CN1993356B - 作为组蛋白脱乙酰基酶新颖抑制剂的取代丙烯基哌嗪衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有组蛋白脱乙酰基酶抑制活性的新颖的式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4和X具有本发明所定义的含义；它们的制备、含有它们的组合物和它们作为药物的用途。

Description

作为组蛋白脱乙酰基酶新颖抑制剂的取代丙烯基哌嗪衍生物
本发明涉及具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。本发明进一步涉及它们的制备方法、包含它们的组合物以及它们在体外和体内抑制HDAC和作为药物的用途，例如作为抑制增殖疾病(比如癌症和牛皮癣)的药物。
熟知核组蛋白是负责调节基因转录和其它DNA-模板化过程的工具的完整和能动组分，所述DNA-模板化过程比如复制、修复、重组和染色体分离。它们是包括乙酰化作用、磷酸化作用、甲基化作用、遍在蛋白化和ADP-核糖基化的翻译后修饰的主体。
组蛋白脱乙酰基酶，在此称为“HDACs”是从蛋白质赖氨酸残基上催化除去乙酰基修饰的酶，包括核核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4。连同组蛋白转乙酰酶(在此称为“HATs”)一起，HDACs调节组蛋白乙酰化作用的水平。核小体组蛋白乙酰化作用的平衡在许多基因的转录中都起着重要作用。组蛋白的低乙酰化作用与导致基因转录受到阻抑的凝聚染色质的结构相关，同时乙酰化组蛋白与更多的开放染色质结构和转录活化相关。
迄今为止，已经描述了十一种结构相关的HDACs并且将它们分为了两种类型。类别I HDACs由HDAC 1、2、3、8和11组成，类别II HDACs由HDAC 4、5、6、7、9和10组成。第三类别的HDACs成员与类别I和类别II HDACs在结构上不相关。类别I/II HDACs通过锌-依赖型机制进行起作用，而类别III HDACs为NAD-依赖型。
除了组蛋白之外，其它蛋白质也已经是乙酰化作用的基质，特别是转录因子，比如p53、GATA-1和E2F；核受体，比如肾上腺糖皮质激素受体、甲状腺受体、雌激素受体；和细胞周期调节蛋白，比如pRb。已经表明，蛋白质的乙酰化作用与蛋白稳定化(比如p53稳定化)、辅因子复原和增强的DNA结合相联系。p53是可以在响应多种应激信号(比如DNA损伤)中诱发细胞周期停滞或者死亡的肿瘤抑制因子。p53-诱发细胞周期停滞的主要目标似乎是p21基因。在通过p53进行活化之后，根据在G1和G2阶段其与导致细胞周期停滞的细胞周期蛋白/依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶配合物的联系、其在老化期间的高端调节以及其与增殖细胞核抗原的相互作用，p21已经得到了鉴定。
HDACs抑制剂的研究表明，它们在细胞周期停滞、细胞分化、细胞程序死亡和转换显型的逆转中都起着重要作用。
例如，抑制剂Trichostatin A(TSA)，导致G1和G2阶段细胞周期停滞、颠倒不同细胞系的转换显型和诱发Friend leukemia细胞和其它细胞的变异。已经报道，TSA(和辛二酰苯胺氧肟酸SAHA)可以抑制鼠中细胞生长、诱发成体终末分化和预防肿瘤形成(Finnin等人，Nature，401：188-193，1999)。
另外据报道，Trichostatin A可以用于纤维症的治疗中，例如肝纤维症和肝硬化(Geerts等人，欧洲专利申请EP 0 827 742，公开于1998年3月11日)。
HDAC抑制剂的药效团由与HDACs的含锌活性部分相互作用的金属结合区域、连接物区域和与活性部分边缘上的残基相互作用的表面识别区域或者封盖区域组成。
此外，HDACs抑制剂可以诱导p21基因表达也已经得到了报道。由这些抑制剂进行的p21基因的转录激活通过在p21促进区域进行组蛋白H3和H4的乙酰化作用后进行染色质改造得到了促进。这种p21的活化以独立于p53的方式发生，由此HDAC抑制剂对于具有突变p53基因的细胞有效，其中突变p53基因是许多肿瘤的标志。
此外，HDAC抑制剂还可以具有间接活性，比如增强宿主免疫应答和抑制肿瘤血管形成，并且由此可以抑制原发肿瘤的生长和阻止其病变转移(Mai等人，Medicinal Research Reviews，25，261-309)。
基于上述可知，HDAC抑制剂可以在细胞增殖疾病或者症状的治疗中具有很强的治疗潜力，包括具有突变p53基因的肿瘤。在2003年8月14日公开的专利申请EP1472216中公开了作用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的的二环氧肟酸盐。
在2003年9月18日公开的专利申请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378中公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌嗪基嘧啶基异羟肟酸，其中在EP1485365中进一步公开了R306465。
公开于2003年10月9日的专利申请EP1492534公开了作为HDAC抑制剂的含有哌嗪连接的氨基甲酸化合物。公开于2003年10月23日的专利申请EP1495002公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代哌嗪基苯基苯甲酰胺化合物。
公开于2004年1月29日的专利申请WO04/009536中公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的在芳基和氧肟酸盐之间含有烷基连接物的衍生物。公开于2004年2月12日的专利申请EP1525199公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的(杂)芳基烯基取代的二环氧肟酸盐。
公开于2004年7月29日的专利申请WO04/063146公开了具有抗炎和抗肿瘤活性的N-羟基-苯甲酰胺衍生物。
公开于2004年7月29日的专利申请WO04/063169公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的芳基氧肟酸盐衍生物。
公开于2004年8月26日的专利申请WO04/072047公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吲哚、苯并咪唑和naphhimidazoles。
公开于2004年9月30日的专利申请WO04/082638公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的连接至非芳香杂环系统的氧肟酸盐。
公开于2004年10月28日的专利申请WO04/092115公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的氧肟酸盐衍生物。
公开于2005年3月31日的专利申请WO05/028447公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯并咪唑。公开于2005年4月7日的专利申请WO05/030704和WO05/030705公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯甲酰胺。
公开于2005年5月6日的专利申请WO05/040101公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的酰基脲连接和磺酰脲连接的氧肟酸盐。
公开于2005年5月6日的专利申请WO05/040161公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的二芳基连接的氧肟酸盐。
本发明化合物在结构上、在它们的药理学活性和/或药理学效力上不同于现有技术。
本发明所要解决的技术问题是提供具有高酶活性和细胞活性的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，它们具有增强的生物利用度和/或体内效力。
本发明的新颖化合物解决了上述难题。本发明化合物表现出了优良的组蛋白脱乙酰基酶抑制酶活性和细胞活性。在细胞和体内水平上，它们都具有活化p21基因的强大能力。它们具有合意的药物动力学分布和对P450酶具有低亲合性，这就降低了不利的药物相互作用的风险，并且由此使得其具有更宽的安全界限。
本发明化合物的有利特征在于其新陈代谢稳定性、溶解性和/或p21诱导能力。更特别而言，本发明化合物在鼠肝细胞中具有延长的半衰期、在水溶液中具有增强的溶解性/稳定性和/或具有增强的体内p21促进剂诱发能力。
本发明涉及式(I)化合物
其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中
各个X独立地为N或者CH；
R1为苯基、萘基或者杂环基；其中
所述苯基或者萘基各自任选地被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、芳基、羟基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰氨基、羟基羰基、C1-6烷氧基羰基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺酰氨基甲基、氨基磺酰基、C1-6烷基氨基磺酰基或者杂环基；
R2为氢、-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；其中
各个R5独立地选自以下的取代基：氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑基或者三唑基；
各个R6独立地选自以下的取代基：羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单-或者二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、哌嗪基、单或者二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
各个R7和R8独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或者单或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；
R3为氢、羟甲基、氨基甲基或者单或二(C1-6烷基)氨基甲基；
R4为氢或者C1-6烷基；
上述芳基为苯基或者萘基；其中
所述苯基或者萘基各自任选被一个或者两个独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基或者羟基羰基的取代基取代；和
上述杂环基为呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、间二氧杂环戊烯基、
Figure 200580025487810000210003_0
唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、异唑基、异噻唑基、
Figure 200580025487810000210003_2
二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、二烷基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、二氢吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基或者二氮杂萘基；其中
所述杂环各自任选被一个或者两个各自独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基、单或者二(C1-6烷基)氨基的取代基取代。
术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或者“组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂”用于确定化合物，其能够与组蛋白脱乙酰基酶相互作用并且抑制它的活性，更具体而言，抑制它的酶催化活性。抑制组蛋白脱乙酰基酶酶催化活性是指降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白上除去乙酰基的能力。优选所述抑制是特异性的，即，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂以低于产生一些其它不相关的生物作用所需的抑制剂浓度的浓度降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白上除去乙酰基的能力。
在上述定义和下文中使用的卤素通常是指氟、氯、溴和碘；C1-4烷基定义为具有1～4个碳原子的直链和支链饱和烃基，比如，例如为甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲基乙基和2-甲基丙基等等；C1-6烷基包括C1-4烷基及其具有5～6个碳原子的同系物，比如，例如为戊基、2-甲基丁基、己基和2-甲基戊基等等；多卤代C1-6烷基定义为含有三个相同或者不同卤素取代基的C1-6烷基，例如三氟甲基；和C3-6环烷基包括具有3～6个碳原子的环状烃基，比如环丙基、环丁基、环戊基和环己基等等。
药学上可接受的加成盐包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。如上文中所记载的药学上可接受的酸加成盐意指包括式(I)化合物能够形成的治疗活性的无毒酸加成盐形式。通过用适当的酸处理所述碱形式，可以将具有碱性性能的式(I)化合物转化为它们药学上可接受的酸加成盐。适当的酸包括，例如，无机酸，比如氢卤酸(例如氢氯酸或者氢溴酸)、硫酸、硝酸和磷酸等等；或者有机酸，比如，例如为乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷基氨基磺酸、水杨酸、对-氨基-水杨酸和帕莫酸等等。
通过用适宜的有机或者无机碱处理所述酸形式，可以将具有酸性性能的式(I)化合物转化成它们药学上可接受的碱加成盐。适当的碱盐形式包括，例如，铵盐、碱金属盐和碱土金属盐(例如，锂盐、钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等等)；与有机碱(例如N，N′-双苄基乙撑二胺、N-甲基-D-葡糖胺、羟胺盐)形成的盐以及与氨基酸(比如，例如为精氨酸和赖氨酸等等)形成的盐。
术语“酸或者碱加成盐”还包括式(I)化合物能够形成的水合物和溶剂加成形式。所述形式的实例为，例如水合物和醇化物等等。
在此使用的术语“式(I)化合物的立体化学异构形式”定义为式(I)化合物可能具有的所有由相同碳原子通过相同键接顺序形成但是具有不同立体结构的化合物，这些化合物是不可互变的。除非另作说明或者表明，化合物的化学命名包括所述化合物可能具有的所有可能立体化学异构形式的混合物。上述混合物可以含有所述化合物基本分子结构的所有非对映异构体和/或对映异构体。意图将纯形式或者彼此混合形式的式(I)化合物的所有立体化学异构形式都包括在本发明范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式意指包括其中一个或者几个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物的那些式(I)化合物，特别是其中哌啶-、哌嗪或者哒嗪-氮原子受到N-氧化的那些N-氧化物。
一些式(I)化合物还可以以互变异构形式存在。虽然在上式中未得到明确说明，但是意图将这种形式包括在本发明范围内。
无论在下文何时使用时，术语“式(I)化合物”都意图还包括其药学上可接受的加成盐和所有立体异构形式。
在此使用的术语“组蛋白脱乙酰基酶”和“HDAC”意图是指任何从组蛋白N-末端赖氨酸残基的ε-氨基上除去乙酰基的酶家族中的一种。除非在上下文中另有说明，术语“组蛋白”意图是指任何从任意物种中得到的组蛋白蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人类HDAC蛋白或者基因产品，包括但不限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。所述组蛋白脱乙酰基酶还可以源于原生动物或者真菌源。
第一组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)R1为苯基或者萘基；其中
所述苯基或者萘基各自被一个或者两个独立地选自以下的取代基取代：C1-6烷基磺酰基氨基、羟基羰基、C1-6烷氧基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺酰基氨基甲基、氨基磺酰基或者C1-6烷基氨基磺酰基；或者
b)R2为-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；
c)R4为C1-6烷基。
第二组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)R1为苯基、萘基或者杂环基；其中
各个所述苯基被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：芳基、羟基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、C1-6烷氧基羰基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺酰基氨基甲基、氨基磺酰基、C1-6烷基氨基磺酰基或者杂环基；或者
b)R2为-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；
c)R4为C1-6烷基。
第三组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)R1为苯基、萘基或者杂环基；其中
所述苯基或者萘基各自被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：C1-6烷基磺酰基氨基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺酰基氨基甲基、氨基磺酰基或者C1-6烷基氨基磺酰基；或者
b)R2为-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；
c)R4为C1-6烷基。
第四组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑基或者三唑基；
b)R6各自独立地选自羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单或二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
c)R4为氢。
第五组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)各个X为N；
b)R1为苯基或者任选被卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基或者芳基取代的苯基；
c)R2为-CH2-R5或者-C(＝O)-R6；
d)R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者咪唑基；
e)R6各自独立地选自C1-6烷基氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基或者吗啉基；
f)R3为氢；或者
g)R4为氢或者C1-6烷基。
第六组重要的化合物由第五组的以下化合物组成，其中应用以下限定：
a)R6各自独立地选自C1-6烷基氨基、C1-6环烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基或者吗啉基。
第七组重要的化合物由以下式(I)化合物组成，其中应用一种或者多种以下限定：
a)各个X为N；
b)R1为苯基或者被卤素取代的苯基；
c)R2为-CH2-R5；
d)R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基或者C1-6烷基羰基氧基；
e)R3为氢；
f)R4为氢。
优选的化合物组由以下式(I)化合物组成，其中
各个X为N；R1为苯基或者任选被卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基或者芳基取代的苯基；R2为-CH2-R5或者-C(＝O)-R6；R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者咪唑基；R6各自独立地选自C1-6烷基氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基或者吗啉基；R3为氢和R4为氢或者C1-6烷基。
另一组优选的化合物由以下式(I)化合物组成，其中R2为-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8。
更优选的化合物组由以下式(I)化合物组成，其中各个X为N；R1为苯基或者被卤素取代的苯基；R2为-CH2-R5；R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基或者C1-6烷基羰基氧基；R3为氢；和R4为氢。
最优选的化合物为化合物No.1、化合物No.8、、化合物No.11、化合物No.9、化合物No.33、化合物No.34和化合物No.7以及化合物No.25。
Figure A20058002548700181
式(I)化合物和它们药学上可接受的盐和N-氧化物及其立体化学异构形式可以以常规方式进行制备。原料和一些中间体都是已知的化合物，它们可以市场购买到或者可以根据本领域熟知的常规反应方法进行制备。
一些制备方法在下文将进行更详尽地描述。其它获得最终式(I)化合物的方法描述于实施例中。
a)式(I)的异羟肟酸可以通过使式(II)中间体与适当的酸反应而得到制备，所述酸比如，例如为三氟乙酸。上述反应在适当的溶剂，比如，例如为甲醇或者二氯甲烷中进行。
b)式(II)的中间体可以通过使式(III)中间体与式(IV)中间体在适当的试剂存在下进行反应而得到制备，所述试剂比如为N’-(乙基亚胺酰基(carbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸化物(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)。该反应可以在比如三乙胺的碱存在下，在适当的溶剂中进行，所述溶剂比如为二氯甲烷和四氢呋喃的混合物。
c)在另一种方法中，其中R4为氢的式(II)中间体，在此称为式(II-a)中间体，可以通过使式(XI)中间体与1，4-二
Figure 200580025487810000210003_4
烷-2，5-二醇和适当的式(VII)硼酸在适当的溶剂(例如，醇，比如为乙醇)中通过一步反应进行制备，式(VII)中R1如上所定义。
d)式(III)中间体可以通过使式(V)中间体与适当的酸性溶液(例如，氢氯酸或者溴化氢)或者碱性溶液(例如，氢氧化钠)在适当的溶剂(例如，醇，比如乙醇或者丙醇)中反应得到制备。
Figure A20058002548700202
本发明还涉及式(V)化合物
Figure A20058002548700203
其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中
各个X独立地为N或者CH；
R1为苯基、萘基或者杂环基；其中
所述苯基或者萘基各自任选地被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、芳基、羟基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰氨基、羟基羰基、C1-6烷氧基羰基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺酰氨基甲基、氨基磺酰基、C1-6烷基氨基磺酰基或者杂环基；
R2为氢、-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；其中
各个R5独立地选自以下的取代基：氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑基或者三唑基；
各个R6独立地选自以下的取代基：羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单-或者二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、哌嗪基、单或者二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
各个R7和R8独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或者单或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；
R3为氢、羟甲基、氨基甲基或者单或二(C1-6烷基)氨基甲基；
R4为氢或者C1-6烷基；
上述芳基为苯基或者萘基；其中
所述苯基或者萘基各自任选地任选被一个或者两个各自独立选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基或者羟基羰基的取代基取代；和
上述杂环基为呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、间二氧杂环戊烯基、唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、异
Figure 200580025487810000210003_6
唑基、异噻唑基、
Figure 200580025487810000210003_7
二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、二烷基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、二氢吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基或者二氮杂萘基；其中
所述杂环各自任选被一个或者两个各自独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基、单或者二(C1-4烷基)氨基的取代基取代。
根据对式(I)化合物限定的组，可以对式(V)化合物的重要化合物组、优选化合物组、更优选化合物组和最优选化合物组进行限定。
新颖的式(V)中间体可以通过以下方式进行制备：
a)通过本领域熟知的反应或者官能团转换反应，将其中R2为-CH2OH和R4为氢的式(V)中间体，在此称为式(V-a)中间体，转化为其中R2不是-CH2OH的式(V)中间体，在此称为式(V-b)中间体。例如，可以将式(V-a)的醇转换为胺、酯和醚。所述胺可以被转化为相应的酰胺和伯胺可以被转化为仲胺或者叔胺。
Figure A20058002548700221
b)式(V-a)的新颖中间体可以通过使式(VI)中间体与1，4-二
Figure 200580025487810000210003_9
烷-2，5-二醇和适当的式(VII)硼酸在适当的溶剂(例如，醇，比如乙醇)中反应一步得到制备，其中R1如上所定义。
Figure A20058002548700222
c)式(V-b)的新颖中间体可以通过使式(VI)中间体与适当的式(VIII)酮在适当的试剂(比如四(ethanolato)钛或者硼氢化钠)存在下，在适宜的溶剂(例如，1，2-二氯乙烷)中反应得到制备。
Figure A20058002548700231
d)其中R2为-COOH的式(V)化合物，在此称为式(V-c)化合物，可以通过使式(VI)中间体与2-氧代-丙酸和适当的式(VII)硼酸(其中R1如上所定义)在适宜的溶剂(例如，1，2-二氯甲烷)中反应一步得到制备。
通过本领域熟知的反应或者官能团转化反应，可以将其中R2为-COOH的式(V-c)中间体转化为其中R2为-C(＝O)-R6的式(V)中间体，例如将其转化为胺和酰胺。
Figure A20058002548700232
式(XI)中间体可以通过使式(IX)中间体与哌啶在适宜的溶剂(例如，二氯甲烷)中反应得到制备。
Figure A20058002548700241
式(IX)中间体可以通过使式(X)中间体与式(IV)中间体在适当的试剂存在下反应得到制备，所述试剂比如为N’-(乙基亚胺酰基)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸化物(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)。该反应可以在碱(比如三乙胺)存在下，在适宜的溶剂中进行，所述溶剂比如为二氯甲烷和四氢呋喃的混合物。
式(X)中间体可以通过使式(VI)中间体与式(XII)中间体在氢氧化钠存在下，在适宜的溶剂(比如四氢呋喃)中反应，随后用盐酸中和和加入碳酸钠而得到制备。
Figure A20058002548700251
式(I)化合物和一些中间体在它们的结构中可以具有至少一个立体异构中心。该立体异构中心可以以R或者S构型存在。
在上文所述方法中制备的式(I)化合物通常为对映异构体的外消旋混合物，它们可以根据本领域熟知的拆分方法进行相互分离。外消旋的式(I)化合物可以通过与适宜的手性酸反应转化成相应的非对映异构体盐形式。随后，通过例如选择结晶或者分级结晶对所述非对映体盐形式进行分离，并且通过碱金属使对映异构体从中游离出来。另一种分离式(I)化合物的光学异构形式的方法涉及使用手性固定相的液相色谱法。所述纯立体化学异构形式还可以由适当原料的相应的纯立体化学异构形式衍生得到，条件是所述反应是立体特异性的。如果期望得到具体的立体异构体，那么优选所述化合物通过立体特异性的制备方法进行合成。这些方法中将有利地应用光学异构纯原料。
式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式具有有价值的药理学性能，它们具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制作用。
通过给药有效量的本发明化合物，本发明提供了抑制细胞异常生长(包括转化细胞)的方法。细胞的异常生长是指独立于正常调节机制的细胞生长(例如，接触性抑制的丧失)。这包括通过引起癌细胞生长停滞、成体终末分化和/或癌细胞程序死亡直接抑制肿瘤生长和通过抑制肿瘤新血管形成间接抑制肿瘤生长。
本发明还提供了通过给药有效量的本发明化合物至需要所述治疗的主体(例如，哺乳动物(并且更特别而言，为人类))而抑制肿瘤生长的方法。特别是，本发明提供了通过给药有效量的本发明化合物而抑制肿瘤生长的方法。可以受到抑制的肿瘤的实例，包括但不限于，肺癌(例如恶性腺瘤和包括非小细胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺恶性肿瘤，比如，例如为外分泌胰腺恶性肿瘤)、结肠癌(例如结肠恶性肿瘤，比如，例如为结肠恶性腺瘤和结肠腺瘤)、包括重病的前列腺癌、淋巴血统生血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏肿瘤)、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、甲状腺小囊癌、脊髓发育不良综合征(MDS)、间质源肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳房恶性肿瘤(例如重乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
根据本发明的化合物可以用于其它治疗学目的，例如：
a)在辐射肿瘤以治疗癌症之前、期间或者之后，通过给药根据本发明的化合物促进肿瘤对放射疗法的感受性；
b)治疗关节病和骨病理学症状，比如风湿性关节炎、骨关节炎、少年关节炎、痛风、多发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮；
c)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖疾病、动脉粥样硬化症和再狭窄；
d)治疗炎性症状和皮肤病，比如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、过敏性鼻炎、移植对宿主疾病、结膜炎、哮喘、ARDS、贝切特氏病、移植排斥、uticaria、过敏性皮炎、局限性脱发、硬皮症、皮疹、湿疹、皮肤肌炎、粉刺、糖尿病、系统红斑狼疮、川崎氏疾病、多发性脑硬化、气肿、囊性纤维化和慢性支气管炎；
e)治疗子宫内膜异位、子宫的纤维状、功能性月经失调和子宫内膜增生；
f)治疗眼睛血管形成，包括影响视网膜和脉络膜血管的血管病；
g)治疗心脏功能障碍；
h)抑制免疫抑制症状，比如HIV感染的治疗；
i)治疗肾功能障碍；
j)消除内分泌病症；
k)抑制糖质新生功能障碍；
l)治疗例如帕金森氏症的神经病理学或者导致认知障碍的神经病理学，例如，阿尔茨海默氏病或者与多谷酰胺相关的神经元疾病。
m)治疗精神错乱，例如精神分裂症、双相性精神障碍、抑郁症、焦虑和精神病，
n)抑制神经肌肉病理学，例如肌萎缩性侧索硬化；
o)治疗脊髓性肌萎缩，
p)治疗其它通过加强基因表达能够检验从而进行治疗的病理学症状；
q)增强基因疗法，
r)抑制脂肪生成，
s)治疗寄生虫病，比如疟疾。
由此，本发明公开了用作药品的式(I)化合物以及这些式(I)化合物用于制备治疗一种或者多种上述症状的药物的用途。
式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式可以具有有价值的诊断性能，在于它们可以用于检测或者鉴定生物样中的HDAC，包括检测或者测定标记化合物和HDAC之间配合物的形成。
所述检测或者鉴定方法可以应用用标记试剂(比如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等等)标记的化合物。上述放射性同位素的实例包括125I、131I、3H和14C。酶通常通过与适当的基质结合导致其可受检测，这反过来也催化可检测反应。其实例包括，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化酶。上述发光物质包括，例如发光氨、发光氨衍生物、莹光素、水母发光蛋白和荧光素酶。
生物样品可以定义为主体组织或者体液。体液的实例是脑脊髓液、血液、血浆、血清、尿、痰和唾液等等。
鉴于它们的有效药理学性能，因此可以将本发明化合物配制成用于多种给药目的的多种药物形式。
为了制备本发明的药物组合物，可以将有效量的作为碱或者酸加成盐形式的本发明具体化合物作为活性成分与药学上可接受的载体密切混合，取决于希望给药的制备形式，所述药学上可接受的载体可以采用多种形式。这些药物组合物可以合宜地为例如适于口服给药、直肠给药、经皮给药或者经肠胃外注射的单位剂型。例如，在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何常用的药物介质，例如在口服液体制剂(例如悬浮液、糖浆剂、酏剂和溶液)的情况下，可以使用例如水、乙二醇、油和醇等等；或者在粉剂、丸剂、胶囊和片剂的情况下，可使用固体载体，例如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、结合剂和崩解剂等等。
因为便于给药，因此片剂和胶囊表示最有利的口服剂量单位形式，在此情况下使用固体药物载体是显然的。对于胃肠外组合物，所述载体通常包括无菌水，至少含有大部分无菌水，不过也可以包含其它成分，例如，溶解辅助剂。例如，可以制成可注射液剂，其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或者盐水和葡萄糖溶液的混合物。还可以将其制成可注射混悬剂，在这种情况下可以使用适当的液体载体和助悬剂等等。在适宜于经皮给药的组合物中，所述载体任选含有渗透增强剂和/或适宜的可润湿剂，任选与较小比例的任何性质的适宜添加剂联合使用，所述添加剂不能对皮肤产生任何显著的有害作用。所述添加剂可以便于对皮肤的给药和/或可以有助于制备期望的组合物。这些组合物可以以多种方法给药，例如，作为透皮贴片、作为点滴剂或者作为膏剂。
为了便于给药和使剂量一致，将上述药物组合物配制成单位剂型是特别有利的。用于本发明说明书和权利要求书中的单位剂型是指适于用作单位剂量的物理分离单位，每个单位含有经计算能产生期望的治疗作用的预定量活性成分以及所需要的药物载体。上述单位剂型的实施例是片剂(包含刻痕片剂或者糖衣片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包、纸囊剂、注射溶液或者悬浮液、一茶匙容量的制剂和一汤匙容量的制剂等等，及其隔离的多重形式。
本领域的熟练技术人员根据以下试验结果可以很容易地确定其有效量。通常，预期其治疗有效量为0.005mg/kg～100mg/kg体重，并且特别是0.005mg/kg～10mg/kg体重。在一天之中，可以适当地将所需剂量以适当的间隔分为两次、三次、四次或者更多次亚剂量给药。可以将所述亚剂量配制成单位剂型，例如，每个单位剂型含有0.5～500mg活性成分，特别是10mg～500mg。
作为本发明的另一方面，提供了HDAC-抑制剂与另一抗癌剂的联用，特别是将其用作药物，更具体而言，将其用于癌症或者相关疾病的治疗中。
对于上述症状的治疗，可以有利地将本发明化合物与一种或者多种其它药物试剂组合使用，更特别而言，与其它抗癌剂组合使用。抗癌剂的实例为：
-铂配位化合物，例如顺氯氨铂、卡铂或者草酸铂；
-紫杉烷化合物，例如帕尼特西或者哚希特西；
-局部异构酶I抑制剂，比如喜树碱化合物，例如伊立替康或者托普特康；
-局部异构酶II抑制剂，比如抗肿瘤鬼臼素衍生物，例如鬼臼亚乙苷或者表鬼臼毒噻吩糖苷；
-抗肿瘤长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱或者长春瑞滨；
-抗肿瘤核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨或者卡培他滨；
-烷基化剂，比如氮芥子气或者亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、亚硝脲氮芥或者环己亚硝脲，
-抗肿瘤蒽环类衍生物，例如道诺红菌素、阿霉素、伊达比星或者米托蒽醌；
-HER2抗体，例如曲妥单抗；
-雌激素受体拮抗剂或者选择性雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、法洛得斯或者雷洛昔芬，
-芳香酶抑制剂，比如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑和伏氯唑；
-异化试剂，比如类视黄醇、维生素D和视黄酸代谢阻滞剂(RAMBA)，例如伊维甲酸；
-DNA转甲基酶抑制剂，例如氮胞苷；
-激酶抑制剂，例如黄吡哚、甲磺酸伊马替尼或者吉菲特本；
-法呢基转化酶抑制剂，
-其它HDAC抑制剂
-泛素-蛋白酶体途径抑制剂，例如Velcade；或者
-Yondehs。
在此使用的术语“铂配位化合物”表示任何提供离子形式铂的肿瘤细胞生长抑制铂配位化合物。
术语“紫杉烷化合物”表示具有紫杉烷环系统的化合物或者与某些种类紫杉(Taxus)树提取物相关或者由某些种类紫杉(Taxus)树提取物得到的化合物。
术语“局部异构酶抑制剂”用来表示能够改变真核细胞中DNA拓扑结构的酶。它们对细胞功能和细胞增殖是至关重要的。在真核细胞中存在两种类型的局部异构酶，即类型I和类型II。局部异构酶I是一种分子量大约为100,000的单体酶。该酶与DNA结合并且引入瞬时单束断裂中，将双螺旋展开(或者使其展开)，并且随后在从DNA束上分离之前对其进行再封闭。局部异构酶II具有类似的作用机制，它们涉及诱导DNA束的断裂或者形成自由基。
术语“喜树碱化合物”用来表示与母体喜树碱化合物相关或者由母体喜树碱化合物得到的化合物，所述母体喜树碱化合物是源于中国树种喜树碱acuminata和印度树种臭味假柴龙树的不溶于水的生物碱。
术语“鬼臼霉素化合物”用来表示与母体鬼臼霉素相关或者由母体鬼臼霉素得到的化合物，所述鬼臼霉素从茄参属植物中提取得到。
术语“抗肿瘤长春花属生物碱”用来表示与玉黍螺植物(长春花)提取物相关或者从中得到的化合物。
术语“烷基化试剂”包括在生理条件下，具有将烷基提供至生物学生命大分子(比如DNA)上的能力的各种化学基团。对于大多数更为重要的试剂，比如氮芥和亚硝基脲，活性烷基化部分在复杂的降解反应之后在体内形成，其中一些降解反应为酶催化反应。烷基化试剂的最重要的药理学作用在于它们干扰涉及细胞增殖的基本机制，特别是DNA合成和细胞分裂。在迅速增殖的组织中，烷基化试剂干扰DNA功能和完整性的能力提供了它们治疗学应用和多种毒性的基础。
术语“抗肿瘤蒽环类衍生物”包括从真菌链球菌、peuticus var.caesius中获得的抗生素和它们的衍生物，其特征在于它们具有通过糖苷键连接的异样蔗糖的四环素环状结构：道诺糖苷。
对于某些病人而言已经表明，人表皮生长因子受体2蛋白(HER2)在原发性乳房恶性肿瘤中的扩增与较差的临床疾病预测相关。曲妥单抗是源于与HER2受体胞外域具有高亲合性和特异性的单克隆IgGlκ抗体的高度纯化重组DNA。
许多乳腺癌都具有雌激素受体，并且这些肿瘤的生长可以通过雌激素进行刺激。术语“雌激素受体拮抗剂”和“选择性雌激素受体调节剂”用来表示与雌激素受体(ER)结合的雌二醇竞争性抑制剂。选择性雌激素受体调节剂，当与ER结合时，诱发受体的立体形状改变，调节其与DNA上雌激素响应元素(ERE)的结合。在绝经后的女性中，循环雌激素的主要来源是通过末梢组织中的芳香酶将肾上腺和卵巢雄激素(雄甾烯二酮和睾丸激素)转为为雌激素(雌甾酮和雌二醇)。对于一些激素依赖性乳腺癌的患者，通过芳香酶抑制作用或者灭活作用导致的雌激素丧失是有效和选择性的治疗方法。
在此使用的术语“抗雌激素剂”不仅包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括如上所述的芳香酶抑制剂。
术语“异化试剂”包括能够以多种方式抑制细胞增殖和诱发变异的化合物。已知维生素D和类视黄醇在调节多种正常和恶性细胞类型的生长和异化中起着重要作用。视黄酸代谢阻滞剂(RAMBA′s)通过抑制细胞色素P450-介导的视黄酸分解代谢增强内源性视黄酸的浓度。
DNA甲基化变化是人类肿瘤中最普遍的畸变行为。选择基因促进剂中的高度甲基化通常与所涉及基因的失活作用相关。术语“DNA甲基转移酶抑制剂”用来表示通过药理学抑制DNA甲基转移酶和再活化肿瘤抑制基因表达而起作用的化合物。
术语“激酶抑制剂”包括涉及细胞周期进程和细胞程序死亡的激酶的有效抑制剂。
术语“法呢基转移酶抑制剂”用来表示设计用于预防Ras和其它胞内蛋白质法呢基化的化合物。已经表明，它们对恶性细胞增殖和存活具有影响。
术语“其它HDAC抑制剂”包括但不限于：
羧酸酯，例如丁酸酯、肉桂酸、4-苯基丁酸酯或者二丙基戊酸，
例如辛二酰基酰基苯胺异羟肟酸(SAHA)的异羟肟酸、含有SAHA类似物的哌嗪、二芳基异羟肟酸酯A-161906和它的carbozolylether、四氢哌啶和四氢萘酮类似物、二环芳基N-羟基羧酰胺、焦酰胺、CG-1521、PXD-101、磺胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、三克定A(TSA)、欧色弗丁、史克嗒、史克嗒相关的三环分子、间-羧基肉桂酸二异羟肟酸(CBHA)、与CBHA相似的异羟肟酸、查布辛素-异羟肟酸类似物、R306465和相关的苯甲酰基和杂芳基异羟肟酸、氨基辛二酸酯和丙二酰二亚胺；
-环状四肽，例如查布辛素、阿狄辛、缩酚肽、spiruchostatin-相关的化合物、RedFK-228、含巯基环状四肽(SCOPs)、含异羟肟酸环状四肽(CHAPs)、TAN-174s和azumamides；
-苯甲酰胺，例如MS-275或者CI-994，或者
-狄普特辛。
术语“泛素-蛋白酶体途径抑制剂”用来表示抑制蛋白酶体内目标细胞蛋白(包括细胞周期调节蛋白)破坏的化合物。
为了治疗癌症，根据本发明的化合物可以结合辐照一起给药至如上所述的患者。辐射是指电离辐射并且特别是γ辐射，特别是现在通用的通过直线加速器或者放射性核素发射的γ辐射。通过放射性核素进行的肿瘤辐射可以为外部辐射或者内部辐射。
本发明还涉及根据本发明的抗癌剂与根据本发明的HDAC抑制剂的组合物。
本发明还涉及用于医疗治疗(例如抑制肿瘤细胞生长)中的根据本发明的组合物。
本发明还涉及用于抑制肿瘤细胞生长的根据本发明的组合物。
本发明还涉及抑制人类主体中肿瘤细胞生长的方法，包括给药所述主体有效量的根据本发明的组合物。
本发明还提供了通过给药有效量的根据本发明的组合物抑制细胞异常生长(包括转化细胞)的方法。
其它药物试剂和HDAC抑制剂可以同时进行给药(例如，在分离或者单位组合物中)或者以任何次序进行顺序给药。在后一种情形中，两种化合物可以在一定的周期内以足以保证有利效果或者协同作用得到实现的量和方式进行给药。应当理解，优选的给药方法和次序以及组合物中各组分的相应剂量和状态将取决于进行给药的具体其它药物试剂和HDAC抑制剂、它们的给药途径、进行治疗的具体肿瘤和进行治疗的具体宿主。利用常规方法和借鉴本文中所列出的信息，给药的最佳方法和次序以及剂量和状态可以由本领域熟练技术人员轻易确定。
在每个疗程中，铂配位化合物有利地以1～500毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如50～400mg/m2，特别是对于顺氯氨铂以约75mg/m2的剂量给药，和对于卡铂以约300mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，紫杉烷化合物有利地以50～400毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如75～250mg/m2，特别是对于帕尼特西以约175～250mg/m2的剂量给药，和对于哚希特西以约75～150mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，喜树碱化合物有利地以0.1～400毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如1～300mg/m2，特别是对于irinotecan以约100～350mg/m2的剂量给药，和对于托普特康以约1～2mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，抗肿瘤鬼臼霉素衍生物有利地以30～300毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如50～250mg/m2，特别是对于鬼臼亚乙苷以约35～100mg/m2的剂量给药，和对于表鬼臼毒噻吩糖苷以约50～250mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，抗肿瘤长春花生物碱有利地以2～30毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，特别是对于长春花碱以约3～12mg/m2的剂量给药，对于长春新碱以约1～2mg/m2的剂量给药，和对于长春瑞滨以约10～30mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，抗肿瘤核苷衍生物有利地以200～2500毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如700～1500mg/m2，对于5-FU以200～500mg/m2的剂量给药，对于吉西他滨以约800～1200mg/m2的剂量给药和对于卡培他滨以约1000～2500mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，烷基化试剂(比如氮芥或者亚硝基脲)有利地以100～500毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如120～200mg/m2，特别是对于环磷酰胺以约100～500mg/m2的剂量给药，对于苯丁酸氮芥以约0.1～0.2mg/kg的剂量给药，对于cdrmustine以约150～200mg/m2的剂量给药和对于环己亚硝脲以约100～150mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，抗肿瘤蒽环类衍生物有利地以10～75毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，例如15～60mg/m2，特别是对于阿霉素以约40～75mg/m2的剂量给药，对于道诺红菌素以约25～45mg/kg的剂量给药，和对于伊达比星以约10～15mg/m2的剂量给药。
在每个疗程中，曲妥单抗有利地以1～5毫克/平方米(mg/m2)体表面积的剂量给药，特别是2～4mg/m2。
取决于具体药剂和进行治疗的症状，抗雌激素剂有利地以每日约1～100mg的剂量给药。为了实现和保持其治疗学作用，他莫昔芬有利地以每天两次5～50mg的剂量口服给药，优选10～20mg，持续充分长的治疗时间。为了实现和保持其治疗学作用，托瑞米芬有利地以每天一次约60mg的剂量口服给药，持续充分长的治疗时间。阿那曲唑有利地以每天一次约1mg的剂量口服给药。屈洛昔芬有利地以每天一次约20～100mg的剂量口服给药。雷洛昔芬有利地以每天一次约60mg的剂量口服给药。依西美坦有利地以每天一次约25mg的剂量口服给药。在每个疗程中，这些剂量可以例如给药一次、两次或者更多次，所述疗程可以例如每7、14、21或者28天重复一次。
鉴于它们的有效药理学性能，为了实现给药目的，可以将根据本发明组合物中的组分，即其它药剂和HDAC抑制剂配制成多种的药物形式。可以将各组分配制成单个药物组合物或者配制成含有两种组分的单位药物组合物。
由此，本发明还涉及包含其它药剂和HDAC抑制剂以及一种或者多种药物载体的药物组合物。
本发明还涉及为药物组合物形式的根据本发明的组合，所述组合物包含抗癌剂和根据本发明的HDAC抑制剂以及一种或者多种药物载体。
本发明还涉及根据本发明的联用剂在制造用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
本发明还涉及作为同时、分离或者顺序用于患有癌症的患者治疗中的组合制剂的含有根据本发明的HDAC抑制剂作为第一活性成分和抗癌剂作为第二活性成分的产品。
试验部分
以下实施例基于例证说明的目的提供。在下文中，“EDC”定义为N-(乙基亚胺酰基)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸盐，“DCM”定义为二氯甲烷，“DIPE”定义为二异丙醚，“DMF”定义为N，N-二甲基甲酰胺，″EtOAc”定义为乙酸乙酯，“EtOH”定义为乙醇，“HOBT”定义为1-羟基-1H-苯并三唑，“MeOH”定义为甲醇，“TFA”定义为三氟乙酸和“THF”定义为四氢呋喃。
A.中间体化合物的制备
实施例A1
a)中间体1
Figure A20058002548700351
的制备
在室温下，将2-(1-哌嗪基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.016mol)、(2-苯基乙烯基)-硼酸(0.016mol)和1，4-二氧六环-2，5-二醇(0.016mol)的EtOH(250ml)混合物搅拌2天，然后将溶剂蒸发(真空)。将所得残余物吸收在DCM和水中，将所得有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上(15-40μm)通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 97/1)对上述所得残余物进行纯化。对纯馏分进行蒸发，从而得到4g(61％)中间体1，熔点128℃。与中间体1相对应的酯可以通过手性色谱法进行分离。
b)中间体2
的制备
在室温下，将中间体1(0.0007mol)的1N氢氧化钠(10ml)和THF(20ml)混合物搅拌48小时。将1N盐酸(10ml)加入其中。将溶剂蒸发。将沉淀过滤、用水洗涤、然后用DIPE洗涤并且对其进行干燥，从而得到0.2g(72％)中间体2，熔点232℃。
c)中间体3
Figure A20058002548700361
的制备
将三乙基胺(0.012mol)、N′-(乙基亚胺酰基)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺(0.00593mol)、1-羟基-1H-苯并三唑(0.00593mol)和O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟胺(0.00593mol)加入到中间体2(0.00395mol)的DCM(70ml)和THF(70ml)混合物的混合物中，然后在室温下将上述反应混合物搅拌3天。将H2O加入其中。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。通过柱色谱(梯度洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)对上述所得残余物进行纯化。收集产品馏分并且将有机溶剂蒸发，从而得到1.5g(84％)中间体3。
实施例A2
a)中间体4
Figure A20058002548700362
的制备
在室温下，将2-(1-哌嗪基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0042mol)、1，4-二氧六环-2，5-二醇(0.0042mol)和(E)[2-(4-氯苯基)乙烯基]-硼酸(0.0042mol)的EtOH(100ml)混合物搅拌72小时，将其倾倒入水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上(15-40μm)通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)对上述所得残余物进行纯化。收集两种馏分并且将溶剂蒸发，从而得到0.85g F1(油)和0.25g F2(总产率：63％)。在2-丙酮/DEPE中对F1进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.6g中间体4，熔点110℃。
b)中间体5
Figure A20058002548700371
的制备
在N2流动下，在5℃下将甲磺酰氯(0.0012mol)加入到中间体4(0.0006mol)和三乙胺(0.0024mol)的THF(15ml)溶液中。
将上述混合物升温至室温，然后将其搅拌1小时并且将其倾倒入冰水中。用DCM对上述混合物进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发，从而得到0.3g中间体5。该产品可以直接用于下一反应步骤中。
c)中间体6
Figure A20058002548700372
的制备
将中间体5(0.0006mol)、吗啉(0.0009mol)和碳酸钾(0.0018mol)的乙腈(30ml)混合物在80℃下搅拌15小时，将其倾倒入水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上(15-40μm)通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 100/0～90/10)对上述所得残余物(0.27g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.085g(29％)中间体6。
d)中间体7
的制备
在室温下，将中间体6(0.0002mol)的1N氢氧化钠(1.5ml)和THF(3ml)混合物搅拌72小时。将1N盐酸(1.5ml)加入其中。
对上述混合物进行蒸发直至干燥为止，得到中间体7。该产品可以直接用于下一反应步骤中，
e)中间体8
Figure A20058002548700382
的制备
在室温下，将中间体7(0.0002mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0002mol)、EDC(0.0002mol)、HOBT(0.0002mol)和三乙胺(0.0002mol)的DCM/THF(10ml)混合物搅拌48小时，将其倾倒入水中并且用EtOAc对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上(5μm)通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)对上述所得残余物(0.095g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.04g(41％)中间体8。
实施例A3
a)中间体11
Figure A20058002548700383
的制备
在N2流动下，将室温的乙醇钛(0.0085mol)加入到2-(1-哌嗪基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0042mol)和4-苯基-3-丁烯-2-酮(0.0051mol)的1，2-二氯乙烷(45ml)溶液中。在室温下将上述所得混合物搅拌24小时。将NaBH(OAc)3(0.0085mol)加入其中。将上述混合物搅拌5小时并且将其倾倒入冰水中。将DCM加入其中。将所得混合物滤过硅藻土。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在kromasil(5μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 100/0～95/5)对上述所得残余物(1.16g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.12g(8％)中间体11。
b)中间体12
的制备
将中间体11(0.0003mol)和氢氧化钠(0.0013mol)的EtOH(15ml)混合物搅拌和回流3小时，然后将其冷却至室温并且将其蒸发至干燥。将所得残余物吸收在乙醚中。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.12g(100％)中间体12，熔点＞260℃。
c)中间体13
Figure A20058002548700392
的制备
在N2流动下，在室温下将EDC(0.0006mol)和HOBT(0.0006mol)加入到中间体12(0.0003mol)的THF(15ml)和DCM(15ml)溶液中。将上述反应混合物搅拌15分钟。将O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0006mol)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌48小时，将其倾倒入冰水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在kromasil(5μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 100/0～95/5)对上述所得残余物(0.25g)进行提取。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.1g(70％)中间体13。
实施例A4
a)中间体14
Figure A20058002548700401
的制备
将2-(1-哌嗪基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.059mol)的THF(300ml)和1N氢氧化钠(300ml)混合物在室温下放置过夜，然后对其进行搅拌。将1N盐酸(300mL)加入其中并且将此混合物搅拌10分钟。将碳酸钠(0.178mol)加入其中并且在室温下将所得混合物搅拌10分钟，然后将1-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基]-2，5-吡咯烷二酮(0.059mol)分小份加入其中并且在室温下将所得反应混合物搅拌15小时。用浓HCl对上述混合物进行酸化，将沉淀滤出并且对其进行干燥(真空)，从而得到22.5g(90％)中间体14，熔点218.5～221.2℃。
b)中间体15
Figure A20058002548700402
的制备
将三乙胺(0.069mol)加入到中间体14(0.0233mol)的DCM/THF(500ml)混合物中，然后将EDC(0.0303mol)和HOBT(0.0303mol)加入其中，随后将O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0303mol)加入其中，在室温下将上述所得混合物搅拌18小时。所得反应混合物用DCM进行稀释并用水进行洗涤。将有机层分离并且用10％碳酸钠溶液对其进行洗涤。对分离的有机层进行干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。通过快速色谱法(洗脱液：在100分钟内DCM/MeOH 100/0～＞97.5/2.5)对所得残余物进行纯化。对产品馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到8.4g(68％)中间体15。
c)中间体16
Figure A20058002548700411
的制备
在室温下将中间体15(0.016mol)的吡啶(0.040mol)和DCM(200ml)混合物搅拌过夜并且用水对所得反应混合物进行提取，然后对水层进行浓缩并且使其与乙腈进行共蒸发。通过快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH/NH3 95/5/0.5)对上述所得残余物(3.5g)进行纯化。对产品馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到2.5g(50％)中间体16，熔点70.8～93.9℃。
d)中间体17
Figure A20058002548700412
的制备
在室温下将中间体16(0.002mol)、(E)[2-(4-氟苯基)乙烯基]-硼酸(0.002mol)和1，4-二氧六环-2，5-二醇(0.002mol)的EtOH(25ml)混合物搅拌15小时，然后将其倾倒在冰上。将NaHCO3加入其中。用DCM对上述所得混合物进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在kromasil(5μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 100/0～90/10)对上述所得残余物(0.68g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.27g(29％)中间体17，熔点90℃。
实施例A5
a)中间体18
Figure A20058002548700421
的制备
将2-氧代-丙酸(0.0169mol)加入到[2-(4-氟苯基)乙烯基]-硼酸(0.0169mol)的DCM(150ml)溶液中，然后将2-(1-哌嗪基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0169mol)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌15小时。将2-氧代丙酸(0.4当量)和[2-(4-氟苯基)乙烯基]-硼酸(0.1当量)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌15小时。所得有机层用水洗涤、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶(15～40μm)上通过柱色谱(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0.1)对上述所得残余物(7.7g)进行纯化。对纯馏份进行收集并且将溶剂蒸发。将所得残余物(6g)溶于3N HCl中。在室温下将上述混合物搅拌2小时。将沉淀过滤、用水(少量)洗涤并且对其进行干燥，从而得到2.8g(36％)中间体18。
b)中间体19
Figure A20058002548700422
的制备
将HOBT(0.0022mol)加入到中间体18(0.0015mol)、N-甲基-甲胺(0.0022mol)和三乙胺(0.0075mol)的DCM/THF(40ml)溶液中，然后将EDC(0.0022mol)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌24小时，将其倾倒入水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。将所得残余物吸收在DIPE中。将所得沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.58g(85％)中间体19；熔点195℃。
c)中间体20
Figure A20058002548700431
的制备
在室温下，将中间体19(0.0011 10ml)和氢氧化锂(0.0023mol)的THF(20ml)和水(10ml)混合物搅拌15小时。将3N HCl加入其中。将THF蒸发。将沉淀过滤、用水洗涤、然后用乙醚洗涤并且对其进行干燥，从而得到0.45g(82％)中间体20。
d)中间体21
Figure A20058002548700432
的制备
在室温下，将HOBT(0.0014mol)加入到中间体20(0.0009mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0014mol)和三乙胺(0.0043mol)的DCM/THF(50/50)(75ml)溶液中，随后将EDC(0.0014mol)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌48小时，将其倾倒入水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上(5μm)通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.1～94/6/0.6)对上述所得残余物(0.7g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.38g(75％)中间体21。
实施例A6
a)中间体22
Figure A20058002548700441
的制备
在N2流动下，在5℃下将氢化钠60％(0.0085mol)分份加入到中间体1(0.0065mol)的THF(60ml)溶液中。在5℃下将上述混合物搅拌15分钟。将碘代甲烷(0.0078mol)的THF(5ml)溶液滴加加入其中。在5℃下将上述混合物搅拌1小时，然后在室温下将其搅拌5小时，将其倾倒在冰上并且用EtOAc对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶(15～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH 99/1)对上述所得残余物(1.75g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.87g(34％)中间体22。
b)中间体23
Figure A20058002548700442
的制备
在室温下，将中间体22(0.0027mol)和氢氧化锂一水合物(0.0055mol)的THF(40ml)和水(20ml)混合物搅拌48小时，用1N HCl对其进行酸化。将THF蒸发。将所得沉淀过滤、用少量水洗涤并且对其进行干燥，得到0.91g(83％)中间体23。
c)中间体24
的制备
在室温下、氮气流中，将HOBT(0.0033mol)加入到中间体23(0.0022mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0033mol)和三乙胺(0.01mol)的DCM/THF(90ml)溶液中，随后将EDC(0.0033mol)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌48小时，将其倾倒入水中并且用DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶(15～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)对上述所得残余物(1.3g)进行纯化。对纯馏分进行收集并且将溶剂蒸发，从而得到0.93g(89％)中间体24。
实施例A7
a)中间体25
Figure A20058002548700451
的制备
在室温下，将2-(1-哌嗪基)-5-吡啶基甲酸乙酯(0.0085mol)、1，4-二氧六环-2，5-二醇(0.0093mol)和(E)-[2-(4-氟苯基)乙烯基]-硼酸(0.0042mol)的EtOH(200ml)混合物搅拌15小时，然后对其进行过滤。将滤液蒸发。将所得残余物吸收在EtOAc中。所得有机层用饱和NaCl洗涤、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。将所得残余物(3.3g)溶于乙醚中并且通过在5℃下向其中滴加加入5～6N的HCl异丙醇溶液(2ml)对其进行酸化。将沉淀滤出、用乙醚洗涤并且进行干燥。将此馏分吸收在水中，将K2CO3加入其中并且通过DCM对所得混合物进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发，得到2.7g(79％)中间体25。
b)中间体26
Figure A20058002548700461
的制备
在室温下，将中间体25(0.002mol)、氢氧化锂(0.004mol)的水(20ml)和THF(40ml)混合物搅拌15小时。对上述混合物进行浓缩。将3N盐酸加入其中。将沉淀过滤、用水洗涤、然后用乙醚洗涤并且对其进行干燥，从而得到0.52g(63％)中间体26。
c)中间体27
Figure A20058002548700462
的制备
将三乙胺(0.0057mol)，N′-(乙基亚胺酰基)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺(0.0019mol)、1-羟基-1H-苯并三唑(0.0019mol)和O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0019mol)加入到中间体26(0.0012mol)的DCM(50ml)和THF(50ml)混合物的混合物中。在室温下将上述反应混合物搅拌24小时，然后将其倾倒入H2O中并且通过DCM对其进行提取。将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶上通过柱色谱(梯度洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2)对所得残余物进行纯化。对产品馏分进行收集并且将有机溶剂蒸发，从而得到0.55g(91％)产品。将上述残余物吸收在乙醚中，将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.5g中间体27，熔点133℃。
实施例A8
中间体28和29
Figure A20058002548700471
的制备
中间体28：游离碱
中间体29：C2H2O4(1∶1)
在5℃下，将乙酸酐(0.014mol)滴加加入到中间体3(0.0014mol)、4-N，N-二甲基氨基吡啶(0.0095g)和吡啶(2.5ml)的DCM(14ml)混合物中。在室温下将上述混合物搅拌24小时、对其进行浓缩、将其吸收在水中并且用乙酸乙酯对其进行提取。将有机层干燥(MgSO4)、过滤并且将溶剂蒸发。在硅胶(5μm)上通过柱色谱(梯度洗脱液：DCM/MeOH 95/5)对上述所得残余物进行纯化。对纯馏分进行收集并且将有机溶剂蒸发，从而得到0.48g(58％)中间体28。对馏分(0.05g)进行乙二酸盐的制备并且在2-丙酮/乙醚中对其进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.042g中间体29，熔点154℃。
表F-1列出了根据一种上述实施例制备的中间体。
表F-1(中间体)，其中Interm.即为中间体；Ex.即为实施例；mp.即为熔点。
Figure A20058002548700481
Figure A20058002548700491
Figure A20058002548700501
B.最终化合物的制备
实施例B1
化合物1
的制备
将中间体3(0.00121mol)的TFA(2.5ml)和MeOH(50ml)混合物搅拌48小时，然后将溶剂蒸发。在硅胶LiChroprepNH2(25～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/H2O 80/20/2)对上述所得残余物进行纯化。对纯馏份进行收集并且将溶剂蒸发。将所得残余物吸收在乙醚中，将沉淀滤出并且在50℃下对其进行干燥(真空)，从而得到0.26g(64％)化合物1，熔点187℃。
实施例B2
化合物2
Figure A20058002548700503
的制备
在室温下，将中间体8(0.00007mol)的三氟乙酸(0.2ml)和MeOH(4.5ml)混合物搅拌96小时。将溶剂蒸发至干燥。在乙醚/2-丙酮中对所得残余物进行结晶。将所得沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.025g(57％)化合物2，熔点135℃。
实施例B3
化合物7
的制备
在室温下，将中间体13(0.0002mol)的TFA(0.5ml)和MeOH(10ml)混合物搅拌48小时，然后将其蒸干。在乙醚中对所得残余物进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.044g(44％)化合物7，熔点161℃。
实施例B4
化合物8
的制备
在室温下，将中间体17(0.0005mol)的TFA(1.2ml)和MeOH(24ml)混合物搅拌5天。将溶剂蒸发至干燥。在硅胶LiChroprep
Figure 200580025487810000210003_11
NH2(25～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/H2O 70/30/3)对上述所得残余物(0.26g)进行纯化。对纯馏份进行收集并且将溶剂蒸发。在乙醚中对所得残余物(0.16g)进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.13g(66％)化合物8，熔点180℃。
实施例B5
化合物9
Figure A20058002548700521
的制备
在室温下，将中间体28(0.0004mol)的TFA(1ml)和MeOH(20ml)混合物搅拌96小时，然后将其蒸干。在硅胶LiChroprep
Figure 200580025487810000210003_12
NH2(25～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/H2O 80/20/2)对上述所得残余物(0.23g)进行纯化。对纯馏份进行收集并且将溶剂蒸发。在乙醚/DIPE中对所得残余物(0.106g)进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.067g(34％)化合物9，熔点161℃。
实施例B6
化合物10
Figure A20058002548700522
的制备
在5℃下，将TFA(1.9ml)滴加加入到中间体21(0.0007mol)的MeOH(38ml)溶液中。在室温下将上述混合物搅拌48小时，然后将其蒸干。在乙醚/CH3CN中对所得残余物进行结晶。将沉淀过滤、用乙醚洗涤并且对其进行干燥，从而得到0.24g(62％)化合物10，熔点146℃。
实施例B7
化合物11
Figure A20058002548700531
的制备
在室温下，将中间体24(0.0018mol)的TFA(4.4ml)和MeOH(87ml)混合物搅拌4天，然后将其蒸干。在硅胶LiChroprep
Figure 200580025487810000210003_13
NH2(25～40μm)上通过柱色谱(洗脱液：DCM/MeOH/H2O 80/20/2)对上述所得残余物(1.05g)进行纯化。对纯馏份进行收集并且将溶剂蒸发。将此馏分(0.634g)吸收在乙醚中。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.43g化合物11，熔点212℃。
实施例B8
化合物31
Figure A20058002548700532
的制备
在室温下，将中间体27(0.0011mol)的三氟乙酸(3ml)和MeOH(60ml)混合物搅拌48小时。将溶剂蒸发至干燥。在乙醚中对所得残余物进行结晶。将沉淀滤出并且对其进行干燥，从而得到0.515g(89％)化合物31，熔点145℃。
表F-2列出了根据一种上述实施例制备的化合物。在表格中使用以下缩略语：.C2HF3O2表示三氟乙酸盐。
表F-2(最终化合物)，其中Co.No.即化合物号；Ex.即实施例；mp.即熔点。
Figure A20058002548700541
Figure A20058002548700551
C.药理学实施例
组蛋白脱乙酰基酶抑制作用的体外测定法(参见实施例C.1)测量了由式(I)化合物得到的对HDAC酶活性的抑制作用。
使用用于细胞毒性或者存活的比色测定法对式(I)化合物关于A2780肿瘤细胞的细胞活性进行测定(Mosmann Tim，Journal ofImmunological Methods 65：55-63，1983)(参见实施例C.2)。
化合物的溶解性度量化合物保持在溶液中的能力。在第一方法中，通过稀释对化合物保持在水溶液中的能力进行测定(参见实施例C.3.a)。在连续三个步骤中使用同一种含水缓冲溶剂对DMSO-母液进行稀释。对于每种稀释物，用浊度计对其混浊度进行测定。
在第二种方法中，可以通过应用化学发光氮气检测器对化合物在不同pH值下的溶解性进行测定(参见实施例C.3.b)。
药物的通透性表现为其由一种介质移动到或者穿过另一种介质的能力。明确而言，是其通过肠膜进入血流和/或从血流进入目标的能力。通透性(参见实施例C.4)可以通过穿过滤器固定化的人工膜磷脂双层的构造进行测定。在滤器固定化的人工膜测定法中，“夹心”由96孔微滴定板和96孔过滤板形成，从而使得各个复合孔被分成在底部具有给体溶液和在顶部具有受体溶液的两个室，所述两个室通过125μm微过滤盘(0.45μm气孔)并且涂覆有二油酰基磷脂酰基-胆碱的2％(wt/v)十二烷溶液，所述测定在该系统接触含水缓冲溶液时在滤器通道内形成多层双层的条件下进行操作。化合物穿过该人工膜的通透性以cm/s进行计量。其目的是寻找药物在两种不同pH值4.0和7.4下穿过平行人工膜的渗透性。利用UV-光谱测定法，在250～500nm之间的最佳波长下对化合物进行检测。
药物的代谢作用是指该脂溶性异种生物化合物或者生物内生化合物被酶催化转化为极性、水溶性和可排泄的代谢产物。药物代谢的主要器官为肝脏。代谢产物的活性通常低于其母体药物或者是无活性的。然而，一些代谢产物可能具有增强的活性或者有毒性作用。由此，药物代谢可以包括“去毒化”和“毒化”过程。一种确定有机体是否具有处理药物和化学物质的能力的主要酶系统为细胞色素P450单氧化酶，该酶是NADPH依赖型酶。通过利用亚细胞人组织，可以对化合物的新陈代谢稳定性进行体外确定(参见实施例C.5.a.)。本文中化合物的新陈代谢稳定性由这些化合物与微粒体培养15分钟之后代谢药物的百分比表示。通过LC-MS分析对化合物的量进行确定。化合物的新陈代谢稳定性还可以通过计算鼠肝细胞中存留一半进行确定(参见实施例C.5.b.)。
已经表明，多种抗肿瘤试剂活化p21蛋白，包括DNA损伤剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。DNA损伤剂通过肿瘤抑制剂p53活化p21基因，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂经转录因子Sp1转录活化p21基因。由此，DNA损伤剂通过p53响应元素活化p21促进剂，同时组蛋白脱乙酰基酶抑制剂通过sp1位置(相对于TATA框位于-60bp～+40bp区域)活化p21促进剂，这些都会引起p21蛋白的增强表达。当细胞中的p21促进剂由不含有p53响应元素的p21 1300bp促进剂片段组成时，其相应的也不会对DNA损伤剂产生响应。化合物诱发p21的能力可以通过多种方法进行测定。第一种方法是用所研究的化合物处理肿瘤细胞，并且在细胞消散之后通过p21酶联免疫吸附测定法(致癌基因的WAFl ELISA)检测p21感应。所述p21测定法是同时使用鼠单株抗体与兔多克隆抗体的酶免疫分析法。对人类p21蛋白具有特异性的兔多克隆抗体已经被固定在试剂盒所提供的塑料孔表面上。任何要测定的存在于样品中的p21均会与捕获抗体结合。生物素酰化检测剂单克隆抗体还可以识别人类p21蛋白，而且可以与通过捕获抗体得到保持的任何p21蛋白结合。检测剂抗体，则通过辣木属过氧化物-偶联的抗生物素蛋白链菌素得到结合。所述辣根过氧化酶催化生色底物四甲基联苯胺的无色溶液转化成蓝色溶液(或者在加入中止剂之后变为黄色)，其强度与结合至板上的p21蛋白的量成正比。显色反应的产品通过分光光度计进行定量。所述定量通过使用已知浓度的p21(通过冻干法提供)构建标准曲线获得。该测定法可以测量作为DNA损伤结果或者作为组蛋白脱乙酰基酶抑制结果的p21诱导(参见实施例C.6a)。
另一种方法在细胞水平上测试作为HDAC抑制作用的化合物诱发p21的能力。利用含有不包括p53响应元素并且其中指示基因表达得到增强的p21 1300bp促进剂片段的表达载体，与对照浓度相比较，细胞可以得到稳定转染，可以鉴定具有p21诱导能力的化合物。所述指示基因为荧光蛋白并且可以将指示基因的表达测定为发射荧光的量(参见实施例C.6.b.)。后一种方法为体内方法，其中鼠用于筛选化合物的药物活性。可以将上述稳定转化的肿瘤细胞以足以形成肿瘤的量施用至鼠。在肿瘤细胞经过形成肿瘤的充分时间之后，可以将潜在的活性化合物给药至动物，并且通过测量指示基因的表达，对所述化合物对肿瘤细胞的效果进行测定。与对照浓度相比，利用药物活性化合物的培养将会导致指示基因表达的增强(参见实施例C.6.C.)。
特异性的HDAC抑制剂不应抑制其它酶，比如大量存在的CYPP450蛋白。CYP P450(大肠杆菌表达的)蛋白质3A4、2D6和2C9可以将它们的特异性基质转化为荧光分子。CYP3A4蛋白将7-苄氧基-三氟甲基香豆素(BFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白将3-[2-(N，N-二乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)转化为3-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-7-羟基-4-甲基香豆素盐酸盐，和CYP2C9蛋白将7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)转化为7-羟基-4-三氟甲基香豆素。抑制这种酶促反应的化合物将会导致荧光信号的降低(参见实施例C.7)。
实施例C1：组蛋白脱乙酰基酶抑制作用的体外测定
使用Biomol(cat.No：AK-500-0001)的HDAC Fluorescent ActivityAssay/Drug Discovery Kit。所述HDAC荧光活性测定法基于Fluor deLys(荧光组蛋白脱乙酰基酶Lvsyl)基质和展开剂的联用。所述Fluorde Lys基质含有乙酰化的赖氨酸侧链。基质的脱乙酰作用使得基质具有感光性，从而在第二步骤中用Fluor de Lys显像剂进行的处理可以产生荧光基团。
HeLa核提取物(Biomol供应)在60μg/ml与75μM基质下进行培养。将Fluor de Lys基质加入到pH值为7.4的含有25mM Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl和1mM MgCl2.6H2O的缓冲液中。30分钟之后，将1体积的显像剂加入其中。用355nm光线对荧光基团进行激发并且在荧光板读数器上对激发光线(450nm)进行检测。
对于各次试验，对照试验(含有HeLa核提取物和缓冲液)、空白培养(含有缓冲液，但不含有HeLa核提取物)和样品(含有溶于DMSO中的化合物并且进一步在缓冲液中进行稀释，和含有HeLa核提取物)进行平行进行。在第一种情形中，化合物在10-5M的浓度下进行试验。当化合物在10-5M显示活性时，构造浓度-反应曲线，其中化合物在10-5M～10-9M之间的浓度下进行试验。所有的样品都试验4次。在各次试验中，从对照试验值核样品值中减去空白值。对照样品表示100％的基质脱乙酰化作用。对于各个样品，其荧光值由对照平均值的百分比表示。适当时，采用分级数据的概率分析对IC50值(使代谢产物的量降低至对照组的50％时所需要的药物浓度)进行计算。在此将试验化合物的效果表示为pIC50(IC50值的负对数值)(参见表F-3)。
实施例C.2：对A2780细胞抗增殖活性的测定
将所有试验化合物都溶于DMSO中，再在培养介质中对其进行进一步稀释。在细胞增殖测定中，最终的DMSO浓度不能超过0.1％(v/v)。对照组含有A2780细胞和DMSO，但是没有化合物，空白组含有DMSO，但是不含有细胞。将MTT以5mg/ml溶解于PBS中。制备含有0.1M甘氨酸和0.1M NaCl，并且用NaOH(1N)缓冲至pH值为10.5的甘氨酸缓冲液(所有试剂都得自于Merck)。
将人类A2780卵巢癌细胞([Fox Chase Cancer Centre，Pennsylvania，USA]Dr T C Hamilton热心捐赠)培养在补充有2mML-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清得RPMI 1640介质中。通常在37℃下，在湿润得5％CO2气氛下将细胞保持为单层培养。每周使用分流比为1∶40得胰蛋白酶/EDTA溶液传代一次。所有的介质核补充物都得自于Life Technologies。采用Gen-Probe类菌质体组织培养试剂盒(供应商：BioMerieux)测得细胞中不含有类菌质体污染。
将细胞接种在NUNCTM 96孔培养板(供应商：Life Technologies)中并且使之粘附在塑料板上过夜。涂覆密度为每孔1500个细胞，总体积为200μl介质。在将细胞粘附到板上之后，对介质进行改变并且将药物和/或溶剂加入其中，至最终体积为200μl。培养4天之后，用200μl新鲜介质替换原介质，利用基于MTT的测定法对细胞密度和生存能力进行评价。向各个孔中加入25μlMTT溶液并且在37℃下将其中细胞再另外培养2小时。然后将介质小心地吸出，通过加入25μl甘氨酸缓冲液，随后加入100μl DMSO使蓝色的MTT-甲
Figure A20058002548700611
产品得到溶解。在微板振荡器上微量培养板振摇10分钟，使用Emax 96-孔分光光度计(供应商：Sopachem)测定540nm处的吸光度。在试验中，各次试验条件的结果为三个重复孔的平均值。基于初次筛选的目的，在单一固定浓度10-6M下对化合物进行试验。对于活性化合物，对其进行重复试验，从而建立其完全浓度-响应曲线。对于各次试验，平行进行对照(不含药物)和空白培养(不含有细胞和药物)试验。从所有的对照值和样品值中扣除空白值。对于各个样品，细胞生长的平均值(以吸光度为单位)都表示为相对于对照组细胞生长的百分数平均值。适当时，利用分级数据的概率分析对IC50值(将细胞生长降低至对照组的50％时所需要的药物浓度)进行计算(Finney，DJ，ProbitAnalyses，第二版，Chapter 10，Graded Responses，CambridgeUniversity Press，Cambridge 1962)。在此将试验化合物的效果表示为pIC50(IC50值的负对数值)(参见表F-3)。
实施例C.3溶解性/稳定性
实施例C.3a.水介质中的动态溶解性
在第一稀释步骤中，将10μl活性化合物的浓缩母液溶解于DMSO(5mM)中，将其加入至100μlpH值为7.4的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中并且对其进行混合。在第二稀释步骤中，将等分(20μl)第一步骤稀释溶液进一步分散在100μlpH值为7.4磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中并且对其进行混合。最后，在第三稀释步骤中，将第二稀释步骤的样品(20μl)进一步稀释在100μlpH值为7.4的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中并且对其进行进一步混合。所有的稀释都在96孔板中进行。在最后一次稀释步骤之后，立即使用浊度计对三个连续稀释步骤的混浊度进行测定。每种化合物的稀释溶液都进行三次重复试验，从而排除随机误差。根据浊度测定值将其分为3级。具有高溶解度的化合物获得3分，这种化合物的第一次稀释溶液为澄清溶液。具有中等溶解度的化合物获得2分。这种化合物的第一次稀释溶液不澄清，但是第二次稀释溶液澄清。具有低溶解度的化合物获得1分，这种化合物的第一次和第二次稀释溶液均不澄清(参见表F-3)。
C.3.b.溶解性
化合物在不同pH值下的溶解性，还可以通过应用化学发光氮气检测器进行测定(参见表F-3)。
实施例C.4：平行人工膜通透性分析
在含有2ml pH值为4或者pH值为7.4的含水缓冲液系统(PSR4系统溶液浓缩物(pION))的深孔或者预混合板中，对原料样品(在100％DMSO中为5mM的等分10μl母液)进行稀释。
在将样品加入到基准板之前，将150μl缓冲液加入到孔中并且进行空白UV测定。此后，将缓冲液除去并且将该板用作基准板。所有测定都在抗UV板(供应商：Costar或者格雷纳)中进行。在对基准板进行空白测定之后，将150μl稀释的样品加入到基准板中，将200μl稀释的样品加入到给体板1上。对受体过滤板1(供应商Millipore，类型-MAIP N45)涂覆4μl人工膜形成溶液(在含有0.1％2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的十二烷中含有1，2-二油酰基-顺式-甘油-3-胆碱磷酸)并且将其置于给体板1顶部，从而形成“夹层”。将缓冲液(200μl)分配入顶部的受体孔中。对此夹心加盖并且在室温下，在暗处将其贮存18小时。
通过向孔中加入150μl缓冲液对受体板2进行空白测定，随后对其进行UV测定。在对受体板2进行空白测定之后，将缓冲液除去并且将150μl受体溶液从受体过滤板1转移至受体板2中。然后从夹层中除去受体过滤板1。在对给体板2进行空白测定(参见上文)之后，将150μl给体溶液从给体板1转移至给体板2。对给体板2、受体板2和基准板孔的UV光谱进行扫描(用SpectraMAX 190进行)。利用PSR4p Command Software对所有的光谱进行处理，从而计算其通透性。所有的化合物都进行三次重复测定。在各次试验中使用酰胺咪嗪、灰黄霉素(griseofulvin)、无环鸟苷(acycloguanisine)、阿替洛尔、利尿磺胺和氯噻嗪作为标准样品。将化合物分为三类：低通透性化合物(平均效果＜0.5×10-6cm/s，记分1)、中等通透性(1×10-6cm/s＞平均效果≥0.5×10-6cm/s，记分2)或者高通透性(≥1×10-6cm/s，记分3)。
实施例C.5：新陈代谢稳定性
实施例C.5.a.
根据Gorrod等人(Xenobiotica 5453-462，1975)所述对亚细胞组织进行制备，其中在组织机械均化作用之后对其进行离心分离。在冰冷的0.1M Tris-HCl(pH值7.4)缓冲液中对肝组织进行洗涤，从而洗掉过量血液。随后将组织吸干、称重并且使用手术剪粗略剪断。在3倍体积的冰冷0.1M磷酸盐缓冲液(pH值7.4)中对上述组织片进行均质化，使用装配有Teflon杵棒的Potter-S(Braun，Italy)或者Sorvall Omni-Mix均质器将其均质化7×10秒。在上述两种情形中，在均质化处理期间，将容器保持在冰中/上。
在4℃下，使用Sorvall离心机或者Beckman超离心机，在9000xg下将组织匀浆离心20分钟。将所得上清液贮存在-80℃下并且将其标示为‘S9’。可以使用Beckman超离心机，在100 000xg下将上述S9组分进一步离心60分钟(4℃)。将所得上清液小心地吸出，将其分为等分并且将其称为“胞质液”。将所得团粒以每0.5g原组织重量1ml终体积的浓度再悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液(pH值7.4)中，并且将其称为“微粒体”。将所有的亚细胞组分分成等分、立即将其冷冻于液氮中并且在-80℃贮存，直至使用。
对于所用要进行试验的样品，培养混合物都含有PBS(0.1M)、化合物(5μM)、微粒体(1mg/ml)和NADPH-生成系统(0.8mM葡糖-6-磷酸、0.8mM氯化镁和0.8单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。对照样品含有相同的物质，但是将其中微粒体替换为通过加热灭活(95摄氏温度下加热10分钟)的微粒体。对照样品中化合物的回收率总是100％。
在37摄氏度下将上述混合物预培养5分钟。在零时间点(t＝0)时通过加入0.8mM NADP启动反应，并且将样品培养15分钟(t＝15)。通过加入2倍体积的DMSO来终止反应。然后将样本以900xg离心10分钟，在分析之前将上清液于室温下贮存不超过24小时。所有培养都一式两份进行。通过LC-MS分析对上清液进行分析。在Xterra MS C18(50×4.6mm，5μm，Waters，US)上进行样本洗脱。使用Alliance 2790(供应商：Waters，US)HPLC系统。使用缓冲液A(在H2O/乙腈中浓度为25mM乙酸铵(pH值5.2))、溶剂B(乙腈)和溶剂C(甲醇)以2.4ml/min的流速进行洗脱。所采用的梯度是，按照线性方式将有机相浓度在5分钟之内由0％升高至50％B和50％C，然后在1分钟之内将其升高至高达100％B，之后将有机相浓度保持恒定1.5分钟。样品的总注射体积为25μl。
使用装配有ESI源的Quattro(供应商：Micromass，Manchester，UK)三重四极质谱仪作为检测器。将ESI源和去溶剂化温度分别设定在120℃和350℃，并且将氮气用作喷雾剂和干燥气体。以正扫描的方式(单个离子反应)获得数据。将锥管电压设定为10V，停留时间为1秒。代谢稳定性以在活性微粒体(E(act))存在下培养15分钟之后化合物的代谢百分比表示(％代谢＝100％-((在t＝15时E(act)的总离子电流(TIC)/t＝0时E(act)的TIC)×100)。代谢百分数小于20％的化合物定义为高度代谢稳定的化合物。代谢百分数为20～70％的化合物定义为中等稳定化合物，和代谢百分数高于70％的化合物定义为低代谢稳定化合物。在进行新陈代谢稳定性筛选时，始终含有三种参考化合物。内含维拉帕米作为具有低代谢稳定性的化合物(％代谢＝73％)。内含西沙必利作为具有中等代谢稳定性的化合物(％代谢45％)，和内含丙醇作为具有中等至高代谢稳定性的化合物(25％代谢)。这些参考化合物用来证实新陈代谢稳定性测定。
C.5.b：鼠肝细胞培养的代谢稳定性
鼠肝细胞从雄性Sprague Dowley大鼠中分离得到。将化合物在100％DMSO溶解成为5mM母液，并且使用24孔板在最终浓度为5μM下与鼠肝细胞培养物(0.5百万活细胞/0.5ml)一起培养0、15、30、60和120分钟。通过加入两倍体积的DMSO制备用于LC-MS的样品。将样品充分振荡并且随后在900g下将其离心10分钟(室温)。所有的试验都一式三份进行。通过LC-MS对50μl所得上清液进行分析。关于LC-MS，在Hypersil BDS C18柱(50×4.6mm，5μm，Thermohypersil，UK)上对样品进行洗脱。所述HPLC系统包含装备有Surveyor自动取样器装置的Surveyor分配系统(Surveyor Inc.，San Jose，US)。使用缓冲液A(在H2O/乙腈(95∶5)中浓度为10mM的乙酸铵(pH 6.9))和溶剂B(乙腈)，在1.2ml/min的流速下进行洗脱。使用的梯度为溶剂A作为开始条件，运行0.5分钟，随后以线性方式在2分钟内将有机相浓度由0％B增加到95％B。将该阶段保持恒定2分钟并且在0.5分钟时间内再次将其降低至0％B。
样品的总注射体积为50μl。将柱温保持在40℃。为了进行MS检测，对LC流进行分流并且将0.1ml进入MS源内。使用装配有ESI源的三重四极质谱仪TSQ Quantum(Thermofinnigan，LaJolla，USA)质谱仪作为检测器。将源电压设定为3800伏特，毛细管温度设定为300℃。为了进行定量的目的，所述质谱仪在正离子模式下按照SIM调节的M+H质量进行运行，扫描宽度为1Da。仪器控制、数据采集和处理都使用Xcalibur软件(ThermoFinnigan，San Jose，CA，U.S.A)进行。化合物在鼠肝细胞中的代谢稳定性由其体外半衰期表示。作为参照，使用了化合物R306465(WO03/76422)(体外半衰期：8分钟)。对本申请的化合物4进行了试验，其体外半衰期为23分钟。
实施例C.6：p21诱导能力
实施例C.6.a：p21酶联免疫吸附测定
以下方案已经被用于测定p21蛋白在人类A2780卵巢癌细胞中的表达水平。将A2780细胞(20000个细胞/180μl)接种在96微孔板中的补充有2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640介质中。在细胞裂解前24小时，将化合物以10-5、10-6、10-7和10-8M的最终浓度加入其中。将所有测试化合物都溶于DMSO中并且在培养介质中对其进行进一步稀释。在加入化合物24小时之后，将上清液从细胞中除去。用200μl冰冷的PBS对细胞进行洗涤。将细胞吸出，并且将30μl裂解缓冲液(50mM Tris.HCl(pH 7.6)、150mM NaCl、1％Nonidet p40和10％丙三醇)加入其中。在-70℃下将该板培养过夜。
从箔袋中取出适当数量的微量滴定孔并且将其置于空的孔支持器内。制备洗涤缓冲液(20×板洗涤浓缩液：100ml PBS和表面活性剂的20倍浓溶液，含有2％氯乙酰胺)的工作溶液(1×)。用蒸馏水对冷冻干燥的p21WAF标样进行重新配制，并且用样品稀释剂(提供于试剂盒)对其进行进一步稀释。
通过在样品稀释中按照1∶4稀释对样品进行预备。将样品(100μl)和p21WAFl标准样品(100μl)移液入适当的孔中并且在室温下将其培养2小时。用1×洗涤缓冲液将各个孔洗涤3次，然后将100μl检测抗体试剂(生物素酰化的单克隆p21WAFl抗体溶液)移液加入各个孔中。将上述孔在室温下培养1小时，然后用1×洗涤缓冲液将其洗涤三次。对400×偶联物(过氧化物酶辣根偶联物：400倍浓溶液)进行稀释，并且将100μl的1×溶液加入到各个孔中。在室温下将孔培养30分钟，然后用1×洗涤缓冲液将其洗涤3次，用蒸馏水将其洗涤1次。将基质溶液(生色底物)(100μl)加入到孔中，并且在室温下在暗处将孔培养30分钟。按照与先前加入基质溶液相同的次序向各个孔中加入终止溶液。使用分光光度平板读数器，在450/595nm双波长下对各个孔的吸光度进行测量。
对于各次试验，均平行进行对照(不含药物)和空白培养(不含细胞或者药物)。从所有的对照值和样品值中扣除空白值。对于每个样品，p21WAFl的诱导值(吸光度单位)以相对于对照中所存在的p21WAFl值的百分数表示。高于130％的诱导百分数定义为显著诱导。在该测试中试验了四种化合物，全部都表现出了显著诱导。
实施例C.6.b.：细胞方法
在37℃下，在具有5％CO2的湿润培养器中，将A2780细胞(ATCC)培养在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI 1640介质中。所有的细胞培养溶液都由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它物质由Nunc提供。
基因组DNA从增殖A2780细胞中提取并且用作p21促进剂嵌套的PCR分离的模板。使用低聚核苷酸对GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC与基因组DNA作为模板，在55℃的退火温度下，进行第一扩增20个周期。在88℃的退火温度下，使相对于TATA框含有-4551至+88片段的所得4.5kb片段与低聚核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC进行再扩增20个周期，从而形成4.5kb片段，随后在88℃的退火温度下，使其与低聚核苷酸对TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC进行扩增20个周期，从而形成相对于TATA框含有-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苷酸(下划线序列)中的限制性位点XhoI和KpnI用于进行亚克隆。
在KpnI和XbaI限制位点上，将荧光素酶报告因子从pGL3-基上除去并且将其替换为ZsGreen指示因子(来自于pZsGreenl-Nl质粒)。通过将上述人类p21促进剂区域的1.3kb片段插入到XhoI和KpnI位点上的pGL3-基-ZsGreen之中，对pGL3-基-ZsGreen-1300进行构造。所有的限制酶都由Boehringer Manheim(Germany)提供。以2×105个细胞的密度将A2780细胞加入6孔板中，将其培养24小时，并且通过使用如制造商所述的Lipofectamine 2000(Invitrogen，Brussels，Belgium)，用2ug pGL3-基-ZsGreen-1300和0.2ug pSV2neo载体对其进行转染。使选择的细胞与G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)一起转染10天并且使单细胞悬浮液进行生长。三周之后，获得单克隆。
使A2780选定克隆进行扩展并且以每孔10000个细胞传种于96孔板中。传种24小时之后，用化合物对细胞再另外处理24小时(影响近端p21促进剂区域的spl位点)。随后，用4％PFA将细胞固定30分钟并且用Hoechst颜料对其进行对比染色。
通过Ascent Fluoroskan(Thermo Labsystems，Brussels，Belgium)对引起ZsGreen形成的p21促进剂活化以及由此产生的荧光进行监控。对于各次试验，均平行进行对照(不含药物)和空白培养(不含细胞或者药物)。从所有的对照值和样品值中扣除空白值。对于每个样品，p21的诱导值(吸光度单位)表示为对照中所存在的p21值的百分数。高于130％的诱导百分数定义为显著诱导。在该测试中试验了二十六种化合物，全部都表现出了显著诱导。
实施例C.6.c.：体内方法
将选择的细胞系皮下注射(107个细胞/200μl)入裸鼠侧腹内，在12天后获得可卡尺测量的肿瘤。从第12天开始，在6天期间内，每天给动物口服或者经脉内注射溶剂和20-40mpk化合物(每次4～10只动物)。通过内部显像的Automated Whole Body Imaging System(装备有GFP滤器并且连接有通过基于National Instruments的IMAQ Vision Software的软件包进行控制的CCD摄像机类型JAI
Figure 200580025487810000210003_15
CV-M90的荧光立体显微镜类型Olympus)对肿瘤的荧光进行测定。使用化合物R306465(WO03/76422)作为基准。通过与R306465进行比较，将化合物分类为惰性(无可测量荧光)、微弱、等同或者更好的级别。对化合物进行测试，在口服之后其效果好于R306465。
实施例C.7：P450抑制能力
将所有的试验化合物都溶于DMSO(5mM)中，并且在乙腈中将其进一步稀释至5×10-4M。进一步在测试缓冲液(0.1M NaK磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中对其进行稀释，其最终溶剂浓度不能高于2％。
CYP3A4蛋白的测定包括在100μl的总体积中，使每孔中含有15pmol P450/mg蛋白(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH形成系统(含3.3mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mM NADP和3.3mM MgCl2-6H2O的测定缓冲液)和化合物。在37℃下预培养5分钟之后，通过向测定缓冲液中加入150μM的荧光探针基质BFC开始酶促反应。在室温下培养30分钟之后，加入2倍体积的乙腈终止反应。在激发波长405nm和发射波长535nm下进行荧光测定。在此试验中，将酮基康唑(Ketoconazole)(IC50值＝3×10-8M)包含在其中作为参照化合物。CYP2D6蛋白的测定包括在100μl的总体积中，使每孔中含有6pmol P450/mg蛋白(在0.01MNaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH形成系统(含0.41mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.0082mM NADP和0.41mM MgCl2-6H2O的测定缓冲液)和化合物。在37℃下预培养5分钟之后，通过向测定缓冲液中加入3μM的荧光探针基质AMMC开始酶促反应。在室温下培养45分钟之后，加入2倍体积的乙腈终止反应。在激发波长405nm和发射波长460nm下进行荧光测定。在此试验中，将奎尼丁(IC50值＜5×10-8M)包含在其中作为参照化合物。
CYP2C9蛋白的测定包括在100μl的总体积中，使每孔中含有15pmol P450/mg蛋白(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH形成系统(含3.3mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mM NADP和3.3mM MgCl2-6H2O的测定缓冲液)和化合物。在37℃下预培养5分钟之后，通过向测定缓冲液中加入200μM的荧光探针基质MFC开始酶促反应。在室温下培养30分钟之后，加入2倍体积的乙腈终止反应。在激发波长405nm和发射波长535nm下进行荧光测定。在此试验中，将磺胺苯吡唑(IC50值＝6.8×10-7M)包含在其中作为参照化合物。
基于初次筛选的目的，在单一固定浓度10-5M下对化合物进行试验。试验活性化合物时，则重复进行试验以建立完整的浓度-响应曲线。对于各次试验，均平行进行对照(不含药物)和空白培养(不含酶或者药物)。所有化合物都重复四次进行测定。从所有的对照值和样品值中扣除空白值。对于各个样品，样品的P450活性的平均值(以相对荧光单位表示)以相对于对照组P450活性平均值的百分数表示。抑制作用百分比以100％减去样品P450活性平均值的值表示。适当时，对化合物的IC50值(使P450活性降低至对照组50％时所需的药物浓度)进行计算。
表F-3列出了根据实施例C.1、C.2、C.3.a和C.3.b进行试验的化合物的结果。
化合物编号   酶催化活性pIC50C.1.   细胞活性pIC50C.2.   溶解度C.3.b.pH＝2.3mg/ml 溶解度C.3.a.
  1   8.2   7.9   3
  2   7.4   6.5   3
化合物编号   酶催化活性pIC50C.1.   细胞活性pIC50C.2.   溶解度C.3.b.pH＝2.3mg/ml 溶解度C.3.a.
  3   8.1   7.5   3
  4   8.2   7.5   3
  5   7.9   7.4   1
  6   7.6   7.4   3
  7   ＞9   7.5   2.0
  8   8.8   7.9   2.9
  9   9.4   7.6
  10   8.4   7.5   3.0
  11   9.4   8.0   3.1
  12   9.0   7.5   2.1
  13   8.8   7.0   3.7
  化合物编号   酶催化活性pIC50C.1.   细胞活性pIC50C.2.   溶解度C.3.b.pH＝2.3mg/ml 溶解度C.3.a.
  14   8.5   7.4   2.8
  15   7.6   7.0   3
  16   7.4   7.1   2.8
  17   8.8   6.7   2.2
  18   8.5   7.0   3.6
  19   8.4   6.3   2.6
  化合物编号   酶催化活性pIC50C.1.   细胞活性pIC50C.2.   溶解度C.3.b.pH＝2.3mg/ml 溶解度C.3.a.
  20   7.7   7.3
  21   7.9   6.8   2.1
  22   7.9   6.8   4.2
  23   8.0   6.6
  24   8.8   7.5   4.0
  25   7.9   7.6   3.4
  26   8.3   7.2   3.5
  27   ＞9   7.5
  28   ＞9   7.5
  31   8.5   7.4
  32   ＞9   ＞7.5
  33   ＞9   8.2
  34   8.8   7.9
  35   9.6   7.8
D.组合物实施例：薄膜包衣片剂
片剂核的制备
对100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物进行充分混合，然后用5g十二烷基硫酸钠和10g聚乙烯吡咯烷酮的约200ml水溶液将上述混合物润湿。将该湿润的粉末混合物过筛、干燥并且再次过筛。然后向其中加入100g微晶纤维素和15g氢化植物油。对上述全部物质进行充分混合并且将其压缩成片剂，得到10.000片片剂，各自含有10mg式(I)化合物。
包衣
向10g甲基纤维素的75ml变性乙醇溶液中加入5g乙基纤维素的150ml CH2Cl2溶液。然后，向其中加入75ml CH2Cl2和2.5ml 1，2，3-丙三醇。将10g聚乙二醇熔化并且将其溶于75ml二氯甲烷中。将后述溶液加入到前述溶液中，然后向其中加入2.5g十八烷酸镁、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml浓着色剂悬浮液，并且对上述物质进行均浆化。在涂敷装置上，将由此获得的混合物涂敷在片剂芯上。

Claims (10)

1.式(I)化合物
其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中
X各自独立地为N或者CH；
R1为苯基；其中
所述苯基任选地被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、苯基；
R2为氢、-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；其中
各个R5独立地选自以下的取代基：氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑基或者三唑基；
各个R6独立地选自以下的取代基：羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单-或者二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、哌嗪基、单或者二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
各个R7和R8独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或者单或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；
R3为氢；
R4为氢或者C1-6烷基。
2.根据权利要求1的化合物，其中
各个X为N；R1为苯基或者任选被卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基或者芳基取代的苯基；R2为-CH2-R5或者-C(＝O)-R6；R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者咪唑基；R6各自独立地选自C1-6烷基氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基或者吗啉基；R3为氢和R4为氢或者C1-6烷基。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中
各个X为N；R1为苯基或者被卤素取代的苯基；R2为-CH2-R5；R5各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基或者C1-6烷基羰基氧基；R3为氢；和R4为氢。
4.根据权利要求1、2或3的化合物，其中所述化合物为化合物1、化合物8、化合物11、化合物9、化合物33、化合物34、化合物7或者化合物25
Figure FSB00000085965200021
5.一种药物组合物，其中包括药学上可接受的载体和治疗有效量的如权利要求1～4所要求的化合物作为活性成分。
6.制备如权利要求5中所要求的药物组合物的方法，其中对药学上可接受的载体和如权利要求1～4所要求的化合物进行密切混合。
7.如权利要求1或2任一项所要求的化合物在制造通过抑制HDACs治疗增殖疾病的药物中的用途。
8.一种制备如权利要求1所要求的化合物的方法，其特征在于使式(II)中间体与适当的酸反应，从而得到式(I)的异羟肟酸，
Figure FSB00000085965200031
9.式(V)化合物
Figure FSB00000085965200032
其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中
X各自独立地为N或者CH；
R1为苯基；其中
所述苯基任选被一个或者两个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、苯基；
R2为氢、-CH2-R5、三氟甲基、-C(＝O)-R6或者-CH2-NR7R8；其中
各个R5独立地选自以下的取代基：氢、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑基或者三唑基；
各个R6独立地选自以下的取代基：羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单-或者二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、哌嗪基、单或者二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
各个R7和R8独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基或者单或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；
R3为氢；
R4为氢或者C1-6烷基。
10.一种制备如权利要求9所要求的化合物的方法，其特征在于
a)通过本领域熟知的反应或者官能团转换反应，将其中R2为-CH2OH和R4为氢的式(V)化合物，在此称为式(V-a)化合物，转化为其中R2不是-CH2OH的式(V)化合物，在此称为式(V-b)化合物，和
Figure FSB00000085965200041
b)通过使式(VI)中间体与1，4-二噁烷-2，5-二醇和适当的式(VII)硼酸反应一步制备式(V-a)化合物，其中R1如权利要求1所定义或者
Figure FSB00000085965200042
c)通过使式(VI)中间体与适当的式(VIII)酮反应制备式(V-b)化合物，其中R1和R2如上所定义
d)通过使式(VI)中间体与2-氧代-丙酸和适当的式(VII)硼酸在适宜的溶剂中反应一步制备其中R2为-COOH的式(V)化合物，在此称为式(V-c)化合物，其中R1如权利要求1所定义，并且进一步通过本领域熟知的反应或者官能团转化反应，将其转化为其中R2为-C(＝O)-R6的式(V)中间体，各个R6独立地选自以下的取代基：羟基、C1-6烷氧基、氨基或者单-或者二(C1-6烷基)氨基、C1-6环烷基氨基、羟基C1-6烷基氨基、哌嗪基、单或者二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、吗啉基或者硫代吗啉基；
Figure FSB00000085965200052
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