CN102309453A - 醋酸艾塞那肽多囊脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种醋酸艾塞那肽多囊脂质体。该制剂以醋酸艾塞那肽为有效成分,并由磷脂、中性类脂、乳化剂组成。其中醋酸艾塞那肽与磷脂质量比为1:0.5~100,与中性类脂质量比为1:0.05~10,与乳化剂质量比为1:0.05~10。本发明还公开了该醋酸艾塞那肽多囊脂质体的制备方法,利用本方法制备的醋酸艾塞那肽多囊脂质体可有效延长醋酸艾塞那肽半衰期,增加其缓释作用。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域,确切地说涉及一种醋酸艾塞那肽多囊脂质体及其制备方法。
背景技术
Exendin-4是一种含有39个氨基酸的人胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物,分子量为4186.6,其结构与GLP-1有53%的同源性,且其N-端不被二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)分解,因此血浆半衰期(t1/2)更长,稳定性更高,药效作用更好(Arulmozhia DK,Portha B.GLP-1 based therapy for type 2 diabetes.Eur J Pharm Sci,2006,28(1-2):96-108. Nielsen LL,Young AA,Parkes DG.Pharmacology of exenatide(synthetic exendin-4):a potential therapeutic for improved glycemic control of type 2 diabetes.Regul Pept,2004,117(2):77-88.Iltz JL,Baker DE,Setter SM,etal.Exenatide:an incretin mimetic for the treatment of type 2 diabetes mellitus.Clin Ther,2006,28(5):652-665)。研究表明,Exendin-4具有促进胰岛素分泌,延迟胃排空、降低食欲,减少食物摄取,保护β细胞并刺激其增生等作用(Lovshin JA,Drucker DJ.Incretin-based therapies for type 2 dia-betes mellitus.Nat Rev Endocrinol,2009,5(5):262-269.)。美国Eli Lilly公司和Amylin Pharmaceuticals公司在体外大量合成了Exendin-4,并将其命名为Exenatide(醋酸艾塞那肽)。2005年4月,美国食品药品管理局批准Exenatide(Byetta@)在美国上市,用于使用二甲双胍、磺脲类药物不能理想控制血糖的Ⅱ型糖尿病患者的治疗(Kendall DM,Cuddihy RM,Bergenstal RM.Clinical application of incretin-based therapy:therapeutic potential,patient selection and clinical use.Am J Med,2009,122(6):S37-S50)。但其需要每天皮下注射两次,给病人带来较大痛苦。因此,研制醋酸艾塞那肽的缓释给药系统具有显著的社会意义和经济价值。
近年来,多囊脂质体(Multivesicular Liposomes, MVLs)因其独特的结构而被广泛用于各种药物传递系统中。MVLs是采用贮库泡沫技术(Depofoam technology, Depo FoamTM)于1983年研制(英国Skyepharma PLC 公司)成功的一种新型脂质体,主要用于运载亲水性药物(KIM S, TURKER MS, CHI EY, et al. Preparation of multivesicular liposomes [J]. Biochim Biophys Acta, 1983, 728 (3) : 339-348; SANJAY KJ, RAJESH KJ, MANISH K, et al. Design and development of multivesicular liposomal depot delivery system for controlled systemic delivery of acyclovir sodium [J]. AAPS Pharmscitech, 2005, 6(1): E35-E41; ZHONG HJ, DENG YJ, WANG XM, et al. Multivesicular liposome formulation for the sustained delivery of breviscapine [J]. Int J Pharm, 2005, 301(1-2): 15-24; DAI CY, WANG BC, ZHAO HW, et al. Preparation and characterization of liposomes-in-alginate(LIA) for protein delivery system[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2006, 47(2): 205-210 )。注射后,作为药物贮库随时间释放被包封的药物(KIM S. DepoFoam-mediated drug delivery into cerebrospinal fluid [J]. Methods Neurosci, 1994, 21(18): 118-131.)。多囊脂质体注射途径广泛,可用于敏感部位的注射如眼部,硬膜外或关节腔等,人体研究表明安全性较高。另外,DepoFoam技术经证明可用于工业化大生产(PEPPER CP, HARTOUNIAN M. cGMP manufacturing scale-up of a multivesicular lipid based drug delivery system [J]. Pharm Eng, 1999, 19(2): 8-18.)。经研究报道,多囊脂质体不同于传统脂质体的同心囊结构,而具有不连续的药物溶液囊泡,这些囊泡被连续的非同心类脂双分子磷脂膜所分隔,具有更多的包封容积和较大粒径,特别是当某个囊泡破裂时,活性物质从破裂的囊泡释出,而完整的囊泡仍然可以保持原状,因此具有很好的缓释效果(KATRE NV, ASHERMAN J, SCHAEFER H, et al. Multivesicular liposome (DepoFoam) technology for the sustained deliver of insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ) [J]. J Pharm Sci, 1998, 87(11): 1341-1346.)。更有研究证明,多囊脂质体通过调节脂质和水相的比例,选择不同中性油脂的链长,调节内水相渗透压等,经非静脉注射后,缓释效果可达到几天甚至几周。(SANKARAM M. A lipid based depot (DepoFoam technology) for sustained release drug delivery [J]. Prog Lipid Res, 2002, 41 (5): 392-406.)而以多囊脂质体作为药物载体并不会引起药物生物活性的降低及改变。
现有技术中对于采用多囊脂质体作为药物的缓释载体已有报道,例如:感觉神经肽P物质制成多囊脂质体(郭文治. P物质多囊脂质体的制备工艺优化及相关性质考察[ J ] 中国药房, 2009, 10 (20) : 767-769);酪丝亮肽制成多囊脂质体(陶 斐. 酪丝亮肽多囊脂质体的制备和体外释放研究[ J ] 中国新药杂志, 2008, 3(17) : 228-232);胸腺五肽缓释制成的多囊脂质体(焦玉焕. 胸腺五肽缓释多囊脂质体的制备及大鼠药物代谢动力学的初步研究 [ J ] 药学学报, 2008, 43(7) : 756-760)。
本发明创造性地将醋酸艾塞那肽制备成多囊脂质体以提高它的缓释效果。经文献检索,目前尚未见有关通过制备醋酸艾塞那肽多囊脂质体以提高其缓释效果的报道。
发明内容
现有技术中虽然已经报导了肽类可制成多囊脂质体以获得显著的缓释特性,但是不同的肽类是否能制成多囊脂质体是难以预料的,并且获得多囊脂质体的处方也需要创造性的劳动。
针对醋酸艾塞那肽半衰期短,本发明提供一种醋酸艾塞那肽多囊脂质体及其制备方法,以延长其半衰期,提高缓释效果。
本发明的醋酸艾塞那肽多囊脂质体,所述磷脂包括大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂或合成磷脂,平均分子量为700~800,优选平均分子量为750的大豆卵磷脂。
其中,醋酸艾塞那肽与磷脂的质量比为1:0.5~100,优选的质量比为1:0.5~10。
本发明的醋酸艾塞那肽多囊脂质体,所述中性类脂包括三油酸甘油酯等中性类脂。
其中,醋酸艾塞那肽与中性类脂的质量比为1:0.05~10,优选的质量比为1:0.05~1。
本发明的醋酸艾塞那肽多囊脂质体,所述乳化剂包括吐温-80、普朗尼克F68、聚氧乙烯蓖麻油、卖泽-52、卖泽-53、卖泽-59、Solutol HS15及含有上述乳化剂的各种比例的混合乳化剂,优选卖泽-52:Solutol HS15 = 2:3的混合乳化剂。
其中,醋酸艾塞那肽与乳化剂的质量比为1:0.05~10,优选的质量比为1:0.05~1。
本发明进一步提供了一种制备醋酸艾塞那肽多囊脂质体的方法,包括以下步骤:
(1)将用于形成脂质体的脂类物质和中性油脂溶于有机溶剂形成油相;
(2)将醋酸艾塞那肽溶于水中形成内水相;
(3)将油相和内水相混合并乳化形成初乳;
(4)将初乳与适当的水溶液混合并乳化形成复乳;
(5)将复乳中的溶媒除去形成醋酸艾塞那肽多囊脂质体。
其中,步骤(1)所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙醚及含有上述溶剂的各种比例的混合溶剂;优选二氯甲烷:乙醚=1:1的混合溶剂。
其中,步骤(3)所述的初乳中油相和内水相的体积比大于1;步骤(4)中所述复乳中初乳与外水相的体积比小于1。初乳中油相和内水相的优选体积比为1:0.8;复乳中初乳与外水相的优选体积比为1:2.5。
其中,步骤(3)和步骤(4)所述的乳化方法包括搅拌、漩涡振荡、剪切、乳匀、高压乳匀、超声的机械操作及上述操作分别结合的混合操作。步骤(3)优选剪切;步骤(4)优选漩涡振荡。
其中,步骤(2)和步骤(4)所述的水溶液中的渗透调节剂选自蔗糖、葡萄糖及二者各种比例的混合物,渗透调节剂与脂类物质的质量比大于1。步骤(2)优选蔗糖,其与脂类物质的质量比为1:1~3;步骤(4)优选葡萄糖,其与脂类物质的质量比为1:0.2~2。
其中,步骤(5)所述去除溶媒的方法包括搅拌挥发、氮气吹除、旋转蒸发法,优旋转蒸发法。
本发明以多囊脂质体为醋酸艾塞那肽药物载体。多囊脂质体脂粒具有不连续的囊泡,粒径大小一般在1~100μm之间,每个囊泡内部含有相连的水腔,腔外由脂薄膜包裹形成一个内部水腔远大于脂腔的体积,其体积比甚至可以达到95:5,因此特别适合于包封水溶性的蛋白质多肽类药物。同时,由于它水腔体积较传统脂质体大,所以包封水溶性药物时对其包封率有显著性提高。
同时,由于多囊脂质体的独特的非同心囊泡结构,其中一个囊泡的破裂并不影响整个囊泡的完整性,因此制剂具有良好的稳定性,表现出药物的释放具有很好的缓释效果,提高了患者的顺应性。
本发明制备的醋酸艾塞那肽多囊脂质体,其粒径范围在1~50μm,平均粒径在1~15μm,能够用于非静脉给药,如皮下、肌内、关节内、硬膜内、眼内等途径注射给药。其制备方法具有操作简单易行,辅料易得的特点。同时,醋酸艾塞那肽多囊脂质体单位体积中的醋酸艾塞那肽含量高,说明本发明的配方和工艺既能达到较高的包封率,又有稳定的载药量。实验证明醋酸艾塞那肽在多囊脂质体中的包封率能达到60%~100%,最佳为80%~100%。药物在多囊脂质体中能持续释放,体外释放实验表明其具有明显的缓释效果,延长了药物在血液中的循环时间。
以下通过实施例的具体实施方式,对本发明的上述内容再作出进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
将本发明实施例醋酸艾塞那肽多囊脂质体(实施例1,2和3)混悬液滴在载玻片上,于光学显微镜下观察并照相(×400),结果见图1。
实验结果表明通过实施例1,2,3的方法,可成功制得大小较均匀,外观较圆整,大脂质体内部含有较多紧实小囊泡的载药多囊脂质体。
将本发明制备的醋酸艾塞那肽多囊脂质体的进行体外释放实验,方法详见实施例5,释放曲线结果见图2。
实验结果表明制备的醋酸艾塞那肽多囊脂质体具有明显的缓释作用,132 h上的累积释放率达到91.53%。将释放数据用不同的释放模型进行拟合,最终确定其最佳拟合模型为零级释放模型,方程为Y=0.4978t+21.226,(r2=0.9769)。
具体实施方式
实施例1
精确称取大豆磷脂40mg、胆固醇20mg、大豆油5mg于5 mlEP管中,加入0.5 ml氯仿:乙醚=1:1的混合有机溶剂使其完全溶解,形成油相;滴加溶有5mg醋酸艾塞那肽的含50 mmol.L-1精氨酸的5%蔗糖溶液(内水相),用Fluka液体乳化机内部剪切形成初乳;后取0.4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol.L-1赖氨酸的3.4%葡萄糖溶液(外水相)中,漩涡振荡10s形成复乳。将复乳转移至圆底烧瓶中,旋转蒸发除去有机溶剂,即得醋酸艾塞那肽多囊脂质体混悬液。
实施例2
精确称取蛋黄卵磷脂40mg、胆固醇20mg、大豆油5mg于5 mlEP管中,加入0.5 ml氯仿:乙醚=1:1的混合有机溶剂使其完全溶解,形成油相;滴加溶有10mg醋酸艾塞那肽的含50 mmol.L-1精氨酸的5%蔗糖溶液(内水相),用Fluka液体乳化机内部剪切形成初乳;后取0.4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol.L-1赖氨酸的3.4%葡萄糖溶液(外水相)中,漩涡振荡10s形成复乳。将复乳转移至圆底烧瓶中,旋转蒸发除去有机溶剂,即得醋酸艾塞那肽多囊脂质体混悬液。
实施例3
精确称取大豆磷脂40mg、胆固醇20mg、三油酸甘油酯8mg于5 mlEP管中,加入0.5 ml氯仿:乙醚=1:1的混合有机溶剂使其完全溶解,形成油相;滴加溶有20mg醋酸艾塞那肽的含50 mmol.L-1精氨酸的5%蔗糖溶液(内水相),用Fluka液体乳化机内部剪切形成初乳;后取0.4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol.L-1赖氨酸的3.4%葡萄糖溶液(外水相)中,漩涡振荡10s形成复乳。将复乳转移至圆底烧瓶中,旋转蒸发除去有机溶剂,即得醋酸艾塞那肽多囊脂质体混悬液。
实施例4
测定包封率
运用生化方法测定样品含量。精密吸取0.25ml载药多囊脂质体混悬液于EP管中,加入两倍量生理盐水稀释后,于2500 r.min-1离心10min,取上清液进行生化测定其含量。生化测定步骤如下,每孔加入50ul标准肽液、阳性对照品或样品,和25ul一抗,4℃过夜培养16-24h,加25ul生物素标记多肽室温(20-23℃)孵育1.5h,加入350ul×缓冲液,洗板4次,加入100ulSA-HRP溶液,室温(20-23℃)孵育1h,每孔加入350ul×缓冲液,洗板4次,每孔加入100ul底物液,室温(20-23℃)孵育15-20min,加入100ul终止液测RFU吸收值,计算结果。载药多囊脂质体包封率计算公式为:En (%) = (Dtot -Dfree)/Dtot× 100
[0034]
实施例5
体外释放实验
以0.1mol·L-1PBS(pH7.4)为释放介质进行醋酸艾塞那肽多囊脂质体的体外释放实验。将3批制备好的醋酸艾塞那肽多囊脂质体分别用该PBS稀释4倍后,分装在EP管中,每管0.5 ml,放置于恒温摇床中,温度37℃±0.5℃,转速30r.min-1,于0、2、6、12、24、36、60、84、108、132 h定时取样。样品2500r.min-1离心10min,取上清液供HPLC分析。
Claims (10)
1.一种醋酸艾塞那肽多囊脂质体,其特征在于由醋酸艾塞那肽、磷脂、中性类脂和非离子型表面活性剂制成。
2.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体中,其中磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂或合成磷脂中的至少一种,平均分子量为700~800。
3.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体,其特征是,醋酸艾塞那肽与磷脂的质量比为1:0.5~100。
4.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体中的中性类脂包括大豆油,不饱和脂肪酸构成的甘油三酸酯。
5.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体,其特征是,醋酸艾塞那肽与中性类脂的质量比为1:0.05~10。
6.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体中的乳化剂包括吐温-80、普朗尼克F68、聚氧乙烯蓖麻油、卖泽-52、卖泽-53、卖泽-59、Solutol HS15及含有上述乳化剂的各种比例的混合乳化剂。
7.如权利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体,其特征是,醋酸艾塞那肽与乳化剂的质量比为1:0.05~10。
8.如权利要求1~7所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体的制备方法,包括下述顺序的步骤:(1)将用于形成脂质体的脂类物质和中性油脂溶于有机溶剂形成油相;(2)将醋酸艾塞那肽溶于水中形成内水相;(3)将油相和内水相混合并乳化形成初乳;(4)将初乳与适当的水溶液混合并乳化形成复乳;(5)将复乳中的溶媒除去形成醋酸艾塞那肽多囊脂质体。
9.如权利要求8所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体的制备方法,其特征是,步骤(1)所述有机溶剂指氯仿、二氯甲烷、乙醚及含有上述溶剂的各种比例的混合溶剂。
10.如权利要求8所述醋酸艾塞那肽多囊脂质体的制备方法,其特征是,步骤(3)和步骤(4)所述的乳化方法包括搅拌、振荡、剪切、乳匀、高压乳匀、超声的机械操作及上述操作分别结合的混合操作。
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