BRPI0513891B1 - Derivados de propenil piperazina substituídos, seu uso como novos inibidores de histona deacetilase, composição farmacêutica, combinação e processo de preparação destes - Google Patents
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Abstract
derivados de propenil piperazina substituídos como novos inibidores de histona deacetilase. a presente invenção refere-se aos novos compostos de fórmula em que r¹, r², r³, r4 e x têm significados definidos, tendo atividade enzimática inibidora de histona deacetilase; sua preparação, composições contendo os mesmos e sua aplicação como um medicamento.
Description
[001] A presente invenção refere-se a compostos tendo atividade enzimática inibidora de histona deacetilase (HDAC). Adicionalmente se refere a processos para sua preparação, a composições compreendendo os mesmos, bem como sua aplicação, tanto in vitro quanto in vivo, para inibir HDAC e como um medicamento, por exemplo, como um medicamento para inibir condições proliferativas, tais como câncer e psoríase.
[002] As histonas nucleares são conhecidas como componentes integrais e dinâmicos do mecanismo responsável pela regulação da transcrição genética e outros processos modelados por DNA tais como replicação, restaruação, recombinação, e segregação cromossômica. São o sujeito de modificações pós-translacionais incluindo acetilação, fosforilação, metilação, ubiquitinação, e ADP-ribosilação.
[003] Histona deacetilase(s), referidas neste relatório como "HDACs", são enzimas que catalisam a remoção da modificação acetil sobre resíduos lisina de proteínas, incluindo as histonas nucleossômicas nucleares H2A, H2B, H3 e H4. Junto com histona acetiltransferase(s), referidas neste relatório como "HATs", HDACs regulam o nível de acetilação das histonas. O balanço da acetilação de histonas nucleossômicas tem um papel importante na transcrição de muitos genes. A hipoacetilação das histonas está associada com estrutura condensada da cromatina resultando na repressão da transcrição genética, ao passo que histonas acetiladas estão associadas com uma estrutura da cromatina mais aberta e ativação de transcrição.
[004] Foram descritas onze HDACs estruturalmente relacionadas e se encaixam em duas classes. HDACs classe I consistem nas HDAC 1, 2, 3, 8 e 11 ao passo que HDACs classe II consistem das HDAC 4, 5, 6, 7, 9 e 10. Membros de uma terceira classe de HDACs são estruturalmente não relacionados com as HDACs da classe I e da classe II. As HDACs classe l/ll operam por mecanismos zinco- dependentes, ao passo que as HDACs classe III são NAD- dependentes.
[005] Além de histonas, outras proteínas também têm sido o substrato para acetilação, em particular fatores de transcrição tais como p53, GATA-1 e E2F; receptores nucleares tais como o receptor de glucocorticóide, os receptores da tiróise, os receptores estrogênicos; e proteínas reguladoras do ciclo celular tais como pRb. A acetilação de proteínas tem sido ligada com a estabilização de proteínas, tais como estabilização de p53, recrutamento de cofatores e aumento da ligação de DNA. p53 é um supressor tumoral que pode induzir interrupção do ciclo celular ou apoptose em resposta a uma variedade de sinais de stress, tais como lesão de DNA. O principal alvo para interrupção do ciclo celular induzida por p53 parece ser o gene p21. Próximo a sua ativação por p53, p21 tem sido identificado em virtude de sua associação com complexos de quinases ciclina/ciclina-dependentes resultando em interrupção do ciclo celular tanto nas fases G1 quanto G2, sua regulação para cima durante a senescência, e sua interação com o antígeno nuclear das células proliferativas.
[006] O estudo de inibidores de HDACs indica que desempenham um papel importante na interrupção do ciclo celular, na diferenciação celular, na apoptose e na reversão de fenótipos transformados.
[007] O inibidor Tricostatina A (TSA), por exemplo, provoca interrupção do ciclo celular tanto nas fases G1 quanto G2, reverte o fenótipo transformado de diferentes linhagens celulares, e induz diferenciação das células de leucemia de Friend e outras. TSA (e ácido suberoilanilida hidroxâmico SAHA) têm sido reportados para inibir o crescimento celular, induzir diferenciação terminal, e prevenir a formação de tumores em camundongos (Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).
[008] A Tricostatina A também tem sido reportada por ser útil no tratamento de fibrose, por exemplo, fibrose hepática e cirrose hepática. (Geerts et al., Pedido de Patente Europeu No. EP 0 827 742, publicado em 11 de março de 1998).
[009] O farmacoforo para inibidores de HDAC consiste em um domínio de ligação de metal, o qual interage com o sítio ativo contendo zinco de HDACs, um domínio encadeador, e um domínio de reconhecimento superficial ou região de capeamento, o qual interage com resíduos sobre a borda do sítio ativo.
[0010] Os inibidores de HDACs também têm sido reportados por induzirem expressão do gene p21. A ativação transcricional do gene p21 por estes inibidores é estimulada por remodelação da cromatina, após acetilação das histonas H3 e H4 na região promotora de p21. Esta ativação de p21 ocorre em um modo independente de p53 e portanto os inibidores de HDAC são operativos em células com genes p53 mutados, uma característica essencial de numerosos tumores.
[0011] Além disso os inibidores de HDAC podem ter atividades indiretas tais como aumento da resposta imune do hospedeiro e inibição da angiogênese tumoral e deste modo podem suprimir o crescimento de tumores primários e impedir metástase (Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309).
[0012] Em vista do citado acima, os inibidores de HDAC podem ter grande potencial no tratamento de doenças ou condições proliferativas celulares, incluindo tumores com genes p53 mutados.
[0013] O pedido de Patente Europeu N° EP1472216 publicado em 14 de agosto de 2003 descreve hidroxamatos bicíclicos como inibidores de histona deacetilase.
[0014] Os pedidos de Patente Européia Nos. EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, EP1485378 publicados em 18 de setembro de 2003, entre outros, descrevem ácidos piperazinilpirimidinilhidroxâmicos substituídos como inibidores de histona deacetilase além disso o pedido de Patente Europeu No. EP1485365 descreve R306465.
[0015] O pedido de Patente Europeu No. EP1492534 publicado em 9 de outubro de 2003, descreve compostos de ácido carbâmico compreendendo uma ligação piperazina, como inibidores de HDAC.
[0016] O pedido de Patente Europeu No. EP1495002 publicado em 23 de outubro de 2003, descrevem compostos de piperazinil fenil benzamida substituídos, como inibidores de histona deacetilases.
[0017] O pedido de Patente Internacional No. W004/009536 publicado em 29 de janeiro de 2004, descreve derivados contendo um encadeador alquil entre o grupo aril e o hidroxamato, como inibidores de histona deacetilases.
[0018] O pedido de Patente Europeu No. EP1525199 publicado em 12 de fevereiro de 2004, descreve hidroxamatos bicíclicos substituídos com (hetero)arilalquenil, como inibidores de histona deacetilases.
[0019] O pedido de Patente Internacional No. W004/063146 publicado em 29 de julho de 2004, descreve derivados de N-hidróxi- benzamida com atividade antiinflamatória e antitumoral.
[0020] O pedido de Patente Internacional No. W004/063169 publicado em 29 de julho de 2004, descreve derivados de aril hidroxamatos substituídos como inibidores de histona deacetilase.
[0021] O pedido de Patente Internacional No. W004/072047 publicado em 26 de agosto de 2004, descreve indóis, benzimidazóis e naftimidazóis como inibidores de histona deacetilases.
[0022] O pedido de Patente Internacional No. WO04/082638 publicado em 30 de setembro de 2004, descreve hidroxamatos encadeados a sistemas de anéis heterocíclicos não-aromáticos como inibidores de histona deacetilases.
[0023] O pedido de Patente Internacional No. W004/092115 publicado em 28 de outubro de 2004, descreve derivados de hidroxamato como inibidores de histona deacetilases.
[0024] O pedido de Patente Internacional No. WO05/028447 publicado em 31 de março de 2005, descreve benzimidazóis como inibidores de histona deacetilases.
[0025] Os pedidos de Patente Internacional Nos. W005/030704 e W005/030705 publicados em 7 de abril de 2005, descrevem benzamidas como inibidores de histona deacetilases.
[0026] O pedido de Patente Internacional No. W005/040101 publicado em 6 de maio de 2005, descreve hidroxamatos conectados a aciluréia e conectados a sulfoniluréia como inibidores de histona deacetilases.
[0027] O pedido de Patente Internacional No. W005/040161 também publicado em 6 de maio de 2005, descreve hidroxamatos encadeados a biaril como inibidores de histona deacetilases.
[0028] Os compostos da presente invenção diferem da técnica anterior em estrutura, em sua atividade farmacológica e/ou potência farmacológica.
[0029] O problema a ser resolvido é proporcionar inibidores de histona deacetilases com alta atividade enzimática e celular que tenham aumento da biodisponibilidade e/ou potência in vivo.
[0030] Os novos compostos da presente invenção resolvem o problema descrito acima.
[0031] Os compostos da presente invenção apresentam excelente atividade enzimática e celular inibidora da histona deacetilase. Têm uma alta capacidade de ativar o gene p21, tanto no nível celular quanto in vivo. Têm um perfil farmacocinético desejável e baixa afinidade pelas enzimas P450, o que reduz o risco de interação adversa fármaco-fármaco permitindo também uma margem de segurança mais ampla.
[0032] Características vantajosas dos presentes compostos são estabilidade metabólica, solubilidade e/ou capacidade de indução de p21. Mais em particular os compostos da presente invenção têm aumento das meias-vidas nos hepatócitos de rato, têm um aumento da solubilidade/ estabilidade em soluções aquosas e/ou têm reforço das capacidades indutoras do estimulador p21 in vivo.
[0033] Esta invenção refere-se a compostos de fórmula (I)
[0034] as formas N-óxido, os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereo-quimicamente isoméricas dos mesmos, em que
[0035] cada X é de modo independente N ou CH;
[0036] R1é fenila, naftalenila ou heterociclila; em que
[0037] cada urn do referido fenil ou naftalenil é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, Ci-6 alquila, Ci-6 alquilóxi, polihaloCi-6 alquila, arila, hidróxi, ciano, amino, Ci-e alquilcarbonilamino, Ci-6 alquilsulfonilamino, hidroxicarbonila, Ci-6 alquiloxicarbonila, hidróxiCi-e alquila, Ci-e alquiloximetila, aminometila, Ci-6 alquilaminometila, Ci-6 alquilcarbonilaminometila, Ci-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, Ci-6 alquilaminossulfonila ou heterociclila;
[0038] R2 é hidrogênio, -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou - CH2-NR7R8; em que
[0039] cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-6 alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, piperazinila, A/-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ou triazolila;
[0040] cada R6 é selecionado de modo independente entre hidróxi, C1-6 alquilóxi, amino ou mono- ou di(Ci-e alquil)amino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, piperazinila, mono- ou di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino A/-metilpiperazinila, morfolinila ou tiomorfolinila;
[0041] cada R7 e R8 são de modo independente selecionados entre hidrogênio, C1-6 alquila, Ci-6alquilcarbonila, C1-6 alquilsulfonila, ou mono-or d i(C 1-4 alquil)aminossulfonila;
[0042] R3 é hidrogênio, hidroximetila, aminometila ou mono- ou d i(Ci-6 alquil)aminometila;
[0043] R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila;
[0044] arila no acima é fenila ou naftalenila; em que
[0045] cada um do referido fenila ou naftalenila é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, trifluorometila, ciano ou hidroxicarbonila; e
[0046] heterociclila no acima é furanila, tienila, pirrolila, pirrolinila, pirolidinila, dioxolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, isoxazolila, isotiazolila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, piranila, piridinila, piperidinila, dioxanila, morfolinila, ditianila, tiomorfolinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, piperazinila, triazinila, tritianila, indolizinila, indolila, indolinila, benzofuranila, benzotiofenila, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, purinila, quinolizinila, quinolinila, cinolinila, ftlazinila, quinazolinila, quinoxalinila ou naftiridinila;
[0047] em que
[0048] cada um do referido heterociclos é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, Ci-6 alquila, Ci-e alquilóxi, ciano, amino, mono-or d i(C 1-4 alquil)amino.
[0049] O termo "inibidor de histona deacetilase" ou "inibidor de histona deacetilases" é usado para identificar um composto, 0 qual é capaz de interagir com uma histona deacetilase e inibir sua atividade, mais particularmente sua atividade enzimática. Inibir a atividade enzimática de histona deacetilase significa reduzir a capacidade de uma histona deacetilase para remover um grupo acetil de uma histona. Preferencialmente, a inibição referida é específica, isto é, 0 inibidor de histona deacetilases reduz a capacidade de uma histona deacetilase para remover um grupo acetila de uma histona em uma concentração que é menor do que a concentração do inibidor que é necessária para produzir alguma outro efeito biológico não relacionado.
[0050] Conforme usado nas definições precedentes e nas partes que se seguem, halo é genérico para flúor, cloro, bromo e iodo; alquila define radicais hidrocarbonetos de cadeia reta e ramificada tendo a partir de 1 até 4 átomos de carbono tais como, por exemplo, metila, etila, propila, butila, 1 -metiletila, 2-metilpropila e similares; alquila inclui alquila e os homólogos superiores do mesmo tendo 5 a 6 átomos de carbono tais como, por exemplo, pentila, 2-metil-butila, hexila, 2-metilpentila e similares; polihaloCi-6 alquila define C1-6 alquila contendo três substituintes halo idênticos ou diferentes, por exemplo, trifluorometila; e C3-6 cicloalquila inclui grupos hidrocarbonetos cíclicos tendo a partir de 3 até 6 carbonos, tais como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclohexila e similares.
[0051] Sais de adição farmaceuticamente aceitáveis englobam sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis conforme mencionado anteriormente neste relatório pretendem compreender as formas de sais de adição de ácidos não tóxicas terapeuticamente ativas, as quais os compostos de fórmula (I) são capazes de formar. Os compostos de fórmula (I) os quais têm propriedades básicas podem ser convertidos em seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis tratano a referida forma de base com um ácido apropriado. Ácidos apropriados compreendem, por exemplo, ácidos inorgânicos tais como ácidos hidrohálicos, por exemplo, ácido clorídrico ou bromídrico; ácidos sulfúrico; nítrico; fosfórico e similares; ou ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácidos acético, trifluoroacético, propanóico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malônico, succínico (por exemplo, ácido butanodióico), maléico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, p- toluenossulfônico, ciclâmico, salicílico, p-amino-salicílico, pamóico e ácidos similares.
[0052] Os compostos de fórmula (I) os quais têm propriedades acidíferas podem ser convertidos em seus farmaceuticamente aceitáveis sais de adição de base tratando a referida forma ácida com uma base orgânica ou inorgânica adequada. Formas de sais de base apropriadas compreendem, por exemplo, os sais de amónio, os sais de metais de álcali e de metais alcalinos terrosos, por exemplo, os sais de lítio, sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, sais com bases orgânicas, por exemplo, os sais de benzatina, A/-metil-D-glucamina, hidrabamina, e sais com aminoácidos tais como, por exemplo, arginina, lisina e similares.
[0053] O termo "sais de adição de ácido ou base" também compreende os hidratos e as formas de adição de solvente, as quais os compostos de fórmula (I) são capazes de formar. Exemplos de similares formas são, por exemplo, hidratos, alcoolatos e similares.
[0054] O termo "formas estereoquimicamente isoméricas de compostos de fórmula (I)", conforme usado neste relatório, define todos os compostos possíveis compostos dos mesmos átomos ligados pela mesma seqüência de ligações mas tendo diferentes estruturas tridimensionais, as quais não são intercambiáveis, as quais os compostos de fórmula (I) podem possuir. A menos que mencionado ou indicado de outro modo, a designação química de um composto engloba a mistura de todas as formas estereoquimicamente isoméricas possíveis, as quais o referido composto possa possuir. A referida mistura pode conter todos os diastereômeros e/ou enantiômeros da estrutura molecular básica do referido composto. Pretende-se que todas as formas estereoquimicamente isoméricas dos compostos de fórmula (I) tanto em forma pura ou em mistura umas com as outras sejam englobadas dentro do âmbito da presente invenção.
[0055] Pretende-se que as formas N-óxido dos compostos de fórmula (I) compreendam os compostos de fórmula (I) em que um ou vários átomos de nitrogênio são oxidados para o denominado A/-óxido, particularmente os A/-óxidos em que um ou mais dos nitrogénios da piperidina, da piperazina ou do piridazinil são A/-oxidados.
[0056] Alguns dos compostos de fórmula (I) também podem existir em suas formas tautoméricas. Pretende-se que as formas referidas embora não indicadas explicitamente na fórmula acima sejam incluídas dentro do escopo da presente invenção.
[0057] Sempre que usado nas partes que se seguem, o termo "compostos de fórmula (I)" pretende incluir também os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e todas as formas estereoisoméricas.
[0058] Conforme usado neste relatório, os termos "histona deacetilase" e "HDAC" pretendem se referir a qualquer uma de uma família de enzimas que removem grupos acetil dos grupos ε-amino de resíduos lisina no N-término de uma histona. A menos que indicado de outro modo pelo contexto, o termo "histona" pretende referir-se a qualquer proteína da histona, incluindo H1, H2A, H2B, H3, H4, e H5, de quaisquer espécies. Proteínas de HDAC humanas ou produtos genéticos, incluem, mas não estão limitados a, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 e HDAC-11. A histona deacetilase também pode ser derivada de uma fonte de protozoários ou fúngica.
[0059] Um primeiro grupo de compostos interessantes consiste nos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) R1 é fenila ou naftalenila; em que
[0060] cada fenila ou naftalenila referida é substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre Ci-6 alquilsulfonilamino, hidroxicarbonila, Ci-6 alquiloximetila, Ci-6 alquilaminometila, Ci-6 alquilcarbonilaminometila, Ci-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila ou Ci-6 alquilaminossulfonila; ou b) R2 é -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou -CH2-NR7R8; c) R4 é C1-6 alquil.
[0061] Um segundo grupo de compostos interessantes consiste nos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) R1 é fenila, naftalenila ou heterociclila; em que
[0062] cada fenila referida é substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre arila, hidróxi, amino, C1-6 alquilcarbonilamino, C1-6 alquilsulfonilamino, C1-6 alquiloxicarbonila, hidróxiCi-e alquila, C1-6 alquiloximetila, aminometila, C1-6 alquilaminometila, C1-6 alquilcarbonilaminometila, C1-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, C1-6 alquilaminossulfonila ou heterociclila; ou b) R2 é -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou -CH2-NR7R8; c) R4 é C1-6 alquila.
[0063] Um terceiro grupo de compostos interessantes consiste nos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) R1 é fenila, naftalenila ou heterociclila; em que
[0064] cada fenila ou naftalenila referida é substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre C1-6 alquilsulfonilamino, Ci-ealquiloximetila, aminometila, C1-6 alquilaminometila, C1-6 alquilcarbonilaminometila, C1-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, ou C1-6 alquilaminossulfonila; ou b) R2 é -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou -CH2-NR7R8; c) R4 é C1-6 alquila.
[0065] Um quarto grupo de compostos interessantes consiste nos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, piperazinila, A/-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ou triazolila; b) cada R6 é selecionado de modo independente entre hidróxi, C1-6 alquilóxi, amino ou mono- ou di(Ci-6 alquil)amino, C1-6 cicloalquilamino, piperazinila, A/-metilpiperazinila, morfolinila ou tiomorfolinila; c) R4 é hidrogênio.
[0066] Um quinto grupo de compostos interessantes consiste nos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) cada X é N; b) R1 é fenila ou fenila opcionalmente substituído com halo, C1-6 alquila, C1-6alquilóxi, polihaloCi-6alquila ou arila; c) R2 é -CH2-R5 ou -C(=O)-R6; d) cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogénio, hidróxi, Ci-ealquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-6 alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, /V-metilpiperazinila, morfolinila, ou imidazolila; e) cada R6 é selecionado de modo independente entre C1-6 alquilamino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino ou morfolinila; f) R3 é hidrogênio; ou g) R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila.
[0067] Um sexto grupo de compostos interessantes consiste nos compostos do quinto grupo em que se aplicam as seguintes restrições: a) cada R6 é selecionado de modo independente entre Ci- ealquilamino, Ci-6cicloalquilamino, di(Ci-6alquil)aminoCi-6alquilamino ou morfolinila.
[0068] Um sétimo grupo de compostos interessantes consiste dos compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das seguintes restrições: a) cada X é N; b) R1 é fenila ou fenila substituída com halo; c) R2 é -CH2-R5; d) cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6alquilóxi, ou C1-6alquilcarbonilóxi; e) R3 é hidrogênio; f) R4 é hidrogênio.
[0069] Um grupo de compostos preferenciais consiste nos compostos de fórmula (I) em que
[0070] cada X é N; R1 é fenila ou fenila opcionalmente substituída com halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, polihaloCi-6 alquila ou arila; R2 é - CH2-R5 ou -C(=O)-R6; cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-e alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, /V-metilpiperazinila, morfolinila ou imidazolila; cada R6 é selecionado de modo independente entre C1-6 alquilamino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino ou morfolinila; R3 é hidrogênio e R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila.
[0071] Outro grupo de compostos preferidos consiste nos compostos de fórmula (I)
[0072] em que R2 é -CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6, ou -CH2- NR7R8.
[0073] Um grupo de compostos preferidos consiste nos compostos de fórmula (I)
[0074] em que cada X é N; R1 é fenila ou fenila substituída com halo; R2 é -CH2-R5;
[0075] cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, Ci-ealquilóxi, ou C1-6 alquilcarbonilóxi; R3 é hidrogênio; e R4 é hidrogênio.
[0076] Composto ainda mais preferido é 0 composto No.1, 0 composto No.8, 0 composto No.11, 0 composto No.9, 0 composto No.33, 0 composto No.34 e composto No.7 e 0 composto No. 25.
[0077] Os compostos de fórmula (I) e seus sais e /V-óxidos farmaceuticamente aceitáveis e formas estereoquimicamente isoméricas dos mesmos podem ser preparados na maneira convencional. As matérias-primas e alguns dos intermediários são compostos conhecidos e estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados de acordo com procedimentos de reações convencionais conhecidos de modo geral na técnica.
[0078] Alguns métodos de preparação serão descritos nas partes que se seguem em mais detalhes. Outros métodos para obter compostos finais de fórmula (I) são descritos nos exemplos. a) Ácidos hidroxãmicos de fórmula (I) podem ser preparados reagindo um intermediário de fórmula (II) com um ácido apropriado, tal como por exemplo, ácido trifluoro acético. A referida reação é realizada in um solvente apropriado, tal como, por exemplo, metanol ou diclorometano.
b) Intermediários de fórmula (II) podem ser preparados reagindo um intermediário de fórmula (III) com um intermediário de fórmula (IV) na presença de reagentes apropriados tais como /V- (etilcarbonimidoil)-/V,/V-dimetil-1,3-propanodiamina, monohidrocloreto (EDC) e 1-hidróxi-1H-benzotriazol (HOBT). A reação pode ser realizada na presença de uma base tal como trietilamina, em um solvente adequado, tal como, uma mistura de diclorometano e tetrahidrofurano.
c) Em um modo alternativo os intermediários de fórmula (II), em que R4 é hidrogênio, referidos neste relatório como intermediários de fórmula (ll-a) podem ser preparados em uma única etapa reagindo o intermediário de fórmula (XI), com 1,4-dioxana-2,5-diol e o ácido borônico apropriado de fórmula (VII), em que R1 é conforme definido acima, em um solvente adequado, por exemplo, um álcool, tal como etanol.
d) Intermediários de fórmula (III) podem ser preparados reagindo um intermediário de fórmula (V) com uma solução acidífera apropriada, por exemplo, ácido clorídrico, ou solução básica, por exemplo, brometo de hidrogênio ou hidróxido de sódio, em um solvente adequado por exemplo, um álcool, tal como etanol ou propanol.
[0079] A presente invenção também refere-se a compostos de fórmula (V)
[0080] as formas A/-óxido, os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereo-quimicamente isoméricas dos mesmos, em que
[0081] cada X é de modo independente N ou CH;
[0082] R1 é fenila, naftalenila ou heterociclila;
[0083] em que
[0084] cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, Ci-6 alquila, Ci-6 alquilóxi, polihaloCi-6 alquila, arila, hidróxi, ciano, amino, Ci-6 alquilcarbonilamino, Ci-6 alquilsulfonilamino, hidroxicarbonila, C1-6 alquiloxicarbonila, hidróxiCi-6 alquila, C1-6 alquiloximetila, aminometila, C1-6 alquilaminometila, C1-6 alquilcarbonilaminometila, C1-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, Ci-ealquilaminossulfonila ou heterociclila;
[0085] R2 é hidrogênio, -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou - CH2-NR7R8;
[0086] em que
[0087] cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-6 alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, piperazinila, /V-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ou triazolila;
[0088] cada R6 é selecionado de modo independente entre hidróxi, C1-6 alquilóxi, amino ou mono- ou di(Ci-6 alquil)amino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, piperazinila, mono- ou di(Ci-6 alquil)aminoCi-6 alquilamino /V-metilpiperazinila, morfolinila ou tiomorfolinila;
[0089] cada R7 e R8 são de modo independente selecionados entre hidrogênio, C1-6 alquila, Ci-6alquilcarbonila, C1-6 alquilsulfonila, ou mono- ou di(Ci-4alquil)aminossulfonila;
[0090] R3 é hidrogênio, hidroximetila, aminometila ou mono- ou d i(Ci-6 alquil)aminometila;
[0091] R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila;
[0092] arila no acima é fenila ou naftalenila;
[0093] em que
[0094] cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, trifluorometila, ciano ou hidroxicarbonila; e heterociclila no acima é furanila, tienila, pirrolila, pirrolinila, pirolidinila, dioxolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, isoxazolila, isotiazolila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, piranila, piridinila, piperidinila, dioxanila, morfolinila, ditianila, tiomorfolinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, piperazinila, triazinila, tritianila, indolizinila, indolila, indolinila, benzofuranila, benzotiofenila, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, purinila, quinolizinila, quinolinila, cinolinila, ftlazinila, quinazolinila, quinaxolinila ou naftiridinila;
[0095] em que
[0096] cada um dos referidos heterociclos é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, Ci-6 alquila, Ci-6 alquilóxi, ciano, amino, ou mono- ou di(Ci-4alquil)amino.
[0097] Grupos de compostos interessantes, preferenciais, mais preferenciais e ainda mais preferenciais podem ser definidos para os compostos de fórmula (V), de acordo com os grupos definidos para os compostos de fórmula (I).
[0098] Os novos intermediários de fórmula (V) podem ser preparados: a) Convertendo intermediários de fórmula (V), em que R2 é -CH2OH, e R4 é hidrogênio, referidos neste relatório como intermediários de fórmula (V-a), em intermediários de fórmula (V) em que R2 é diferente de -CH2OH, referidos neste relatório como intermediários de fórmula (V-b), através de reações conhecidas na técnica ou transformações de grupos funcionais. Por exemplo, os álcoois de fórmula (V-a) podem ser convertidos em aminas, ésteres e éteres. As aminas podem ser transformadas nas amidas correspondentes e as aminas primárias podem ser convertidas em aminas secundárias ou terciárias.
b) Os novos intermediários de fórmula (V-a) podem ser preparados em uma única etapa reagindo o intermediário de fórmula (VI), com 1,4-dioxana-2,5-diol e o ácido borônico apropriado de fórmula (VII), em que R1 é conforme definido acima, em um solvente adequado, por exemplo, um álcool, tal como etanol. 
c) Os novos intermediários de fórmula (V-b) podem ser preparados reagindo os intermediários de fórmula (VI) com a cetona apropriada de fórmula (VIII) na presença de um reagente apropriado, tal como tetracis(etanolato)titânio ou um boridreto de sódio, em um solvente adequado por exemplo, 1,2-dicloroetano. 
d) Os novos intermediários de fórmula (V), em que R2 é - COOH neste relatório referidos como compostos de fórmula (V-c) podem ser preparados em uma única etapa reagindo o intermediário de fórmula (VI), com ácido 2-oxo- propanóico e o ácido borônico apropriado de fórmula (VII), em que R1 é conforme definido acima, em um solvente adequado, por exemplo, 1,2-diclorometano 
[0099] Intermediários de fórmula (V-c), em que R2 é -COOH, podem ser convertidos em intermediários de fórmula (V) em que R2 é - C(=O)-R6, através de reações conhecidas na técnica ou transformações de grupos funcionais, por exemplo a conversão em aminas e amidas.
[00100] Os intermediários de fórmula (XI) podem ser preparados reagindo o intermediário de fórmula (IX) com piperidina em um solvente adequado por exemplo, diclorometano.
[00101] Os intermediários de fórmula (IX) podem ser preparados reagindo um intermediário de fórmula (X) com um intermediário de fórmula (IV), na presença de reagentes apropriados tais como /V- (etilcarbonimidoil)-A/,/V-dimetil-1,3-propanediamina, monohidrocloreto (EDO) e 1-hidróxi-1/-/-benzotriazol (HOBT). A reação pode ser realizada na presença de uma base tal como trietilamina, em um solvente adequado, tal como, uma mistura de diclorometano e tetrahidrofurano.
[00102] Intermediários de fórmula (X) podem ser preparados reagindo um intermediário de fórmula (VI) com um intermediário de fórmula (XII), na presença de hidróxido de sódio, em um solvente adequado, tal como tetrahidrofurano, seguida por neutralização com ácido clorídrico e adição de carbonato de sódio.
[00103] Os compostos de fórmula (I) e alguns dos intermediários podem ter no mínimo um centro estereogênico em sua estrutura. Este centro estereogênico pode estar presente em uma configuração R ou uma configuração S.
[00104] Os compostos de fórmula (I) conforme preparados nos processos descritos anteriormente neste relatório são geralmente misturas racêmicas de enantiômeros, os quais podem ser separados uns dos outros seguindo procedimentos de resolução conhecidos na técnica. Os compostos racêmicos de fórmula (I) podem ser convertidos nas formas de sais diastereompéricos correspondentes por meio de reação com um ácido quiral adequado. As referidas formas de sais diastereompéricos são em seguida separadas, por exemplo, por meio de cristalização seletiva ou fracionária e os enantiômeros são liberados das mesmas por álcali. Uma maneira alternativa de separar as formas enantioméricas dos compostos de fórmula (I) envolve cromatografia líquida usando uma fase estacionária quiral. As formas estereoquimicamente isoméricas puras também podem ser derivadas das formas estereoquimicamente isoméricas puras correspondentes das matérias-primas apropriadas , contanto que a reação ocorra estereoespecificamente. Preferencialmente se for desejado um estereoisômero específico, o referido composto seria sintetizado por meio de métodos de preparação estereoespecíficos. Estes métodos vantajosamente vão empregar a matérias-primas enantiomericamente puras.
[00105] Os compostos de fórmula (I), os sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis e formas estereoisoméricas dos mesmos têm propriedades farmacológicas benéficas pelo fato de que têm um efeito inibidor de histona deacetilase (HDAC).
[00106] Esta invenção proporciona um método para inibir o crescimento anormal de células, incluindo células transformadas, por administração de uma quantidade eficaz de um composto da invenção. Crescimento anormal de células se refere a crescimento celular independente de mecanismos reguladores normais (por exemplo, perda de inibição de contato). Isto inclui a inibição de crescimento tumoral tanto diretamente causando interrupção do crescimento, diferenciação terminal e/ou apoptose de células cancerígenas, quanto indiretamente, por inibição da neovascularização de tumores.
[00107] Esta invenção também proporciona um método para inibir o crescimento de tumores por meio da administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por exemplo, um mamífero (e mais particularmente um ser humano) que necessite de tal tratamento. Em particular, esta invenção proporciona um método para inibir o crescimento de tumores por meio da administração de uma quantidade eficaz dos compostos da presente invenção. Exemplos de tumores os quais podem ser inibidos, mas não limitados a, câncer pulmonar (por exemplo, adenocarcinoma e incluindo câncer pulmonar de células não-pequenas), cânceres pancreáticos (por exemplo, carcinoma pancreático tal como, por exemplo carcinoma pancreático exócrino), cânceres de cólon (por exemplo, carcinomas colorretal, tais como, por exemplo, adenocarcinoma de cólon e adenoma de cólon), câncer de próstata incluindo a doença avançada, tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt), leucemias mielóides (por exemplo, leucemia mielógena aguda (AML)), câncer folicular da tiróide, síndrome mielodisplásica (MDS), tumores de origem mesenquimal (por exemplo, fibrossarcomas e rabdomiossarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumor benigno da pele (por exemplo, ceratoacantomas), carcinoma de mama (por exemplo, câncer de mama avançado), carcinoma renal, carcinoma de ovário, carcinoma de bexiga e carcinoma epidermal.
[00108] O composto de acordo com a invenção pode ser usado para outros fins terapêuticos,
[00109] por exemplo: a) a sensibilização de tumores à radioterapia por meio da administração do composto de acordo com a invenção antes, durante ou depois de irradiação do tumor para tratar câncer; b) tratamento de artropatias e condições osteopatológicas tais como artrite reumatóide, osteoartrite, artrite juvenil, gota, poliartrite, artrite psoriática, espondilite anquilosante e lúpus eritematoso sistêmico; c) inibição da proliferação de células dos músculos lisos incluindo distúrbios proliferativos vasculares, aterosclerose e restenose; d) tratamento de condições inflamatórias e condições dérmicas tais como colite ulcerativa, doença de Crohn, rinite alérgica, doença enxerto vs. hospedeiro, conjuntivite, asma, ARDS, doença de Behcet, rejeição de transplante, urticaria, dermatite alérgica, alopecia areata, escleroderma, exantema, eczema, dermatomiosite, acne, diabetes, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Kawasaki, esclerose múltipla, enfisema, fibrose cística e bronquite crônica; e) tratamento de endometriose, fibróides uterinos, sangramento uterino disfuncional e hiperplasia endometrial; f) tratamento de vascularização ocular incluindo vasculopatia afetando vasos da retina e da coróide; g) tratamento de uma disfunção cardíaca; h) inibição de condições imunossupressivas tais como o tratamento de infecções por HIV; i) tratamento de disfunção renal; j) supressão de distúrbios endócrinos; k) inibição de disfunção de gluconeogênese; l) tratamento de uma neuropatologia, por exemplo, doença de Parkinson ou uma neuropatologia que resulta em um distúrbio cognitivo, por exemplo, doença de Alzheimer ou doenças neuronais relacionadas com poliglutamina; m) tratamento de distúrbios psiquiátricos, por exemplo, esquizofrenia, distúrbio bipolar, depressão, ansiedade e psicose; n) inibição de uma patologia neuromuscular, por exemplo, esclerose lateral amiotrófica; o) tratamento de atrofia muscular espinal; p) tratamento de outras condições patológicas tratáveis por tratamento por potencialização da expressão de um gene; q) reforço de terapia genética; r) inibição de adipogênese; s) tratamento de parasitose tal como malária.
[00110] Deste modo, a presente invenção descreve os compostos de fórmula (I) para aplicação como um medicamento bem como a aplicação destes compostos de fórmula (I) para a fabricação de um medicamento para tratar uma ou mais das condições mencionadas acima.
[00111] Os compostos de fórmula (I), os sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis e formas estereoisoméricas dos mesmos podem ter valiosas propriedades diagnósticas pelo fato de que podem ser usados para detectar ou identificar uma HDAC em uma amostra biológica compreendendo detectar ou medir a formação de um complexo entre um composto marcado e um HDAC.
[00112] Os métodos de detecção ou identificação podem usar compostos que são marcados com agentes de marcação tais como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias luminosas, e etc. Exemplos dos radioisótopos incluem 125l, 1311, 3H e 14C. Enzimas são geralmente tornadas detectáveis por conjugação de um substrato apropriado o qual, por sua vez, catalisa uma reação detectável. Exemplos das mesmas incluem, por exemplo, beta- galactosidase, beta-glucosidase, fosfatase alcalina, peroxidase e malato dehidrogenase, preferencialmente peroxidase de rábano- silvestre. As substâncias luminosas incluem, por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, aequorina e luciferase.
[00113] Amostras biológicas podem ser definidas como tecido do corpo ou fluidos corporais. Exemplos de fluidos corporais são fluido cerebroespinal, sangue, plasma, soro, urina, escarro, saliva e similares.
[00114] Em vista de suas propriedades farmacológicas úteis, os compostos em questão podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para fins de administração.
[00115] Para preparar as composições farmacêuticas desta invenção, uma quantidade eficaz de um composto particular, em forma de sal de adição básico ou ácido, como o ingrediente ativo é combinada em íntima mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, cujo veículo pode tomar uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração. Estas composições farmacêuticas são desejavelmente em forma de dosagem unitária adequada, preferencialmente, para administração por via oral, por via retal, por via percutânea, ou por injeção parenteral. Por exemplo, na preparação das composições em forma de dosagem oral, podem ser empregados quaisquer dos meios farmacêuticos usuais, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois e similares no caso de preparações líquidas orais tais como suspensões, xaropes, elixires e soluções; ou veículos sólidos tais como amidos, açúcares, caulim, lubrificantes, aglutinantes, agentes desintegrantes e similares no caso de pós, pílulas, cápsulas e comprimidos.
[00116] Devido à sua facilidade de administração, comprimidos e cápsulas representam a forma de unidade de dosagem oral mais vantajosa, caso no qual são obviamente empregados veículos farmacêuticos sólidos. Para composições parenterais, o veículo geralmente compreenderá água estéril, no mínimo em grande parte, embora outros ingredientes, para auxiliar a solubilidade, por exemplo, possam ser incluídos. Soluções injetáveis, por exemplo, podem ser preparadas nas quais o veículo compreende solução salina, solução de glicose ou uma mistura de solução salina e glicose. Suspensões injetáveis também podem ser preparadas em cujo caso podem ser empregados veículos líquidos apropriados, agentes de suspensão e similares. Nas composições adequadas para administração percutánea, o veículo opcionalmente compreende um agente de reforço da penetração e/ou um agente umectante adequado, opcionalmente combinado com aditivos adequados de qualquer natureza em menores proporções, cujos aditivos não causam um efeito prejudicial significante para a pele. Os aditivos referidos podem facilitar a administração na pele e/ou podem ser úteis para preparar as composições desejadas. Estas composições podem ser administradas de vários modos, por exemplo, como um emplastro transdérmico, como uma tintura ou como uma pomada.
[00117] É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas mencionadas acima em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem conforme usado no relatório descritivo e reivindicações aqui se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido. Exemplos de tais formas de unidade de dosagem são comprimidos (incluindo comprimidos ranhurados ou revestidos), cápsulas, pílulas, pacotes de pó, wafers, soluções ou suspensões injetáveis, colheres de chá, colheres de sopa e similares, e múltiplos segregados das mesmas.
[00118] Aqueles versados na técnica podem determinar facilmente a quantidade eficaz dos resultados de teste apresentados nas partes que se seguem. Em geral é contemplado que uma quantidade terapeuticamente eficaz seria de 0,005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, e em particular de 0,005 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Pode ser apropriado administrar a dose requerida como duas, três, quatro ou mais subdoses em intervalos apropriados durante todo o dia. As referidas subdoses podem ser formuladas como formas de unidades de dosagem, por exemplo, contendo 0,5 a 500 mg, e em particular 10 mg a 500 mg de ingrediente ativo por forma de unidade de dosagem.
[00119] Como outro aspecto da presente invenção é prevista uma combinação de um inibidor de HDAC com outro agente anticancerígeno, especialmente para aplicação como um medicamento, mais especificamente no tratamento de câncer ou doenças relacionadas.
[00120] Para o tratamento das condições acima, os compostos da invenção podem ser empregados vantajosamente em combinação com um ou mais agentes medicinais diferentes, mais particularmente, com outros agentes anticancerígenos. Exemplos de agentes anticancerígenos são: - compostos de coordenação de platina, por exemplo, cisplatina, carboplatina ou oxaliplatina; - compostos de taxano, por exemplo, paclitaxel ou docetaxel; - inibidores da topoisomerase I tais como compostos de camptotecina, por exemplo, irinotecan ou topotecan; - inibidores da topoisomerase II tais como derivados de podofilotoxina antitumorais, por exemplo, etoposídeo ou teniposídeo; - vinca alcalóides antitumorais, por exemplo, vinblastina, vincristina ou vinorelbina; - derivados de nucleosídeos antitumorais, por exemplo, 5- fluorouracila, gencitabina ou capecitabina; - agentes alquilantes tais como mostarda de nitrogênio ou nitrosouréia, por exemplo, ciclofosfamida, clorambucil, carmustina ou lomustina; - derivados de antraciclinas antitumorais, por exemplo, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina ou mitoxantrone; - anticorpos HER2, por exemplo, trastuzumab; - antagonistas de receptores estrogênicos ou moduladores de receptores estrogênicos seletivos, por exemplo, tamoxifen, toremifeno, droloxifeno, faslodex ou raloxifeno; - inibidores da aromatase tais como exemestane, anastrozol, letrazol e vorozol; - agentes de diferenciação tais como retinóides, vitamina D e agentes de bloqueio do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA), por exemplo, acutane; - inibidores de DNA metil transferase, por exemplo, azacitidina; - inibidores de quinase, por exemplo, flavoperidol, mesilato de imatinib ou gefitinib; - inibidores da farnesiltransferase; - outros inibidores da HDAC - inibidores do caminho ubiquitina-proteassoma, por exemplo, Velcade; ou - Yondelis.
[00121] O termo "composto de coordenação de platina" é usado neste relatório para denotar qualquer composto de coordenação de platina inibidor do crescimento celular tumoral o qual proporciona platina sob a forma de um íon.
[00122] O termo "compostos de taxano" indica uma classe de compostos tendo o sistema de anel de taxano e relacionados com ou derivados de extratos de algumas espécies de árvores de teixo (Taxus).
[00123] O termo "inibidores da topisomerase" é usado para indicar enzimas que são capazes de alterar a topologia do DNA em células eucarióticas. São cruciais para funções celulares importantes e a proliferação celular. Há duas classes de topoisomerases nas células eucarióticas, isto é, tipo I e tipo II. A topoisomerase I é uma enzima monomérica de aproximadamente 100.000 de peso molecular. A enzima liga a DNA e introduz uma ruptura de filamento único transitória, desenrola a dupla hélice (ou permite que esta desenrole) e em seguida fecha de novo a ruptura antes da dissociação do filamento de DNA. A Topisomerase II tem um mecanismo de ação similar o qual envolve a indução de rupturas de filamentos de DNA ou a formação dos radicais livres.
[00124] O termo "compostos de camptotecina" é usado para indicar compostos que são relacionados a ou derivados do composto de camptotecina matriz o qual é um alcalóide insolúvel em água derivado da árvore chinesa Camptothecin acuminatae a árvore indiana Nothapodytes foetida.
[00125] O termo "compostos de podofilotoxina" é usado para indicar compostos que são relacionados a ou derivados da podofilotoxina matriz, a qual é extraída da planta mandrágora.
[00126] O termo "vinca alcalóides antitumorais" é usado para indicar compostos que são relacionados a ou derivados de extratos da planta pervinca (Vinca rosea).
[00127] O termo "agentes alquilantes" engloba um grupo diverso de produtos químicos que têm a característica comum de que têm a capacidade de contribuir, sob condições fisiológicas, grupos alquila para macromoléculas biologicamente vitais tais como DNA. Com a maior parte dos agentes mais importantes tais como as mostardas de nitrogênio e as nitrosouréias, as porções alquilantes ativas são geradas in vivo depois de reações degradativas complexas algumas das quais são enzimáticas. As mais importantes ações farmacológicas dos agentes alquilantes são aquelas que interrompem os mecanismos fundamentais relacionado com proliferação celular em particular síntese de DNA e divisão de célula. A capacidade dos agentes alquilantes para interferir com funções de DNA e integridade em tecidos rapidamente proliferantes proporciona a base para suas aplicações terapêuticas e para muitas de suas propriedades tóxicas.
[00128] O termo "derivados de antraciclinas antitumorais" compreende antibióticos obtidos do fungo Strep, peuticus var. caesius e seus derivados, caracterizados por terem uma estrutura de anel de tetraciclinas com um açúcar incomum, daunosamina, fixado por uma ligação glicosídica.
[00129] Tem sido demonstrado que a amplificação da proteína receptora 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER 2) em carcinomas de mama primários se correlaciona com um mau prognóstico clínico para alguns pacientes. Trastuzumab é um anticorpo lgG1 capa monoclonal humanizado derivado de DNA recombinante altamente purificado que liga com alta afinidade e especificidade ao domínio extracelular do receptor HER2.
[00130] Muitos cânceres de mama têm receptores estrogênicos e o crescimento destes tumores pode ser estimulado por estrogênio. Os termos "antagonistas de receptores estrogênicos" e "moduladores de receptores estrogênicos seletivos" são usados para indicar ligação de inibidores de estradiol competitivos com o receptor estrogênico (ER). O modulador de receptor estrogênico seletivo, quando ligado ao receptor estrogênico, induz uma alteração na forma tridimensional do receptor, modulando sua ligação ao elemento estrogênio responsive (ERE) sobre o DNA.
[00131] Em mulheres na pós-menopausa, a principal fonte de estrogênio circulante é de conversão de androgênios adrenais e ovarianos (androstenodiona e testosterone) em estrogênios (estrona e estradiol) pela enzima aromatase nos tecidos periféricos. A privação de estrogênio através de inibição ou inativação da aromatase é um tratamento eficaz e seletivo para alguns pacientes na pós-menopausa com câncer de mama hormônio-dependente.
[00132] O termo "agente antiestrogênico" é usado neste relatório para incluir não somente antagonistas de receptores estrogênicos e moduladores de receptores estrogênicos seletivos mas também inibidores da aromatase conforme discutido acima.
[00133] O termo "agentes de diferenciação" engloba compostos que podem, de vários modos, inibir a proliferação celular e induzir diferenciação. Sabe-se que vitamina D e retinóides têm um papel importante na regulação do crescimento e diferenciação de uma ampla variedade de tipos celulares normais e malignos. Agentes de bloqueio do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA's) aumentam os níveis de ácidos retinóicos endógenos por inibição do catabolismo de ácidos retinóicos mediados pelo citocromo P450.
[00134] Alterações de metilação de DNA estão entre as anormalidades mais comuns na neoplasia humana. Hipermetilação dentro dos promotores de genes selecionados é geralmente associada com inativação dos genes envolvidos. O termo "inibidores de DNA metil transferase"é usado para indicar compostos que agem através de inibição farmacológica de DNA metil transferase e reativação da expressão de gene supressor tumoral.
[00135] O termo "inibidores de quinases" compreende potentes inibidores de quinases que estão envolvidos na progressão do ciclo celular e morte celular programada (apoptose)
[00136] O termo "inibidores da farnesiltransferase" é usado para indicar compostos que foram designados para prevenir a farnesilação de Ras e outras proteínas intracelulares. Foi demonstrado que têm efeito sobre a proliferação e sobrevida de células malignas.
[00137] O termo "outros inibidores de HDACs" compreende mas não está limitado a: - carboxilatos, por exemplo, butirato, ácido cinâmico, 4- fenilbutirato ou ácido valpróico; - ácidos hidroxâmicos, por exemplo, ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA), piperazina contendo SAHA análogos, biaril hidroxamato A-161906 e seus éter carbozolílico-, tetrahidropiridina- e tetralona- análogos, aril-A/-hidroxicarboxamidas bicíclicas, piroxamida, CG-1521, PXD-101, ácido hidroxámico de sulfonamida, LAQ-824, LBH-589, tricostatina A (TSA), oxanflatina, escriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas com escriptaid, ácido ácido m-carbóxi cinâmico bishidroxâmico (CBHA), ácidos hidroxâmicos similares a CBHA, ácido trapoxin-hidroxâmico análogo, R306465 e ácidos benzoil- e heteroaril- hidroxâmicos relacionados, aminossuberatos e malonildiamidas; - tetrapeptídeos cíclicos, por exemplo, trapoxin, apidicin, depsipeptídeo, compostos relacionados com espirucostatina, RedFK- 228, tetrapeptídeos cíclicos contendo sulfidrila (SCOPs), tetrapeptídeos cíclicos contendo ácido hidroxámico (CHAPs), TAN- 1748 e azumamidas; - benzamidas, por exemplo, MS-275 ou CI-994, ou - depudecin.
[00138] O termo "inibidores do caminho ubiquitina-proteassoma" é usado para indentificar compostos que inibem a destruição visada de proteínas celulares no proteassoma, incluindo proteínas reguladoras do ciclo celular.
[00139] Para o tratamento de câncer os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados a um paciente conforme descrito acima, em combinação com irradiação. Irradiação significa radiação ionizante e em particular radiação gama, especialmente a radiação emitida por aceleradores lineares ou por radionuclídeos que estão em uso comum hoje em dia. A irradiação do tumor por radionuclídeos pode ser externa ou interna.
[00140] A presente invenção também se refere a uma combinação de acordo com a invenção de um agente anticancerígeno e um inibidor de HDAC de acordo com a invenção.
[00141] A presente invenção também se refere a uma combinação de acordo com a invenção para aplicação em terapia médica, por exemplo, para inibir o crescimento de células tumorais.
[00142] A presente invenção também se refere a algumas combinações de acordo com a invenção para inibir o crescimento de células tumorais.
[00143] A presente invenção também se refere a um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo humano o qual compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma combinação de acordo com a invenção.
[00144] Esta invenção proporciona adicionalmente um método para inibir o crescimento anormal de células, incluindo células transformadas, por administração de uma quantidade eficaz de uma combinação de acordo com a invenção.
[00145] O outro agente medicinal e inibidor de HDAC podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, em composições separadas ou unitárias) ou seqüencialmente em qualquer ordem. No último caso, os dois compostos serão administrados dentro de um período e em uma quantidade e maneira que são suficientes para assegurar que seja obtido um efeito vantajoso ou sinérgico. Será reconhecido que o método e ordem de administração preferenciais e as respectivas quantidades das dosagens e regimes para cada componente da combinação dependerão do outro agente medicinal em particular e inibidor de HDAC que está sendo administrado, sua via de administração, o tumor em particular que está sendo tratado e o hospedeiro em particular que está sendo tratado. O método e ordem de administração e as quantidades das dosagens e regimes ótimos podem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica usando métodos convencionais e em vista das informações determinadas neste relatório.
[00146] O composto de coordenação de platina é administrado vantajosamente em uma dosagem de 1 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 50 a 400 mg/m2, particularmente para cisplatina em uma dosagem de cerca de 75 mg/m2 e para carboplatina em cerca de 300 mg/m2 por curso de tratamento.
[00147] O composto de taxano é administrado vantajosamente em uma dosagem de 50 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel em uma dosagem de cerca de 175 a 250 mg/m2 e para docetaxel em cerca de 75 a 150 mg/m2 por curso de tratamento.
[00148] O composto de camptotecina é administrado vantajosamente em uma dosagem de 0,1 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 1 a 300 mg/m2, particularmente para irinotecan em uma dosagem de cerca de 100 a 350 mg/m2 e para topotecan em cerca de 1 a 2 mg/m2 por curso de tratamento.
[00149] O derivado de podofilotoxina antitumoral é administrado vantajosamente em uma dosagem de 30 a 300 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 50 a 250 mg/m2, particularmente paa etoposídeo em uma dosagem de cerca de 35 a 100 mg/m2 e para teniposídeo em cerca de 50 a 250 mg/m2 por curso de tratamento.
[00150] O vinca alcalóide antitumoral é administrado vantajosamente em uma dosagem de 2 a 30 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, particularmente para vinblastina em uma dosagem de cerca de 3 a 12 mg/m2 , para vincristina em uma dosagem de cerca de 1 a 2 mg/m2 , e para vinorelbina em dosagem de cerca de 10 a 30 mg/m2 por curso de tratamento.
[00151] O derivado de nucleosideos antitumoral é administrado vantajosamente em uma dosagem de 200 a 2500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 700 a 1500 mg/m2, particularmente para 5-FU em uma dosagem de 200 a 500 mg/m2, para gencitabina em uma dosagem de cerca de 800 a 1200 mg/m2 e para capecitabina em cerca de 1000 a 2500 mg/m2 por curso de tratamento.
[00152] Os agentes alquilantes tais como mostarda de nitrogênio ou nitrosouréia são administrados vantajosamente em uma dosagem de 100 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 120 a 200 mg/m2, particularmente para ciclofosfamida em uma dosagem de cerca de 100 a 500 mg/m2 , para clorambucil em uma dosagem de cerca de 0,1 a 0,2 mg/kg, para carmustine em uma dosagem de cerca de 150 a 200 mg/m2 , e para lomustine em uma dosagem de cerca de 100 a 150 mg/m2 por curso de tratamento.
[00153] O derivado de antraciclinas antitumoral é administrado vantajosamente em uma dosagem de 10 a 75 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 15 a 60 mg/m2, particularmente para doxorubicina em uma dosagem de cerca de 40 a 75 mg/m2, para daunorubicina em uma dosagem de cerca de 25 a 45mg/m2 , e para idarubicina em uma dosagem de cerca de 10 a 15 mg/m2 por curso de tratamento.
[00154] Trastuzumab é administrado vantajosamente em uma dosagem de 1 a 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, particularmente 2 a 4 mg/m2 por curso de tratamento.
[00155] O agente antiestrogênico é administrado vantajosamente em uma dosagem de cerca de 1 a 100 mg diariamente dependendo do agente em particular e da condição que está sendo tratada. Tamoxifeno é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de 5 a 50 mg, preferencialmente 10 a 20 mg duas vezes ao dia, continuando a terapia por tempo suficiente para obter e manter um efeito terapêutico. Toremifeno é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia, continuando a terapia por tempo suficiente para obter e manter um efeito terapêutico. Anastrozole é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de cerca de 1 mg uma vez ao dia. Droloxifeno é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de cerca de 20 a 100 mg uma vez ao dia. Raloxifeno é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia. Exemestane é administrado vantajosamente por via oral em uma dosagem de cerca de 25 mg uma vez ao dia.
[00156] Estas dosagens podem ser administradas, por exemplo, uma vez, duas vezes ou mais por curso de tratamento, o qual pode ser repetido, por exemplo, a cada 7,14, 21 ou 28 dias.
[00157] Em vista de suas úteis propriedades farmacológicas, os componentes das combinações de acordo com a invenção, isto é, o outro agente medicinal e o inibidor de HDAC podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para fins de administração. Os componentes podem ser formulados separadamente em composições farmacêuticas individuais ou em uma composição farmacêutica unitária contendo ambos os componentes.
[00158] A presente invenção portanto também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o outro agente medicinal e o inibidor de HDAC junto com um ou mais veículos farmacêuticos.
[00159] A presente invenção também se refere a uma combinação de acordo com a invenção sob a forma de uma composição farmacêutica compreendendo um agente anticancerígeno e um inibidor de HDAC de acordo com a invenção junto com um ou mais veículos farmacêuticos.
[00160] A presente invenção se refere adicionalmente à aplicação de uma combinação de acordo com a invenção na fabricação de uma composição farmacêutica para inibir o crescimento de células tumorais.
[00161] A presente invenção se refere adicionalmente a um produto contendo como primeiro ingrediente ativo um inibidor de HDAC de acordo com a invenção e como segundo ingrediente ativo um agente anticancerígeno, como uma preparação combinada para aplicação simultânea, isolada ou seqüencial no tratamento de pacientes sofrendo de câncer.
[00162] Os exemplos seguintes são proporcionados para fins de ilustração. Nas partes que se seguem, "EDC" é definido como A/'- (etilcarbonimidoil)-A/,A/-dimetil-1,3-propanodiamina, monocloridrato, "DCM" é definido como diclorometano, "DIPE" é definido como éter diisopropílico, "DMF" é definido como A/,A/-dimetilformamida, "EtOAc" é definido como acetato de etila, "EtOH" é definido como etanol, "HOBT" é definido como 1-hidróxi-1H-benzotriazol, "MeOH" é definido como metanol, "TFA" é definido como ácido trifluoroacético e "THF" é definido como tetrahidrofurano. A. Preparação dos compostos intermediários Exemplo A1 a)Preparaçâo dp intermediário 1
[00163] Uma mistura de ácido 2-(1-piperazinil)- 5- pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,016 mol), ácido (2-feniletenil)- borônico (0,016 mol) e 1,4-dioxana-2,5-diol (0,016 mol) em EtOH (250 ml) foi agitada por 2 dias em temperatura ambiente e em seguida o solvente foi evaporado (vac.), O resíduo foi absorvido em DCM e água e a camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (15-40 pm) (eluente: DCM/MeOH a 97/1). As frações puras foram evaporadas, produzindo 4 g (61%) do intermediário 1, ponto de fusão 128°C.
[00164] Ésteres, correspondendo ao intermediário 1, podem ser separados por cromatografia quiral. b).Preparaçao do intermediário.2
[00165] Uma mistura do intermediário 1 (0,0007 mol) em hidróxido de sódio a 1N (10 ml) e THF (20 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas. Ácido clorídrico a 1N (10 ml) foi adicionado. O solvente foi evaporado. O precipitado foi filtrado, lavado com água, em seguida com DIPE e seco, produzindo 0,2 g (72%) do intermediário 2,ponto de fusão 232°C. ç).Preparação do intermediário 3
[00166] Trietil amina (0,012 mol), /V'-(etilcarbonimidoil)-/V,/V-dimetil- 1,3-propanodiamina (0,00593 mol), 1-hidróxi- 1/-/-benzotriazol (0,00593 mol) e O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,00593 mol) foram adicionados a uma mistura do intermediário 2 (0,00395 mol) em uma mistura de DCM (70 ml) e THF (70 ml), em seguida a mistura da reação foi agitada por 3 dias em temperatura ambiente. H2O foi adicionada. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), retirada por filtragem e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (gradiente do eluente: DCM/MeOH/NFUOH a 97/3/0,1). As frações do produto foram coletadas e o solvente orgânico foi evaporado produzindo 1,5 g (84 %) do intermediário 3. Exemplo A2 a). Preparação dp intermediário 4
[00167] Uma mistura de ácido 2-(1-piperazinil)- 5- pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,0042 mol), 1,4-dioxana-2,5-diol (0,0042 mol) e ácido (E)-[2-(4-clorofenil)etenil]- borônico (0,0042 mol) em EtOH (100 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 72 horas, vertida em água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado. O resíduo (1,8 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica- gel (15-40 pm) (eluente: DCM/MeOH/NHUOH a 97/3/0,1;). Duas frações foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,85 g de F1 (óleo) e 0,25 g de F2 (rendimento global: 63%). F1 foi cristalizado a partir de 2-propanona/DIPE. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,6 g do intermediário 4, ponto de fusão 110°C. b). Preparação dp intermediário 5
[00168] Cloreto de metanossulfonila (0,0012 mol) foi adicionado a 5°C a uma solução do intermediário 4(0,0006 mol) e trietil amina (0,0024 mol) em THF (15 ml) sob fluxo de N2. A mistura foi trazida até a temperatura ambiente, em seguida agitada por 1 hora e vertida em água gelada. A mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado, produzindo 0,3 g do intermediário 5. Este produto foi usado diretamente na etapa de reação seguinte. c)Preparaçãp do intermediário 6
[00169] Uma mistura do intermediário 5(0,0006 mol), morfolina (0,0009 mol) e carbonato de potássio (0,0018 mol) em acetonitrila (30 ml) foi agitada a 80°C por 15 horas, vertida em água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,27 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (5 pm) (eluente: DCM/MeOH a 100/0 até 90/10). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,085 g (29%) do intermediário 6. d). Preparação dp intermediário 7
[00170] Uma mistura do intermediário 6(0,0002 mol) em hidróxido de sódio a 1N (1,5 ml) e THF (3 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 72 horas. Ácido clorídrico a 1N (1,5 ml) foi adicionado. A mistura foi evaporada até a secura, produzindo o intermediário 7. Este produto foi usado diretamente na etapa de reação seguinte. e). Preparação dp intermediário 8
[00171] Uma mistura do intermediário 7 (0,0002 mol), O-(tetrahidro- 2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0002 mol), EDC (0,0002 mol), HOBT (0,0002 mol) e trietil amina (0,0002 mol) em DCM/THF (10 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas, vertida em água e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,095 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (5 pm) (eluente: DCM/MeOH/NHziOH a 97/3/0,1). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,04 g (41%) do intermediário 8. Exemplo A3 a). Preparação dp intermediário 11
[00172] Etilato de titânio (0,0085 mol) foi adicionado em temperatura ambiente a uma solução de ácido 2-(1 -piperazinil)- 5- pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,0042 mol) e 4-fenil-3-buten-2-ona (0,0051 mol) em 1,2-dicloro- etano (45 ml) sob fluxo de N2 . A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas. NaBH(OAc)3 (0,0085 mol) foi adicionado. A mistura foi agitada por 5 horas e vertida em água gelada. DCM foi adicionado. A mistura foi filtrada sobre celite. A camada orgânica foi separada, seca (MgSOzi), filtrada, e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (1,16 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre cromasil (5 pm) (eluente: DCM/MeOH a 100/0 até 95/5). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado, produzindo 0,12 g (8%) do intermediário 11. b). Preparação dp. Intermediário 12
[00173] Uma mistura do intermediário 11(0,0003 mol) e hidróxido de sódio (0,0013 mol) em EtOH (15 ml) foi agitada e refluxada por 3 horas, em seguida resfriada até a temperatura ambiente e evaporada até a secura. O resíduo foi absorvido em éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,12 g (100%) do intermediário 12, ponto de fusão > 260°C. c).Preparação do intermediário.13
[00174] EDC (0,0006 mol) e HOBT (0,0006 mol) foram adicionados em temperatura ambiente a uma solução do intermediário 12 (0,0003 mol) em agitada (0,0006 ambiente por 48 horas, vertida em água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (0,25 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre Kromasil (5pm) (eluente: DCM/MeOH a As frações puras foram coletadas e 0 solvente produzindo 0,1 g (70%) do intermediário 13. Exemplo A4 a).Preparação do intermediário.14
[00175] Uma mistura de pirimidinacarboxílico, éster etílico hidróxido de sódio a 1N (300 ml) foi deixada em repouso de um dia para 0 outro em temperatura ambiente e em seguida agitada. Ácido clorídrico a 1N (300 ml) foi adicionado e a mistura foi agitada por 10 min. Carbonato de sódio (0,178 mol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 10 minutos em temperatura ambiente, em seguida 1-[[(9/-/-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]óxi]-2,5-pirrolidinadiona (0,059 mol) foi adicionado em pequenas porções e a mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas. A mistura foi acidificada com HCI concentrado e o precipitado foi retirado por filtragem e seco (vac.), produzindo 22,5 g (90 %) do intermediário 14, ponto de fusão 218,5-221,2°C. b). Preparação। dp ..intermediário 15
[00176] Trietilamina (0,069 mol), em seguida EDC (0,0303 mol) e HOBT (0,0303 mol) seguido por O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0303 mol) foram adicionados a uma mistura do intermediário 14(0,0233 mol) em DCM/THF (500 ml) e a mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 18 horas. A mistura foi diluída com DCM e lavada com água. A camada orgânica foi separada e lavada com uma solução a 10 % de carbonato de sódio. A camada orgânica separada foi seca (MgSO4), retirada por filtragem e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna por cintilação (eluente: DCM/MeOH a 100/0 -> 97,5/2,5 em 100 min.). As frações do produto foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 8,4 g (68 %) do intermediário 15. Ç)Preparação do.intermediárip 16.
[00177] Uma mistura do intermediário 15(0,016 mol) em piridina (0,040 mol) e DCM (200 ml) foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente e a mistura da reação foi extraída com água, em seguida a camada aquosa foi concentrada e co-evaporada com acetonitrila. O resíduo (3,5 g) foi purificado por cromatografia de coluna por cintilação (eluente: DCM/MeOH/NHa) a 95/5/0,5). As frações do produto foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 2,5 g (50 %) do intermediário 16, ponto de fusão 70,8-93,9 d).Preparação do.intermediário 17
[00178] Uma mistura do intermediário 16(0,002 mol), ácido (E)-[2- (4-fluorofenil)etenil]-borônico (0,002 mol) e 1,4-dioxano-2,5-diol (0,002 mol) em EtOH (25 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas, vertida sobre gelo. NaHCOa foi adicionado. A mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,68 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre cromasil (5pm) (eluente: DCM/MeOH a 100/0 até 90/10). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,27 g (29%) do intermediário 17, ponto de fusão 90°C. Exemplo A5 a) . Preparação dp.intermediário. 18
[00179] Ácido 2-oxo-propanóico (0,0169 mol) em seguida ácido 2- (1-piperazinil)-5-pirimidinecarboxílico, éster etílico (0,0169 mol) foram adicionados a uma solução de ácido [2-(4-fluorofenil)etenil]-borônico (0,0169 mol) em DCM (150 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas. Ácido 2-oxo- propanóico (0,4 eq) e ácido [2-(4- fluorofenil)etenil]- borônico (0,1 eq) foram adicionado. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas. A camada orgânica foi lavado com água, seca (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (7,7 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica- gel (15-40 pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH a 92/8/0,1). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado. Este resíduo (6 g) foi dissolvido em HCI a 3N. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. O precipitado foi filtrado, lavado com água (o mínimo) e seco, produzindo 2,8 g (36%) do intermediário 18. b) . Preparação dp.intermediário 19
[00180] HOBT (0,0022 mol) em seguida EDC (0,0022 mol) foram adicionados a uma solução do intermediário 18(0,0015 mol), A/-metil- metanamina (0,0022 mol) e trietilamina (0,0075 mol) em DCM/THF (40 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas, vertida em água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSOzi), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi absorvido em DIPE. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,58 g (85%) do intermediário 19, ponto de fusão 195°C. .Ç).Preparaçãpdpjntermediárip 20
[00181] Uma mistura do intermediário 19(0,0011 mol) e hidróxido de lítio (0,0023 mol) em THF (20 ml) e água (10 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas. HCI a 3N foi adicionado. THF foi evaporado. O precipitado foi filtrado, lavado com água, em seguida com éter dietílico e seco, produzindo 0,45 g (82%) do intermediário 20. d). Ereparapãp dp. Intermediário 21
[00182] HOBT (0,0014 mol) em seguida EDC (0,0014 mol) foram adicionados em temperatura ambiente a uma solução do intermediário 20(0,0009 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0014 mol) e trietilamina (0,0043 mol) em DCM/THF (50/50) (75 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas, vertida em água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,7 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (5 pm) (eluente: DCM/MeOH/NHziOH a 99/1/0,1 até 94/6/0,6). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,38 g (75%) do intermediário 21. Exemplo A6 a) . Preparaçãojp. intermediário.22
[00183] Hidreto de sódio 60% (0,0085 mol) foi adicionado em porções a 5°C a uma solução do intermediário 1 (0,0065 mol) em THF (60 ml) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada a 5°C por 15 minutos. Uma solução de iodometano (0,0078 mol) em THF (5 ml) foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada a 5°C por 1 hora, em seguida agitada em temperatura ambiente por 5 horas, vertida sobre gelo e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (1,75 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (15-40 pm) (eluente: DCM/MeOH 99/1). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado, produzindo 0,87 g (34%) do intermediário 22. b) . Preparação dp.intermediário 23
[00184] Uma mistura do intermediário 22(0,0027 mol) e monoidrato de hidróxido de lítio (0,0055 mol) em THF (40 ml) e água (20 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas, acidificada com HCI a 1N. THF foi evaporado. O precipitado foi filtrado, lavado com um mínimo de água e seco, produzindo: 0,91 g (83%) do intermediário 23. .Ç)Preparação dpjntermediárip.24
[00185] HOBT (0,0033 mol) em seguida EDC (0,0033 mol) foram adicionados em temperatura ambiente a uma solução do intermediário 23(0,0022 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0033 mol) e trietilamina (0,01 mol) em DCM/THF (90 ml) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas, vertida em água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCU), filtrada e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (1,3 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (15-40 pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH a 97/3/0,1). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado, produzindo 0,93 g (89%) do intermediário 24. Exemplo A7 a) Preparacao do. intermediário.25
[00186] Uma mistura de ácido 2-(1-piperazinil)- 5-piridilcarboxílico, éster etílico (0,0085 mol), 1,4-dioxano-2,5-diol (0,0093 mol) e ácido (E)-[2-(4-fluorofenil)etenil]- borônico (0,0042 mol) em EtOH (200 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas, em seguida filtrada. O filtrado foi evaporado. O resíduo foi absorvido em EtOAc. A camada orgânica foi lavada com NaCI saturado, seca (MgSCU), filtrada, e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (3,3 g) foi dissolvido em éter dietílico e acidificado por adição gota a gota a 5°C de HCI a 5-6N em isopropanol (2 ml). O precipitado foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco. Esta fração foi absorvida em água, K2CO3 foi adicionado e a mistura foi extraída por DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), filtrada, e o solvente foi evaporado, produzindo 2,7 g (79%) do intermediário 25. b). Preparação dp.intermediário 26
[00187] Uma mistura do intermediário 25 ((0,002 mol), hidróxido de lítio (0,004 mol) em água (20 ml) e THF (40 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 15 horas. A mistura foi concentrada. Ácido clorídrico a 3N foi adicionado. O precipitado foi filtrado, lavado com água, em seguida com éter dietílico e seco, produzindo 0,52 g (63%) do intermediário 26. c)Preparaçãpdpjntermediárip 27
[00188] Trietil amina (0,0057 mol), A/'-(etilcarbonimidoil)-A/,A/-dimetil- 1,3-propanodiamina (0,0019 mol), 1-hidróxi- 1 H-benzotriazol (0,0019 mol) e O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0019 mol) foram adicionados a uma mistura do intermediário 26 (0,0012 mol) em uma mistura de DCM (50 ml) e THF (50 ml). A mistura da reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente, em seguida vertida em H2O e extraída por DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSO4), retirada por filtragem e 0 solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (gradiente do eluente: DCM/MeOH/NH4OH a 95/5/0,2). As frações do produto foram coletadas e 0 solvente orgânico foi evaporado produzindo 0,55 g (91 %). Este resíduo foi absorvido em éter dietílico, 0 precipitado foi retirado por filtragem e seco produzindo 0,5 g do intermediário 27, ponto de fusão 133°C. Exemplo A8 Preparação dojntermediárip.28e 29
intermediário 28: base livre intermediário 29: C2H2O4 (1:1)
[00189] Anidrido acético (0,014 mol) foi adicionado gota a gota a 5°C, a uma mistura do intermediário 3 (0,0014 mol), 4-N-N- dimetilaminopiridina (0,0095 g) e piridina (2,5 ml) em DCM (14 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 24h, concentrada, absorvida em água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi seca (MgSCU), retirada por filtragem e 0 solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (5 pm) (gradiente do eluente: DCM/MeOH a 95/5). As frações puras foram coletadas e 0 solvente orgânico foi evaporado produzindo 0,48 g (58 %) do intermediário 28. O sal de oxalato foi preparado em uma fração (0,05 g) e foi cristalizado a partir de 2-propanona/éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,042 g do intermediário 29, ponto de fusão 154°C.
[00190] A Tabela F-1 lista os intermediários que foram preparados de acordo com um dos Exemplos acima. Tabela F-1 (intermediários)
B. Preparação dos compostos finais Exemplo B1 Preparação do composto 1 
[00191] Uma mistura do intermediário 3 (0,00121 mol) em TFA (2,5 ml) e MeOH (50 ml) foi agitada por 48 horas e em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel LiChroprep® NH2 (25-40 pm) (eluente: DCM/MeOH/FW a 80/20/2). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado. O resíduo foi absorvido em éter dietílico e 0 precipitado foi em seguida filtrado e seco (vac.) a 50°C, produzindo 0,26 g (64%) do composto 1, ponto de fusão 187°C. Exemplo B2 Preparação do composto 2
[00192] Uma mistura do intermediário 8(0,00007 mol) em ácido trifluoroacético (0,2 ml) e MeOH (4,5 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 96 horas. O solvente foi evaporado até a secagem. O resíduo foi cristalizado a partir de éter dietílico/2-propanona. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,025 g (57%) do composto 2, ponto de fusão 135°C. Exemplo B3 Preparação do composto 7
[00193] Uma mistura do intermediário 13 (0,0002 mol) em TFA (0,5 ml) e MeOH (10 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas, em seguida evaporado até a secagem. O resíduo foi cristalizado a partir de éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,044 g (44%) do composto 7, ponto de fusão 161°C. Exemplo B4 Preparação dp composto 8.
[00194] Uma mistura do intermediário 17 (0,0005 mol) em TFA (1,2 ml) e MeOH (24 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 5 dias. O solvente foi evaporado até a secagem. O resíduo (0,26 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel LiChroprep® NH2 (25-40 pm) (eluente: DCM/MeOH/H2O a 70/30/3). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,16 g) foi cristalizado a partir de éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,13 g (66%) do composto 8, ponto de fusão 180°C. Exemplo B5 Preparação do.çomposto 9.
[00195] Uma mistura do intermediário 28 (0,0004 mol) em TFA (1 ml) e MeOH (20 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 96 horas, em seguida evaporado. O resíduo (0,23 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel LiChroprep® NH2 (25-40pm) (eluente: DCM/MeOH/FW a 80/20/2). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado. O resíduo (0,106 g) foi cristalizado a partir de éter dietílico/DIPE. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,067 g (34%) do composto 9, ponto de fusão 161°C. Exemplo B6 . Preparação do composto 10
[00196] TFA (1,9 ml) foi adicionado gota a gota a 5°C a uma solução do intermediário 21 (0,0007 mol) em MeOH (38 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas em seguida evaporado até a secagem. O resíduo foi cristalizado a partir de éter dietílico/CHaCN. O precipitado foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco, produzindo 0,24 g (62%) do composto 10, ponto de fusão 146°C. Exemplo B7 Preparação do composto 11
[00197] Uma mistura do intermediário 24 (0,0018 mol) em TFA (4,4 ml) e MeOH (87 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 4 dias, em seguida evaporado até a secagem. O resíduo (1,05 g) foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel LiChroprep® NH2 (25-40pm) (eluente: DCM/MeOH/FhO a 80/20/2). As frações puras foram coletadas e 0 solvente foi evaporado. Esta fração (0,634 g) foi absorvida em éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,43 g do composto 11, ponto de fusão 212°C. Exemplo B8 Preparação dp.composto 31
[00198] Uma mistura do intermediário 27(0,0011 mol) em ácido trifluoroacético (3 ml) e MeOH (60 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas. O solvente foi evaporado até a secagem. O resíduo foi cristalizado a partir de éter dietílico. O precipitado foi retirado por filtragem e seco, produzindo 0,515 g (89%) do composto 31, ponto de fusão 145°C.
[00199] A Tabela F-2 lista os compostos que foram preparados de acordo com um dos Exemplos acima. As abreviações seguintes foram usadas nas tabelas: .C2HF3O2 significa o sal de trifluoroacetato. Tabela F-2 (compostos finais)
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[00200] O teste em vitropara inibição de histona deacetilase (veja o exemplo C.1) mede a inibição da atividade enzimática de HDAC obtida com os compostos de fórmula (I).
[00201] A atividade celular dos compostos de fórmula (I) foi determinada sobre células tumorais A2780 usando um teste colorimétrico para toxicidade ou sobrevida celular (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983) (veja o exemplo C.2).
[00202] A solubilidade de um composto mede a capacidade de um composto para permanecer em solução.
[00203] Em um primeiro método é medida a capacidade de um composto para permanecer em solução aquosa na diluição (veja o exemplo C.3.a) . Soluções básicas de DMSO são diluídas com um único solvente de tampão aquoso em 3 etapas consecutivas. Para cada diluição a turvação é medida com um nefelômetro.
[00204] Em um segundo método a solubilidade de um composto em diferentes pH's pode ser medida com a aplicação de um detector de nitrogênio quimiluminescente (veja o exemplo C.3.b).
[00205] A permeabilidade de um fármaco expressa sua capacidade para mover de um meio para ou através de outro. Especificamente sua capacidade para mover através da membrana intestinal para dentro da corrente sangüínea e/ou da corrente sangüínea para o alvo. A permeabilidade (veja o exemplo C.4) pode ser medida através da formação de uma bicamada fosfolipídica de membrana artificial imobilizada sobre filtro. No teste da membrana artificial imobilizada sobre filtro, forma-se um "sanduíche" com uma lâmina de microtítulo de 96 cavidades e uma lâmina de filtro de 96 cavidades, de tal modo que cada cavidade composta é dividida em duas câmaras com uma solução doadora no fundo e uma solução aceitadora na parte de cima, separadas por um disco de microfiltro de 125 |im (poros de 0,45 |im), revestido com solução de dodecano a 2% (peso/vol) de dioleoilfosfatidil-colina, sob condições que formam bicamadas multilamelares dentro dos canais de filtro quando o sistema entra em contato com uma solução tampão aquosa. A permeabilidade dos compostos através desta membrana artificial é medida em cm/s. O propósito é buscar a permeação dos fármacos através de uma membrana artificial paralela em 2 diferentes pH's: 4,0 e 7,4. A detecção dos compostos é feita com espectrometria UV em comprimento de onda ótimo entre 250 e 500 nm.
[00206] Metabolismo de fármacos significa que um composto xenobiótico ou endobiótico solúvel em lipídeo é transformado enzimaticamente em (a) um ou mais metabolites polares, hidrossolúveis e excretáveis. O principal óirgão para o metabolismo de fármacos é o fígado. Os produtos metabólicos são freqüentemente menos ativos do que o fármaco matriz ou inativo. No entanto, alguns metabolitos podem ter aumento da atividade ou efeitos tóxicos. Portanto o metabolismo de fármacos pode incluir tanto processos de "detoxicação" e "toxicação". Um dos principais sistemas enzimáticos que determinam a capacidade do organismo para lidar com fármacos e produtos químicos é representado pelas citocromo P450 monooxigenases, as quais são enzimas NADPH dependentes. A estabilidade metabólica dos compostos pode ser determinada in vitro com a aplicação de tecido humano subcelular (veja o exemplo C.5.a.). Aqui a estabilidade metabólica dos compostos é expressada como % de fármaco metabolisada depois de 15 minutos de incubação destes compostos com microssomas. A quantificação dos compostos foi determinada por análise LC-MS.
[00207] A estabilidade metabólica dos compostos também pode ser determinada calculando a meiavida dos compostos em células de hepatócito de rato (veja o exemplo C.5.b.).
[00208] Foi demonstrado que uma ampla variedade de agentes antitumorais ativam a proteína p21, incluindo agentes de lesão de DNA e inibidores de histona deacetilases. Os agentes de lesão de DNA ativam o gene p21 através do supressor tumoral p53, enquanto os inibidores de histona deacetilases ativam transcricionalmente o gene p21 através do fator de transcrição Sp1. Portanto, os agentes de lesão de DNA ativam o promotor p21 através do elemento responsivo a p53 enquanto inibidores de histona deacetilases ativam o promotor p21 através de sítios sp1 (localizados na região -60 bp a +40 bp relativa ao box TATA) ambos levando a aumento da expressão da proteína p21. Quando o promotor p21 em algumas células consiste em um fragmento promotor p21 de 1300 bp que não compreende os elementos responsivos a p53 é por conseguinte não responsivo a agentes de lesão de DNA.
[00209] A capacidade dos compostos para induzir p21 pode ser avaliada de vários modos. Um primeiro método é tratar células tumorais com o composto de interesse e depois de lise das células detectar indução de p21 com o teste imunossorvente ligado a enzima p21 (WAF1 ELISA da Oncogene). O teste p21 é um imunoensaio enzimático de "sanduíche" empregando tanto anticorpos policlonais de coelho quanto monoclonais de camundongo. Um anticorpo policlonal de coelho, específico para a proteína p21 humana, foi imobilizada sobre a superfície das cavidades plásticas proporcionadas no kit. Qualquer p21 presente na amostra a ser testada ligará ao anticorpo de captura. O anticorpo monoclonal detector biotinilado também reconhece a proteína p21 humana, e ligará a qualquer p21, a qual tenha sido retida pelo anticorpo de captura. O anticorpo detector, por sua vez, é ligado por estreptavidina conjugada a peroxidase de rábano-silvestre. A peroxidase de rábano-silvestre catalisa a conversão do substrato cromogênico tetra-metilbenzidina de uma solução incolor para uma solução azul (ou amarela depois da adição de reagente de tamponamento), cuja intensidade é proporcional à quantidade de proteína p21 ligada à lâmina. O produto da reação colorido é quantificado usando um espectrofotômetro. A quantificação é obtida pela construção de uma curva padrão usando concentrações conhecidas de p21 (fornecida liofilizada). Este teste pode medir a indução de p21 como a conseqüência da lesão de DNA ou como a conseqüência da inibição da histona deacetilase (veja o exemplo C.6.a.).
[00210] Outro método testa a capacidade dos compostos para induzir p21 como a conseqüência da dinibição a HDAC no nível celular. As células podem ser estavelmente transfectadas com um vetor de expressão contendo um fragmento promotor de p21 de 1300bp que não compreende os elementos responsivos a p53 e em que um aumento da expressão de um gene repórter, comparado com os níveis de controle, identifica o composto como tendo capacidade de indução de p21. O gene repórter é uma proteína fluorescente e a expressão do gene repórter é medida como a quantidade de luz fluorescente emitida (veja o exemplo C.6.b.).
[00211] O último método é um método in vivo em que camundongos são usados para triagem da atividade farmacêutica de um composto. As células tumorais estavelmente transformadas descritas acima podem ser administradas a camundongos em uma quantidade suficiente para efetuar produção de um tumor. Depois das células tumorais terem suficiente tempo para formar um tumor, um composto potencialmente ativo pode ser administrado aos animais e o efeito do referido composto sobre as células tumorais é avaliado medindo a expressão do gene repórter. A incubação com compostos ativos farmacêuticos resultará em um aumento da expressão de gene repórter comparados com os níveis de controle (veja o exemplo C.6.c.)
[00212] Inibidores de HDAC específicos não devem inibir outras enzimas como as abundantes proteínas CYP P450. As proteínas CYP P450 (expressadas por E. coli) 3A4, 2D6 en 2C9 convertem seus substratos específicos em uma molécula fluorescente. A proteína CYP3A4 converte 7- benzilóxi-trifluorometil cumarina (BFC) em 7- hidróxi-trifluorometil cumarina. A proteína CYP2D6 converte 3-[2-(N,N- dietil-N-metilamino)etil]-7-metóxi-4-metilcumarina (AMMC) em cloridrato de 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidróxi-4-metilcumarina e a proteína CYP2C9 converte 7-Metóxi-4-trifluorometil cumarina (MFC) em 7-hidróxi-trifluorometil cumarina. Compostos inibidores da reação enzimática resultarão em uma redução do sinal fluorescente (veja o exemplo C.7).
[00213] Foi usado o Kit de Teste da Atividade Fluorescente de HDAC / Descoberta de Fármaco (HDAC Fluorescent Activity Assay/Drug Discovery Kit) da Biomol (cat.No: AK-500-0001) . O teste da atividade fluorescente de HDAC (HDAC Fluorescent Activity Assay) se baseia na combinação de developer e substrato de Fluor de Lys (Fluoroαenic Histone deAcetylase Lysyl).O substrato de Fluor de Lys, compreende uma cadeia lateral lisina acetilada. A deacetilação do substrato sensibiliza o substrato de modo que, na segunda etapa, tratamento com o fomentador de Fluor de Lys produz um fluoróforo.
[00214] Extratos nucleares HeLa (fornecedor: Biomol) foram incubados a 60 ng/ml com 75 |iM de substrato. O substrato de Fluor de Lys foi adicionado em um tampão contendo 25 mM de Tris, 137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI e 1 mM de MgCh. 6H2O em pH 7,4. Depois de 30 min, foi adicionado 1 volume do fomentador. O fluoróforo foi excitado com 355 nm de luz e a luz emitida (450 nm) foi detectada sobre uma leitora de lâminas fluorométrica.
[00215] Para cada experimento, controles (contendo extrato nuclear HeLa e tampão), uma incubação em branco (contendo tampão mas não extrato nuclear HeLa) e amostras (contendo composto dissolvido em DMSO e adicionalmente diluído em tampão e extrato nuclear HeLa) foram realizados em paralelo. Em primeiro lugar, os compostos foram testados em uma concentração de 10'5M. Quando os compostos apresentaram atividade a 10’5M, foi feita uma curva concentração- resposta em que os compostos foram testados em concentrações entre 10-5M e 10-9M. Toda as amostras foram testadas 4 vezes. Em cada teste 0 valor em branco foi substraído tanto dos valores controle quanto dos valores das amostras. A amostra controle representou 100% de deacetilação de substrato. Para cada amostra a fluorescência foi expressada como uma percentagem do valoir médio dos controles. Quando apropriado valores de IC50 (concentração do fármaco, necessária para reduzir a quantidade de metabolitos para 50% do controle) foram computados usando análise de próbite para dados graduados. Neste relatório os efeitos dos compostos de teste são expressados como pICso (0 valor do log negativo do valor de IC50) (veja a Tabela F-3).
[00216] Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO e foram feitas diluições adicionais em meio de cultura. As concentrações de DMSO finais nunca excederam 0,1 % (v/v) nos testes de proliferação celular. Os controles continham células A2780 e DMSO sem composto e as em branco continham DMSO mas não células. MTT foi dissolvido a 5 mg/ml em PBS. Um tampão de glicina consistiu de 0,1 M de glicina e 0,1 M de NaCI tamponada para pH 10,5 com NaOH (1 N) foi preparado (todos os reagentes foram da Merck).
[00217] As células de carcinoma ovariano A2780 humano (uma gentil doação do Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, EUA]) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 50 pg/ml de gentamicina e 10 % de soro de feto de vitelo. As células foram mantidas rotineiramente como culturas de monocamada a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5 % umidificada. As células foram passadas uma vez por semana usando uma solução de tripsina/EDTA em uma proporção de divisão de 1:40. Todos os meios e suplementos foram obtidos da Life Technologies. As células estavam livres de contaminação por micoplasma conforme determinado usando 0 kit de Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture (fornecedor: BioMérieux).
[00218] As células foram semeadas em lâminas de cultura de 96 cavidades NUNC® (Fornecedor: Life Technologies) e foram deixadas para aderir ao plástico de um dia para 0 outro. As densidades usadas para laminação foram 1500 células por cavidade em um volume total de 200 pl de meio. Depois de adesão celular às lâminas, 0 meio foi trocado e foram adicionados fármacos e/ou solventes para um volume final de 200 pl. Depois de quatro dias de incubação, 0 meio foi substituído por 200 pl de meio fresco e foi avaliada a densidade e a viabilidade celulares usando um teste à base de MTT. A cada cavidade, 25 pl de solução MTT foi adicionado e as células foram adicionalmente incubadas por 2 horas a 37°C. O meio foi em seguida cuidadosamente aspirado e o produto de MTT-formazano azul foi solubilizado por meio da adição de 25 pl de tampão de glicina seguido por 100 pl de DMSO. As lâminas de microteste foram agitadas por 10 min sobre uma shaker de microlâminas e a absorvência a 540 nm foi medida usando um espectrofotômetro de 96 cavidades Emax (Fornecedor: Sopachem).
[00219] Dentro de um experimento, os resultados para cada condição experimental são a média de 3 cavidades em replicata. Para fins de triagem inicial , os compostos foram testados em uma única concentração fixa de 10-6 M. Para compostos ativos, os experimentos foram repetidos para estabelecer curvas cheias concentração- resposta. Para cada experimento, controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo células ou fármacos) foram realizados em paralelo. O valor em branco foi subtraído de todos os valores de controle e amostra. Para cada amostra, o valor médio para crescimento celular (em unidades de absorvência) foi expressado como uma percentagem do valor médio para crescimento celular do controle. Quando apropriado, os valores da ICso (concentração do fármaco, necessária para reduzir o crescimento celular para 50% do controle) foram computados usando análise de próbite para dados graduados (Finney, D.J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Neste relatório os efeitos dos compostos de teste são expressados como pICõo (o valor do log negativo do valor da ICso) (veja a Tabela F-3).
[00220] Na primeira etapa de diluição, 10 |il de uma solução básica concentrada do composto ativo, solubilizada em DMSO (5 mM), foi adicionada a 100 pJ de tampão de citrato de fosfato pH 7,4 e misturada. Na segunda etapa de diluição, uma alíquota (20 pl) da primeira etapa de diluição foi adicionalmente dispensada em 100 |il de tampão de citrato de fosfato pH 7,4 e misturada. Finalmente, na terceira etapa de diluição, uma amostra (20 |il) da segunda etapa de diluição foi adicionalmente diluída em 100 |il de tampão de citrato de fosfato pH 7,4 e misturada. Todas as diluições foram realizadas em lâmina de 96 cavidadess. Imediatamente depois da última etapa de diluição a turvação das três etapas de diluição consecutivas foram medidas com um nefelômetro. Foi feita diluição em triplicata para cada composto para excluir erros ocasionais. Com base nas medições da turvação é realizada uma classificação em 3 classes. Compostos com alta solubilidade obtiveram um escore de 3 e para estes compostos a primeira diluição é clara. Compostos com solubilidade média obtiveram um escore de 2. Para estes compostos a primeira diluição não é clara e a segunda diluição é clara. Compostos com baixa solubilidade obtiveram um escore de 1 e para estes compostos tanto a primeira quanto a segunda diluição não são claras (veja a Tabela F-3).
[00221] A solubilidade de um composto, em diferentes pH's, também pode ser medida com a aplicação de um detector de nitrogênio quimiluminescente (veja a Tabela F-3).
[00222] As amostras básicas (alíquotas de 10 p.l de uma solução básica de 5 mM em 100 % de DMSO) foram diluídas em uma lâmina de cavidade profunda ou Pre-mix contendo 2 ml de um sistema tampão aquoso pH 4 ou pH 7,4 (PSR4 System Solution Concentrate (pION)).
[00223] Antes das amostras serem adicionadas à lâmina de referência, 150 jil de tampão foi adicionado às cavidades e foi realizada uma medição UV em branco. Depois disso o tampão foi descartado e a lâmina foi usada como lâmina de referência. Todas as medições foram feitas em lâminas resistentes a UV (fornecedor: Costar ou Greiner).
[00224] Depois da medição em branco da lâmina de referência, 150 Lil das amostras diluídas foi adicionado à lâmina de referência e 200 pl das amostras diluídas foi adicionado à lâmina doadora 1. Uma lâmina de filtro aceitadora 1 (fornecedor: Millipore, type:MAIP N45) foi revestida com 4 |il da solução formadora de membrana artificial (1,2- Dioleoil-sn-Glicer-3-Fosfocolina em Dodecano contendo 0,1% de 2,6- Di-terc-butil-4-metilfenol e colocada sobre a parte superior da lâmina doadora 1 para formar um "sanduíche". Foi dispensado tampão (200 Lil) dentro das cavidades aceitadoras na parte superior. O sanduíche foi coberto com uma tampa e armazenado por 18h em temperatura ambiente no escuro.
[00225] Uma medição em branco da lâmina aceitadora 2 foi realizada através da adição de 150 |il de tampão às cavidades, seguida por uma medição UV. Depois da medição em branco da lâmina aceitadora 2 o tampão foi descartado e 150 de solução aceitadora foi transferida da lâmina de filtro aceitadora 1 para a lâmina aceitadora 2. Em seguida a lâmina de filtro aceitadora 1 foi removida do sanduíche. Depois da medição em branco da lâmina doadora 2 (veja acima), 150 |il da solução doadora foi transferido da lâmina doadora 1 para a lâmina doadora 2. Os espectros UV das cavidades da lâmina doadora 2, da lâmina aceitadora 2 e da lâmina de referência foram escaneados (com um SpectraMAX 190). Todos os espectros foram processados para calcular a permeabilidade com o programa PSR4p Command Software. Todos os compostos foram medidos em triplo. Carbamazepina, griseofulvina, acicloguanisina, atenolol, furosemida, e clorotiazida foram usados como padrões em cada experimento. Os compostos foram classificados em 3 categorias como tendo uma baixa permeabilidade (efeito médio < 0,5 x 10-6 cm/s; escore 1), uma permeabilidade média (1 x 10-6 cm/s > efeito médio > 0,5 x 10'6 cm/s; escore 2) ou uma alta permeabilidade (> 1 x 10-6 cm/s; escore 3).
[00226] Preparações de tecido subcelular foram feitas de acordo com Gorrod et al. (Xenobiotica 5: 453-462, 1975) por separação centrífuga depois de homogeneização mecânica de tecido.
[00227] Tecido hepático foi enxaguado em tampão Tris-HCI a 0,1 M gelado (pH 7,4) para lavar o excesso de sangue. Em seguida o tecido foi seco manchado "blotted",pesado e cortado grosseiramente usando tesouras cirúrgicas. Os pedaços de tecido foram homogeneizados em 3 volumes de tampão de fosfato a 0,1 M gelado (pH 7,4) usando ou um Potter-S (Braun, Itália) equipado com um almofariz Teflon ou um homogeneizador Sorvall Omni-Mix, por 7 x 10 seg. Em ambos os casos, o recipiente foi mantido em/sobre gelo durante o processo de homogenização.
[00228] Os homogenados de tecido foram centrifugados a 9000 x g por 20 minutos a 4 °C usando uma centrífuga Sorvall ou Ultracentrífuga Beckman. O sobrenadante resultante foi armazenado a -80 °C e é designado 'S9'.
[00229] A fração S9 pode ser adicionalmente centrifugada a 100.000 x g por 60 minutos (4 °C) usando uma ultracentrífuga Beckman. O sobrenadante resultante foi cuidadosamente aspirado, dividido em alíquotas e designado 'citosol'. O pélete foi ressuspendido em tampão de fosfato a 0,1 M (pH 7.4) em um final volume de 1 ml por 0,5 g de peso de tecido original e designado 'microssomos'.
[00230] Todas as frações subcelulares foram divididas em alíquotas, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C até o uso.
[00231] Para as amostras a serem testadas, a mistura de incubação continha PBS (0,1 M), composto (5 piM), microssomas (1 mg/ml) e um sistema gerador de NADPH (0,8 mM de glicose-6-fosfato, 0,8 mM de cloreto de magnésio e 0,8 Unidads de glicose-6-fosfato desidrogenase). Amostras controle continham o mesmo material mas os microssomas foram substituídos por microssomas inativados por calor (10 min a 95 graus Celsius) . A recuperação dos compostos nas amostras controle foi sempre de 100%.
[00232] As misturas foram pré-incubadas por 5 min a 37 graus Celsius. A reação foi iniciada no ponto de tempo zero (t = 0) por adição de 0,8 mM de NADP e as amostras foram incubadas por 15 min (t = 15). A reação foi terminada pela adição de 2 volumes de DMSO. Em seguida as amostras foram centrifugadas por 10 min a 900 x g e os sobrenadantes foram armazenado em temperatura ambiente por não mais de 24 h antes da análise. Todas as incubações foram realizadas em duplo. A análise dos sobrenadantes foi realizada com análise LCMS. Eluição das amostras foi realizada em um Xterra MS C18 (50 x 4,6 mm, 5 |j.m, Waters, US). Foi usado um sistema de HPLC Alliance 2790 (Fornecedor: Waters, EUA). Elution foi com tampão A (25 mM de acetato de amónio (pH 5,2) em FhO/acetonitrila (95/5)), o solvente B sendo acetonitrila e o solvente C metanol em um índice de fluxo de 2,4 ml/min. O gradiente empregado foi aumentando a concentração da fase orgânica de 0 % sobre 50 % de B e 50 % de C em 5 min até 100 % de B em 1 min em um modo linear e a concentração da fase orgânica foi mantida estacionária por um adicional de 1,5 min. O volume de injeção total das amostras foi de 25 |il.
[00233] Um espectrômetro de massa triplo quádruplo Quattro (fornecedor: Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado com fonte de e ESI foi usado como detector. A fonte e a temperatura de dessolvação foram ajustadas em 120 e 350 °C respectivamente e foi usado nitrogênio como nebulizador e gás de secagem. Os dados foram adquiridos em modo de varredura positiva (reação iônica única). A voltagem do cone foi ajustada a 10 V e o tempo de retardo foi de 1 seg.
[00234] A estabilidade metabólica foi expressada como % de metabolismo do composto depois de 15 min de incubação na presença de microssomas ativos (E(act))
[00235] Compostos que tinham uma percentagem de metabolismo menor do que 20 % foram definidos como altamente metabólico estáveis. Os compostos que tinham um metabolismo entre 20 e 70 % foram definidos como intermediariamente estáveis e compostos que apresentaram uma percentagem de metabolismo maior do que 70 foram definidos como baixo metabólico estáveis. Três compostos de referência foram sempre incluídos sempre que foi realizada uma triagem da estabilidade metabólica. Verapamil foi incluído como um composto com baixa estabilidade metabólica (% de metabolismo = 73 %). Cisapride foi incluído como um composto com média estabilidade metabólica (% de metabolismo 45 %) e propanol foi incluído como um composto com estabilidade metabólica intermediário a alta (25 % de metabolismo). Estes compostos de referência foram usados para validar o teste da estabilidade metabólica.
[00236] Hepatócitos de rato foram isolados de ratos machos Sprague Dowley. Os compostos foram dissolvidos para uma solução básica a 5 mM em 100% de DMSO e incubados em uma concentração final de 5 pM por 0, 15, 30, 60 e 120 min com culturas celular de hepatócitos de rato (0,5 milhão de células viáveis/ 0,5 ml) usando lâminas de 24 cavidades.
[00237] Foram preparadas amostras para LC-MS por adição de dois volumes de DMSO. As amostras foram completamente sacudidas e em seguida centrifugadas a 900 g por 10 min (temperatura ambiente). Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Do sobrenadante resultante 50 pl foi analisado por LC-MS.
[00238] Para LC-MS, foi realizada eluição das amostras sobre uma coluna Hypersil BDS C18 (50 x 4,6 mm, 5 pm, Thermohypersil, Reino Unido). O sistema de HPLC compreendeu um sistema de liberação Surveyor (Surveyor Inc., San Jose, EUA) equipado com um dispositivo autossampler Surveyor. Eluição foi com tampão A (10 mM de acetato de amónio (pH 6,9) em FhO/Acetonitrila (95:5)) e solvente B (acetonitrila) em um índice de fluxo de 1,2 ml/min. O gradiente empregado foi 0,5 min solvente A como condição de partida seguido por aumento da concentração da fase orgânica de 0 % de B até 95% de B durante 2 min em um modo linear. Esta fase foi mantida estacionária por um adicional de 2 min e reduzida de novo para 0% de B dentro de 0,5 min.
[00239] O volume de injeção total das amostras foi de 50 pL. A temperatura do forno da coluna foi mantida a 40 °C. O fluxo de LC foi dividido para detecção de MS e 0,1 ml deixado dentro da fonte.
[00240] Foi usado um espectrômetro de massa triplo quádruplo TSQ Quantum (Thermofinnigan, LaJolla, EUA) equipado com uma fonte de ESI para detecção. A voltagem da fonte foi ajustada a 3800 volt, a temperatura do capilar a 300°C. O espectrômetro de massa foi operado em modo iônico positivo em SIM ajustado para a massa de M+H com uma largura da varredura de 1 Da para fins de quantificação. Foram realizadas controle dos instrumentos, aquisição de dados e processamento usando o software Xcalibur (ThermoFinnigan, San Jose, CA, EUA). A estabilidade metabólica dos compostos nos hepatócitos de rato foi expressada como meias-vidas in vitro.
[00241] Como referência, foi usado o composto R306465 (Pedido de patente internacional No. WO 03/76422) (meia vida in vitro\ 8 min). O composto 4 do presente pedido foi testado e teve uma meia vida in vitro de 23 min.
[00242] O protocolo seguinte foi aplicado para determinar o nível de expressão de proteína p21 em células de carcinoma ovariano A2780 humano. As células A2780 (20000 células/180 pil) foram semeadas em lâminas de 96 microcavidades em meio RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 50 pg/ml de gentamicina e 10 % de soro de feto de vitelo. 24 horas antes da lise das células, os compostos foram adicionados em concentrações finais de 10-5, 10-6, 10’7 e 10-8 M. Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO e foram feitas diluições adicionais em meio de cultura. 24 horas depois da adição do composto, os sobrenadantes foram removidos das células. As células foram lavadas com 200 p.l de PBS gelado. As cavidades foram aspiradas e 30 p.l de tampão de lise (50 mM de Tris.HCI (pH 7,6), 150 mM de NaCI, 1 % de Nonidet p40 e 10 % de glicerol) foi adicionado. As lâminas foram incubadas de um dia para o outro a -70 °C.
[00243] O número apropriado de cavidades de microtítulo foi removido da bolsa de folha e colocado dentro de um suporte de cavidade vazias. Foi preparada uma solução da elaboração (1x) do tampão de lavagem (Wash Buffer, 20x concentrado de lavagem de lâmina: 100 ml de 20 vezes solução concentrada de PBS e tensoativo. Contém 2 % de cloroacetamida). O padrão p21WAF liofilizado foi reconstituído com H2O destilada e adicionalmente diluído com diluente da amostra (proporcionado no kit)
[00244] As amostras foram preparadas diluindo as mesmas a 1:4 em diluente da amostra. As amostras (100 ^1) e os padrões p21WAF1 (100 nl) foram pipetados para dentro das cavidades apropriadas e incubados em temperatura ambiente por 2 horas. As cavidades foram lavadas 3 vezes com 1x tampão de lavagem e em seguida 100 p.l de reagente de anticorpo detector (uma solução de anticorpo monoclonal biotinilado p21WAF1) foi pipetado para dentro de cada cavidade. As cavidades foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora e em seguida lavadas três vezes com 1x tampão de lavagem. O conjugado 400x (conjugado de peroxidase estreptavidina : solução concentrada 400 vezes) foi diluído e 100 p.l de 1x a solução foi adicionado à cavidades. As cavidades foram incubadas em temperatura ambiente por 30 min e em seguida lavadas 3 vezes com 1x tampão de lavagem e 1 vez com H2O destilada. Solução de substrato (substrato cromogênico) (100 |il) foi adicionado às cavidades e as cavidades foram incubadas por 30 minutos no escuro em temperatura ambiente. Solução de tamponamento foi adicionada a cada cavidade na mesma ordem que a solução de substrato previamente adicionada. A absorvência em cada cavidade foi medida usando uma leitora de lâmina espectrofotométrica em comprimentos de onda duplos de 450/595 nm.
[00245] Para cada experimento, controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo células ou fármacos) foram realizados em paralelo. O valor em branco foi subtraído de todos os valores dos controlee e das amostras. Para cada amostra, 0 valor para indução de p21WAF1 (em unidades de absorvência) foi expressado como a percentagem do valor para p21WAF1 presente no controle. Percentagem de indução maior do que 130 % foi definida como indução importante.
[00246] Foram testados quatro compostos e todos apresentaram indução importante.
[00247] Células A2780 (ATCC) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina e gentamicina a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Todas as soluções de cultura celular são proporcionadas pela Gibco- BRL (Gaithersburg, MD). Outros materiais são proporcionados pela Nunc.
[00248] DNA genômico foi extraído de células A2780 proliferativas e usado como modelo para isolamento por PCR aninhado do promotor p21. A primeira amplificação foi realizada por 20 ciclos em uma temperatura de recozimento de 55°C usando 0 par de oligonucleotídeos GAGGGCGCGGTGCTTGG e TGCCGCCGCTCTCTCACC com 0 DNA genômico como modelo. O fragmento de 4,5 kb resultante contendo o fragmento de -4551 a +88 relativo ao box TATA foi reamplificado com os oligonucleotídeos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG e ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC por 20 ciclos com recozimento a 88°C resultando em um fragmento de 4,5 kb e subseqüentemente com 0 par de oligonucleotídeos TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC e ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC por 20 ciclos com recozimento a 88°C resultando em um fragmento de 1,3 kb contendo 0 fragmento de -1300 a +88 relativo ao box TATA. Os sítios de restrição Xhol e Kpnl presentes nos oligonucleotídeos (seqüência sublinhada) foram usados para subclonagem.
[00249] A luciferase repórter foi removido do pGL3-básico e substituída pelo ZsGreen repórter (do plasmídeo pZsGreen1-N1) nos sítios de restrição Kpnl e Xbal. pGL3-basic-ZsGreen-1300 foi construído através de inserção do fragmento de 1,3 kb mencionado acima da região p21 promotora humana em pGL3-basic-ZsGreen nos sítios Xhol e Kpnl. Todas as enzimas de restrição são proporcionadas pela Boehringer Manheim (Alemanha).
[00250] Células A2780 foram laminadas em uma lâmina de 6 cavidades em uma densidade de 2x105 células, incubadas por 24 horas, e transfectadas com 2 ug de pGL3-basic-ZsGreen-1300 e 0,2 ug de vetor pSV2neo usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Brussels, Bélgica) conforme descrito pelo fabricante. As células transfectadas foram selecionadas por 10 dias com G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) e suspensões celulares únicas foram cultivadas. Depois de três semanas, foram obtidos clones únicos.
[00251] Os clones selecionados A2780 foram expandidos e semeados a 10000 células por cavidade em lâminas de 96 cavidades. 24 horas depois da semeadura, as células foram tratadas por um adicional de 24 horas com compostos (afetando sítios sp1 na região p21 promotora proximal). Em seguida, as células foram fixadas com 4% de PFA por 30' e contracoradas com corante Hoechst. A ativação do promotor p21 levando a produção de ZsGreen e deste modo a fluorescência, foi monitorada pelo Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussels, Bélgica).
[00252] Para cada experimento, controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo células ou fármacos) foram realizados em paralelo. O valor em branco foi subtraído de todos os valores de controle e das amostras. Para cada amostra, o valor para indução de p21 foi expressado como a percentagem do valor para p21 presente no controle. Percentagem de indução maior do que 130 % foi definida como indução importante.
[00253] Vinte e seis compostos foram testados e apresentaram indução importante.
[00254] Um clone selecionado foi injetado por via subcutânea (107 células/200 pl) no flanco de camundongos nude e urn tumor mensurável por calibrador foi obtido depois de 12 dias. A partir do dia 12 em diante, os animais foram dosados, por via oral ou por via intravenal, diariamente durante 6 dias com solvente e 20-40 mpk de composto (4-10 animais cada). Os tumores foram avaliados por fluorescência pelo sistema de estudo por imagens do corpo inteiro automatizado desenvolvido in-house (Automated Whole Body Imaging System)(Estereomicroscópio fluorescente tipo Olympus® SZX12 equipado com um filtro GFP e acoplado a uma câmera CCD tipo JAI® CV-M90 controlada por uma pacote de software à base do IMAQ Vision Software da National Instruments®). Como referência, foi usado o composto R306465 (Pedido de patente internacional No. WO 03/76422) . Os compostos foram classificados como inativos (sem fluorescência mensurável), mais fracos, idênticos ou melhores do que R306465. O composto 1 foi testado e foi melhor do que R306465 depois de administração oral.
[00255] Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO (5 mM) e uma diluição adicional a 5 10-4 M foi feita em acetonitrila. Foram feitas diluições adicionais no tampão de teste (0,1M de tampão de fosfato de NaK pH 7,4) e a concentração de solvente final nunca foi maior do que 2 %.
[00256] O teste para a proteína CYP3A4 compreende por cavidade 15 pmoles de P450/mg de proteína (em 0,01 M de tampão de fosfato de NaK + 1,15% de KCI), um sistema gerador de NADPH (3,3 mM de Glicose-6-fosfato, 0,4 U/ml de Glicose-6-fosfato desidrogenase, 1,3 mM de NADP e 3,3 mM de MgCh.δFhO em tampão de teste) e composto em um volume de teste total de 100 pl. Depois de uma pré- incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada com a adição de 150 pM do substrato de sonda fluorescente BFC em tampão de teste. Depois de uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente a reação foi terminada depois da adição de 2 volumes de acetonitrila. Determinações fluorescentes foram realizadas em um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. Cetoconazol (valor da ICso = 3 X 10'8M) foi incluído como composto de referência neste experimento.
[00257] O teste para a proteína CYP2D6 compreende por cavidade 6 pmoles de P450/mg de proteína (em 0,01 M de tampão de fosfato de NaK + 1,15% de KCI), um sistema gerador de NADPH (0,41 mM de Glicose-6-fosfato, 0,4 U/ml de Glicose-6-fosfato desidrogenase, 0,0082 mM de NADP e 0,41 mM de MgCfc.θFW em tampão de teste) e composto em um volume de teste total de 100 pl. Depois de uma pré- incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada com a adição de 3 pM do substrato de sonda fluorescente AMMC em tampão de teste. Depois de uma incubação de 45 minutos em temperatura ambiente a reação foi terminada depois da adição de 2 volumes de acetonitrila. Determinações fluorescentes foram realizadas em um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Quinidina (valores da ICso < 5 X 10-8 M) foi incluída como composto de referência neste experimento.
[00258] O teste para a proteína CYP2C9 compreende por cavidade 15 pmoles de P450/mg de proteína (em 0,01 M de tampão de fosfato de NaK + 1,15% KCI), um sistema gerador de NADPH (3,3 mM de Glicose-6-fosfato, 0,4 U/ml de Glicose-6-fosfato desidrogenase, 1,3 mM de NADP e 3,3 mM de MgCl2.6H2O em tampão de teste) e composto em um volume de teste total de 100 pl. Depois de uma pré- incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada com a adição de 200 pM do substrato de sonda fluorescente MFC em tampão de teste. Depois de uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente a reação foi terminada depois da adição de 2 volumes de acetonitrila. Determinações fluorescentes foram realizadas em um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. Sulfafenazol (valor da ICso = 6,8 X 10-7 M) foi incluído como composto de referência neste experimento.
[00259] Para fins de triagem inicial, os compostos foram testados em uma única concentração fixa de 1 X 10-5 M. Para compostos ativos, os experimentos foram repetidos para estabelecer curvas cheias concentração-resposta. Para cada experimento, controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo enzima ou fármacos) foram realizados em paralelo. Todos os compostos foram analisados em quadruplicata. O valor em branco foi subtraído de todos os valores de controle e amostras. Para cada amostra, o valor médio de atividade de P450 da amostra (em unidades de fluorescência relativa) foi expressado como uma percentagem do valor médio da atividade de P450 do controle. A percentagem de inibição foi expressada como 100% menos o valor médio da atividade de P450 da amostra. Quando apropriado, foram calculados os valores da ICso (concentração do fármaco, necessária para reduzir a atividade de P450 para 50% do controle).Tabela F-3: lista os resultados dos compostos que foram testados de acordo com o exemplo C.1, C.2, C.3.a. e C.3.b
[00260] Uma mistura de 100 g de um composto de fórmula (I), 570 g de lactose e 200 g de amido é bem misturada e depois disso umidificada com uma solução de 5 g de dodecil sulfato de sódio e 10 g de polivinil-pirrolidona em cerca de 200 ml de água. A mistura de pós a úmido é peneirada, seca e novamente peneirada. Em seguida é adicionado 100 g de celulose microcristalina e 15 g de óleo vegetal hidrogenado. O todo é bem misturado e prensado em comprimidos, dando 10.000 comprimidos, cada um compreendendo 10 mg de um composto de fórmula (I).
[00261] A uma solução de 10 g de metil celulose em 75 ml de etanol desnaturado é adicionada uma solução de 5 g de etil celulose em 150 ml de diclorometano. Em seguida são adicionados 75 ml de diclorometano e 2,5 ml de 1,2,3-propanotriol. 10 g de polietileno glicol é fundido e dissolvido em 75 ml de diclorometano. A última solução é adicionada à precedente e em seguida são adicionados 2,5 g de de octadecanoato de magnésio, 5 g de polivinil-pirrolidona e 30 ml de suspensão colorida concentrada e o todo é homogeneizado. Os núcleos dos comprimidos são revestidos com a mistura obtida deste modo em um equipamento de revestimento.
Claims (12)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (I),
as formas N-óxido, os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereo-quimicamente isoméricas dos mesmos, em que cada X é de modo independente N ou CH; R1 é fenila, naftalenila ou heterociclila; em que cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, polihaloCi-6 alquila, arila, hidróxi, ciano, amina, C1-6 alquilcarbonilamino, C1-6 alquilsulfonilamino, hidroxicarbonila, C1-6 alquiloxicarbonila, hidróxiCi- ealquila, Ci-e alquiloximetila, aminometila, C1-6 alquilaminometila, C1-6 alquilcarbonilamino-metila, C1-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, Ci-ealquilaminossulfonila ou heterociclila; R2 é hidrogênio, -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou - CH2-NR7R8; em que cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-e alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, piperazinila, /V-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ou triazolila; cada R6 é selecionado de modo independente entre hidróxi, C1-6 alquilóxi, amino ou mono- ou di(Ci-6 alquil)amino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, piperazinila, mono- ou di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino, /V-metilpiperazinila, morfolinila ou tiomorfolinila; cada R7 e R8 são de modo independente selecionados entre hidrogênio, C1-6 alquila, Ci-6alquilcarbonila, C1-6 alquilsulfonila, ou mono- ou di(Ci-4 alquilaminossulfonila; R3 é hidrogênio, hidroximetila, aminometila ou mono- ou d i(Ci-6 alquilaminometila; R4 é hidrogênio ou Ci-ealquila; arila no acima é fenila ou naftalenila; em que cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, trifluorometila, ciano ou hidroxicarbonila; e heterociclila no acima é furanila, tienila, pirrolila, pirrolinila, pirolidinila, dioxolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, isoxazolila, isotiazolila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, piranila, piridinila, piperidinila, dioxanila, morfolinila, ditianila, tiomorfolinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, piperazinila, triazinila, tritianila, indolizinila, indolila, indolinila, benzofuranila, benzotiofenila, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, purinila, quinolizinila, quinolinila, cinolinila, ftlazinila, quinazolinila, quinoxalinila ou naftiridinila; em que cada um dos referidos heterociclos são opcionalmente substituídos com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, ciano, amina, mono-or d i(C 1-4 alquil)amina.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada X é N; R1 é fenila ou fenila opcionalmente substituída com halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, polihaloCi-ealquila ou arila; R2 é -CH2-R5 ou -C(=O)-R6; cada R5é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-6 alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, A/-metilpiperazinila, morfolinila ou imidazolila; cada R6 é selecionado de modo independente entre C1-6 alquilamino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino ou morfolinila; R3 é hidrogênio e R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que cada X é N; R1 é fenila ou fenila substituída com halo; R2 é -CH2-R5; cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, C1-6 alquilóxi, ou C1-6 alquilcarbonilóxi; R3 é hidrogênio; e R4 é hidrogênio.
4. Composto de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que 0 referido composto é o composto No.1, 0 composto No.8, 0 composto No.11, 0 composto No.9, 0 composto No.33, 0 composto No.34,o composto No.7 ou 0 composto No. 25.
.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende veículos farmaceuticamente aceitáveis e como um ingrediente ativo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como definido nas reivindicações 1 a 4.
6. Processo para preparar uma composição farmacêutica como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os veículos farmaceuticamente aceitáveis e um composto como definido nas reivindicações 1 a 4, são intimamente misturados.
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para aplicação como um medicamento.
8. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças proliferativas.
9. Combinação, caracterizada pelo fato de compreender um agente anticancerígeno e um inibidor de HDAC como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
10. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pela reação de um intermediário de fórmula (II) com um apropriado ácido produzindo um ácido hidroxâmico de fórmula (I),
11. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (V),
as formas N-óxido, os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereo-quimicamente isoméricas dos mesmos, em que cada X é de modo independente N ou CH; R1 é fenila, naftalenila ou heterociclila; em que cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, Ci-6 alquila, Ci-6 alquilóxi, polihaloCi-6 alquila, arila, hidróxi, ciano, amina, Ci-6 alquilcarbonilamino, Ci-6 alquilsulfonilamino, hidroxicarbonila, Ci-6 alquiloxicarbonila, hidróxiCi-e alquila, Ci-6 alquiloximetila, aminometila, Ci-6 alquilaminometila, Ci-6 alquilcarbonilamino-metila, Ci-6 alquilsulfonilaminometila, aminossulfonila, Ci-6 alquilaminossulfonila ou heterociclila; R2 é hidrogênio, -CH2-R5, trifluorometila, -C(=O)-R6, ou - CH2-NR7R8; em que cada R5 é selecionado de modo independente entre hidrogênio, hidróxi, Ci-ealquilóxi, C1-6 alquilóxiCi-e alquilóxi, C1-6 alquilcarbonilóxi, piperazinila, A/-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ou triazolila; cada R6 é selecionado de modo independente entre hidróxi, Ci-6 alquilóxi, amina ou mono- ou di(Ci-6 alquil)amino, C1-6 cicloalquilamino, hidróxiCi-e alquilamino, piperazinila, mono- ou di(Ci-e alquil)aminoCi-6 alquilamino, /V-metilpiperazinila, morfolinila ou tiomorfolinila; cada R7 e R8são de modo independente selecionados entre hidrogênio, C1-6 alquila, Ci-ealquilcarbonila, C1-6 alquilsulfonila, ou mono- ou di(Ci-4alquil)aminossulfonila; R3 é hidrogênio, hidroximetila, aminometila ou mono- ou d i(Ci-6 alquil)aminometila; R4 é hidrogênio ou C1-6 alquila; arila no acima é fenila ou naftalenila; em que cada uma da referida fenila ou naftalenila é opcionalmente substituída com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, trifluorometila, ciano ou hidroxicarbonila; e heterociclila no acima é furanila, tienila, pirrolila, pirrolinila, pirolidinila, dioxolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, isoxazolila, isotiazolila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, piranila, piridinila, piperidinila, dioxanila, morfolinila, ditianila, tiomorfolinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, piperazinila, triazinila, tritianila, indolizinila, indolila, indolinila, benzofuranila, benzotiofenila, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, purinila, quinolizinila, quinolinila, cinolinila, ftlazinila, quinazolinila, quinaxolinila ou naftiridinila; em que cada um do referido heterociclos é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes cada um selecionado de modo independente entre halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, ciano, amina, ou mono- ou di(Ci-4alquil)amina.
12. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a) converter compostos de fórmula (V), em que R2 é - CH2OH, e R4 é hidrogênio, referidos neste relatório como compostos de fórmula (V-a), em compostos de fórmula (V), em que R2 é diferente de -CH2OH, referidos neste relatório como compostos de fórmula (V- b), através de reações conhecidas na técnica ou transformações de grupos funcionais, e
b) preparar os compostos de fórmula (V-a) em uma única etapa reagindo 0 intermediário de fórmula (VI), com 1,4-dioxano-2,5- diol e 0 ácido borônico apropriado de fórmula (VII), em que R1 é conforme definido acima ou 
c) preparar os compostos de fórmula (V-b) reagindo 0 intermediário de fórmula (VI), com a cetona apropriada de fórmula (VIII), em que R1 e R2 são conforme definido acima.
d) preparar os compostos de fórmula (V), em que R2 é - COOH referidos neste relatório como compostos de fórmula (V-c), em uma única etapa reagindo o intermediário de fórmula (VI), com ácido 2-oxo- propanóico e o ácido borônico apropriado de fórmula (VII), em que R1 é conforme definido acima, em um solvente adequado e conversão adicional em intermediários de fórmula (V) em que R2 é - C(=O)-R6, através de reações conhecidas na técnica ou transformações de grupos funcionais.
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