ES2350487T3

ES2350487T3 - Administración intranasal de péptidos reguladores de glucosa.

Info

Publication number: ES2350487T3
Application number: ES04815393T
Authority: ES
Inventors: Henry R. Costantino; Steven C. Quay
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2011-01-24
Anticipated expiration: 2024-12-17
Also published as: ATE480259T1; CN1933855A; EP1696960B1; DE602004029086D1; AU2004312043A1; JP2007518722A; US20050143303A1; EP1696960A1; AU2004312043B2; IL176541A0; MXPA06007317A; KR20060134036A; CA2551530A1; NO20063436L; ZA200606153B; NZ548695A; WO2005065714A1

Abstract

Formulación farmacéutica para liberación intranasal, que comprende: un péptido regulador de glucosa seleccionado entre un péptido de amilina, pramlintida, un péptido GLP-1 o una extendina; agua; una ciclodextrina; y un fosfolípido.

Description

Descripción [0001] Los péptidos reguladores de glucosa son una clase de péptidos que han mostrado que tienen potencial terapéutico en el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), la diabetes gestacional o la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), el tratamiento de la obesidad y el tratamiento de la dislipidemia. Véase la Patente de Estados Unidos 6.506.724, Publicación de la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. 20030036504A1, Patente Europea No. EP1083924B1, Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 98/30231A y Solicitud de Patente Internacional No. WO 00/73331A2. Estos péptidos incluyen un péptido de tipo glucagón, GLP, por ejemplo GLP-1, las exendinas, especialmente exendina-4, también conocida como exenatida, y péptidos de amilina y análogos de amilina, tales como pramlintida. Sin embargo, hasta la fecha estos péptidos únicamente se han administrado a los seres humanos mediante inyección. [0002] De este modo, existe la necesidad de desarrollar modos de administración de estos péptidos distintos de la inyección. Breve descripción de los dibujos [0003]

Figura 1. TER antes y después de 1 hora de incubación para la formulación #1 de fluoresceína-exenatida (formulación con excipientes transmucosales) y #2 (formulación salina) en comparación con control PBS y control Triton-X. La figura 2 muestra los datos de MMT para la formulación #1 de fluoresceínaexenatida (formulación con excipientes transmucosales) y #2 (formulación salina) en comparación con control PBS y control Triton-X. La figura 3 muestra los datos de LDH para la formulación #1 de fluoresceínaexenatida (formulación con excipientes transmucosales) y #2 (formulación salina) en comparación con control PBS y control Triton-X. La figura 4 muestra los datos de permeación para la formulación #1 de fluoresceína-exenatida (formulación con excipientes transmucosales) y #2 (formulación salina).

Descripción de la Invención [0004] La presente invención cumple con las necesidades anteriores y satisface los objetivos y las ventajas adicionales proporcionando una composición tal como se expone en las reivindicaciones, junto con un uso terapéutico correspondiente tal como se expone en las reivindicaciones. En ciertos aspectos de la invención, el péptido regulador de glucosa se administra en formulaciones a la mucosa intranasal de tal manera que por lo menos aproximadamente un 10%, preferiblemente 15%, más preferiblemente 20% o más del péptido regulador de glucosa contenido en la dosis se libera a la circulación sistémica o, en otras palabras, está biodisponible. La biodisponibilidad del GRP es la fracción de la dosis que llega al sistema sistémico, donde si el medicamento se administra por vía intravenosa, la biodisponibilidad es del 100%. Preferiblemente, el péptido regulador de glucosa es una sal farmacéuticamente aceptable de exendina-4, de pramlintida o de GLP-1 y el mamífero es un humano. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales de ácido inorgánico, sales de amina orgánica, sales de ácido orgánico, sales de metales alcalinotérreos y mezclas de los mismos. Entre los ejemplos adecuados de sales farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero sin limitación, haluro, glucosamina, alquil glucosamina, sulfato, clorhidrato, carbonato, bromhidrato, N’,N-dibenciletilen-diamina, trietanolamina, dietanolamina, trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, diciclohexilamina; fosfato, sulfato, sulfonato, benzoato, acetato, salicilato, lactato, tartrato, citrato, mesilato, gluconato, tosilato, maleato, fumarato, estearato y mezclas de los mismos. [0005] En otra realización de la presente invención, se proporciona una formulación de péptido regulador de glucosa intranasal con excipientes transmucosales que da lugar a una permeación del péptido regulador de glucosa en un ensayo de permeación de tejido in vitro por lo menos 10 veces mayor, preferiblemente por lo menos 50 veces, más preferiblemente 100 veces, que la permeación del péptido regulador de glucosa cuando esté presente en una formulación salina que consiste en agua, el péptido regulador de glucosa, cloruro de sodio y un tampón, donde ambas formulaciones tienen pHs y osmolaridades idénticos, y donde ambas formulaciones se analizan bajo las mismas condiciones de ensayo de permeación de tejido in vitro. Un ejemplo de un ensayo de permeación de tejido in vitro apropiado es el “Aumento de la permeabilidad de exenatida marcada con fluoresceína a través de una barrera celular utilizando potenciadores de la permeación” descrito en el Ejemplo 12. [0006] La presente invención también se refiere a una formulación intranasal de un péptido regulador de glucosa que substancialmente está libre de proteínas o polipéptidos que estabilizan la formulación. En particular, la formulación preferida está libre de proteínas, tales como albúmina, y proteínas derivadas de colágeno, tales como gelatina. [0007] En otros aspectos de la presente invención, una formulación de péptido regulador de glucosa está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua y un agente solubilizante que tiene un pH de 2-8. En una realización preferida, el agente solubilizante es una ciclodextrina. [0008] En otra realización de la presente invención, una formulación de péptido regulador de glucosa transmucosal está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua, un agente solubilizante, preferiblemente una ciclodextrina, y, por lo menos, un poliol, preferiblemente 2 polioles. En realizaciones alternativas, la formulación puede contener uno o todos de los siguientes componentes: un agente quelante, un agente activo en superficie y un agente tamponador. [0009] En otra realización de la presente invención, la formulación está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua, un agente quelante y un agente soluble. [0010] En otra realización de la presente invención, la formulación está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua y un agente quelante que tiene un pH de 2-8. [0011] En otra realización de la presente invención, la formulación está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua, un agente quelante y, por lo menos, un poliol, tal como manitol, lactosa o sorbitol, y preferiblemente 2 polioles. Las realizaciones adicionales pueden incluir, pero sin limitación, un agente activo en superficie, un agente solubilizante y un agente tamponador. [0012] En otra realización de la presente invención, la formulación está comprendida de un péptido regulador de glucosa, agua, y, por lo menos 2 polioles, tales como lactosa y sorbitol. Entre los agentes adicionales que se pueden añadir a la formulación se incluyen, pero sin limitación, un agente solubilizante, un agente quelante, uno o más agentes tamponadores y un agente activo en superficie. [0013] El aumento de la administración o liberación intranasal de un agonista de péptido regulador de glucosa de acuerdo con los métodos y las composiciones de la invención permite el uso farmacéutico eficaz de estos agentes para tratar una serie de enfermedades, tales como la diabetes y la obesidad en sujetos mamíferos. [0014] La presente invención cubre esta necesidad proporcionando una formulación líquida o deshidratada de péptido regulador de glucosa, donde la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es un polipéptido o una proteína. La formulación líquida de péptido regulador de glucosa (GRP) está comprendida de agua, GRP y, por lo menos, uno de los siguientes aditivos seleccionados del grupo que consiste en polioles, agentes activos en superficie, agentes solubilizantes y agentes quelantes. El pH de la formación es preferiblemente de 2 hasta aproximadamente 8,0, preferiblemente de 4,0 hasta 6,0, más preferiblemente aproximadamente 4,5 ± 0,5. [0015] Otra realización de la presente invención es una formulación acuosa reguladora de glucosa de la presente invención comprendida de agua, un péptido regulador de glucosa, un poliol y un agente activo en superficie, donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8, y la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0016] Otra realización de la presente invención es una formulación acuosa de péptido regulador de glucosa que está comprendida de agua, péptido regulador de glucosa, un poliol y un agente solubilizante, donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 8, y la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0017] Otra realización de la presente invención es una formulación acuosa de péptido regulador de glucosa que está comprendida de agua, péptido regulador de glucosa, un agente solubilizante y un agente activo en superficie, donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 8, y la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0018] Otra realización de la presente invención es una formulación acuosa de péptido regulador de glucosa que está comprendida de agua, un péptido regulador de glucosa, un agente solubilizante, un poliol y un agente activo en superficie, donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 8, y la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0019] En otro aspecto de la presente invención, la formulación acuosa estable se deshidratada para producir una formulación de péptido regulador de glucosa deshidratada que está comprendida de péptido regulador de glucosa y, por lo menos, uno de los siguientes aditivos seleccionados del grupo que consiste en polioles, agentes activos en superficie, agentes solubilizantes y agentes quelantes, donde dicha formulación de péptido regulador de glucosa deshidratada está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido, tal como albúmina, colágeno o proteína derivada de colágeno, tal como gelatina. La deshidratación se puede conseguir mediante varios medios, tales como liofilización, secado por pulverización, secado y precipitación inducida con sales, secado al vacío, evaporación rotativa o precipitación con CO2 supercrítico. [0020] En una realización, el péptido regulador de glucosa deshidratado está comprendido de un péptido regulador de glucosa, un poliol y un agente activo en superficie, donde la formulación está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido.

[0021] En otra realización, la formulación deshidratada de péptido regulador de glucosa está comprendida de un péptido regulador de glucosa, un agente activo en superficie, donde la formulación de péptido regulador de glucosa está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0022] En otra realización, la formulación deshidratada de péptido regulador de glucosa está comprendida de un péptido regulador de glucosa, un agente activo en superficie y un agente solubilizante, donde la formulación de péptido regulador de glucosa está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0023] En otra realización de la presente invención, la formulación deshidratada de péptido regulador de glucosa está comprendida de un péptido regulador de glucosa, un poliol, un agente activo en superficie y un agente solubilizante, donde la formulación de péptido regulador de glucosa está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína o un polipéptido. [0024] Se puede usar cualquier agente solubilizante, pero el preferido se selecciona del grupo que consiste en hidroxipropil-β-ciclodextrano, sulfobutileter-β-ciclodextrano, metil-β-ciclodextrina y quitosano. [0025] Generalmente, un poliol se selecciona del grupo que consiste en lactosa, sorbitol, trehalosa, sacarosa, manitol, manosa y maltosa y los derivados y homólogos de los mismos. [0026] Un agente activo en superficie satisfactorio se selecciona del grupo que consiste en L-α-didecanoil fosfatidilcolina (DDPC), polisorbato 20 (Tween 20), polisorbato 80 (Tween 80), polietilenglicol (PEG), alcohol cetílico, polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico (PVA), alcohol de lanolina y monooleato de sorbitán. [0027] En una formulación preferida, la formulación de péptido regulador de glucosa está también comprendido de un agente quelante, tal como ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) o ácido etilenglicol tetraacético (EGTA). También se puede añadir un conservante, tal como clorobutanol o cloruro de benzalconio, a la formulación para inhibir el crecimiento microbiano. [0028] El pH se regula generalmente mediante un agente de control de pH, tal como un sistema de tampón, tal como, por ejemplo, citrato de sodio y ácido cítrico o tartarato de sodio y ácido tartárico, o fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico, o acetato de sodio y ácido acético, o ácido succínico e hidróxido de sodio. [0029] La presente invención comprende también una formulación, donde la concentración del péptido regulador de glucosa es de 0,1-15,0 mg/mL, preferiblemente 1,0-5,0 mg/mL y el pH de la solución acuosa es de 2–8, preferiblemente aproximadamente de 4,5±0,5. [0030] La presente invención incluye además la formulación de péptido regulador de glucosa, donde la concentración del poliol está entre aproximadamente 0,1% y 10% (p/v) y adicionalmente, donde la concentración del poliol está en el intervalo desde aproximadamente 0,1% hasta 3% (p/v). [0031] La presente invención incluye también una formulación que contiene un agente activo en superficie, donde la concentración del agente activo en superficie está entre aproximadamente 0,00001% y aproximadamente 5% (p/v), preferiblemente entre aproximadamente 0,0002% y aproximadamente 0,1% (p/v). [0032] La presente invención también incluye una formulación que contiene un agente solubilizante, donde la concentración del agente soluble es de 1% -10% (p/v), más preferiblemente de 1% hasta 5% (p/v). [0033] La solución final se puede filtrar y secar por congelación, liofilizar, usando métodos bien conocidos para un experto en la materia, y siguiendo las instrucciones del fabricante del equipo de liofilización. Esto produce una formulación deshidratada de péptido regulador de glucosa substancialmente libre de un estabilizante que es una proteína. [0034] En una realización preferida, la formulación de péptido regulador de glucosa está comprendida además de por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en un agente activo en superficie, un agente de solubilización, un poliol y un agente quelante. Preferiblemente, el péptido regulador de glucosa es un péptido de amilina, un GLP-1 o un péptido de exendina. [0035] En otra realización de la presente invención, se proporciona una formulación de péptido regulador de glucosa que es capaz de aumentar la cantidad del péptido regulador de glucosa en el plasma de un mamífero en, por lo menos, 10, 20, 40, 60, 80

o más pmoles por mL de plasma, donde 100 µL o menos de la formulación se administra por intranasalmente en una única administración a dicho mamífero. [0036] En realizaciones de ejemplo, los usos y las composiciones de la presente invención proporcionan para la liberación terapéuticamente eficaz en la mucosa del péptido regulador de glucosa para la prevención o el tratamiento de la obesidad y trastornos alimenticios en sujetos mamíferos. En un aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones farmacéuticas aceptables para la administración intranasal que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido regulador de glucosa y uno o más agentes que aumentan la administración por vía intranasal, tal como se describe aquí, donde las formulaciones son eficaces en un método de administración por la mucosa nasal de la invención para prevenir la aparición o la progresión de la obesidad o trastornos alimenticios en un sujeto mamífero. La administración por la mucosa nasal de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de péptido regulador de glucosa y de uno o más agentes que aumentan la administración intranasal produce niveles terapéuticos elevados de un agonista de péptido regulador de glucosa en el sujeto. [0037] Los usos y composiciones mejorados de la presente invención proporcionan una administración terapéuticamente eficaz por la mucosa de un péptido regulador de glucosa para la prevención o el tratamiento de una serie de enfermedades y condiciones en los sujetos mamíferos. Se puede administrar el péptido regulador de glucosa mediante una serie de vías de la mucosa, por ejemplo, por el contacto del péptido regulador de glucosa con un epitelio de mucosa nasal, un epitelio de mucosa de pulmón o bronquial, la superficie bucal oral o la superficie de la mucosa de intestino delgado u oral. En las realizaciones de ejemplo, los métodos y las composiciones están dirigidos o formulados para la administración intranasal (por ejemplo, administración por la mucosa nasal o administración por la mucosa intranasal). [0038] Las formulaciones de péptido regulador de glucosa para la mucosa, los métodos preparativos y los usos de la invención anteriores proporcionan una administración por la mucosa mejorada de un péptido regulador de glucosa a los sujetos mamíferos. Estas composiciones y usos pueden implicar la formulación combinatoria o la administración coordinada de uno o más péptidos reguladores de glucosa con uno o más agentes potenciadores de la administración por la mucosa. Entre los agentes potenciadores de la liberación por la mucosa a seleccionar para lograr estas formulaciones y métodos son (A) agentes de solubilización, (B) agentes que modifican la carga, (C) agentes de control de pH, (D) inhibidores de enzimas degradativas; (E) agentes que limpian la mucosidad o mucolíticos; (F) agentes ciliostáticos; (G) agentes que aumentan la penetración de membrana; (por ejemplo, (i) un tensoactivo, (ii) una sal biliar, (iii) un aditivo de ácido graso o fosfolípido, micela mixta, liposoma o portador, (iv) un alcohol, (v) una enamina, (vi) un compuesto donador de NO, (vii) una molécula anfipática de cadena larga, (viii) un aumentador de penetración hidrofóbico pequeño; (ix) sodio o un derivado de ácido salicílico; (x) un glicerol éster de ácido acetoacético; (xi) un derivado de beta-ciclodextrina o ciclodextrina; (xii) un ácido graso de cadena media, (xiii) un agente quelante; (xiv) un aminoácido o sal del mismo, (xv) un N-acetilamino ácido o sal del mismo, (xvi) una enzima degradativa para un componente seleccionado de la membrana, (xvii) un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, (xviii) un inhibidor de la síntesis de colesterol, o (xiv) cualquiera combinación de los agentes que aumentan la penetración de membrana de (i)-(xviii); (H) agentes moduladores de la fisiología de unión epitelial, tales como estimuladores de óxido nítrico (NO), quitosano y derivados de quitosano; (I) agentes vasodilatadores; (J) agentes selectivos potenciadores del transporte; y (K) vehículos, portadores, soportes de liberación estabilizantes o especies que forman complejos con los que el péptido o péptidos reguladores de glucosa están combinados, asociados, contenidos, encapsulados o unidos de manera eficaz para estabilizar el agente activo para una administración por la mucosa aumentada. [0039] En varias realizaciones de la invención, un péptido regulador de glucosa se combina con uno, dos, tres, cuatro o más agentes potenciadores de la liberación por la mucosa indicados en (A) – (K) anteriormente. Estos agentes potenciadores de la administración por la mucosa se pueden mezclar, solos o juntos, con el péptido regulador de glucosa o, sinó, se pueden combinar con los mismos en una formulación farmacéuticamente aceptable o vehículo de liberación. La formulación de un péptido regulador de glucosa con uno o más de los agentes que aumentan la liberación por la mucosa de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención (opcionalmente se incluye cualquier combinación de dos o más agentes que aumentan la liberación por la mucosa seleccionados entre (A)-(K) mencionados anteriormente) proporciona una biodisponibilidad aumentada del péptido de unión que regula la glucosa después de la administración de la misma a una superficie de mucosa de un sujeto mamífero. [0040] La presente invención proporciona además el uso de un péptido regulador de glucosa para la producción de un medicamento para la administración transmucosal de un péptido regulador de glucosa para el tratamiento de la hiperglicemia, diabetes mellitus, dislipidemia, supresión del apetito, inducción de la pérdida de peso, disminución de la ingesta de alimentos, o para el tratamiento de obesidad en un mamífero. [0041] Una dosis eficaz para la mucosa de un péptido regulador de glucosa en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 0,001 pmol y aproximadamente 100 pmol por kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,1 pmol y aproximadamente 10 pmol por kg de peso corporal,

o entre aproximadamente 0,1 pmol y aproximadamente 5 pmol por kg de peso corporal. En realizaciones de ejemplo adicionales, la dosis de amilina es entre aproximadamente 0,5 pmol y aproximadamente 1,0 pmol por kg de peso corporal. En una realización preferida, una dosis intranasal variará desde 0,1-100 µg/kg, o aproximadamente 7-7000 µg, más preferiblemente 0,5-10 µg/kg, o de 35 hasta 700 µg. Más específicamente, las dosis de GRP intranasal variarán desde 20 µg, 50 µg, 100 µg, 150 µg, 200 µg hasta 400 µg. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar una o más veces al día, o 3 veces a la semana o una vez a la semana durante entre una semana y por lo menos 96 semanas o incluso durante la vida del paciente o sujeto individual. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas de la invención se administran una o más veces al día, dos veces al día, cuatro veces al día, seis veces al día u ocho veces al día. [0042] Los agentes potenciadores de la administración intranasal se emplean para aumentar la liberación de amilina en o a través de una superficie de la mucosa nasal. Para fármacos absorbidos pasivamente, la contribución relativa de los mecanismos paracelular y transcelular para el transporte de fármacos depende del pKa, coeficiente de partición, radio molecular y carga del fármaco, el pH del medio luminal en el que se libera el fármaco y el área de la superficie de absorción. El agente potenciador de la liberación intranasal de la presente invención puede ser un agente de control de pH. El pH de la formulación farmacéutica de la presente invención es un factor que afecta a la absorción de amilina por los mecanismos transcelulares y paracelulares para el transporte del medicamento. En una realización, en la formulación farmacéutica de la presente invención se ajusta el pH entre aproximadamente pH 2 y 8. En una realización adicional, en la formulación farmacéutica de la presente invención se ajusta el pH entre aproximadamente pH 3,0 y 6,0. En una realización adicional, en la formulación farmacéutica de la presente invención se ajusta el pH entre aproximadamente pH 4,0 y 6,0. Generalmente el pH es 4,5 ± 0,5. [0043] Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona usos terapéuticos y composiciones mejoradas para la administración por la mucosa de péptido regulador de glucosa a sujetos mamíferos para el tratamiento o la prevención de una serie de enfermedades y condiciones. Los ejemplos de sujetos mamíferos apropiados para el tratamiento y profilaxis de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, primates no humanos y humanos, especies de ganado, tales como caballos, ganado vacuno, ovejas y cabras, y especies domesticas y experimentales, incluyendo perros, gatos, ratones, ratas, cobayas y conejos. [0044] Para proporcionar una mejor comprensión de la presente invención se proporcionan las siguientes definiciones: Exendinas y Agonistas de Exendina [0045] Las exendinas son péptidos que se aislaron por primera vez a partir de secreciones salivares del Gilamonster, un lagarto encontrado en Arizona, y la lagartija barbuda mejicana. La exendina-3 está presente en las secreciones salivares de Heloderma horridum, y la exendina-4 está presente en las secreciones salivares de Heloderma suspectum [Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62 (1990); Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05 (1992)]. Las exendinas tienen acierta similitud de secuencia con algunos miembros de la familia de péptidos de tipo glucagón, siendo la homología más alta, 53%, con GLP-1[7-36]NH2 [Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55, (1993)]. GLP-1[7-36]NH2 también conocido como proglucagón[78107] y más común como “GLP-1”, presenta un efecto insulinotrópico, que estimula la secreción de insulina; GLP-1 también inhibe la secreción de glucagón [Orskov, et al., Diabetes, 42:658-61 (1993); D’Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-38 (1996)]. Se describe que GLP-1 inhibe el vacío gástrico [Williams B, et al., J clin Encocrinol Metab 81: (1) 327-32 (1996); Wettergen A, et al., Dig Dis Sci 38: (4):665-73 (1993)] y la secreción de ácido gástrico. [Schjoldager B T, et al., Dig Dis Sci 34: (5): 703-8, (1989); O’Halloran DJ, et al., J endocrinol 126 (1): 169-73 (1990); Wettergen A, et al., Dig Dis Sci 38: (4):665-73 (1993)]. GLP-1 [7-37], que tiene un residuo de glicina adicional en su extremo terminal de carboxilo, también estimula la secreción de insulina en los humanos [Orskov, et al., Diabetes, 42:658-61 (1993)]. Se ha descrito que el receptor acoplado a adenilato-ciclasa de proteína G transmembrana que se cree que es responsable del efecto insulinotrópico de GLP-1, se ha clonado a partir de una línea de células beta [Thorens, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:8641-45 (1992)].

[0046] La presente invención se dirige a usos terapéuticos para el tratamiento de la diabetes mellitus gestacional que comprende la administración intranasal de una exendina, por ejemplo: Exendina-3

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o Exenatida (exendina-4) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser, donde la serina C-terminal está amidada (SEC ID NO: 2), u otros compuestos que se unen de manera eficaz al receptor en el que la exendina ejerce sus acciones que son beneficiosas en el tratamiento de la diabetes mellitus gestacional. La utilización de la exendina-3 y la exendina-4 como agentes insulinotróficos para el tratamiento de la diabetes mellitus y la prevención de la hiperglicemia se ha descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,424,286. También se ha observado que las exendinas son útiles en la modulación de los niveles de triglicéridos y para tratar la dislipidemia. Péptidos de tipo glucagón (GLP) [0047] La secuencia de aminoácidos de GLP-1 se proporciona, entre otros, por Schmidt et al. (Diabetologia 28 704-707 (1985). El GLP-1 es un péptido con 37 residuos de aminoácidos originado a partir de preproglucagón que se sintetiza, entre otros, en las células L en el íleo distal, en el páncreas y en el cerebro. El procesado del preproglucagón a GLP-1 (7-36)amida, GLP-1 (7-37) y GLP-2 tiene lugar principalmente en las células L. Aunque las propiedades farmacológicas interesantes de GLP-1(7-37) y análogos del mismo han acaparado mucha atención en los últimos años, poco se saber sobre la estructura de estas moléculas. La estructura secundaria de GLP-1 en micelas se ha descrito por Thorton et al. (Biochemistry 33 3532-3539 (1994)), pero en solución normal, GLP-1 se considera una molécula muy flexible. [0048] GLP-1 y análogos de GLP-1 y fragmentos de los mismos son útiles, entre otros en el tratamiento de la diabetes Tipo 1 y Tipo 2 y la obesidad. [0049] El documento WO 87/06941 describe fragmentos de GLP-1, incluyendo GLP1(7-37), y derivados funcionales de los mismos y a su uso como agente insulinotrópico. [0050] El documento WO 90/11296 describe fragmentos de GLP-1, incluyendo GLP-1 (7-36), y derivados funcionales de los mismos que presentan actividad insulinotrópica que supera la actividad insulinotrópica de GLP-1(1-36) o GLP-1(1-37) y a su uso como agentes insulinotrópicos. [0051] La secuencia de aminoácidos de GLP-1(7-36) es:

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y GLP-1(7-37) es

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[0052] WO 91/11457 describe análogos de los péptidos GLP-1 activos 7-34, 7-35, 736, y 7-37 que también pueden ser útiles como grupos de GLP-1. [0053] EP 0708179-A2 (Eli Lilly & Co.) describe análogos y derivados de GLP-1 que incluyen un grupo imidazol N-terminal y opcionalmente un grupo C6-C10 acilo no

10 ramificado unido al residuo de lisina en la posición 34. [0054] EP 0699686-A2 (Eli Lilly & Co.) describe ciertos fragmentos truncados N-terminales de GLP-1 que se describen como biológicamente activos. Péptidos de amilina KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEC ID NO: 5)

15 [0055] Los agonistas de amilina incluyen:

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en las que la tirosina C-terminal de SEC ID NO: 47 está amidada. La SEC ID NO: 47 amidada también se denomina acetato de pramlintida. El acetato de pramlintida tiene un enlace disulfuro entre las cisteínas en las posiciones 2 y 7. [0056] Según la presente invención, el péptido regulador de glucosa también incluye las bases libres, sales por adición de ácido o sales metálicas, tales como sales potásicas

o sódicas de los péptidos y péptidos de amilina que han sido modificados por procesos tales como amidación, glicosilación, acilación, sulfatación, fosforilación, acetilación, ciclación y otros métodos de modificación covalente conocidos. [0057] De este modo, según la presente invención, los péptidos descritos anteriormente se incorporan en formulaciones adecuadas para la liberación transmucosal, especialmente liberación intranasal. Agentes potenciadores de la liberación por la mucosa [0058] Los "agentes potenciadores de liberación por la mucosa" se definen como agentes químicos y otros excipientes que, cuando se añaden a una formulación que comprende agua, sales y/o tampones comunes y péptido regulador de glucosa (la formulación de control), producen una formulación que produce un incremento significativo en el transporte del péptido regulador de glucosa a través de la mucosa medido mediante la concentración máxima (Cmax) en sangre, suero o fluido cerebroespinal o mediante el área bajo la curva, AUC, en una representación de la concentración frente al tiempo. La mucosa incluye las superficies de la mucosa nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar, vagina y rectal y, de hecho, incluyen todas las membranas secretoras de mucosidad que recubren todas las cavidades corporales o las vías que comunican con el exterior. Los agentes potenciadores de la liberación por la mucosa se denominan a veces portadores. Formulación sin endotoxina [0059] "Formulación sin endotoxina" significa una formulación que contiene un péptido regulador de glucosa y uno o más agentes potenciadores de la liberación por la mucosa que está sustancialmente libre de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas en el interior de un microorganismo y se liberan únicamente cuando los microorganismos se rompen o mueren. Las sustancias pirogénicas incluyen sustancias termoestables inductoras de fiebre (glicoproteínas) de la membrana externa de bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y shock si se administran a humanos. La producción de formulaciones que están libres de endotoxinas puede requerir un equipamiento especial, técnicos expertos y puede ser significativamente más cara que fabricar formulaciones que no están libres de endotoxinas. Debido a que se ha visto que la administración intravenosa de GLP o amilina simultáneamente con la infusión de endotoxina en roedores previene la hipotensión e incluso la muerte asociada con la administración de endotoxina sola (Patente de Estados Unidos 4,839,343), la producción de formulaciones libres de endotoxinas de estos agentes terapéuticos no se esperaría como necesaria para la administración no parental (no inyectada). Administración sin infusión [0060] "Administración sin infusión” significa cualquier método de liberación que no implique una inyección directamente en una arteria o vena, un método que fuerza o impulsa (habitualmente un fluido) a algo y especialmente para introducir en una parte del cuerpo mediante una aguja, jeringa u otro método invasivo. La administración son infusión incluye la inyección subcutánea, la inyección intramuscular, la inyección intraperitoneal y los métodos de inyección de liberación a la mucosa. [0061] Los métodos y composiciones mejorados para la administración en la mucosa de péptido regulador de glucosa a sujetos mamíferos optimizan las pautas de dosificación del péptido regulador de glucosa. La presente invención proporciona la liberación por la mucosa de péptido regulador de glucosa formulado con uno o más agentes potenciadores de la liberación por la mucosa, en los que la liberación de la dosis del péptido regulador de la glucosa está sustancialmente normalizada y/o sostenida para un periodo de liberación eficaz de liberación del péptido regulador de glucosa que varía desde aproximadamente 0,1 a 2,0 horas; 0,4 a 1,5 horas; 0,7 a 1,5 horas; o 0,8 a 1,0 horas; tras la administración en la mucosa. La liberación sostenida del péptido regulador de glucosa conseguida se puede facilitar mediante la administración repetida de péptidos reguladores de glucosa exógenos utilizando las composiciones de la presente invención. [0062] Las composiciones mejoradas y sus usos terapéuticos para la administración en la mucosa de péptido regulador de glucosa a los sujetos mamíferos optimizan las pautas de dosificación del péptido regulador de glucosa. La presente invención proporciona una liberación mejorada en la mucosa (por ejemplo, nasal) de una formulación que comprende péptido regulador de glucosa en combinación con uno o más agente potenciadores de la liberación por la mucosa y un agente o agentes opcionales potenciadores de la liberación sostenida. Los agentes potenciadores de a liberación por la mucosa de la presente invención proporcionan un aumento eficaz en la liberación, por ejemplo, un aumento en la concentración máxima en plasma (Cmax) para aumentar la actividad terapéutica del péptido regulador de glucosa administrado a través de la mucosa. Un segundo factor que afecta a la actividad terapéutica del péptido regulador de glucosa en el plasma sanguíneo y CNS es el tiempo de residencia (RT). Los agentes potenciadores de la liberación sostenida, en combinación con agentes potenciadores de la liberación intranasal, aumentan la Cmax y aumentan el tiempo de residencia del péptido regulador de glucosa. En la presente invención se describen vehículos de liberación polimérica y otros agentes y métodos de la presente invención que proporcionan formulaciones potenciadores de la liberación sostenida, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). La presente invención proporciona una forma de dosificación mejorada del péptido regulador de glucosa para el tratamiento de síntomas relacionados con la obesidad, cáncer de colon, cáncer por exendina, o cáncer de mama en sujetos mamíferos. [0063] En las formulaciones de liberación por la mucosa y usos terapéuticos de la invención, el péptido regulador de glucosa a menudo se combina o se administra de forma coordinada con un portador o vehículo adecuado para la liberación por la mucosa. Tal como se utiliza aquí, el término “portador” significa un relleno, diluyente

o material encapsulante sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Un portador líquido que contiene agua puede contener aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tamponadores, agentes quelantes, agentes complejantes, agentes solubilizantes, humectantes, disolventes, agentes de suspensión y/o aumentadores de la viscosidad, agentes tonificantes, agentes humectantes u otros materiales biocompatibles. Una tabla de ingredientes indicados por las categorías anteriores se puede encontrar en la U.S Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859, (1990). Algunos ejemplos de los materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógeno; solución salina isotónica; solución de Ringer, alcohol etílico y soluciones de tampón fosfato, así como otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes en las composiciones, según los deseos del formulador, agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato sódico y estearato magnésico, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfito sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similar; antioxidantes solubles en fase oleosa, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del modo de administración concreto.

[0064] En las composiciones de liberación en mucosa y los usos terapéuticos de la invención, se utilizan diversos agentes potenciadores de la liberación que potencian la liberación del péptido regulador de glucosa en o a través de la superficie de la mucosa. En este aspecto, la liberación del péptido regulador de glucosa a través del epitelio de la mucosa puede tener lugar “transcelularmente” o “paracelularmente”. El grado en que estos mecanismos contribuyen al flujo global y biodisponibilidad del péptido regulador de glucosa depende del medio de la mucosa, las propiedades físico-químicas del agente activo y de las propiedades del epitelio de la mucosa. El transporte paracelular implica sólo la difusión pasiva, mientras que el transporte transcelular puede tener lugar mediante procesos pasivos, facilitados o activos. En general, los solutos polares hidrofílicos transportados de forma pasiva se difunden a través de la ruta paracelular, mientras que los solutos más lipofílicos utilizan la ruta transcelular. La absorción y biodisponibilidad (por ejemplo, tal como se refleja mediante el coeficiente de permeabilidad o un ensayo fisiológico), para solutos diversos absorbidos pasivamente y activamente, se pueden evaluar fácilmente, en términos de componentes de liberación tanto paracelulares como transcelulares, para cualquier péptido regulador de glucosa seleccionado en la invención. Para fármacos absorbidos pasivamente, la contribución relativa de los mecanismos paracelular y transcelular para el transporte de fármacos depende del pKa, coeficiente de partición, radio molecular y carga del fármaco, el pH del medio luminal en el que se libera el fármaco y el área de la superficie de absorción. La ruta paracelular representa una fracción relativamente pequeña del área superficial accesible del epitelio de la mucosa nasal. En términos generales, se ha descrito que las membranas celulares ocupan un área superficial de la mucosa que es mil veces mayor que el área ocupada por los espacio paracelulares. De este modo, el área accesible más pequeña y la discriminación en base al tamaño y carga contra la permeación macromolecular sugerirían que la ruta paracelular sería una ruta generalmente menos favorable que la liberación transcelular para el transporte de fármacos. De forma sorprendente, los métodos y composiciones de la invención proporcionan un transporte significativamente mejor de agentes bioterapéuticos en el epitelio de la mucosa y a través del mismo mediante la ruta paracelular. Por lo tanto, los métodos y composiciones de la invención reconocen de manera satisfactoria las rutas tanto paracelular como transcelular, de manera alternativa o en un único método

o composición. [0065] Tal como se utiliza aquí, “agentes potenciadores de la liberación por la mucosa” incluye agentes que potencian la liberación o solubilidad (por ejemplo, de un vehículo de liberación de la formulación), la velocidad de difusión, la capacidad y evolución con el tiempo de la penetración, captación, tiempo de residencia, estabilidad, vida media eficaz, niveles de concentración máxima o sostenida, depuración u otras características de liberación por la mucosa deseadas (por ejemplo, medidas en el punto de liberación o en un punto diana de actividad seleccionado, tal como el torrente sanguíneo o el sistema nervioso central) del péptido regulador de glucosa u otro compuesto o compuestos biológicamente activos. El aumento de la liberación por la mucosa puede así tener lugar mediante cualquiera de una serie de mecanismos, por ejemplo, mediante el incremento de la difusión, transporte, persistencia o estabilidad del péptido regulador de glucosa, incremento de la fluidez de membrana, modulación de la disponibilidad o acción del calcio u otros iones que regulan la permeación intracelular o paracelular, solubilización de los componentes de la membrana de la mucosa (por ejemplo, lípidos), cambio de los niveles de sulfhidrilo no proteicos y proteicos en tejidos de mucosa, incremento del flujo de agua a través de la superficie de la mucosa, modulación de la fisiología de la unión epitelial, reducción de la viscosidad de la mucosidad que recubre el epitelio de la mucosa, reducción de la velocidad de depuración mucociliar y otros mecanismos. [0066] Tal como se utiliza aquí, una “cantidad eficaz en la mucosa del péptido regulador de glucosa" contempla la liberación eficaz en la mucosa del péptido regulador de glucosa a un punto diana para a actividad del fármaco en el sujeto que puede implicar una serie de rutas de liberación o transferencia. Por ejemplo, un agente activo determinado puede hallar su camino a través de aclarados entre células de la mucosa y alcanzar una pared vascular adyacente, mientras que mediante otra ruta el agente, pasivamente o activamente, puede captarse en células de la mucosa para actuar en las células o descargarse o transportarse fuera de las células para alcanzar un sitio diana secundario, tal como la circulación sistémica. Los métodos y composiciones de la invención pueden inducir la translocación de agentes activos junto con una o más de dichas rutas alternativas, o pueden actuar directamente en el tejido de la mucosa o tejido vascular proximal para inducir la absorción o penetración del agente o agentes activos. La inducción de la absorción o penetración en este contexto no se limita a estos mecanismos. [0067] Tal como se utiliza aquí, “concentración máxima (Cmax) del péptido regulador de glucosa en plasma sanguíneo", "área bajo la curva de concentración vs. tiempo (AUC) del péptido regulador de glucosa en plasma sanguíneo", "tiempo hasta la concentración máxima en plasma (tmax) del péptido regulador de glucosa en plasma sanguíneo" son parámetros farmacocinéticas conocidos por un experto en la materia. Laursen et al., Eur. J. Endocrinology, 135: 309-315, 1996. La "curva de concentración vs. tiempo" mide la concentración del péptido regulador de glucosa en un suero sanguíneo de un sujeto vs. tiempo después de la administración de una dosis de péptido regulador de glucosa al sujeto mediante una ruta de administración intranasal, intramuscular, subcutánea, u otra ruta de administración parenteral. "Cmax" es la concentración máxima de péptido regulador de glucosa en el suero sanguíneo de un sujeto después de una dosis individual de péptido regulador de glucosa al sujeto. "tmax" es el tiempo en alcanzar la concentración máxima de péptido regulador de glucosa en suero sanguíneo de un sujeto después de la administración de una dosis individual del péptido regulador de glucosa al sujeto. [0068] Tal como se utiliza en la presente invención, el “área bajo la curva de concentración vs. Tiempo (AUC) del péptido regulador de glucosa en plasma sanguíneo” se calcula según la regla trapezoidal lineal y con la adición de las áreas residuales. Una disminución del 23% o un incremento del 30% entre las dos dosificaciones se detectaría con una probabilidad del 90%, (tipo II error β = 10%). La “velocidad de liberación” o la “velocidad de absorción” se estima mediante la comparación del tiempo (máx) para alcanzar la concentración máxima (Cmax). Tanto la Cmax como tmax se analizan utilizando métodos no paramétricos. Las comparaciones de la farmacocinética de las administraciones intramuscular, subcutánea, intravenosa e intranasal del péptido regulador de glucosa se realizaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA). Para las comparaciones por parejas, se utiliza el procedimiento secuencial de Bonferroni-Holmes para evaluar la significancia. La relación dosis-respuesta ente las tres dosis nasales se estima mediante una análisis por regresión P <0,05 se considera significativo. Los resultados se indican como valores promedio +/-SEM. [0069] Mientras que el mecanismo de inducción de la absorción puede variar con diferentes agentes potenciadores de la liberación por la mucosa de la invención, los reactivos útiles en este contexto no afectarán sustancialmente de manera adversa al tejido de la mucosa y se seleccionarán según las características fisico-químicas del péptido regulador de glucosa particular u otros agentes activos o potenciadores de la liberación. En este contexto, los agentes potenciadores de la liberación que aumentan la penetración o permeabilidad de los tejidos de la mucosa darán lugar a menudo a ciertas alteraciones de la barrera de permeabilidad protectora de la mucosa. Para que dichos agentes potenciadores de la liberación sean valiosos en la invención, se desea en general que cualquier cambio significativo en la permeabilidad de la mucosa sea reversible en un espacio de tiempo apropiado para la duración deseada de la liberación del fármaco. Además, no debería haber una toxicidad sustancial acumulada, ni cambios perjudiciales permanentes inducidos en las propiedades de barrera de la mucosa con un uso a largo plazo. [0070] En ciertos aspectos de la invención, los agentes de inducción de la absorción para la administración coordinada o formulación combinatoria con péptido regulador de glucosa de la invención se seleccionan entre moléculas hidrofílicas pequeñas, incluyendo, pero sin limitación, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida, etanol, propilenglicol, y las 2-pirrolidonas. Alternativamente, las moléculas anfipáticas de cadena larga, por ejemplo, desacilmetil sulfóxido, azona, laurilsulfato sódico, ácido oleico, y sales biliares, se pueden utilizar para aumentar la penetración en la mucosa del péptido regulador de glucosa, En aspectos adicionales, se utilizan tensoactivos (por ejemplo, polisorbatos) como compuestos adjuntos, agentes de procesado, o aditivos de formulación para aumentar la liberación intranasal del péptido regulador de glucosa. Los agentes, tales como DMSO, polietilenglicol y etanol, si están presentes en concentraciones suficientemente elevadas en el medio de liberación (por ejemplo, mediante la preadministración o incorporación en una formulación terapéutica), pueden entrar en la fase acuosa de la mucosa y alterar sus propiedades de solubilización, aumentando así la separación del péptido regulador de glucosa del vehículo en la mucosa. [0071] Los agentes potenciadores de la liberación por la mucosa adicionales que son útiles en la administración coordinada y métodos de procesamiento y formulaciones de combinación de la invención incluyen, pero sin limitación, micelas mixtas; enaminas; dadores de óxido nítrico (por ejemplo, S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina, NOR1, NOR4—que preferiblemente se coadmisnitran con un atrapante de NO, tal como carboxi-PITO o doclofenac sódico); salicilato sódico; ésteres de glicerol de ácido acetoacético (por ejemplo, gliceril-1,3-diacetoacetato o 1,2-isopropilidenglicerina-3acetoacetato); y otros agentes inductores de la difusión para liberación o la penetración intra o transepitelial que son fisiológicamente compatibles para la liberación por la mucosa. Otros agentes inductores de la absorción se seleccionan de una variedad de portadores, bases y excipientes que aumentan la liberación por la mucosa, la estabilidad, actividad o penetración transepitelial del péptido regulador de glucosa. Estos incluyen, ente otros, ciclodextrinas y derivados de β-ciclodextrinas (por ejemplo, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina y heptakis(2,6-di-O-metil-β-ciclodextrina). Estos compuestos, opcionalmente conjugados con uno o más de los principios activos y formulados además opcionalmente en una base oleaginosa, aumentan la biodisponibilidad en las formulaciones para mucosa de la invención. Otros agentes potenciadores de la absorción adicionales para la liberación por la mucosa incluyen ácidos grasos de cadena media, incluyendo mono y diglicéridos (por ejemplo, caprato sódico – extractos de aceite de coco, Capmul), y triglicéridos (por ejemplo, amilodextrina, Estaram 299, Miglyol 810). [0072] Las composiciones terapéuticas y profilácticas para la mucosa de la presente invención se pueden complementar con cualquier agente inductor de la penetración adecuado que facilite la absorción, difusión o penetración del péptido regulador de glucosa a través de las barreras de la mucosa. El inductor de la penetración puede ser cualquier promotor que sea farmacéuticamente aceptable. De este modo, en aspectos más detallados de la invención, se proporcionan composiciones que incorporan uno o más agentes inductores de la penetración seleccionados entre salicilato sódico y derivados de ácido salicílico (salicilato de acetilo, salicilato de colina, salicilamida, etc.); aminoácidos y sales de los mismos (por ejemplo, ácidos monoaminocarboxílico, tales como glicina, alanina, fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, etc.; hidroxiaminoácidos, tales como serina; aminoácidos ácidos, tales como ácido aspártico, ácido glutámico, etc; y aminoácidos básicos, tales como lisina etcincluyendo sus sales de metales alcalinos o alcalinotérreos); y ácidos N-acetilamino (N-acetilalanina, N-acetilfenilalanina, N-acetilserina, N-acetilglicina, N-acetillisina, ácido N-acetilglutámico, N-acetilprolina, N-acetilhidroxiprolina, etc.) y sus sales (sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos). Además, se proporcionan como agentes inductores de la penetración en los métodos y composiciones de la invención sustancias que se utilizan en general como emulsionantes (por ejemplo, oleil fosfato sódico, laurilfosfato sódico, laurilsulfato sódico, miristilsulfato sódico, alquil éteres de polioxietileno, ésteres alquílicos de polioxietileno, etc.), ácido caproico, ácido láctico, ácido málico y ácido cítrico y sales de metales alcalinos de los mismos, ácidos pirrolidonacarboxílicos, ésteres alquílicos de ácidos pirrolidonacarboxílicos, Nalquilpirrolidonas, ésteres acílicos de prolina, y similares. [0073] En varios aspectos de la invención, se proporcionan formulaciones mejoradas para la liberación en mucosa nasal y usos terapéuticos que permiten la liberación de un péptido regulador de glucosa y otros agentes terapéuticos de la invención a través de barreras de la mucosa entre los puntos de administración y los puntos diana seleccionados. Ciertas formulaciones se adaptan específicamente para una célula, tejido u órgano diana seleccionado. O incluso un estado patológico concreto. En otros aspectos, las formulaciones y usos terapéuticos proporcionan una endocitosis o transcitosis selectiva eficaz del péptido regulador de glucosa específicamente guiada a lo largo de una vía intracelular o intercelular definida. Habitualmente, el péptido regulador de glucosa se carga de manera eficaz a niveles de concentración eficaces en un portador u otros vehículos de liberación, y se libera y mantiene en una forma estabilizada, por ejemplo, en la mucosa nasal y/o durante el paso a través de compartimentos intracelulares y membranas a un sitio diana remoto para la acción del fármaco (por ejemplo, la corriente sanguínea o un tejido, órgano o compartimento extracelular definido). El péptido regulador de glucosa se puede proporcionar en un vehículo de liberación o en todo caso modificado (por ejemplo, en forma de un profármaco), donde la liberación o activación del péptido regulador de glucosa se desencadena mediante un estímulo fisiológico (por ejemplo, un cambio de pH, enzimas lisosomales, etc.). A menudo, el péptido regulador de glucosa es farmacológicamente inactivo hasta que alcanza su sitio diana para la actividad. En la mayoría de casos, el péptido regulador de glucosa y otros componentes de la formulación son no tóxicos y no inmunogénicos. En este contexto, se seleccionan en general portadores y otros componentes de la formulación por su capacidad para degradarse rápidamente y excretarse bajo condiciones fisiológicas. Al mismo tiempo, las formulaciones son químicamente y físicamente estables en la forma de dosificación para el almacenamiento eficaz. Análogos de péptidos y proteínas y miméticos [0074] Se incluyen en esta definición de péptidos y proteínas biológicamente activos para su uso en la invención péptidos (compuestos de dos o más aminoácidos unidos covalentemente), proteínas, fragmentos de péptidos o proteínas, análogos de péptidos o proteínas, naturales o sintéticos, terapéuticamente o profilácticamente activos, y derivados químicamente modificados o sales de péptidos o proteínas activas. Se contemplan una amplia variedad de análogos y miméticos del péptido regulador de glucosa útiles para su uso en la invención y se pueden producir y analizar la actividad biológica según métodos conocidos. A menudo, los péptidos o proteínas del péptido regulador de glucosa u otros péptidos o proteínas biológicamente activos para su uso en la invención son muteínas que son fácilmente obtenibles por sustitución, adición o deleción parcial de aminoácidos en una secuencia de péptido o proteína natural o nativa (por ejemplo, tipo salvaje, mutante natural o variante alélica). Adicionalmente, se incluyen los fragmentos biológicamente activos de péptidos o proteínas nativas. Dichos derivados mutantes y fragmentos mantienen sustancialmente la actividad biológica deseada del péptido o proteínas nativas. En el caso de péptido o proteínas que tienen cadenas de carbohidratos, las variantes biológicamente activas destacadas por alteraciones en estos grupos carbohidrato también se incluyen en la invención. [0075] Tal como se utiliza aquí, el término “sustitución conservativa de aminoácido” se refiere a la capacidad de intercambio general de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo habitualmente intercambiable de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es de alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifático-hidroxilo es de serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es de asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es de fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es de lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es de cisteína y metionina. Entre los ejemplos de sustituciones conservativas se incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro. Así mismo, la presente invención contempla la sustitución de un residuo polar (hidrofílico), tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre treonina y serina. Adicionalmente, también se contempla la sustitución de un residuo básico, tal como lisina o histidina por otro o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos de ejemplo son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. Mediante la alineación de un análogo de péptido o proteína de manera óptima con un péptido o proteína nativa correspondiente y mediante la utilización de ensayos apropiados, por ejemplo, ensayos de proteínas de adhesión unión a receptor, para determinar una actividad biológica seleccionada, se puede identificar fácilmente análogos de péptido y proteína operativos para su uso en los métodos y composiciones de la invención. Los análogos de péptidos y proteínas operativos son habitualmente específicamente inmunoreactivos con anticuerpos desarrollados contra el correspondiente péptido o proteína nativa. [0076] Una estrategia para estabilizar las formulaciones de proteína sólida de la invención es incrementar la estabilidad física de la proteína purificada, por ejemplo, liofilizada. Esto inhibirá la agregación a través de interacciones hidrofóbicas, así como mecanismos covalentes que pueden incrementar a mediada que las proteínas se despliegan. Las formulaciones estabilizantes en este contexto incluyen a menudo formulaciones basadas en polímero, por ejemplo, un sistema de formulación de hidrogel degradable/liberación. Tal como se ha indicado anteriormente, el papel crítico del agua en la estructura, función y estabilidad de la proteína es conocido. Habitualmente, las proteínas son relativamente estables en el estado sólido con gran parte del agua eliminada. Sin embargo, las formulaciones de proteínas terapéuticas sólidas se hidratan tras el almacenamiento a humedades elevadas o durante la liberación a partir de una composición o dispositivo de liberación sostenida. La estabilidad de proteínas disminuye generalmente con el aumento de la hidratación. El agua también puede jugar un papel significativo en la agregación de proteínas sólidas, por ejemplo, mediante el incremento de la flexibilidad de las proteínas, dando lugar a una mayor accesibilidad de grupos reactivos, mediante la disposición de una fase móvil para reactivos, y mediante la utilización como reactivo en varios procesos perjudiciales, tales como la beta-eliminación e hidrólisis. [0077] Las preparaciones de proteínas que contienen entre aproximadamente un 6% y un 28% de agua son las más inestables. Por debajo de este nivel, la movilidad del agua unida y los movimientos internos de la proteína son bajos. Por encima de este nivel, la movilidad del agua y movimientos de las proteínas se aproximan a los de una hidratación total. Hasta cierto punto, en varios sistemas se ha observado un aumento de la susceptibilidad hacia la agregación en fase sólida con un aumento de la hidratación. Sin embargo, con un contenido de agua más elevado, se observa una menor agregación debido al efecto de dilución. [0078] Según estos principios, un método eficaz para estabilizar péptidos y proteínas contra la agregación en estado sólido para la liberación por la mucosa es controlar el contenido de agua en una formulación sólida y mantener la actividad del agua en la formulación a niveles óptimos. Este nivel depende de la naturaleza de la proteína, pero en general, las proteínas mantenidas por debajo de su cubrimiento de agua en “monocapa” mostrarán una estabilidad en estado sólido superior. [0079] En la presente invención se proporcionan un conjunto de aditivos, diluyentes, bases y vehículos de liberación que controlan de manera eficaz el contenido de agua para aumentar la estabilidad de las proteínas. Estos reactivos y materiales portadores eficaces como agentes anti-agregación en este sentido incluyen, por ejemplo, polímeros de varias funcionalidades, tales como polietilenglicol, dextrano, dietilaminoetil dextrano, y carboximetil celulosa, que aumentan significativamente la estabilidad y reducir la agregación en fase sólida de péptidos y proteínas mezcladas con los mismos u unidos a los mismos. En algunos casos, la actividad o estabilidad física de proteínas también se puede aumentar mediante diversos aditivos a soluciones acuosas de los fármacos peptídicos o proteicos. Por ejemplo, se pueden utilizar aditivos, tales como polioles (incluyendo azúcares), aminoácidos, proteínas, tales como colágeno y gelatina, y varias sales. [0080] Ciertos aditivos, en particular azúcares y otros polioles, también confieren una estabilidad física significativa para secar, por ejemplo, proteínas liofilizadas. Estos aditivos también se pueden utilizar en la invención para proteger las proteínas contra la agregación no sólo durante la liofilización, sino también durante el almacenamiento en el estado seco. Por ejemplo, la sacarosa y Ficoll 80 (un polímero con unidades de sacarosa) muestran una protección significativa contra la agregación de péptido o proteína durante la incubación en fase sólida bajo diversas condiciones. Estos aditivos también pueden aumentar la estabilidad de proteínas sólidas insertadas en las matrices de polímeros. [0081] Los aditivos adicionales, por ejemplo sacarosa, estabilizan proteínas contra la agregación en estado sólido en atmósferas húmedas a temperaturas elevadas, tal como puede ocurrir en ciertas formulaciones de liberación sostenida de la invención. Las proteínas, tales como gelatina y colágeno, también sirven como agentes estabilizantes

: o de relleno para reducir la desnaturalización y agregación de proteínas no estables en este contexto. Estos aditivos se pueden incorporar en procesos de fusión polimérica composiciones en la invención. Por ejemplo, se pueden preparar micropartículas de polipéptidos mediante la simple liofilización o secado por pulverización de una solución que contiene diversos aditivos estabilizantes descritos anteriormente. La liberación sostenida de péptidos y proteínas no agregados se puede obtener de este modo durante un periodo de tiempo largo. [0082] En la presente invención se proporcionan componentes y métodos preparativos adicionales, así como aditivos de formulación específicos, que proporcionan formulaciones para liberación por la mucosa de péptidos y proteínas propensos a la agregación, donde el péptido o proteína se estabiliza en una forma no agregada sustancialmente pura utilizando un agente de solubilización. Se contemplan un conjunto de componentes y aditivos para su uso en estos métodos y formulaciones. Ejemplos de estos agentes de solubilización son ciclodextrinas (CDs) que se unen selectivamente a cadenas laterales hidrofóbicas de los polipéptidos. Se ha observado que estas CDs se unen a parches hidrofóbicos de proteínas de forma que inhiben significativamente la agregación. Esta inhibición es selectiva con respecto a tanto la CD como la proteína implicada. Dicha inhibición selectiva de la agregación de proteínas proporciona ventajas adicionales en los métodos de liberación intranasal y composiciones de la invención. Los agentes adicionales para su uso en este contexto incluyen dímeros, trímeros y tetrámeros de CD con geometrías variantes controladas por los enlazadores que bloquean específicamente la agregación de péptidos y proteína. Los agentes y métodos de solubilización para la incorporación en la

invención implican el uso de péptidos y miméticos de péptidos para bloquear selectivamente las interacciones proteína-proteína. En un aspecto, la unión específica de las cadenas laterales hidrofóbicas indicadas para los multímeros de CD se extiende a proteínas a través del uso de péptidos y miméticos de péptidos que bloquean de manera similar la agregación de proteínas. Se encuentran disponibles un amplio conjunto de métodos adecuados y agentes anti-agregación para la incorporación en las composiciones y procedimientos de la invención. Agentes de modificación de carga y de control de pH y métodos [0083] Para mejorar las características de transporte de agentes biológicamente activos (incluyendo péptido regulador de glucosa, otros péptidos y proteínas activas y fármacos macromoleculares y de molécula pequeña) para la mayor liberación a través de barreras de membrana de la mucosa hidrofóbicas, la presente invención también proporciona técnicas y reactivos para la modificación de la carga de agentes biológicamente activos seleccionados o agentes potenciadores de la liberación descritos aquí. En este aspecto, las permeabilidades relativas de macromoléculas están relacionadas en general con sus coeficientes de partición. El grado de ionización de las moléculas, que depende del pKa de la molécula y el pH en la superficie de la membrana mucosal, también afecta a la permeabilidad de las moléculas. La permeación y partición de los agentes biológicamente activos, incluyendo péptido regulador de glucosa y análogos de la invención, para la liberación mucosal se pueden facilitar mediante la alteración de la carga o la dispersión de la carga del agente activo

: o agente permeabilizante, que se consigue, por ejemplo, mediante la alteración de grupos funcionales cargados, mediante la modificación del pH del vehículo o solución de liberación en el que se libera el agente activo, o mediante la administración coordinada de un reactivo que altera la carga o el pH con el agente activo. [0084] En concordancia con estas enseñanzas generales, la liberación mucosal de especies macromoleculares cargadas, incluyendo péptido regulador de glucosa y otros péptidos y proteínas biológicamente activos, en los métodos y composiciones de la invención mejora sustancialmente cuando el agente activo se libera a la superficie mucosal en un estado de carga eléctrica sustancialmente no ionizado o neutro. [0085] Ciertos péptidos reguladores de la glucosa y otros componentes de péptidos y proteínas biológicamente activos de las formulaciones para la mucosa para su uso en la invención se modificarán en la carga para producir un aumento en la densidad de carga positiva del péptido o proteína. Estas modificaciones se extienden también a la cationización de conjugados de péptidos y proteínas, portadores y otras formas de

liberación descritas aquí. La cationización ofrece un medio conveniente de alteración de las propiedades de biodistribución y transporte de proteínas y macromolécula en la invención. La cationización se realiza de manera que conserva sustancialmente la actividad biológica del agente activo y limita potencialmente los efectos secundarios adversos, incluyendo daño en el tejido y toxicidad. Agentes inhibidores de enzimas degradativas y métodos [0086] Otro excipiente que se puede incluir en la preparación trans-mucosal es un inhibidor de enzimas degradativas. Entre los ejemplos de complejos inhibidores de enzimas-polímero mucoadhesivo que son útiles en las formulaciones de liberación mucosal y métodos de la invención se incluyen, pero sin limitación: carboximetilcelulosa-pepestatina (con actividad anti-pepsina); inhibidor de poli(ácido acrílico)-Bowman-Birk (anti-quimiotripsina); Poli(ácido acrílico)-quimioestatina (antiquimiotripsina); Poli (ácido acrílico)-elastatinal (anti-elastasa); carboximetilcelulosaelastatinal (anti-elastasa); Policarbofilo-elastatinal (anti-elastasa); Quitosano-antipaína (anti-tripsina); Poli(ácido acrílico)-bacitracina (anti-aminopeptidasa N); Quitosano-EDTA (anti-aminopeptidasa N, anti-carboxipeptidasa A); Quitosano-EDTA-antipaína (anti-tripsina, anti-quimiotripsina, antielastasa). Tal como se describe en detalle a continuación, ciertas realizaciones de la invención incorporarán opcionalmente un nuevo derivado de quitosano o forma químicamente modificada de quitosano. Uno de dichos nuevos derivados para su uso en la invención se indica como polímero de β[1→4]-2-guanidino-2-desoxi-D-glucosa (poli-GuD). [0087] Cualquier inhibidor que inhiba la actividad de una enzima para proteger el agente o agentes biológicamente activos se puede utilizar de manera útil en la composición y usos terapéuticos de la invención. Los inhibidores de enzimas útiles para la protección de proteínas biológicamente activas y péptidos incluyen, por ejemplo, inhibidor de tripsina de soja e inhibidor de tripsina y quimiotripsina aislado de tubérculos de patata (solanum tuberosum L.). Se puede utilizar una combinación o mezclas de inhibidores. Los inhibidores adicionales de enzimas proteolíticas para su use en la invención incluyen enzima ovomucoide, mesilato de gabaxato, alfalantitripsina, aprotinina, amaestatina, bestatina, puromicina, bacitracina, leupepsina, alfa2-macroglobulina, pepestatina e inhibidor de tripsina de clara de huevo o soja. Estos y otros inhibidores se pueden utilizar solos o combinados. El inhibidor o inhibidores se pueden incorporar en un portador o unidos al mismo, por ejemplo, un polímero hidrofílico, recubierto en la superficie de la forma de dosificación que está en contacto con la mucosa nasal, o incorporado en la fase superficial de la superficie, combinado con el agente biológicamente activo o en una formulación administrada por separado (por ejemplo, preadministrada). [0088] La cantidad del inhibidor, por ejemplo de un inhibidor de enzima proteolítica que se incorpora opcionalmente en las composiciones de la invención variará dependiendo de (a) las propiedades del inhibidor específico, (b) e número de grupos funcionales presentes en la molécula (que pueden reaccionar para introducir la insaturación etilénica necesaria para la copolimerización con monómeros que forman hidrogeles), y (c) el número de grupos lectinas , tales como glicósidos, que están presentes en la molécula inhibidora. También puede depender del agente terapéutico específico que se pretende administrar. En general, una cantidad útil de un inhibidor de enzimas varía de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, a menudo de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, y más habitualmente de aproximadamente 0,5 mg/ml a 5 mg/ml de la formulación (es decir, una formulación de inhibidor de proteasas separado o formulación combinada con el inhibidor y el agente biológicamente activo). [0089] En el caso de inhibidores de tripsina, los inhibidores adecuados se pueden seleccionar entre, por ejemplo, aprotinina, BBI, inhibidor de tripsina de soja, ovomucoide de pollo, ovoinhibidor de pollo, inhibidor de tripsina de exendina humana, mesilato de camostato, inhibidores de flavonoides, antipaína, leupeptina, paminobenzamidina, AEBSF, TLCK (tosillisina clorometilcetona), APMSF, DFP, PMSF, y derivados de poli(acrilato). En el caso de la inhibición de quimiotripsina, los inhibidores adecuados se pueden seleccionar entre, por ejemplo, aprotinina, BBI, inhibidor de tripsina de soja, quimioestatina, benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, FK-448, ovoinhibidor de pollo, complejos de ácidos bifenil boxónico con azúcares, DFP, PMSF, β-fenilpropionato, y derivados de poli(acrilato). En el caso de inhibición de elastasa, los inhibidores adecuados se pueden seleccionar entre, por ejemplo, elastatinal, metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetona (MPCMK), BBI, inhibidor de tripsina de soja, ovoinhibidor de pollo, DFP, y PMSF. [0090] Los inhibidores de enzimas adicionales para su uso en la invención se seleccionan de un amplio rango de inhibidores no proteicos que varían en su grado de potencia y toxicidad. Tal como se describe con más detalle a continuación, la inmovilización de estos agentes adjuntos a matrices u otros vehículos de liberación, o el desarrollo de análogos modificados químicamente se puede realizar fácilmente para reducir o incluso eliminar, cuando se hallan, los efectos tóxicos. Entre este amplio grupo de inhibidores de enzimas candidatos para su uso en la presente invención se encuentran los inhibidores organofósforos, tales como diisopropilfluorofosfato (DFP) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), que son potentes inhibidores reversibles de serin proteasas (por ejemplo, tripsina y quimiotripsina). La inhibición adicional de acetilcolinesterasa por estos compuestos los hace altamente tóxicos en dispositivos de liberación no controlados. Otro inhibidor candidato, fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF), tiene una actividad inhibidora comparable con DFP y PMSF, pero es destacadamente menos tóxico. El clorhidrato de fluoruro de (4aminofenil)-metanosulfonilo (APMSF) es otro potente inhibidor de tripsina, pero es tóxico en dispositivos no controlados. A diferencia de estos inhibidores, el metanosulfonato de 4-(4-isopropilpiperadinocarbonil)fenil-1,2,3,4-tetrahidro-1napftoato (FK-448) es una sustancia poco tóxica, que representa un inhibidor potente y específico de quimiotripsina. Más representantes de este grupo no proteico de candidatos inhibidores y que muestran también un riesgo tóxico bajo son el mesilato de camostato (N,N’-dimetil carbamoilmetil-p-(p -guanidino-benzoiloxi)fenilacetato metano-sulfonato). [0091] Otro agente inhibidor de enzimas para su uso en los usos terapéuticos y composiciones de la presente invención son aminoácidos y aminoácidos modificados que interfieren con la degradación enzimática de compuestos terapéuticos específicos. Para su uso en este contexto, los aminoácidos y aminoácidos modificados son sustancialmente no tóxicos y se pueden producir a un coste bajo. Sin embargo, debido a su peso molecular bajo y buena solubilidad, se diluyen fácilmente y se absorben en medios con mucosa. Sin embargo, bajo condiciones adecuadas, los aminoácidos pueden actuar como inhibidores competitivos reversibles de las enzimas proteasas. Ciertos aminoácidos modificados pueden mostrar una actividad inhibidora mucho más fuerte. Un aminoácido modificado deseado en este contexto se conoce como un inhibidor en “estado de transición”. La fuerte actividad inhibidora de estos compuestos se basa en su similitud estructural con un sustrato en su geometría en estado de transición, mientras que se selecciona en general por tener una afinidad mucho más elevada por el sitio activo de una enzima que el propio sustrato. Los inhibidores en estado de transición son inhibidores reversibles competitivos. Entre los ejemplos de este tipo de inhibidor se encuentran los derivados del ácido α-aminoborónico, tales como boro-leucina, boro-valina y boro-alanina. El átomo de boro estos derivados puede formar un ion boronato tetraédrico que se cree que mimetiza el estado de transición de péptidos durante su hidrólisis por aminopeptidasas. Estos derivados de aminoácido son inhibidores potentes y reversibles de aminopeptidasa y se describe que la boro-leucina es más de 100 veces más eficaz en la inhibición de enzimas que la bestatina y más de 1000 veces más eficaz que la puromicina. Otro aminoácido modificado para el que se ha descrito una fuerte actividad inhibidora de proteasa es la N-acetilcisteína, que inhibe la actividad enzimática de aminopeptidasa N. Este agente adjunto también muestra propiedades mucolíticas que se pueden utilizar en métodos y composiciones de la presente invención para reducir los efectos de la barrera de difusión de la mucosidad. [0092] Se pueden seleccionar otros inhibidores de enzima para su uso en los métodos de administración coordinada y formulaciones combinatorias de la invención entre inhibidores de enzima de péptidos y péptidos modificados. Un representante importante de esta clase de inhibidores es el dodecapéptido cíclico, bacitracina, obtenido de Bacillus licheniformis. Además de estos tipos de péptidos, ciertos dipéptidos y tripéptidos muestran una actividad inhibidora débil no específica hacia ciertas proteasas. Por analogía con los aminoácidos, su actividad inhibidora se puede mejorar mediante modificaciones químicas. Por ejemplo, los análogos de dipéptidos de ácido fosfónico también son inhibidores de “estado de transición” con una fuerte actividad inhibidora hacia las aminopeptidasas. Se ha descrito que se han utilizado para estabilizar la encefalina leucina administrada de forma nasal. Otro ejemplo de un análogo en estado de transición es la pepestatina pentapéptido modificada, que es un inhibidor muy potente de pepsina. El análisis estructural de pepestatina, mediante el análisis de la actividad inhibidora de varios análogos sintéticos, mostró las principales características de estructura y función de la molécula responsable de la actividad inhibidora. Otro tipo especial de péptido modificado incluye inhibidores con una función aldehído situada de forma terminal en su estructura. Por ejemplo, se ha observado que la secuencia benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, que cumple los requisitos de especificidad primaria y secundaria conocidos de la quimiotripsina, es un inhibidor reversible potente de esta proteinasa diana. Las estructuras químicas de inhibidores adicionales con una función aldehído situada de forma terminal, por ejemplo, antipaína, leupeptina, quimioestatina y elastatinal, también son conocidas en la técnica como las estructuras de otros inhibidores de péptido modificados reversibles conocidos, tales como fosforamidon, bestatina, puromicina y amastatina. [0093] Debido a sus masas moleculares comparativamente elevadas, los inhibidores de proteasas polipeptídicos son más susceptibles que compuestos más pequeños a la liberación concentrada en una matriz fármaco-portador. Los agentes adicionales para la inhibición de proteasas en las formulaciones y métodos de la invención implican el uso de agentes complejantes. Estos agentes median en la inhibición de la enzima mediante la privación del medio intranasal (o composición preparativa o terapéutica) de cationes divalentes, que son cofactores para muchas proteasas. Por ejemplo, los agentes complejantes EDTA y DTPA como agentes adjuntos administrados de manera coordinada o formulados de manera combinatoria, en la concentración adecuada, será suficiente para inhibir proteasas seleccionadas para aumentar de este modo la liberación intranasal de agentes biológicamente activos según la invención. Más representantes de esta clase de agentes inhibidores son EGTA, 1,10-fenantrolina y hidroxiquinolina. Además, debido a su propensión a cationes divalentes quilato, estos y otros agentes complejantes son útiles en la invención como agentes directos, promotores de la absorción. [0094] Tal como se indica en más detalle en otros puntos de la memoria, también se contempla el uso de varios polímeros, particularmente polímeros mucoadhesivos, como agentes inhibidores de enzimas en la administración coordinada, métodos de procesado y/o métodos de formulación combinatoria y composiciones de la invención. Por ejemplo, los derivados de poli(Acrilato), tales como ácido poliacrílico y policarbofilo, pueden afectar en la actividad de varias proteasas, incluyendo tripsina, quimiotripsina. El efecto inhibidor de estos polímeros también se puede basar e la complejación de cationes divalentes, tales como Ca2+ y Zn2+. También se contempla que estos polímeros pueden actuar como compañeros conjugados o portadores para agentes inhibidores de enzimas adicionales, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se ha desarrollado un conjugado quitosano-EDTA y es útil en la invención y muestra un fuerte efecto inhibidor hacia la actividad enzimática de proteasas dependientes de zinc. Las propiedades multiadhesivas de los polímeros tras la unión covalente de otros inhibidores de enzimas en este contexto no se espera que estén sustancialmente comprometidas, ni se espera que disminuya la utilidad general de dichos polímeros como vehículo de administración para agentes biológicamente activos. Por el contrario, la distancia reducida entre el vehículo de administración y la superficie de la mucosa obtenida por el mecanismo mucoadhesivo minimizará el metabolismo presistémico del agente activo, mientras que los inhibidores de enzimas unidos covalentemente permanecen concentrados en el punto de administración del fármaco, minimizando efectos de dilución no deseados de los inhibidores, así como efectos tóxicos y otros efectos secundarios causados por los mismos. De este modo, la cantidad eficaz de un inhibidor de enzimas administrado de forma coordinada se puede reducir debido a la exclusión de efectos de dilución.

[0095] Entre los ejemplos de complejos polímero mucoadhesivo-inhibidor de enzimas que son útiles en las formulaciones de la mucosa y métodos de la invención se incluyen, pero sin limitación: carboximetilcelulosa-pepestatina (con actividad antipepsina); ácido poliacrílico-inhibidor Bowman-Birk (anti-quimiotripsina); ácido poliacrílico-quimioestatina (anti-quimiotripsina); ácido poliacrílico-elastatinal (antielastasa); carboximetilcelulosa-elastatinal (anti-elastasa); Policarbofilo-elastatinal (anti-elastasa); quitosano-antipaína (anti-tripsina); ácido poliacrílico-bacitracina (antiaminopeptidasa N); quitosano-EDTA (anti-aminopeptidasa N, anti-carboxipeptidasa A); quitosano-EDTA-antipaína (anti-tripsina, anti-quimiotripsina, antielastasa). Agentes mucolíticos y depuradores de mucosidad y métodos [0096] La liberación eficaz de agentes bioterapéuticos a través de administración intranasal debe tener en cuenta la menor velocidad de transporte de fármacos a través del recubrimiento de mucosidad protectora de la mucosa nasal, además de la pérdida de fármaco debido a la unión de las glicoproteínas de la capa de mucosidad. La mucosidad normal es una sustancia viscoelástica de tipo gel que consiste en agua, electrolitos, mucinas, macromoléculas y células epiteliales desprendidas. Actúa principalmente como citoprotector y lubricante que cubre los tejidos de mucosa subyacentes. La mucosidad es secretada por células secretoras distribuidas al azar localizadas en el epitelio nasal y en otros epitelios de la mucosa. La unidad estructural de la mucosidad es la mucina. Esta glicoproteína es principalmente responsable para la naturaleza viscoelástica de la mucosidad, aunque otras macromoléculas también pueden contribuir a esta propiedad. En la mucosidad respiratoria, dichas macromoléculas incluyen IgA, IgM, IgE secretoras producidas localmente, lisozima y broncotransferrina, que también juegan un papel importante en mecanismos de defensa del huésped. [0097] Los usos terapéuticos de la administración coordinada de la presente invención incorporan opcionalmente agentes mucolíticos eficaces o agentes depuradores de la mucosidad, que actúan para degradar mucosidad delgada o clara de las superficies de la mucosa intranasal para facilitar la absorción de agentes bioterapéuticos administrados intranasalmente. En estos usos, un agente mucolítico o depurador de la mucosa se administra coordinadamente como compuesto adjunto para aumentar la administración intranasal del agente biológicamente activo. Alternativamente, se incorpora una cantidad eficaz de un agente mucolítico o depurador de la mucosidad como agente de procesamiento en un método procesado múltiple de la invención, o como aditivo en una formulación combinatoria de la invención, para proporcionar una formulación mejorada que potencia la liberación intranasal de compuestos bioterapéuticos mediante la reducción de los efectos barrera de la mucosidad intranasal. [0098] Existen un conjunto de agentes mucolíticos o depuradores de la mucosidad para la incorporación en los usos terapéuticos y composiciones de la invención. En base a sus mecanismos de acción, los agentes mucolíticos y depuradores de mucosidad se pueden clasificar a menudo en los siguientes grupos: proteasas (por ejemplo, pronasa, papaína) que dividen el núcleo de la proteína de glicoproteínas de mucina; compuestos sulfhidrilo que rompen las uniones disulfuro de las mucoproteínas, y detergentes (por ejemplo, Triton X-100, Tween 20) que rompen enlaces no covalentes en la mucosidad. Los compuestos adicionales en este contexto incluyen, pero sin limitación, sales biliares y tensoactivos, por ejemplo, desoxicolato sódico, taurodesoxicolato sódico, glicocolato sódico y lisofosfatidilcolina. [0099] La eficacia de las sales biliares en provocar la rotura estructural de la mucosidad es en el orden desoxicolato > taurocolato > glicocolato. Otros agentes eficaces que reducen la viscosidad o adhesión de la mucosidad para aumenta la administración intranasal según la invención incluyen, por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta, y agentes mucolíticos que funcionan por quelación, tal como péptidos Nacilcolágeno, ácido biliares y saponinas (el último actúa en parte por quelación con Ca2+ y/o Mg 2+ que juegan un papel importante en el mantenimiento de la estructura en capas de la mucosidad). [0100] Los agentes mucolíticos adicionales para su uso en los usos terapéuticos y composiciones de la invención incluyen N-acetil-L-cisteína (ACS), un potente agente mucolítico que reduce tanto la viscosidad como la adherencia de mucosidad broncopulmonar y se describe que incrementa de manera moderada la biodisponibilidad nasal de la hormona de crecimiento humana en ratas anestesiadas (del 7,5 al 12,2%). Estos y otros agentes mucolíticos y depuradores de la mucosidad se ponen en contacto con la mucosa nasal, habitualmente en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,2 a 20 mM, coordinadamente con la administración del agente biológicamente activo, para reducir la viscosidad polar y/o la elasticidad de la mucosidad intranasal. [0101] Otros agentes mucolíticos o depuradores de la mucosidad se pueden seleccionar de un conjunto de enzimas glucosidasa, que son capaces de dividir enlaces glicosídicos en la glicoproteína de la mucosidad. Las α-amilasa y β-amilasa son representativas de esta clase de enzimas, aunque su efecto mucolítico puede estar limitado. En cambio, las glicosidasas bacterianas permiten que estos microorganismos permeen las capas de mucosidad de sus huéspedes. [0102] Para el uso combinado con la mayoría de agentes biológicamente activos en la invención, incluyendo agentes terapéuticos de péptidos y proteínas, los detergentes no ionogénicos son también en general útiles como agentes mucolíticos o depuradores de la mucosidad. Estos agentes habitualmente no modificarán o afectarán sustancialmente la actividad de los polipéptidos terapéuticos. Agentes cilioestáticos y métodos [0103] Debido a la capacidad de autolimpieza de ciertos tejidos de mucosa (por ejemplo, tejidos de mucosa nasal) mediante depuración mucociliar es necesaria una función protectora (por ejemplo, para eliminar el polvo, alérgenos y bacterias), se ha considerado en general que esta función no debería verse afectada por medicación para la mucosa. El transporte mucociliar en el tracto respiratorio es un mecanismo de defensa particularmente importante contra infecciones. Para conseguir esta función, el golpeo ciliar en las fosas nasales y vías respiratorias mueve una capa de mucosidad a lo largo de la mucosa para eliminar las partículas inhaladas y microorganismos. [0104] Los agentes cilioestáticos son útiles en los métodos y composiciones de la invención para incrementar el tiempo de residencia del péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí administrados por la mucosa (por ejemplo, intranasalmente). En particular, la administración de estos agentes en los métodos y composiciones de la invención aumenta significativamente en ciertos aspectos por la administración coordinada o formulación combinatoria de uno o más agentes cilioestáticos que actúan inhibiendo reversiblemente la actividad ciliar de células de la mucosa, para proporcionar un incremento reversible temporal en el tiempo de residencia del agente o agentes activos administrados por la mucosa. Para su uso en estos aspectos de la invención, los factores cilioestáticos anteriores, específicos o indirectos en su actividad, son todos candidatos para la utilización satisfactoria como agentes cilioestáticos en cantidades apropiadas (dependiendo de la concentración, duración y modo de administración), de manera que producen una reducción transitoria (es decir, reversible) o cese de la depuración mucociliar en un punto de administración en la mucosa para aumentar la administración del péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, sin efectos secundarios inaceptablemente adversos. [0105] En aspectos más detallados, se utiliza un factor cilioestático específico en un protocolo de formulación combinada o administración coordinada con una o más proteínas péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y/o agentes biológicamente activos descritos aquí. Se pueden utilizar en estas realizaciones de la invención varios factores cilioestáticos bacterianos aislados y caracterizados en la literatura. Los factores cilioestáticos de la bacteria Pseudomonas aeruginosa incluyen un derivado de fenazina, un compuesto pio (2-alquil-4-hidroxiquinolinas), y un ramnolípido (también conocido como hemolisina). El compuesto pio producía cilioestasis en concentraciones de 50 μg/ml y sin lesiones ultraestructurales obvias. El derivado de fenazina también inhibía la motilidad ciliar, pero causaba cierta alteración de la membrana, aunque a concentraciones sustancialmente superiores de 400 μg/ml. La exposición limitada de explantes traqueales al rhamnolípido dio lugar a cilioestasis, que se asocia con membranas filiares alteradas. Una exposición más extensa a rhamnolípido se asocia con la eliminación de brazos de dineína de los axonemas. Agentes activos en superficie y métodos [0106] Se pueden utilizar uno o más agentes potenciadores de la penetración de membrana en un uso terapéutico para la liberación por la mucosa o formulación de la invención para aumentar la liberación por la mucosa de proteínas o péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. Los agentes potenciadores de la penetración de membrana en este contexto se pueden seleccionar entre: (i) un tensoactivo, (ii) una sal biliar, (iii) un aditivo fosfolípido, micela mixta, liposoma, o portador, (iv) un alcohol, (v) una enamina, (vi) un compuesto dador de NO, (vii) una molécula anfipática de cadena larga (viii) potenciadores hidrofóbicos pequeños de la penetración; (ix) sodio o derivado del ácido salicílico; (x) un glicerol éster del ácido acetoacético (xi) un derivado de ciclodextrina o beta-ciclodextrina, (xii) un ácido graso de cadena media,

(xiii) un agente quelante, (xiv) un aminoácido o sal del mismo, (xv) un Nacetilaminoácido o sal del mismo, (xvi) una enzima degradativa para componente de la membrana seleccionado, (xvii) un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, o (xviii) un inhibidor de la síntesis de colesterol; o (xix) cualquier combinación de agentes potenciadores de la penetración de membrana mencionados en (i)-(xix). [0107] Ciertos agentes activos en superficie se incorporan fácilmente en las formulaciones de liberación por la mucosa y suso terapéuticos de la invención como agentes potenciadores de la absorción en la mucosa. Estos agentes, que se pueden administrar de manera coordinada o formular de manera combinatoria con las proteínas o péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, se pueden seleccionar de un amplio conjunto de tensoactivos conocidos. Los tensoactivos, que se encuentran generalmente en tres clases: (1) éteres de polioxietileno no iónicos; (2) sales biliares, tales como glicocolato sódico (SGC) y desoxicolato (DOC); y (3) derivados de ácido fusídico, tales como taurodihidrofusidato sódico (STDHF). Los mecanismos de acción de estas diversas clases de agentes activos en superficie incluyen habitualmente la solubilización del agente biológicamente activo. Para las proteínas y péptidos que a menudo forman agregados, las propiedades activas en superficie de estos promotores de la absorción pueden permitir interacciones con proteínas, de manera que unidades más pequeñas, tales como monómeros recubiertos de tensoactivo, se pueden mantener más fácilmente en solución. Entre los ejemplos de otros agentes activos en superficie son L-αdidecanoil fosfatidilcolina (DDPC), polisorbato 80 y polisorbato 20. Estos monómeros son presumiblemente unidades más transportables que los agregados. Un segundo potencial mecanismo es la protección del péptido o proteína de la degradación proteolítica por proteasas en el medio de la mucosa. Tanto las sales biliares como los derivados de ácido fusídico, según se ha descrito, inhiben la degradación proteolítica de proteínas por homogenatos nasales a concentraciones inferiores o equivalentes a las requeridas para aumentar la absorción de las proteínas. Esta inhibición de proteasas puede ser especialmente importante para péptidos con una vida media biológica corta. Enzimas de degradación e inhibidores de la síntesis de ácidos grasos y colesterol [0108] En aspectos relacionados de la invención, las proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos para la administración en la mucosa se pueden formular o administrar de manera coordinada con una agente potenciador de la penetración seleccionado entre una enzima degradativa, o un agente estimulador metabólico o inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, esteroles u otros componentes de la barrera epitelial seleccionados, Patente de Estados Unidos No. 6,190,894. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas degradativas, tales como fosfolipasa, hialuronidasa, neuraminidasa y condroitinasa para aumentar la penetración en la mucosa de proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos sin causar daños irreversibles a la barrera de la mucosa. En una realización, se utiliza la condroitinasa en un uso o composición terapéutica tal como se proporciona aquí para alterar los constituyentes de glicoproteína o glicolípido de la barrera de permeabilidad de la mucosa, aumentando así la absorción en la mucosa de proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos en la presente invención. [0109] Con respecto a los inhibidores de la síntesis de constituyentes de la barrera de la mucosa, se destaca que los ácidos grasos libres representan el 20-25% de los lípidos epiteliales en peso. Las dos enzimas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de ácidos grasos libres son la acetil CoA carboxilasa y ácido graso sintetasa. A través de una serie de etapas, los ácidos grasos libres se metabolizan en fosfolípidos. De este modo, los inhibidores de la síntesis y metabolismo de ácidos grasos libres para su uso en los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan, inhibidores de acetil CoA carboxilasa, tales como ácido 5-tetradeciloxi-2furancarboxílico (TOFA); inhibidores de ácido graso sintetasa; inhibidores de fosfolipasa A, tal como gomisina A, ácido 2-(p-amilcinnamil)amino-4-clorobenzoico, bromuro de bromofenacilo, monoalido, ácido 7,7-dimetil-5,8-eicosadienoico, nicergolina, cefarantina, nicardipina, quercetina, AMP dibutiril-cíclico, R-24571, Noleoiletanolamina, N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) fosfastidil serina, ciclosporina A, anestésicos tópicos, incluyendo dibucaína, prenilamina, retinoides, tales como ácido todo-trans retinoico y ácido 13-cis-retinoico, W-7, trifluoperazina, R-24571 (calmidazolio), 1-hexadocil-3-trifluoroetil glicero-sn-2-fosfomentol (MJ33); bloqueadores de canales de calcio, incluyendo nicardipina, verapamilo, diltiazem, nifedipina, y nimodipina; antimalariales, incluyendo quinacrina, mepacrina, cloroquina e hidroxicloroquina; bloqueadores beta, incluyendo propanalol y labetalol; antagonistas de calmodulina; EGTA; timersol; glucocorticosteroides, incluyendo dexametasona y prednisolona; y agentes antiinflamatorios no esteroidales, incluyendo indometacina y naproxeno. [0110] Los esteroles libres, principalmente colesterol, representan el 20-25% de los lípidos epiteliales en peso. La enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol es la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG) CoA reductasa. Los inhibidores de la síntesis del colesterol para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, inhibidores competitivos de (HMG) CoA reductasa, tales como simvastatina, lovastatina, fluindostatina (fluvastatina), pravastatina, mevastatina, así como otros inhibidores de HMG CoA reductasa, tales como oleato de colesterol, sulfato y fosfato de colesterol y esteroles oxigenados, tales como 25-OH--y 26-OH--colesterol; inhibidores de la escualeno sintetasa; inhibidores de la escualeno epoxidasa; inhibidores de DELTA7 o DELTA24 reductasas, tales como 22,25-diazacolesterol, 20,25-diazacolestenol, AY9944, y triparanol. [0111] Cada uno de los inhibidores de la síntesis de ácidos grasos o los inhibidores de la síntesis de esteroles se pueden administrar de manera coordinada o se formulan de manera combinada con una o más proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos en la presente invención para conseguir una mayor penetración epitelial del agente o agentes activos. Un intervalo de concentraciones eficaces para el inhibidor de esterol en una formulación terapéutica o adjunta para la liberación por la mucosa es en general de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 20% en peso del total, más habitualmente desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%. Agentes dadores de óxido nítrico y métodos [0112] Se selecciona un dador de óxido nítrico (NO) como un agente potenciador de la penetración de membrana para aumentar la liberación por la mucosa de una o más proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos en la presente invención. Se conocen en la técnica varios dadores de NO y son útiles en concentraciones eficaces en los métodos y formulación de la invención. Entre los ejemplos de dadores de NO incluyen, pero sin limitación, nitroglicerina, nitroprusido, NOC5 [3-(2-hidroxi-1-(metiletil)-2nitrosohidrazino)-1-propanamina], NOC12 [N-etil-2-(1-etil-hidroxi-2nitrosohidrazino)-etanamina], SNAP [S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina], NORI y NOR4. Dentro de los usos terapéuticos y composiciones de la invención, se administra de manera coordinada o se formula de manera combinatoria, en o a través del epitelio de la mucosa, una cantidad eficaz de un dador de NO seleccionado con una o más proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y/o agentes biológicamente activos descritos en la presente invención, Agentes para la modulación de la estructura y/o fisiología de la unión epitelial [0113] La presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una o más proteínas de péptidos reguladores de glucosa, en combinación con agentes potenciadores de la liberación por la mucosa descritos aquí formulados en una preparación farmacéutica para la liberación por la mucosa. [0114] El agente de permeabilización aumenta de manera reversible el transporte paracelular epitelial mucosal, habitualmente mediante la modulación de la estructura y/o fisiología de la unión epitelial en una superficie epitelial de la mucosa en el sujeto. Este efecto implica habitualmente la inhibición por el agente permeabilizante de la unión homotípica o heterotípica entre las proteínas adhesivas de la membrana epitelial de células epiteliales vecinas. Las proteínas diana para este bloqueo de la unión homotípica o heterotípica se pueden seleccionar entre varias moléculas de adhesión de unión (JAM) relacionadas, ocludinas o claudinas. Ejemplos de éstas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena única que se unen a los dominios extracelulares de estas proteínas. [0115] En realizaciones detalladas adicionales, la presente invención describe péptidos y análogos de péptidos permeabilizantes y miméticos para aumentar el transporte paracelular epitelial de la mucosa. Los péptidos y análogos de péptidos y miméticos del sujeto funcionan habitualmente en las composiciones y usos terapéuticos de la invención mediante la modulación de la estructura y/o fisiología de la unión epitelial en un sujeto mamífero. En ciertas realizaciones, los péptidos y análogos de péptidos y miméticos inhiben de manera eficaz la unión homotípica y/o heterotípica de una proteína adhesiva de membrana epitelial selecciona entre una molécula de adhesión de unión (JAM), ocludina o claudina. [0116] Uno de dichos agentes que se ha estudiado ampliamente es la toxina bacteriana de la Vibrio cholerae conocida como la “toxina oclusora de zona” (ZOT). Esta toxina media el incremento de la permeabilidad en la mucosa intestinal y provoca síntomas de enfermedad incluyendo diarrea en sujetos infectados. Fasano et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 8:5242-5246 (1991). Cuando se ensaya sobre mucosa ileal de conejo, la ZOT incrementaba la permeabilidad intestinal mediante la modulación de la estructura de uniones estrechas intercelulares. Más recientemente, se ha observado que la ZOT es capaz de abrir reversiblemente las uniones estrechas en la mucosa intestinal. También se ha descrito que la ZOT es capaz abrir reversiblemente uniones estrechas en la mucosa nasal. Patente de Estados Unidos No. 5,908,825. [0117] En los usos terapéuticos y composiciones descritas en la invención, ZOT, así como varios análogos y miméticos de ZOT que actúan como agonistas o antagonistas de la actividad de ZOT, son útiles para aumentar la liberación intranasal de agentes biológicamente activos mediante el incremento de la absorción paracelular en la mucosa nasal o a través de la misma. En este contexto, la ZOT actúa habitualmente provocando una reorganización estructural de uniones estrechas marcadas por una localización alterada de la proteína de unión ZO1. En estos aspectos de la invención, la ZOT se administra de forma coordinada o se formula de forma combinatoria con el agente biológicamente activo en una cantidad eficaz para producir una absorción significativamente aumentada del agente activo, mediante el incremento reversible de la permeabilidad en la mucosa nasal sin efectos secundarios adversos sustanciales. Agentes vasodilatadores y métodos [0118] Otra clase de agentes promotores de la absorción que muestran una utilidad ventajosa en los métodos de administración coordinada y formulación combinatoria y composiciones de la invención son compuestos vasoactivos, más específicamente vasodilatadores. Estos compuestos actúan en la invención modulando la estructura y fisiología de la vasculatura de la submucosa; incrementando la velocidad de transporte del péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos en el epitelio de la mucosa o a través del mismo y/o a tejidos o compartimentos diana específicos (por ejemplo, la circulación sistémica o el sistema nervioso central). [0119] Los agentes vasodilatadores que se pueden utilizar en la invención provocan habitualmente una relajación de los vasos sanguíneos de la submucosa mediante un descenso del calcio citoplasmático, un incremento en el óxido nítrico (NO) o mediante la inhibición de la quinasa de cadena ligera de miosina. Se dividen en general en 9 clases: antagonistas de calcio, abridores de los canales de potasio, inhibidores ACE, antagonistas de receptor de angiotensina II, antagonistas de receptores α-adrenérgicos e imidazol, agonistas β1-adrenérgicos, inhibidores de fosfodiesterasa, eicosanoides y dadores de NO. [0120] A pesar de las diferencias químicas, las propiedades farmacocinéticas de los antagonistas de calcio son similares. La absorción en la circulación sistémica es elevada y estos agentes, por tanto, experimentan un metabolismo de primer paso considerable por el hígado, dando lugar a una variación individual en la farmacocinética. A excepción de los fármacos más nuevos del tipo dihidropiridina (amlodipina, felodipina, isradipina, nilvadipina, nisoldipina y nitrendipina), la vida media de los antagonistas de calcio es corta. Por lo tanto, para mantener una concentración eficaz de fármaco, muchos de éstos pueden requerir la liberación mediante dosificación múltiple, o formulaciones de liberación controlada, tal como se describe en otros puntos de la memoria. El tratamiento con al abridor del canal de potasio monoxidilo también puede estar limitado en la manera y nivel de administración debido a los potenciales efectos secundarios adversos. [0121] Los inhibidores de ACE evitan la conversión de angiotensina-I a angiotensina-II y son más eficaces cuando se incrementa la producción de renina. Dado que ACE es idéntica a la quininasa-II, la cual inactiva el potente vasodilatador endógeno bradiquinina, la inhibición de ACE provoca una reducción en la degradación de bradiquinina. Los inhibidores de ACE proporcionan la ventaja añadida de efectos cardioprotectores y cardioreparadores, al evitar y revertir la fibrosis cardiaca y la hipertrofia ventricular en modelos de animales. El mecanismo de eliminación predominante de la mayoría de inhibidores de ACE es a través de la excreción renal. Por lo tanto, la incapacidad renal está asociada con una eliminación reducida y se recomienda una reducción de la dosis del 25 al 50% en pacientes con una incapacidad renal de moderada a grave. [0122] Con respecto a los dadores de NO; estos compuestos son particularmente útiles en la invención por sus efectos adicionales en la permeabilidad de la mucosa. Además de los dadores de NO indicados anteriormente, los complejos de NO con nucleófilos denominados NO/nucleófilos o NONOatos, liberan de manera espontánea y no enzimática NO cuando se disuelven en solución acuosa a pH fisiológico. En cambio, los nitro vasodilatadores, tales como la nitroglicerina, requieren una actividad enzimática específica para la liberación de NO. Los NONOatos liberan NO con una estequiometría definida y a unas velocidades predecibles que varían desde <3 minutos para dietilamina/NO hasta aproximadamente 20 horas para dietilentriamina/NO (DETANO). [0123] En ciertos usos terapéuticos y composiciones de la invención, un agente vasodilatador seleccionado se puede administrar de manera coordinada (por ejemplo, sistémicamente o intranasalmente, simultáneamente o en una asociación temporal eficaz de manera combinatoria) o formular de manera combinatoria con uno o más péptidos reguladores de glucosa, y otro u otros agentes biológicamente activos en una cantidad eficaz para aumentar la absorción en la mucosa del agente o agentes activos para alcanzar un tejido o compartimento diana en el sujeto (por ejemplo, el hígado, la vena porta hepática, tejido o fluido SNC, o plasma sanguíneo). Agentes potenciadores de transporte selectivos [0124] Las composiciones y usos terapéuticos de la invención incorporan opcionalmente un agente potenciador del transporte selectivo que facilita el transporte de uno o más agentes biológicamente activos. Estos agentes potenciadores del transporte se pueden utilizar en un protocolo de formulación combinatoria o administración coordinada con uno o más péptidos o proteínas reguladores de glucosa, análogos y miméticos descritos aquí, para potenciar de forma coordinada la liberación de uno o más agentes biológicamente activos adicionales a través de las barreras de transporte de la mucosa, para potenciar la liberación por la mucosa del agente o agentes activos para alcanzar un tejido o compartimento diana en el sujeto (por ejemplo, el epitelio de la mucosa, hígado, tejido o fluido de SNC, o plasma sanguíneo). Alternativamente, se pueden utilizar agentes potenciadores del transporte en un protocolo de formulación combinatoria o administración coordinada para potenciar directamente la liberación por la mucosa de uno o más de las proteínas o péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, con o sin un aumento de la liberación de un agente biológicamente activo adicional. [0125] Entre los ejemplos de agentes potenciadores del transporte selectivos para su uso en este aspecto de la invención se incluyen, pero sin limitación, glicósidos, moléculas que contienen azúcares, y agentes de unión, tales como agentes de unión a lectinas, que son conocidos por interaccionar específicamente con los componentes de la barrera de transporte epitelial. Por ejemplo, se pueden utilizar ligandos “bioadhesivos” específicos, incluyendo varias lectinas de plantas y bacterias, que se unen a grupos de azúcares de la superficie celular mediante interacciones mediadas por el receptor, como portadores o mediadores del transporte conjugados para potenciar la liberación por la mucosa, por ejemplo nasal, de agentes biológicamente activos de la invención. Ciertos ligandos bioadhesivos para su uso en la invención mediarán en la transmisión de señales biológicas a células diana epiteliales que desencadenan una captación selectiva del ligando adhesivo por procesos de transporte celular especializados (endocitosis y transcitosis). Estos mediadores de transporte se pueden utilizar, por lo tanto, como un “sistema portador” para estimular o dirigir la captación selectiva de uno o más proteínas o péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y otro u otos agentes biológicamente activos en el epitelio de la mucosa y/o a través de la misma. Estos y otros agentes potenciadores del transporte selectivos aumentan significativamente la liberación por la mucosa de compuestos biofarmacéuticos macromoleculares (particularmente péptidos, proteínas, oligonucleótidos y vectores polinucleótidos) de la invención. Las lectinas son proteínas de plantas que se unen a azúcares específicos hallados en la superficie de glicoproteínas y glicolípidos de células eucariotas. Las soluciones concentradas de lectinas tienen un efecto “mucoatractivo” y varios estudios han demostrado una rápida endocitosis mediada por receptor (RME) de lectinas y conjugados de lectinas (por ejemplo, concanavalina A conjugada con partículas de oro coloidales) a través de las superficies de la mucosa. Estudios adicionales han descrito que los mecanismos de captación para lectinas se pueden utilizar para el reconocimiento in vivo de fármacos intestinales. En algunos de estos estudios, se acoplaron covalentemente nanopartículas de poliestireno (500 nm) a lectina de tomate y se describió que producían una captación sistémica mejorada después de la administración oral a ratas. [0126] Además de las lectinas de plantas, los factores de adhesión e invasión microbiana proporcionan una fuente rica de candidatos para su uso como adhesivos/portadores de transporte selectivo en usos terapéuticos de liberación por la mucosa y composiciones de la invención. Son necesarios dos componentes para los procesos de adherencia bacteriana, una “adhesina” bacteriana (factor de adherencia o colonización) y un receptor en la superficie de la célula huésped. Las bacterias que provocan infecciones en la mucosa necesitan penetrar la capa de mucosidad antes de unirse por sí mismos a la superficie epitelial. Esta unión está mediada normalmente por estructuras de fimbrias o pilus bacterianos, aunque otros componentes de la superficie celular también pueden tomar parte en el proceso. Las bacterias adherentes colonizan el epitelio de la mucosa mediante multiplicación e iniciación de una serie de reacciones bioquímicas en el interior de la célula diana a través de mecanismos de transducción de señales (con o sin la ayuda de toxinas). Asociadas con estos mecanismos invasivos, se conocen una amplia diversidad de proteínas bioadhesivas (por ejemplo, invasina, internalina) producidas originalmente por diversas bacterias y virus. Éstas permiten la unión extracelular de dichos microorganismos con una selectividad impresionante para especies huésped e incluso tejidos diana particulares. Las señales transmitidas por dichas interacciones receptor-ligando desencadenan el transporte de microorganismos vivos intactos a células epiteliales, y finalmente a través de las mismas, mediante procesos endocitóticos y transcitóticos. Dichos fenómenos naturales se pueden aprovechar (por ejemplo, mediante complejación de los agentes biológicamente activos, tales como el péptido regulador de glucosa con una adhesina) según las enseñanzas de la presente invención para la liberación aumentada de compuestos biológicamente activos en el epitelio de la mucosa o a través del mismo y/o a otros sitios diana designados para la acción del fármaco. [0127] También son útiles en los métodos y composiciones de la invención varias toxinas bacterianas y de plantas que se unen a las superficies epiteliales de una manera específica parecida a las lectinas. Por ejemplo, la toxina difteria (DT) entra en células huésped rápidamente mediante RME. Así mismo, la subunidad B de la toxina lábil con el calor de E. coli se une al borde en cepillo de las células epiteliales intestinales de una manera específica parecida a las lectinas. La captación de esta toxina y la transcitosis a la parte basolateral de los enterocitos se ha descrito in vivo e in vitro. Otras investigaciones han expresado el dominio transmembrana de la toxina de difteria en E. coli como una proteína de fusión de unión a maltosa y lo han acoplado a poli-Llisina de peso molecular elevado. El complejo resultante se utiliza satisfactoriamente para medir en la internalización de un gen informador in vitro. Además de estos ejemplos, el Staphylococcus aureus produce un conjunto de proteínas (por ejemplo, enterotoxina A de estafilococos (SEA), SEB, toxina 1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1) que actúan como superantígenos y toxinas. Los estudios relativos a estas proteínas han descrito una endocitosis facilitada dependiente de la dosis de SEB y TSST-I en células Caco-2. [0128] Las hemaglutininas virales comprenden otro tipo de agente de transporte para facilitar la liberación por la mucosa de agentes biológicamente activos en los usos terapéuticos y composiciones de la invención. La etapa inicial en muchas infecciones virales es la unión de las proteínas de superficie (hemaglutininas) a células de la mucosa. Estas proteínas de unión se han identificado para la mayoría de virus, incluyendo rotavirus, virus varicela zoster, virus del bosque de semliki, adenovirus, virus del enrollado de la hoja de la patata y reovirus. Éstas y otras hemaglutininas virales de ejemplo se pueden utilizar en una formulación combinatoria (por ejemplo, una mezcla o formulación conjugada) o un protocolo de administración coordinada con uno o más de los péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos descritos aquí, para aumentar de forma coordinada la liberación por la mucosa de uno o más agentes biológicamente activos adicionales. Alternativamente, se pueden utilizar las hemaglutininas virales en una formulación combinatoria o protocolo de administración coordinada para aumentar directamente la liberación por la mucosa de uno o más proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, con o sin aumento de la liberación de un agente biológicamente activo adicional. [0129] También están disponibles para su uso en la invención un conjunto de factores mediadores del transporte endógenos y selectivos. Las células de mamífero han desarrollado un conjunto de mecanismos para facilitar la internalización de sustratos específicos y dirigir éstos a compartimentos definidos. De manera colectiva, estos procesos de deformaciones de la membrana se denominan “endocitosis” y comprenden fagocitosis, pinocitosis, endocitosis mediada por receptor (RME mediada por clatrina) y potocitosis (RME no mediada por clatrina). La RME es un proceso biológico celular altamente específico por el cual, tal como implica su nombre, varios ligandos se unen a receptores de la superficie celular y se internalizan posteriormente y circulan en el interior de la célula. En muchas células, el proceso de endocitosis es tan activo que la superficie de la membrana completa se internaliza y se sustituye en menos de media hora. Se proponen dos clases de receptores en base a su orientación en la membrana celular; lo extremos amino de los receptores de Tipo I se localizan en la parte extracelular de la membrana, mientras que los receptores de Tipo II presentan esta misma cola de proteína en el medio intracelular.

[0130] Otras realizaciones de la invención describen transferrina como portador o estimulante de la RME de agentes biológicamente activos administrados por la mucosa. La transferrina, una glicoproteína transportador de hierro de 80 kDa, es captada de manera eficaz en las células por la RME. Los receptores de transferrina se hallan en la superficie de la mayoría de células proliferantes, en cantidades elevadas en eritroblastos y en muchos tipos de tumores. La transcitosis de transferrina (Tf) y conjugados de transferrina, según se ha descrito, aumenta en presencia de Brefeldina A (BFA), un metabolito fúngico. En otros estudios, se ha descrito que el tratamiento con BFA incrementa rápidamente la endocitosis apical de la ricina y HRP en células MDCK. De este modo, se pueden utilizar la BFA y otros agentes que estimulan el transporte mediado por receptor en los usos terapéuticos de la invención como agentes formulados de manera combinatoria (por ejemplo, conjugados) y/o administrados de forma coordinada para aumentar el transporte mediado por receptor de agentes biológicamente activos, incluyendo proteínas de péptido regulador de glucosa. Vehículos de liberación polimérica y métodos [0131] En ciertos aspectos de la invención, las proteínas de péptido regulador de glucosa, otros agentes biológicamente activos descritos aquí, y agentes potenciadores de la liberación tal como se han descrito anteriormente, se pueden incorporar individualmente o combinatoriamente, en una formulación administrada por la mucosa (por ejemplo, nasalmente) que incluye un polímero biocompatible que actúa como portador o base. Dichos portadores de polímeros incluyen polvos poliméricos, matrices, o vehículos para la liberación de micropartículas, entre otras formas de polímero. El polímero puede ser de origen vegetal, animal o sintético. A menudo, el polímero está reticulado. Adicionalmente, en los sistemas de liberación, el péptido regulador de glucosa se puede funcionalizar de manera que se puede unir covalentemente al polímero y hacerlo inseparable del polímero por simple lavado. En otras realizaciones, el polímero se modifica químicamente con un inhibidor de enzimas u otos agentes que pueden degradar o inactivar el agente o agentes biológicamente activos y/o el agente o agentes potenciadores de la liberación. En ciertas formulaciones, el polímero es un polímero parcialmente o completamente insoluble en agua, pero hinchable en agua, por ejemplo, un hidrogel. Los polímeros útiles en este aspecto de la invención son de forma deseable interactivos con el agua y/o hidrofílicos por naturaleza para absorber cantidades significativas de agua, y a menudo forman hidrogeles cuando se ponen en contacto con agua o medio acuoso durante un periodo de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio con agua. En realizaciones más detalladas, el polímero es un hidrogel que, cuando se pone en contacto con un exceso de agua, absorbe al menos dos veces su peso en agua en equilibrio cuando se expone a agua a temperatura ambiente, Patente de Estados Unidos No. 6,004,583. [0132] Los sistemas de liberación de fármacos basados en polímeros biodegradables se prefieren en muchas aplicaciones biomédicas, ya que dichos sistemas se rompen mediante hidrólisis o mediante reacción enzimática en moléculas no tóxicas. La velocidad de degradación se controla mediante la manipulación de la composición de matriz polimérica biodegradable. Estos tipos de sistemas se pueden utilizar por tanto en ciertos dispositivos para la liberación a largo plazo de agentes biológicamente activos. Los polímeros biodegradables, tales como ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA) y poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA), han recibido una gran atención como posibles portadores de fármacos, ya que se ha observado que los productos de degradación de estos polímeros presentan una toxicidad baja. Durante la función metabólica normal del cuerpo estos polímeros se degradan en dióxido de carbono y agua. Estos polímeros también han mostrado una biocompatibilidad excelente. [0133] Para prolongar la actividad biológica del péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, así como agentes potenciadores de la liberación opcionales, estos agentes se pueden incorporar en matrices poliméricas, por ejemplo, poliortoésteres, polianhídridos o poliésteres. Esto produce una actividad sostenida y la liberación de un agente o agentes activos, por ejemplo, tal como se determina mediante la degradación de la matriz polimérica. Aunque la encapsulación de moléculas bioterapéuticas en el interior de polímeros sintéticos las puede estabilizar durante el almacenamiento y liberación, el mayor obstáculo de la tecnología de liberación basada en polímeros es la pérdida de la actividad de las moléculas terapéuticas durante los procesos de formulación que a menudo implican calor, sonicación o disolventes orgánicos. [0134] Los polímeros inductores de la absorción contemplados para su uso en la presente invención pueden incluir derivados y variantes modificadas químicamente o físicamente de los tipos de polímeros anteriores, además de otros polímeros naturales o sintéticos, gomas, resinas y otros agentes, así como mezclas de estos materiales entre sí u otros polímeros, siempre que las alteraciones, modificaciones o mezcla no afecte de manera adversa a las propiedades deseadas, tales como la absorción del agua, la formación de hidrogel y/o la estabilidad química para la aplicación útil. En aspectos más detallados de la invención, los polímeros, tales como nylon, acrilan y otros polímeros sintéticos normalmente hidrofóbicos se pueden modificar suficientemente mediante reacción para conseguir geles hinchables en agua y/o formar geles estables en medio acuoso. [0135] Los polímeros inductores de la absorción de la invención pueden incluir polímeros del grupo de homo y copolímeros basados en diversas combinaciones de los siguientes monómeros de vinilo: ácidos acrílico y metacrílico, acrilamida, metacrilamida, hidroxietilacrilato o metacrilato, vinilpirrolidonas, así como polivinilalcohol y su copolímeros y terpolímeros, polivinilacetato, su copolímeros y terpolímeros con los monómeros indicados anteriormente y ácido 2-acrilamido-2metil-propanosulfónico (AMPS®). Muy útiles son los copolímeros de los monómeros indicados anteriormente con monómeros funcionales copolimerizables, tales como ésteres acrilato o metacrilato de acril o metacril amida, donde los grupos éster derivan de alquilo de cadena lineal o ramificada, arilo que tiene hasta cuatro anillos aromáticos que pueden contener sustituyentes alquilo de 1 a 6 carbonos; esteroides, sulfatos, fosfatos o monómeros catiónicos, tales como N,N-dimetilaminoalquil(met)acrilamida, dimetilaminoalquil(met)acrilato, cloruro de (met)acriloxialquiltrimetilamonio, cloruro de (met)acriloxialquildimetilbencil amonio. [0136] Polímeros inductores de la absorción adicionales para su uso en la invención son aquellos clasificados como dextranos, dextrinas, y de la clase de materiales clasificados como gomas y resinas naturales, o de la clase de polímeros naturales, tales como colágeno procesado, quitina, quitosano, opulalano, zooglano, alginatos y alginatos modificados, tales como “Kelcoloide” (un alginato modificado con polipropilenglicol), gomas gelano, tales como "Kelocogel", gomas Xanatano, tales como "Keltrol", estastina, alfa hidroxibutirato y sus copolímeros, ácido hialurónico y sus derivados, ácido poliláctico y ácidos glicólicos. [0137] Una clase muy útil de polímeros aplicables en la presente invención son ácidos carboxílicos olefínicamente insaturados que contienen por lo menos un doble enlace olefínico carbono-carbono activado y por lo menos un grupo carboxilo; es decir, un ácido o grupo funcional convertido fácilmente a un ácido que contiene un doble enlace olefínico que actúa fácilmente en la polimerización debido a su presencia en la molécula de monómero, en la posición alfa-beta con respecto al grupo carboxilo o como parte de una agrupación metileno terminal. Los ácidos olefínicamente insaturados de esta clase incluyen dichos materiales como ácidos acrílicos representados tipificados por el propio ácidos acrílico, ácido alfa-ciano acrílico, ácido beta metilacrílico (ácido crotónico), ácido alfa-fenil acrílico, ácido beta-acriloxi propiónico, ácido cinámico, ácido p-cloro cinámico, 1-carboxi-4-fenil-1,3-butadieno, ácido itacónico, ácido citracónico, ácido mesacónico, ácido glutacónico, ácido aconítico, ácido maleico, ácido fumárico, y tricarboxi etileno. Tal como se utiliza aquí, el término “ácido carboxílico” incluye los ácidos policarboxílicos y aquellos anhídridos de ácido, tales como anhídrido maleico, donde el grupo anhídrido se forma mediante la eliminación de una molécula de agua de los dos grupos carboxilo localizados en la misma molécula de ácido carboxílico. [0138] Los acrilatos representativos útiles como agentes inductores de la absorción en la invención incluyen acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo, acrilato de isopropilo, acrilato de butilo, acrilato de isobutilo, metacrilato de metilo, etacrilato de metilo, metacrilato de etilo, acrilato de etilo, acrilato de heptilo, metacrilato de octilo, metacrilato de isopropilo, metacrilato de 2-etilhexilo, acrilato de nonilo, acrilato de hexilo, metacrilato de n-hexilo y similares. Los ésteres alquil acrílicos superiores son acrilato de decilo, metacrilato de isodecilo, acrilato de laurilo, acrilato de estearilo, acrilato de behenilo y acrilato de melisilo y las variantes metacrilato de los mismos. Las mezclas de dos o tres o más ésteres acrílicos de larga cadena se pueden polimerizar satisfactoriamente con uno de los monómeros carboxílicos. Otros comonómeros incluyen olefinas, incluyendo alfa olefinas, éteres de vinilo, ésteres de vinilo, y mezclas de los mismos.

[0139] Otros monómeros de vinilideno, incluyendo nitrilos acrílicos, también se pueden utilizar como agentes inductores de la absorción en los usos terapéuticos y composiciones de la invención para aumentar la liberación y la absorción de una o más proteínas de péptidos regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otro agente o agentes biológicamente activos, incluyendo para aumentar la liberación del agente o agentes activos a una tejido o compartimento diana en el sujeto (por ejemplo, el hígado, vena porta hepática, tejido o fluido del SNC o plasma sanguíneo). Los nitrilos alfa-beta olefínicamente insaturados son preferiblemente nitrilos monoolefínicamente insaturados que tienen de 3 a 10 átomos de carbono, tales como acrilonitrilo, metacrilonitrilo y similares. Los más preferidos son acrilonitrilo y metacrilonitrilo. También se incluyen las amidas acrílicas que contienen de 3 a 35 átomos de carbono que incluyen amidas monoolefínicamente insaturadas. Las amidas representativas incluyen acrilamida, metacrilamida, N-t-butil acrilamida, N-ciclohexilacrilamida, amidas de alquilos superiores, donde el grupo alquilo en el nitrógeno contiene de 8 a 32 átomos de carbono, amidas acrílicas incluyendo N-alquilol amidas de ácidos carboxílicos alfa, beta-olefinicamente insaturados incluyendo aquellas que tienen de 4 a 10 átomos de carbono, tales como N-metilol acrilamida, N-propanol acrilamida, Nmetilol metacrilamida, N-metilol maleimida, ésteres del ácido N-metilol maleámico, N-metilol-p-vinil benzamida, y similares. [0140] Los materiales inductores de la absorción adicionales útiles son alfa-olefinas que contienen de 2 a 18 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono; dienos que contienen de 4 a 10 átomos de carbono; ésteres de vinilo y ésteres de alilo, tales como acetato de vinilo; aromáticos de vinilo, tales como estireno, metil estireno y cloro estireno; vinilo y alil ésteres y cetonas, tales como vinil metil éter y metil vinil cetona; cloroacrilatos; acrilatos de cianoalquilo, tales como acrilato de alfacianometilo y los acrilatos de alfa-, beta-y gamma-cianopropilo; alcoxiacrilatos , tales como acrilato de metoxietilo; haloacrilatos, tales como acrilato de cloroetilo; haluros de vinilo y cloruro de vinilo, cloruro de vinilideno y similares; divinilos, diacrilatos y otros monómeros polifuncionales, tales como divinal éter, diacrilato de dietilenglicol, dimetacrilato de etilenglicol, mutilen-bis-acrilamida, alilpentaeritritol, y similares; y fosfonatos de bis (beta-haloalquil) alquenilo, tales como fosfonato de bis(betacloroetil) vinilo y similares, tal como se conocen por los expertos en la materia. Los copolímeros en los que el monómero que contiene carboxi es un constituyente menor y los otros monómeros de vinilideno son los componentes principales se preparan fácilmente según los métodos descritos aquí. [0141] Cuando se utilizan hidrogeles como agentes inductores de la absorción en la invención, éstos se componen de copolímeros sintéticos del grupo de ácidos acrílicos y metacrílicos, acrilamida, metacrilamida, hidroxietilacrilato (HEA) o metacrilato (HEMA) y vinilpirrolidona que son interactivos con el agua e hinchables. Ejemplos ilustrativos específicos de polímeros útiles, especialmente para la liberación de péptidos o proteínas, son los siguientes tipos de polímeros: (met)acrilamida y 0,1 a 99 % en peso de ácido (met)acrílico; (met)acrilamidas y 0,1-75 % en peso de cloruro de (met)acriloxietil trimetilamonio; (met)acrilamida y 0,1-75 % en peso (met)acrilamida; ácido acrílico y 0,1-75 % en peso de (meta)acrilatos de alquilo; (met)acrilamida y 0,175 % en peso AMPS.RTM. (marca comercial de Lubrizol Corp.); (met)acrilamida y 0 a 30% en peso de alquil(met)acrilamidas y 0,1-75 % en peso de AMPS.RTM.; (met)acrilamida y 0,1-99 % en peso de HEMA; (met)acrilamida y 0,1 a 75 % en peso de HEMA y 0,1 a 99% ácido (met)acrílico; ácido (met)acrílico y 0,1-99 % en peso de HEMA; 50% molar de vinil éter y 50% molar de anhídrido maleico; (met)acrilamida y 0,1 a 75% en peso de cloruro de (met)acriloxialquil dimetil bencilamonio; (met)acrilamida y 0,1 a 99% en peso de vinil pirrolidona; (met)acrilamida y 50% en peso de vinil pirrolidona y 0,1-99,9% en peso de ácido (met)acrílico; ácido (met)acrílico y 0,1 a 75% en peso de AMPS.RTM. y 0,1-75% en peso de alquil(met)acrilamida. En los ejemplos anteriores, alquilo significa C1 a C30, preferiblemente C1 a C22, lineal y ramificado y cíclico C4 a C16; donde (met) se utiliza, significa que se incluyen los monómeros con y sin el grupo metilo. Otros polímeros hidromel muy útiles son variantes hinchables, pero insolubles de poli (vinil pirrolidona) almidón, carboximetilcelulosa y polivinilalcohol. [0142] Los materiales de hidrogel polímero adicionales útiles en la presente invención incluyen (poli)hidroxialquil (met)acrilato; hidrogeles aniónicos y catiónicos; complejos de poli(electrolitos); poli(vinil alcoholes) que tiene un residual acetato bajo; una mezcla hinchable de agar reticulado y carboximetilcelulosa reticulado, una composición hinchable que comprende metilcelulosa mezclada con un agar reticulado en poca cantidad; un copolímero hinchable en agua producido por una dispersión de copolímero finamente dividido de anhídrido maleico con estireno, etileno, propileno o isobutileno; un polímero hinchable en agua de N-vinil lactamas; sales sódicas hinchables de carboximetilcelulosa; y similares. [0143] Otros polímeros que embeben y retienen el fluido en gel útiles para formar el hidrogel hidrofílico para la liberación por la mucosa de agentes biológicamente activos de la invención incluyen pectina; polisacáridos, tales como agar, acacia, karaya, tragacanto, alginas y guar y sus formas reticuladas; polímeros, copolímeros y derivados de sales de ácido acrílico, poliacrilamidas; polímeros de anhídrido indeno maleico hinchable en agua; copolímeros de injertos de almidón; polímeros de tipo acrilato y copolímeros con absorbabilidad en agua de aproximadamente 2 a 400 veces su peso original; diésteres de poliglucano; una mezcla de poli(vinil alcohol) reticulado y poli(N-vinil-2-pirrolidona); geles de copolímeros en bloque de polioxibutilenopolietileno; goma carob, geles de poliésteres, geles de poliurea, geles de poliéter, geles de poliamida, geles de poliimida; geles de polipéptido; geles de poliaminoácidos; geles policelulósicos; polímeros de acrilato de anhídrido indeno maleico reticulados; y polisacáridos. [0144] Los polímeros de hidrogel sintéticos para su uso en la invención se pueden fabricar mediante una combinación infinita de varios monómeros en varias proporciones. El hidrogel se puede reticular y posee en general la capacidad de embeber y absorber fluido e hincharse o expandirse hasta un estado de equilibrio ampliado. El hidrogel habitualmente se hincha o expande después de la liberación en la superficie de la mucosa nasal, absorbiendo aproximadamente 2-5, 5-10, 10-50, hasta 50-100 o más veces su peso de agua. El grado óptimo de hinchabilidad para un hidrogel determinado se determinará para diferentes agentes biológicamente activos dependiendo de factores, tales como el peso molecular, el tamaño, la solubilidad y características de difusión del agente activo transportado por o atrapado o encapsulado en el polímero, y el espaciado específico y el movimiento de cadena cooperativo asociado con cada polímero individual. [0145] Los polímeros hidrofílicos útiles en la invención son insolubles en agua, pero hinchables en agua. Dichos polímeros hinchados en agua se refieren habitualmente como hidrogeles o geles. Dichos geles se pueden producir de manera conveniente a partir de polímero soluble en agua mediante el proceso de reticulación de los polímeros por un agente reticulante adecuado. Sin embargo, los hidrogeles estables también se pueden formar a partir de polímeros específicos bajo condiciones definidas de pH, temperatura y/o concentración iónica, según métodos conocidos en la técnica. Habitualmente, los polímeros están reticulados, es decir, reticulados en el grado en el que los polímeros poseen buenas propiedades hidrofílicas, presentan una integridad física mejorada (en comparación con polímeros no reticulados del mismo tipo similar) y muestran una capacidad mejorada de mantener en la red del gel tanto el agente biológicamente activo de interés como compuestos adicionales para la coadministración con el mismo, tal como una citoquina o inhibidor de enzima, manteniendo a la vez la capacidad de liberar el agente o agentes activos en la localización y tiempo apropiados. [0146] En general, los polímeros de hidrogel para su uso en la invención se reticulan con una reticulación difuncional en la cantidad de 0,01 a 25 por ciento en peso, en base al peso de los monómeros que forman el copolímero y más preferiblemente de 0,1 a 20 por ciento en peso y más a menudo de 0,1 a 15 por ciento en peso del agente reticulador. Otra cantidad útil de un agente reticulante es de 0,1 a 10 por ciento en peso. También se pueden utilizar agentes reticulantes multifuncionales tri, tetra, o superiores. Cuando se utilizan dichos reactivos, se pueden requerir cantidades menores para obtener una densidad de reticulación equivalente, es decir el grado de reticulación, o propiedades de red que son suficientes para contener de manera eficaz el agente o agentes biológicamente activos. [0147] Las reticulaciones pueden ser covalente, iónico o enlaces de hidrógeno con el polímero que posee la capacidad de hincharse en presencia de fluidos que contiene agua. Dichos reticuladores y reacciones de reticulación son conocidos por los expertos en la técnica y en muchos casos dependen del sistema polimérico. De este modo, una red reticulada se puede formar mediante copolimerización de monómeros insaturados con radicales libres. Los hidrogeles poliméricos también se pueden formar Mediante reticulación de polímeros preformados mediante la reacción de grupos funcionales en los polímeros, tales como alcoholes, ácidos, aminas con grupos, tales como glioxal, formaldehído o glutaraldehído, bis anhídridos y similares. [0148] Los polímeros también se pueden reticular con cualquier polieno, por ejemplo, decadieno o trivinil ciclohexano; acrilamidas, tales como N,N-metilen-bis (acrilamida); acrilatos polifuncionales, tales como triacrilato de trimetilol propano; o monómero de vinilideno polifuncional que contiene por lo menos 2 grupos CH2 terminales, incluyendo, por ejemplo, divinal benceno, divinal naftaleno, acrilatos de alilo y similares. En ciertas realizaciones, los monómeros de reticulación para su uso en la preparación de los copolímeros son polialquenil poliéteres que tienen más de un grupo alquenil éter por molécula, que puede poseer opcionalmente grupos alquenilo en que un doble enlace olefínico está presente unido a un grupo metileno terminal (por ejemplo, producido mediante la eterificación de un alcohol polihídrico que contiene por lo menos 2 átomos de carbono y por lo menos 2 grupos hidroxilo). Los compuestos de esta clase se pueden producir mediante la reacción de un haluro de alquenilo, tal como cloruro de alilo o bromuro de alilo, con una solución acuosa fuertemente alcalina de uno o más alcoholes polihídricos. El producto puede ser una mezcla de complejos de poliéteres con cantidades variantes de grupos éter. La eficacia del agente reticulante de poliéter aumenta con el número de grupos potencialmente polimerizables en la molécula. Habitualmente, se utilizan los poliéteres que contienen un promedio de dos o más grupos alquenil éter por molécula. Otros monómeros de reticulación incluyen, por ejemplo, ésteres de dialilo, éteres de dimetalilo, acrilatos de alilo o metalilo y acrilamidas, tetravinil silano, polialquenil metanos, diacrilatos y dimetacrilatos, compuestos de divinilo, tales como divinil benceno, fosfato de polialilo, compuestos de dialiloxi y ésteres de fosfito y similares. Los agentes habituales son alil pentaeritritol, alil sacarosa, triacrilato de trimetilolpropano, diacrilato de 1,6hexanodiol, dialil éter de trimetilolpropano, triacrilato de pentaeritritol, dimetacrilato de tetrametileno, diacrilato de etileno, dimetacrilato de etileno, dimetacrilato de trietilenglicol, y similares. El alil pentaeritritol, dialiléter de trimetilolpropano y alil sacarosa proporcionan polímeros adecuados. Cuando el agente reticulante está presente, las mezclas poliméricas contienen normalmente entre aproximadamente 0,01 a 20 por ciento en peso, por ejemplo, 1%, 5% o 10% o más en peso de monómero de reticulación en base al total de monómero de ácido carboxílico , más otros monómeros.

[0149] En aspecto más detallados de la invención, la liberación por la mucosa de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, aumenta al mantener el agente o agentes activos en una liberación lenta o portador o vehículo enzimáticamente o fisiológicamente protector, por ejemplo, un hidrogel que protege el agente activo de la acción de enzimas degradativas. En ciertas realizaciones, el agente activo está unido por medios químicos al portador o vehículo, al que también se pueden mezclar o unir agentes adicionales, tales como inhibidores de enzima, citoquinas, etc. El agente activo alternativamente se puede inmovilizar a través de un encapsulamiento físico suficiente en el portador o vehículo, por ejemplo, una matriz polimérica. [0150] Los polímeros, tales como hidrogeles útiles en la presente invención, pueden incorporar agentes funcionales unidos, tales como glicósidos incorporados químicamente al polímero para aumentar la biodisponibilidad intranasal de agentes activos formulados con el mismo. Ejemplos de dichos glicósidos son glucósidos, fructósidos, galactósidos, arabinósidos, manósidos y sus derivados sustituidos con alquilo y glicósidos naturales, tales como arbustina, florizina, amigdalina, digitonina, saponina e indicano. Existen varias maneras en las que un glicósido típico se puede unir a un polímero. Por ejemplo, el hidrógeno de los grupos hidroxilo de un glicósido u otro carbohidrato similar se puede sustituir por el grupo alquilo de un polímero hidrogel para formar un éter. Además, los grupos hidroxilo de los glicósidos pueden reaccionar para esterificar los grupos carboxilo de un hidrogel polimérico para formar ésteres poliméricos in situ. Otra estrategia es utilizar la condensación de acetobromoglucosa con colest-5-en-3-beta-ol sobre un copolímero de ácido maleico. Las poliacrilamidas N-sustituidas se pueden sintetizar mediante la reacción de polímeros activados con omega-aminoalquilglicósidos: (1) (espaciador carbohidrato) (n)-poliacrilamida, “pseudopolisacáridos”; (2) (espaciador carbohidrato) (n) fosfatidiletanolamina(m)-poliacrilamida, neoglicolípidos, derivados de fosfatidiletanolamina; (3) (espaciador carbohidrato) (n)-biotin(m)-poliacrilamida. Estos derivados biotinilados se pueden unir a lectinas en la superficie de la mucosa para facilitar la absorción del agente o agentes biológicamente activos, por ejemplo, un péptido regulador de glucosa encapsulado en polímero. [0151] En aspecto más detallados de la invención, se modifican uno o más péptidos reguladores de glucosa, que incluyen opcionalmente agentes activos secundarios, tales como inhibidor o inhibidores de proteasa, citoquina o citoquinas, modulador o moduladores adicionales de la fisiología de unión intercelular, etc., y se unen a un portador o matriz polimérica. Por ejemplo, esto se puede llevar a cabo mediante la unión química de un agente activo de péptido o proteína y otro agente o agentes opcionales en una red polimérica reticulada. También es posible modificar químicamente el polímero de forma separada con un agente interactivo, tal como una molécula que contiene glicosidales. En ciertos aspectos, el agente o agentes biológicamente activos y el agente o agentes activos secundarios opcionales se pueden funcionalizar, es decir, donde un grupo reactivo apropiado es identificado o añadido químicamente al agente o agentes activos. Más a menudo, se añade un grupo etilénico polimerizable y el agente activo funcionalizado se copolimeriza a continuación con monómeros y un agente reticulante utilizando un método de polimerización estándar, tal como polimerización en solución (normalmente en agua), polimerización en emulsión, suspensión o dispersión. A menudo, el agente funcionalizante se dispone con una concentración elevada suficiente de grupos funcionales o polimerizables para asegurar que varios sitios del agente o agentes activos son funciones. Por ejemplo, en un polipéptido que comprende 16 sitios amina, se desea, en general, funcionalizar por lo menos 2, 4, 5, 7 y hasta 8 o más de los sitios. [0152] Después de la funcionalización, el agente o agentes funcionalizados se mezclan con monómeros y un agente reticulador que comprenden los reactivos a partir de los cuales se forma el polímero de interés. A continuación, la polimerización es inducida en este medio para crear un polímero que contiene el agente o agentes activos unidos. A continuación, el polímero se lava con agua u otros disolventes apropiados y, en cualquier caso, se purifican para eliminar las trazas de impurezas no reaccionadas y, si es necesario, se muele o se rompe mediante medios físicos, tales como mediante agitación, forzándolo a través de una malla, ultrasonidos u otro medio adecuado hasta un tamaño de partícula adecuado. El disolvente, normalmente agua, se elimina a continuación de manera que no des naturaliza o, en cualquier caso, degrada el agente o agentes activos. Un método deseado es la liofilización (secado por congelación), pero hay otros métodos disponibles y se pueden utilizar (por ejemplo, secado al vacío, secado con aire, secado por pulverización, etc.). [0153] Para introducir grupos polimerizables en péptidos, proteínas y otros agentes activos de la invención, es posible hacer reaccionar grupos amino, hidroxilo, tiol disponibles y otros grupos reactivos con electrófilos que contienen grupos insaturados. Por ejemplo, los monómeros insaturados que contienen grupos N-hidroxi succinimidilo, carbonatos activos, tales como carbonato de p-nitrofenilo, carbonatos de triclorofenol, tresilato, oxicarbonilimidazoles, epóxido, isocianatos y aldehído, y carboximetil azidas insaturadas y disulfuro de ortopiridilo pertenecen a esta categoría de reactivos. Ejemplos ilustrativos de reactivos insaturados son alil glicidil éter, cloruro de alilo, bromuro de alilo, yoduro de alilo, cloruro de acriloilo, isocianato de alilo, cloruro de alilsulfonilo, anhídrido maleico, copolímeros de anhídrido maleico y alil éter, y similares. [0154] Todos los derivados activos de lisina, excepto aldehído, pueden reaccionar en general con otros aminoácidos, tales como grupos imidazol de histidina y grupos hidroxilo de tirosina y los grupos tiol de cistina si el medio local aumenta la nucleofilicidad de estos grupos. Los reactivos funcionalizantes que contienen aldehído son específicos de lisina. Estos tipos de reacciones con grupos disponibles de lisinas, cisteínas, tirosina se han documentado ampliamente en la literatura y son conocidos por los expertos en la materia. [0155] En el caso de agentes biológicamente activos que contienen grupos amina, es conveniente hacer reaccionar dichos grupos con cloruro de aciloilo, tal como cloruro de acriloilo, e introducir el grupo acrílico polimerizable en el agente reaccionado. A continuación, durante la preparación del polímero, tal como durante la reticulación del copolímero de acrilamida y ácido acrílico, el agente activo funcionalizado, a través de grupos acrílicos, se une al polímero y queda unido al mismo. [0156] En aspectos adicionales de la invención, los agentes biológicamente activos, incluyendo los péptidos, proteínas, nucleósidos, y otras moléculas que son bioactivas in vivo, se estabilizan por conjugación mediante la unión covalente de uno o más agentes activos a un polímero que incorpora como parte integral del mismo un grupo hidrofílico, por ejemplo, un polialquilenglicol lineal, un grupo lipofílico (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,681,811). En un aspecto, un agente biológicamente activo está unido covalentemente con un polímero que comprende (i) un grupo polialquilenglicol lineal y (ii) un grupo lipofílico, en el que el agente activo, el grupo polialquilenglicol lineal, y el grupo lipofílico están dispuestos conformacionalmente entre sí, de manera que el agente terapéutico activo presenta una mayor resistencia in vivo a la degradación enzimática (es decir, en relación a su estabilidad bajo condiciones similares en una forma no conjugada carente del polímero acoplado al mismo). En otro aspecto, la formulación estabilizada por conjugación tiene una conformación tridimensional que comprende el agente biológicamente activo acoplado covalentemente con un complejo polisorbato que comprende (i) un grupo polialquilenglicol lineal y (ii) un grupo lipofílico, donde el agente activo, el grupo polialquilenglicol lineal, y el grupo lipofílico están dispuestos conformacionalmente entre sí, de manera que (a) el grupo lipofílico está disponible exteriormente en la conformación tridimensional, y (b) el agente activo en la composición tiene una mayor resistencia in vivo a la degradación enzimática. [0157] En un aspecto adicional relacionado, se proporciona un complejo conjugado con múltiples ligandos que comprende un agente biológicamente activo acoplado covalentemente con un grupo con esqueleto de triglicérido a través de un grupo espaciador de polialquilenglicol unido a un átomo de carbono del grupo con esqueleto de triglicérido y, por lo menos un grupo ácido graso unido covalentemente directamente a un átomo de carbono del grupo con esqueleto de triglicérido o unido covalentemente a través de un grupo espaciador de polialquilenglicol (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,681,811). En dicho complejo de agentes terapéuticos conjugados a múltiples ligandos, los átomos de carbono alfa’ y beta del grupo triglicérido bioactivo pueden tener grupos ácidos grasos unidos mediante unión covalente directa a los mismos o unión covalente indirecta a los mismos a través de grupos espaciadores de polialquilenglicol. Alternativamente, un grupo ácido graso puede estar unido covalentemente directamente o a través de un grupo espaciador de polialquilenglicol a los carbonos alfa y alfa’ del grupo con esqueleto de triglicérido, estando el agente terapéutico bioactivo acoplado covalentemente con el carbono gamma del grupo con esqueleto de triglicérido, estando directamente unido covalentemente al mismo o unido indirectamente a los mismos a través de un grupo espaciador de polialquileno. Se entenderá que son posibles en el alcance de la invención una amplia variedad de formas estructurales, de composición y conformación para el complejo de agentes terapéuticos conjugados a múltiples ligandos que comprende el grupo con esqueleto de triglicérido. Cabe indicar además que en dicho complejo de agentes terapéuticos conjugados a múltiples ligandos, el agente o agentes biológicamente activos pueden estar de forma ventajosa acoplados covalentemente con el grupo con esqueleto modificado con triglicérido a través de grupos espaciadores de alquilo, o alternativamente, otros grupos espaciadores, en el alcance de la invención. Tal como se utiliza en dicho contexto, la aceptabilidad del grupo espaciador se refiere a características de aceptabilidad específicas estéricas, de composición y aplicación del uso final. [0158] En aspectos adicionales de la invención, se proporciona un complejo estabilizado por conjugación que comprende un complejo de polisorbato que comprende un grupo polisorbato que incluye un esqueleto de triglicérido que tiene acoplado covalentemente a los átomos de carbono alfa, alfa y beta del mismo grupo funcionalizantes que incluyen (i) un grupo ácido graso; y (ii) u polietilenglicol que tiene un agente biológicamente activo o un grupo unido covalentemente al mismo, por ejemplo, unido a una funcionalidad apropiada del grupo polietilenglicol. Dicha unión covalente puede ser directa, por ejemplo, a una funcionalidad hidroxi terminal del grupo polietilenglicol, o alternativamente, la unión puede ser indirecta, por ejemplo, mediante la reacción en el extremo terminal del grupo polietilenglicol con un grupo espaciador de funcionalidad carboxi terminal, de manera que el grupo polietilenglicol funcionalizado en el extremo tiene una funcionalidad carboxi terminal a la que pueden estar unidos el agente biológicamente activo o un grupo. [0159] En aspectos adicionales de la invención, se proporciona un complejo estable, soluble en agua y estabilizado por conjugación, que comprende uno o más proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y/u otro u otros agentes biológicamente activos descritos aquí unidos covalentemente a un grupo glicolípido modificado con polietilenglicol (PEG) fisiológicamente compatible. En dicho complejo, el agente o agentes biológicamente activos se pueden acoplar covalentemente al grupo glicolípido modificado con PEG fisiológicamente compatible por un enlace covalente lábil en un grupo aminoácido libre del agente activo, donde el enlace covalente lábil es escindible in vivo mediante la hidrólisis bioquímica y/o proteólisis. El grupo glicolípido modificado con PEG fisiológicamente compatible pueden comprender ventajosamente un polímero polisorbato, por ejemplo, un polímero polisorbato que comprende grupos éster de ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en monopalmitato, dipalmitato, monolaurato, dilaurato, trilaurato, monoleato, dioleato, trioleato, monostearato, diestearato, y triestearato. En dicho complejo, el grupo glicolípido modificado con PEG fisiológicamente compatible puede comprender de manera adecuada un polímero seleccionado del grupo que consiste en éteres de polietilenglicol de ácidos grasos, y ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos, donde los ácidos grasos para ejemplo comprenden un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácidos láurico, palmítico, oleico y esteárico. Almacenamiento del material [0160] En ciertos aspectos de la invención, las formulaciones combinatorias y/o usos terapéuticos coordinados de la presente invención incorporan una cantidad eficaz de péptidos y proteínas que se pueden adherir a vidrio cargado, reduciendo así la concentración eficaz en el recipiente. Los recipientes silanizados, por ejemplo, recipientes de vidrio silanizado, se utilizan para almacenar el producto acabado para reducir la adsorción del polipéptido o proteína a un recipiente de vidrio.

[0161] En ciertos aspectos adicionales de la invención, un kit comprende una composición farmacéutica estable de uno o más compuestos de péptidos reguladores de glucosa formulados para la administración en la mucosa del sujeto mamífero, donde la composición es eficaz para aliviar uno o más síntomas de obesidad, cáncer, o malnutrición o lavado relacionado con el cáncer en un sujeto sin efectos secundarios adversos inaceptables. El kit comprende además un vial para reactivo farmacéutico para contener uno o más compuestos de péptidos reguladores de glucosa. El vial para reactivo farmacéutico está compuesto de polímero de grado farmacéutico, vidrio u otro material adecuado. El vial para reactivo farmacéutico es, por ejemplo, un vial de vidrio silanizado. El kit comprende además una apertura para la liberación de la composición a una superficie de la mucosa nasal del sujeto. La apertura de liberación está compuesta de un polímero de grado farmacéutico, vidrio u otro material adecuado. La apertura de liberación es, por ejemplo, un vidrio silanizado. [0162] Una técnica de silanización combina una técnica de limpieza especial para las superficies a silanizar con un proceso de silanización a baja presión. El silano se encuentra en fase gas y a una temperatura mayor de las superficies a silanizar. El método proporciona superficies reproducibles con capas de silano estables homogéneas y funcionales que tienen características de una monocapa. Las superficies silanizadas evitan la unión al vidrio de polipéptidos o agentes potenciadores de la liberación por la mucosa de la presente invención. [0163] El procedimiento es útil para preparar viales para reactivos farmacéuticos silanizados para contener las composiciones del péptido regulador de glucosa de la presente invención. Las bandejas de vidrio se limpian mediante el enjuague con agua doble destilada (ddH2O) antes de su uso. La bandeja de silano se enjuaga a continuación con EtOH al 95%, y la bandeja de acetona se enjuaga con acetona. Los viales para reactivo farmacéutico se sonican en acetona durante 10 minutos. Después de la sonicación en acetona, los viales para reactivo se lavan en una bandeja con ddH2O por lo menos dos veces. Los viales para reactivo se sonican en NaOH 0,1 M durante 10 minutos. Mientras se sonican los viales para reactivo en NaOH, la solución de silano se somete bajo una campana. (Solución de silano: 800 mL de etanol al 95%; 96L de ácido acético glacial; 25 mL de glicidoxipropiltrimetoxisilano). Después de la sonicación con NaOH, los viales para reactivo se lavan en una bandeja con ddH2O por lo menos dos veces. Los viales para reactivo se sonican en una solución de silano durante 3 a 5 minutos. Los viales para reactivo se lavan con una bandeja de EtOH al 100%. Los viales para reactivo se secan con gas N2 prepurificado y se almacenan en un horno a 100oC durante por lo menos 2 horas antes de su uso. Vehículos de liberación de bioadhesivos y métodos [0164] En ciertos aspectos de la invención, las formulaciones combinatorias y/o usos terapéuticos coordinados de la presente invención pueden incorporar una cantidad eficaz de un bioadhesivo no tóxico como compuesto adjunto o portador para aumentar la liberación por la mucosa de uno o más agentes biológicamente activos. Los agentes bioadhesivos en este contexto muestran una adhesión general o específica a uno o más componentes o superficies de la mucosa diana. El bioadhesivo mantiene una gradiente de concentración deseado del agente biológicamente activo en la mucosa o a través de la misma para asegurar la penetración de incluso moléculas grandes (por ejemplo, péptidos y proteínas) en el epitelio de la mucosa o a través de la misma. Habitualmente, la utilización de un bioadhesivo en los métodos y composiciones de la invención produce un incremento de dos a cinco veces, a menudos de cinco a diez veces en la permeabilidad para péptidos y proteínas en el epitelio de la mucosa o a través de la misma. Este aumento de permeación epitelial permite a menudo la liberación transmucosal de macromoléculas grandes, por ejemplo, a la parte basal del epitelio nasal o en los compartimentos extracelulares adyacentes o plasma sanguíneo o tejido o fluido de SNC. [0165] Este aumento en la administración proporciona una eficacia ampliamente mejorada de la administración de péptidos bioactivos, proteínas y otras sustancias terapéuticas moleculares. Estos resultados dependerán en parte de la hidrofilicidad del compuesto, a través de lo cual se conseguirá una mayor penetración con sustancias hidrofílicas en comparación con compuestos insolubles. Además de estos efectos, la utilización de bioadhesivos para aumentar la persistencia del fármaco en la superficie de la mucosa puede producir un mecanismo de reserva para la administración prolongada de fármacos, mediante lo cual los compuesto no sólo penetran a través del tejido de la mucosa, sino que también se retrodifunden hacia la superficie de la mucosa una vez el material se agota en la superficie. [0166] Se describen en la técnica un conjunto de bioadhesivos adecuados para la administración oral, las Patentes de Estados Unidos Nos. 3,972,995; 4,259,314; 4,680,323; 4,740,365; 4,573,996; 4,292,299; 4,715,369; 4,876,092; 4,855,142; 4,250,163; 4,226,848; 4,948,580; Republicación de la Patente de Estados Unidos 33,093, que son útiles en los usos terapéuticos y composiciones de la invención. El potencial de diversos polímeros bioadhesivos como plataforma de administración en la mucosa, por ejemplo nasal, en los métodos y composiciones de la invención se puede evaluar fácilmente determinando su capacidad para mantener y liberar el péptido regular de glucosa, así como por su capacidad de interaccionar con las superficies de la mucosa después de la incorporación del agente activo en las mismas. Además, se aplicarán los métodos conocidos para determinar la biocompatibilidad de polímeros seleccionados con el tejido en el punto de administración en la mucosa. Cuando la mucosa diana está cubierta de mucosidad (es decir, en ausencia de tratamiento mucolítico o para la depuración de la mucosidad), puede servir como conexión con el epitelio de la mucosa subyacente. Por lo tanto, el término “bioadhesivo”, tal como se utiliza aquí, también cubre compuestos mucoadhesivos útiles para aumentar la liberación por la mucosa de agentes biológicamente activos de la invención. Sin embargo, el contacto adhesivo con el tejido de la mucosa mediado por la adhesión a una capa en gel de mucosidad se puede limitar por la unión incompleta o transitoria entre la capa de mucosidad y el tejido subyacente, particularmente en superficies nasales en las que tiene lugar una depuración rápida de la mucosidad. En este aspecto, las glicoproteínas de mucina se secretan continuamente e, inmediatamente después de su liberación de las células o glándulas, forman un gel viscoelástico. La superficie luminal de la capa de gel adherente, sin embargo, se erosiona continuamente mediante acción mecánica, enzimática y/o ciliar. Cuando dichas actividades son más prominentes o cuando se desean tiempos de adhesión más largos, los usos terapéuticos coordinados y los métodos de formulación combinados de la invención pueden incorporar además métodos o agentes mucolíticos y/o ciliostáticos tal como se ha descrito anteriormente. [0167] Habitualmente, los polímeros mucoadhesivos que se pueden utilizar en la invención son macromoléculas naturales o sintéticas que se adhieren a superficies de tejidos de mucosa húmedas mediante mecanismos complejos, aunque no específicos. Además de estos polímeros mucoadhesivos, la invención proporciona además usos terapéuticos y composiciones que incorporan bioadhesivos que se adhieren directamente a una superficie celular, en lugar de a la mucosidad, mediante interacciones específicas, incluyendo interacciones mediadas por receptor. Un ejemplo de bioadhesivos que actúan de esta manera específica es el grupo de compuestos conocidos como lectinas. Éstas son glicoproteínas con la capacidad de reconocer específicamente y unirse a moléculas de azúcar, por ejemplo, glicoproteínas o glicolípidos, que forman parte de las membranas de las células epiteliales intranasales y pueden considerarse como “receptores de lectinas” [0168] En ciertos aspectos de la invención, los materiales bioadhesivos para potenciar la liberación intranasal de agentes biológicamente activos comprenden una matriz de un polímero o mezcla de polímeros hidrofílicos, por ejemplo, solubles en agua o hinchables, que se pueden adherir a una superficie mucosa húmeda. Estos adhesivos se pueden formular como pomadas, películas delgadas de hidrogel (ver anteriormente) y otras formas de aplicación. A menudo, estos adhesivos presentan el agente biológicamente activo mezclado con los mismos para realizar una liberación lenta o liberación local del agente activo. Algunos se formulan con ingredientes adicionales para facilitar la penetración del agente activo a través de la mucosa nasal, por ejemplo, en el sistema circulatorio del individuo. [0169] Varios polímeros, tanto naturales como sintéticos, muestran una unión significativa a la mucosidad y/o a las superficies epiteliales de la mucosa bajo condiciones fisiológicas. La fuerza de esta interacción se puede medir fácilmente mediante pruebas de abrasión mecánica o cizalladura. Cuando se aplica a una superficie de mucosa húmeda, muchos materiales secos se adherirán espontáneamente, al menos ligeramente. Después de dicho contacto inicial, ciertos materiales hidrofílicos empiezan a atraer el agua mediante adsorción, hinchamiento o fuerzas capilares, y si esta agua se absorbe del sustrato subyacente o de la interfase polímero-tejido, la adhesión puede ser suficiente para conseguir el objetivo de potenciar la absorción a la mucosa de agentes biológicamente activos. Dicha “adhesión por hidratación” puede ser bastante fuerte, pero las formulaciones adaptadas para utilizar este mecanismo deben explicar el hinchamiento que continúa a medida que la dosis se transforma en un mucílago hidratado. Esto está previsto para muchos hidrocoloides útiles en la invención, especialmente algunos derivados de celulosa, que son en general no adhesivos cuando se aplican en un estado prehidratado. No obstante, los sistemas de liberación de fármacos bioadhesivos para la administración en la mucosa son eficaces en la invención cuando dichos materiales se aplican en forma de un polvo polimérico seco, microesfera o forma de liberación de tipo película. [0170] Otros polímeros se adhieren a las superficies de la mucosa no sólo cuando se aplican en seco, sino también en un estado completamente hidratado y en presencia de cantidades en exceso de agua. La selección de un mucoadhesivo requiere de este modo la debida consideración de las condiciones, tanto fisiológicas como fisico-químicas, bajo las cuales se formará y mantendrá el contacto con el tejido. En particular, la cantidad de agua o humedad presente habitualmente en la cara deseada de adhesión y el pH dominante son conocidos por afectar ampliamente la fuerza de unión mucoadhesiva de diferentes polímeros.

[0171] En los últimos 20 años se han fabricado y estudiado varios sistemas de liberación de fármacos bioadhesivos poliméricos, no siempre con éxito. Sin embargo, actualmente se utilizan un conjunto de dichos portadores en aplicaciones clínicas que implican usos dentales, ortopédicos, oftalmológicos y quirúrgicos. Por ejemplo, se han utilizado ampliamente hidrogeles de base acrílica para dispositivos bioadhesivos. Los hidrogeles de base acrílica son adecuados para la bioadhesión debido a su flexibilidad y características no abrasivas en el estado parcialmente hinchado, que reducen el desgaste causado por el daño en los tejidos en contacto. Además, su alta permeabilidad en el estado hinchado permite que cadenas poliméricas no reticuladas de monómeros no reaccionados y el iniciador se desprendan por lavado de la matriz después de la polimerización, lo cual es una característica importante para la selección de materiales bioadhesivos para su uso en la invención. Los dispositivos de polímeros de base acrílica muestran una fuerza de unión adhesiva muy elevada. Para la liberación controlada en la mucosa de fármacos de péptidos y proteínas, los métodos y composiciones de la invención incluyen opcionalmente el uso de portadores, por ejemplo, vehículos de liberación polimérica, que actúan en parte para proteger el agente biológicamente activo de roturas proteolíticas, mientras que al mismo tiempo proporcionan una mayor penetración del péptido o proteína en la mucosa nasal o a través de la misma. En este contexto, los polímeros bioadhesivos han demostrado un considerable potencial por potenciar la liberación oral del fármaco. Como ejemplo, la biodisponibilidad de 9-desglicinamida, 8-arginina vasopresina (DGAVP) administrada intraduodenalmente a ratas junto con una dispersión salina al 1% (p/v) del mucoadhesivo policarbofilo derivado de ácido poliacrílico, aumenta de 3 a 5 veces en comparación con una solución acuosa del fármaco de péptido sin este polímero. [0172] Los polímeros mucoadhesivos del tipo ácido poliacrílico son potentes inhibidores de algunas proteasas intestinales. El mecanismo de inhibición de enzimas se explica por la fuerte afinidad de esta clase de polímeros por cationes divalentes, tales como calcio o zinc, que son cofactores esenciales de las metalo-proteinasas, tales como tripsina y quimiotripsina. Se describe que la privación a las proteasas de sus cofactores por el ácido poliacrílico induce cambios estructurales irreversibles de las proteínas enzimáticas que se acompañaron por una pérdida de actividad enzimática. A la vez, otros polímeros mucoadhesivos (por ejemplo, algunos derivados de celulosa y quitosano) pueden no inhibir enzimas proteolíticas bajo ciertas condiciones. A diferencia de otros inhibidores de enzimas contemplados para su uso en la presente invención (por ejemplo, aprotinina, bestatina), que son moléculas relativamente pequeñas, la absorción transnasal de polímeros inhibidores es probable que sea mínima a la vista del tamaño de estas moléculas y de este modo eliminan posibles efectos secundarios adversos. De este modo, los polímeros mucoadhesivos, particularmente del tipo de ácido poliacrílico, pueden actuar tanto como adhesivos promotores de la absorción como agentes protectores de enzimas para aumentar la liberación controlada de fármacos de péptidos y proteínas, especialmente cuando se considera la seguridad. [0173] Además de proteger contra la degradación enzimática, los bioadhesivos y otros agentes inductores de la absorción polimérica o no polimérica para su uso en la invención pueden incrementar directamente la permeabilidad en la mucosa a agentes biológicamente activos. Para facilitar el transporte de moléculas grandes e hidrofílicas, tales como péptidos y proteínas, a través de la barrera epitelial nasal, se ha postulado que polímeros mucoadhesivos y otros agentes producen mayores efectos de permeación más allá de lo que representa el tiempo de residencia premucosal prolongado del sistema de liberación. La evolución con el tiempo de las concentraciones en plasma del fármaco sugirió, según se ha descrito, que las microesferas biodhesivas provocaban un incremento agudo, aunque transitorio, de la permeabilidad de la insulina a través de la mucosa nasal. Otros polímeros mucoadhesivos para su uso en la invención, por ejemplo, quitosano, aumentan, según se ha descrito, la permeabilidad de ciertos epitelios de la mucosa incluso cuando se aplican como una solución acuosa o gel. Se describió que otro polímero mucoadhesivo afectaba directamente en la permeabilidad epitelial era el ácido hialurónico y derivados éster de éste. Un agente bioadhesivo particularmente útil en la administración coordinada y/o métodos de formulación combinatoria y composiciones de la invención es el quitosano, así como sus análogos y derivativos. El quitosano es un polímero biocompatible y biodegradable no tóxico que se utiliza ampliamente para aplicaciones farmacéuticas y médicas debido a sus propiedades favorables de baja toxicidad y buena biocompatibilidad. Es un poliaminosacárido natural preparado a partir de quitina mediante la N-desacetilación con álcali. Tal como se utiliza en los métodos y composiciones de la invención, el quitosano incrementa la retención de proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí en un punto de aplicación en la mucosa. Este modo de administración también puede mejorar la complacencia y aceptación del paciente. Tal como se proporciona además en la presente invención, los métodos y composiciones de la invención incluirán opcionalmente un nuevo derivado de quitosano o forma químicamente modificada de quitosano. Uno de dichos derivados nuevos para su uso en la invención se indica como el polímero β-[1→4]-2-guanidino-2-desoxi-D-glucosa (poli-GuD). El quitosano es el producto N-desacetilado de la quitina, un polímero natural que se ha utilizado ampliamente para preparar microesferas para formulaciones orales e intranasales. El polímero de quitosano también se ha propuesto como un portador soluble para la liberación parenteral de fármacos. En un aspecto de la invención, se utiliza o-metilisourea para convertir una quitosano amina en su grupo guanidinio. El compuesto de guanidinio se prepara, por ejemplo, mediante la reacción entre soluciones equinormales de quitosano y o-metilisourea a pH por encima de 8,0. [0174] Los compuestos adicionales clasificados como agentes bioadhesivos para su uso en la presente invención actúan mediando interacciones específicas, habitualmente clasificadas como “interacciones receptor-ligando” entre estructuras complementarias del compuesto bioadhesivo y un componente de la superficie epitelial de la mucosa. Muchos ejemplos naturales ilustran esta forma de bioadhesión por unión específica, tal como se ejemplifica por las interacciones lectinas-azúcar. Las lectinas son (glico)proteínas de origen no inmune que se unen a polisacáridos o glicoconjugados. [0175] Se han investigado lectinas de planta como posibles agentes farmacéuticos promotores de absorción. Una lectina de planta, hemaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA), muestra una biodisponibilidad oral elevada de más del 10% después de administrar a ratas. La lectinas del tomate (Lycopersicon esculeutum) (TL) parece ser segura para varios modos de administración. [0176] En resumen, los agentes bioadhesivos anteriores son útiles en las formulaciones combinatorias y usos terapéuticos coordinados de la presente invención, que incorporan opcionalmente una cantidad eficaz y forman un agente bioadhesivo para prolongar la persistencia o, en cualquier caso, incrementar la absorción en la mucosa de una o más proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos. Los agentes bioadhesivos se pueden administrar de forma coordinada como compuestos adjuntos o como aditivos en las formulaciones combinatorias de la invención. En ciertas realizaciones, el agente bioadhesivo actúa como “cola farmacéutica”, mientras que en otras realizaciones la liberación de adjuntos o formulación combinatoria del agente bioadhesivo sirve para intensificar el contacto del agente biológicamente activo con la mucosa nasal, en algunos casos mediante la inducción de interacciones específicas receptor-ligando con “receptores” de células epiteliales y en otros mediante el incremento de permeabilidad epitelial para aumentar significativamente el gradiente de concentración de fármaco medido en un punto diana de liberación (por ejemplo, hígado, plasma sanguíneo o tejido o fluido del SNC). Agentes bioadhesivos adicionales para su uso en la presente invención actúan como inhibidores de enzimas (por ejemplo, proteasa) para aumentar la estabilidad de agentes bioterapéuticos administrados por la mucosa administrados de forma coordinada o en una formulación combinatoria con el agente bioadhesivo. Liposomas y vehículos de liberación micelar [0177] Los usos terapéuticos coordinados y las formulaciones combinatorias de la presente invención incorporan opcionalmente portadores eficaces basados en lípidos o ácidos grasos, agentes de procesamiento o vehículos de liberación, para proporcionar formulaciones mejoradas para la liberación por la mucosa de proteínas de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos. Por ejemplo, se proporciona un conjunto de formulaciones y usos terapéuticos para la liberación por la mucosa que comprenden uno o más de estos agentes activos, tales como un péptido o proteína, mezclada o encapsulada por, o administrada coordinadamente con, un liposoma, un portador micelar mezclado, o una emulsión, para aumentar la estabilidad química y física e incrementar la vida media de los agentes biológicamente activos (por ejemplo, reduciendo la susceptibilidad a la proteólisis, modificación química y/o desnaturalización) tras la liberación por la mucosa. [0178] En ciertos aspectos de la invención, los sistemas de liberación especializados para agentes biológicamente activos comprenden vesículas de lípidos pequeños conocidos como liposomas. Éstas están fabricadas habitualmente de moléculas de lípidos naturales, biodegradables, no tóxicos y no inmunogénicas y pueden atrapar o unir de manera eficaz moléculas fármacos, incluyendo péptidos y proteínas, en o sobre, sus membranas. La atracción de los liposomas como sistema liberador de péptido y proteína en la presente invención se incrementa por el hecho de que las proteínas encapsuladas pueden permanecer en su medio acuoso preferido en las vesículas, mientras que la membrana liposomal las protege contra la proteólisis y otros factores desestabilizantes. Incluso aunque no todos los métodos de preparación de liposomas conocidos son factibles en la encapsulación de péptidos y proteínas debido a sus propiedades físicas y químicas únicas, varios métodos permiten la encapsulación de estas macromoléculas sin una desactivación sustancial. [0179] Existen un conjunto de métodos disponibles para preparar liposomas para su uso en la invención, Patentes de Estados Unidos Nos. 4,235,871, 4,501,728, y 4,837,028. Para su uso con la liberación en liposomas, el agente biológicamente activo se encuentra habitualmente atrapado en el liposoma o vesícula lipídica o se encuentra unido al exterior de la vesícula.

[0180] Como los liposomas, los ácidos grasos insaturados de cadena larga, que también aumentan la actividad para la absorción por la mucosa, pueden formar vesículas cerradas con estructuras de tipo bicapa (denominadas "ufasomas"). Éstas se pueden formar, por ejemplo, utilizando ácido oleico para capturar péptidos y proteínas biológicamente activas para la liberación por la mucosa, por ejemplo, liberación intranasal, de la invención. [0181] Otros sistemas de liberación para su uso en la invención combinan el uso de polímeros y liposomas para unir las propiedades ventajosas de ambos vehículos, tales como la encapsulación en el interior del polímero de fibrina natural. Además, la liberación de compuestos bioterapéuticos de este sistema de liberación es controlable a través del uso de reticulación covalente y la adición de agentes antifibrinolíticos al polímero de fibrina. [0182] Sistemas de liberación más simplificados para su uso en la invención pueden incluir el uso de lípidos catiónicos como vehículos o portadores de liberación, que se pueden utilizar de manera eficaz para proporcionar una interacción electrostática entre el portador lipídico y dichos agentes biológicamente activos cargados como proteínas y ácidos nucleicos polianiónicos. Esto permite un envasado eficaz de los fármacos en una forma adecuada para la administración en la mucosa y/o la posterior liberación a compartimentos sistémicos. [0183] Los vehículos de liberación adicional para su uso en la invención incluyen ácidos grasos de cadena larga y media, así como micelas mezcladas con tensoactivos con ácidos grasos. Los lípidos más naturales en forma de ésteres presentan importantes implicaciones con respecto a su propio transporte a través de las superficies de la mucosa. Se ha observado que los ácidos grasos y sus monoglicéridos que tienen grupos polares unidos en forma de micelas mixtas actúan en la barrera intestinal como potenciadores de la penetración. Este descubrimiento de la función modificadora de la barrera de los ácidos grasos libres (ácidos carboxílicos con una longitud de cadena que varía desde 12 a 20 átomos de carbono) y sus derivados polares ha estimulado una amplia búsqueda sobre la aplicación de estos agentes como potenciadores de la absorción en la mucosa. [0184] Para su uso en la invención, los ácidos grasos de cadena larga, especialmente lípidos fusogénicos (ácidos grasos insaturados y monoglicéridos, tales como ácido oleico, ácido linoleico, monooleína, etc.) , proporcionan portadores útiles para potenciar la liberación de péptido regulador de glucosa, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. Se ha observado que los ácidos grasos de cadena media (C6 a C12) y monoglicéridos presentan una mayor actividad en la absorción intestinal de fármacos y se pueden adaptar para su uso en las formulaciones de liberación por la mucosa y usos terapéuticos de la invención. Además, las sales sódicas de ácidos grasos de cadena media y larga son vehículos de liberación eficaces y agentes potenciadores de la absorción para la liberación por la mucosa de agentes biológicamente activos de la invención. De este modo, se pueden utilizar ácidos grasos en formas solubles de sales sódicas o mediante la adición de tensoactivos no tóxicos, por ejemplo, aceite de ricino hidrogenado polioxietilado, taurocolato sódico, etc. Otros ácidos grasos y preparaciones micelares mixtas que son útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, caprilato sódico (C8), caprato sódico (C10), laurato sódico (C12) u oleato sódico (C18), opcionalmente combinados con sales biliares, tales como glicocolato y taurocolato. “Pegilación” [0185] Los usos terapéuticos y composiciones proporcionadas en la presente invención pueden implicar la modificación química de péptidos y proteínas biológicamente activas mediante la unión covalente de materiales poliméricos, por ejemplo, dextranos, polivinil pirrolidonas, glicopéptidos, polietilenglicol y poliaminoácidos. Los péptidos y proteínas conjugadas resultantes mantienen sus actividades biológicas y solubilidad para la administración por la mucosa. En realizaciones alternativas, las proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos y miméticos, y otros péptidos y proteínas biológicamente activas, se conjugan a polímeros de óxido de polialquileno, particularmente polietilenglicoles (PEG). Patente de Estados Unidos No. 4,179,337. [0186] Los polímeros PEG reactivos a amina para su uso en la invención incluyen SCPEG con masas moleculares de 2000, 5000, 10000,12000, y 20 000; U-PEG-10000; NHS-PEG-3400-biotina; T-PEG-5000; T-PEG-12000; y TPC-PEG-5000. La PEGilación de péptidos y proteínas biológicamente activas se puede conseguir mediante la modificación de puntos carboxilo (por ejemplo, grupos ácido aspártico o ácido glutámico además del extremo carboxilo). Se ha descrito la utilidad de la PEGhidrazida en la modificación selectiva de grupos carboxilo de proteína activada con carbodiimida bajo condiciones ácidas. Alternativamente, se puede utilizar la modificación PEG bifuncional de péptidos y proteínas biológicamente activas. En algunos procedimientos, los residuos de aminoácidos cargados, incluyendo lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico presentan una marcada tendencia a ser accesible al disolvente en las superficies de las proteínas.

Otras modificaciones de agentes activos estabilizantes [0187] Además de la PEgilación, los agentes biológicamente activos, tales como péptidos y proteínas para su uso en la invención se pueden modificar para aumentar la vida media circulante mediante la protección del agente activo a través de la conjugación a otros compuestos protectores o estabilizantes conocidos, por ejemplo, mediante la creación de proteínas de fusión con un péptido, proteína, análogo o mimético activos unidos a una o más proteínas portadoras, tales como una o más cadenas de inmunoglobulina. Formulación y administración [0188] Las formulaciones de liberación en las mucosas de la presente invención comprenden un péptido regulador de glucosa, habitualmente combinado junto con uno

o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El portador o portadores deben ser “farmacéuticamente aceptables” en el sentido de ser compatibles con otros ingredientes de la formulación y no producir un efecto perjudicial inaceptable en el sujeto. Dichos portadores se describen aquí anteriormente o en cualquiera caso son bien conocidos por los expertos en farmacología. De forma deseable, la formulación no debería incluir sustancias, tales como enzimas o agentes oxidantes con los que el agente biológicamente activo a administrar se sabe que es incompatible. Las formulaciones se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en farmacia. [0189] En las composiciones y suso terapéuticos de la invención, las proteínas de péptido regulador de glucosa, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí se pueden administrar a sujetos por vía intranasal. En otras realizaciones alternativas, el agente o agentes biológicamente activos se pueden administrar ex vivo mediante la exposición directa a células, tejidos u órganos originarios de un sujeto mamífero, por ejemplo, como componente de una formulación de tratamiento de tejido u órgano ex vivo. [0190] Las composiciones según la presente invención se administran a menudo en una solución acuosa como pulverizador nasal y se puede dispensar en forma de pulverización mediante una serie de métodos conocidos por los expertos en la materia. Los sistemas preferidos para dispensar líquidos como un pulverizador nasal se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4,511,069. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes para dosis múltiples, por ejemplo en el sistema de dispensación sellado descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4,511,069. Las formas de administración por aerosol pueden incluir, por ejemplo, nebulizadores de aire comprimido, por inyección, por ultrasonido y piezoeléctricos, que liberan el agente biológicamente activo disuelto o suspendido en un disolvente farmacéutico, por ejemplo, agua, etanol o una mezcla de los mismos. [0191] Las soluciones de pulverización nasal de la presente invención comprenden habitualmente el fármaco o el fármaco a administrar, opcionalmente formulado con un agente activo de superficie, tal como un tensoactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato-80) y uno o más tampones. En algunas realizaciones de la presente invención, la solución de pulverización nasal comprende además un propelente. El pH de la solución de pulverización nasal se encuentra opcionalmente entre aproximadamente pH 2,0 y 8, preferiblemente 4,5 ± 0,5. Los tampones adecuados para su uso en estas composiciones son tal como se describen anteriormente o en cualquier caso como se conocen en la técnica. Se pueden añadir otros componentes para aumentar o mantener la estabilidad química, incluyendo conservantes, tensoactivos, dispersantes o gases. Entre los conservantes adecuados se incluyen, pero sin limitación, fenol, metil paraben, paraben, m-cresol, tiomersal, clorobutanol, cloruro de benzalconio, benzoato de sodio y similares. Entre los tensoactivos adecuados se incluyen, pero sin limitación, ácido oleico, trioleato de sorbitano, polisorbatos, lecitina, fosfatidil colinas y varios diglicéridos y fosfolípidos de cadena larga. Entre los dispersantes adecuados se incluyen, pero sin limitación, ácido etilendiaminotetracético, y similares. Entre los gases adecuados se incluyen, pero sin limitación, nitrógeno, helio, clorofluorocarbonos (CFCs), hidrofluorocarbonos (HFCs), dióxido de carbono, aire y similar. [0192] En realizaciones alternativas, las formulaciones para mucosa se administran como formulaciones en polvo seco que comprenden el agente biológicamente activo en una forma seca, normalmente liofilizada, de un tamaño de partícula apropiado, o en un rango de tamaño de partícula apropiado, para la administración intranasal. El tamaño de partícula mínimo apropiado para la deposición en las vías nasales o pulmonares es a menudo de aproximadamente 0,5 μ de diámetro aerodinámico equivalente mediano en masa (MMEAD), habitualmente aproximadamente 1 μ MMEAD, y más habitualmente aproximadamente 2 μ MMEAD. El tamaño de partícula máximo apropiado para la deposición en las vías nasales es a menudo de aproximadamente 10 μ MMEAD, habitualmente aproximadamente 8 μ MMEAD y más habitualmente aproximadamente 4 μ MMEAD. Los polvos intranasalmente respirables dentro de estos intervalos de tamaño se pueden producir mediante una serie de técnicas convencionales, tales como molido por inyección, secado por pulverización, precipitación con disolvente, condensación con fluido supercrítico, y similares. Estos polvos secos de MMEAD apropiado se pueden administrar a un paciente a través de un inhalador de polvo seco convencional (DPI), que depende de la respiración del paciente, tras la inhalación pulmonar o nasal, para dispersar el polvo en una cantidad aerosolizada. Alternativamente, el polvo seco se puede administrar a través de dispositivos asistidos con aire que utilizan una fuente de energía externa para dispersar el polvo en una cantidad aerosolizada, por ejemplo, una bomba de pistón. [0193] Los dispositivos para polvo seco requieren habitualmente una masa en polvo en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 20 mg para producir una dosis aerosolizada individual (“puff”). Si la dosis requerida o deseada del agente biológicamente activo es inferior que esta cantidad, el agente activo en polvo se combinará habitualmente con un polvo de relleno en seco farmacéutico para proporcionar la masa en polvo total requerido. Los polvos de relleno seco preferido incluyen sacarosa, lactosa, dextrosa, manitol, glicina, trehalosa, albúmina de suero humano (HSA) y almidón. Otros polvos de relleno en seco adecuados incluyen celobiosa, dextranos, maltotriosa, pectina, citrato de sodio, ascorbato de sodio, y similares. [0194] Para formular composiciones para liberación por la mucosa de la presente invención, el agente biológicamente activo se puede combinar con varios aditivos farmacéuticamente aceptables, así como una base o portador para la dispersión del agente o agentes activos. Los aditivos deseados incluyen, pero sin limitación, agente de control de pH, tales como arginina, hidróxido de sodio, glicina, ácido clorhídrico, ácido cítrico, ácido acético, etc. Además, se pueden incluir anestésicos locales (por ejemplo, bencil alcohol), agentes isotonizantes (por ejemplo, cloruro sódico, manitol, sorbitol), inhibidores de la adsorción (por ejemplo, Tween 80), agentes aumentadores de la solubilidad (por ejemplo, ciclodextrinas y derivados de los mismos), estabilizantes (por ejemplo, albúmina de suero), y agentes reductores (por ejemplo, glutatión). Cuando la composición para la liberación por la mucosa es un líquido, la tonicidad de la formulación, medida en referencia a la tonicidad de una solución salina fisiológica al 0,9 % (p/v) tomada como unidad, se ajusta habitualmente a un valor en el que no se inducirá un daño tisular sustancial irreversible en la mucosa nasal en el punto de administración. En general, la tonicidad de la solución se ajusta hasta un valor de aproximadamente 1/3 a 3, más habitualmente ½ a 2, y lo más a menudo de ¾ a 1,7. [0195] El agente biológicamente activo se puede dispersar en una base o vehículo, que puede comprender un compuesto hidrofílico que tiene capacidad de dispersar el agente activo y cualquier aditivo deseado. La base se puede seleccionar entre una amplia variedad de portadores adecuados, incluyendo, pero sin limitación, copolímeros de ácidos policarboxílicos o sales de los mismos, anhídridos carboxílicos, (por ejemplo, anhídrido maleico) con otros monómeros (por ejemplo, (met)acrilato de metilo, ácido acrílico, etc.), polímeros de vinilo hidrofílicos, tales como acetato de polivinilo, polivinil alcohol, polivinilpirrolidona, derivados de celulosa, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etc., y polímeros naturales, tales como quitosano, colágeno, alginato sódico, gelatina, ácido hialurónico, y sales de metales no tóxicos de los mismos. A menudo, se selecciona un polímero biodegradable como una base o portador, por ejemplo, ácido poliláctico, copolímero de poli(ácido láctico-ácido glicólico), ácido polihidroxibutírico, copolímero de poli(ácido hidroxibutírico-ácido glicólico) y mezclas de los mismos. Alternativa o adicionalmente, los ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como ésteres de ácidos grasos de poliglicerina, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, etc., se pueden utilizar como portadores. Los polímeros hidrofílicos y otros portadores se pueden utilizar solos o combinados y se puede transmitir una mayor integridad estructural al portador mediante cristalización parcial, enlace iónico, reticulación y similar. El portador se puede disponer en una variedad de formas, que incluyen fluido o soluciones viscosas, geles, pastas, polvos, microesferas y películas para la aplicación directa en la mucosa nasal. El uso de un portador seleccionado en este contexto puede dar lugar a la inducción de la absorción del agente biológicamente activo. [0196] El agente biológicamente activo se puede combinar con la base o portador según diversos métodos y la liberación del agente activo puede ser por difusión, desintegración del portador, o formulación asociada de canales de agua. En algunas circunstancias, el agente activo se dispersa en microcápsulas (microesferas) o nanocápsulas (nanoesferas) preparadas a partir de un polímero adecuado, por ejemplo, 2-cianoacrilato de isobutilo y se dispersa en un medio dispersante biocompatible aplicado a la mucosa nasal, lo cual produce una liberación sostenida y actividad biológica durante un tiempo prolongado.

[0197] Para aumentar adicionalmente la liberación por la mucosa de agentes farmacéuticos de la invención, las formulaciones que comprenden el agente activo también pueden contener un compuesto de peso molecular bajo hidrofílico como base

o excipiente. Dichos compuestos de peso molecular bajo hidrofílicos proporcionan un medio de paso a través del cual se puede difundir un agente activo soluble en agua, tal como un péptido o proteína fisiológicamente activos, a través de la base a la superficie del cuerpo donde se absorbe el agente activo. El compuesto de peso molecular bajo hidrofílico absorbe opcionalmente humedad de la mucosa o la atmósfera de la administración y disuelve el péptido activo soluble en agua. El peso molecular del compuesto de peso molecular bajo hidrofílico es generalmente no superior a 10000 y preferiblemente no superior a 3000. Los compuestos de peso molecular bajo hidrofílico de ejemplo incluyen compuestos polioles, tales como oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos, tales como sacarosa, manitol, sorbitol, lactosa, Larabinosa, D-eritrosa, D-ribosa, D-xilosa, D-manosa, trehalosa, D-galactosa, lactulosa, celobiosa, gentibiosa, glicerina y polietilenglicol. Otros ejemplos de compuestos de peso molecular bajo hidrofílico útiles como portadores de la invención incluyen Nmetilpirrolidona, y alcoholes (por ejemplo, oligovinil alcohol, etanol, etilenglicol, propilenglicol, etc.). Estos compuestos de peso molecular bajo hidrofílico se pueden utilizar solos o en combinación con otro o con otros componentes activos o inactivos de la formulación intranasal. [0198] Las composiciones de la invención pueden contener alternativamente como portadores farmacéuticamente aceptables sustancias según se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores del pH y agentes tamponadores, agentes para el ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar portadores farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similar. [0199] Las composiciones terapéuticas para la administración del agente biológicamente activo también se puede formular como una solución, microemulsión u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de principios activos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similar), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada para las soluciones se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula deseado en el caso de formulaciones dispersables, y mediante el uso de tensoactivos. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada del agente biológicamente activo se puede ocasionar mediante la inclusión en la composición de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. [0200] En ciertas realizaciones de la invención, el agente biológicamente activo se administra en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. El agente activo se puede preparar con portadores que protegerán contra la liberación rápida, por ejemplo, un vehículo de liberación controlada, tal como un polímero, sistema de liberación microencapsulado o gel bioadhesivo. La liberación prolongada del agente activo, en varias composiciones de la invención, se puede ocasionar mediante la inclusión en la composición de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando se desean formulaciones de liberación controlada del agente biológicamente activo, los aglutinantes de liberación controlada adecuados para su uso según la presente invención incluyen cualquier material de liberación controlada biocompatible que sea inerte al agente activo y que sea capaz de incorporar el agente biológicamente activo. En la técnica se conocen numerosos materiales de este tipo. Los aglutinantes de liberación controlada útiles son materiales que se metabolizan lentamente bajo condiciones fisiológicas tras la administración intranasal (por ejemplo, en la superficie de la mucosa nasal, o en presencia de fluidos corporales tras la administración transmucosal). Entre los aglutinantes apropiados se incluyen, pero sin limitación, polímeros biocompatibles y copolímeros utilizados previamente en la técnica en formulaciones de liberación sostenida. Dichos compuestos biocompatibles no son tóxicos y son inertes a los tejidos circundantes y no desencadenan efectos secundarios adversos significativos, tales como irritación nasal, respuesta inmune, inflamación o similar. Se metabolizan en productos metabólicos que también son biocompatibles y fácilmente eliminados del organismo. [0201] Entre los materiales poliméricos de ejemplo para su uso en este contexto se incluyen, pero sin limitación, matrices poliméricas derivadas de poliésteres copoliméricos y homopoliméricos que tienen uniones de éster hidrolizables. Un grupo de éstos son conocidos en la técnica por ser degradables y por conducir a productos de degradación que no tienen toxicidad o es baja. Entre los ejemplos de polímeros se incluyen ácido poliglicólicos (PGA) y ácidos polilácticos (PLA), poli(ácido DL-láctico-ácido coglicólico) (DL PLGA), poli(ácido D-láctico-ácido coglicólico)(D PLGA) y poli(ácido L-láctico-ácido coglicólico)(L PLGA). Otros polímeros biodegradables o bioerosionables útiles incluyen, pero sin limitación, polímeros tales como poli(epsilon-caprolactona), poli(epsilon-aprolactona-CO-ácido láctico), poli(εaprolactona-CO-ácido glicólico), poli(ácido beta-hidroxi butírico), poli(alquil-2cianoacrilato), hidrogeles, tales como poli(hidroxietil metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos) (es decir, L-leucina, ácido glutámico, ácido L-aspártico y similares), poli(éster urea), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), polímeros de poliacetales, poliortoésteres, policarbonato, polimaleamidas, polisacáridos y copolímeros de los mismos. Muchos métodos para preparar dichas formulaciones son conocidos en general por los expertos en la materia. Otras formulaciones útiles incluyen composiciones deliberación controlada, por ejemplo, microcápsulas, Patente de Estados Unidos Nos. 4,652,441 y 4,917,893, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico útiles en la fabricación de microcápsulas y otras formulaciones, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,677,191 y 4,728,721, y composiciones de liberación sostenida para péptidos solubles en agua Patente de Estados Unidos No. 4,675,189. [0202] Se pueden preparar soluciones estériles mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes indicados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los indicados anteriormente. En el caso de polvos estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. [0203] La administración en la mucosa según la invención permite la auto-administración eficaz del tratamiento por los pacientes, siempre que haya suficientes garantías en el lugar para controlar y hacer un seguimiento de la dosificación y los efectos secundarios. La administración en la mucosa también supera ciertos inconvenientes de otras formas de administración, tales como inyecciones, que son dolorosas y exponen el paciente a posibles infecciones y pueden presentar problemas de biodisponibilidad del fármaco. Para la administración nasal y pulmonar, son bien conocidos los sistemas para la dispensación controlada con aerosol de líquidos terapéuticos como un pulverizador. En una realización, las dosis fijas de agente activo se liberan mediante una válvula de bomba mecánica especialmente construida, Patente de Estados Unidos No. 4,511,069.

Dosificación [0204] Para los objetivos profilácticos y de tratamiento, el agente o agentes biológicamente activos descritos en la presente invención se pueden administrar al sujeto en una liberación en bolo única, a través de una liberación continua (por mucosa) durante un periodo de tiempo largo o en un protocolo de administración repetida (por ejemplo, mediante un protocolo de administración repetida horaria, diaria

o semanal). En este contexto, una dosis terapéuticamente eficaz del péptido regulador de glucosa puede incluir dosis repetidas en un régimen de profilaxis o tratamiento prolongado que producirá resultados clínicamente significativos para aliviar uno o más síntomas o condiciones detectables asociadas con una enfermedad o condición diana tal como se establece anteriormente. La determinación de dosificaciones eficaces en este contexto se basa habitualmente en estudios de modelos animales seguidos de pruebas clínicas humanas y está guiada por la determinación de dosis eficaces y protocolos de administración que reducen significativamente la aparición o gravedad de síntomas de enfermedades diana o condiciones en el sujeto. Los modelos adecuados en este aspecto incluyen, por ejemplo, murino, rata, porcino, felino, primate no humano, y otros sujetos de modelos animales aceptados conocidos en la técnica. Alternativamente, las dosis eficaces se pueden determinar utilizando modelos in vitro (por ejemplo, ensayos inmunológicos e histopatológicos). Utilizando dichos modelos, sólo cálculos y ajustes ordinarios son requeridos habitualmente para determinar una concentración y dosis apropiadas para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente o agentes biológicamente activos (por ejemplo, cantidades que son eficaces intranasalmente, eficaces transdérmicamente, eficaces intravenosamente o eficaces intramuscularmente para obtener una respuesta deseada). [0205] La presente invención proporciona composiciones y usos terapéuticos para la administración intranasal del péptido regulador de glucosa, donde el compuesto o compuestos de péptido regulador de glucosa se administra repetidamente a través de un régimen de dosificación eficaz intranasal que implica administraciones múltiples del péptido regulador de glucosa al sujeto durante una pauta diaria o semanal para mantener un nivel intermitente elevado y disminuido terapéuticamente eficaz de péptido regulador de glucosa durante un periodo de dosificación extendido. Las composiciones y método proporcionan el compuesto o compuestos de péptido regulador de glucosa que son autoadministradas por el sujeto en una formulación nasal entre una y seis veces diarias para mantener un intermitente elevado y disminuido terapéuticamente eficaz de péptido regulador de glucosa durante un periodo de dosificación de 8 horas a 24 horas. [0206] La solicitud también incluye kits, envases y unidades multirecipiente que contienen las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, principios activos y/o medios para la administración de los mismos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y otras condiciones en sujetos mamíferos. Brevemente, estos kits incluyen un recipiente o formulación que contiene una o más proteínas de péptidos reguladores de glucosa, análogos o miméticos, y/u otros agentes biológicamente activos en combinación con agentes potenciadores de la liberación por la mucosa descritos aquí formulados en una preparación farmacéutica para la liberación por la mucosa. [0207] Las formulaciones intranasales de la presente invención se pueden administrar utilizando cualquier botella pulverizadora o jeringuilla, o mediante instilación. Un ejemplo de una botella pulverizadora nasal es el "Nasal Spray Pump w/ Safety Clip, Pfeiffer SAP # 60548, que libera una dosis de 0,1 mL por chorro y tiene una longitud del tubo de inmersión de 36,05 mm. Se puede adquirir de Pfeiffer de America of Princeton, NJ. Administración nasal con aerosol de un péptido regulador de glucosa [0208] Se ha descubierto que los GRPs se pueden administrar intranasalmente utilizando un pulverizador nasal o aerosol. Esto es sorprendente porque se ha observado que muchas proteínas y péptidos se rompen o desnaturalizan debido a las fuerzas mecánicas generadas por el actuador en la producción del pulverizador o aerosol. En este área, son útiles las siguientes definiciones.

1.: Aerosol – Producto que está envasado bajo presión y contiene ingredientes terapéuticamente activos que son liberados tras la activación de un sistema de válvulas adecuado.

2.: Aerosol de dosis fija – Forma de dosificación presurizada comprendida de válvulas de dosis fija, que permiten la liberación de una cantidad uniforme de pulverizado tras cada activación.

3.: Aerosol en polvo – Producto que está envasado bajo presión y contiene ingredientes terapéuticamente activos en forma de polvo, que se libera tras la activación de un sistema de válvulas apropiado.

4.: Aerosol por pulverización – Producto aerosol que utiliza un gas comprimido como propelente para proporcionar la fuerza necesaria para expulsar el producto como un pulverizado húmedo; generalmente aplicable a soluciones de agentes medicinales en disolventes acuosos.

5.: Pulverizado – Líquido dividido finamente por un chorro de aire o vapor. Los productos fármacos para pulverización nasal contienen ingredientes terapéuticamente activos disueltos o suspendidos en soluciones o mezclas de excipientes en dispensadores no presurizados.

6.: Pulverizado de dosis fija – Forma de dosificación no presurizada que consiste en válvulas que permiten la dispensación de una cantidad específica de pulverizado tras cada activación

7.: Pulverizado en suspensión – Preparación líquida que contiene partículas sólidas dispersadas en un vehículo líquido y en forma de gotas gruesas o como sólidos finamente divididos. [0209] La caracterización dinámica de fluido del pulverizado por aerosol emitido por bombas de pulverización nasal de dosis fija como dispositivo de liberación de fármacos (“DDD”). La caracterización de la pulverización es una parte integral de los formularios reguladores para la aprobación de la Food and Drug Administration ("FDA") de los procedimientos de investigación y desarrollo, seguridad de la calidad y ensayos de estabilidad para bombas de pulverización nasal nuevas y existentes. [0210] Se ha observado que una caracterización en profundidad de la geometría del pulverizador es el mejor indicador del rendimiento gomal de las bombas de pulverización nasal. En particular, se ha observado que las mediciones del ángulo de divergencia del pulverizador (geometría del plasma (“plume”)) a medida que sale del dispositivo; la elipticidad en sección transversal del pulverizador, uniformidad y distribución de partícula/gota (patrón de pulverización); y la evolución con el tiempo del pulverizado en desarrollo son las cantidades del rendimiento más representativas en la caracterización de una bomba de pulverización nasal. Durante los análisis de garantía de calidad y estabilidad, las mediciones de la geometría del plasma y el patrón de pulverización son identificadores clave para verificar la consistencia y conformidad con los criterios de los datos aprobados para las bombas de pulverización nasal. Definiciones [0211] Altura del plasma – la medición desde la punta del accionador al punto en el que el ángulo del plasma se vuelve no lineal debido a la rotura del flujo lineal. En base al examen visual de las imágenes digitales y para establecer un punto de medición para la anchura que concuerda con el punto de medición más alejado del patrón de pulverización, se define una altura de 30 mm para este estudio. Eje mayor – la cuerda mayor que se puede dibujar en el patrón de pulverización ajustado que cruza COMw en unidades base (mm)

Eje menor -la cuerda menor que se puede dibujar en el patrón de pulverización ajustado que cruza COMw en unidades base (mm) Proporción de elipticidad – la proporción de eje mayor con respecto al eje menor, preferiblemente entre 1,0 y 1,5, y más preferiblemente entre 1,0 y 1,3.

5 D10 – diámetro de gota para el cual el 10% del volumen líquido total de la muestra consiste en gotas de un diámetro menor (μm) D50 – diámetro de gota para el cual el 50% del volumen líquido total de la muestra consiste en gotas de un diámetro menor (μm), también conocido como la mediana del diámetro de la masa

10 D90 -diámetro de gota para el cual el 90% del volumen líquido total de la muestra consiste en gotas de un diámetro menor (μm) Rango – medición de la anchura de la distribución. Cuanto más pequeño es el valor, más estrecha es la distribución. El rango se calcula como (D90-D10)/D50 % RSD – desviación estándar relativa en porcentaje, la desviación estándar dividida

15 por la media de la serie y multiplicado por 100, también conocido como % CV. [0212] Volumen – el volumen de líquido o polvo descargado desde el dispositivo de liberación con cada acción, preferiblemente entre 0,01 ml y aproximadamente 2,5 mL y los más preferible entre 0,01 mL y 0,25 mL. [0213] Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, no limitación.

20 EJEMPLO 1 (Profético) Composición de formulaciones que contienen GRP [0214] Se prepara y evalúa de la siguiente manera un ejemplo de formulación profética de ejemplo para una liberación aumentada en la mucosa nasal de péptidos reguladores

25 de glucosa que siguen las enseñanzas de la presente memoria.

Tabla 1: composición de formulación con GRP

Formulaciones: Agente potenciador de la liberación por la mucosa

A: Solución salina tamponada con fosfato (0,8%) pH 7,4 (Control 1)

B: Solución salina tamponada con fosfato (0,8%) pH 5,0 (Control 2)

C: L-arginina (10% p/v)

D: poli-L-arginina (0,5% p/v)

E: Gamma-ciclodextrina (1% p/v)

F: α-ciclodextrina (5% p/v)

G: metil-β-ciclodextrina (3% p/v)

H: Sal sódica de ácido n-cáprico (0,075% p/v)

I: Quitosano (0,5% p/v)

J: L-α-didecanoil fosfatidilcolina (3,5% p/v)

K: S-nitroso-N-acetil-penicilamina (0,5% p/v)

L: Palmitoil-DL-carnitina (0,02% p/v)

M: Plurónico-127 (0,3% p/v)

N: Nitroprúsido de sodio (0,3% p/v)

O: Glicocolato de sodio (1% p/v)

P: F1: Gelatina, DDPC, MBCD, EDTA

F 1: L-α-didecanoil fosfatidilcolina (0,5% p/v), metil-β-ciclodextrina (3% p/v), EDTA (0,1% p/v, Conc. Inf. 0,5 M), Gelatina (0,5 % p/v)

• Se añade una cantidad de un GRP a la formulación para producir una concentración suficiente para producir un efecto terapéutico.

EJEMPLO 2 (Profético) Preparación de una formulación de amilina libre de un estabilizante que es una

5 proteína [0215] Se prepara una formulación de amilina adecuada para la administración intranasal de amilina, que está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína que tiene la formulación indicada a continuación.

1. Se añaden aproximadamente ¾ de agua a un vaso de precipitados y se agita con una

10 vara agitadora sobre una placa de agitación y se añade citrato de sodio hasta que se disuelve completamente.

2.: A continuación se añade EDTA y se agita hasta que se disuelve completamente.

3.: A continuación, se añade el ácido cítrico y se agita hasta que se disuelve completamente.

15 4. Se añade la metil-β-ciclodextrina y se agita hasta que se disuelve completamente.

5.: A continuación, se añade DDPC y se agita hasta que se disuelve completamente.

6.: A continuación, se añade lactosa y se agita hasta que se disuelve completamente.

7.: A continuación, se añade sorbitol y se agita hasta que se disuelve completamente.

8. A continuación, se añade clorobutanol y se agita hasta que se disuelve 20 completamente.

9.: Se añade amilina y se agita suavemente hasta que se disuelve.

10.: 11 Comprobar el pH para asegurar que es 5,0 ± 0,25. Añadir HCl diluido o NaOH diluido para ajustar el pH.

11.: Añadir agua hasta volumen final Tabla 2

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico: 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

Amilina: 1 0,1

Agua purificada

Formulación pH 5 ± 0,25 Osmolaridad ∼250

5

EJEMPLO 3 (Profético) Preparación de una formulación de amilina libre de estabilizante que es una proteína y

10 la concentración de amilina es 15 mg/mL [0216] Se prepara una segunda formulación como antes, a excepción de que la concentración de amilina es de 15 mg/mL tal como se muestra a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico: 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

amilina: 15 0,1

Agua purificada

Formulación pH 4-6

EJEMPLO 4

(Profético)

Preparación de una formulación de pramlintida libre de estabilizante que es una 5 proteína y está libre de endotoxina

[0217] Se puede fabricar la siguiente formulación nasal de acetato de pramlintida libre

de endotoxina

Tabla 4

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 2,5 0,025

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico (EDTA): 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,6 0,16

Ácido cítrico, anhidro: 0,9 0,09

Pramlintida, libre de endotoxina: 2 0,2

Agua purificada

Formulación pH 5 ± 0,25

EJEMPLO 5 (Profético) Formulación bucal de un GRP [0218] Se preparan comprimidos bicapa de la siguiente manera. Se prepara una capa

15 adhesiva pesando 70 partes en peso de óxido de polietileno (Polyox 301N; Union Carbide), 20 partes en peso de ácido poliacrílico (Carbopol 934P; B.F. Goodrich), y 10 partes en peso de un rellenador comprimible de xilitol/carboximetil celulosa (Xylitab 200; Xyrofin). Estos ingredientes se mezclan enrollado en un tarro durante 3 minutos. A continuación, la mezcla se transfiere a un plato evaporador y rápidamente se granula en húmedo con etanol absoluto hasta una consistencia de tipo semimasa. Esta masa se hace pasar inmediatamente y rápidamente a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 14 (abertura de 1,4 mm) al que se adhieren los gránulos húmedos. El tamiz se cubre con papel de aluminio perforado y los gránulos húmedos se secan durante la noche a 30oC. Los gránulos secados se extrajeron del tamiz y, a continuación, se pasan a través de un tamiz de malla 20 (abertura de 0,85 mm) para reducir adicionalmente el tamaño de los gránulos. Las partículas que no pasan a través del tamiz de malla 20 se muelen brevemente con un mortero y se machacan para minimizar la cantidad de partículas finas y a continuación se pasa a través de un tamiz de malla 20. Los gránulos resultantes se colocan a continuación en un tarro de mezclado, y se añaden 0,25 partes en peso de ácido esteárico y 0,06 partes por peso de sabor de menta (Universal Flavors) y se mezclan a los gránulos. Los porcentajes finales en peso de los ingredientes son, de este modo, un 69,78% de óxido de polietileno, 9,97% de rellenador comprimible de xilitol/carboximetil celulosa, 19,94% de ácido poliacrílico, 0,25% de ácido esteárico y 0,06% de sabor a menta. Se coloca una cantidad de 50 mg de esta mezcla en un tamiz de 0,375 pulgadas de diámetro y se descomprime en un Carver Press Model C con una presión de 0,25 toneladas métricas durante un tiempo permanente de 3 segundos para formar la capa adhesiva. [0219] La capa activa se prepara pesando 49,39 partes en peso de manitol, 34,33 partes en peso de hidroxipropil celulosa (Klucel L F; Aqualon, Wilmington, Del.) y 15,00 partes en peso de taurocolato sódico (Aldrich, Milwaukee, Wis.), y mezclando mediante enrollado en un tarro durante 3 minutos. A continuación, la mezcla se transfiere a un plato evaporador y se granula en húmedo rápidamente con etanol absoluto hasta una consistencia del tipo semimasa. Esta masa se hace pasar inmediatamente y rápidamente a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 14 al que se adhieren los gránulos húmedos. El tamiz se cubre con papel de aluminio perforado y los gránulos húmedos se secan durante la noche a 30oC. La granulación seca se pasa secuencialmente a continuación a través de tamices de malla 20, 40 (abertura de 0,425 mm) y 60 (abertura de 0,25 mm) para reducir más el tamaño de partícula. Las partículas que no pasan a través de un tamiz se muelen brevemente con un mortero y se machacan para minimizar las partículas finas y, a continuación se pasan a través de un tamiz. Las partículas cribadas se pesaron y, a continuación, se mezclan secuencialmente 0,91 partes en peso de GRP y 0,06 partes en peso de colorante lago aluminio FD&C amarillo #6HT con la granulación seca mediante dilución geométrica. A continuación, la granulación coloreada se pasa a continuación en un tarro de mezcla y se mezcla con 0,25 partes en peso se estearato de magnesio (lubricante) y 0,06 partes en peso de sabor de menta mediante enrollado durante 3 minutos. Se colocan 50 mg de muestra de este material en la parte superior de la capa adhesiva parcialmente comprimida y a continuación se comprimen ambas capas a una presión de 1,0 toneladas durante un tiempo permanente de 3 segundos para producir un comprimido bicapa adecuado para la liberación bucal. [0220] Este procedimiento da lugar a un comprimido gingival en el que la capa activa contiene un 0,91% en peso de GRP, 15% en peso de NaTC y 84,09% en peso de rellenador, lubricante, colorante, auxiliares de formulación o agentes aromatizantes. EJEMPLO 6 (no es parte de la invención) (Profético) Liberación pulmonar de GRP [0221] Los compuestos portadores, preparados tal como se ha descrito a continuación, se pueden utilizar directamente como portadores de la liberación mediante la simple mezcla de uno o más compuestos o sales, poliaminoácidos o péptidos con un péptido regulador de glucosa libre de endotoxina para la liberación pulmonar. [0222] Las mezclas de administración se preparan mezclando una solución acuosa del portador con una solución acuosa del principio activo justo antes de la administración. Alternativamente, el portador y el ingrediente biológica o químicamente activo se pueden mezclar durante el proceso de fabricación. Las soluciones pueden contener opcionalmente aditivos, tales como sales de tampón fosfato, ácido cítrico, ácido acético, gelatina y goma acacia. [0223] Un conjunto de métodos liberación pulmonar conocidos pueden utilizar péptido regulador de glucosa libre de endotoxina, especialmente GRP, para mejorar la liberación de GRP a los pulmones. Las siguientes solicitudes de patentes no limitantes se incorporan en la presente por referencia para la liberación pulmonar: Solicitudes de Patentes de Estados Unidos Nos. 20030223939, 20030215514, 20030215512, 20030209243, 20030203036, 20030198601, 20030183228, 200301885765, 20030150454, 20030124193, 20030094173. EXAMPLE 7 (no es parte de la invención) (Profético) Preparación de portadores para la liberación pulmonar Preparación de ácido 2-(4-(N-saliciloil)aminofenil) propiónico (Portador B) [0224] Se trata una emulsión de 58,6 g (0,355 mol) de ácido 2-(4aminofenil)propiónico y 500 ml de cloruro de metileno con 90,11 ml (77,13 g. 0-710 mol) de cloruro de trimetilsililo y se calienta hasta reflujo durante 120 min. La mezcla de reacción se enfría hasta 0°C y se trata con 184,44 ml (107,77 g, 1,065 mol) de trietilamina. Después de agitar durante 5 minutos, esta mezcla se trata con una solución de 70,45 g (0,355 mol) de cloruro de O-acetilsaliciloilo y 150 ml de cloruro de metileno. La mezcla de reacción se calienta hasta 25° C y se agita durante 64 h. Los compuestos volátiles se eliminan al vacío. El residuo se agita en hidróxido de sodio acuoso 2 N durante una hora y se acidifica con ácido sulfúrico acuoso 2 M. El sólido se recristaliza dos veces a partir de etanol/agua para producir un sólido tostado. El aislamiento por filtración da lugar a un rendimiento esperado de 53,05 g (52% de rendimiento) de ácido 2-(4-(N-saliciloil) aminofenil)propiónico. Propiedades. Solubilidad: 200 mg/m: 200 mg+350 .μL 2N NaOH+650 μL H2O-pH-7,67. Análisis: C, 67,36; H, 5,3; N, 4,91. Preparación de 2-(4-(N-saliciloil)aminofenil)propionato sódico (sal sódica del portador B) [0225] Se trata una solución de 53,05 g (0,186 mol) de ácido 2-(4-(Nsaliciloil)aminofenil)propiónico y 300 ml de etanol con 7,59 g (0,190 mol) de NaOH disuelto en 22 ml de agua. La mezcla de reacción se agita durante 30 min a 25°C y durante 30 min a 0° C. El sólido amarillo pálido resultante se aísla por filtración para producir 52,61 g de 2-(4-(N-saliciloil) aminofenil)propionato sódico. Propiedades. Solubilidad: 200 mg/ml de solución clara, pH=6,85. Análisis C, 60,45; H, 5,45; N, 3,92; Na, 6,43. Punto de fusión 236-238° C. Preparación de la sal sódica del Portador C [0226] Se carga un matraz de base redonda de 2 L equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo con una suspensión de ácido 3-(4-aminofenil)propiónico (15,0 g, 0,084 moles, 1,0 equiv.) en diclorometano (250 ml). Se añade de golpe clorotrimetilsilano (18,19 g, 0,856 moles, 2,0 equiv.) y la mezcla se calienta a reflujo durante 1,5 h bajo argón. La reacción se deja enfriar hasta temperatura ambiente y se coloca en un baño de hielo (temperatura interna <10° C). El condensador de reflujo se sustituye por un embudo de adición que contiene trietilamina (25,41 g, 0,251 moles, 3,0 equiv.). La trietilamina se añade gota a gota durante 15 min, y se forma un sólido amarillo durante la adición. El embudo se sustituye por otro embudo de adición que contiene una solución de cloruro de 2,3-dimetoxibenzoilo (I 8,31 g, 0,091 moles, 1,09 equiv.) en diclorometano (100 mL). La solución se añade gota a gota durante 30 min.

La reacción se agita en el baño de hielo durante otros 30 min y a temperatura ambiente durante 3 h. El diclorometano se evapora al vacío para producir un aceite marrón. El aceite marrón se enfría en un baño de hielo y se añade la solución enfriada en hielo de bicarbonato de sodio saturado (250 ml). Se extrae el baño de hielo, y la mezcla de reacción se agita durante 1 h para producir una solución marrón clara. La solución se acidifica con HCl concentrado y se guarda a aproximadamente SC durante 1 hora. La mezcla se extrae con diclorometano (3 veces 100 mL), se seca sobre sulfato sódico, las sales se filtran y se extrae el diclorometano al vacío. El sólido resultante se recristaliza a partir de acetato de etilo/agua al 50% (v/v) para producir el Portador C ácido como agujas blancas (25,92 g. 90%). Análisis para C19H21NO5: C, 66,46; H, 6,16; N, 4,08. pf= 99-102°C. [0227] Se disuelven 12 gramos del Portador C ácido en etanol, 75 mL, con calentamiento. A estas solución se añade una solución de hidróxido sódico 8,5 M (1,02 equivalentes molares, 1,426 gramos en 4,5 mL de agua). La mezcla se agita durante 15 minutos. Se extraen al vacío aproximadamente tres cuartos del etanol y se añade nheptano, 100 mL, al aceite resultante que provoca que se forme precipitado. Los sólidos se secan al vacío a 50° C. Análisis: C19H20NO5Na0,067H2O: C, 62,25; H, 5,54; N, 3,82; Na, 6,27. Preparación de ácido N-(4-metilsaliciloil)-8-aminocaprílico (Portador D)

(a): Preparación de oligo(4-metilsalicilato) [0228] Se añaden en un matraz de 4 bocas de 1 L con una vara de agitación magnética, un termómetro y un condensador anhídrido acético (32 mL, 34,5 g, 0,338 mol, 1,03 eq), ácido 4-metilsalicílico (50 g, 0,329 mmol, 1,00 eq), y xilenos (100 mL). El matraz se coloca en un baño de arena y empieza el calentamiento de la mezcla blanca turbia. La mezcla de reacción se aclara hasta una solución amarilla alrededor de 90°C. La mayoría de los compuestos orgánicos volátiles (xilenos y ácido acético) se destilan en una trampa durante tres horas (135-146°C.). La destilación se continúa durante otra hora (un total de 110 mL destilados), durante la cual la temperatura del recipiente aumenta lentamente hasta 204°C y el destilado cae como un hilo. El residuo se vierte mientras aún está caliente en una bandeja de aluminio. Después de enfriar se forma un vidrio amarillo quebradizo. El sólido se muele hasta un polvo fino. El oligo(4metilsalicilato) obtenido se utiliza sin purificación adicional.

(b): Preparación de ácido N-(4-metilsaliciloil)-8-aminocaprílico [0229] Se añaden a un matraz de base redonda de 1 L equipado con una vara de agitación magnética, un condensador y un embudo de adición una solución 7M de

carbonato de potasio (45 mL, 43,2 g, 0,313 mol, 0,95 eq), ácido 8-aminocaprílico (41,8 g, 262 mol, 798 eq), y agua (20 mL). La mezcla blanca turbia se trata con una solución de oligo(4-metilsalicilato) (44,7 g, 0,329 mmol, 1,0 eq) y dioxano (250 mL), añadidos durante treinta minutos. La mezcla de reacción se calienta hasta 90°C durante 3 horas (en cuyo punto se determina que la reacción ha terminado mediante HPLC). La mezcla de reacción naranja claro se enfría hasta 30°C y se acidifica hasta pH=2 con ácido sulfúrico acuoso al 50% (64 g). El sólido resultante se aísla por filtración. El sólido blanco se recristaliza a partir de 1170 mL de etanol-agua al 50%. El sólido se recupera por filtración y se seca durante 18 horas en un horno al vacío a 50°C. Se aísla el ácido N-(4-metilsaliciloil)-8-ami-nocaprílico como un sólido banco (30,88 g, 52%); pf=113114°. Análisis: C6H23NO4: C, 65,51; H, 7,90; N, 4,77. [0230] A continuación, se prepara una solución acuosa de un GRP y se mezcla con uno

o más de los portadores para producir una composición de GRP, que, a continuación se puede pulverizar en los pulmones. Una concentración adecuada de GRP para la composición resultante debería ser de aproximadamente 400 μg/mL. Véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20030072740. EJEMPLO 8 (Profético) Preparación de una formulación de GLP-1 libre de estabilizante que es una proteína [0231] Se prepara una formulación de GLP-1 adecuada para la administración intranasal de GLP-1, que está sustancialmente libre de un estabilizante que es un polipéptido o una proteína que tiene la formulación indicada a continuación.

1.: Se añaden aproximadamente ¾ de agua a un vaso de precipitados y se agita con una vara agitadora sobre una placa de agitación y se añade citrato de sodio hasta que se disuelve completamente.

4.: Se añade la metil-β-ciclodextrina y se agita hasta que se disuelve completamente.

8.: A continuación, se añade clorobutanol y se agita hasta que se disuelve completamente.

9.: Se añade GLP-1 y se agita suavemente hasta que se disuelve.

10.: Comprobar el pH para asegurar que es 4,5 ± 0,5. Añadir HCl diluido o NaOH diluido para ajustar el pH.

11.: Añadir agua hasta volumen final Tabla 5

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico (EDTA): 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

GLP-1: 1 0,1

Agua purificada

Formulación pH 4,5 ± 0,5 Osmolaridad ∼250

5

EJEMPLO 9 (Profético) Preparación de una formulación de GLP-1 libre de estabilizante que es una proteína [0232] Se prepara una segunda formulación como antes, a excepción de que la

10 concentración de GLP-1 es de 15 mg/mL tal como se muestra a continuación en la Tabla 6. Tabla 6

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico: 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

GLP-1: 1 0,1

Agua purificada

Formulación pH 4,5 ± 0,5

EJEMPLO 10 (Profético) Preparación de una formulación de Exendina-4 libre de estabilizante que es una

5 proteína [0233] Se prepara una formulación de exendina-4 adecuada para la administración intranasal de exendina, que está sustancialmente libre de un estabilizante que es una proteína que tiene la formulación indicada a continuación.

8.: A continuación, se añade clorobutanol y se agita hasta que se disuelve 20 completamente.

9.: Se añade exendina-4 y se agita suavemente hasta que se disuelve.

10.: Comprobar el pH para asegurar que es 5,0 ± 0,25. Añadir HCl diluido o NaOH diluido para ajustar el pH.

11.: Añadir agua hasta volumen final 25 Tabla 7

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico: 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

Exendina-4: 1 0,1

Agua purificada

Formulación pH 4,5 ± 0,5 Osmolaridad ∼250

EJEMPLO 11

(Profético)

[0234] Se prepara una segunda formulación como antes, a excepción de que la 5 concentración de exendina-4 es de 15 mg/mL tal como se muestra a continuación en la Tabla 8. Tabla 8

Reactivo: mg/mL %

Clorobutanol, anhidro: 5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina: 45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina: 1 0,1

Edetato disódico: 1 0,1

Citrato sódico, dihidrato: 1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro: 0,86 0,086

α-lactosa monohidrato: 9 0,9

Sorbitol: 18,2 1,82

Exendina-4: 15 0,1

Agua purificada

Formulación pH 5 ± 0,25

EJEMPLO 12 Aumento de la permeabilidad de exenatida marcada con fluoresceína a través de una barrera celular utilizando potenciadores de la permeación Muestras: Formulación #1: [0235] 1 mg/mL de Fluoresceína-exendina 4 (AnaSpec, Inc, San Jose, CA) 10 mM del sistema tampón citrato de sodio/ácido cítrico, pH 4,5 45 mg/mL de metil-beta-ciclodextrina 1 mg/mL de EDTA 1 mg/mL de DDPC 25 mM de lactosa 100 mM de sorbitol 0,5% clorobutanol Formulación #2 (formulación salina) [0236] 1 mg/mL de Fluoresceína-exendina 4 (AnaSpec, Inc, San Jose, CA) 10 mM del sistema tampón citrato de sodio/ácido cítrico, pH 4,5 140 mM de NaCl Métodos:

Cultivos celulares

[0237] Se utilizó la línea celular MatTek Corp. (Ashland, MA) como fuente de células epiteliales traqueales/bronquiales normales derivadas de ser humano (Modelo de Tejido EpiAirway™). Las células se proporcionaron como inserciones desarrolladas para confluir en filtros Millipore Milicell-CM comprendidos de Teflón hidrofílico transparente (PTFE). Tras la recepción, las membranas se cultivaron en medio basal de 1 ml (Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de rojo fenol y de hidrocortisona) a 37°C con CO2 al 5% durante 24-48 horas antes del uso. Las inserciones se administraron durante cada día de recuperación.

Ensayos del tejido

[0238] Cada inserción del tejido se colocó en un pozo individual que contenía 1 mL de medio basal. En la superficie apical de las inserciones, se aplicaron 100 μl de la formulación de prueba y las muestras se colocaron en un agitador (∼ 100 rpm) durante 1 h a 37 °C. Las muestras del medio de cultivo subyacente se guardaron a 4°C hasta 48 horas para las evaluaciones de la lactato deshidrogenasa (LDH, citotoxicidad) y la permeación de la muestra. Se midió la resistencia eléctrica transepitelial (TER) antes y después de una incubación de 1 hora. Después de la incubación, se analizaron las inserciones celulares por su viabilidad celular a través del ensayo de la deshidrogenasa mitocondrial (MDH).

Medición de la Resistencia Eléctrica Transepitelial (TER)

[0239] Las mediciones de TEER se realizaron utilizando la Cámara de Medición de la Resistencia del Tejido Endohm-12 conectada al Voltohmetro Epitelial EVOM (World Precision Instruments, Sarasota, FL) con los cables conductores de los electrodos. Los electrodos y la inserción de cultivo de tejido como blanco se equilibraron durante por lo menos 20 minutos en una solución tamponada de fosfato con el interruptor en posición de desconexión para comprobar la calibración. La resistencia de fondo se midió con 1,5 mL de PBS en la cámara de tejido Endohm y 250 μL de PBS en la inserción como blanco. Para cada determinación de TER, se añadieron -250 μL de PBS a la inserción seguido de la sustitución en la cámara de Endohm. La resistencia de expresa como (resistencia medida -blanco) X 0,6 cm2.

Ensayo de LDH

[0240] La cantidad de muerte celular se analizó midiendo la pérdida de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células utilizando un Kit de Ensao de Toxicidad CytoTox 96 (Promega Corp., Madison, WI). Se utilizó un medio de cultivo nuevo sin células como blanco. Se añadieron a cada pocillo cincuenta microlitros de solución sustrato y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, se añadieron a cada pocillo 50 μL de solución de detención y las placas se leyeron en un lector de densidad óptica en placa a 490 nm.

Ensayo de MTT

[0241] Se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo de MTT (MTT-100, MatTek kit). Se pipeteó un concentrado de MTT descongelado y diluido (300 μL) en una placa de 24 pocillos. Las inserciones de tejido se secaron suavemente, se colocaron en los pocillos de las placas, y se incubaron a 37°C durante 3 horas. Después de la incubación, se extrajo cada inserción de la placa, se transfirió suavemente, y se colocó en una placa de extracción de 24 pocillos. A continuación, las inserciones de cultivo celular se sumergieron en 2,0 mL de la solución de extracción por pocillo (para cubrir completamente la muestra). La placa de extracción se cubrió y selló para reducir la evaporación de extractante. Después de incubación durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad, se decantó el líquido en cada inserción al pocillo del que se tomó y se desechan las inserciones. La solución extractante (200 μL en por lo menos por duplicado) se pipeteó en una placa de microtitulación de 96 pocillos, junto con los blancos de extracto. La densidad óptica de las muestras se midió a 550 nm en un lector

de placas (Molecular Devices, Palo Alto, CA).

Cuantificación de fluoresceína-exendina 4 permeada a través de la barrera de tejido

[0242] La cantidad de fluoresceína-exendina 4 que perneó a través de la barrera celular in vitro se cuantificó utilizando Lector de Placas por Fluorescencia Bio-Tek Microplate, FLC 800 (Bioteck Instruments Inc, Winooski, VT). Las muestras basolaterales de cada pocillo se recogieron después de una hora de incubación y se leyeron no diluidas con el lector de placas por fluorescencia utilizando un patrón producido de la misma solución madre de Fluoresceína-Exendina 4 y PBS que se utilizó para el experimento de permeación. Se generó una curva estándar sobre el intervalo de cuantificación relevante. La excitación utilizada fue 485 y de emisión 528. [0243] Los datos mostrados en la figura 1 indican que la adición de los potenciadores de la permeación en la formulación #1 redujeron ampliamente la TER. En este caso, la reducción en la TER era comparable con la muestra de control de Triton-X. En cambio, la formulación 2, que no presentaba ningún potenciador de permeación, no mostraba una reducción en la TER, un comportamiento similar al control de PBS (solución salina tamponada con fosfato). [0244] La figura 2 representa datos para el ensayo de MTT (viabilidad celular). Se puede observar que tanto la formulación #1 como la formulación #2 mostraron una viabilidad elevada, por lo menos un 80% mayor en comparación con el control de PBS. Tal como se esperaba, el control con Triton disminuyó drásticamente la viabilidad celular. [0245] La figura 3 presentaba datos para el ensayo de LDH (citotoxicidad). Se puede observar que tanto la formulación # 1 como la formulación #2 mostraban una citotoxicidad baja, similar control de PBS. Tal como se esperaba, el control del Triton disminuyó drásticamente la viabilidad celular. [0246] Finalmente, los datos para la permeación de fluoresceína-exenatida en las formulaciones #1 y #2 se proporcionan en la figura 4 (cabe indicar que el eje y se muestra en escala logarítmica). La formulación #1, con la adición de potenciadores de permeación para abrir reversiblemente las uniones estrechas, mostró un aumento espectacular de la permeación en comparación con la formulación #2 simple (un incremento de unas 200 veces).

LISTADO DE SECUENCIAS [0247]

<110> Quay. Steven C. Costantino. Henry R.

<120> ADMINISTRACIÓN INTRANASAL DE PÉPTIDO REGULADOR DE GLUCOSA

<130> 03-14PCT

<150> 60/532.337

<151> 2003-12-26

<160> 47

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

•: US 6506724 B [0001] • US 4226848 A [0166]

•: US 20030036504 A1 [0001] • US 4948580 A [0166]

•: EP 1083924 B1 [0001] • US 33093 A [0166]

•: WO 9830231 A1 [0001] • US 4235871 A [0179]

•: WO 0073331 A2 [0001] • US 4501728 A [0179]

•: US 5424286 A [0046] • US 4837028 A [0179]

•: WO 8706941 A [0049] • US 4179337 A [0185]

•: WO 9011296 A [0050] • US 4511069 A [0190] [0203]

•: WO 9111457 A [0052] • US 4652441 A [0201]

•: EP 0708179 A2 [0053] • US 4917893 A [0201]

•: EP 0699686 A2 [0054] • US 4677191 A [0201]

•: US 4839343 A [0059] • US 4728721 A [0201]

•: US 6190894 B [0108] • US 4675189 A [0201]

•: US 5908825 A [0116] • US 20030223939 A [0223]

•: US 6004583 A [0131] • US 20030215514 A [0223]

•: US 5681811 A [0156] [0157] • US 20030215512 A [0223]

•: US 3972995 A [0166] • US 20030209243 A [0223]

•: US 4259314 A [0166] • US 20030203036 A [0223]

•: US 4680323 A [0166] • US 20030198601 A [0223]

•: US 4740365 A [0166] • US 20030183228 A [0223]

•: US 4573996 A [0166] • US 200301885765 A [0223]

•: US 4292299 A [0166] • US 20030150454 A [0223]

•: US 4715369 A [0166] • US 20030124193 A [0223]

•: US 4876092 A [0166] • US 20030094173 A [0223]

•: US 4855142 A [0166] • US 20030072740 A [0230]

•: US 4250163 A [0166] • WO 60532337 A [0247]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

•: Eng, J. et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 20259-62 [0045]

•: Eng., J. et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 7402-05 [0045]

•: Goke et al. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, 19650-55 [0045]

•: Orskov et al. Diabetes, 1993, vol. 42, 658-61 [0045]

•: D’Alessio et al. J. Clin. Invest., 1996, vol. 97, 133-38 [0045]

•: Williams B et al. J Clin Encocrinol Metab, 1996, vol. 81 (1), 327-32 [0045]

•: Wettergren A et al. Dig Dis Sci, 1993, vol. 38 (4), 665-73 [0045]

•: Schjoldager B T et al. Dig Dis Sci, 1989, vol. 34 (5), 703-8 [0045]

•: O’Halloran D J et al. J Endocrinol, 1990, vol. 126 (1), 169-73 [0045]

•: Thorens. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1992, vol. 89, 8641-45 [0045]

•: Schmidt et al. Diabetologia, 1985, vol. 28, 704-707 [0047]

• Thorton et al. Biochemistry, 1994, vol. 33, 3532-3539 [0047] 5 • U.S Pharmacopeia National Formulary, 1990, 1857-1859 [0063]

•: Laursen et al. Eur. J. Endocrinology, 1996, vol. 135, 309-315 [0067]

•: Fasano et al. Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 1991, vol. 8, 5242-5246 [0116]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Formulación farmacéutica para liberación intranasal, que comprende: un péptido regulador de glucosa seleccionado entre un péptido de amilina,

pramlintida, un péptido GLP-1 o una extendina; agua; una ciclodextrina; y un fosfolípido.
2.

Formulación según la reivindicación 1, en la que dicha ciclodextrina se selecciona del grupo que consiste en hidroxipropil-β-ciclodextrano, sulfobutiléter-βciclodextrano, y metil-β-ciclodextrina.
3.

Formulación según la reivindicación 2, en la que dicha ciclodextrina es metil-β-ciclodextrina.
4.

Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la formulación comprende además un agente quelante; preferiblemente en la que dicho agente quelante es ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) o ácido etilenglicol tetraacético (EGTA).
5.

Formulación según la reivindicación 1, en la que el péptido regulador de glucosa se selecciona entre un péptido de amilina de SEC ID NO: 6-47, pramlintida, péptido-1 de tipo glucagón (GLP) o exendina-4.
6.

Formulación según la reivindicación 1, en la que el fosfolípido es L-αdidecanoil fosfatidilcolina (DDPC).
7.

Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la formulación tiene un pH de 3 a 6.
8.

Formulación según la reivindicación 1, que comprende además un hidrogel.
9.

Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la formulación está libre de un estabilizante que es un polipéptido o una proteína.
10.

Formulación según la reivindicación 1, en la que el péptido regulador de glucosa es exendina-4.
11.

Formulación según la reivindicación 1, en la que dicha formulación contiene:
12.

Formulación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste en obesidad, diabetes mellitus, supresión del apetito, inducción de

Reactivo

mg/mL %

Clorobutanol, anhidro

5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina

45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina

1 0,1

Edetato disódico

1 0,1

Citrato sódico, dihidrato

1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro

0,86 0,086

α-lactosa monohidrato

9 0,9

Sorbitol

18,2 1,82

Exendina-4

1 0,1

Agua purificada

Adición hasta un 100% de volumen

Formulación pH 4,5 ± 0,5 Osmolaridad ∼250

Reactivo

mg/mL %

Clorobutanol, anhidro

5,0 0,50

metil-β-ciclodextrina

45 4,5

L-α-didecanoil fosfatidilcolina

1 0,1

Edetato disódico

1 0,1

Citrato sódico, dihidrato

1,62 0,162

Ácido cítrico, anhidro

0,86 0,086

α-lactosa monohidrato

9 0,9

Sorbitol

18,2 1,82

Exendina-4

15 0,1

Agua purificada

Adición hasta un 100% de volumen

Formulación pH 5 ± 0,25

5 la pérdida de peso, disminución de la ingesta de alimentos, hiperglicemia, y dislipidemia.
13. Utilización de la formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste en obesidad, diabetes mellitus,

10 supresión del apetito, inducción de la pérdida de peso, disminución de la ingesta de alimentos, hiperglicemia, y dislipidemia.