ES2327253T3 - Derivados de propenil piperazina sustituidos como nuevos inhibidores de histona deacetilasa. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I), ** ver fórmula** las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y su forma estereoquímicamente isomérica, en el que cada X es independientemente N o CH; R 1 es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; en el que cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre halo, alquilo C 1-6, alquil C 1-6-oxi, polihaloalquilo C 1-6, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil C 1-6-carbonilamino, alquil C 1-6-sulfonilamino, hidroxicarbonilo, alquil C 1-6-oxicarbonilo, hidroxialquil C1-6, alquil C1-6-oximetilo, aminometilo, alquil C1-6-aminometilo, alquil C1-6-carbonilaminometilo, alquil C1-6-sulfonilaminometilo, aminosulfonilo, alquil C1-6-aminosulfonilo o heterociclilo; R 2 es hidrógeno, -CH 2-R 5 , trifluorometilo, -C(=O)-R 6 , o -CH 2-NR 7 R 8 ; en el que cada R 5 se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil C1-6-oxi, alquil C1-6-oxi-alquil C1-6oxi, alquil C1-6-carboniloxi, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo; cada R 6 se selecciona independientemente entre hidroxi, alquil C 1-6-oxi, amino o mono- o di-(alquil C 1-6) amino, cicloalquil C 1-6-amino, hidroxialquil C 1-6-amino, piperazinilo, mono- o di-(alquil C 1-6) amino-alquil C 1-6-amino Nmetilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo; cada R 7 y R 8 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquil C1-6-carbonilo, alquil C1-6sulfonilo, o mono- o di-(alquil C 1-4)-aminosulfonilo; R 3 es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo o mono- o di-(alquil C1-6) aminometilo; R 4 es hidrógeno o alquilo C1-6; arilo en lo anterior es fenilo o naftalenilo; en el que cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre halo, alquilo C 1-6, alquil C 1-6-oxi, trifluorometilo, ciano o hidroxicarbonilo; y heterociclilo es furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo, tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo, purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftlazinilo, quinazolinilo, quinaxolinilo o naftiridinilo; en el que cada uno de dichos heterociclos está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre halo, alquilo C 1-6, alquil C 1-6-oxi, ciano, amino, o mono- o di-(alquil C 1-4)-amino.
Description
Derivados de propenil piperazina sustituidos
como nuevos inhibidores de histona deacetilasa.
Esta invención se refiere a compuestos que
tienen actividad enzimática inhibidora de histona desacetilasa
(HDAC). También está relacionada con procesos para su preparación,
con las composiciones que los comprenden, así como su uso, tanto
in vitro como in vivo, para inhibir HDAC y como una
medicina, por ejemplo, como una medicina para inhibir afecciones
proliferativas, tales como el cáncer y la psoriasis.
Se sabe que las histonas nucleares son
componentes integrales y dinámicos de la maquinaria responsable de
regular la transcripción de genes y otros procesos del ADN plantilla
tal como la replicación, reparación, recombinación y segregación de
los cromosomas. Son objeto de modificaciones
post-translación, incluyendo a la acetilación,
fosforilación, metilación, ubiquitinación y
ADP-ribosilación.
La(s) histona(s)
desacetilasa(s), denominada(s) en este documento
"HDAC", son enzimas que catalizan la eliminación de la
modificación de acetilo en residuos de lisina de proteínas,
incluyendo las histonas nucleosómicas nucleares H2A, H2B, H3 y H4.
Junto con la(s) histona(s)
acetiltransferasa(s), llamadas en este documento "HAT",
las HDAC regulan el nivel de acetilación de las histonas. El
equilibrio de acetilación de las histonas nucleosómicas desempeña
un papel importante en la transcripción de muchos genes. La
hipoacetilación de histonas tiene que ver con la estructura de
cromatina condensada que causa la represión de la transcripción de
los genes, mientras que las histonas acetiladas tienen que ver con
una estructura de cromatina más abierta y la activación de la
transcripción.
Se han descrito once HDAC estructuralmente
relacionadas y se dividen en dos clases. Las HDAC clase I consisten
en HDAC 1, 2, 3, 8 y 11 mientras que las HDAC clase II consisten en
HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Los miembros de una tercera clase de HDAC
no están estructuralmente relacionados con las HDAC clase I y clase
II. Las HDAC clase I/II funcionan por mecanismos dependientes del
cinc, mientras que la HDAC clase III depende del
NAD.
NAD.
Además de las histonas, también han sido
sustrato para la acetilación otras proteínas, en factores de
transcripción particulares tales como p53, GATA-1 y
E2F; receptores nucleares tales como el receptor de
glucocorticoides, los receptores de tiroides, los receptores de
estrógenos; y proteínas reguladoras del ciclo celular tales como
las pRb. La acetilación de proteínas se ha relacionado con la
estabilización de proteínas, tal como la estabilización de p53, el
reclutamiento de cofactores y la mayor unión del ADN. p53 es un
supresor tumoral que puede inducir a la detención del ciclo celular
o a la apoptosis como respuesta a una variedad de señales de
estrés, tal como el daño al ADN. El objetivo principal para la
detención de ciclo celular inducida por p53 parece ser el gen p21.
Junto con su activación por p53, se ha identificado que p21, en
virtud de su asociación con complejos de quinasa dependientes de
ciclina/ciclina que causan la detención del ciclo celular tanto como
en fases G1 como G2, su regulación durante la senectud, y su
interacción con el antígeno nuclear celular proliferante.
El estudio de inhibidores de las HDAC indica que
desempeñan un papel importante en la detención del ciclo celular,
la diferenciación celular, la apoptosis y la inversión de fenotipos
transformados.
El inhibidor de tricostatina A (TSA), por
ejemplo, causa la detención del ciclo celular tanto en la fase G1
como en la G2, devuelve el fenotipo transformado de diferentes
líneas celulares, e induce la diferenciación de células de leucemia
Friend y otras. Se ha descubierto que la TSA (y el ácido hidroxámico
suberoilanilida, SAHA) inhibe el crecimiento celular, induce la
diferenciación terminal, y previene la formación de tumores en
ratones (Finnin et al., Nature, 401:
188-193, 1999).
También se ha descubierto que la Tricostatina A
es útil en el tratamiento de la fibrosis, p.ej la fibrosis hepática
y cirrosis hepática. (Geerts et al., solicitud de patente
europea EP 0 827742, publicada el 11 de marzo de 1998).
El farmacóforo para los inhibidores de HDAC
consiste en un dominio de unión metálico, que se relaciona con el
sitio activo que contiene cinc de las HDAC, un dominio enlazante, y
un dominio de reconocimiento superficial o región cubierta, que
está interacciona con residuos en el borde del sitio activo.
También se ha descubierto que los inhibidores de
las HDAC inducen la expresión de los genes p21. La activación
transcripcional del gen p21 por estos inhibidores está promovida por
la remodelación de la cromatina, siguiendo la acetilación de las
histonas H3 y H4 en la región promotora de p21. Esta activación de
p21 ocurre de una manera independiente de p53 y así los inhibidores
de HDAC están operativos en células con genes de p53 transformados,
el sello de numerosos tumores.
Además, los inhibidores de HDAC pueden tener
actividades indirectas tales como el aumento de las respuestas
inmunes del huésped y la inhibición de la angiogenesis tumoral y así
pueden suprimir el crecimiento de tumores primarios e impedir la
metástasis (Mai et al., Medicinal Research Reviews,
25: 261-309).
En vista de lo anterior, los inhibidores de HDAC
pueden tener un gran potencial en el tratamiento de enfermedades o
afecciones de células proliferativas, incluyendo los tumores con
genes p53 mutados.
La solicitud de patente EP1472216 publicada el
14 de agosto de 2003 describe hidroxamatos bicíclicos como
inhibidores de histona desacetilasa.
Las solicitudes de patente EP1485099, EP1485348,
EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365,
EP1485370, EP1485378 publicadas el 18 de Sep., 2003, entre otras, describen ácidos piperazinil-pirimidinil-hidroxámicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa; además el documento EP1485365 describe a R306465.
EP1485370, EP1485378 publicadas el 18 de Sep., 2003, entre otras, describen ácidos piperazinil-pirimidinil-hidroxámicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa; además el documento EP1485365 describe a R306465.
La solicitud de patente EP1492534, publicada el
9 de octubre de 2003, describe compuestos de ácido carbámico que
comprenden un enlace de piperazina, como inhibidores de HDAC.
La solicitud de patente EP1495002, publicada el
23 de octubre de 2003, describe compuestos de
piperazinil-fenil-benzamida
sustituidos, como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/009536, publicada
el 29 de enero de 2004, describe derivados que contienen un
enlazante de alquilo entre el grupo arilo y el hidroxamato, como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1525199, publicada el
12 de febrero de 2004, describe hidroxamatos bicíclicos sustituidos
con (hetero)arilalquenilo, como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/063146, publicada
el 29 de julio de 2004, describe derivados de derivados de
N-hidroxi-benzamida con actividad
anti-inflamatoria y antitumoral.
La solicitud de patente WO04/063169, publicada
el 29 de julio de 2004, describe derivados de hidroxamato de arilo
sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/072047, publicada
el 26 de agosto de 2004, describe índoles, bencimidazoles y
naftimidazoles como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/082638, publicada
el 30 Sep. de 2004, describe hidroxamatos unidos a sistemas de
anillo heterocíclicos no aromáticos como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/092115, publicada
el 28 de octubre de 2004, describe derivados de hidroxamato como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/028447, publicada
el 31 de marzo de 2005, describe benzimidazoles como inhibidores de
histona desacetilasa.
Las solicitudes de patente WO05/030704 y
WO05/030705, publicadas el 7 de abril de 2005, describen benzamidas
como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/040101, publicada
el 6 de mayo de 2005, describe hidroxamatos conectados de acilurea
y conectados de sulfonilurea como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/040161, también
publicada el 6 de mayo de 2005, describe hidroxamatos unidos a
biarilo como inhibidores de histona desacetilasa.
Los compuestos de la presente invención se
diferencian de la técnica anterior en su estructura, en su actividad
farmacológica y/o su potencia farmacológica.
El problema que se soluciona es proporcionar
inhibidores de histona desacetilasa con alta actividad enzimática y
celular que tienen mayor biodisponibilidad y/o potencia in
vivo.
Los nuevos compuestos de la presente invención
solucionan el anterior problema descrito. Los compuestos de la
presente invención muestran una excelente actividad enzimática y
celular inhibiendo a la histona desacetilasa. Tienen una alta
capacidad para activar el gen p21, tanto a nivel celular como in
vivo. Tienen un perfil farmacocinético deseable y una baja
afinidad para las enzimas P450, lo que reduce el riesgo de la
interacción adversa fármaco-fármaco lo que permite
también un margen de seguridad más amplio.
Las ventajosas características de los presentes
compuestos son la estabilidad metabólica, la solubilidad y/o la
capacidad de inducción de p21. Más en particular, los compuestos de
la presente invención tienen mayores semividas en hepatocitos de
rata, tienen una mayor solubilidad/estabilidad en soluciones acuosas
y/o tienen mayores capacidades inductoras del promotor p21 in
vivo.
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Esta invención se refiere a compuestos de
fórmula (I):
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las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas
estereoquímicas, en las
que
cada X es independientemente N o CH;
R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo;
en el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6}, arilo,
hidroxi, ciano, amino, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-sulfonilamino,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxialquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oximetilo, aminometilo,
alquil C_{1-6}-aminometilo,
alquil
C_{1-6}-carbonilaminometilo,
alquil
C_{1-6}-sulfonilaminometilo,
aminosulfonilo, alquil
C_{1-6}-aminosulfonilo o
heterociclilo;
R^{2} es hidrógeno,
-CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo,
-C(=O)-R^{6}, o
-CH_{2}-NR^{7}R^{8}; en el que
cada R^{5} se selecciona independientemente
entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi, piperazinilo,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,
imidazolilo o triazolilo; cada R^{6} se selecciona
independientemente entre hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, amino o mono- o
di-(alquil C_{1-6})amino, cicloalquil
C_{1-6}-amino, hidroxialquil
C_{1-6}-amino, piperazinilo,
mono- o di-(alquil
C_{1-6})-aminoalquil
C_{1-6}-amino,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo;
cada R^{7} y R^{8} se seleccionan independientemente entre
hidrógeno, alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-carbonilo, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-4})-aminosulfonilo;
R^{3} es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo
o mono- o di-(alquil
C_{1-6})aminometilo;
R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6};
arilo en lo anterior es fenilo o naftalenilo; en
el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
ciano o hidroxicarbonilo;
y
y
heterociclilo en lo anterior es furanilo,
tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo,
tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo,
pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo,
oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo,
piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo,
piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo,
tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo,
benzotiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo,
purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftlazinilo,
quinazolinilo, quinoxalinilo o naftiridinilo; en el que
cada uno de dichos heterociclos está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, ciano, amino, mono- o
di-(alquil C_{1-4})-amino.
La expresión "inhibidor de histona
desacetilasa" se usa para identificar un compuesto que es capaz
de interaccionar con una histona desacetilasa e inhibir su
actividad, más particularmente, su actividad enzimática. La
inhibición de la actividad enzimática de la histona desacetilasa
significa reducir la capacidad de una histona desacetilasa de
quitar un grupo acetilo de una histona. Preferentemente, tal
inhibición es específica, es decir el inhibidor de histona
desacetilasa reduce la capacidad de una histona desacetilasa de
quitar un grupo acetilo de una histona a una concentración que es
inferior que la concentración del inhibidor que se requiere para
producir algún otro efecto biológico no
relacionado.
relacionado.
Según se usa en las definiciones anteriores y
posteriores, halo significa fluoro, cloro, bromo y yodo; alquilo
C_{1-4} define radicales hidrocarburo de cadena
lineal y ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono tales
como, p.ej metilo, etilo, propilo, butilo,
1-metiletilo, 2-metilpropilo y otros
similares; alquilo C_{1-6} incluye alquilo
C_{1-4} y sus homólogos superiores que tienen
entre 5 y 6 átomos de carbono tales como, por ejemplo, pentilo,
2-metil-butilo, hexilo,
2-metilpentilo y otros similares;
polihalo-alquilo C_{1-6} define
un alquilo C_{1-6} que contiene tres sustituyentes
halo idénticos o diferentes por ejemplo trifluorometilo; y
cicloalquilo C_{3-6} incluye grupos hidrocarburo
cíclicos que tienen entre 3 y 6 carbones, tales como ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo y
otros
similares.
similares.
Las sales de adición farmacéuticamente
aceptables abarcan sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables y sales de adición de base farmacéuticamente aceptables.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, como se
menciona más arriba, se supone que comprenden las formas de la sal
de adición de ácido no tóxicas terapéuticamente activas que los
compuestos de fórmula (I) son capaces de formar. Los compuestos de
fórmula (I) que tienen propiedades básicas pueden ser convertidos
en sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables
tratando dicha forma básica con un ácido apropiado. Los ácidos
apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como
los ácidos hidrohálicos, p.ej ácido clorhídrico o bromhídrico;
sulfúrico; nítrico; fosfórico y otros ácidos similares; o ácidos
orgánicos tales como, por ejemplo, acético trifluoroacético,
propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico,
succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico,
málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico,
bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico,
salicílico, p-amino-salicílico,
pamoico y otros ácidos similares.
Los compuestos de fórmula (I) que tienen
propiedades ácidas pueden ser convertidos en sus sales de adición
de base farmacéuticamente aceptables tratando dicha forma ácida con
una base orgánica o inorgánica adecuado. Las formas de sal básica
apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, sales
metálicas alcalinas y alcalino-térreas, p.ej sales
de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y otras similares, sales
con bases orgánicas, p.ej benzatina,
N-metil-D-glucamina,
sales de hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por
ejemplo, arginina, lisina y otras similares.
La expresión "sales de adición de ácido o
base" también comprende los hidratos y las formas de adición de
disolvente, que los compuestos de fórmula (I) son capaces de formar.
Los ejemplos de tales formas son p.ej hidratos, alcoholatos y otros
similares.
La expresión "formas estereoquímicamente
isoméricas de los compuestos de fórmula (I)", según se usa en
este documento, define a todos los compuestos posibles combinados
de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero
que tienen estructuras tridimensionales diferentes, que no son
intercambiables, que los compuestos de la fórmula (I) pueden
poseer. A menos que se mencione o indique de otra manera, la
designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las
formas estereoquímicamente isoméricas posibles, que dicho compuesto
puede poseer. Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros
y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho
compuesto. Todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los
compuestos de fórmula (I), tanto en la forma pura como en mezcla,
se requieren que estén dentro del ámbito de la presente
invención.
Las formas de N-óxido de los compuestos de
fórmula (I) se supone que comprenden a aquellos compuestos de
fórmula (I) en los que uno o varios átomos de nitrógeno son
oxidados al llamado N-óxido, en particular aquellos N-óxidos en los
que uno o varios de los nitrógenos de piperidina, piperazina o
piridazinilo están N-oxididados.
Algunos compuestos de la fórmula (I) pueden
existir también en sus formas tautoméricas. Tales formas, aunque no
se indique explícitamente en la fórmula anterior, se requieren que
estén incluidas dentro del ámbito de la presente invención.
Siempre que se use en este documento, la
expresión "compuestos de fórmula (I)" se supone que incluyen
también las sales de adición farmacéuticamente aceptables y todas
las formas estereoisoméricas.
Según se usa en este documento, la expresión
"histona desacetilasa" y el término "HDAC" se refieren a
cualquiera de una familia de enzimas que eliminan los grupos
acetilo de los grupos \varepsilon-amino de
residuos lisina en el extremo N-terminal de una
histona. A menos que se indique de otra forma por el contexto, el
término "histona" se supone que se refiere a cualquier
proteína histona, incluyendo H1, H2A, H2B, H3, H4 y H5, de
cualquier especie. Las proteínas HDAC humanas o los productos
génicos, incluyen, pero sin limitación, a HDAC-1,
HDAC-2, HDAC-3,
HDAC-4, HDAC-5,
HDAC-6, HDAC-7,
HDAC-8, HDAC-9,
HDAC-10 y HDAC-11. La histona
desacetilasa también puede ser derivada a partir de una fuente
protozoaria o fúngica.
Un primer grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que se aplican
una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- R^{1} es fenilo o naftalenilo; en el que
- \quad
- cada dicho fenilo o naftalenilo es sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre alquil C_{1-6}-sulfonilamino, hidroxicarbonilo, alquil C_{1-6}-oximetilo, alquil C_{1-6}-aminometilo, alquil C_{1-6}-carbonilaminometilo, alquil C_{1-6}-sulfonilaminometilo, aminosulfonilo o alquil C_{1-6}-aminosulfonilo; o
- b)
- R^{2} es -CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo, -C(=O)-R^{6}, o -CH_{2}-NR^{7}R^{8};
- c)
- R^{4} es alquilo C_{1-6}.
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Un segundo grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que se aplican
una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; en el que cada dicho fenilo es sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre arilo, hidroxi, amino, alquil C_{1-6}-carbonilamino, alquil C_{1-6}-sulfonilamino, alquil C_{1-6}-oxicarbonilo, hidroxialquilo C_{1-6}, alquil C_{1-6}-oximetilo, aminometilo, alquil C_{1-6}-aminometilo, alquil C_{1-6}-carbonilaminometilo, alquil C_{1-6}-sulfonilaminometilo, aminosulfonilo, alquil C_{1-6}-aminosulfonilo o heterociclilo; o
- b)
- R^{2} es -CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo, -C(=O)-R^{6}, o -CH_{2}-NR^{7}R^{8};
- c)
- R^{4} es alquilo C_{1-6}.
\vskip1.000000\baselineskip
Un tercer grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que se aplican
una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; en el que cada dicho fenilo o naftalenilo son sustituidos con uno o dos sustituyentes cada uno independientemente seleccionado entre alquil C_{1-6}-sulfonilamino, alquil C_{1-6}-oximetilo, aminometilo, alquil C_{1-6}-aminometilo, alquil C_{1-6}-carbonilaminometilo, alquil C_{1-6}-sulfonilaminometilo, aminosulfonilo o alquil C_{1-6}-aminosulfonilo; o
- b)
- R^{2} es -CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo, -C(=O)-R^{6}, o -CH_{2}-NR^{7}R^{8};
- c)
- R^{4} es alquilo C_{1-6}.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cuarto grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de la fórmula (I) en el que se
aplican una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- cada R^{5} se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo;
- b)
- cada R^{6} se selecciona independientemente entre hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi, amino o mono- o di-(alquil C_{1-6})-amino, cicloalquil C_{1-6}-amino, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo;
- c)
- R^{4} es hidrógeno.
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Un quinto grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en el que se aplica
una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- cada X es N;
- b)
- R^{1} es fenilo o fenilo opcionalmente sustituido con halo, alquilo C_{1-6}, alquil C_{1-6}-oxi, polihalo-alquilo C_{1-6} o arilo;
- c)
- R^{2} es -CH_{2}- R o -C(=O)-R^{6};
- d)
- cada R^{5} se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi, alquil C_{1-6}-oxi-alquil C_{1-6}-oxi, alquil C_{1-6}-carboniloxi, N-metilpiperazinilo, morfolinilo, o imidazolilo;
- e)
- cada R^{6} se selecciona independientemente entre alquil C_{1-6}-amino, cicloalquil C_{1-6}-amino, hidroxialquil C_{1-6}-amino, di(alquil C_{1-6})amino-alquil C_{1-6}-amino o morfolinilo;
- f)
- R^{3} es hidrógeno; o
- g)
- R^{4} es hidrógeno o alquilo C_{1-6}.
\newpage
Un sexto grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos del quinto grupo en los que se
aplica la restricción siguiente:
- a)
- cada R^{6} se selecciona independientemente de alquil C_{1-6}-amino, cicloalquil C_{1-6}-amino, di(alquil C_{1-6})amino-alquil C_{1-6}-amino o morfolinilo.
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Un séptimo grupo de compuestos interesantes
consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que se aplica
una o varias de las restricciones siguientes:
- a)
- cada X es N;
- b)
- R^{1} es fenilo o fenilo sustituido con halo;
- c)
- R^{2} es -CH_{2}-R^{5};
- d)
- cada R^{5} se selecciona independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi, o alquil C_{1-6}-carboniloxi;
- e)
- R^{3} es hidrógeno;
- f)
- R^{4} es hidrógeno.
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Un grupo de compuestos preferidos consiste en
aquellos compuestos de fórmula (I) en los que:
cada X es N; R^{1} es fenilo o fenilo
opcionalmente sustituido con halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6} o arilo;
R^{2} es -CH_{2}-R^{5} o
-C(=O)-R^{6}; cada R^{5} se selecciona
independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o imidazolilo; cada
R^{6} se selecciona independientemente entre alquil
C_{1-6}-amino, cicloalquil
C_{1-6}-amino,
hidroxi-alquil
C_{1-6}-amino, di(alquil
C_{1-6})-amino-alquil
C_{1-6}-amino o morfolinilo;
R^{3} es hidrógeno y R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6}.
Otro grupo de compuestos preferidos consiste en
aquellos compuestos de fórmula (I) en los que R^{2} es
-CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo,
-C(=O)-R^{6}, o
-CH_{2}-NR^{7}R^{8}.
Un grupo de compuestos más preferidos consiste
en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que cada X es N;
R^{1} es fenilo o fenilo sustituido con halo; R^{2} es
-CH_{2}-R^{5}; cada R^{5} se selecciona
independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, o alquil
C_{1-6}-carboniloxi; R^{3} es
hidrógeno; y R^{4} es hidrógeno.
El compuesto más preferido es el compuesto Nº.
1, compuesto Nº. 8, compuesto Nº. 11, compuesto Nº. 9, compuesto
Nº. 33, compuesto Nº. 34 y el compuesto Nº. 7 y el compuesto Nº.
25.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los compuestos de fórmula (I) y sus sales
farmacéuticamente aceptables y N-óxidos y sus formas
estereoquímicamente isoméricas pueden prepararse de manera
convencional. Los materiales de partida y algunos intermedios son
compuestos conocidos y están comercialmente disponibles o pueden
prepararse según procedimientos de reacción convencionales
generalmente conocidos en la técnica.
Algunos métodos de preparación serán descritos
en este documento de aquí en adelante más detalladamente. Otros
métodos para obtener los compuestos finales de fórmula (I) son
descritos en los ejemplos.
a) Los ácidos hidroxámicos de fórmula (I) pueden
prepararse haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (II) con un
ácido apropiado, tal como, por ejemplo, ácido trifluoroacético.
Dicha reacción se realiza en un disolvente apropiado, tal como, por
ejemplo, metanol o diclorometano.
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b) Los intermedios de fórmula (II)
pueden prepararse haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (III)
con un intermedio de fórmula (IV) en presencia de reactivos
apropiados tales como
N'-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina,
monohidrocloruro (EDC) y
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(HOBT). La reacción puede ser realizada en presencia de una base
tal como trietilamina, en un disolvente adecuado, tal como, una
mezcla de diclorometano y
tetrahidrofurano.
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c) De un modo alternativo, los
intermedios de fórmula (II), en los que R^{4} es hidrógeno,
llamados en este documento los intermedios de fórmula
(II-a) pueden prepararse en una etapa solo haciendo
reaccionar el intermedio de fórmula (XI), con
1,4-dioxano-2,5-diol
y el ácido borónico apropiado de fórmula (VII), en el que R^{1}
es como se define antes, en un disolvente adecuado, p.ej un alcohol,
tal como el
etanol.
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d) Los intermedios de fórmula (III)
pueden prepararse haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (V)
con una solución del ácido apropiado, p.ej ácido clorhídrico, o
solución básica, p.ej bromuro de hidrógeno o hidróxido de sodio, en
un disolvente adecuado, p.ej un alcohol, tal como etanol o
propanol.
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\newpage
La presente invención también se refiere a
compuestos de fórmula (V)
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las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas
estereoquímicas, en las
que
cada X es independientemente N o CH;
R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo;
en el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquil C_{1-6}, arilo,
hidroxi, ciano, amino, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-sulfonilamino,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxialquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oximetilo, aminometilo,
alquil C_{1-6}-aminometilo,
alquil
C_{1-6}-carbonilaminometilo,
alquil
C_{1-6}-sulfonilaminometilo,
aminosulfonilo, alquil
C_{1-6}-aminosulfonilo o
heterociclilo;
R^{2} es hidrógeno,
-CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo,
-C(=O)-R^{6}, o
-CH_{2}-NR^{7}R^{8}; en el que
cada R^{5} se selecciona independientemente
entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi, piperazinilo,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,
imidazolilo o triazolilo; cada R^{6} se selecciona
independientemente entre hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, amino o mono- o
di-(alquil C_{1-6}) amino, cicloalquil
C_{1-6}-amino, hidroxialquil
C_{1-6}-amino, piperazinilo,
mono- o di-(alquil C_{1-6})
amino-alquil
C_{1-6}-amino,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo;
cada R^{7} y R^{8} se seleccionan independientemente entre
hidrógeno, alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-carbonilo, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-4})-aminosulfonilo;
R^{3} es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo
o mono- o di-(alquil C_{1-6}) aminometilo;
R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6};
arilo en lo anterior es fenilo o naftalenilo; en
el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
ciano o hidroxicarbonilo;
y
y
heterociclilo en lo anterior es furanilo,
tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo,
tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo,
pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo,
oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo,
piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo,
piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo,
tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo,
benzotiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo,
purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftlazinilo,
quinazolinilo, quinaxolinilo o naftiridinilo; en el que
cada uno de dichos heterociclos está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, ciano, amino, o mono-
o di-(alquil C_{1-4})-amino.
Pueden ser definidos grupos de compuestos
interesantes, preferidos, más preferidos y los más preferidos para
los compuestos de fórmula (V), de acuerdo con los grupos definidos
para los compuestos de la fórmula (I).
Los nuevos intermedios de fórmula (V) pueden
prepararse al:
a) convertir los intermedios de fórmula (V), en
los que R^{2} es -CH_{2}OH, y R^{4} es hidrógeno, llamados en
este documento los intermedios de fórmula (V-a), en
los intermedios de fórmula (V) en los que R^{2} es distinto a
-CH_{2}OH, llamados en este documento intermedios de fórmula
(V-b), mediante reacciones conocidas en la técnica
o transformaciones de grupo funcionales. Por ejemplo, los alcoholes
de fórmula (V-a) pueden ser convertidos en aminas,
ésteres y éteres. Las aminas pueden ser transformadas en las
correspondientes amidas y las aminas primarias pueden ser
convertidas en aminas secundarias o terciarias.
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b) Los nuevos intermedios de
fórmula (V-a) pueden prepararse en una sola etapa
haciendo reaccionar el intermedio de fórmula (VI) con
1,4-dioxano-2,5-diol
y el ácido borónico apropiado de fórmula (VII), en el que R^{1}
es como se define antes, en un disolvente adecuado, p.ej un alcohol,
tal como el
etanol.
c) Los nuevos intermedios de
fórmula (V-b) pueden prepararse haciendo reaccionar
los intermedios de fórmula (VI) con la cetona apropiada de fórmula
(VIII) en presencia de un reactivo apropiado, tal como
tetrakis(etanolato)titanio o un borohidruro de sodio,
en un disolvente adecuado p.ej
1,2-dicloroetano.
d) Los nuevos intermedios de
fórmula (V), en los que R^{2} es -COOH, denominados en este
documento los compuestos de fórmula (V-c), pueden
prepararse en una sola etapa haciendo reaccionar el intermedio de
fórmula (VI), con el ácido
2-oxo-propanoico y el ácido borónico
apropiado de fórmula (VII), en el que R^{1} es como se define
antes, en un disolvente adecuado, p.ej
1,2-diclorometano.
Los intermedios de fórmula
(V-c), en los que R^{2} es - COOH, pueden ser
convertidos en intermedios de fórmula (V) en los que R es
-C(=O)-R^{6}, mediante reacciones conocidas por la
técnica o transformaciones de grupo funcionales, por ejemplo la
conversión en aminas y amidas.
Los intermedios de fórmula (XI) pueden
prepararse haciendo reaccionar el intermedio de fórmula (IX) con
piperidina en un disolvente adecuado, p.ej diclorometano.
Los intermedios de fórmula (IX) pueden
prepararse haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (X) con un
intermedio de fórmula (IV), en presencia de un reactivo apropiado
tal como
N'-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina,
monohidrocloruro (EDC) y
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(HOBT). La reacción puede ser realizada en presencia de una base
tal como trietilamina, en un disolvente adecuado, tal como, una
mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.
Los intermedios de fórmula (X) pueden prepararse
haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (VI) con un intermedio
de fórmula (XII), en presencia de hidróxido de sodio, en un
disolvente adecuado, tal como tetrahidrofurano, seguido de la
neutralización con ácido clorhídrico y adición de carbonato de
sodio.
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Los compuestos de fórmula (I) y algunos
intermedios pueden tener al menos un centro estereogénico en su
estructura. Este centro estereogénico puede estar presente en una
configuración R o S.
Los compuestos de fórmula (I), según se preparan
en los procesos arriba descritos, son generalmente mezclas
racémicas de enantiómeros, que pueden ser separados entre sí
siguiendo procedimientos de resolución conocidos por la técnica.
Los compuestos racémicos de fórmula (I) pueden ser convertidos en
las correspondientes formas diastereoméricas salinas por la
reacción con un ácido quiral adecuado. Dichas formas
diastereoméricas salinas son separadas posteriormente, por ejemplo,
por cristalización selectiva o fraccionaria y los enantiómeros son
liberados a partir de ahí por un álcali. Una manera alternativa de
separar las formas enantioméricas de los compuestos de fórmula (I)
implica la cromatografía líquida usando una fase estacionaria
quiral. Dichas formas estereoquímicamente isoméricas puras también
pueden obtenerse a partir de las formas estereoquímicamente
isoméricas puras correspondientes a partir de los materiales de
partida apropiados, a condición de que la reacción ocurra
estereoespecíficamente. Preferentemente, si se desea el
estereoisómero específico, dicho compuesto sería sintetizado por
métodos de preparación estereoespecíficos. Estos métodos emplearán
ventajosamente materiales de partida enantioméricamente puros.
Los compuestos de fórmula (I), las sales de
adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sus formas
estereoisoméricas tienen propiedades farmacológicas valiosas porque
tienen un efecto inhibitorio de histona desacetilasa (HDAC).
Esta invención proporciona un método para
inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo células
transformadas, administrando una cantidad eficaz de un compuesto de
la invención. El crecimiento anormal de células se refiere al
crecimiento de células independiente de los mecanismos reguladores
normales (p.ej, la pérdida de inhibición por contacto). Esto
incluye la inhibición del crecimiento de tumores, directamente
causando la detención del crecimiento, la diferenciación terminal
y/o la apoptosis de las células cancerígenas e, indirectamente,
inhibiendo la neovascularización de tumores.
Esta invención también proporciona un método
para inhibir el crecimiento de tumores administrando una cantidad
eficaz de un compuesto de la presente invención, a un sujeto, p.ej
un mamífero (y más particularmente un ser humano) en necesidad de
tal tratamiento. En particular, esta invención proporciona un método
para inhibir el crecimiento de tumores mediante la administración
de una cantidad eficaz de los compuestos de la presente invención.
Los ejemplos de tumores que pueden ser inhibidos, pero sin
limitación, son cáncer de pulmón (p.ej adenocarcinoma e incluyendo
cáncer de pulmón de células no pequeñas), cánceres pancreáticos
(carcinoma, p.ej pancreático, tal como, por ejemplo carcinoma
pancreático exocrino), cánceres de colon (p.ej carcinomas
colorectal, tal como, por ejemplo, adenocarcinoma de colon y
adenoma de colon), cáncer de próstata incluyendo la enfermedad
avanzada, tumores hematopoyéticos de linaje Infoide (p.ej., leucemia
linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt),
leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielogenosa aguda (AML)),
cáncer de tiroides folicular, síndrome mielodisplásico (MDS),
tumores de origen mesenquimal (p.ej fibrosarcomas y
rabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas,
gliomas, tumor benigno de la piel (p.ej queratoacantomas), carcinoma
de mama (p.ej, cáncer de mama avanzado), carcinoma de riñón,
carcinoma de ovario, carcinoma de vejiga y carcinoma
epidérmico.
El compuesto según la invención puede ser usado
con otros fines terapéuticos, por ejemplo:
- a)
- el reconocimiento de tumores con radioterapia administrando el compuesto según la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para tratar el cáncer;
- b)
- tratar artropatías y afecciones osteopatológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico;
- c)
- inhibir la proliferación de células de músculo liso incluyendo desórdenes proliferativos vasculares, aterosclerosis y restenosis;
- d)
- tratar afecciones inflamatorias y afecciones dérmicas tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad de injerto contra huésped, conjuntivitis, asma, ARDS, enfermedad de Behcets, rechazo de trasplantes, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczemas, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica;
- e)
- tratar endometriosis, fibroides uterinas, sangrado uterino disfuncional e hiperplasia endometrial;
- f)
- tratar la vascularisación ocular incluyendo la vasculopatía que afecta a los vasos retinales y coroidales;
- g)
- tratar una disfunción cardíaca;
- h)
- inhibir afecciones inmunodepresivas tales como el tratamiento de las infecciones por VIH;
- i)
- tratar la disfunción renal;
- j)
- suprimir los desórdenes endocrinos;
- k)
- inhibir la disfunción de la gluconeogénesis;
- l)
- tratar una neuropatología, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson o un neuropatología que causa un desorden cognoscitivo, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer o enfermedades neuronales relacionadas con poliglutamina;
- m)
- tratar desórdenes psiquiátricos, por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis;
- n)
- inhibir una patología neuromuscular, por ejemplo, esclerosis lateral amilotrófica;
- o)
- tratar la atrofia muscular espinal;
- p)
- tratar otras afecciones patológicas susceptibles al tratamiento por la expresión potenciadora de un gen;
- q)
- realzar la terapia génica;
- r)
- inhibir la adipogenesis;
- s)
- tratar parasitosis tales como la malaria.
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Por lo tanto, la presente invención describe los
compuestos de fórmula (I) para uso como un fármaco así como el uso
de estos compuestos de fórmula (I) para la fabricación de un
medicamento para tratar una o varias de las afecciones arriba
mencionadas.
Los compuestos de fórmula (I), las sales de
adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sus formas
estereoisoméricas pueden tener valiosas propiedades diagnósticas en
las cuales pueden ser usados para detectar o identificar una HDAC
en una muestra biológica que comprende la detección o la medición de
la formación de un complejo entre un compuesto marcado y una
HDAC.
Los métodos de detección o identificación pueden
usar compuestos que sean marcados mediante el marcaje de agentes
tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes,
sustancias luminosas, etc. Los ejemplos de radioisótopos incluyen
^{125}I, ^{131}I, ^{3}H y ^{14}C. Las enzimas se hacen, por
lo general, detectables por su conjugación con el sustrato
apropiado que, a su vez, cataliza una reacción detectable. Los
ejemplos de esto incluyen, por ejemplo,
beta-galactosidasa,
beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y
malato deshidrogenasa, preferentemente peroxidasa de rábano picante.
Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados
de luminol, luciferina, aecuorina y luciferasa.
Las muestras biológicas pueden ser definidas
como tejido del cuerpo o fluidos del cuerpo. Los ejemplos de
fluidos del cuerpo son fluido cerebroespinal, sangre, plasma, suero,
orina, esputo, saliva y otros similares.
En vista de sus propiedades farmacológicas
útiles, los compuestos objeto pueden ser formulados en varias formas
farmacéuticas con el fin de su administración.
Para preparar las composiciones farmacéuticas de
esta invención, se combina una cantidad eficaz de un compuesto
particular, en forma de sal de adición de base o de ácido, como
ingrediente activo en mezcla con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, cuyo vehículo puede tomar una amplia variedad de formas,
según la forma de preparación deseada para la administración. Estas
composiciones farmacéuticas están deseablemente en forma de dosis
unitaria adecuadas, preferentemente, para la administración oral,
rectal, percutánea o inyección parenteral. Por ejemplo, en la
preparación de las composiciones en la forma de administración oral,
puede ser empleado cualquiera de los medios farmacéuticos
habituales, tal como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites,
alcoholes y otros similares en el caso de preparaciones líquidas
orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o
vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín,
lubricantes, aglomerantes, agentes desintegrantes y otros similares
en el caso de polvos, píldoras, cápsulas y pastillas.
A causa de su facilidad en la administración,
las pastillas y las cápsulas representan la forma de unidad de
administración oral más ventajosa, en cuyo caso son obviamente
empleados vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones
parenterales, el vehículo comprenderá por lo general agua estéril,
al menos en gran parte, aunque puedan ser incluidos otros
ingredientes para ayudar a la solubilidad, por ejemplo. Pueden
prepararse soluciones inyectables, por ejemplo, en las que el
vehículo comprenda solución salina, solución de glucosa o una
mezcla de solución de glucosa y salina. También pueden prepararse
suspensiones inyectables en cuyo caso pueden ser empleados
vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y otros
similares. En las composiciones adecuadas para la administración
percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente que
potencia la penetración y/o un agente humectante adecuado,
opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier
naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no causan ningún
efecto deletéreo significativo en la piel. Dichos aditivos pueden
facilitar la administración a la piel y/o pueden ser provechosos
para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones
pueden ser administradas de varios modos, p.ej, como un parche
transdérmico, tal como una crema o como un
ungüento.
ungüento.
Sobre todo, es ventajoso formular las
composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas en formas de
administración unitaria para facilitar la administración y por la
uniformidad de la dosis. La forma de administración unitaria según
se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones en este
documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas
como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad
predeterminada del ingrediente activo, calculada para producir el
efecto terapéutico deseado, conjuntamente con el vehículo
farmacéutico requerido. Los ejemplos de tales formas de
administración unitaria son comprimidos (incluyendo comprimidos
revestidos o marcados), cápsulas, píldoras, paquetes en polvo,
obleas, soluciones inyectables o suspensiones, cucharaditas,
cucharadas y otros similares, y sus múltiplos segregados.
Los expertos en la técnica podrían determinar
fácilmente la cantidad eficaz a partir de los resultados de los
ensayos presentados más adelante. En general, se contempla que una
cantidad terapéuticamente eficaz estaría entre 0,005 mg/kg de peso
corporal y 100 mg/kg, y en particular entre 0,005 mg/kg de peso
corporal y 10 mg/kg. Puede ser apropiado administrar la dosis
requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis en intervalos
apropiados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden ser
formuladas como formas de administración unitarias, por ejemplo,
conteniendo entre 0,5 y 500 mg, y en particular entre 10 mg y 500 mg
del ingrediente activo por forma de administración unitaria.
Como otro aspecto de la presente invención, se
presenta una combinación de un inhibidor de HDAC con otro agente
anticáncer, sobre todo para su uso como un fármaco, más expresamente
en el tratamiento del cáncer o enfermedades relacionadas.
Para el tratamiento de las susodichas
afecciones, los compuestos de la invención pueden ser ventajosamente
empleados en combinación con uno o varios agentes farmacológicos
distintos, más particularmente, con otros agentes anticáncer. Los
ejemplos de agentes anticáncer son:
- -
- compuestos de coordinación de platino, por ejemplo, cisplatin, carboplatin u oxaliplatin;
- -
- compuestos de taxano, por ejemplo, paclitaxel o docetaxel;
- -
- inhibidores de topoisomerasa como compuestos de camptotecin, por ejemplo, irinotecan o topotecan;
- -
- inhibidores de topoisomerasa II como derivados antitumorales de podofilotoxina, por ejemplo, etoposido o teniposido;
- -
- alcaloides de la vinca antitumorales, por ejemplo, vinblastina, vincristina o vinorelbina;
- -
- derivados de nucleósidos antitumorales, por ejemplo, 5-fluorouracil, gemcitabina o capecitabina;
- -
- agentes alquilantes, tales como mostaza de nitrógeno o nitrosourea, por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucil, carmustina o lomustina;
- -
- derivados de antraciclina antitumorales, por ejemplo, daunorubicin, doxorubicin, idarubicin o mitoxantrona;
- -
- anticuerpos de HER2, por ejemplo, trastuzumab;
- -
- antagonistas del receptor de estrógeno o moduladores del receptor de estrógeno selectivos, por ejemplo, tamoxifen, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno;
- -
- inhibidores de aromatasa tales como exemestano, anastrozol, letrazol y vorozol;
- -
- agentes diferenciantes tales como retinoides, vitamina D y agentes bloqueantes del metabolismo del ácido retinoico (RAMBA), por ejemplo, accutano;
- -
- inhibidores de ADN metil-transferasa, por ejemplo, azacitidina;
- -
- inhibidores de quinasa, por ejemplo, flavoperidol, imatinib mesilato o gefitinib;
- -
- inhibidores de farnesiltransferasa;
- -
- otros inhibidores de HDAC
- -
- inhibidores de la ruta de ubiquitina-proteasoma, por ejemplo, Velcade; o
- -
- Yondelis.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "compuesto de coordinación de
platino" se usa en este documento para denotar cualquier
crecimiento de células tumorales que inhiban al compuesto de
coordinación de platino que proporciona el platino en la forma de
un ión.
La expresión "compuestos de taxano" indica
una clase de compuestos que tienen el sistema de anillo de taxano y
que están relacionados o se obtienen a partir de extractos de
ciertas especies de árboles tejo (Taxus).
La expresión "inhibidores de topisomerasa"
se usa para indicar enzimas que son capaces de cambiar la topología
del ADN en células eucariótas. Son críticos para las funciones
celulares importantes y la proliferación de células. Hay dos clases
de topoisomerasas en las células eucarióticas, a saber, tipo I y
tipo II. La topoisomerasa I es una enzima monomérica de
aproximadamente 100.000 de peso molecular. La enzima se une al ADN e
introduce una ruptura monocatenaria pasajera, desenrolla la doble
hélice (o permite que se desenrolle) y posteriormente resella la
ruptura antes de disociar la cadena de ADN. La topisomerasa II tiene
un mecanismo de acción similar que implica la inducción de rupturas
de la cadena de ADN o la formación de radicales libres.
La expresión "compuestos de camptotecin" se
usa para indicar los compuestos que están relacionados o son
derivados a partir del compuesto de camptotecin madre que es un
alcaloide insoluble en agua derivado del árbol chino
Camptothecin acuminata y el árbol indio Nothapodytes
foetida.
La expresión "compuestos de podofilotoxina"
se usa para indicar a los compuestos que están relacionados o son
derivados de la podofilotoxina madre, que es extraída a partir de la
planta mandrágora.
La expresión "alcaloides de la vinca
antitumorales" se usa para indicar a los compuestos que están
relacionados o son derivados de extractos de la planta
vincapervinca (Vinca rosea).
La expresión "agentes alquilantes" abarca a
un grupo diverso de productos químicos que tienen el rasgo común de
que tienen la capacidad de contribuir, en afecciones fisiológicas,
con grupos alquilo a macromoléculas biológicamente vitales tales
como el ADN. Con la mayor parte de los agentes más importantes como
las mostazas de nitrógeno y las nitrosoureas se generan restos
alquilantes activos in vivo después de complejas reacciones
de degradación, algunas de las cuales son enzimáticas. Las acciones
farmacológicas más importantes de los agentes alquilantes son
aquellas que perturban los mecanismos fundamentales ocupados en la
proliferación de células en la síntesis del ADN particular y la
división celular. La capacidad de los agentes alquilantes de
interferir en la función del ADN y la integridad en los tejidos
proliferantes proporciona rápidamente la base para sus aplicaciones
terapéuticas y para muchas de sus propiedades tóxicas.
La expresión "derivados de antraciclina
antitumorales" comprende a los antibióticos obtenidos a partir
del hongo Strep. peuticus var. caesius y sus derivados,
caracterizados por tener una estructura de anillo de tetraciclina
con un azúcar inusual, daunosamina, unido por un enlace
glucosídico.
La amplificación de la proteína del receptor del
factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER 2) en carcinomas de
mama primarios se ha demostrado que guarda correlación con un
deficiente pronóstico clínico para ciertos pacientes. El
Trastuzumab es un anticuerpo kappa de IgG1 monoclónico humanizado
derivado de ADN recombinante muy purificado que se une con afinidad
alta y precisión a la esfera extracelular del receptor HER2.
Muchos cánceres de mama tienen receptores de
estrógenos y el crecimiento de estos tumores puede ser estimulado
por los estrógenos. Los términos "antagonistas del receptor de
estrógeno" y los "moduladores del receptor de estrógeno
selectivos" son usados para indicar a los inhibidores
competitivos del estradiol que se unen al receptor de estrógeno
(ER). Los moduladores del receptor de estrógeno selectivos, cuando
se unen al ER, inducen un cambio de la forma tridimensional del
receptor, modulando su unión al elemento responsable del estrógeno
(ERE) en el ADN.
En mujeres postmenopáusicas, la fuente principal
del estrógeno circulante es la conversión de andrógenos
suprarrenales y ováricos (androestendiona y testosterona) en
estrógenos (estrona y estradiol) por la enzima aromatasa en tejidos
periféricos. La privación de estrógenos por la inhibición de
aromatasa o la inactivación es un tratamiento eficaz y selectivo
para algunos pacientes postmenopáusicos con cáncer de mama hormonal
dependiente.
La expresión "agente antiestrógeno" se usa
en este documento para incluir no sólo a antagonistas del receptor
de estrógeno y moduladores del receptor de estrógeno selectivos sino
también a inhibidores de aromatasa como se comenta antes.
La expresión "agentes diferenciadores"
abarca a compuestos que, de varios modos, pueden inhibir la
proliferación de células e inducir a la diferenciación. Se sabe que
la vitamina D y los retinoides desempeñan un papel principal en la
regulación del crecimiento y la diferenciación de una amplia
variedad de tipos de células normales y malignas. Los agentes
bloqueantes del metabolismo del ácido retinoico (los RAMBA) aumentan
los niveles del ácido retinoico endógeno inhibiendo el catabolismo
mediado por la citocromo P450 de ácidos retinoicos.
Los cambios de la metilación del ADN están entre
las anormalidades más comunes en la neoplasia humana. La
hipermetilación dentro de los promotores de genes seleccionados
tiene que ver por lo general con la inactivación de los genes
implicados. La expresión "inhibidores de la ADN
metil-transferasa" se usa para indicar a los
compuestos que actúan a través de la inhibición farmacológica de la
ADN metil-transferasa y la reactivación de la
expresión del gen supresor del tumor.
La expresión "inhibidores de quinasa"
comprende a potentes inhibidores de quinasas que están implicados en
la progresión del ciclo celular y la muerte celular programada
(apoptosis).
La expresión "inhibidores de
farnesiltransferasa" se usa para indicar a los compuestos que
fueron diseñados para prevenir la farnesilación de Ras y otras
proteínas intracelulares. Se ha demostrado que tienen efectos en la
proliferación de célula malingnas y en la supervivencia.
La expresión "otros inhibidores de HDAC"
comprende, pero no está limitada a:
- -
- carboxilatos, por ejemplo, butirato, ácido cinnámico, ácido 4-fenilbutirato o valproico;
- -
- ácidos hidroxámicos, por ejemplo, ácido suberoilanilida-hidroxámico (SAHA), análogos de SAHA que contienen piperazina, hidroxamato de biarilo A-161906 y sus análogos de carbozoliléter, tetrahidropiridina y tetralona, aril-N-hidroxicarboxamidas bicíclicas, piroxamida, CG-1521, PXD-101, sulfonamida ácido hidroxámico, LAQ-824, LBH-589, tricostatin (TSA), oxamflatin, scriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas con scriptaid, ácido m-carboxi cinnámico, ácido bishidroxámico (CBHA), ácidos hidroxamicos tipo CBHA, análogo del ácido trapoxin-hidroxámico, R306465 y ácidos benzoilo y heteroaril-hidroxámico relacionados, aminosuberatos y malonildiamidas;
- -
- tetrapéptidos cíclicos, por ejemplo, trapoxin, apidicin, depsipeptido, compuestos relacionados con spiruchostatin, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos que contienen sulfhidrilo (SCOP), tetrapéptidos cíclicos que contienen ácido hidroxámico (CHAP), TAN-174S y azumamidas;
- -
- benzamidas, por ejemplo, MS-275 o CI-994, o
- -
- depudecin.
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La expresión "inhibidores de la ruta de
ubiquitina-proteasoma" se usa para indentificar a
los compuestos que inhiben la destrucción dirigida de proteínas
celulares en el proteasoma, incluyendo las proteínas reguladoras
del ciclo celular.
Para el tratamiento del cáncer los compuestos
según la presente invención pueden ser administrados a un paciente
como se describe antes, junto con irradiación. La irradiación
significa la radiación de ionización y, en particular, de rayos
gamma, sobre todo la que se emite con aceleradores lineales o
radionucléidos que son de uso común hoy en día. La irradiación del
tumor por radionucléidos puede ser externa o interna.
La presente invención también está relacionada
con una combinación, según la invención, de un agente anticáncer y
un inhibidor de HDAC según la invención.
La presente invención también está relacionada
con una combinación, según la invención, para uso en terapia
médica, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de células
tumorales.
La presente invención también está relacionada
con unas combinaciones, según la invención, para inhibir el
crecimiento de células tumorales.
La presente invención también está relacionada
con un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en
un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad
eficaz de una combinación según la invención.
Esta invención proporciona además un método para
inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo células
transformadas, administrando una cantidad eficaz de una combinación
según la invención.
El otro agente farmacológico y el inhibidor de
HDAC pueden ser administrados simultáneamente (p.ej, en
composiciones separadas o unitarias) o secuencialmente en cualquier
orden. En el último caso, los dos compuestos serán administrados en
un período y en una cantidad y manera que sean suficientes para
asegurar que es conseguido un efecto sinérgico o ventajoso. Será
apreciado que el método preferido y el orden de administración y las
cantidades de dosis respectivas y regímenes para cada componente de
la combinación dependerán del otro agente farmacológico particular
e inhibidor de HDAC administrado, su ruta de administración, el
tumor particular tratado y el huésped particular tratado. El método
óptimo y el orden de administración y las cantidades de las dosis y
el régimen pueden ser fácilmente determinados por los expertos en
la técnica usando métodos convencionales y a la vista de la
información dispuesta en este documento.
El compuesto de coordinación de platino es
ventajosamente administrado en una dosis de 1 a 500 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 50 y 400 mg/m^{2}, en particular para cisplatin en una
dosis de aproximadamente 75 mg/m^{2} y para carboplatin en
aproximadamente 300 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El compuesto de taxano es ventajosamente
administrado en una dosis entre 50 y 400 mg por metro cuadrado
(mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo entre 75
y 250 mg/m^{2}, en particular para paclitaxel en una dosis entre
aproximadamente 175 y 250 mg/m^{2} y para docetaxel entre
aproximadamente 75 y 150 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El compuesto de camptotecin es ventajosamente
administrado en una dosis entre 0,1 y 400 mg por metro cuadrado
(mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo entre 1 y
300 mg/m^{2}, en particular para irinotecan en una dosis entre
aproximadamente 100 y 350 mg/m^{2} y para topotecan entre
aproximadamente 1 y 2 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El derivado de podofilotoxina antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 30 y 300 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 50 y 250 mg/m^{2}, en particular, para etoposido en una
dosis entre aproximadamente 35 y 100 mg/m^{2} y para teniposido
entre aproximadamente 50 y 250 mg/m^{2} por curso del
tratamiento.
El alcaloid de la vinca antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 2 y 30 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, en
particular para vinblastina en una dosis entre aproximadamente 3 y
12 mg/m^{2}, para vincristina en una dosis entre aproximadamente 1
y 2 mg/m^{2}, y para vinorelbina en una dosis entre
aproximadamente 10 y 30 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El derivado de nucleósido antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 200 y 2500 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 700 y 1500 mg/m^{2}, en particular para
5-FU en una dosis entre 200 y 500 mg/m^{2}, para
gemcitabina en una dosis entre aproximadamente 800 y 1200
mg/m^{2} y para capecitabina entre aproximadamente 1000 y 2500
mg/m^{2} por curso del tratamiento.
Los agentes alquilantes tales como la mostaza de
nitrógeno o nitrosourea son ventajosamente administrados en una
dosis entre 100 y 500 mg por metro cuadrado (mg/m^{2}) del área de
superficie de cuerpo, por ejemplo entre 120 y 200 mg/m^{2}, en
particular, para ciclofosfamida en una dosis entre aproximadamente
100 y 500 mg/m^{2}, para clorambucil en una dosis entre
aproximadamente 0,1 y 0,2 mg/kg, para carmustina en una dosis entre
aproximadamente 150 y 200 mg/m^{2}, y para lomustina en una dosis
entre aproximadamente 100 y 150 mg/m^{2} por curso del
tratamiento.
El derivado de antraciclina antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 10 y 75 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 15 y 60 mg/m^{2}, en particular para doxorubicin en una
dosis entre aproximadamente 40 y 75 mg/m^{2}, para daunorubicin en
una dosis entre aproximadamente 25 y 45 mg/m^{2}, y para
idarubicin en una dosis entre aproximadamente 10 y 15 mg/m^{2}
por curso del tratamiento.
El Trastuzumab se administra ventajosamente en
una dosis entre 1 y 5 mg por metro cuadrado (mg/m^{2}) del área
de superficie de cuerpo, en particular entre 2 y 4 mg/m^{2} por
curso del tratamiento.
El agente antiestrógeno se administra
ventajosamente en una dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg
diariamente según el agente particular y la condición tratada. El
Tamoxifen se administra ventajosamente oralmente en una dosis entre
5 y 50 mg, preferentemente entre 10 y 20 mg dos veces al día,
siguiendo la terapia durante el tiempo suficiente para conseguir y
mantener un efecto terapéutico. El Toremifeno se administra
ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente 60 mg una
vez al día, siguiendo la terapia durante el tiempo suficiente para
conseguir y mantener un efecto terapéutico. El Anastrozol se
administra ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente
1 mg una vez al día. El Droloxifeno se administra ventajosamente
oralmente en una dosis entre aproximadamente 20 y 100 mg una vez al
día. El Raloxifeno se administra ventajosamente oralmente en una
dosis de aproximadamente 60 mg una vez al día. El Exemestano se
administra ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente
25 mg una vez al día.
Estas dosis pueden ser administradas por ejemplo
una vez, dos veces o más por curso del tratamiento, que puede ser
repetido por ejemplo cada 7,14, 21 ó 28 días.
En vista de sus propiedades farmacológicas
útiles, los componentes de las combinaciones según la invención, es
decir el otro agente farmacológico y el inhibidor de HDAC, pueden
ser formulados en varias formas farmacéuticas con fines de
administración. Los componentes pueden ser formulados por separado
en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición
farmacéutica unitaria que contiene ambos componentes.
La presente invención, por lo tanto, también
está relacionada con una composición farmacéutica que comprende al
otro agente farmacológico y el inhibidor de HDAC junto con uno o
varios vehículos farmacéuticos.
La presente invención también está relacionada
con una combinación según la invención en la forma de una
composición farmacéutica que comprende a un agente anticáncer y un
inhibidor de HDAC según la invención junto con uno o varios
vehículos farmacéuticos.
La presente invención está relacionada además
con el uso de una combinación según la invención en la fabricación
de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de
células tumorales.
La presente invención está relacionada además
con un producto que contiene como primer ingrediente activo un
inhibidor de HDAC según la invención y como segundo ingrediente
activo un agente anticáncer, como una preparación combinada para
uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de pacientes
que sufren de cáncer.
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Los ejemplos siguientes son proporcionados con
fines ilustrativos.
De aquí en adelante en este documento,
"EDC" se define como
N'-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina,
monohidrocloruro, "DCM" se define como diclorometano,
"DIPE" se define como diisopropil-éter, "DMF" se define
como N,N-dimetilformamida, "EtOAc" se define
como acetato de etilo, "EtOH" se define como etanol,
"HOBT" se define como
1-hidroxi-1H-benzotriazol,
"MeOH" se define como metanol, "TFA" se define como ácido
trifluoroacético y "THF" se define como tetrahidrofurano.
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Ejemplo
A1
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Una mezcla del éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-pirimidincarboxílico
(0,016 mol),
ácido-(2-feniletenil)-borónico
(0,016 mol) y
1,4-dioxano-2,5-diol
(0,016 mol) en EtOH (250 ml) fue agitada durante 2 días a
temperatura ambiente y luego el disolvente fue evaporado (vac.), el
residuo fue llevado a DCM y agua y la capa orgánica fue separada,
secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue evaporado. El
residuo fue purificado mediante cromatografía de columna sobre gel
de sílice (15-40 \mum) (eluyente: DCM/MeOH 97/1).
Las fracciones puras fueron evaporadas, proporcionando 4 g (61%)
del intermedio 1, punto de fusión 128ºC.
Los ésteres, correspondientes al intermedio 1,
pueden ser separados por cromatografía quiral.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla del intermedio 1 (0,0007 mol) en
hidróxido de sodio 1N (10 ml) y THF (20 ml) fue agitada a
temperatura ambiente durante 48 horas. Fue añadido ácido
clorhídrico 1N (10 ml). El disolvente fue evaporado. El precipitado
fue filtrado, lavado con agua, luego con DIPE y secado,
proporcionando 0,2 g (72%) del intermedio 2, punto de fusión
232ºC.
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Fueron añadidos trietilamina (0,012 mol),
N'-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina
(0,00593 mol),
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(0,00593 mol) y
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,00593 mol) a una mezcla del intermedio 2 (0,00395 mol) en una
mezcla de DCM (70 ml) y THF (70 ml), entonces la mezcla de reacción
fue agitada durante 3 días a temperatura ambiente. Fue añadida
H_{2}O. La capa orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}),
filtrada y el disolvente fue evaporado. El residuo fue purificado
mediante cromatografía de columna (gradiente eluyente:
DCM/MeOH/NHOH 97/3/0,1). Las fracciones del producto fueron
recuperadas y el disolvente orgánico fue evaporado proporcionando
1,5 g (84%) del intermedio 3.
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Ejemplo
A2
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla del éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-pirimidincarboxílico
(0,0042 mol),
1,4-dioxano-2,5-diol
(0,0042 mol) y ácido (E)
[2-(4-clorofenil)etenil-borónico
(0,0042 mol) en EtOH (100 ml) fue agitada a temperatura ambiente
durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa
orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada, y el
disolvente fue evaporado. El residuo (1,8 g) fue purificado mediante
cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40
\mum) (eluyente: DCM/MeOH/NH_{4}OH 97/3/0,1;). Dos fracciones
fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando
0,85 g de F1 (aceite) y 0,25 g de F2 (rendimiento global: 63%). El
F1 fue cristalizado a partir de 2-propanona/DIPE. El
precipitado fue filtrado y fue secado, proporcionando 0,6 g del
intermedio 4, punto de fusión 110ºC.
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Fue añadido cloruro de metanosulfonilo (0,0012
mol) a 5ºC a una solución del intermedio 4 (0,0006 mol) y
trietilamina (0,0024 mol) en THF (15 ml) bajo flujo de N_{2}. La
mezcla fue llevada a temperatura ambiente, luego se agitó durante 1
hora y se vertió en agua helada. La mezcla fue extraída con DCM. La
capa orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada, y el
disolvente fue evaporado, proporcionando 0,3 g del intermedio 5.
Este producto fue usado directamente en la siguiente etapa de
reacción.
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Una mezcla del intermedio 5 (0,0006 mol),
morfolina (0,0009 mol) y carbonato de potasio (0,0018 mol) en
acetonitrilo (30 ml) fue agitada a 80ºC durante 15 horas, vertida
en agua y extraída con DCM. La capa orgánica fue separada, secada
(MgSO_{4}), filtrada, y el disolvente fue evaporado. El residuo
(0,27 g) fue purificado mediante cromatografía de columna sobre gel
de sílice (5 \mum) (eluyente: DCM/MeOH de 100/0 a 90/10). Las
fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado,
proporcionando 0,085 g (29%) del intermedio 6.
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Una mezcla del intermedio 6 (0,0002 mol) en
hidróxido de sodio 1N (1,5 ml) y THF (3 ml) fue agitada a
temperatura ambiente durante 72 horas. Fue añadido ácido
clorhídrico 1N (1,5 ml). La mezcla fue evaporada hasta sequedad,
proporcionando el intermedio 7. Este producto fue usado directamente
en la siguiente etapa de reacción.
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Una mezcla del intermedio 7 (0,0002 mol),
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0002 mol), EDC (0,0002 mol), HOBT (0,0002 mol) y trietilamina
(0,0002 mol) en DCM/THF (10 ml) fue agitada a temperatura ambiente
durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa
orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada, y el
disolvente fue evaporado. El residuo (0,095 g) fue purificado
mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (5 \mum)
(eluyente: DCM/MeOH/NH_{4}OH 97/3/0,1). Las fracciones puras
fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando
0,04 g (41%) del intermedio 8.
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Ejemplo
A3
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Fue añadido etilato de titanio (0,0085 mol) a
temperatura ambiente a una solución del éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-pirimidincarboxílico
(0,0042 mol) y
4-fenil-3-buten-2-ona
(0,0051 mol) en 1,2-dicloro-etano
(45 ml) bajo flujo de N_{2}. La mezcla fue agitada a temperatura
ambiente durante 24 horas. Fue añadido
NaBH(OAc)_{3} (0,0085 mol). La mezcla fue agitada
durante 5 horas y se vertió en agua helada. Fue añadido DCM. La
mezcla fue filtrada sobre celite. La capa orgánica fue separada,
secada (MgSO_{4}), filtrada, y el disolvente fue evaporado. El
residuo (1,16 g) fue purificado mediante cromatografía de columna
sobre kromasil (5 \mum) (eluyente: DCM/MeOH de 100/0 a 95/5). Las
fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado,
proporcionando 0,12 g (8%) del intermedio 11,
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Una mezcla del intermedio 11 (0,0003 mol) e
hidróxido de sodio (0,0013 mol) en EtOH (15 ml) fue agitada y
sometida a reflujo durante 3 horas, luego se enfrió a temperatura
ambiente y se evaporó hasta sequedad. El residuo fue llevado a éter
de dietilo. El precipitado fue filtrado y secado, proporcionando
0,12 g (100%) del intermedio 12, punto de fusión > 260ºC.
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Fueron añadidos EDC (0,0006 mol) y HOBT (0,0006
mol) a temperatura ambiente a una solución del intermedio 12
(0,0003 mol) en THF (15 ml) y DCM (15 m) bajo flujo de N_{2}. La
mezcla fue agitada durante 15 minutos. Fue añadida
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0006 mol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante
48 horas, se vertió en agua helada y se extrajo con DCM. La capa
orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada, y el
disolvente fue evaporado. El residuo (0,25 g) fue purificado
mediante cromatografía de columna sobre kromasil (5 \mum)
(eluyente: DCM/MeOH de 100/0 a 95/5). Las fracciones puras fueron
recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando 0,1 g
(70%) del intermedio 13.
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Ejemplo
A4
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Una mezcla del éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-pirimidincarboxílico
(0,059 mol) en THF (300 ml) e hidróxido de sodio 1N (300 ml) fue
dejada reposar durante la noche a temperatura ambiente y luego fue
agitada. Fue añadido ácido clorhídrico 1N (300 ml) y la mezcla fue
agitada durante 10 minutos. Fue añadido carbonato de sodio (0,178
mol) y la mezcla resultante fue agitada durante 10 minutos a
temperatura ambiente, entonces fue añadido en pequeñas partes
1-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi]-2,5-pirrolidindiona
(0,059 mol) y la mezcla de reacción fue agitada a temperatura
ambiente durante 15 horas. La mezcla fue acidificada con HCl
concentrado y el precipitado fue filtrado y secado (vac.),
proporcionando 22,5 g (90%) de intermedio 14, punto de fusión
218,5-221,2ºC.
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Fueron añadidos trietilamina (0,069 mol),
después EDC (0,0303 mol) y HOBT (0,0303 mol) seguido de
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0303 mol) a una mezcla del intermedio 14 (0,0233 mol) en DCM/THF
(500 ml) y la mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente
durante 18 horas. La mezcla fue diluida con DCM y lavada con agua.
La capa orgánica fue separada y lavada con una solución de
carbonato de sodio del 10%. La capa orgánica separada fue secada
(MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue evaporado. El residuo fue
purificado por cromatografía de columna flash (eluyente: DCM/MeOH
100/0-> 97,5/2,5 en 100 minutos). Las fracciones del producto
fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando
8,4 g (68%) del intermedio 15.
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Una mezcla del intermedio 15 (0,016 mol) en
piridina (0,040 mol) y DCM (200 ml) fue agitada durante la noche a
temperatura ambiente y la mezcla de reacción fue extraída con agua,
entonces la capa acuosa fue concentrada y fue
co-evaporada con acetonitrilo. El residuo (3,5 g)
fue purificado por cromatografía de columna flash (eluyente:
DCM/MeOH/NH_{3}) 95/5/0,5). Las fracciones del producto fueron
recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando 2,5 g
(50%) del intermedio 16, punto de fusión
70,8-93,9ºC.
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Una mezcla del intermedio 16 (0,002 mol), ácido
(E)
[2-(4-fluorofenil)etenil]-borónico
(0,002 mol) y
1,4-dioxano-2,5-diol
(0,002 mol) en EtOH (25 ml) fue agitada a temperatura ambiente
durante 15 horas, se vertió en hielo. Fue añadido NaHCO_{3}. La
mezcla fue extraída con DCM. La capa orgánica fue separada, secada
(MgSO_{4}), filtrada, y el disolvente fue evaporado. El residuo
(0,68 g) fue purificado mediante cromatografía de columna sobre
kromasil (5 \mum) (eluyente: DCM/MeOH de 100/0 a 90/10). Las
fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado,
proporcionando 0,27 g (29%) del intermedio 17, punto de fusión
90ºC.
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Ejemplo
A5
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Fueron añadidos el ácido
2-oxo-propanoico (0,0169 mol),
después el éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-pirimidincarboxílico
(0,0169 mol) a una solución de ácido
[2-(4-fluorofenil)etenil]-borónico
(0,0169 mol) en DCM (150 ml). La mezcla fue agitada a temperatura
ambiente durante 15 horas. El ácido
2-oxo-propanoico (0,4 eq) y el ácido
[2-(4-fluorofenil)etenil]-borónico
(0,1 eq) fueron añadidos. La mezcla fue agitada a temperatura
ambiente durante 15 horas. La capa orgánica fue lavada con agua,
secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue evaporado. El
residuo (7,7 g) fue purificado mediante cromatografía de columna
sobre gel de sílice (15-40 \mum) (eluyente:
DCM/MeOH/NH_{4}OH 92/8/0,1). Las fracciones puras fueron
recuperadas y el disolvente fue evaporado. Este residuo (6 g) fue
disuelto en HCl 3N. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente
durante 2 horas. El precipitado fue filtrado, lavado con agua
(mínimo) y secado, proporcionando 2,8 g (36%) del intermedio 18.
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Fueron añadidos HOBT (0,0022 mol), después EDC
(0,0022 mol) a una solución del intermedio 18 (0,0015 mol),
N-metil-metanamina (0,0022 mol) y
trietilamina (0,0075 mol) en DCM/THF (40 ml). La mezcla fue agitada
a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en agua y se
extrajo con DCM. La capa orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}),
filtrada y el disolvente fue evaporado. El residuo fue llevado a
DIPE. El precipitado fue filtrado y secado, proporcionando 0,58 g
(85%) del intermedio 19, punto de fusión 195ºC.
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Fue agitada una mezcla del intermedio 19 (0,0011
mol) e hidróxido de litio (0,0023 mol) en THF (20 ml) y agua (10
ml) a temperatura ambiente durante 15 horas. Fue añadido HCl 3N. El
THF fue evaporado. El precipitado fue filtrado, lavado con agua,
luego con éter de dietilo y secado, proporcionando 0,45 g (82%) del
intermedio 20.
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Fueron añadidos HOBT (0,0014 mol), después EDC
(0,0014 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermedio
20 (0,0009 mol),
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0014 mol) y trietilamina (0,0043 mol) en DCM/THF (50/50) (75
ml). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas,
se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica fue
separada, secada (MgSO), filtrada y el disolvente fue evaporado. El
residuo (0,7 g) fue purificado mediante cromatografía de columna
sobre gel de sílice (5 \mum) (eluyente: DCM/MeOH/NH_{4}OH de
99/1/0,1 a 94/6/0,6). Las fracciones puras fueron recuperadas y el
disolvente fue evaporado, proporcionando 0,38 g (75%) del
intermedio 21.
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Ejemplo
A6
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Fue añadido a porciones hidruro de sodio al 60%
(0,0085 mol) a 5ºC a una solución del intermedio 1 (0,0065 mol) en
THF (60 ml) bajo flujo de N_{2}. La mezcla fue agitada a 5ºC
durante 15 minutos. Una solución de yodometano (0,0078 mol) en THF
(5 ml) fue añadida gota a gota. La mezcla fue agitada a 5ºC durante
1 hora, luego fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas,
vertida en hielo y extraída con EtOAc. La capa orgánica fue
separada, secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue
evaporado. El residuo (1,75 g) fue purificado mediante
cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40
\mum) (eluyente: DCM/MeOH 99/1). Las fracciones puras fueron
recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando 0,87 g
(34%) del intermedio 22.
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Una mezcla del intermedio 22 (0,0027 mol) y
monohidrato de hidróxido de litio (0,0055 mol) en THF (40 ml) y
agua (20 ml) fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas, y
fue acidificada con HCl 1N. El THF fue evaporado. El precipitado
fue filtrado, lavado con el mínimo de agua y secado, proporcionando
0,91 g (83%) del intermedio 23.
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Fueron añadidos HOBT (0,0033 mol), después EDC
(0,0033 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermedio
23 (0,0022 mol),
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0033 mol) y trietilamina (0,01 mol) en DCM/THF (90 ml) bajo
flujo de N_{2}. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente
durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa
orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente
fue evaporado. El residuo (1,3 g) fue purificado mediante
cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40
\mum) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). Las fracciones puras
fueron recuperadas y el disolvente fue evaporado, proporcionando
0,93 g (89%) del intermedio 24.
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Ejemplo
A7
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Una mezcla de éster etílico del ácido
2-(1-piperazinil)-5-piridilcarboxílico,
(0,0085 mol),
1,4-dioxano-2,5-diol
(0,0093 mol) y ácido
(E)-[2-(4-fluorofenil)etenil]-borónico
(0,0042 mol) en EtOH (200 ml) fue agitada a temperatura ambiente
durante 15 horas, luego se filtró. El filtrado fue evaporado. El
residuo fue llevado a EtOAc. La capa orgánica fue lavada con NaCl
saturado, secada (MgSO_{4}), filtrada, y el disolvente fue
evaporado. El residuo (3,3 g) fue disuelto en dietiléter y fue
acidificado por adición gota a gota a 5ºC de HCl
5-6N en isopropanol (2 ml). El precipitado fue
filtrado, lavado con dietiléter y secado. Esta fracción fue llevada
a agua, fue añadido K_{2}CO_{3} y la mezcla fue extraída por
DCM. La capa orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}), filtrada,
y el disolvente fue evaporado, proporcionando 2,7 g (79%) del
intermedio 25.
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Una mezcla del intermedio 25 ((0,002 mol),
hidróxido de litio (0,004 mol) en agua (20 ml) y THF (40 ml) fue
agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla fue
concentrada. Fue añadido ácido clorhídrico 3N. El precipitado fue
filtrado, lavado con agua, luego con dietiléter y secado,
proporcionando 0,52 g (63%) del intermedio 26.
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Fueron añadidos trietilamina (0,0057 mol),
N'-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina
(0,0019 mol),
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(0,0019 mol) y
O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina
(0,0019 mol) a una mezcla del intermedio 26 (0,0012 mol) en una
mezcla de DCM (50 ml) y THF (50 ml). La mezcla de reacción fue
agitada durante 24 h a temperatura ambiente, luego se vertió en
H_{2}O y se extrajo por DCM. La capa orgánica fue separada,
secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue evaporado. El
residuo fue purificado mediante cromatografía de columna sobre gel
de sílice (gradiente eluyente: DCM/MeOH/NH_{4}OH 95/5/0,2). Las
fracciones del producto fueron recuperadas y el disolvente orgánico
fue evaporado proporcionando 0,55 g (91%). Este residuo fue llevado
a dietiléter, el precipitado fue filtrado y secado proporcionando
0,5 g del intermedio 27, punto de fusión 133ºC.
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Ejemplo
A8
Fue añadido gota a gota anhídrido acético (0,014
mol) a 5ºC a una mezcla del intermedio 3 (0,0014 mol),
4-N-N-dimetilaminopiridina
(0,0095 g) y piridina (2,5 ml) en DCM (14 ml). La mezcla fue
agitada a temperatura ambiente durante 24 h, fue concentrada,
llevada a agua y extraída con acetato de etilo. La capa orgánica fue
secada (MgSO_{4}), filtrada y el disolvente fue evaporado. El
residuo fue purificado mediante cromatografía de columna sobre gel
de sílice (5 \mum) (gradiente eluyente: DCM/MeOH 95/5). Las
fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente orgánico fue
evaporado proporcionando 0,48 g (58%) del intermedio 28. La sal de
oxalato fue preparada en una fracción (0,05 g) y fue cristalizada a
partir de 2-propanona/dietiléter. El precipitado fue
filtrado y secado, proporcionando 0,042 g del intermedio 29, punto
de fusión 154ºC.
La Tabla F-1 enumera en una
lista los intermedios que fueron preparados según alguno de los
anteriores Ejemplos.
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Ejemplo
B1
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Una mezcla del intermedio 3 (0,00121 mol) en TFA
(2,5 ml) y MeOH (50 ml) fue agitada durante 48 horas y luego el
disolvente fue evaporado. El residuo fue purificado mediante
cromatografía de columna sobre gel de sílice LiChroprep® NH_{2}
(25-40 \mum) (eluyente: DCM/MeOH/H_{2}O
80/20/2). Las fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente
fue evaporado. El residuo fue llevado a dietiléter y el precipitado
fue filtrado después y secado (vac.) a 50ºC, proporcionando 0,26 g
(64%) del compuesto 1, punto de fusión 187ºC.
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Ejemplo
B2
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Una mezcla del intermedio 8 (0,00007 mol) en
ácido trifluoroacético (0,2 ml) y MeOH (4,5 ml) fue agitada a
temperatura ambiente durante 96 horas. El disolvente fue evaporado
hasta sequedad. El residuo fue cristalizado a partir de
dietiléter/2-propanona. El precipitado fue filtrado
y secado, proporcionando 0,025 g (57%) del compuesto 2, punto de
fusión 135ºC.
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Ejemplo
B3
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Una mezcla del intermedio 13 (0,0002 mol) en TFA
(0,5 ml) y MeOH (10 ml) fue agitada a temperatura ambiente durante
48 horas, luego se evaporó hasta sequedad. El residuo fue
cristalizado a partir de dietiléter. El precipitado fue filtrado y
secado, proporcionando 0,044 g (44%) del compuesto 7, punto de
fusión 161ºC.
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Ejemplo
B4
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Una mezcla del intermedio 17 (0,0005 mol) en TFA
(1,2 ml) y MeOH (24 ml) fue agitada a temperatura ambiente durante
5 días. El disolvente fue evaporado hasta sequedad. El residuo (0,26
g) fue purificado mediante cromatografía de columna sobre gel de
sílice LiChroprep® NH_{2} (25-40 \mum)
(eluyente: DCM/MeOH/H_{2}O 70/30/3). Las fracciones puras fueron
recuperadas y el disolvente fue evaporado. El residuo (0,16 g) fue
cristalizado a partir de dietiléter. El precipitado fue filtrado y
secado, proporcionando 0,13 g (66%) del compuesto 8, punto de
fusión 180ºC.
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Ejemplo
B5
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Una mezcla del intermedio 28 (0,0004 mol) en TFA
(1 ml) y MeOH (20 ml) fue agitada a temperatura ambiente durante 96
horas, luego se evaporó. El residuo (0,23 g) fue purificado mediante
cromatografía de columna sobre gel de sílice LiChroprep® NH_{2}
(25-40 \mum) (eluyente: DCM/MeOH (H_{2}O
80/20/2). Las fracciones puras fueron recuperadas y el disolvente
fue evaporado. El residuo (0,106 g) fue cristalizado a partir de
dietiléter/DIPE. El precipitado fue filtrado y secado,
proporcionando 0,067 g (34%) del compuesto 9, punto de fusión
161ºC.
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Ejemplo
B6
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Fue añadido gota a gota TFA (1,9 ml) a 5ºC a una
solución del intermedio 21 (0,0007 mol) en MeOH (38 ml). La mezcla
fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas, después fue
evaporada hasta sequedad. El residuo fue cristalizado a partir de
dietiléter/CH_{3}CN. El precipitado fue filtrado, lavado con
dietiléter y secado, proporcionando 0,24 g (62%) del compuesto 10,
punto de fusión 146ºC.
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Ejemplo
B7
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Una mezcla del intermedio 24 (0,0018 mol) en TFA
(4,4 ml) y MeOH (87 ml) fue agitada a temperatura ambiente durante
4 días, luego se evaporó hasta sequedad. El residuo (1,05 g) fue
purificado mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice
LiChroprep® NH_{2} (25-40 \mum) (eluyente:
DCM/MeOH/H_{2}O 80/20/2). Las fracciones puras fueron recuperadas
y el disolvente fue evaporado. Esta fracción (0,634 g) fue llevada
a dietiléter. El precipitado fue filtrado y secado, proporcionando
0,43 g del compuesto 11, punto de fusión 212ºC.
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Ejemplo
B8
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Una mezcla del intermedio 27 (0,0011 mol) en
ácido trifluoroacético (3 ml) y MeOH (60 ml) fue agitada a
temperatura ambiente durante 48 horas. El disolvente fue evaporado
hasta sequedad. El residuo fue cristalizado a partir de dietiléter.
El precipitado fue filtrado y secado, proporcionando 0,515 g (89%)
del compuesto 31, punto de fusión 145ºC.
La Tabla F-2 enumera en una
lista los compuestos que fueron preparados según uno de los
anteriores Ejemplos. Las siguientes abreviaturas fueron usadas en
las tablas: C_{2}HF_{3}O_{2} significa sal de
trifluoroacetato.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El ensayo in vitro para la inhibición de
histona desacetilasa (véase el ejemplo C.1) mide la inhibición de
la actividad enzimática de HDAC obtenida con los compuestos de
fórmula (I).
La actividad celular de los compuestos de
fórmula (I) fue determinada en células tumorales A2780 usando un
ensayo colorimétrico para observar la toxicidad en la célula o la
supervivencia (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods
65: 55-63, 1983) (véase el ejemplo C.2).
La solubilidad de un compuesto mide la capacidad
de un compuesto de permanecer en la solución. En un primer método,
se mide la capacidad de un compuesto para permanecer en una solución
acuosa bajo dilución (véase el ejemplo C.3.a). Las soluciones madre
de DMSO son diluidas con un disolvente tampón acuoso solo en 3
etapas consecutivas. Para cada dilución la turbulencia se mide con
un nefelómetro.
En un segundo método, la solubilidad de un
compuesto a diferentes pH puede ser medida con el uso de un detector
de nitrógeno quimioluminescente (véase el ejemplo C.3.b).
La permeabilidad de un fármaco expresa su
capacidad de moverse de un medio a otro o a través de éste.
Expresamente su capacidad de moverse por la membrana intestinal en
la corriente sanguínea y/o a partir de la corriente sanguínea hacia
su objetivo. La permeabilidad (véase el ejemplo C.4) puede ser
medida por la formación de una bicapa fosfolipídica de membrana
artificial inmovilizada en un filtro. En el ensayo de la membrana
artificial inmovilizada en un filtro, se forma un "sandwich"
con una placa de microtítulo de 96 pocillos y una placa de filtro
de 96 pocillos, tal que cada compuesto se divide bien en dos cámaras
con una solución donadora en el fondo y una solución aceptadora
encima, separadas por un disco de microfiltro de 125 \mum (poros
0,45 \mum), revestido con una solución de dodecano al 2% (p/v) de
dioleoilfosfatidil-colina, bajo ciertas condiciones
en las que las bicapas multi-lamminares forman
dentro canales de filtro cuando el sistema se pone en contacto con
una solución reguladora acuosa. La permeabilidad de los compuestos
por esta membrana artificial se mide en cm/s. El objetivo es buscar
la penetración de los fármacos a través de una membrana artificial
paralela a 2 pH diferentes: 4,0 y 7,4. La detección del compuesto
se hace con espectrometría UV a una longitud de onda óptima entre
250 y 500 nm.
El metabolismo de los fármacos significa que un
compuesto endobiótico o xenobiótico soluble en lípidos es
enzimáticamente transformado en (a) metabolitos polar, soluble en
agua y excretable. El órgano principal para el metabolismo del
fármaco es el hígado. Los productos metabólicos son a menudo menos
activos que el fármaco parenteral o inactivo. Sin embargo, algunos
metabolitos pueden tener mayor actividad o efectos tóxicos. Así, el
metabolismo del fármaco puede incluir tanto procesos de
"intoxicación" como de "desintoxicación". Uno de los
sistemas enzimáticos principales que determinan la capacidad del
organismo en las transacciones con fármacos y productos químicos se
representa por las monooxigenasas citocromo P450, que son enzimas
dependientes del NADPH. La estabilidad metabólica de los compuestos
puede ser determinada in vitro con el uso de tejido humano
subcelular (véase el ejemplo C.5.a.). En este caso, la estabilidad
metabólica de los compuestos se expresa como el % del fármaco
metabolizado después de una incubación de 15 minutos de estos
compuestos con microsomas. La cuantificación de los compuestos fue
determinada por análisis LC-MS. La estabilidad
metabólica de los compuestos también puede ser determinada
calculando la semivida de los compuestos en hepatocitos de rata
(véase el ejemplo
C.5.b.).
C.5.b.).
Se ha demostrado que una amplia variedad de
agentes antitumorales activa a la proteína p21, incluyendo a agentes
perjudiciales para el ADN e inhibidores de la histona desacetilasa.
Los agentes perjudiciales del ADN activan el gen p21 a través del
supresor tumoral p53, mientras que los inhibidores de histona
desacetilasa activan transcripcionalmente el gen p21 vía el factor
de transcripción Sp1. Así, los agentes perjudiciales de ADN activan
al promotor p21 a través del elemento sensible p53 mientras que los
inhibidores de histona desacetilasa activan al promotor p21 a
través de los sitios sp1 (localizados en la región de -60 bp a +40
bp con respecto al cuadro TATA) conduciendo ambos a una mayor
expresión de la proteína p21. Cuando el promotor p21 en unas
células consiste en un fragmento promotor de 1300 bp de p21 que no
comprende elementos sensibles de p53 no es, en consecuencia,
sensible a los agentes perjudiciales del ADN. La capacidad de los
compuestos para inducir p21 puede ser evaluada de varios modos. Un
primer método es tratar a las células tumorales con el compuesto de
interés y después de la lisis de las células detectar la inducción
de p21 con ensayo inmunoabsorbente unido a enzima p21 (ELISA WAF1
de Oncogene). El ensayo de p21 es un inmunoensayo enzimático tipo
"sandwich" que emplea tanto anticuerpos monoclónicos de ratón
como policlónicos de conejo. Un anticuerpo policlónico de conejo,
específico para la proteína p21 humana, ha sido inmovilizado en la
superficie de pocillos de plástico proporcionados en el kit.
Cualquier p21 presente en la muestra que se analiza se unirá al
anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclónico detector
biotinilado también reconoce a la proteína p21 humana, y se unirá a
cualquier p21, que haya sido retenida por el anticuerpo de captura.
El anticuerpo detector, por su parte, se une mediante la
estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante. La
peroxidasa de rábano picante cataliza la conversión del sustrato
cromogénico tetra-metilbenzidina desde una solución
incolora a una solución azul (o amarilla después de la adición del
reactivo de parada), cuya intensidad es proporcional al total de la
proteína p21 unida a la placa. El producto de reacción coloreado se
cuantifica usando un espectrofotómetro. La cuantificación se logra
por la construcción de una curva estándar usando concentraciones
conocidas de p21 (proporcionadas por el liofilizado). Este ensayo
puede medir la inducción de p21 como consecuencia del daño al ADN o
como consecuencia de la inhibición de la histona desacetilasa
(véase el ejemplo C.6.a.).
Otro método prueba la capacidad de los
compuestos para inducir p21 como consecuencia de la inhibición de
HDAC a nivel celular. Las células pueden ser establemente
transfectadas con un vector de expresión que contiene un fragmento
promotor de 1300bp de p21 que no comprende los elementos sensibles a
p53 y en el que el aumento de la expresión del gen reportero,
comparado con los niveles de control, identifica si el compuesto
tiene capacidad de inducción con p21. El gen reportero es una
proteína fluorescente y la expresión del gen reportero se mide como
la cantidad de luz de neón emitida (véase el ejemplo C.6.b.). El
último método es un método in vivo en el que los ratones son
usados para rastrear la actividad farmacéutica de un compuesto. Las
anteriormente descritas células tumorales establemente transformadas
pueden ser administradas a ratones en una cantidad suficiente para
forzar la producción de un tumor. Después de que las células
tumorales tengan el tiempo suficiente para formar un tumor, puede
ser administrado un compuesto potencialmente activo a los animales
y evaluar el efecto de dicho compuesto en las células tumorales
midiendo la expresión del gen reportero. La incubación con
compuestos activos farmacéuticos causará un aumento en la expresión
del gen reportero comparado con los niveles control (véase el
ejemplo
C.6.c.).
C.6.c.).
Los inhibidores de HDAC específicos no deben
inhibir a otras enzimas como las abundantes proteínas CYP P450. Las
proteínas CYP P450 (expresadas en E. coli) 3A4, 2D6 en 2C9
convierten sus sustratos específicos en una molécula fluorescente.
La proteína CYP3A4 convierte al
7-benciloxi-trifluorometil-coumarin
(BFC) en
7-hidroxi-trifluorometil-coumarin.
La proteína CYP2D6 convierte a
3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil-7-metoxi-4-metilcoumarin
(AMMC) en hidrocloruro de
3-[2-(N,N-dietilamino)etil-7-hidroxi-4-metilcoumarin
y la proteína CYP2C9 convierte
7-metoxi-4-trifluorometil-coumarin
(MFC) en
7-hidroxi-trifluorometil-coumarin.
Los compuestos que inhiben la reacción enzimática causarán una
disminución de la señal fluorescente (véase el ejemplo C.7).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.1
Se usó el ensayo de actividad fluorescente de
HDAC/kit de detección de fármacos de Biomol (Nº. de cat.
AK-500-0001). El ensayo de
actividad fluorescente de HDAC está basado en el sustrato "Fluor
de Lys" (abreviatura de "Fluorogenic Histone
deAcetilase Lysyl") y la combinación del revelador.
El sustrato Fluor de Lys comprende una cadena lateral de lisina
acetilada. La desacetilación del sustrato sensibiliza al sustrato de
modo que, en la segundo etapa, el tratamiento con el revelador
Fluor de Lys produzca un fluoróforo.
Se incubaron extractos nucleares de HeLa
(proveedor: Biomol) a 60 \mug/ml con 75 \muM de sustrato. El
sustrato Fluor de Lys fue añadido en un tampón que contenía Tris 25
mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM y MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 1 mM a pH
7,4. Después de 30 minutos, fue añadido 1 volumen del revelador. El
fluoróforo fue excitado con luz a 355 nm y la luz emitida (450 nm)
se detectó en un lector de placas fluorométrico. Para cada
experimento, fueron realizados en paralelo los controles (que
contenían extracto nuclear de HeLa y tampón), una incubación en
blanco (que contenía el tampón pero ningún extracto nuclear de HeLa)
y las muestras (que contenían el compuesto disuelto en DMSO y más
diluido en tampón y extracto nuclear HeLa). En el primer caso, los
compuestos fueron probados a una concentración de 10^{-5} M.
Cuando los compuestos mostraron actividad a 10^{-5}M, se realizó
una curva respuesta frente a la concentración en la que los
compuestos fueron probados a concentraciones entre 10^{-5} M y
10^{-9} M. Toda la muestra fue probada 4 veces. En cada prueba, el
valor en blanco fue sustraído tanto del control como de los valores
de la muestra. La muestra control representaba el 100% de la
desacetilatión del sustrato. Para cada muestra, la fluorescencia
fue expresada como un porcentaje del valor medio de los controles.
Cuando se obtuvieron los valores de IC_{50} apropiados (la
concentración del fármaco, tenía que reducir la cantidad de
metabolitos al 50% del control) estos fueron calculados usando el
análisis de protrozos para los datos clasificados. En este
documento, los efectos de los compuestos de prueba son expresados
como pIC_{50} (valor del log negativo del valor de IC_{50})
(véase la Tabla
F-3).
F-3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.2
Todos los compuestos probados fueron disueltos
en DMSO y fueron hechas otras diluciones en el medio de cultivo.
Las concentraciones de DMSO finales nunca excedieron el 0,1% (v/v)
en los ensayos de proliferación de células. Los controles contenían
células A2780 y DMSO sin compuesto y los blancos contenían DMSO,
pero ninguna célula. Fue disuelto MTT en 5 mg/ml en PBS. Fue
preparado un tampón de glicina que comprendía glicina 0,1 M y NaCl
0,1 M almacenado en un tampón a pH 10,5 con NaOH (1 N) (todos los
reactivo eran de Merck).
Fueron cultivadas células de carcinoma ovárico
humanas A2780 (por amabilidad del doctor T. C. Hamilton [Fox Chase
Cancer Centre, Pensilvania, EE.UU.) en medio RPMI 1640 suplementado
con L-glutamina 2 mM, gentamicina a 50 \mug/ml y
suero de ternero fetal al 10%.
Las células fueron rutinariamente mantenidas
como cultivos en monocapas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al
5% humedecida. Las células fueron repasadas una vez por semana
usando una solución de tripsina/EDTA en una proporción divisoria
1:40. Todos los medios y los suplementos fueron obtenidos de Life
Technologies. Las células estaban sin ninguna contaminación de
micoplasma como se determina usando el kit Gen-Probe
Mycoplasma Tissue Culture (proveedor: BioMerieux).
Las células fueron sembradas en placas de 96
pocillos de cultivo de NUNCTM (Proveedor: Life Technologies) y se
les permitió adherirse al plástico durante la noche. Las densidades
usadas para la puesta en placa era 1500 células por pocillo en un
volumen total de 200 \mul de medio. Después de la adherencia de
las células a las placas, el medio fue cambiado y los fármacos y/o
los disolventes fueron añadidos a un volumen final de 200 \mul. A
los cuatro días siguientes de la incubación, el medio fue sustituido
por 200 \mul de medio recién preparado y la densidad de las
células y la viabilidad fue evaluada usando un ensayo MTT. A cada
pocillo, fueron añadidos 25 \mul de solución MTM y las células
fueron incubadas durante 2 horas más a 37ºC. El medio fue aspirado
con cuidado después y el producto MTT-formazan azul
fue solubilizado por la adición de 25 \mul de tampón de glicina
seguido de 100 \mul de DMSO. Las placas de microprueba fueron
agitadas durante 10 minutos en un agitador de microplacas y fue
medida la absorbancia a 540 nm usando un espectrofotómetro de 96
pocillos Emax (Proveedor: Sopachem). En cada experimento, los
resultados para cada condición experimental son la media de 3
pocillos repetidos. Para el rastreo inicial, los compuestos fueron
probados a una concentración fija única de 10^{-6} M. Para los
compuestos activos, los experimentos fueron repetidos para
establecer las completas curvas respuesta frente a la
concentración. Para cada experimento, los controles (que no
contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (que no
contenía ninguna célula o fármaco) fueron realizados en paralelo.
El valor del blanco fue restado de todos los valores de control y
muestra. Para cada muestra, el valor medio para el crecimiento de
las células (en unidades de absorbancia) fue expresado como el
porcentaje del valor medio para el crecimiento de las células del
control. Cuando era apropiado, los valores de IC_{50} (la
concentración del fármaco tenía que reducir el crecimiento de las
células en un 50% del control) fueron calculados usando el análisis
de protrozos para los datos clasificados (Finney, D. J., Probit
Analyses, 2ª Ed. Capítulo 10, "Graded Responses",
Cambridge University Press, Cambridge 1962). En este documento, los
efectos de los compuestos de prueba son expresados como pIC_{50}
(el valor del log negativo del valor de IC_{50}) (véase la Tabla
F-3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.3
En el primer paso de dilución, 10 \mul de una
solución madre concentrada del compuesto activo, solubilizada en
DMSO (5 mM) fueron añadidos a 100 \mul de tampón de citrato de
fosfato, pH 7,4, y fueron mezclados. En el segundo paso de
dilución, una alícuota (20 \mul) del primer paso de dilución fue
dispensada además en 100 \mul de tampón de citrato de fosfato, pH
7,4, y fue mezclado. Finalmente, en el tercer paso de dilución, una
muestra (20 \mul) del segundo paso de dilución fue diluida además
en 100 \mul de tampón de citrato de fosfato, pH 7,4, y fue
mezclado. Todas las diluciones fueron realizadas en placas de 96
pocillos. Inmediatamente después del último paso de dilución, la
turbulencia de los tres pasos de dilución consecutivos fueron
medidas con un nefelómetro. Fue hecha una dilución por triplicado
para cada compuesto para excluir los errores ocasionales. Según las
medidas de turbulencia, se realizó una clasificación en 3 clases.
Los compuestos con solubilidad alta obtuvieron un resultado de 3 y
para estos compuestos la primera dilución era clara. Los compuestos
con una solubilidad media obtuvieron un resultado de 2. Para estos
compuestos la primera dilución no era clara y la segunda dilución
era clara. Los compuestos con solubilidad baja obtuvieron un
resultado de 1 y para estos compuestos tanto la primera como la
segunda dilución no eran claras (véase la Tabla
F-3).
F-3).
\vskip1.000000\baselineskip
La solubilidad de un compuesto, a pH diferente,
también puede ser medida con el uso de un detector de nitrógeno
quimioluminescente (véase la Tabla F-3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.4
Fueron diluidas las muestras madre (alícuotas de
10 \mul de una solución madre 5 mM en DMSO al 100%) en una placa
de pocillos profundos o placa de premezcla que contenía 2 ml de un
sistema tampón acuoso a pH 4 o pH 7,4 (Concentrado de Solución del
Sistema de PSR4 (pION)). Antes de que las muestras fueran añadidas a
la placa de referencia, fueron añadidos a los pocillos 150 \mul
del tampón y fue realizada una medida UV del blanco. A partir de
entonces, el tampón fue desechado y la placa fue usada como placa de
referencia. Todas las medidas fueron hechas en placas resistentes a
UV (proveedor: Costar o Greiner).
Después de la medida del blanco de la placa de
referencia, fueron añadidos a la placa de referencia 150 \mul de
las muestras diluidas y fueron añadidos a la placa donadora 1200
\mul de las muestras diluidas. Una placa de filtro aceptadora I
(proveedor: Millipore, tipo:MAIP N45) fue revestida de 4 \mul de
la solución artificial formadora de membrana
(1,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-Fosfocolina
en Dodecano conteniendo
2,6-Di-terc-butil-4-metilfenol
al 0,1% y fue colocada encima de la placa donadora 1 para formar un
"sandwich". El tampón (200 \mul) fue dispensado en los
pocillos aceptadores en la parte superior. El sandwich fue cubierto
con una tapa y fue almacenado durante 18 h a temperatura ambiente
en oscuridad.
Una medida en blanco de la placa aceptadora 2
fue realizada por la adición de 150 \mul de tampón a los pocillos,
seguido de una medida UV. Después de la medida en blanco de la
placa aceptadora 2, el tampón fue desechado y 150 \mul de la
solución aceptadora fueron transferidos de la placa de filtro
aceptadora I a la placa aceptadora 2. Después, la placa de filtro
aceptadora I fue retirada del sandwich. Después de la medida del
blanco de la placa donadora 2 (véase más arriba), 150 \mul de la
solución donadora fueron transferidos de la placa donadora 1 a la
placa donadora 2. Los espectros UV de la placa donadora 2, placa
aceptadora 2 y los pocillos de placa de referencia fueron
explorados (con un SpectraMAX 190). Todos los espectros fueron
tratados para calcular la permeabilidad con el Software PSR4p
Command. Todos los compuestos fueron medidos por triplicado. Se
usaron carbamazepina, griseofulvin, acicloguanisina, atenolol,
furosemida y clorotiazida como estándares en cada experimento. Los
compuestos fueron clasificados en 3 categorías por tener una
permeabilidad baja (efecto medio < 0,5 x 10^{-6} cm/s;
puntuación 1), una permeabilidad media (1 x 10^{-6} cm/s>
efecto medio
\hbox{> 0,5 x 10 ^{-6} cm/s; puntuación 2) o
una permeabilidad alta (> 1 x 10 ^{-6} cm/s; puntuación
3).}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.5
Ejemplo
C.5.a.
Se hicieron preparaciones de tejido subcelulares
según Gorrod et al. (Xenobiotica 5:
453-462, 1975) por separación centrífuga después de
una homogeneización mecánica del tejido. El tejido hepático fue
aclarado en tampón Tris-HCI 0,1 M helado (pH 7,4)
para lavar la sangre en exceso. El tejido fue entonces secado,
transferido, pesado y cortado groseramente con tijeras quirúrgicas.
Los pedazos de tejido fueron homogeneizados en 3 volúmenes de
tampón fosfato 0,1 M helado (pH 7,4) usando o bien un
Potter-S (Braun, Italia) equipado con una manivela
de Teflón o bien un homogeneizador Omni-mix de
Sorvall, durante 7 x 10 segundos. En ambos casos, el matraz fue
mantenido en hielo durante el proceso de homogeneización.
Los homogenados de tejido se centrifugaron a
9000 x g durante 20 minutos a 4ºC usando una centrifugadora Sorvall
o Ultracentrifugadora Beckman. El sobrenadante resultante fue
almacenado a -80ºC y se denominó "S9".
La fracción S9 puede ser centrifugada más a
100,000 x g durante 60 minutos (4ºC) usando una ultracentrifugadora
Beckman. El sobrenadante resultante fue aspirado con cuidado,
dividido en alícuotas y fue denominado "citosol". El pelete
fue suspendido de nuevo en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) en un
volumen final de 1 ml por 0,5 g de peso de tejido original y fue
denominado "microsomas".
Todas las fracciones subcelulares fueron
divididas en alícuotas, fueron inmediatamente congeladas en
nitrógeno líquido y almacenadas a -80ºC hasta su uso.
Para las muestras que se probaron, la mezcla de
incubación contenía PBS (0,1M), compuesto (5 \muM), microsomas (1
mg/ml) y un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 0,8 mM, cloruro
de magnesio 0,8 mM y 0,8 unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa).
Las muestras de control contenían el mismo material pero los
microsomas fueron sustituidos por microsomas inactivados con calor
(10 minutos a 95 grados Celsius). La recuperación de los compuestos
en las muestras de control era siempre del 100%.
Las mezclas fueron preincubadas durante 5
minutos a 37 grados Celsius. La reacción fue comenzada en el punto
de tiempo cero (t=0) por la adición de NADP 0,8 mM y las muestras
fueron incubadas durante 15 minutos (t=15). La reacción fue
terminada por la adición de 2 volúmenes de DMSO. Entonces, las
muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 900 x g y los
sobrenadantes fueron almacenados a temperatura ambiente durante no
más de 24 h antes del análisis. Todas las incubaciones fueron
realizadas por duplicado. El análisis de los sobrenadantes fue
realizado con análisis LC-MS. La elución de las
muestras fue realizada en MS C18 de Xterra (50 x 4,6 mm, 5 \mum,
Waters, EE.UU). Fue usado un sistema HPLC 2790 de Alliance
(Proveedor: Waters, EE.UU.). La elución se realizó con tampón A
(acetato de amonio 25 mM (pH 5,2) en H_{2}O/acetonitrilo (95/5)),
siendo el disolvente B acetonitrilo y el disolvente C metanol a un
caudal de 2,4 ml/min. El gradiente empleado aumentaba la
concentración de la fase orgánica desde 0% a más del 50% de B y al
50% de C en 5 minutos hasta el 100% de B en 1 minuto de modo lineal
y la concentración de la fase orgánica fue mantenida estacionaria
durante 1,5 minutos más. El volumen de inyección total de las
muestras fue 25 \mul.
Un espectrómetro de masas con triple quadrupolo
de Quattro (proveedor: Micromass, Manchester, Reino Unido) ajustado
y una fuente ESI fue usada como detector. La fuente y la temperatura
de desolvatación fueron puestas a 120 y 350ºC, respectivamente y
fue usado nitrógeno como nebulizador y gas secante. Los datos fueron
adquiridos en el modo de exploración positivo (reacción de ión
única). El voltaje del cono fue puesto a 10 V y el tiempo de espera
era 1 segundo.
La estabilidad metabólica fue expresada como el
% de metabolismo del compuesto después de 15 minutos de incubación
en presencia de microsomas activados (E (act)) (% de metabolismo =
100% - ((corriente iónica total (TIC) x E(act) x a t = 15
)/TIC de E (act) a t = 0) x 100). Los compuestos que tenían un
porcentaje de metabolismo menor del 20% fueron definidos como
metabólicos muy estables. El compuesto que tenía un metabolismo
entre el 20 y el 70% fue definido como intermediamente estable y
los compuestos que mostraron un porcentaje de metabolismo más alto
que 70 fueron definidos como metabólicos poco estables. Siempre eran
incluidos tres compuestos de referencia cuando se realizaba una
proyección de estabilidad metabólica. El Verapamil fue incluido como
un compuesto con una estabilidad metabólica baja (%
metabolismo=73%). La Cisaprida fue incluida como un compuesto con
una estabilidad metabólica media (% metabolismo = 45%) y el propanol
fue incluido como un compuesto con una estabilidad metabólica de
intermedia a alta (metabolismo del 25%). Estos compuestos de
referencia fueron usados para validar el ensayo de estabilidad
metabólica.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron aislados hepatocitos a partir de ratas
macho Sprague Dowley. Los compuestos fueron disueltos en una
solución madre 5 mM en DMSO al 100% y fueron incubados a una
concentración final de 5 \muM durante 0, 15, 30, 60 y 120 minutos
con cultivos de hepatocitos de rata (0,5 millones de células
viables/0,5 ml) usando placas de 24 pocillos.
Las muestras fueron preparadas para el análisis
LC-MS por la adición de dos volúmenes de DMSO. Las
muestras fueron agitadas a fondo y posteriormente fueron
centrifugadas a 900 g durante 10 minutos (temperatura ambiente).
Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Del
sobrenadante resultante, fueron analizados 50 \mul por
LC-MS.
Para LC-MS, la elución de las
muestras fue realizada en una columna BDS C18 de Hypersil (50 x 4,6
mm, 5 \mum, Thermohypersil, Reino Unido). El sistema HPLC
comprendió un sistema de administración de Surveyor (Surveyor Inc,
San José, EE.UU.) equipado con un dispositivo de automuestreo de
Surveyor. La elución se realizó con tampón A (acetato de amonio 10
mM (pH 6,9) en H_{2}O/Acetonitrilo (95:5)) y disolvente B
(acetonitrilo) a un caudal de 1,2 ml/min. El gradiente empleado fue
de 0,5 minutos de disolvente A como condición de partida seguido
por el aumento de la concentración de la fase orgánica del 0% de B
hasta el 95% de B más de 2 minutos de una manera lineal. Esta fase
fue mantenida estacionaria durante 2 minutos más y se redujo otra
vez al 0% de B a los 0,5
minutos.
minutos.
El volumen de inyección total de las muestras
era 50 \mul. La temperatura de la estufa de la columna fue
mantenida a 40ºC. El flujo de LC fue separado para la detección de
MS y 0,1 ml entraron a la fuente. Un espectrómetro de masas,
espectrómetro de masas de cuadripolo triple TSQ Quantum
(Thermofinnigan, La Jolla, EE.UU.), ajustado a una fuente ESI fue
usado para la detección. El voltaje de la fuente fue puesto a 3800
voltios, la temperatura capilar a 300ºC. El espectrómetro de masas
se hizo funcionar en el modo de ión positivo en SIM ajustado a la
masa de M+H con un rango de exploración de 1 Da con fines de
detección. El control del instrumento, la adquisición de los datos
y el procesamiento fueron realizados usando el software Xcalibur
(ThermoFinnigan, San José, California., EE.UU.). La estabilidad
metabólica de los compuestos en los hepatocitos de rata fue
expresada como semividas in vitro.
Como referencia, fue usado el compuesto R306465
(documento WO03/76422) (semivida in vitro: 8 minutos).
El compuesto 4 de la presente aplicación fue
probado y tenía una semivida in vitro de 23 minutos.
\newpage
Ejemplo
C.6
Ejemplo
C.6.a
El siguiente protocolo se ha aplicado para
determinar el nivel de expresión de la proteína p21 en células de
carcinoma ovárico humano A2780. Las células A2780 (20000 células/180
\mul) fueron sembradas en placas de 96 micropocillos en medio
RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50
\mug/ml de gentamicina y suero de ternero fetal al 10%. 24 horas
antes de la lisis de las células, los compuestos fueron añadidos a
las concentraciones finales de 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y
10^{-8} M. Todos los compuestos probados fueron disueltos en DMSO
y fueron hechas diluciones adicionales en el medio de cultivo. 24
horas después de la adición del compuesto, los sobrenadantes fueron
retirados de las células. Las células fueron lavadas con 200 \mul
de PBS helado. Los pocillos fueron aspirados y fueron añadidos 30
\mul de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 7,6),
NaCl 150 mM, Nonidet p40 al 1% y glicerol al 10%). Las placas fueron
incubadas durante toda la noche a -70ºC.
El número apropiado de pocillos de microtítulo
fue quitado de la bolsa de papel metalizado y fueron colocados en
un sostenedor de pocillos al vacío. Se preparó una solución de
trabajo (1 x), del tampón de lavado (20 x concentrado de lavado de
placa: solución concentrada de 100 ml 20 veces de PBS y tensioactivo
(contiene cloroacetamida al 2%). El p21WAF liofilizado estándar fue
reconstituido con H_{2}O destilada y después fue diluido con
diluyente de muestra (proporcionado en el kit).
Las muestras se prepararon diluyéndolas 1:4 en
diluyente de muestra. Las muestras (100 \mul) y los estándares
p21WAF1 (100 \mul) se pipetearon en los pocillos apropiados y se
incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocillos
fueron lavados 3 veces con 1 x tampón de lavado y luego fueron
pipeteados en cada pocillo 100 \mul del reactivo del anticuerpo
detector (una solución del anticuerpo monoclónico p21WAF1
biotinilado). Los pocillos fueron incubados a temperatura ambiente
durante 1 hora y luego fueron lavados tres veces con 1 x tampón de
lavado. El conjugado 400 x (conjugado de peroxidasa y
estreptavidina:solución concentrada 400 veces) fue diluido y fueron
añadidos a los pocillos 100 \mul de la solución 1 x. Los pocillos
fueron incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego
fueron lavados 3 veces con 1 x tampón de lavado y 1 vez con
H_{2}O destilada. La solución de sustrato (sustrato cromogénico)
(100 \mul) fue añadida a los pocillos y los pocillos fueron
incubados durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
La solución de parada fue añadida a cada pocillo en el mismo orden
que la solución de sustrato antes añadida. La absorbancia en cada
pocillo fue medida usando un lector de placas espectrofotométrico a
longitudes de onda duales de 450/595 nm.
Para cada experimento, los controles (que no
contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (que no
contenía ninguna célula o fármaco) fueron realizados en paralelo. El
valor en blanco fue sustraído de todos los valores del control y de
la muestra. Para cada muestra, el valor para la inducción de p21WAF1
(en unidades de absorbancia) fue expresado como el porcentaje del
valor para el p21WAF1 presente en el control. Un porcentaje de
inducción más alto que el 130% fue definido como una inducción
significativa. Cuatro compuestos fueron probados y todos mostraron
una inducción significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.6.b.
Fueron cultivadas células A2780 (ATCC) en medio
RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2
mM y gentamicina a 37ºC en una incubadora humedecida con CO_{2}
al 5%. Todas las soluciones del cultivo celular son proporcionadas
por Gibco-BRL (Gaithersburg, Md.). Otros materiales
fueron proporcionados por Nunc.
El ADN genómico fue extraído de células A2780
proliferantes y fue usado como plantilla para el aislamiento por
PCR anidada del promotor p21. La primera amplificación fue realizada
durante 20 ciclos a una temperatura de hibridación de 55ºC usando
el par de oligonucleótidos GAGGGCGCGGTGCTTGG y TGCCGCCGCTCTCT
CACC con ADN genómico como plantilla. El fragmento de 4,5 kilobytes que resulta y que contiene los fragmentos de -4551 a +88 con relación al cuadro TATA fue amplificado de nuevo con los oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 4,5 kilobytes y posteriormente con el par de oligonucleótidos TCGGGTACCGGTA
GATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 1,3 kilobytes que contiene el fragmento de -1300 a +88 con relación al cuadro TATA. Los sitios de restricción XhoI y KpnI presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) fueron usados para la subclonación.
CACC con ADN genómico como plantilla. El fragmento de 4,5 kilobytes que resulta y que contiene los fragmentos de -4551 a +88 con relación al cuadro TATA fue amplificado de nuevo con los oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 4,5 kilobytes y posteriormente con el par de oligonucleótidos TCGGGTACCGGTA
GATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 1,3 kilobytes que contiene el fragmento de -1300 a +88 con relación al cuadro TATA. Los sitios de restricción XhoI y KpnI presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) fueron usados para la subclonación.
El reportero de luciferasa fue quitado del
pGL3-básico y fue sustituido por el reportero
ZsGreen (a partir del plásmido pZsGreen1-N1) en los
sitios de restricción KpnI y XbaI. El
pGL3-básico-ZsGreen-1300
fue construido vía la introducción del fragmento de 1,3 kilobytes
arriba mencionado de la región promotora p21 humana en
pGL3-basic-ZsGreen en los sitios
XhoI y KpnI. Todas las enzimas de restricción son proporcionadas por
Boehringer Manheim (Alemania). Las células A2780 fueron puestas en
placas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10^{5}
células, incubadas durante 24 horas, y transfectadas con 2 \mug de
pGL3-basic-ZsGreen-1300
y 0,2 \mug del vector pSV2neo usando Lipofectamina 2000
(Invitrogen, Bruselas, Bélgica) como se describe por el fabricante.
Las células transfectadas fueron seleccionadas durante 10 días con
G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.) y fueron
cultivadas suspensiones de células solas. Después de tres semanas,
fueron obtenidos clones individuales.
Los clones seleccionados de A2780 fueron
ampliados y sembrados a 10000 células por pocillo en placas de 96
pocillos. 24 horas después de la siembra, las células fueron
tratadas durante unas 24 horas adicionales con los compuestos (que
afectan a los sitios sp1 en la región promotora proximal p21).
Posteriormente, las células fueron fijadas con PFA al 4% durante
30' y fueron contrateñidas con tinte de Hoechst. La activación del
promotor p21 que conduce a la producción de ZsGreen y así a la
generación de fluorescencia, fue supervisada por Ascent Fluoroskan
(Thermo Labsystems, Bruselas, Bélgica).
Para cada experimento, los controles (que no
contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (que no
contenía ninguna célula o fármaco) fueron realizados en paralelo. El
valor en blanco fue sustraído de todos los valores de control y
muestra. Para cada muestra, el valor para la inducción de p21 fue
expresado como el porcentaje del valor para el p21 presente en el
control. Un porcentaje de inducción más alto que el 130% fue
definido como una inducción significativa.
Veintiséis compuestos fueron probados y
mostraron una inducción significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.6.c
Un clon seleccionado fue inyectado vía
subcutánea (10^{7} células/200 \mul) en el flanco de ratones
desnudos y fue obtenido un tumor mensurable con pinza después de 12
días. A partir del día 12, los animales fueron medicados, oralmente
o intravenalmente, diariamente durante 6 días con el disolvente y el
compuesto 20-40 de mpk (4-10
animales cada uno). Los tumores fueron evaluados por fluorescencia
por el Sistema de Representación de Cuerpo Entero Automatizado
desarrollado en el laboratorio de los inventores (estereomicroscopio
fluorescente tipo Olimpo® SZX12 equipado con un filtro de GFP y
conectado a una cámara CCD tipo JAI®. El CV-M90
controlado por un paquete de software basado en el Software de
Visión IMAQ de National Instruments®). Como referencia, fue usado
el compuesto R306465 (documento WO03/76422). Los compuestos fueron
clasificados como inactivos (ninguna fluorescencia mensurable), más
débil, idéntica o mejor que R306465. El compuesto 1 fue probado y
era mejor que R306465 después de la administración oral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C.7
Todos los compuestos probados fueron disueltos
en DMSO (5 mM) y se hizo una dilución adicional a 5 x 10^{-4} M
en acetonitrilo. Otras diluciones fueron hechas en tampón de ensayo
(tampón fosfato NaK 0,1M, pH 7,4) y la concentración del disolvente
final nunca fue más alta que el 2%.
El ensayo para la proteína CYP3A4 comprende por
pocillo 15 pmol de P450/mg de proteína (en tampón fosfato NaK 0,01M
+ KCl al 1,15%), un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 3,3 m; en
tampón de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de
100 \mul. Después de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la
reacción enzimática fue comenzada con la adición de 150 \muM del
sustrato sonda fluoresente BFC en tampón de ensayo. Después de una
incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción fue
terminada después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las
determinaciones fluorescentes fueron realizadas a una longitud de
onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de
535 nm. El Ketoconazol (valos IC_{50} = 3 x 10^{-8} M) fue
incluido como el compuesto de referencia en este experimento. El
ensayo para la proteína CYP2D6 comprende por pocillo 6 pmol de
P450/mg de proteína (en tampón fosfato NaK 0,01M + KCl al 1,15%),
un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 0,41 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
NADP 0,0082 mM y MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,41 mM en tampón de
ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100 \mul.
Después de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la reacción
enzimática fue comenzada con la adición de 3 \muM del sustrato
sonda fluorescente AMMC en tampón de ensayo. Después de una
incubación de 45 minutos a temperatura ambiente la reacción fue
terminada después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las
determinaciones fluorescentes fueron realizadas a una longitud de
onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de
460 nm. La Quinidina (valor IC_{50} < 5 x 10^{-8}M) fue
incluida como el compuesto de referencia en este experimento.
El ensayo para la proteína CYP2C9 comprende por
pocillo 15 pmol de P450/mg de proteína (en en tampón fosfato NaK
0,01M + KCl al 1,15%), un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 3,3 mM en
tampón de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de
100 \mul. Después de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la
reacción enzimática fue comenzada con la adición de 200 \muM del
sustrato sonda fluorescente MFC en tampón de ensayo. Después de una
incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción fue
terminada después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las
determinaciones fluorescentes fueron realizadas a una longitud de
onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de
535 nm. El Sulfafenazol (valor IC_{50} = 6,8 x 10^{-7}M) fue
incluido como el compuesto de referencia en este experimento.
Con fines de rastreo inicial, los compuestos
fueron probados a una concentración fija única de 1 x 10^{-5} M.
Para los compuestos activos, los experimentos fueron repetidos para
establecer las curvas respuesta completa frente a la concentración.
Para cada experimento, los controles (que no contenían ningún
fármaco) y una incubación en blanco (que no contenía ninguna enzima
o fármaco) fueron realizados en paralelo. Todos los compuestos
fueron analizado por cuadruplicado. El valor en blanco fue restado
de todos los valores de control y muestra. Para cada muestra, el
valor medio de la actividad de P450 de la muestra (en unidades de
fluorescencia relativas) fue expresado como el porcentaje del valor
medio de la actividad de P450 del control. El porcentaje de
inhibición fue expresado como el 100% menos el valor medio de la
actividad de P450 de la muestra. Cuando fue apropiado, fueron
calculados los valores de IC_{50} (la concentración del fármaco
tenía que reducir la actividad de P450 al 50% del control).
La Tabla F-3 muestra en una
lista los resultados de los compuestos que fueron probados según el
ejemplo C.1, C.2, C.3.a. y C.3.b
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 100 g de un compuesto de fórmula
(I), 570 g de lactosa y 200 g de almidón se mezcla bien y a partir
de entonces se humedece con una solución de dodecilsulfato de sodio
de 5 g y 10 g de polivinil-pirrolidona en
aproximadamente 200 ml de agua. La mezcla en polvo mojada se tamiza,
se seca y se tamiza otra vez, Entonces se añaden 100 g de celulosa
microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Se mezcla todo
bien y se prensa como comprimidos, dando 10,000 comprimidos,
comprendiendo cada uno 10 mg de un compuesto de fórmula (I).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 10 g de metilcelulosa en 75 ml
de etanol desnaturalizado se añade una solución de 5 g de
etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Entonces se añaden 75 ml de
diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3-propanotriol, 10 g
de polietilenglicol son fundidos y disueltos en 75 ml de
diclorometano. La solución última se añade a la primera y luego se
añaden 2,5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de
polivinilpirrolidona y 30 ml de suspensión de color concentrada y
todo se homogeneiza. Los núcleos del comprimido se revisten con la
mezcla así obtenida en un aparato de revestimiento.
Claims (12)
1. Un compuesto de fórmula (I),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas
estereoquímicas, en el
que
cada X es independientemente N o CH;
R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo;
en el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6}, arilo,
hidroxi, ciano, amino, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-sulfonilamino,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxialquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oximetilo, aminometilo,
alquil C_{1-6}-aminometilo,
alquil
C_{1-6}-carbonilaminometilo,
alquil
C_{1-6}-sulfonilaminometilo,
aminosulfonilo, alquil
C_{1-6}-aminosulfonilo o
heterociclilo;
R^{2} es hidrógeno,
-CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo,
-C(=O)-R^{6}, o
-CH_{2}-NR^{7}R^{8}; en el que
cada R^{5} se selecciona independientemente
entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi, piperazinilo,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,
imidazolilo o triazolilo;
cada R^{6} se selecciona independientemente
entre hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi,
amino o mono- o di-(alquil C_{1-6}) amino,
cicloalquil C_{1-6}-amino,
hidroxialquil C_{1-6}-amino,
piperazinilo, mono- o di-(alquil C_{1-6})
amino-alquil
C_{1-6}-amino
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o
tiomorfolinilo;
cada R^{7} y R^{8} se seleccionan
independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-carbonilo, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-4})-aminosulfonilo;
R^{3} es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo
o mono- o di-(alquil C_{1-6}) aminometilo;
R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6};
arilo es fenilo o naftalenilo; en el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
ciano o hidroxicarbonilo; y
heterociclilo es furanilo, tienilo, pirrolilo,
pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo,
imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo,
pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo,
oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo,
piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo,
piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo,
tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo,
benzotiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo,
purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftlazinilo,
quinazolinilo, quinoxalinilo o naftiridinilo; en el que
cada uno de dichos heterociclos está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, ciano, amino, mono- o
di-(alquil C_{1-4})-amino.
2. Un compuesto según la reivindicación 1 en el
que:
cada X es N; R^{1} es fenilo o fenilo
opcionalmente sustituido con halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6} o arilo;
R^{2} es -CH_{2}-R^{5} o
-C(=O)-R^{6}; cada R^{5} se selecciona
independientemente entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o imidazolilo; cada
R^{6} se selecciona independientemente entre alquil
C_{1-6}-amino, cicloalquil
C_{1-6}-amino, hidroxialquil
C_{1-6}-amino, di (alquil
C_{1-6}) amino-alquil
C_{1-6}-amino o morfolinilo;
R^{3} es hidrógeno y R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6}.
3. Un compuesto según la reivindicación 1 y 2,
en el que:
cada X es N; R^{1} es fenilo o fenilo
sustituido con halo; R^{2} es -CH_{2}-R^{5};
cada R^{5} se selecciona independientemente entre hidrógeno,
hidroxi, alquil C_{1-6}-oxi, o
alquil C_{1-6}-carboniloxi;
R^{3} es hidrógeno; y R^{4} es hidrógeno.
4. Un compuesto según la reivindicación 1, 2 y
3, en el que dicho compuesto es el compuesto Nº. 1, compuesto Nº.
8, compuesto Nº. 11, compuesto Nº. 9, compuesto Nº. 33, compuesto
Nº. 34, compuesto Nº. 7 o el compuesto Nº.
25.
25.
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\vskip1.000000\baselineskip
5. Una composición farmacéutica que comprende a
vehículos farmacéuticamente aceptables y como ingrediente activo
una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según se
reivindica en la reivindicación 1 a 4.
6. Un proceso de preparar una composición
farmacéutica según se reivindica en la reivindicación 5, en el que
los vehículos farmacéuticamente aceptables y un compuesto según se
reivindica en la reivindicación 1 a 4 son profundamente
mezclados.
7. Un compuesto según se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como una
medicina.
8. El uso de un compuesto según se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
9. Una combinación de un agente anticáncer y un
inhibidor de HDAC según se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
\newpage
10. Un proceso para preparar un compuesto según
se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado por hacer
reaccionar un intermedio de fórmula (II) con un ácido apropiado
produciendo un ácido hidroxámico de fórmula (I),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un compuesto de fórmula (V),
las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y su forma estereoquímicamente
isomérica, en el
que
cada X es independientemente N o CH;
R^{1} es fenilo, naftalenilo o heterociclilo;
en el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, polihaloalquilo
C_{1-6}, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-sulfonilamino,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxialquil C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oximetilo, aminometilo,
alquil C_{1-6}-aminometilo,
alquil
C_{1-6}-carbonilaminometilo,
alquil
C_{1-6}-sulfonilaminometilo,
aminosulfonilo, alquil
C_{1-6}-aminosulfonilo o
heterociclilo;
R^{2} es hidrógeno,
-CH_{2}-R^{5}, trifluorometilo,
-C(=O)-R^{6}, o
-CH_{2}-NR^{7}R^{8}; en el que
cada R^{5} se selecciona independientemente
entre hidrógeno, hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-oxi-alquil
C_{1-6}-oxi, alquil
C_{1-6}-carboniloxi, piperazinilo,
N-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,
imidazolilo o triazolilo; cada R^{6} se selecciona
independientemente entre hidroxi, alquil
C_{1-6}-oxi, amino o mono- o
di-(alquil C_{1-6}) amino, cicloalquil
C_{1-6}-amino, hidroxialquil
C_{1-6}-amino, piperazinilo,
mono- o di-(alquil C_{1-6})
amino-alquil
C_{1-6}-amino
N-metilpiperazinilo, morfolinilo o
tiomorfolinilo;
cada R^{7} y R^{8} se seleccionan
independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-carbonilo, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-4})-aminosulfonilo;
R^{3} es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo
o mono- o di-(alquil C_{1-6}) aminometilo;
R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1-6};
arilo en lo anterior es fenilo o naftalenilo; en
el que
cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
ciano o hidroxicarbonilo; y
heterociclilo es furanilo, tienilo, pirrolilo,
pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo,
imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo,
pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo,
oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo,
piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo,
piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo,
tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo,
benzotiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, benztiazolilo,
purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftlazinilo,
quinazolinilo, quinaxolinilo o naftiridinilo; en el que
cada uno de dichos heterociclos está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno
independientemente seleccionado entre halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, ciano, amino, o mono-
o di-(alquil C_{1-4})-amino.
12. Un proceso para preparar un compuesto según
se reivindica en la reivindicación 11, caracterizado por:
- a)
- convertir compuestos de fórmula (V), en los que R^{2} es -CH_{2}OH, y R^{4} es hidrógeno, llamados en este documento compuestos de fórmula (V-a), en compuestos de fórmula (V), en los que R^{2} es además -CH_{2}OH, llamado en este documento compuestos de fórmula (V-b), mediante reacciones conocidas en la técnica o transformaciones de grupo funcionales, y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- preparar compuestos de fórmula (V-a) en una sola etapa haciendo reaccionar el intermedio de fórmula (VI) con 1,4-dioxano-2,5-diol y el ácido borónico apropiado de fórmula (VII), en el que R^{1} es como se define antes o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- c)
- preparar los compuestos de fórmula (V-b) haciendo reaccionar el intermedio de fórmula (VI), con la cetona apropiada de fórmula (VIII), en el que R^{1} y R^{2} son como se define antes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- d)
- preparar los compuestos de fórmula (V), en los que R2 es -COOH, llamado en este documento compuestos de fórmula (V-c), en una sola etapa haciendo reaccionar el intermedio de fórmula (VI), con ácido 2-oxo-propanoico y el ácido borónico apropiado de fórmula (VII), en el que R^{1} es como se define antes, en un disolvente adecuado y la conversión además en los intermedios de fórmula (V) en el que R^{2} es -C(=O)-R^{6}, mediante reacciones conocidas en la técnica o transformaciones de grupos funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
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| EP04077171 | 2004-07-28 | ||
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