MX2007001119A - Derivados sustituidos de propenil piperazina como nuevos inhibidores de histona desacetilasa. - Google Patents

Derivados sustituidos de propenil piperazina como nuevos inhibidores de histona desacetilasa.

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MX2007001119A
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Sven Franciscus Anna Va Brandt
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Laurence Fra Marconnet-Decrane
Janine Arts
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Abstract

La presente invencion comprende los nuevos compuestos de formula (I) (ver formula (I)) en la cual R1, R2, R3, R4 y X tienen significados definidos, que poseen actividad inhibitoria de la enzima histona desacetilasa; su preparacion, composiciones que los contienen y su uso como medicamento.

Description

DERIVADOS SUSTITUIDOS DE PROPENIL PIPERAZINA COMO NUEVOS INHIBIDORES DE HISTONA DESACETILASA MEMORIA DESCRIPTIVA Esta invención trata de compuestos que tienen actividad inhibitoria de la enzima histona desacetilasa (HDAC). También se refiere a procedimientos para su preparación, a composiciones que las comprenden, como así también a su uso, in vitro e in vivo, para inhibir HDAC y como medicamento, por ejemplo como medicamento para inhibir enfermedades proliferatívas, tales como cáncer y psoriasis. Las histonas nucleares se conocen como componentes dinámicos e integrales de la maquinaria responsable de la regulación de la transcripción genética y otros procedimientos ADN templados tales como replicación, reparación, recombinación, y segregación cromosómica. Estas son la materia de las modificaciones postranslacionales que incluyen la acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinación y ribosilación del ADP. La(s) histona desacetilasa(s), denominadas en la presente memoria "HDAC", son enzimas que catalizan la eliminación de la modificación acetilo de los residuos de lisina de las proteínas, incluyendo las histonas nucleosómicas del núcleo H2A, H2B, H3 y H4. En conjunto con la(s) histona acetiltransferasa(s), denominadas en la presente memoria "HAT", las HDAC regulan el nivel de acetilación de las histonas. El equilibrio de acetilación de las histonas nucleosomales cumple un papel importante en la transcripción de varios genes. La hipoacetilación se asocia con la estructura de cromatina condensada, que produce la represión de la transcripción genética, mientras que las histonas acetiladas se asocian con una estructura de cromatina más abierta y con la activación de la transcripción. Se han descrito once HDAC estructuralmente relacionadas que se dividen en dos clases. Las HDAC clase I consisten en HDAC 1 , 2, 3, 8 y 11 mientras que las HDAC clase II consisten en HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Los miembros de la tercera clase de HDAC no están relacionados estructuralmente con las HDAC de clase I y II. Las HDAC clase l/ll actúan por mecanismos zinc-dependientes, mientras que las HDAC clase lll son NAD-dependientes. Además de las histonas, otras proteínas han sido también sustratos para la acetilación, en particular factores de transcripción tales como p53, GATA-1 y E2F; receptores nucleares tales como receptores glucocorticoideos, receptores tiroideos, receptores estrogénicos, y proteínas reguladoras de los ciclos celulares tales como pRb. La acetilación de proteínas ha sido relacionada con la estabilización proteica, como la estabilización de p53, reclutamiento de cofactores y aumento de la unión al ADN. p53 es una proteína de supresión tumoral que puede inducir la detención del ciclo celular o la apoptosis en respuesta a una variedad de señales de estrés, tal como el daño del ADN. El principal objetivo para que p53 induzca la detención del ciclo celular parece ser el gen 21. Después de su activación por p53, p21 ha sido identificado debido a su asociación con complejos ciclina/quinasa dependiente de ciclina que producen la detención del ciclo celular en las fases G1 y G2, su regulación por aumento durante la senescencia, y su interacción con el antígeno nuclear de las células proliferantes. El estudio de los inhibidores de HDAC indica que ellos cumplen un papel importante en la detención del ciclo celular, diferenciación celular, apoptosis y la inversión de los fenotipos transformados. El inhibidor tricostatina A (TSA), por ejemplo, causa la detención celular en las fases G1 y G2, invierte los fenotipos transformados de las diferentes células de distintas líneas celulares, e induce la diferenciación de células leucémicas Friend y otras. Se ha informado que TSA (y ácido hidróxamico suberoilanilida (SAHA) inhiben el crecimiento celular, inducen la diferenciación terminal y evitan la formación de tumores en ratones (Finnin et al., Nature, 401 : 188-193, 1999). También se ha informado que la tricostatina A es útil para el tratamiento de la fibrosis, por ej. fibrosis hepática y cirrosis hepática. (Geerts et al., solicitud europea de patente EP 0 827 742, publicado el 11 Marzo de 1998). El farmacóforo para los inhibidores de HDAC consiste en un dominio de unión metálica, el cual interactúa con el sitio activo de HDAC que contiene zinc, un dominio conector, y un dominio de reconocimiento de superficie o región terminal, el cual interactúa con residuos ubicados en el borde del sitio activo. Se ha informado que los inhibidores de HDAC inducen la expresión del gen p21. La activación transcripcional del gen p21 mediante estos inhibidores está promovida por la remodelación de la cromatina, seguida por la acetilación de las histonas H3 y H4 en la región promotora de p21. Esta activación de p21 se produce de un modo independiente de p53 y de esta manera, los inhibidores de HDAC son operativos en las células con genes p53 mutados, un marcador de numerosos tumores. Además, los inhibidores de HDAC pueden tener acciones indirectas tales como el aumento de la respuesta inmune del huésped y la inhibición de la angiogénesis del tumor y en consecuencia pueden suprimir el crecimiento de los tumores primarios e impedir la metástasis. (Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309). En función de lo descrito anteriormente, los inhibidores de HDAC pueden tener gran potencial en el tratamiento de trastornos o enfermedades proliferativas, incluyendo los tumores con genes p53 mutados. La solicitud de patente EP1472216 publicada el 14 de agosto de 2003 revela hidroxamatos bicíclicos como inhibidores de la histona desacetilasa. Las solicitudes de patente EP1485099 EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, EP1485378 publicadas el 18 de septiembre de 2003, entre otras, revela ácidos piperazinilpirimidinilhidróxamico sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa además de EP1485365 que revela R306465. La solicitud de patente EP1492534 publicada el 9 de octubre de 2003, revela compuestos de ácido carbámico que comprenden una enlace de piperazina, como inhibidores de HDAC. La solicitud de patente EP1495002 publicada el 23 de octubre de 2003, revela compuestos de piperazinil fenil benzamida sustituidos, como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO04/009536 publicada el 29 de enero de 2004, revela derivados que contienen un alquilo conector entre el grupo arilo y el hidroxamato, como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente EP1525199publicada el 12 de febrero de 2004, revela (hetero)arilalquenil hidroxamatos bicíclicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO04/063146 publicada el 29 julio de 2004, revela derivados de N-hidroxi-benzamida con actividad antiinflamatoria y antitumoral. La solicitud de patente WO04/063169 publicada el 29 de Julio de 2004, revela derivados de aril hidroxamato sustituido como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO04/072047 publicada el 26 de agosto de 2004, revela Índoles, bencimidazoles y naftiimidazoles como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/082638 publicada el 30 de setiembre de 2004, revela hidroxamatos ligados a sistemas anulares heterocíclicos no aromáticos como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO04/092115 publicada el 28 Octubre de 2004, revela derivados de hidroxamato como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO05/028447 publicada el 31 de marzo de 2005, revela benzoimidazoles como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patentes WO05/030704 y WO05/030705 publicada el 7 de abril de 2005, revela benzamidas como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO05/040101 publicada el 6 de mayo de 2005, revela hidroxamatos conectados a acilureas y conectados a sulfonilureas como inhibidores de histona desacetilasa. La solicitud de patente WO05/040161 también publicada el 6 de mayo de 2005, revela hidroxamatos ligados a biarilos como inhibidores de histona desacetilasa. Los compuestos de la presente invención difieren día técnica previo en la estructura, en su actividad farmacológica y/o la potencia farmacológica. El problema que debe ser resuelto es proporcionar inhibidores de histona desacetilasa con elevada actividad enzimática y celular que tengan aumentada la biodisponibilidad y/o la potencia in vivo.
Los nuevos compuestos de la presente invención resuelven el problema descrito anteriormente. Los compuestos de la presente invención muestran una excelente actividad inhibitoria de histona desacetilasa enzimática y celular. Ellos tienen una gran capacidad para activar el gen p21 , tanto a nivel celular como in vivo. Ellos tienen perfil farmacocinético deseable y baja afinidad por las enzimas P450, lo cual reduce el riesgo de interacción adversa fármaco-fármaco y permite un margen de seguridad más amplio. Otras características ventajosas de los presentes compuestos son la estabilidad metabólica, solubilidad y/o la capacidad de inducción de p21. En particular los compuestos de la presente invención tienen aumentada la vida media en los hepatocitos de las ratas, tienen una mayor solubilidad/ estabilidad en solución acuosa y/o tienen aumentada la capacidad de inducir al promotor p21 in vivo. Esta invención trata de compuestos de fórmula (I) las formas ?/-óxidos, las sales de adición con ácidos aceptables para uso farmacéutico y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, en los cuales cada X es independientemente N o CH; R1 es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C1-6, alquiloxi de C?-6, polihaloalquilo de C?-6, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil C?-6carbonilamino, alquilsulfonilamino de C?-6, hidroxicarbonilo, alquiloxi Ci-ßcarbonilo, hidroxialquilo de C?-6) alquiloxi C?. 6metilo, aminometilo, alquil C?-6aminometilo, alquil C-i-ßcarbonilaminometilo, alquil CT-eSulfonilaminometilo, aminosulfonilo, alquil C?-6aminosulfonilo o heterociclilo; R2 es hidrógeno, -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8; donde cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C?-6, alquiloxi C?.6alquiloxi C?-6, alquil C?-6carboniloxi, piperazinilo, ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de hidroxi, alquiloxi de C?-6, amino o mono- o di(alquil C?-6)amino, cicloalquilamino de C1-6, hidroxialquilamino de C1-6, piperazínilo, mono- o di(alquil Ci. 6)aminoalquilamino C?-6, ?/-metílpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo; cada R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C-?-6, alquil C?.6carbonilo, alquilsulfonilo de C?.6, o mono-o di(alquil R3 es hidrógeno, hidroximetilo, amínometilo o mono- o dí(alquil Ci-ß) aminometilo; R4 es hidrógeno o alquilo de C1-6; arilo como se menciona anteriormente es fenilo o naftalenilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de C1-6, trifluorometilo, ciano o hidroxicarbonilo; y heterociclilo en los anteriores es furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridacinilo, pirimidinilo, piracinílo, piperazinilo, triacinilo, trítianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, indazolílo, benzoimidazolilo, benzotiazolílo, purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo o naftiridinilo; donde cada uno de dichos heterociclos está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C1-6, alquíloxi de C1-6, ciano, amino, mono-o di(alquil C?_ )amino. El término "inhibidores de histona desacetilasa" o "inhibidor de histona desacetilasa" se usó para identificar un compuesto, el cual es capaz de interactuar con la histona desacetilasa y de inhibir su actividad, particularmente su actividad enzimática. La actividad enzimática inhibitoria de histona desacetilasa significa la reducción de la actividad enzimática de histona desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de la histona. Preferiblemente, tal inhibición es específica, es decir, el inhibidor de histona desacetilasa reduce la capacidad de la histona desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de una histona a una concentración menor que la concentración de inhibidor que se requiere para producir otro efecto biológico no relacionado. Como se usa en las definiciones precedentes y mencionadas posteriormente halo es genérico para flúor, cloro, bromo y yodo; alquilo de C^_4 define radicales hidrocarburo saturados de cadena lineal y ramificada que tienen 1 a 4 átomos de carbono tales como por ej. metilo, etilo, propilo, butilo, 1 -metiletilo, 2-metilpropilo y sustancias similares; alquilo de C,.6 incluye alquilo de C,_4 y sus homólogos superiores que tienen 5 a 6 átomos de carbono tal como, por ejemplo, pentilo, 2-metilbutilo, hexilo, 2-metilpentilo y otros similares; polihaloalquilo de C1-6 define a alquilo de C?-6 que contiene tres sustituyentes halo idénticos o diferentes por ejemplo trifluorometilo; y cícloalquilo de C3-6 incluye grupos hidrocarburo cíclicos que tienen de 3 a 6 carbonos, tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciciohexilo y otros similares. Las sales de adición aceptables para uso farmacéutico abarcan sales de adición con ácido aceptables para uso farmacéutico y sales de adición con bases aceptables para uso farmacéutico. Las sales de adición con ácidos aceptables para uso farmacéutico son sales como las mencionadas anteriormente en la presente memoria que comprenden formas de sales de adición con ácidos no tóxicas terapéuticamente activas, las cuales pueden ser formadas a partir de los compuestos de la fórmula (I). Los compuestos de fórmula (I) que tiene propiedades básicas se pueden convertir en sus sales de adición con ácidos aceptable para uso farmacéutico por tratamiento de dicha forma de base con un ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácidos hidrohálicos, por ej. ácido clorhídrico o bromhídrico; sulfúrico; nítrico; fosfórico y otros ácidos similares; o ácidos orgánicos tale como, por ejemplo, acético, trifluoroacético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir, ácido butano dioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, bencensulfónico, p-toluensulfónico, ciclámico, salicílico, p-amino-salicílíco, pamoico y otros ácidos similares. Los compuestos de fórmula (I) que tiene propiedades acidas pueden convertirse en sus sales de adición con bases aceptables para uso farmacéutico mediante el tratamiento de dicha forma de sal con una base orgánica o inorgánica adecuada. Las formas básicas de sales apropiadas comprenden por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, por ej., litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y sales similares, sales con bases orgánicas, por ej., sales de benzatina, ?/-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginína, lisina y sustancias similares. El término "sales de adición con ácidos o bases" también comprende a los hidratos y a las formas de adición con solventes, las cuales pueden formarse a partir de los compuestos de la fórmula (I). Ejemplos de tales formas son hidratos, alcoholatos y sustancias similares. El término "formas estereoquímicamente isoméricas del compuesto de fórmula (I)", como se usa en la presente memoria, define a todos los compuestos posibles que poseen los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes y no intercambiables, que pueden ser presentados por los compuestos de fórmula (I). A menos que se mencione o indique de otra manera, el nombre químico de un compuesto abarca la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas, que dicho compuesto puede tener. Dicha mezcla puede contener todos los diasterómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de la fórmula (I) tanto en su forma pura como en la mezcla con otros deben ser incluidas dentro del campo de la presente invención. Las formas ?/-óxido de los compuestos de fórmula (I) comprenden a los compuestos de fórmula (I) en las que uno o varios átomos de nitrógeno se oxidan a los también llamados ?/-óxidos, en particular los N-óxidos en los que uno o más de los nitrógenos de piperidina, piperazina o piridazinilo están ?/-oxidados. Algunos de los compuestos de fórmula (I) pueden existir también en sus formas tautoméricas. Aunque tales formas no estén indicadas de manera explícita en la fórmula mencionada anteriormente deben ser incluidas dentro del campo de la presente invención. Dondequiera que se haya empleado anteriormente el término "compuesto de fórmula (I)" quiere decir que incluye también a las sales de adición aceptables para uso farmacéutico y todas las formas estereoisoméricas. Tal como se usa en la presente memoria, los términos "histona desacetilasa" y "HDAC" se refieren a cualquiera de las enzimas de la familia que elimina los grupos acetilo de los grupos e-amino de los residuos de lisina en el N-terminal de una histona. A menos que se indique de otra manera en el contexto, el término "histona" se refiere a cualquier histona proteica, incluyendo H1 , H2A, H2B, H3, H4, y H5, provenientes de cualquier especie. Las proteínas humanas HDAC o productos génicos, incluyen, pero sin estar limitadas, a HDAC-1 , HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 HDAC-10 y HDAC-11. La histona desacetilasa puede también derivar de una fuente protozoaria o fúngica. Un primer grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los que se aplica una o más de las siguientes restricciones: a) R1 es fenilo o naftalenilo; donde cada dicho fenilo o naftalenilo está sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de alquilsulfonilamino de C?-6, hidroxicarbonilo, alquiloxi C?-6metilo, alquil C?-6 aminometilo, alquil C?-6carbonilaminometilo, alquilo C?-6sulfonilaminometilo, aminosulfonilo o alquilaminosulfonilo de C?-6; o b) R2 es -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8; c) R4 es alquilo de C?-6. Un segundo grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de la siguientes restricciones : a) R1 es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; donde cada uno de dichos fenilos está sustituido con uno o más sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de arilo, hidroxi, amino, alquil C?-6carbonilamino, alquilsulfonilamino de C?-6, alquiloxi C?-6carbonilo, hidroxialquilo de C?-6, alquiloxi C?-6metilo, aminometílo, alquil C-i. 6aminometilo, alquil C?.6carbonilaminometilo, alquil C?-6sulfonilaminometilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo de C?-6 o heterociclilo; o b) R2 es -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8; c) R4 es alquilo de C?-6. Un tercer grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de las siguientes restricciones: a) R1 es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está sustituido con uno o más sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de alquilsulfonilamino de C?-6, alquiloxi C?-6metilo, aminometilo, alquil Ci. 6aminometilo, alquil Ci-ecarbonilaminometilo, alquil C?-6sulfonilaminometilo, aminosulfonilo, o alquilaminosulfonilo de C?-6; o b) R2 es -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8; c) R4 es alquilo de C?-6. Un cuarto grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C1-6, píperazinilo, ?/-metilpiperazin¡lo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo; b) cada R6 se selecciona independientemente de hidroxi, alquiloxi de C1-6, amino o mono- o di(alquil C^amino, cicloalquilamino de Ci. 6, piperazinilo, /V-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo; c) R4 es hidrógeno. Un quinto grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada X es N; b) R1 es fenilo o fenilo opcionalmente sustituido con halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de C?-6, polihaloalquilo de C?-6 ? arilo; c) R2 es -CH2-R5 o -C(=0)-R6; d) cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C?-6, alquiloxiCi-ßalquiloxi C?-6, alquil C?-6carboniloxi, N-metilpiperazinilo, morfolinilo, o imídazolilo; e) cada R6 se selecciona independientemente de alquilamino de C?-6, cicloalquilamino de C1-6, hidroxialquilamino de C1-6, di(alquil Ci. 6)aminoalquilamino Ci-ß o morfolinilo; f) R3 es hidrógeno; o g) R4 es hidrógeno o alquilo de C?-6. Un sexto grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada R6 se selecciona independientemente de alquilamino de C1-6, cicloalquílamino de C?-6, di(alquil C?-6)aminoalquilamino C1-6 o morfolinilo. Un séptimo grupo de compuestos de interés consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en los cuales se aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada X es N; b) R1 es fenilo o fenilo sustituido con halo; c) R2 es -CH2-R5; d) cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxí, alquiloxi de C?-6, o alquil C?-6carboniloxi; e) R3 es hidrógeno; f) R4 es hidrógeno.
Un grupo de compuestos preferidos consiste en los compuestos de fórmula (I) donde cada X es N; R1 es fenilo o fenilo opcionalmente sustituido con halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de polihaloalquilo de C?-6 o arilo; R2 es -CH2-R5 o -C(=0)-R6; cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C-?.6, alquiloxiCi-ßalquiloxi C?-6, alquil d- 6carboniloxi, ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo o imidazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de alq.uilamino de C?-6, cicloalquilamino de C?. 6, hidroxialquilamino de Ci-ß, di(alquil Ci-ejaminoalquilamino C?-6 o morfolinilo; R3 es hidrógeno y R4 es hidrógeno o alquilo de C?-6. Otro grupo de compuestos preferidos consiste de los compuestos de fórmula (I) en la cual R2 es -CH2-R5, trifluorometílo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8. El grupo de los compuestos más preferidos consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) en la cual cada X es N; R1 es fenilo o fenilo sustituido con halo; R2 es -CH -R5; cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C?-6, o alquil C?-6carboniloxi; R3 es hidrógeno; y R4 es hidrógeno. Los compuestos más preferidos son el compuesto No.1 , el compuesto No.8, el compuesto No.11 , el compuesto No.9, el compuesto No.33, el compuesto No.34, el compuesto No.7 y el compuesto No. 25.
Los compuestos de fórmula (I) y sus sales aceptables para uso farmacéutico y N-óxidos y sus formas estereoquímicamente isoméricas, se pueden preparar de manera convencional. Los materiales de partida y algunos de los intermediarios son compuestos conocidos y disponibles en el comercio o pueden prepararse de acuerdo con procedimientos de reacción convencionales tal como se conoce en la técnica. Algunos métodos de preparación se describirán posteriormente en la presente memoria con más detalle. Otros métodos para obtener los r compuestos finales de fórmula (I) se describen en los ejemplos. a) Los ácidos hidroxámicos de fórmula (I) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de fórmula (II), con un ácido apropiado, tal como por ejemplo, ácido trifluoroacético. Dicha reacción se lleva a cabo en un solvente apropiado, tal como, por ejemplo, metanol o diclorometano. b) Los intermediarios de fórmula (II) se pueden preparar por medio de la reacción de un intermediario de fórmula (lll) con un intermediario de fórmula (IV) en presencia de reactivos apropiados tal como monoclorhidrato de ?/,-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-dimetil-1 ,3-propandiamina (EDC) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol (HOBT). La reacción se debe llevar a cabo en presencia de una base tal como trietilamina, en un solvente adecuado, tal como, una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.
(II) c) En forma alternativa los intermediarios de fórmula (II), donde R4 es hidrógeno, se mencionan en la presente memoria como intermediarios de fórmula (ll-a) se pueden preparar en una reacción de un solo paso del intermediario de fórmula (XI), con 1 ,4-dioxan-2,5-diol y el ácido borónico apropiado de fórmula (Vil), en la cual R1 es tal como se definió anteriormente, en un solvente adecuado, por ej., un alcohol, tal como etanol.
(Il-a) d) Los intermediarios de fórmula (lll) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de fórmula (V) con una solución acida apropiada, por ej., ácido clorhídrico o solución básica tal como bromuro de hidrógeno o hidróxido de sodio, en un solvente apropiado, por ejemplo un alcohol, tal como etanol o propanol.
La presente invención también trata de compuestos de fórmula las formas ?/-óxido, las sales de adición aceptables para uso farmacéutico y sus formas estereoquímicamente isoméricas, donde cada X es independientemente N o CH; R1 es fenilo, naftalenílo o heterociclilo; en el cual cada uno de dichos fenilos o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C?-6, alquíloxi de C?-6, polihaloalquilo de C?-6, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil C?.6carbonilamino, alquilsulfonilamino de C?.6, hidroxicarbonilo, alquiloxi Ci-ßcarbonilo, hidroxialquilo de C?-6, alquiloxí C?-6metilo, aminometilo, alquil C?-6aminometilo, alquil C1-6carbonilaminometilo, alquil C?-6sulfonilam¡nometilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo de Ci-ß o heterociclilo; R2 es hidrógeno, -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=0)-R6, o -CH2-NR7R8; en el cual cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C?-6, alquiloxiC?-6alquiloxi C?-6, alquil C?-6carboniloxi, piperazinilo, ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de hidroxi, alquiloxi C?-6, amino o mono- o di(alquil C^amino, cicloalquilamino de C1-6, hidroxialquilamino de Ci-ß, piperazinilo, mono o di(alquil C?-6)aminoalquilamino C?-6, ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinílo; cada R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquil Ci-ßcarbonilo, alquilsulfonilo de C1-6, o mono o di(alquil C?-4)amínosulfonilo; R3 es hidrógeno, hidroximetilo, aminometilo o mono- o di(alquil C?-6)aminometilo; R4 es hidrógeno o alquilo de C?-6; arilo tal como se mencionó anteriormente es fenilo o naftalenilo; donde cada uno de dichos fenilos o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C?-6, alquiloxí de d-ß, trifluorometilo, ciano o hidroxicarbonilo; y heterociclilo tal como se menciona anteriormente es furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolílo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo, tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, ¡ndazolilo, benzoimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinnolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinaxolinilo o naftiridinilo; en el cual cada uno de dichos heterociclos está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de Ci-ß, ciano, amino, o mono-o di(alquil C?-4)amino. Los grupos de compuestos interesantes, preferidos, más preferidos y muy especialmente preferidos se pueden definir para los compuestos de fórmula (V), de acuerdo con los grupos definidos para los compuestos de fórmula (I). Los nuevos intermediarios de fórmula (V) se pueden preparar mediante: a) Conversión de los intermediarios de fórmula (V), en la cual R2 es -CH2OH, y R4 es hidrógeno, denominados en la presente memoria intermediarios de fórmula (V-a), en intermediarios de fórmula (V) en la cual R2 es diferente de CH2OH, denominados en la presente memoria intermediarios de fórmula (V-b), por medio de reacciones conocidas en la técnica o transformación de grupos funcionales. Por ejemplo los alcoholes de fórmula (V-a) se pueden convertir en aminas, esteres y éteres. Las aminas se pueden transformaren las amidas correspondientes y las aminas primarias se pueden convertir en aminas secundarias y terciarias. b) Los nuevos intermediarios de fórmula (V-a) se pueden preparar mediante la reacción en un solo paso del intermediario de fórmula (VI), con 1 ,4-dioxan-2,5-diol y el ácido borónico apropiado de fórmula (Vil), en la cual R1 es tal como de definió anteriormente, en un solvente adecuado, por ej., un alcohol, tal como etanol.
Cv (VII) c) Los nuevos intermediarios de fórmula (V-b) se pueden preparar mediante al reacción de los intermediarios de fórmula (VI) con la cetona apropiada de fórmula (VIII) en presencia de un reactivo apropiado, tal como tetrakis(etanolato) de titanio o borohidruro de sodio, en un solvente adecuado por ej., 1 ,2-dicloroetano.
(VI) (VIII) d) Los nuevos intermediarios de fórmula (V), en la cual R >2 es -COOH mencionado en la presente memoria como compuestos de fórmula (V-c) se pueden preparar mediante una reacción de un solo paso del intermediario de fórmula (VI), con ácido 2-oxo-propanoico y el ácido borónico apropiado de fórmula (Vil), en el cual R1 es como se definió anteriormente, en un solvente adecuado, por ej., 1 ,2-diclorometano. Los intermediarios de fórmula (V-c), en la cual R2 es -COOH, se pueden convertir en intermediarios de fórmula (V) en la cual R2 es -C(=O)-R6, por medio de reacciones conocidas en la técnica o transformación de grupos funcionales, por ejemplo la conversión en aminas y amidas.
(VI) (VII) Los intermediarios de fórmula (XI) se pueden preparar por medio de la reacción del intermediario de fórmula (IX) con piperidina en un solvente adecuado por ej., diclorometano.
Los intermediarios de fórmula (IX) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de fórmula (X) con un intermediario de fórmula (IV), en presencia de reactivos apropiados tal como monoclorhidrato de N-(etilcarbonimidoil)- /,?/-dimetil-1 ,3-propandiamina (EDC) y 1 -hidroxi- 1 H-benzotriazol (HOBT). La reacción se puede llevar a cabo en presencia de una base tal como trietilamina, en un solvente adecuado, tal como, una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.
Los intermediarios de fórmula (X) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de fórmula (VI) con un intermediario de fórmula (Xll), en presencia de hidróxido de sodio, en un solvente adecuado, tal como tetrahidrofurano, seguido de neutralización con ácido clorhídrico y la adición de carbonato de sodio.
(VI) (XII) Los compuestos de fórmula (I) y algunos de los intermediarios pueden tener al menos un centro estereogénico en su estructura. Este centro estereogénico se puede presentar con configuración R o S.
Los compuestos de fórmula (I) que se preparan con los procedimientos descritos anteriormente en la presente memoria son generalmente mezclas racémicas de enantiómeros, los cuales se puede separar de los otros siguiendo procedimientos de resolución conocidos en la técnica. Los compuestos racémicos de fórmula (I) se pueden convertir en las formas de sales diastereoméricas correspondientes mediante la reacción con un ácido quiral adecuado. Dichas formas de sales diastereoméricas se separan posteriormente, por ejemplo, por cristalización fraccionada o selectiva en los enantíómeros liberados a partir del álcali. Un modo alternativo de separar formas enantioméricas de los compuestos de fórmula (I) incluye la cromatografía líquida que emplea una fase quiral estacionaria. Dichas formas isoméricas estereoquímicamente puras se pueden derivar de las formas isoméricas estereoquímicamente puras correspondientes a los materiales de partida apropiados, provistos para que la reacción se produzca en forma estereoespecífica. Preferiblemente, si se desea un estereoisómero específico, dicho compuesto se debería sintetizar mediante métodos de preparación específicos. Estos métodos serán más provechosos si se utilizan materiales de partida enantioméricamente puros. Los compuestos de fórmula (I), las sales de adición con ácido aceptables para uso farmacéutico y sus formas estereoisoméricas tienen propiedades farmacológicas valiosas ya que tienen efectos inhibitorios sobre la histona desacetilasa (HDAC).
Esta invención proporciona un método para inhibir el crecimiento celular anormal, que incluye las células transformadas, mediante la administración de una cantidad efectiva del compuesto de la invención. El crecimiento anormal de células se refiere al crecimiento celular independiente de los mecanismos regulatorios normales (por ej., falta de inhibición por contacto). Esto incluye la inhibición del crecimiento tumoral en forma directa al causar detención del crecimiento celular, diferenciación terminal y/o apoptosis de las células cancerosas, y en forma indirecta por inhibición de la neovascularización tumoral. Esta invención también proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral mediante la administración de una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención, a un sujeto, por ej., un mamífero (y especialmente seres humanos) que necesiten tal tratamiento. En particular, esta invención proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral mediante la administración de una cantidad efectiva de compuesto de la presente invención. Ejemplos de tumores que se pueden inhibir, pero sin limitación, son: cáncer de pulmón (por ej., adenocarcinoma que incluye al cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer pancreático (por ej., carcinoma pancreático tal como, por ejemplo, carcinoma pancreático Ej.ocrino), cáncer de colon (por ej., carcinomas colorrectales, tales como, por ejemplo, adenocarcinoma y adenoma de colon), cáncer de próstata que incluye la enfermedad avanzada, tumores hematopoyéticos, tumores de linaje linfoide (por ej., leucemia línfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt), leucemias mieloideas (por ejemplo, leucemia mielógena aguda (AML)), cáncer folicular tiroideo, síndrome mielodisplástico (MDS), tumores de origen mesenquimático (por ej., fibrosarcomas y rhabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumores benignos de piel (por ej., queratoacantomas), carcinoma de mama (por ej., cáncer de mama avanzado), carcinoma renal, carcinoma ovárico, carcinoma de vejiga y carcinoma epidérmico. Los compuestos de acuerdo con la invención se pueden usar con otros propósitos terapéuticos, por ejemplo: a) La sensibilización de tumores para la radioterapia mediante la administración de los compuestos acordes con la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para el tratamiento del cáncer; b) Tratamiento de artropatías y enfermedades osteopatológicas tales como artritis reumatoidea, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico; c) Inhibición de la proliferación de las células del músculo liso incluyendo trastornos proliferativos vasculares, aterosclerosis y restenosis; d) Tratamiento de enfermedades inflamatorias y dérmicas tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad del huésped vs. injerto, conjuntivitis, asma, ARDS, enfermedad de Behcets, rechazo al transplante, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, escleroderma, exantema, eczema, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica; e) Tratamiento de endometriosis, fibroides uterinos, hemorragia uterina disfuncional e hiperplasia endometrial; f) tratamiento de la vascularización ocular incluyendo las vasculopatías que afectan los vasos coroideos y retiñíanos; g) tratamiento de la disfunción cardíaca; h) Inhibición de las patologías inmunosupresivas tal como el tratamiento de las infecciones con HIV; i) Tratamiento de la disfunción renal; j) Trastornos endocrinos supresores; k) Inhibición de la disfunción de la gluconeogénesis; I) Tratamiento de neuropatologías por ejemplo, enfermedad de Parkinson o neuropatologías que producen trastorno cognitivos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o patologías neuronales asociadas con la poliglutamina; m) Tratamiento de trastornos psiquiátricos por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis; n) Inhibición de patologías neuromusculares, por ejemplo, esclerosis amilotrófica lateral; o) Tratamiento de atrofia muscular espinal; p) Tratamiento de otras patologías que requieran tratamiento para potenciar la expresión genética; q) Mejora de la terapia genética; r) Inhibición de adipogénesís; s) Tratamiento de parasitosis tales como la malaria. Por lo tanto, la presente invención revela los compuestos de fórmula (I) para uso medicinal tanto como el uso de estos compuestos de fórmula (I) para la elaboración de medicamentos para el tratamiento de una o más de las enfermedades mencionadas anteriormente Los compuestos de fórmula (I), las sales de adición con ácidos aceptables para uso farmacéutico y sus formas estereoisoméricas pueden tener propiedades diagnósticas valiosas ya que se pueden usar para la detección o identificación de HDAC en muestras biológicas, que comprenden la detección o medición de la formación de complejos entre un compuesto marcado y la HDAC. Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos marcados con agentes marcadores tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, etc. Ejemplos de radioisótopos incluyen 125l, 131l, 3H y 14C. Las enzimas se hacen usualmente detectables mediante la conjugación de un sustrato apropiado, el cual a su vez cataliza una reacción detectable. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato deshidrogenasa, con preferencia peroxidasa de rábano picante. Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, acuorina y luciferasa.
Las muestras biológicas se pueden definir como tejidos corporales o líquidos corporales. Ejemplos de líquidos corporales son líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, saliva y otros similares. En vista de la utilidad de sus propiedades farmacológicas, los compuestos se pueden formular en diferentes formas farmacéuticas de acuerdo con los propósitos de administración. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, una cantidad efectiva de un compuesto particular, en forma de sal de adición con ácidos o bases, como ingrediente activo se combina en una mezcla con el vehículo aceptable para uso farmacéutico. Este vehículo puede adoptar una amplia variedad de formas que dependen de la forma de preparación que requiere la administración. Estas composiciones farmacéuticas se requieren en formas adecuadas de dosis unitarias, con preferencia, para administración oral, rectal, percutánea, o por inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en forma de dosis orales, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos usuales, tal como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y otras sustancias similares. En el caso de los líquidos para administración oral se emplean preparaciones tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o vehículos sólidos tal como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y otros similares para el caso de polvos, pildoras, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosis unitaria por vía oral más ventajosa. En tal caso se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Para las composiciones de uso parenteral, el vehículo comprenderá generalmente, agua estéril, al menos en mayor parte, aunque se pueden incluir otros ingredientes, por ejemplo para aumentar la solubilidad. Las soluciones inyectables, por ejemplo, se pueden preparar en vehículos que comprenden solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y glucosa. Las suspensiones inyectables se pueden preparar empleando en cada caso vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y otros similares. En las composiciones adecuadas para administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente para mejorar la penetración y/o un agente humectante adecuado, combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en una proporción menor, para que estos aditivos no causen efectos perjudiciales a la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración en la piel y/o mejorar la preparación de la composición deseada. Estas composiciones se pueden administrar de diferentes maneras, por ej., como parches transdérmicos, linimento o como ungüento. Es muy ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas de dosis unitarias por la facilidad de administración y la uniformidad de las dosis uniformidad de las dosis obtenidas. Las formas de dosis unitarias usadas en la especificación y las reivindicaciones de la presente memoria son unidades de forma física distinta que se mencionan como dosis unitarias; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Ejemplos de tales formas de dosis unitarias son comprimidos (incluyendo comprimidos recubiertos o ranurados), cápsulas, pildoras, polvos compactos, obleas, soluciones inyectables o suspensiones, cucharaditas, cucharadas y otras similares, y sus múltiples derivados segregados. Los expertos en la técnica podrían determinar con facilidad la cantidad efectiva a partir de los resultados de los ensayos que se presentarán posteriormente en esta memoria descriptiva. En general se considera que una cantidad terapéuticamente efectiva sería de aproximadamente 0.005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, y en particular de 0.005 mg/kg a 10 mg/kg peso corporal. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida en dos tres, cuatro o más subdosis en intervalos apropiados durante todo el día. Dichas subdosis se pueden formular como formas de dosis unitarias, por ejemplo, que contienen 0.5 a 500 mg, y en particular 10 mg a 500 mg de ingrediente activo por unidad de dosis. Como otro aspecto de la presente invención, se puede idear una combinación de un inhibidor de HDAC con otro agente antineoplásico, especialmente para uso como medicina, más específicamente en el tratamiento de cáncer o enfermedades relacionadas. Para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, los compuestos de la invención se pueden usar en forma ventajosa en combinación con uno o más agentes medicinales, más particularmente, con otros agentes anti-neoplásicos. Ejemplos de agentes anti-neoplásícos son: - compuestos de coordinación del platino, por ejemplo, cisplatino, carboplatino o oxaliplatino; - compuestos con taxano por ejemplo, paclitaxel o docetaxel; inhibidores de topoisomerasa I tales como compuestos de capftotecina, por ejemplo, irinotecano o topotecano; - inhibidores de topoisomerasa II tales como derivados de podofilotoxinas tumorales, por ejemplo etopósido o tenipósido; - alcaloides antitumorales de la vinca, por ejemplo vinblastina, vincristína o vinorrelbina; - derivados de nucleósídos antitumorales, 5-fluorouracilo, gemcitabina o capecitabina; - agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas o nitrosourea, por ejemplo, cíclofosfamida, clorambucilo, carmustína o lomustina; - derivados de antraciclina antitumorales por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubícina, idarrubicína o mitoxantrona; - anticuerpos HER2, por ejemplo trastuzumab; - antagonistas de receptores de estrógenos o moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno; - inhibidores de aromatasa tales como exemestano, anastrozol, letrazol y vorozol; - agentes de diferenciación tales como retinoides, vitamina D y ácido retinoico agentes bloqueantes del metabolismo (RAMBA) por ejemplo, acutano; - inhibidores de ADN metil transferasa por ejemplo, azacitídina; - inhibidores de quinasas por ejemplo, flavoperidol, imatinib mesilato o gefitinib; - inhibidores de famesiltransferasa; - otros inhibidores de HDAC; - inhibidores de la vía ubiquitin-proteosómica por ejemplo, Velcade; o - Yondelis. El término "compuestos de coordinación del platino" se usa en la presente memoria descriptiva, para denominar a los compuestos de coordinación de platino que inhiben el crecimiento tumoral, los cuales proveen el platino en forma de ion. El término "compuestos de tipo taxano" indica la clase de compuestos que tienen el sistema anular del taxano y se relacionan o derivan de Ej.tractos de determinadas especies de árboles de tejo (Taxus). El término "inhibidores de topoisomerasa" se usa para indicar a las enzimas capaces de alterar la topología de ADN en las células eucarióticas. Estos son indispensables para las funciones celulares importantes y para la proliferación celular. Hay dos clases de topoisomerasas las células eucarióticas, llamadas tipo I y tipo II. La topoisomerasa I es una enzima monomérica de aproximadamente 100.000 de peso molecular. La enzima se une al ADN y produce una ruptura transitoria de la cadena simple, desenrolla la doble hélice (o permite que se desenrolle) y posteriormente cierra la ruptura antes de disociar la cadena de ADN. La topoisomerasa II tiene un mecanismo de acción similar que implica la inducción de la ruptura de la cadena de ADN o la formación de radicales libres. El término "compuestos tipo camptotecina" se usa para indicar a los compuestos que se relacionan o derivan del compuesto original captotecina, que es un alcaloide insoluble en agua derivado del árbol chino Capftotheca acuminata y del árbol de India Nothapodytes foetida. El término "compuestos tipo podofilotoxínas" se usa para indicar a los compuestos relacionados o derivados de la podofilotoxina original, la cual se Ej.trae de la planta de mandragora. El término "alcaloides antitumorales de la vinca" se usa para indicar a los compuestos relacionados o derivados de extractos de la planta vinca (Bincha rosea). El término "agentes alquilantes" abarca un grupo de diversos productos químicos que tienen la característica común, de que pueden aportar en condiciones fisiológicas, grupos alquilo a macromoléculas biológicamente vitales tal como ADN. En la mayoría de los agentes más importantes tal como las mostazas de nitrógeno y las nitrosoureas, los residuos activos alquilantes son generados in vivo después de complejas reacciones degradativas, algunas de las cuales son enzimáticas. Las acciones farmacológicas más importantes de los agentes alquilantes son las que alteran los mecanismos fundamentales que afectan la proliferación celular, en particular la síntesis de ADN y la división celular. La capacidad de los agentes alquilantes de interferir en las funciones del ADN y la integridad de los tejidos de proliferación rápida proporciona el fundamento para sus aplicaciones terapéuticas y para la mayoría de sus propiedades tóxicas. El término "derivados de antraciclina antitumorales" comprende a los antibióticos obtenidos del hongo Strep. peuticus var. caesius o sus derivados, caracterizados por tener una estructura anular de tetracíclina con un azúcar inusual, daunosamina, unido por un enlace glicosídíco. Se ha demostrado que la amplificación del receptor-2 proteico del factor de crecimiento epidérmico humano (HER 2)en el carcinoma de mamas primario se correlaciona con un mal pronóstico para determinados pacientes. Trastuzumab es un anticuerpo lgG1 kappa, monoclonal humanizado derivado de ADN recombínante de alta pureza, el cual se une con gran especificidad y afinidad al dominio extracelular del receptor de HER2. Muchos cánceres de mama tiene receptores de estrógenos y el crecimiento de estos tumores se puede estimular con estrógenos. El término "antagonistas de receptores de estrógenos" y "moduladores selectivos de los receptores de estrógenos" se usa para indicar los inhibidores competitivos de la unión a estradiol de los receptores de estrógeno (ER). Los moduladores selectivos de los receptores de estrógeno, cuando se unen a los ER, inducen un cambio en la estructura tridimensional del receptor, al modular su unión al elemento que responde a los estrógenos (ERE) en el ADN. En las mujeres posmenopáusicas, la fuente principal de estrógenos circulantes es a partir de la conversión de andrógenos adrenales y ováricos (androstenodiona y testosterona) a estrógenos (estrona y estradiol) mediante la enzima aromatasa en los tejidos periféricos. La pérdida de estrógenos a través de la inhibición o inactivación de la aromatasa es un tratamiento selectivo y efectivo para algunas pacientes posmenopáusicas con cáncer de mamas hormonodependientes. El término "agente antiestrogénico" se usa en la presente memoria descriptiva para incluir no sólo a los antagonistas de los receptores de estrógenos y los receptores selectivos de estrógenos sino también a los inhibidores de aromatasa mencionados anteriormente. El término "agentes de diferenciación" abarca a los compuestos que pueden inhibir de distintas maneras la proliferación celular e inducir la diferenciación. Se sabe que la vitamina D y los retinoides cumplen un papel importante en la regulación del crecimiento y la diferenciación de una amplia variedad de tipos celulares normales y malignos. Los agentes bloqueantes del metabolismo del acido retinoico (RAMBA) aumentan los niveles de ácidos retínoicos endógenos mediante la inhibición del catabolismo de los ácidos retinoicos mediado por el citocromo P450.
Las modificaciones de la metilación del ADN son una de las anormalidades más comunes en la neoplasia humana. La hipermetilación de los promotores de genes seleccionados está generalmente asociada con la inactivación de los genes implicados. El término "inhibidores de la ADN metil transferasa" se usa para indicar compuestos que actúan a través de la inhibición farmacológica de la ADN metil transferasa y la reactivación de la Ej. presión del gen supresor del tumor. El término "inhibidores de quinasas" comprende a los potentes inhibidores de quinasas que están implicados en la evolución del ciclo celular y la muerte celular programada (apoptosis). El término "inhibidores de famesiltransferasa" se usa para indicar a los compuestos diseñados para evitar la famesilación de Ras y otras proteínas intracelulares. Se ha demostrado que estos compuestos tienen efecto sobre la proliferación y supervivencia de las células malignas. El término "otros inhibidores de HDAC" comprende, pero sin limitación, a: - Carboxilatos, por ejemplo butirato, ácido cinámico, 4-fenilbutirato o ácido valproíco; - ácidos hidroxámícos, por ejemplo ácido hidróxamíco suberoilanilida (SAHA), piperazina que contiene análogos de SAHA, biaril hidroxamato A-161906 y sus carbozoliléter, tetrahidropirídi- y tetralon-análogos, aril-?/-hidroxicarboxamidas bícíclicas, piroxamida, CG-1521 , PXD-101 , ácido hidroxámico sulfonamída, LAQ-824, LBH-589, tricostatina A (TSA), oxamflatin, scriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas con scriptaid, ácido m-carboxi cinámico, ácido bishidroxámico (CBHA), ácidos hidroxámicos del tipo CBHA, análogos del ácido trapoxin-hidroxámico, R306465 y ácidos benzoil- y heteroaril-hidroxámicos relacionados, aminosuberatos y maloníldiamidas; - tetrapéptidos cíclicos por ejemplo, trapoxina, apídicina, depsipeptida, compuestos relacionados con la espirucostatina, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos que contienen sulfhidrilos (SCOPs), tetrapéptidos cíclicos que contienen ácido hidroxámico CHAP), TAN-174 y azumamidas; - benzamidas, por ejemplo MS-275 o CI-994, o - depudecina. El término "inhibidores de la vía ubiquitina-proteosómica" se usa para identificar compuestos que inhiben la destrucción de las proteínas celulares en el proteosoma, incluyendo las proteínas regulatorias del ciclo celular. Para el tratamiento del cáncer los compuestos acordes con la presente invención se pueden administrar a los pacientes tal como se describió anteriormente, en conjunto con la irradiación. La irradiación quiere decir radiación ionizante y en particular radiación gamma, especialmente la que se emite mediante aceleradores lineales o mediante radionúclídos que son de uso común en la actualidad. La irradiación del tumor por medio de los radíonúclidos puede ser externa o interna.
La presente invención también se refiere a la combinación acorde a la invención de un agente antineoplásico y un inhibidor de HDAC acorde a la invención. La presente invención también se refiere a la combinación acorde a la invención para uso en terapia médica por ejemplo, para inhibir el crecimiento de las células tumorales. La presente invención también se refiere a la combinación acorde a la invención para inhibir el crecimiento de las células tumorales. La presente invención también se refiere al método de inhibición del crecimiento de las células tumorales en los seres humanos, el cual comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de una combinación acorde a la invención. Esta invención también proporciona un método para inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo las células transformadas, mediante la administración de una cantidad efectiva de una combinación acorde a la invención. El otro agente medicinal y el inhibidor de HDAC se puede administrar en forma simultánea (por ej., en composiciones separadas o unitarias) o en forma secuencial en cualquier orden. En el último caso, los dos compuestos se administrarán en un período y en una cantidad y manera suficiente para asegurar que se alcanzará un efecto sinérgico y ventajoso. Se considerará que el método de preferencia, el orden de administración y las respectivas cantidades de dosis y regímenes para cada componente de la combinación, dependerán de cuales agentes medicinales e inhibidores de HDAC sean administrados, su vía de administración, el tumor particular que se trata y el huésped particular que está siendo tratado. El método óptimo, el orden de administración, la cantidad de dosis y el esquema de dosis es determinado por los expertos en la técnica mediante métodos convencionales bajo la perspectiva de lo que ya se ha establecido en la presente memoria descriptiva. Los compuestos de coordinación de platino se administra ventajosamente con una dosis de 1 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 50 a 400 mg/m2, particularmente para cisplatino con una dosis de aproximadamente 75 mg/m2 y para carboplatino de aproximadamente 300mg/m2 durante el curso del tratamiento. El compuestos tipo taxano se administra en forma ventajosa con una dosis de 50 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel con una dosis de aproximadamente 175 a 250 mg/m2 y para docetaxel con aproximadamente 75 a 150 mg/m2 durante el curso del tratamiento. El compuesto tipo camptotecina se administra en forma ventajosa con una dosis de 0.1 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 1 a 300 mg/m2, en particular para irinotecano con una dosis de aproximadamente 100 a 350 mg/m2 y para topotecano con aproximadamente 1 a 2 mg/m2 durante el curso del tratamiento.
El compuesto derivado de podofilotoxinas antitumoral se administra en forma ventajosa con dosis de aproximadamente 30 a 300 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 50 a 250mg/m2, en particular para etoposida con una dosis de aproximadamente 35 a 100 mg/m2 y para teniposida con una dosis de aproximadamente 50 a 250 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los alcaloides antitumorales de la vinca se administran en forma ventajosa con una dosis de aproximadamente 2 a 30 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, en particular para vinblastina con una dosis de aproximadamente 3 a 12 mg/m2, para vincristina con una dosis de aproximadamente 1 a 2 mg/m2, y para vinorrelbina con una dosis de aproximadamente 10 a 30 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los derivados de nucleósidos antitumorales se administran en forma ventajosa con una dosis de aproximadamente 200 a 2500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 700 a 1500 mg/m2, en particular para 5-FU con una dosis de 200 a 500mg/m2, para gemcitabina con una dosis de aproximadamente 800 a 1200 mg/m2 y para capecitabina de aproximadamente 1000 a 2500 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los agentes alquilantes tales como mostaza nitrogenada o nitrosourea se administran en forma ventajosa con una dosis de aproximadamente 100 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 120 a 200 mg/m2, en particular para ciclofosfamida con una dosis de aproximadamente 100 a 500 mg/m2 , para clorambucilo con una dosis de aproximadamente 0.1 a 0.2 mg/kg, para carmustina con una dosis de aproximadamente 150 a 200 mg/m2, y para lomustina con una dosis de aproximadamente 100 a 150 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los derivados de antraciclína antitumorales se administran en forma ventajosa con una dosis de aproximadamente 10 a 75 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 15 a 60 mg/m2, en particular para doxorrubicina con una dosis de aproximadamente 40 a 75 mg/m2, para daunorrubicína con una dosis de aproximadamente 25 a 45mg/m2, y para idarrubícina con una dosis de aproximadamente 10 a 15 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Trastuzumab se administra en forma ventajosa con dosis de aproximadamente 1 a 5 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, en particular 2 a 4mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los agentes antiestrógenos se administran en forma ventajosa con una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg diarios de acuerdo al agente particular y a la enfermedad que está tratando. Tamoxifeno se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 5 a 50 mg, con preferencia de 10 a 20 mg dos veces por día, y se continúa la terapia durante el tíepfo suficiente para alcanzar y mantener el efecto terapéutico. Toremifeno se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 60 mg una vez por día, y se continúa la terapia durante el tiempo suficiente para alcanzar y mantener el efecto terapéutico. Anastrozol se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 1 mg una vez por día. Droloxífeno se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 20-100 mg una vez por día. Raloxífeno se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 60 mg una vez por día. Exemestano se administra en forma ventajosa por vía oral con dosis de aproximadamente 25mg una vez por día. Estas dosis se pueden administrar por ejemplo, una vez, dos veces o más durante el curso del tratamiento, el cual se puede repetir por ejemplo, cada 7,14, 21 o 28 días. En vista de sus útiles propiedades farmacológicas, los componentes de las combinaciones de acuerdo con la invención, es decir, otro agente medicinal y el inhibidor de HDAC se pueden formular en diferentes formas farmacéuticas de acuerdo con los propósitos de administración. Los componentes se pueden formular en forma separada y en composiciones farmacéuticas individuales o unitarias que contiene ambos componentes. La presente invención por consiguiente también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden otro agente medicinal y el inhibidor de HDAC junto con uno o más vehículos farmacéuticos. La presente invención también se refiere a una combinación acorde con la invención en forma de una composición farmacéutica que comprende un agente anticanceroso y un inhibidor de HDAC inhibidor acorde con la invención junto con uno o más vehículos farmacéuticos.
La presente invención también se refiere al uso de una combinación acorde con la invención en al elaboración de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de las células tumorales. La presente invención también se refiere al producto que contiene como primer ingrediente activo al inhibidor de HDAC acorde con la invención y como segundo ingrediente activo a un agente antineoplásico, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencíal en el tratamiento de pacientes que sufren de cáncer.
Parte Experimental Los siguientes ejemplos se proporcionan con propósitos ilustrativos. En la presente memoria, "EDC" se define como monoclorhidrato de ?/'-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-dimet¡l-1 ,3-propandiamina, "DCM" se define como diclorometano, "DIPE" se define como diisopropil éter, "DMF" se define como ?/,?/-dimetillformamida, "EtOAc" se define como acetato de etilo, "EtOH" se define como etanol, "HOBT" se define como 1-hidroxi-1r7-benzotriazol, "MeOH" se define como metanol, "TFA" se define como ácido trifluoroacético y "THF" se define como tetrahidrofurano.
A. Preparación de los compuestos intermediarios EJEMPLO A1 a) Preparación del intermediario 1 Una mezcla del éster etílico del ácido 2-(1-piperaziníl)-5-pírimídincarboxílico (0.016 mol), ácido (2-feniloetenil)-borónico (0.016 mol) y 1 ,4-dioxan-2,5-diol (0.016 mol) en EtOH (250 ml) se agitó durante 2 días a temperatura ambiente y luego se evaporó el solvente (vac), El residuo se retiró con DCM y agua y se separaron las fases orgánicas, se secaron (MgSO4), se filtraron y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH 97/1 ). Las fracciones puras se evaporaron, produciendo 4 g (61 %) del intermediario 1 , punto de fusión 128°C. Los esteres correspondientes al intermediario 1 , se pueden separar por cromatografía quiral. b) Preparación del intermediario 2 Una mezcla del intermediario 1(0.0007 mol) en hidróxido de sodio 1 N (10 ml) y THF (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Se agregó acido clorhídrico 1 N (10 ml). El solvente se evaporó. El precipitado se filtró, se lavó con agua, luego con DIPE y se secó, produciendo 0.2 g (72%) del intermediario 2,punto de fusión 232°C. c) Preparación del intermediario 3 Se agregaron trietílamina (0.012 mol), ?/'-(et¡lcarbonim¡doil)-?/,?/-dimetíl-1 ,3-propandiam¡na (0.00593 mol), 1-hidroxi-1 /-/-benzotriazol (0.00593 mol) y 0-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.00593 mol) a una mezcla del intermediario 2 (0.00395 mol) en una mezcla de DCM (70 ml) y THF (70 ml), luego la mezcla de reacción se agitó durante 3 días a temperatura ambiente. Se agregó H20. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (eluyente en gradiente: DCM/MeOH/NH OH 97/3/0.1 ). Se recogieron las fracciones del producto se y se separó el solvente orgánico, produciendo 1.5 g (84 %) del intermediario 3.
EJEMPLO A2 a) Preparación del intermediario 4 Una mezcla del éster etílico del ácido 2-(1-piperazinil)- 5-pirimidincarboxílico (0.0042 mol), 1 ,4-dioxan-2,5-diol (0.0042 mol) y (E) ácido [2-(4-clorofenilo)etenil]-borónico (0.0042 mol) en EtOH (100 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. Se recogieron dos fracciones y el solvente se evaporó, produciendo 0.85 g de F1 (aceite) y 0.25 g de F2 (rendimiento total: 63%). F1 se cristalizó de 2-propanona/DIPE. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.6 g del intermediario 4, punto de fusión 110°C. b) Preparación del intermediario 5 Se agregó cloruro de metansulfonilo (0.0012 mol) a 5°C a una solución del intermediario 4(0.0006 mol) y trietilamina (0.0024 mol) en THF (15 ml) bajo corriente de N2. La mezcla se llevó a temperatura ambiente, luego se agitó durante 1 hora y se vertió en agua con hielo. La mezcla se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO ), filtró y el solvente se evaporó, produciendo 0.3 g del intermediario 5. Este producto se usó directamente en el próximo paso de la reacción. c) Preparación del intermediario 6 Una mezcla del intermediario 5(0.0006 mol), morfolína (0.0009 mol) y carbonato de potasio (0.0018 mol) en acetonitrilo (30 ml) se agitó a 80°C durante 15 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.27 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH 100/0 to 90/10). Se recogieron las fracciones puras y el el solvente se evaporó, produciendo 0.085 g (29%) del intermediario 6. d) Preparación del intermediario 7 Una mezcla del intermediario 6(0.0002 mol) en hidróxido de sodio 1 N (1.5 ml) y THF (3 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. Se agregó ácido clorhídrico 1 N (1.5 ml). La mezcla se evaporó a sequedad, produciendo el intermediario 7. Este producto se usó directamente en el próximo paso de la reacción. e) Preparación del intermediario 8 Una mezcla del intermediario 7(0.0002 mol), 0-(tetrahidro-2H-píran-2-il)- hidroxilamina (0.0002 mol), EDC (0.0002 mol), HOBT (0.0002 mol) y trietílamina (0.0002 mol) en DCM/THF (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.095 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.04 g (41 %) del intermediario 8.
EJEMPLO A3 a) Preparación del intermediario 11 Se agregó etilato de titanio (0.0085 mol) a temperatura ambiente a una solución de etiléster del ácido 2-(1-piperazinil)-5-pirim¡dincarboxílico (0.0042 mol) y 4-fenil-3-buten-2-ona (0.0051 mol) en 1 ,2-dicloro-etano (45 ml) bajo corriente de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Luego se agregó NaBH(OAc)3 (0.0085 mol). La mezcla se agitó durante 5 horas y se vertió en agua con hielo. Se agregó DCM. La mezcla se filtró en celite. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.16 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH 100/0 a 5/5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.12 g (8%) del intermediario 11 . b) Preparación del intermediario 12 Una mezcla del intermediario 11 (0.0003 mol) e hidróxido de sodio (0.0013 mol) en EtOH (15 ml) se agitó y reflujo durante 3 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se tomó con dietil éter. El precipitado se filtró y secó produciendo 0.12 g (100%) del intermediario 12, punto de fusión > 260°C. c) Preparación del intermediario 13 Se agregaron EDC (0.0006 mol) y HOBT (0.0006 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 12 (0.0003 mol) en THF (15 ml) y DCM (15ml) bajo corriente de N2. La mezcla se agitó durante 15 minutos. Luego se agregó O-(tetrahidro-2/- -piran-2-il)-hidroxilamina (0.0006 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO- , se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.25 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH 100/0 a 95/5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.1 g (70%) del intermediario 13 .
EJEMPLO A4 a) Preparación del intermediario 14 Una mezcla de éster etílico del ácido 2-(1-piperazinil)-5-pírimidincarboxílico (0.059 mol) en THF (300 ml) e hidróxido de sodio 1 N (300 ml) se dejó en reposo durante toda la noche a temperatura ambiente y luego se agitó. Se agregó ácido clorhídrico 1 N (300 ml) y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Se agregó carbonato de sodio (0.178 mol) y la mezcla resultante se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó en pequeñas porciones 1 -[[(9/- -fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi]-2,5-pirrolidindiona (0.059 mol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla se acidificó con HCl concentrado y el precipitado se filtró y secó produciendo 22.5 g (90%) del intermediario 14 , punto de fusión 218.5-221.2°C b) Preparación del intermediario15 Se agregaron trietilamina (0.069 mol), luego EDC (0.0303 mol) y HOBT (0.0303 mol) seguidos por 0-(tetrahídro-2H-piran-2-¡l)-hidrox¡lamina (0.0303 mol) a una mezcla del intermediario 14 (0.0233 mol) en DCM/THF (500 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se diluyó con DCM y se lavó con agua. La fase orgánica se separó, se lavó con una solución de carbonato de sodio al 10%. La fase orgánica separada se secó (MgS0 ), filtró y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante una columna cromatográfica Instantánea, (eluyente: DCM/MeOH 100/0 -> 97.5/2.5 en 100 minutos.) Las fracciones del producto se recogieron y el solvente se evaporó, produciendo 8.4 g (68 %) del intermediario 15. c) Preparación del intermediario 16 Una mezcla del intermediario 15 (0.016 mol) en piridina (0.040 mol) y DCM (200 ml) se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se extrajo con agua, luego la fase acuosa se concentró y co-evaporó con' acetonitrilo. El residuo (3.5 g) residuo se purificó mediante una columna cromatográfica Instantánea (eluyente: DCM/MeOH/NH3) 95/5/0.5). Las fracciones del producto se recogieron y el solvente se evaporó, produciendo 2.5 g (50%) del intermediario 16, punto de fusión 70.8-93.9°C. d) Preparación del intermediario 17 Una mezcla del intermediario 16 (0.002 mol), (E) ácido [2-(4-fluorofenílo)etenil]-borónico (0.002 mol) y 1 ,4-dioxan-2,5-díol (0.002 mol) en EtOH (25ml) se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas, se vertió sobre hielo. Luego se agregó NaHC?3. La mezcla se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.68 g) se purificó mediante una columna cromatográfica sobre cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH 100/0 a 90/10). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.27g (29%) del intermediario 17, punto de fusión 90°C.
EJEMPLO A5 a) Preparación del intermediario 18 Se agregaron ácido 2-oxo-propanoico (0.0169 mol), luego éster etílico del ácido 2-(1-piperaz¡nil)-5-pirim¡dincarboxíl¡co (0.0169 mol) a una solución de ácido [2-(4-fluorofenilo)etenil]-borónico (0.0169 mol) en DCM (150 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego se agregaron ácido 2-oxo-propanoico (0.4 eq) y ácido [2-(4-fluorofenilo)etenil]-borónico (0.1 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La fase orgánica se lavó con agua, se secó (MgSO4), filtró y el solvente se evaporó. El residuo (7.7 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo (6g) se disolvió en HCl 3N. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El precipitado se filtró, se lavó con agua (cantidad mínima) y se secó, produciendo 2.8 g (36%) del intermediario 18. b) Preparación del intermediario 19 HOBT (0.0022 mol) y luego EDC (0.0022 mol) se agregaron a una solución del intermediario 18 (0.0015 mol), ?/-metil-metanam¡na (0.0022 mol) y trietilamina (0.0075 mol) en DCM/THF (40 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se retiró con DIPE. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.58 g (85%) del intermediario 19, punto de fusión 195°C. c) Preparación del intermediario 20 Una mezcla del intermediario 19 (0.0011 mol) e hidróxido de litio (0.0023 mol) en THF (20 ml) y agua (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego se agregó HCl 3N. THF se evaporó. El precipitado se filtró, se lavó con agua, luego con dietil éter y se secó, produciendo 0.45 g (82%) del intermediario 20. d) Preparación del intermediario 21 Se agregaron HOBT (0.0014 mol) y luego EDC (0.0014 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 20 (0.0009 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0014 mol) y trietílamina (0.0043 mol) en DCM/THF (50/50) (75 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS0 ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.7 g) se purificó medíante una columna cromatográfica de gel de sílice (5 µm)(eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.1 a 94/6/0.6). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.38 g (75%) del intermediario 21.
EJEMPLO A6 a) Preparación del intermediario 22 Se agregó por porciones hidruro de sodio al 60% (0.0085 mol) a 5°C a una solución del intermediario 1 (0.0065 mol) en THF (60 ml) bajo corriente de N2. La mezcla se agitó a 5°C durante 15 minutos. Luego se agregó gota a gota una solución de yodometano (0.0078 mol) en THF (5 ml). La mezcla se agitó a 5°C durante 1 hora, luego se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas, se vertió sobre hielo y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.75 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH 99/1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.87 g (34%) del intermediario 22. b) Preparación del intermediario 23 Una mezcla del intermediario 22 (0.0027 mol) e hidróxido de litio monohidratado (0.0055 mol) en THF (40 ml) y agua (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y se acidificó con HCl 1 N. THF se evaporó. El precipitado se filtró, se lavó con una cantidad mínima de agua y se secó, produciendo: 0.91 g (83%) del intermediario 23. c) Preparación del intermediario 24 Se agregaron HOBT (0.0033 mol) y luego EDC (0.0033 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 23 (0.0022 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0033 mol) y trietilamina (0.01 mol) en DCM/THF (90 ml) bajo corriente de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS0 ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.3 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.93 g (89%) del intermediario 24.
EJEMPLO A7 a) Preparación del intermediario 25 Una mezcla de éster etílico del ácido 2-(1-piperazinil)-5-piridilcarboxílico (0.0085 mol), 1 ,4-dioxan-2,5-diol (0.0093 mol) y ácido (E)-[2-(4-fluorofenílo)etenil]- borónico (0.0042 mol) en EtOH (200 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas y luego se filtró. El filtrado se evaporó. El residuo se retiró con EtOAc. La fase orgánica se lavó con solución de NaCI saturado, se secó (MgS04), filtró y el solvente se evaporó. El residuo (3.3 g) se disolvió en dietil éter y se acidificó gota a gota mediante la adición a 5°C de HCl 5-6N en isopropanol (2 ml). El precipitado se filtró, se lavó con dietil éter y se secó. Esta fracción se retiró con agua, se agregó K2C03 y la mezcla se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS0 ), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 2.7 g (79%) del intermediario 25. b) Preparación del intermediario 26 Una mezcla del intermediario 25 (0.002 mol), hidróxido de litio (0.004 mol) en agua (20 ml) y THF (40 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla se concentró. Se agregó ácido clorhídrico 3N. El precipitado se filtró, se lavó con agua, luego con dietil éter y se secó, produciendo 0.52 g (63%) del intermediario 26. c) Preparación del intermediario 27 Se agregaron trietilamina (0.0057 mol), ??-íetilcarbonimidoil)-?/,?-dimetil-1 ,3-propandiamina (0.0019 mol), 1-hídroxi-1H-benzotriazol (0.0019 mol) y 0-(tetrahidro-2H-piran-2-¡l)-hidroxilamina (0.0019 mol) a una mezcla del intermediario 26 (0.0012 mol) en una mezcla de DCM (50 ml) y THF (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente, luego se vertió en H20 y se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se purificó medíante una columna cromatográfica de gel de sílice (gradiente de eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2). Las fracciones del producto se recogieron y el solvente orgánico se evaporó, produciendo 0.55 g (91 %). Este residuo se tomó en dietíl éter, el precipitado se filtró y secó produciendo 0.5 g del intermediario 27, punto de fusión 133°C.
EJEMPLO A8 Preparación del intermediario 28 y 29 intermediario 28: base libre intermediario 29: C2H2O (1 :1 ) Se agregó gota a gota anhídrido acético (0.014 mol) a 5°C, a una mezcla del intermediario 3 (0.0014 mol), 4-N-N-dimetilaminopiridina (0.0095 g) y piridina (2.5 ml) en DCM (14 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se concentró, se retiró en agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice (5 µm)(gradiente del eluyente: DCM/MeOH 95/5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente orgánico se evaporó, produciendo 0.48 g (58%) del intermediario 28. La sal de oxalato se preparó sobre una fracción (0.05 g) y se cristalizó de 2-propanona/dietil éter. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.042 g del intermediario 29, punto de fusión 154°C. El cuadro F-1 enumera los intermediarios que se prepararon de acuerdo con los ejemplos anteriores CUADRO F-1 (Intermediarios) B. Preparación de compuestos finales EJEMPLO B1 Preparación del compuesto 1 Una mezcla del intermediario 3 (0.00121 mol) en TFA (2.5 ml) y MeOH (50 ml) se agitó durante 48 horas y luego el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y solvente se evaporó. El residuo se retiró con dietil éter y el precipitado luego se filtró y se secó (vacío) a 50°C, produciendo 0.26 g (64%) de compuesto 1 , punto de fusión 187°C.
EJEMPLO B2 Preparación del compuesto 2 H2O .C2HF3O2 Una mezcla de intermediario 8 (0.00007 mol) en ácido trifluoroacético (0.2 ml) y MeOH (4.5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 96 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó en dietil éter/2-propanona. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.025 g (57%) de compuesto 2, punto de fusión 135°C.
EJEMPLO B3 Preparación del compuesto 7 (E) .C2HF3O2 Una mezcla del intermediario 13 (0.0002 mol) en TFA (0.5 ml) y MeOH (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, luego se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó de dietil éter. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.044 g (44%) de compuesto 7, punto de fusión 161 °C.
EJEMPLO B4 Preparación del compuesto 8 Una mezcla del intermediario 17 (0.0005 mol) en TFA (1.2 ml) y MeOH (24 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 5 días. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo (0.26 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 70/30/3). Se recogieron las fracciones puras y solvente se evaporó. El residuo (0.16 g) se cristalizó en dietil éter. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.13 g (66%) de compuesto 8, punto de fusión 180°C.
EJEMPLO B5 Preparación del compuesto 9 Una mezcla del intermediario 28 (0.0004 mol) en TFA (1 ml) y MeOH (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 96 horas y luego se evaporó. El residuo (0.23 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y solvente se evaporó. El residuo (0.106 g) se cristalizó en dietil éter/DIPE. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.067 g (34%) de compuesto 9, punto de fusión 161 °C.
EJEMPLO B6 Preparación del compuesto 10 .C2HF3O2.H20 Se agregó gota a gota TFA (1.9 ml) a 5°C a una solución del intermediario 21 (0.0007 mol) en MeOH (38 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y luego se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó en dietil éter/CH3CN. El precipitado se filtró, se lavó con dietil éter y se secó, produciendo 0.24 g (62%) de compuesto 10, punto de fusión 146°C.
EJEMPLO B7 Preparación del compuesto 11 Una mezcla del intermediario 24 (0.0018 mol) en TFA (4.4ml) y MeOH (87 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 4 días, y luego se evaporó a sequedad. El residuo (1.05 g) se purificó mediante una columna cromatográfica de gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H20 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y solvente se evaporó. Esta fracción (0.634 g) se retiró en dietil éter. El precipitado se filtró, se lavó con dietil éter y se secó, produciendo 0.43 g de compuesto 11 , punto de fusión 212°C.
EJEMPLO B8 Preparación del compuesto 31 Una mezcla del intermediario 27 (0.0011 mol) en ácido trifluoroacétíco (3 ml) y MeOH (60 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó en dietil éter. El precipitado se filtró, se lavó con dietil éter y se secó, produciendo 0.515 g (89%) de compuesto 31 , punto de fusión 145°C. El cuadro F-2 enumera los compuestos que se prepararon de acuerdo con los ejemplos anteriores. Las siguientes abreviaturas se usaron en los cuadros: .C2HF3O2 significa la sal trifluoroacetato.
CUADRO F-2 (Compuestos finales) C. Ejemplo farmacológico: El ensayo in vitro para inhibición de histona desacetilasa (véase ejemplo C.1 ) mide la inhibición de la actividad enzimática de HDAC obtenida con los compuestos de fórmula (I). La actividad celular de los compuestos de fórmula (I) se determinó en las células tumorales A2780 mediante un ensayo colorimétrico para la toxicidad o supervivencia celular (Mosmann Tim, Journal of Immunologícal Methods 65: 55-63, 1983) (véase ejemplo C.2). La solubilidad de un compuesto mide la capacidad de un compuesto para permanecer en solución. En un primer método se mide la capacidad de los compuestos para permanecer en solución por dilución (ver ejemplo C.3. a). Las soluciones de DMSO se diluyen con un único solvente regulador de pH acuoso en tres etapas consecutivas. Para cada dilución se mide la turbidez con un nefelómetro. En un segundo método se puede medir la solubilidad de los compuestos a diferentes pH mediante el uso de un detector quimioluminiscente de nitrógeno (ver ejemplo C.3.b).
La permeabilidad del fármaco expresa su capacidad para moverse de un medio a otro o a través de otro, especialmente su capacidad para atravesar la membrana intestinal e ingresar al torrente sanguíneo y/o del torrente sanguíneo hacia su objetivo. La permeabilidad (ver ejemplo C.4) se puede medir mediante una membrana artificial formada por una bicapa de fosfolípidos que actúa como un filtro inmóvil. En el ensayo de la membrana artificial con filtro inmóvil, se forma un "sandwich" con una placa de 96 pocilios de microtitulación y una placa filtro de 96 pocilios, de manera tal que cada pocilio de compuesto está dividido en dos cámaras con una solución donadora en el fondo y una solución aceptora en el extremo superior, separados por un disco de microfiltración de 125 µm (poros de 0.45 µm), recubierto con solución de dioleoilfosfatidílcolina en dodecano al 2% (p/v) en condiciones tales que la bicapa multilaminar se forme dentro de los canales de filtración cuando el sistema se pone en contacto con la solución acuosa del regulador de pH. La permeabilidad de los compuestos a través de la membrana artificial se mide en cm/s. El objetivo es buscar la permeación de los fármacos a través de una membrana artificial paralela a 2 valores de pH diferentes: 4.0 y 7.4. La detección de los compuestos se realiza con espectrometría UV a una longitud de onda óptima entre 250 y 500 nm. El metabolismo de los fármacos se refiere a compuestos liposolubles xenobióticos o endobiótícos que se transforman enzimátícamente en (a) metabolito(s) hidrosolubles polares y excretables. El principal órgano para metabolizar los fármacos es el hígado. Los productos metabólícos son con frecuencia menos activos que el fármaco original, o inactivos. Sin embargo algunos metabolítos pueden aumentar su actividad o efectos tóxicos. En consecuencia el metabolismo de los fármacos incluye los procesos de "detoxifícación" y "toxicación". Uno de los sistemas enzimáticos más importantes que determinan la capacidad del organismo de encargarse de los fármacos y productos químicos está representado por las monooxigenasas del citocromo P450. las cuales son enzimas NADPH-dependientes. La estabilidad metabólica de los compuestos se puede determinar in vitro mediante el uso de tejido subcelular humano (ver ejemplo C.5.a.). En esta memoria descriptiva la estabilidad de los compuestos se expresa como % del fármaco metabolizado después de 15 minutos de incubación de estos compuestos con microsomas. La cuantificacíón de los compuestos se determinó mediante análisis por LCMS. La estabilidad metabólica de los compuestos también se puede determinar con el cálculo de la vida medía de los compuestos en los hepatocitos celulares de ratas, (ver ejemplo C.5.b.). Se ha demostrado que una amplia variedad de agentes antitumorales activan la proteína p21 , incluyendo los agentes que dañan el ADN y los inhibidores de histona desacetilasa. Los agentes que dañan el ADN activan el gen p21 mediante el supresor tumoral p53, mientras que los inhibidores de histona desacetilasa activan de manera transcripcional el gen de p21 por medio de la transcripción del factor Sp1. De esta manera, los agentes que dañan el ADN activan al promotor p21 medíante los elementos que responden al p53 mientras que los inhibidores de histona desacetílasa activan al promotor p21 por medio de los sitios sp1 (localizados en la región -60 pb a +40 pb respecto de la caja TATA) y ambos aumentan la expresión de la proteína p21. Cuando el promotor p21 en una célula consiste en un fragmento del promotor p21 de 1300 bp que no comprende los elementos que responden a p53, por consiguiente éste no es respondedor a agentes que dañan el ADN. Se puede evaluar la capacidad de los compuestos para inducir p21 de varias maneras. Un primer método es tratar a las células tumorales con los compuestos de interés y luego lisar las células para detectar la inducción de p21 con el ensayo de inmunoabsorbancia ligado a enzimas (WAF1 ELISA de Oncogene). El ensayo de p21 es un inmunoensayo "sandwich" que emplea anticuerpos monoclonales de ratón y policlonales de conejo. Un anticuerpo policlonal de conejo, específico para la proteína p21 humana, ha sido inmovilizado en la superficie de los pocilios plásticos provistos por el equipo de ensayo. Cualquier cantidad de p21 presente en la muestra de ensayo se unirá al anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclonal detector biotinilado también reconoce proteínas p21 humanas, y se unirá a cualquier p21 , el cual está retenido por el anticuerpo de captura. El anticuerpo detector, a su vez, está unido a la estreptoavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. La peroxidasa de rábano cataliza la conversión del sustrato cromogénico tetra-metilbencidina de una solución incolora a una solución azul (o amarilla después de la adición de reactivo de detención), la intensidad del cual es proporcional a la cantidad de proteína p21 unida a la placa. El producto de reacción de color se cuantífica con un espectrofotómetro. La cuantificación se realiza mediante la construcción de una curva estándar empleando concentraciones conocidas de p21 (provistas liofilizadas). Este ensayo puede medir la inducción de p21 como consecuencia de la inhibición del daño al ADN o como consecuencia de la inhibición de histona desacetilasa (ver ejemplo C.6.a.). Otro método ensaya la capacidad de los compuestos para inducir p21 como consecuencia de la inhibición de HDAC a nivel celular. Las células se pueden transfectar en forma estable con un vector de expresión que contenga fragmentos del promotor p21 de 1300 pb que no comprenda a los elementos que responden a p53 y en el que un aumento de la expresión de un gen reportero, comparado con los niveles controles, identifica los compuestos que tienen capacidad de inducción de p21. El gen reportero es una proteína fluorescente y la expresión del gen reportero se mide como la cantidad de luz fluorescente emitida. (Ver ejemplo C.6.b). El último método es un método in vivo en el que se usan ratones para controlar la actividad farmacéutica de los compuestos. Las células tumorales transformadas en forma estable, tal como se describió anteriormente, se pueden administrar a los ratones en cantidad suficiente para producir la formación de un tumor. Una vez que las células tumorales tuvieron el tiempo suficiente para formar un tumor, se puede administrar el compuesto potencialmente activo a los animales y el efecto de dichos compuestos sobre las células tumorales se evalúa midiendo la expresión del gen reportero. La incubación con los compuestos farmacéuticos activos producirá un aumento de la expresión del gen reportero comparada con los niveles de control (ver ejemplo C.6.C.). Los inhibidores específicos de HDAC no deberían inhibir a otras enzimas como las abundantes proteínas CYP P450. Las proteínas CYP P450 (expresadas en E coli) 3A4, 2D6 y 2C9 convierten sus sustratos específicos en moléculas fluorescentes. La proteína CYP3A4 convierte 7-benciloxitrifluorometil cumarina (BFC) en 7-hidroxi-trifluorometil cumarina. La proteína CYP2D6 convierte 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoxi-4-metílcumarina (AMMC) en clorhidrato de 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-h¡droxi-4-metílcumarina y la proteína CYP2C9 convierte 7-metoxi-4-trifluorometílcumarina (MFC) en 7-hidroxi-trifluorometil- cumarina. Los compuestos que inhiben las reacciones enzimátícas producirán una disminución de la señal fluorescente (ver ejemplo C.7).
EJEMPLO C.1 Ensayo tn Vitro de inhibición de histona desacetilasa Se usó el equipo de ensayo de actividad fluorescente HDAC/Drug Discovery de Biomol (cat.No: AK-500-0001 ). El ensayo de actividad fluorescente HDAC se basa en el substrato Fluor de Lys ([¡sil histona desacetilasa fluorogénica) y la combinación del desarrollador. El substrato Fluor de Lys, comprende una cadena lateral de lisina acetilada. La desacetilación del substrato sensibiliza al substrato de modo que en un segundo paso, el tratamiento con el desarrollador de Fluor de Lys produce un fluoróforo. Se incubaron extractos nucleares de HeLa (proveedor: Biomol) de 60 µg/ml con substrato 75 µM. Se agregó el substrato Fluor de Lys a un regulador de pH que contenía Tris 25 mM, NaCI 137 mM, KCl 2.7 mM y MgCI2.6H2O 1 mM a pH 7.4. Después de 30 min, se agregó 1 volumen del desarrollador. El fluoróforo se excitó con luz de 355 nm y la luz emitida (450 nm) se detectó en un lector de placas fluorométrico. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (que contenían extracto nuclear HeLa y regulador de pH), un blanco de incubación (que contenía regulador de pH pero no tenía extracto nuclear HeLa) y muestras (que contenían muestras disueltas en DMSO y diluidas adicíonalmente en regulador de pH, y extractos nucleares HeLa). En primera instancia, los compuestos se ensayaron con una concentración de 10"5M. Para los compuestos que tienen actividad a 10"5M, se hizo una curva de concentración-respuesta en la que se ensayaron los compuestos con concentraciones entre 10"5M y 10"9M. Todas las muestras se ensayaron cuatro veces. En cada ensayo se restó el valor del blanco a los valores de los controles y las muestras. La muestra control representaba el 100% de desacetilación del substrato. Para cada muestra la fluorescencia se expresó como porcentaje del valor promedio de los controles. Los valores apropiados de IC5o (concentración del fármaco que se necesita para reducir la cantidad de metabolitos al 50% del control) se calcularon mediante análisis probit para datos graduados. En la presente memoria los efectos de los compuestos de ensayo se expresaron como pICso (el logaritmo negativo del valor de la IC50) (ver cuadro F-3).
EJEMPLO C.2 Determinación de la actividad antiproliferativa de las células A2780 Todos los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO y luego se hicieron diluciones adicionales en el medio de cultivo. Las concentraciones finales de DMSO nunca se excedieron de 0.1 % (v/v) en las pruebas de proliferación celular. Los controles contenían células A2780 y DMSO sin compuestos y los blancos contenían DMSO pero no células. Se disolvió 5 mg/ml de MTT en PBS. Se preparó un regulador de pH de glicina que comprendía glicina 0.1 M y NaCI 0.1 M regulado a pH 10.5 con NaOH (1 N) (todos los reactivos eran de Merck). Se cultivaron células humanas de carcinoma ovárico A2780 (un obsequio del Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cáncer Centre, Pennsylvania, USA]) en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50 µg/ml de gentamicina y suero fetal de ternero al 10%. Las células se conservaron de forma habitual como cultivos de monocapas a 37°C en una atmósfera humidíficada de CO2 al 5%. Las células se trasladaron una vez por semana mediante una solución de trípsina/EDTA con una relación de corte de 1 :40. Todos los medios y suplementos se obtuvieron de Life Technologies. Las células estaban libres de contaminación con micoplasmas lo cual se determinó mediante el equipo de prueba genética de cultivo de micoplasma en tejidos (proveedor: BioMérieux). Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocilios en NUNC™ (proveedor: Life Technologies) y se permitió que se adhirieran al plástico durante toda la noche. Las densidades celulares usadas para colocar en las placas fueron de 1500 células por pocilio en un volumen total de 200 µl de medio. Después de la adhesión de las células a las placas, se cambió el medio y se agregaron fármacos y/o solventes a un volumen final de 200 µl. Luego de cuatro días de incubación, el medio se reemplazó con 200 µl de medio fresco y se midió la densidad celular y la viabilidad por medio de un ensayo basado en MTT. Se agregaron 25 µl de solución MTT a cada pocilio y las células se incubaron después durante 2 horas a 37°C. Luego se aspiró con cuidado el medio y el producto de formazam-MTT azul se solubilizó mediante el agregado de 25 µl de regulador de pH de glicina seguido por 100 µl de DMSO. Las microplacas de ensayo se agitaron durante 10 minutos en un agitador de microplacas y se midió la absorbancia a 540 nm con un espectrofotómetro Emax de 96 pocilios (proveedor: Sopachem). Dentro de un experimento, los resultados para cada situación experimental son la media de los pocilios por triplicado. Con propósitos inicíales de selección, los compuestos se ensayaron con una única concentración fija de 10~6 M. Para los compuestos activos, los experimentos se repitieron para establecer curvas de concentración-respuesta completas. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (que no contienen fármaco) y un blanco de incubación (que no contiene células ni fármaco). El valor del blanco se restó de los valores de los controles y las muestras. Para cada muestra, el valor medio de crecimiento celular (en unidades de absorbancia) se expresó como un porcentaje del valor medio del crecimiento celular del control. Los valores de IC50 (concentración del fármaco que se necesita para reducir el crecimiento celular al 50% del control) se calcularon mediante análisis probit para datos graduados (Finney, D.J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). En la presente memoria descriptiva los efectos de los compuestos de ensayo se expresaron como plC50 (el logaritmo negativo del valor de IC50)(ver cuadro F-3).
EJEMPLO C.3 Solubilidad/Estabilidad C.3. a Cinética de la solubilidad en medio acuoso En el primer paso de dilución, se agregaron 10 µl de una solución concentrada de los compuestos activos, solubilizado en DMSO (5 mM), a 100 µl de regulador de pH citrato-fosfato pH 7.4 y se mezcló. En el segundo paso de dilución, una alícuota (20 µl) del primer paso de dilución se dispensó después en 100 µl del regulador de pH citrato-fosfato pH 7.4 y se mezcló. Finalmente en el tercer paso de dilución, una muestra (20 µl) del segundo paso de dilución se diluyó después en 100 µl regulador de pH citrato- fosfato pH 7.4 y se mezcló. Todas las diluciones se realizaron en placas de 96 pocilios. Inmediatamente después del último paso de dilución se midió la turbidez de los tres pasos consecutivos de dilución con un nefelómetro. La dilución se hizo por triplicado para cada compuesto para excluir errores ocasionales. Se llevó a cabo una categorización de tres clases basadas en las mediciones de turbidez. A los compuestos de alta solubilidad se les asignó un puntaje de 3 y para estos compuestos la primera dilución es límpida. Los compuestos con solubilidad media obtuvieron un puntaje de 2. Para estos compuestos la primera dilución no es turbia y la segunda es límpida. Los compuestos con baja solubilidad obtuvieron un puntaje de 1 y para estos compuestos la primer y segunda dilución no son límpidas (ver cuadro F-3).
C.3.b. Solubilidad También se puede medir la solubilidad de un compuesto, a diferentes pH, por medio de un detector quimioluminiscente de nitrógeno (ver cuadro F-3).
EJEMPLO C.4 Análisis de la permeabilidad con una membrana artificial paralela Las muestras de abastecimiento (alícuotas de 10 µl de una solución de abastecimiento 5 mM en DMSO 100%) se diluyeron en un pocilio profundo o en una placa de premezcla que contenía 2 ml de un sistema regulador de pH acuoso a pH 4 o pH 7.4 (PSR4 Sistema de Solución Concentrada (plON)). Antes que las muestras se agregaran a la placa de referencia, se agregaron 150 µl de regulador de pH a los pocilios y se llevó a cabo un blanco de medición de UV. Luego se descartó el regulador de pH y la placa se usó como placa de referencia. Toda las mediciones se hicieron en placas resistentes al UV (proveedor: Costar o Greiner). Después del blanco de medición de la placa de referencia, se agregaron 150 µl de las muestras diluidas a la placa de referencia y se agregaron 200 µl de las muestras diluidas a la placa donadora 1. Una placa aceptora con filtro (proveedor: Millipore, tipo:MAIP N45) se cubrió con 4 µl de la solución para formar la membrana artificial (1 ,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-fosofocolina en dodecano que contenía 2,6-di-terbutil-4-metilfenol al 0.1 %) y se colocó en el extremo superior de la placa donadora 1 para formar un "sandwich". El regulador de pH (200 µl) se dispensó en los pocilios aceptores del extremo superior. El _sandwich_se cubrió, con una tapa y se conservó durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. El blanco de medición de la placa aceptora 2 se preparó mediante la adición de 150 µl de regulador de pH a los pocilios, seguido de una medición de UV. Después de la medición del blanco de la placa aceptora 2, se descartó el regulador de pH y se transfirieron 150 µl de la solución aceptora de la placa aceptora con filtrol a la placa aceptora 2. Luego la placa aceptora con filtrol se retiró del sandwich. Luego se transfirieron el blanco de medición de la placa donadora 2 (ver lo descrito anteriormente) y 150 µl de la solución donadora de la placa donadora 1 a la placa aceptora 2. El espectro UV de la placa donadora 2, la placa aceptora 2 y los pocilios de la placa de referencia se midieron (con un SpectraMAX 190). Todos los espectros se procesaron para calcular la permeabilidad con el programa de cómputo PSR4p Command Software. Todos los compuestos se midieron por triplicado. Se usaron carbamacepina, gríseofulvina, acicloguanisina, atenolol, furosemida y clorotiazida como patrones en cada experimento. Los compuestos se dividieron en 3 categorías de acuerdo a su permeabilidad, se consideró baja permeabilidad (efecto medio <0.5 x 10"6 cm/s; puntaje 1 ), permeabilidad media (1 x 10"6 cm/s > efecto medio >0.5 x 10~6 cm/s; puntaje 2) o permeabilidad alta (> 1 x 10"6 cm/s; puntaje 3).
EJEMPLO C.5 Estabilidad metabólica Ejemplo C. 5.a Se hicieron preparaciones de tejidos subcelulares de acuerdo con Gorrod er al. (Xenobiotica 5: 453-462, 1975) mediante la separación por centrifugación después de la homogenización mecánica del tejido. El tejido hepático se enjuagó con regulador de pH Tris-HCl 0.1 M en baño de hielo (pH 7.4) para lavar el exceso de sangre. Luego se secó, se pesó y se cortó de manera grosera con tijeras quirúrgicas. Los fragmentos de tejido se homogenizaron en 3 volúmenes de regulador de pH fosfato 0.1 M en baño de hielo (pH 7.4) usando un Potter-S (Braun, Italy) provisto de un pilón de Teflon o un homogenizador Sorvall Omni-Mix, durante 7 a 10 seg. En ambos casos, los recipientes se conservaron en/sobre hielo durante todo el procedimiento de homogenización. Los homogenatos de tejido se centrifugaron a 9000 x g durante 20 minutos a 4°C usando una centrífuga Sorvall o una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante resultante se conservó a -80 °C y se denominó 'S9'. La fracción S9 después se puede centrifugar a 100.000 x g durante 60 minutos (4°C) usando una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante resultante se aspiró con cuidado, se dividió en alícuotas y se denominó 'citosol'. La pella se resuspendió en regulador de pH fosfato 0.1 M (pH 7.4) en un volumen final de 1 ml por 0.5 g de peso original de tejido y se denominó 'microsomas'. Todas las fracciones subcelulares se dividieron en alícuotas, e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Para las muestras de ensayo, la mezcla de incubación contenía PBS (0.1 M), compuesto (5 µM), microsomas (1 mg/ml) y un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 0.8 mM, cloruro de magnesio 0.8 mM y 0.8 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). Las muestras de control contenían el mismo material pero los microsomas se reemplazaron por microsomas inactivados por calor (10 minutos a 95 grados Celsius). La recuperación de los compuestos de las muestras de control fue siempre del 100%. Las mezclas se preincubaron durante 5 minutos a 37 grados Celsius. La reacción comenzó a tiempo cero (t = 0) con la adición de NADP 0.8 mM y las muestras se incubaron durante 15 minutos (t = 15). La reacción se terminó con la adición de 2 volúmenes de DMSO. Luego las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 900 x g y los sobrenadantes se conservaron a temperatura ambiente durante un tiempo no mayor de 24 horas antes del análisis. Todas las incubaciones se realizaron por duplicado. El análisis del sobrenadante se realizó con análisis LC-MS. La elución de muestras se realizó en Xterra MS C18 (50 x 4.6 mm, 5 µm, Waters, US). Se usó un sistema de HPLC Alliance 2790 (proveedor: Waters, US) HPLC. La elución se realizó con regulador de pH A (acetato de amonio 25 mM pH 5.2) en H2O/acetonitrilo (95/5)), el solvente B fue acetonitrilo y el solvente C metanol con un caudal de flujo de 2.4 ml/min. El gradiente empleado consistió en aumentar las concentraciones de la fase orgánica de 0% hasta 50% de B y 50% de C en 5 minutos, hasta 100% de B en 1 minuto de forma lineal y la concentración de la fase orgánica se mantuvo estacionaria durante 1.5 minutos adicionales. El volumen total de inyección de las muestras fue de 25 µl. Se usó como detector un espectrómetro de masa triple cuadripolar Quattro (proveedor: Mícromass, Manchester, UK) adecuado con fuente ESI. La fuente y la temperatura de desolvatación se fijaron en 120 y 350°C respectivamente y se usó nitrógeno como gas nebulizador y de secado. Los datos se obtuvieron en modo de barrido positivo (reacción de ion único). El voltaje del cono se fijó en 10 V y el tiempo de residencia fue de 1 segundo. La estabilidad metabólica se expresó como % de metabolización del compuesto después de 15 minutos de incubación en presencia de microsomas activos (E(act)) (% de metabolización = 100% -((Corriente Iónica Total (TIC) de E(activídad) a t=15/TIC de E(actividad) a t=0) x 100). Los compuestos que tenían un porcentaje de metabolízación menor del 20% se definieron como de alta estabilidad metabólica. Los compuestos que tuvieron una metabolización entre 20 y 70% se definieron como de estabilidad intermedia y los compuestos que presentaron un porcentaje de metabolización superiores al 70% se definieron como de baja estabilidad metabólica. Se emplearon tres compuestos de referencia que siempre se incluyen como controles de estabilidad metabólica. Verapamil se incluyó como compuesto con baja estabilidad metabólica (% de metabolización = 73%). Cisapríde se incluyó como compuesto con estabilidad metabólica media (% de metabolización 45%) y propanol se incluyó como compuesto con estabilidad metabólica intermedia a alta (25% de metabolización). Estos compuestos de referencia se usaron para validar el ensayo de estabilidad metabólica.
C.5.b: Estabilidad metabólica con cultivos celulares de hepatocitos de rata. Se aislaron hepatocitos de ratas macho Sprague Dowley. Los compuestos se disolvieron en una solución madre 5 mM en DMSO al 100% y se incubó hasta una concentración final de 5 µM a 0, 15, 30, 60 y 120 minutos con cultivos celulares de hepatocitos de rata (0.5 millón de células viables/0.5 ml) usando placas de 24 pocilios. Las muestras se prepararon para LC-MS por medio de la adición de dos volúmenes de DMSO. Las muestras se agitaron completamente y después se centrifugaron a 900 g durante 10 minutos (temperatura ambiente).
Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Se analizaron 50 µl del sobrenadante resultante con LC-MS. Para LC-MS, la elución de las muestras se realizó sobre una columna de Hypersil BDS C18 (50 x 4.6 mm, 5 µm, Thermohypersil, UK). El sistema de HPLC comprendía un sistema liberador Surveyor (Surveyor Inc., San José, US) equipado con dispositivo automático de muestreo Surveyor. La elución se realizó con regulador de pH A (acetato de amonio 10 mM (pH 6.9) en H2O/acetonitrilo (95:5)) y solvente B (acetonítrilo) con un caudal de flujo de 1 .2 ml/min. El gradiente empleado fue 0.5 min del solvente A como condición inicial seguida por concentraciones crecientes de la fase orgánica desde 0% B hasta 95% B por 2 minutos en forma lineal. Esta fase se mantuvo estacionaria durante otros 2 minutos y se redujo otra vez a 0% de B en 0.5 minutos.
El volumen total de inyección de las muestras fue de 50 µl. La temperatura del homo de la columna se mantuvo en 40°C. El flujo de LC se dividió para la detección por EM y 0.1 ml ingresó a la fuente. Se usó para la detección un espectrómetro de masa triple cuadripolar TSQ Quantum (Thermofinnigan, LaJolla, USA) adecuado con fuente ESI. El voltaje de la fuente fue de 3800 voltios, la temperatura del capilar de 300°C. El espectrómetro de masa se operó en modo de ion positivo en SIM ajustado a la masa de M+H con una amplitud de barrido de 1 Da a los fines de la cuantificación. El instrumental de control, la obtención y procesamiento de datos se llevaron a cabo usando el Software Xcalibur (ThermoFinnigan, San José, CA, U.S.A). La actividad metabólica de los compuestos en hepatocitos de rata se expresó como vida media in vitro. Como referencia, se usó el compuesto R306465 (WO03/76422) (vida media in vitro: 8 minutos). Se ensayó el compuesto 4 de la presente solicitud y tuvo una vida media in vitro de 23 minutos.
EJEMPLO C.6 Capacidad de inducción de p21 Ejemplo C.6.a: Ensayo de inmunoabsorbancia ligado a enzimas para p21 El siguiente protocolo se ha aplicado para determinar el nivel de expresión de la proteína p21 human en células de carcinoma ovárico A2780.
Las células A2780 (20.000 células/180 µl) se sembraron en placas de 96 micropocillos el medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50 µg/ml de gentamicina y suero fetal de ternero al 10%. 24 horas antes de la lisis de las células, se agregaron los compuestos con una concentración final de 10"5, 10"6, 10"7 y10"8 M. Todos los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO y luego se hicieron diluciones en el medio de cultivo. 24 horas después de la adición los compuestos, se eliminaron los sobrenadantes de las células. Las células se lavaron con 200 µl PBS en baño de hielo. Los pocilios se aspiraron y se agregaron 30 µl de regulador de pH de lisis (Tris. HCl 50 mM (pH 7.6), NaCI 150 mM, Nonidet p40 1 % y glicerol 10%). Las placas se incubaron durante toda la noche a -70 °C. El número apropiado de pocilios de mícrotitulación se retiraron de la bolsa de papel y se colocaron en un receptáculo de pocilios vacío. Se preparó una solución de trabajo del regulador de pH de lavado (1x) (concentrado para lavado de placas 20x: 100 ml de la solución concentrada 20 veces de PBS y agente tensioactivo. Contiene cloroacetamida al 2%). El estándar liofilizado de p21WAF se reconstituyó con H2O destilada y posteriormente se diluyó con diluyente de muestras (provisto en el equipo). Las muestras se prepararon con una dilución 1 :4 en el diluyente de muestras. Las muestras (100 µl) y los estándares de p21WAF1 (100 µl) se pipetearon en los pocilios adecuados y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocilios se lavaron 3 veces con el regulador de pH de lavadolx y luego se pipetearon 100 µl del reactivo de anticuerpo detector (una solución de anticuerpo monoclonal p21WAF1 biotinilado) en cada pocilio. Los pocilios se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se lavó tres veces con regulador de pH de lavado 1x. El conjugado 400x (conjugada estreptoavidina-peroxidasa: solución concentrada 400 veces) se diluyó y se agregaron 100 µl de la solución 1x a los pocilios. Los pocilios se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lavó 3 veces con regulador de pH de lavado 1x y 1 vez con H2O destilada. La solución de substrato (substrato cromogénico )(100 µl) se agregó a los pocilios y éstos se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La solución de detención se agregó a cada pocilio en el mismo orden en que previamente se agregó la solución de substrato. Se midió la absorbancia de cada pocilio usando un espectrofotómetro con lectora de placas de longitud de onda dual de 450/595 nm. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (no contenían fármaco) y un blanco de incubación (no contenía células ni fármaco). El valor del blanco se restó de todos los valores de los controles y las muestras. Para cada muestra, el valor de inducción de p21WAF1 (en unidades de absorbancia) se expresó como el porcentaje del valor de p21WAF1 presente en el control. El porcentaje de inducción mayor que 130% se definió como inducción significativa. Se ensayaron cuatro compuestos y todos presentaron inducción significativa.
Ejemplo C.6.b.: Método celular Las células A2780 (ATCC) se cultivaron en el medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM y gentamicina a 37°C en una incubadora humidificada con CO25%. Todas las soluciones de cultivo celulares son provistas por Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Otros materiales son provistos por Nunc. El ADN genómico se extrajo de las células proliferantes A2780 y se usaron como molde para el aislamiento de PCR alojada del promotor p21. La primera amplificación se llevó a cabo durante 20 ciclos a una temperatura de templado de 55°C usando el par de oligonucleótidos GAGGGCGCGGTGCTTGG y TGCCGCCGCTCTCTCACC con el ADN genómíco como molde. El fragmento resultante de 4.5 kb que contenía el fragmento-4551 a +88 relacionado con la caja TATA se reamplificó con los oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC para 20 ciclos con templado a 88°C produciendo un fragmento de 4.5 kb y después el par de oligonucleótidos TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con templado a 88°C produciendo un fragmento de 1.3 kb que contenía el fragmento -1300 a +88 relacionado con la caja TATA. Los sitios restringidos Xhol y Kpnl presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) se usaron para subclonación. El indicador de luciferasa se eliminó de pGL3 básica y se remplazó por el indicador ZsVerde (proveniente del plásmido pZsVerde1-N1 ) en los sitios restringidos de Kpnl y Xbal. pGL3-básica-ZsVerde-1300 se construyó por medio de la inserción del fragmento de 1.3 kb mencionado anteriormente de la región promotora de p21 humana dentro de pGL3-básica-ZsVerde en los sitios Xhol y Kpnl. Todas las enzimas de restricción son provistas por Boehringer Manheim (Alemania). Las células A2780 se inocularon en una placa de 6 pocilios con una densidad de 2 x105 células, se incubaron durante 24 horas, y se transfectaron con 2 µg de pGL3-básica-ZsVerde-1300 y 0.2 µg del nuevo vector pSV2 usando Lipofectamína 2000 (Invitrogen, Bruselas, Bélgica) tal como lo describe el fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días con G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y crecieron suspensiones celulares simples. Después de tres semanas, se obtuvieron clones simples. Los clones seleccionados A2780 se expandieron y se sembraron a razón de 10.000 células por pocilio en la placa de 96 pocilios. 24 horas después de la siembra, las células se trataron durante 24 horas adicionales con compuestos (que afectan el sitio sp1 de la región proximal del promotor p21 ). Luego, las células se fijaron con PFA al 4% durante 30 minutos y se tiñeron con colorante de Hoechst. El promotor de activación p21 llevó a la producción de ZsVerde y por lo tanto la fluorescencia se detectó con un Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Bruselas, Bélgica). Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (no contenían fármaco) y un blanco de incubación (no contenía células ni fármacos). El valor del blanco se restó de todos los valores de controles y muestras. Para cada muestra, el valor de inducción para p21 se expresó como el porcentaje del valor para p21 presente en el control. El porcentaje de inducción mayor de 130 % se definió como inducción significativa. Se ensayaron veintiséis compuestos y todos presentaron inducción significativa.
Ejemplo C.6.C.: Método in vivo Un clon seleccionado se inyectó por vía subcutánea (107 células/200 µl) en el flanco de ratones lampiños y se obtuvo un tumor de calibre medible después de 12 días. El día 12, a los anímales se les administró por vía oral o intravenosa en forma diaria durante 6 días el solvente y los compuestos 20-40 mpk (4-10 animales cada uno). Se evaluó la fluorescencia de los tumores por medio del sistema de imágenes corporales totales automatizadas de desarrollo propio (Estereomicroscopio fluorescente tipo Olympus® SZX12 equipado con filtro GFP y acoplado a una cámara CCD tipo JAI® CV-M90 controlado por un programa de cómputo basado en IMAQ Vision Software de National Instruments®). El compuesto R306465 (WO03/76422) se usó como referencia. Los compuestos se clasificaron en inactivos (sin fluorescencia medible), más débil, idéntico o mejor que R306465. El compuesto 1 se ensayó y resultó mejor que R306465 después de la administración oral.
EJEMPLO C.7 Capacidad de inhibición de P450 Todos los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO (5 mM) y la dilución posterior a la concentración de 5 x 10"4 M se hizo con acetonitrilo. Más diluciones se hicieron en regulador de pH de ensayo (regulador de pH fosfato de NaK 0.1 M pH 7.4) y la concentración final del solvente nunca fue mayor del 2%. El ensayo para la proteína CYP3A4 comprende 15 pmol de P450/mg proteína (en regulador de pH fosfato de NaK 0.01 M + KCl 1.15%), un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 3.3 mM, Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.4 U/ml, NADP 1.3 mM y MgCI2.6H2O 3.3 mM en regulador de pH de ensayo) por pocilio y los compuestos en un volumen total de ensayo de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C la reacción enzimátíca comenzó con la adición de 150 µM del substrato con sonda fluorescente-BFC en regulador de pH de ensayo. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se terminó después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Se incluyó ketoconazol (valor de IC5o = 3 X 10"8M) como compuesto de referencia en este experimento. El ensayo para la proteína CYP2D6 comprende 6 pmol de P450/mg proteína (en regulador de pH fosfato de NaK 0.01 M + KCl 1.15%), un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 0.41 mM, Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.4 U/ml, NADP 0.0082 mM y MgCI2.6H2O 0.41 mM en regulador de pH de ensayo) por pocilio y los compuestos en un volumen total de ensayo de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C la reacción enzímática comenzó con la adición del substrato con sonda fluorescente AMMC 3 µM en regulador de pH de ensayo. Después de una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Se incluyó quinidina como compuesto de referencia (valor de IC50 <5 X 10"8 M) en este experimento. El ensayo para la proteína CYP2C9 comprende 15 pmol de P450/mg proteína (regulador de pH fosfato de NaK 0.01 M + KCl 1.15%) por pocilio, un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 3.3 mM, Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.4 U/ml, NADP 1.3 mM y MgCI2.6H2O 3.3 mM en regulador de pH de ensayo) y los compuestos en un volumen total de ensayo de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C la reacción enzimática comenzó con la adición de del substrato 200 µM con sonda fluorescente MFC en regulador de pH de ensayo. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Se incluyó como compuesto de referencia el sulfafenazol (valor de IC5o = 6.8 X 10~7 M) en este experimento. Para los propósitos de selección inicial, los compuestos se ensayaron a una concentración única fijada en 1 X 10"5 M. Para los compuestos activos, los experimentos se repitieron para establecer la curva completa de concentración-respuesta. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (no contenían ningún fármaco) y un blanco de incubación (no contenía enzimas ni fármacos). Todos los compuestos se ensayaron por cuadruplicado. El valor del blanco se restó de todos los valores de controles y muestras. Para cada muestra, el valor medio de la actividad de P450 de la muestra (en unidades relativas de fluorescencia) se expresó como un porcentaje del valor medio de la actividad de P450 del control. El porcentaje de inhibición se expresó como 100% menos el valor medio de la actividad de P450 de la muestra. Cuando correspondió, se calcularon los valores de IC50 (concentración del fármaco que se necesita para reducir la actividad de P450 al 50% del control).
CUADRO F-3 D. Ejemplo de composición: Comprimidos recubiertos con película Preparación del núcleo del comprimido Una mezcla de 100 g del compuesto de fórmula (I), 570 g de lactosa y 200 g de almidón se mezclaron bien y se humectaron con una solución de 5 g de dodecil sulfato de sodio y 10 g de polivinil-pirrolidona en aproximadamente 200 ml de agua. La mezcla de polvo húmedo se tamizó, secó y tamizó otra vez. Luego se agregó 100 g de celulosa microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Todo se mezcló bien y se prensó en comprimidos, obteniéndose 10.000 comprimidos, cada uno conteniendo 10 mg del compuesto de fórmula (I).
Cubierta Se agregó a una solución de 10 g de metil celulosa en 75 ml de metanol desnaturalizado una solución de 5 g de etil celulosa en 150 ml de diclorometano. Luego se agregaron 75 ml de diclorometano y 2.5 ml de 1 ,2,3-propanotríol y se fundieron 10 g de políetilenglicol y disolvieron en 75 ml de diclorometano. La última solución se agregó a la primera y luego se agregaron 2.5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de polivinil-pirrolidona y 30 ml de suspensión concentrada de color y toda la mezcla se homogeneizó. El núcleo del comprimido se recubrió con la mezcla obtenida de esta manera en un aparato de recubrimiento.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto de fórmula (I), las formas ?/-óxidos, las sales de adición con ácidos aceptables para uso farmacéutico y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, en el cual cada X es independientemente N o CH; R1 es fenilo, naftalenilo o heterociclilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C?-6, alquiloxí de C?-6, polihaloalquilo de C?-6, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil C?-6carbonilamino, alquilsulfonilamino de C?-6, hidroxicarbonilo, alquiloxi Ci-ßcarbonilo, hidroxialquilo de C?-6, alquiloxi d-ßmetilo, aminometilo, alquil C?-6aminometílo, alquil C?-6carbonilaminometilo, alquil C?-6sulfonilamínometilo, aminosulfonilo, alquil C?.6aminosulfonilo o heterociclilo; R2 es hidrógeno, -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=O)-R6, o -CH2-NR7R8; donde cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hídroxi, alquíloxi de C?-6, alquiloxi C?_ 6alquiloxi C?-6, alquil Ci-ßcarboniloxi, piperazinilo, /V-metilpiperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, imidazolilo o triazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de hidroxi, alquiloxi de C?-6, amino o mono- o di(alquil C 6)amino, cicloalquilamino de C?-6, hidroxialquilamino de C?-6, piperazinilo, mono- o di(alquil C?-6)aminoalquilam¡no C?-6. ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo o tiomorfolinilo; cada R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C-?-6, alquil C1-6carbonilo, alquilsulfonilo de C?-6, o mono-o di(alquil C?-4)aminosulfonilo; R3 es hidrógeno, hidroxímetilo, aminometilo o mono- o di(alquil Ci-ß) aminometilo; R4 es hidrógeno o alquilo de C?-6; arilo como se menciona anteriormente es fenilo o naftalenilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C-?-6, alquíloxi de C-?-6, trifluorometilo, ciano o hídroxicarbonilo; y heterociclílo en los anteriores es furanilo, tíenilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolídinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolílo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridacinilo, pirimidinilo, piracinilo, piperazinilo, triacinilo, tritianílo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, ¡ndazolilo, benzoimidazolilo, benzotiazolílo, purinilo, quinolízinilo, quinolínilo, cinolinílo, ftalazínilo, quinazolínilo, quinoxalínilo o naftirídinílo; donde cada uno de dichos heterociclos está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de C-i. 6, ciano, amino, mono-o di(alquil C?- )amino. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada X es N; R1 es fenilo o fenilo opcionalmente sustituido con halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de Ci-ß, polihaloalquilo de C?-6 o arilo; R2 es -CH2-R5 o -C(=O)-R6; cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C?-6, alquiloxí C-i-ßalquiloxi C?-6, alquil C?. 6carboniloxi, ?/-metilpiperazinilo, morfolinilo o imídazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de alquilamíno de C1-6, cicloalquilamino de C-i. 6, hidroxíalquilamíno de C1-6, di(alquil C?-6)aminoalquilamino C?-6 o morfolinilo;
R3 es hidrógeno y R4 es hidrógeno o alquilo de C?-6.
3.- El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque cada X es N; R1 es fenilo o fenilo sustituido con halo; R2 es -CH2-R5; cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de C1-6, o alquil C?-6carboniloxi; R3 es hidrógeno; y R4 es hidrógeno.
4.- El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizado además porque dicho compuesto es el compuesto No,1 , el compuesto No, 8, el compuesto No,11 , el compuesto No, 9, el compuesto No, 33, el compuesto No, 34, el compuesto No, 7 o el compuesto No, 25. Compuesto No,1 Compuesto No. 8 Compuesto No. 11 Compuesto No. 33; .HCl; Compuesto No. 34; .HCl; enantiómero A enantiómero B Compuesto No. 7; .C2HF302; (E) Compuesto No. 25; enantiómero A
5.- Una composición farmacéutica que comprende vehículos aceptables para uso farmacéutico y como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
6.- Un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque los vehículos aceptables para uso farmacéutico y un compuesto de las reivindicaciones 1 a 4 se mezclan íntimamente.
7.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como medicamento.
8.- Uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
9.- Una combinación de un agente anti-neoplásíco y un inhibidor de HDAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10.- Un procedimiento de preparación de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por la reacción de un intermediario de fórmula (II) con un ácido apropiado para producir un ácido hidroxámico de fórmula (I),
11.- Un compuesto de fórmula (V), las formas ?/-óxidos, las sales de adición con ácidos aceptables para uso farmacéutico y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, en el cual cada X es independientemente N o CH; R1 es fenilo, naftalenilo o heterociclílo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente a partir de halo, alquilo de C-?-6, alquiloxi de C?-6, polihaloalquilo de C-?-6, arilo, hidroxi, ciano, amino, alquil C ßcarbonilamino, alquílsulfonilamino de C?-6, hidroxicarbonilo, alquiloxi C1-6carbonilo, hidroxialquilo de d-6, alquiloxi C?-6metilo, aminometilo, alquil C-i-ßamínometilo, alquil C?-6carbonilam¡nometilo, alquil Ci-ßsulfonilaminometilo, aminosulfonilo, alquil C?-6aminosulfonílo o heterociclilo; R2 es hidrógeno, -CH2-R5, trifluorometilo, -C(=O)-R6, o -CH2-NR7R8; donde cada R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, hidroxi, alquiloxi de Ci-ß, alquiloxi C-i. 6alquiloxi C1-6, alquil C?-6carbonilox¡, piperazinilo, ?/-metilpiperazin¡lo, morfolinilo, tiomorfolinilo, ¡midazolilo o triazolilo; cada R6 se selecciona independientemente de hidroxi, alquiloxi de C?-6, amino o mono- o di(alquil C-i. 6)am¡no, cicloalquilamíno de C1-6, hidroxialquilamíno de C?-6, piperazinilo, mono- o di(alquil C?-6)aminoalquilamíno C?-6, ?/-metilpíperazinílo, morfolinilo o tiomorfolinilo; cada R7 y R8 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquil C1-6carbonílo, alquilsulfonílo de C1-6, o mono-o di(alquil C?-4)aminosulfonilo; R3 es hidrógeno, hidroximetilo, amínometilo o mono- o di(alquil Ci-ß) amínometilo; R4 es hidrógeno o alquilo de Ci-ß; arilo como se menciona anteriormente es fenilo o naftalenilo; donde cada uno de dichos fenilo o naftalenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de C-?-6, trifluorometilo, ciano o hidroxicarbonilo; y heterociclilo en los anteriores es furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolínilo, pirolidinilo, dioxolilo, oxazolilo, tiazolílo, imidazolilo, imídazolinilo, imidazolídinilo, pirazolilo, pirazolínilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, ¡sotiazolilo, oxadiazolilo, triazolílo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridacinilo, pirimidinílo, piracinilo, piperazinilo, triacinilo, tritianilo, indolizinilo, indolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, indazolilo, benzoimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo o naftiridinílo; donde cada uno de dichos heterociclos está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de halo, alquilo de C?-6, alquiloxi de C?. 6, ciano, amino, mono-o di(alquil C?- )amino.
12.- Un procedimiento de preparación de un compuesto de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado por: a) la conversión de compuestos de fórmula (V), en los cuales R2 es -CH2OH, y R4 es hidrógeno, denominados en la presente compuestos de fórmula (V-a), en compuestos de fórmula (V), en los cuales R2 es diferente de -CH2OH, denominados en la presente compuestos de fórmula (V-b), por medio de reacciones conocidas en la técnica o transformaciones de grupos funcionales, y b) preparación de los compuestos de fórmula (V-a) en un solo paso haciendo reaccionar el intermediario de fórmula (VI), con 1 ,4-dioxano-2,5-diol y el ácido borónico apropiado de fórmula (Vil), en el cual R1 es tal como se definió anteriormente o c) preparación de los compuestos de fórmula (V-b) haciendo reaccionar el intermediario de fórmula (VI), con la cetona apropiada de fórmula (VIII), en la cual R1 y R2 son tales como se definieron anteriormente. (VI) (VIII) d) preparación de los compuestos de fórmula (V), en los cuales R2 es -COOH, denominados en la presente compuestos de fórmula (V-c), en un solo paso haciendo reaccionar el intermediario de fórmula (VI), con ácido 2-oxo-propanoico y el ácido borónico apropiado de fórmula (Vil), en la cual R1 es tal como se definió anteriormente, en un solvente adecuado y la posterior conversión en intermediarios de fórmula (V) en los cuales R2 es -C(=O)-R6, por medio de reacciones conocidas en la técnica o transformaciones de grupos funcionales. (VI) (VII)
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0307599A (pt) 2002-03-13 2005-02-01 Janssen Pharmaceutica Nv Derivados de sulfonilamino como inibidores de histona deacetilase
ES2307909T3 (es) 2002-03-13 2008-12-01 Janssen Pharmaceutica Nv Derivados de piperazinil, piperidinil y morfolinil como nuevos inhidbidores de la histona deacetilasa.
IL164007A0 (en) 2002-03-13 2005-12-18 Janssen Pharmaceutica Nv New inhibitors of histone deacetylase
MX2007001120A (es) 2004-07-28 2007-03-15 Janssen Pharmaceutica Nv Derivados de indolil alquil sustituidos como nuevos inhibidores de la histona desacetilasa.
EP1885710B1 (en) 2005-05-18 2015-08-19 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted aminopropenyl piperidine or morpholine derivatives as novel inhibitors of histone deacetylase
WO2007049262A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Berand Limited Methods and compositions for the promotion of neuronal growth and the treatment of asociality and affective disorders
JP5137849B2 (ja) 2006-01-19 2013-02-06 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ ヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしての置換インドリル−アルキル−アミノ−誘導体
US8114876B2 (en) 2006-01-19 2012-02-14 Janssen Pharmaceutica N.V. Pyridine and pyrimidine derivatives as inhibitors of histone deacetylase
DE602007001190D1 (de) 2006-01-19 2009-07-09 Janssen Pharmaceutica Nv Aminophenylderivate als neue inhibitoren von histondeacetylase
US8101616B2 (en) 2006-01-19 2012-01-24 Janssen Pharmaceutica N.V. Pyridine and pyrimidine derivatives as inhibitors of histone deacetylase
EP1839656A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-03 TopoTarget Germany AG Use of valproic acid for the topical treatment of mild to moderate acne vulgaris
CN101918389A (zh) * 2007-11-02 2010-12-15 梅特希尔基因公司 组蛋白脱乙酰酶抑制剂
CN101723896B (zh) * 2009-11-03 2012-10-31 山东大学 酪氨酸衍生物类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其应用
WO2012117421A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Orchid Research Laboratories Ltd Histone deacetylase inhibitors
KR101419836B1 (ko) * 2012-05-10 2014-07-16 서울대학교산학협력단 Δ5-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물
KR101586045B1 (ko) 2013-07-30 2016-01-15 충북대학교 산학협력단 신규 페닐티아졸 기반 히드록삼산 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물
KR102132078B1 (ko) 2018-09-20 2020-07-08 원광대학교산학협력단 방향족 화합물, 아민 및 친핵체를 이용한 3가지 성분 반응으로 1-에틸-4-페닐피페라진 유도체를 제조하는 방법
KR20230155311A (ko) 2022-05-03 2023-11-10 충북대학교 산학협력단 신규한 n-히드록시프로펜아미드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20230155310A (ko) 2022-05-03 2023-11-10 충북대학교 산학협력단 신규한 n-히드록시프로펜아미드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH17194A (en) * 1980-03-06 1984-06-19 Otsuka Pharma Co Ltd Novel carbostyril derivatives,and pharmaceutical composition containing the same
IL164007A0 (en) * 2002-03-13 2005-12-18 Janssen Pharmaceutica Nv New inhibitors of histone deacetylase
ES2307909T3 (es) * 2002-03-13 2008-12-01 Janssen Pharmaceutica Nv Derivados de piperazinil, piperidinil y morfolinil como nuevos inhidbidores de la histona deacetilasa.
CA2479906C (en) * 2002-04-03 2011-02-08 Topotarget Uk Limited Carbamic acid compounds comprising a piperazine linkage as hdac inhibitors

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