CN103948544B - 重组Exendin-4鼻腔喷雾剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种重组Exendin-4鼻腔喷雾剂及其制备方法，每100ml制剂中含：10-100mg重组Exendin-4、1mg粘膜渗透强化剂、0.01mg防腐剂、加缓冲液至100？ml、所述的缓冲液组成为20mM？Tri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。血浆中重组Exendin-4浓度在给药后1小时内比肌肉注射高约20%，2-6小时内是注射的2-70倍，鼻喷雾剂的生物利用度达40%以上，鼻喷雾剂药效长。而且鼻喷雾剂给药血浆中Exendin-4浓度高峰比肌肉注射提前45分钟，说明使用粘膜渗透强化剂壳聚糖更利于重组Exendin-4进入血液。重组Exendin-4鼻喷剂生物利用度高，说明2-型糖尿病治疗除了肌肉注射外，可以利用更加简便有效的鼻腔喷雾的给药物方式；进入血液比注射快，使其作为药物使用时能快速有效降低糖尿病患者的餐后血糖含量。
Description
技术领域
本发明涉及重组Exendin-4鼻腔喷雾剂配方及使用方法。
背景技术
糖尿病是一种世界性疾病，全球患者达3.66亿，目前中国已超9200万，其中90%为2-型糖尿病。Exendin-4是从希腊毒蜥中分离一种含39氨基酸残基的多肽，与肠促胰岛素GLP-1有53%的同源性。它通过葡萄糖依赖的促胰岛素分泌、改善β-胰岛细胞质量、抑制胰高血糖素分泌、减缓胃排空等机制维持血糖浓度。2004年美国Amylin公司首先申请了化学合成Exendin-4的专利，商品名exenatide；其注射液于2005年在美国上市，2009年5月在我国上市，商品名百泌达。目前百泌达医生处方已超过740万张，它能有效降低2-型糖尿病患者空腹及餐后血糖浓度、糖化血红蛋白含量、改善脂代谢，同时减少低血糖发生及体重增加的风险，减少心血管病发生。作为一种治疗2-型糖尿的新药，Exendin-4将给使用口服降糖药不能取得良好效果的患者带来福音。
目前Exendin-4主要采用化学合成，市价高达7000元/mg。本实验室不仅选育了重组Exendin-4高产工程菌（发明专利：ZL200810049811.5），探索了重组Exendin-4中试技术，还优化了重组Exendin-4纯化工艺（ZL200810049810.0，ZL200910172667.9），使重组Exendin-4成本降至每毫克2.6元。目前临床上Exendin-4采用皮下注射给药，给病人带来了很多不便和痛苦，为了简化其给药方式，本实验室对重组Exendin-4的鼻腔给药途径进行了研究。
蛋白质及多肽药物鼻腔给药限制因素很多，首先是蛋白质及多肽在药剂体系中的稳定性，即在使用状态下蛋白质及多肽在一定的时间如10-15天内不降解；其次是蛋白质及多肽药物的生物利用度，鼻腔粘膜对进出膜的分子具有选择性，这些大分子不容易透过鼻腔粘膜；第三是给药的准确性及对鼻腔粘膜的安全性。由于上述因素的限制，目前鼻腔给药成功的蛋白质及多肽药物，全球只有一种，即鲑鱼降钙素（含32个氨基酸残基的多肽），有3家公司的鲑鱼降钙素鼻喷雾剂上市，生物利用度达50%。
鼻腔给药进入血液中的剂量因个体差异，没有注射的药物精确，但Exendin-4是依赖于血糖浓度起作用，进入药量不准确，如多一点不会出现低血糖情况，少一点可以加大剂量，非常安全。
发明内容
本发明的目的是提供重组Exendin-4鼻喷雾剂的配方及使用方法，用该配方能获得药物稳定性好、生物利用度高的重组Exendin-4鼻喷雾剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，每100ml制剂中含：
10-100mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂
0.01mg防腐剂
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
所述的粘膜渗透强化剂为壳聚糖。
所述的防腐剂为苯扎氯铵。
本发明的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至终质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10-50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.1-1mg/ml。
配好的重组Exendin-4鼻喷雾制剂置于4℃保存。
本发明的有益效果：含1%壳聚糖，鼻喷剂量是注射的5倍时，血浆中重组Exendin-4浓度在给药后1小时内比肌肉注射高约20%，2-6小时内是注射的2-70倍，鼻喷雾剂的生物利用度达40%以上，鼻喷雾剂药效长。而且鼻喷雾剂给药血浆中Exendin-4浓度高峰比肌肉注射提前45分钟，说明使用粘膜渗透强化剂壳聚糖更利于重组Exendin-4进入血液。重组Exendin-4鼻喷剂生物利用度高，说明2-型糖尿病治疗除了肌肉注射外，可以利用更加简便有效的鼻腔喷雾的给药物方式；进入血液比注射快，使其作为药物使用时能快速有效降低糖尿病患者的餐后血糖含量。
具体实施方式
实施例1用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物（如兔子，体重2Kg）实验，每100ml制剂中含：
10mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备制备方法，包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.1mg/ml。
实施例2用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物（如兔子，体重2Kg）实验，每100ml制剂中含：
20mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备制备方法，包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.2mg/ml。
实施例3用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物（如兔子，体重2Kg）实验，每100ml制剂中含：
30mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备制备方法，包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.3mg/ml。
实施例4用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床研究（60-80kg体重，每100ml制剂中含：
40mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备方法包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.4mg/ml。
（5）使用时采用在4℃保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100μl。
实施例5用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床研究（60-80kg体重，每100ml制剂中含：
60mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备方法包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.6mg/ml。
（5）使用时采用在4℃保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100μl。
实施例6用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床研究（60-80kg体重，每100ml制剂中含：
80mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备方法包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.8mg/ml。
（5）使用时采用在4℃保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100μl。
实施例7用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床研究（60-80kg体重，每100ml制剂中含：
40mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
其制备方法包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.4mg/ml。
（5）使用时采用在4℃保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100μl。
本发明重组Exendin-4鼻喷雾制剂的稳定性及生物利用度鉴定。
（1）稳定性鉴定：依据蛋白质鼻喷雾制剂的使用方法，一般保存在冰箱的4℃冷藏室。我们对pH5.0至7.0的一系列鼻喷雾制剂的稳定性进行了鉴定。每隔3天从不同pH值得鼻喷雾制剂取20μl样品，变性后，利用Ticin-SDS-PAGE鉴定重组Exendin-4的降解程度。发现pH6的鼻喷雾制剂稳定性最好，在4℃保存15天时，重组Exendin-4约为对照的60%（见图1）。而且每天喷26ug(200ul)，连续1个月对日本大耳白兔鼻喷实验结果表明，该鼻喷雾制剂对兔子鼻腔无刺激性，兔子生长正常。
（2）生物利用度测定：
本研究利用3月龄日本大耳白兔子进行了重组Exendin-4鼻喷雾制剂生物利用度测定。兔子皮下注射重组Exendin-4剂量为2.6μg/Kg，给药200μl。鼻喷重组Exendin-4剂量为13μg/Kg，每个鼻孔各喷100μl。耳缘静脉取血每次抽0.2ml，血样于4℃、3200rpm离心10min，上清于-80℃保存备用。利用Exendin-4EIA试剂盒（型号：s-1297，Bachem）及MultiskanGO型酶标仪测定血浆中重组Exendin-4浓度。利用Origin8.0软件来处理数据，利用SPSS18.0分析血浆中重组Exendin-4浓度，利用DAS2.0软件分析药代动力学特征。结果表明含1%壳聚糖的重组Exendin-4鼻喷雾制剂于给药后25min血浆Exendin-4中重组达到高峰，皮下注射于给药后1hr达到高峰；鼻腔给药比皮下注射药效快。其次，含1%壳聚糖的重组Exendin-4鼻喷雾制剂可以较长时间在血液中维持一定的浓度，生物利用度高达40%以上（见图2）。
本实验室在大量实验基础上确定了重组Exendin-4鼻喷雾剂缓冲成分、pH值、吸收促进剂，给药体积、给药剂量，与注射方法相比，重组Exendin-4鼻喷雾剂的生物利用度达40%以上，而且血浆中Exendin-4高峰比注射提前45分钟。
Claims (2)
1.一种重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，其特征在于每100ml制剂中含：
10-100mg重组Exendin-4
1mg粘膜渗透强化剂
0.01mg防腐剂
加缓冲液至100ml，
所述的缓冲液组成为20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80；
所述的粘膜渗透强化剂为壳聚糖；
所述的防腐剂为苯扎氯铵。
2.权利要求1所述的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）基本缓冲液配制：20mMTri-Cl，pH6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80，室温配制，灭菌后保存；
（2）将防腐剂加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01%；
（3）将粘膜渗透强化剂溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至终质量体积浓度1%；
（4）原药浓度：将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10-50mg/ml，然后用缓冲液定容，原药浓度为0.1-1mg/ml。
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