somministrazione orale di 520 mg/die di solfato ferroso, controllando tutti i valori ematologici prima e dopo 30 giorni di trattamenti.

Allo studio sono ammesse 53 donne di età compresa fra 20 e 39 anni, senza gravi patologie concomitanti e in trimestri differenti di gravidanze fisiologiche affette da ID o IDA (i soggetti hanno fornito il consenso informato). Tutti i soggetti arruolati hanno concluso questo studio clinico.

Ipoferremia e anemia sono definite rispettivamente da:

1. ferro sierico totale corrispondente a 30 mg/dl o meno

2. La ferritina sierica corrispondente a 12 ng/ml o meno

3. Numero di globuli rossi <4.000.000

4. L'emoglobina corrispondente a 11 g/dl o meno I pazienti sono stati divisi in due gruppi:

Gruppo 1: 8 donne sono state trattate per 30 giorni con somministrazione orale di 520 mg di solfato ferroso una volta al giorno

Gruppo 2: 43 donne ha ricevuto la somministrazione orale di 1 capsula 100 mg di lattoferrina due volte al giorno prima dei pasti, 28 sono state trattate per 30 giorni e 15 per 60 giorni.

I risultati, riportati nella Tabella 7, confermano che la somministrazione orale di 1 capsula 100 mg di lattoferrina due volte al giorno prima dei pasti esercita una maggiore efficienza rispetto a quella di solfato ferroso.

Tabella 7. I valori medi dei valori ematologici di donne che soffrono di ID e IDA prima e dopo 30 giorni di somministrazione di solfato ferroso o prima e dopo 30 e 60 giorni di somministrazione lattoferrina

Azione della lattoferrina nella modulazione sistemica dell’omeostasi del ferro

Presi insieme i dati delle prove cliniche, è evidente che lattoferrina contribuisce sia all’immunità sia all’immunità acquisita, favorendo il reclutamento di leucociti ed esercitando una potente inibitoria sulla sintesi di IL-6.

È importante sottolineare che IL-6, espresso ad alti livelli, induce un aumento della sintesi di epcidina ed una diminuzione dell’espressione di ferroportina risultando quindi in una ipoferremia ed anemia sideropenica.

In queste condizioni patologiche, in cui l’epcidina è sovraespressa, la lattoferrina ripristina il trasporto del ferro dalle cellule al sangue.

La Figura 1 mostra l’interruolo della lattoferrina con proteine chiave dell'omeostasi del ferro sistemico: la lattoferrina, somministrata per via orale nelle donne in gravidanza che soffrono di carenza di ferro anemia (ipoferremia) diminuisce l’IL-6 ripristinando così l'esportazione di ferro dalle cellule nel sangue attraverso la ferroportina.

Inoltre, è stato ipotizzato che la potente attività antiinfiammatoria della lattoferrina verso la IL-6, per primo dimostrato nelle donne incinta che soffrono di ID e IDA, può essere realizzato attraverso il reclutamento e l'attivazione delle cellule dendritiche.

Il meccanismo proposto è illustrato nella figura 2: la lattoferrina, somministrata per via orale, media la sua attività attraverso l'intestino ed il GALT (gut-associated lymphoid tissue) il più grande organo linfatico del corpo e agisce attraverso un nuovo meccanismo di reclutamento e attivazione delle cellule dendritiche.

In seguito a somministrazione orale, la lattoferrina viene trasportato da M-cellule nelle placche del piccolo intestino di Peyer, dove recluta le cellule dendritiche circolanti immature e induce la loro maturazione.

All'interno cellule dendritiche, la lattoferrina migra nel nucleo dove si lega a sequenze di DNA, inibendo le citochine proinfiammatorie, IL-6 incluso.

Assorbimento negli enterociti

Alcuni ricercatori ritengono che la lattoferrina per os sia in grado di aumentare l'assorbimento del ferro. Al contrario, l'unico studio clinico effettuato su 20 volontari ha dimostrato che il ferro chelato dalla lattoferrina viene assorbito in modo simile al solfato ferroso.

Pertanto, l'ipotesi che lattoferrina può aumentare l'assorbimento del ferro negli enterociti è scorretta.

La capacità della lattoferrina di prevenire e curare ipoferremia e la carenza di ferro non è dovuta alla sua capacità di aumentare l'assorbimento del ferro, ma alla sua capacità di modulare i fattori chiave di ferro omeostasi sistemica.

Antigenicità

La lattoferrina bovina viene utilizzata in diversi prodotti come additivo alimentare.

Anche se lattoferrina bovina umana ha una così alta omologia di sequenza (circa il 70%) e gli anticorpi anti-lattoferrina umana cross-reagiscono con la lattoferrina bovina, sono stati condotti studi in modelli animali per definire l'antigenicità della lattoferrina.

L'assenza di anticorpi anti-lattoferrina bovina può essere attribuita ai meccanismi di esclusione immunitaria, che riducono al minimo la reazione putativa dopo l'ingestione di cibo.

Negli esseri umani, fino ad ora, gli anticorpi anti-lattoferrina umana sono stati trovati in alcune patologie autoimmuni come l'artrite reumatoide ed il lupus eritematoso.

Questi anticorpi vengono prodotti contro la lattoferrina endogena e la loro influenza su queste patologie non è stata mai dimostrata.

Nei nostri studi clinici, su un totale di circa 1000 soggetti, la lattoferrina somministrata per via orale prima dei pasti non ha esercitato alcun effetto collaterale o avverso fino alla concentrazione di 100 mg/tre volte al giorno.

Tossicità

Il test di tossicità lattoferrina è stato effettuato in vitro e in vivo.

Riguardo citotossicità saggiata in cellule coltivate umani, è stato dimostrato che lattoferrina bovina non intacca nessuno dei parametri di citotossicità fino a 10 mg/ml.

In esperimenti in vivo condotti attraverso una somministrazione orale della singola dose di lattoferrina bovina per tempi diversi nei ratti, la lattoferrina bovina non esercita alcuna effetto collaterale negativo fino a concentrazioni di lattoferrina corrispondenti a 2000 mg/Kg/giorno.

Pertanto, la tossicità di lattoferrina bovina è molto bassa es anche nei nostri studi clinici, condotti attraverso una somministrazione orale, la lattoferrina bovina non ha mostrato effetti negativi o collaterali fino ad un totale di 300 mg/giorno.

La somministrazione orale di lattoferrina bovina suggerito da noi in donne in gravidanza o in altri soggetti corrisponde a 3 mg/Kg/giorno, molto lontano da quella somministrata (2 g/Kg/giorno) nei ratti, mostrando alcun effetto collaterale.

Mutagenesi - teratogenicità

La lattoferrina bovina non mostra alcun effetto mutageno.

La teratogenicità è un effetto collaterale potenziale di molti farmaci al di fuori della biologia degli esseri umani. La lattoferrina è presente nel latte umano e bovino e lattoferrina bovina e non è inclusa negli elenchi delle sostanze teratogene.

Sicurezza

La lattoferrina bovina è considerato un additivo alimentare altamente sicuro.

Tollerabilità

E’ ben noto che la supplementazione di ferro attraverso solfato ferroso o di altri composti di ferro-solubilizzante non solo esercita una bassa efficacia, ma induce diversi effetti collaterali.

In particolare, la somministrazione orale di solfato ferroso può causare molti problemi, tra cui disturbi gastrointestinali, nausea, vomito, diarrea, costipazione, e, a volte, può aumentare la suscettibilità alle infezioni.

A differenza della somministrazione orale di solfato ferroso, la lattoferrina bovina somministrata per via orale mostra un’alta conformità, come dimostrato da numerosi studi clinici.

Da quanto sopra descritto, saranno evidenti alla persona esperta nel settore i numerosi vantaggi apportati dalla presente invenzione.

In particolare, la preparazione farmaceutica descritta risolve i problemi dovuti all’assunzione di integratori a base di ferro rappresentati soprattutto da problemi gastrointestinali (nausea, acidità di stomaco, diarrea), che hanno dimostrato di ridurre notevolmente l’accettabilità delle cure suggerite ai pazienti.

La tecnologia di produzione, inoltre, supera i problemi legati al retrogusto delle preparazioni a base di ferro note nell’arte.

L’incremento della biodisponibilità del ferro nelle forme proposte, inoltre, riduce la quantità necessaria da somministrare, con notevoli ulteriori vantaggi.

Secondo la presente invenzione, inoltre, il ferro è somministrato insieme alla lattoferrina, producendo un effetto sinergico del tutto sorprendente per quanto concerne la capacità di aumentare i livelli di ferro nel sangue.

Inoltre, potendo agire su diversi meccanismi, quali ad esempio i meccanismi infiammatori che coinvolgono la produzione di interleuchina 6 (IL-6) possono essere trattati con effetti decisamente positivi anche pazienti affetti da patologie infiammatorie croniche.

La persona esperta nel settore sarà in grado di apportare modifiche ed adattamenti alla presente invenzione, senza tuttavia uscire dall’ambito delle rivendicazioni qui annesse.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una preparazione farmaceutica comprendente lattoferrina e ferro.
2. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che la lattoferrina è in forma microincapsulata o in forma liposomale.
3. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzata dal fatto che il ferro è in forma microincapsulata o in forma liposomale.
4. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta forma microincapsulata è ottenuta mediante l’impiego di uno dei composti selezionati nel gruppo che comprende: cera d’api, cera carnauba, cera candellilla, shellac; acido laurico, acido caprico, acido miristico, acido stearico, glicerildistearato, glicerilmonostearato, glicerilstearato, esteri acido behenico, glicerina dibehenato, acido palmitico, stearina, olio di semi di cotone, stearina, olio di soia, olio di palma idrogenato, grassi idrogenati dell’olio di cocco esterificati con PEG; alginati, gomma arabica, lecitina, ad esempio lecitina di girasole, lecitina di soia, amido modificato, grassi.
5. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 2 o 4, in cui la lattoferrina è presente in una concentrazione di circa il 30-50% (peso/peso) e preferibilmente di circa il 40% (peso/peso).
6. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente circa 100-300 mg, preferibilmente circa 150-250 mg ed ancor più preferibilmente circa 200 mg di lattoferrina.
7. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente circa 200-400 mg e più preferibilmente 300-325 mg di ferro.
8. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il ferro è nella forma di sale pirofosfato, fumarato o solfato, preferibilmente pirofosfato.
9. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente ulteriormente carnosina.
10. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente ulteriormente uno o più veicolanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
11. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per uso medico.
12. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente per uso medico nel trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro (IDA).
13. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente 11 o 12 per uso medico nel trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro (IDA) in donne in gravidanza.
14. La preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti 12 o 13 per uso medico nel trattamento dell’ipoferremia e/o dell’anemia da carenza di ferro (IDA) detta ipoferremia e/o anemia da carenza di ferro (IDA) essendo associate ad una condizione infiammatoria.
15. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente, in cui detta condizione infiammatoria è caratterizzata da un valore serico di IL-6 maggiore di circa 19 pg/ml e preferibilmente compreso fra circa 19 e 77 pg/ml.
16. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui detta condizione infiammatoria è correlata ad una patologia selezionata nel gruppo che comprende: HIV, epatite C, fibrosi cistica, ipertensione.
17. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 o 12, per l’uso medico in un soggetto dializzato.
18. La preparazione farmaceutica per l’uso medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 11 a 17, in cui detta preparazione è somministrata una o due volte al giorno.