TWI394752B - 作為組蛋白去乙醯基酶的新穎抑制劑之經取代的丙烯基六氫吡衍生物 - Google Patents

Description

作為組蛋白去乙醯基酶的新穎抑制劑之經取代的丙烯基六氫吡 衍生物

本發明係關於具有組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制酵素活性的化合物。其進一步係關於其製備、含彼之組成物及其在試管中及活體中抑制HDAC、並且作為醫藥品的用途，例如：作為抑制增生症狀的醫藥品，如：癌症及牛皮癬。

核組蛋白已知為對調節基因轉錄及其他DNA－模板(templated)過程負責之機制的整合及動力組份，如：該過程如：複製、修復、重組及染色體分離(segregation)。其為包括乙醯基化、磷酸化、甲基化、泛素化作用(ubiquitination)及ADP－核糖基化之後轉譯改質的目標。

在此被稱為”HDACs”之組蛋白去乙醯基酶，為在蛋白質之離胺酸殘基上催化乙醯基化改質之移除的酵素，包括：核心核小體(nucleosomal)組蛋白H2A、H2B、H3及H4。與在此稱為”HATs”的組蛋白乙醯基轉移酶一起，HDASs調節組蛋白之乙醯基化份量。核小體組蛋白之乙醯基化的平衡在許多基因的轉錄中扮演重要的角色。組蛋白的次乙醯基化(hypoacetylation)與造成基因轉錄之阻遏(repression)的縮合染色質(chromatin)結構相關，而乙醯基化組蛋白與更多開放染色質結構及轉錄的活化相關。

十一個結構相關的HDACs已經被敘述，並且落於兩類當中。第I類HDACs是由HDAC 1、2、3、8及11組成，而第II類HDACs是由HDAC4、5、6、7、9及10組成。第三類之HDACs的成員是結構上不相關於第I類及第II類HDACs。第I/II類HDACs是由取決於鋅的機制所操作，而第III類HDACs是取決於NAD。

除了組蛋白之外，其他蛋白質也已為乙醯基化的基質，特別是轉錄因子，如：p53、GATA－1及E2F；核受體，如：糖皮質受體、甲狀腺受體、雌激素受體；及細胞循環調節蛋白質，如：pRb。蛋白質的乙醯基化已與蛋白質穩定聯結，如：p53的穩定、共同因子的補充及增加DNA鍵結。p53是一個腫瘤壓制劑，其可在對各種壓力訊號反應中引發細胞循環停止或凋亡，如：DNA損壞。p53引發之細胞循環停止的主要目標似乎是p21基因。次於藉著p53之其活化，p21已藉著其與細胞週期素(cyclin)/取決於細胞週期素激酶錯合物的相關性被鑑別，該錯合物造成G1及G2期的細胞循環停止，其在衰老及其與增生細胞核抗原的交互作用期間向上調節。

HDACs抑制劑的研究指出：其在細胞循環停止、細胞分化、凋亡及轉型之表現型的反轉中扮演重要的角色。

抑制劑例如曲古柳菌素(Trichostatin)A(TSA)的抑制導致不同細胞株之G1及G2期的細胞循環停止及轉型表現型的反轉，並引發弗蘭德(Friend)白血病細胞及其他的分化。TSA及suberoylanilide異羥肟酸(SAHA)已被報告抑制細胞生長、引發終端分化並且避免腫瘤在老鼠上形成(Finnin等人，Nature,401：188－193,1999)。

曲古柳菌素A也被報告在纖維化的治療上為有用的，例如：肝纖維化及肝硬化(Geerts等人，歐洲專利申請書EP 0 827 742，1998年3月11日出版)。

對於HDAC抑制劑的Pharamacophore由金屬鍵結區域組成，其與HDACs的含鋅活性位置、聯結劑區域及表面認知區域或覆蓋(capping)區域交互作用，其與在活性位置之邊緣上的殘基交互作用。

也報告HDACs的抑制劑引發p21基因表現。藉這些抑制之p21基因的轉錄活化，以染色質重塑促進，續以p21啟動子區域中之組蛋白H3及H4的乙醯基化。p21之此活化發生在取決於p53的方式，並因此HDAC抑制劑在具突變p53基因之細胞中(為一些腫瘤顯著標誌)為可操作的。

另外，HDAC抑制劑可具有間接活性，如：宿主免疫反應的增產(augmentation)及腫瘤血管生成的抑制，並且因此可壓制主要腫瘤的生長並且阻礙轉移(Mai等人medicinal Research Reviews,25：261－309)。

關於上述，HDAC抑制劑可在細胞增生疾病或症狀的治療上具有大大的潛力，包括具突變p53基因之腫瘤。

2003年8月14日公開之歐洲專利申請案EP14772216揭示雙環異羥肟酸酯類(hydroxamates)作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2003年9月18日公開之歐洲專利申請案EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378當中，揭示經取代之六氫吡基嘧啶基異羥肟酸作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。進一步，EP1485365揭示R306465。

在2003年10月9日公開之歐洲專利申請案EP1492534揭示包含六氫吡聯結基的胺甲酸化合物，作為HDAC的抑制劑。

在2003年10月23日公開之歐洲專利申請案EP1495002揭示經取代之六氫吡基苯基苯醯胺化合物作為組蛋白去乙醯基酶抑制劑。

在2004年1月29日公開之專利申請案WO04/009536揭示在芳基團及異羥肟酸酯之間含烷基聯結基的衍生物，作為組蛋白去乙醯基酶抑制劑。

在2004年2月12日公開之專利申請案EP1525199揭示(雜)芳基烯基經取代之二環異羥肟酸酯，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2004年7月29日公開之專利申請案WO04/063146揭示具抗發炎及抗腫瘤活性的N－羥基－苯醯胺衍生物。

在2004年7月29日公開之專利申請案WO04/063169揭示經取代之異羥肟酸酯衍生物，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2004年8月26日公開之專利申請案WO04/072047揭示吲哚類、苯并咪唑類及萘咪唑類，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2004年9月30日公開之專利申請案WO04/082638揭示聯結到非芳香雜環環系統的異羥肟酸酯，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2004年10月28日公開之專利申請案WO04/092115揭示異羥肟酸酯衍生物，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2005年3月31日公開之專利申請案WO05/028447揭示苯并咪唑類，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2005年4月7日公開之專利申請案WO05/030704及WO05/030705揭示苯甲醯胺，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2005年5月6日公開之專利申請案WO05/040101揭示醯基尿素聯接及磺醯基尿素聯接的異羥肟酸酯，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

在2005年5月6日公開之專利申請案WO05/040161也揭示二芳基聯結之異羥肟酸酯，作為組蛋白去乙醯基酶的抑制劑。

本發明之化合物在結構，在其藥理活性及/或藥理效力上不同於習知技藝。

要被解決的問題提供具高酵素及細胞活性的組蛋白去乙醯基酶的抑制劑，其具有增加生物有效性及/或活體中的效力。

本發明之新穎化合物解決上述的問題。本發明之化合物顯示優越組蛋白去乙醯基酶抑制酵素及細胞活性。其具有在細胞及活體中層面上活化p21基因的高能力。其具有理想的藥物動力型態及對P450酵素的低親和性，減少負面藥物－藥物交互作用的危險，也容許更廣泛的安全界限。

本化合物的另一個優越特色是代謝穩定性、溶解度及/或p21引發能力。更特別地，本發明之化合物在老鼠肝細胞中具有增加的半衰期、在水溶液中具有增加的溶解度/穩定性及/或在活體中增加p21啟動子引發能力。

本發明係關於式(I)化合物： 其N－氧化物形式、醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式，其中各X是獨立為N或CH；R¹ 是苯基、萘基或雜環基；其中該苯基或萘基各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、多鹵基C_{1 － 6} 烷基、芳基、羥基、氰基、胺基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基、羥羰基、C_{1 － 6} 烷氧基羰基、羥基C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基甲基、胺甲基、C_{1 － 6} 烷基胺甲基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺甲基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基、C_{1 － 6} 烷基胺基磺醯基或雜環基的取代基取代；R² 是氫、－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ ；其中各R⁵ 獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷基羰基氧基、六氫吡基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基、硫基嗎啉基、咪唑基或三唑基；各R⁶ 是獨立選自羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、胺基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基、C_{1 － 6} 環烷基胺基、羥基C_{1 － 6} 烷基胺基、六氫吡基、單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基C_{1 － 6} 烷基胺基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基或硫基嗎啉基；各R⁷ 及R⁸ 獨立選自氫、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷基羰基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基磺醯基；R³ 是氫、羥甲基、胺甲基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基甲基；R⁴ 是氫或C_{1 － 6} 烷基；在上述中的芳基為苯基或萘基；其中該苯基或萘基各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、三氟甲基、氰基或羰基羰基的取代基取代；在上述中的雜環基為呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二噁茂基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、吡咪烷基、唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、六氫吡啶基、二噁烷基、嗎啉基、二硫基(dithianyl)、硫基嗎啉基、吡噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三硫基、吲哚嗪基、吲哚基、吲哚啉基、苯並呋喃基、苯並噻吩基、吲唑基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、啉基、呔基(phthlazinyl)、喹唑啉基、喹噁啉基或萘啶基；其中該雜環各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、氰基、胺基、單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基的取代基取代。

用語”組蛋白去乙醯基酶抑制劑”或”組蛋白去乙醯基酶的抑制劑”被用來鑑別化合物，其能夠與組蛋白去乙醯基酶交互作用並且抑制其活性，更特別地其酵素活性。抑制組蛋白去乙醯基酶酵素活性意為減少組蛋白去乙醯基酶從組蛋白移除乙醯基團的能力。較佳地，此抑制為特定的，即：組蛋白去乙醯基酶抑制劑減少組蛋白去乙醯基酶從組蛋白移除乙醯基團能力的濃度，是低於需要產生一些其他不相關生物效應之抑制劑的濃度。

如在前述定義及此後所用的，鹵基為氟基、氯基、溴基及碘基的通稱；C_{1 － 4} 烷基定義為直鏈及支鏈、具有1至4個碳原子的飽和烴基團，如：甲基、乙基、丙基、丁基、1－甲基乙基、2－甲基丙基及類似物；C_{1 － 6} 烷基包括C_{1 － 4} 烷基及其具有5至6個碳原子的更高同源物，例如：戊基、2－甲基－丁基、2－甲基戊基及類似物；多鹵基C_{1 － 6} 烷基定義為含有三個相同或不同鹵基取代基，例如：三氟甲基；及C_{3 － 6} 環烷基包括具有3至6個碳原子的環烴基團，如：環丙基、環丁基、環戊基、環己基及類似物。

醫藥可接受加成鹽類包含醫藥可接受酸加成鹽類及醫藥可接受鹼加成鹽類。如上述之醫藥可接受加成鹽類意為包含治療活性、非毒性的酸加成鹽形式，其為式(I)化合物能形成的。具有鹼性性質的式(I)化合物可藉著該鹼形式以適當酸處理，而被轉化其醫藥可接受酸加成鹽類。適當酸包含例如：無機酸類，如：氫鹵酸類，例如：氫氯或氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及類似酸類；或有機酸類，例如：醋酸、三氟醋酸、丙酸、羥基醋酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸(即：丁烷二酸)、順丁烯二酸、反丁烯二酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、對－甲苯磺酸、環已烷基氨基磺酸、水楊酸、對－胺基－水楊酸、雙羥萘酸及類似物。

具有酸性性質的式(I)化合物可藉著該酸形式以適當有機或無機鹼處理，而被轉化其醫藥可接受鹼加成鹽類。適當鹼形式包含例如：銨鹽類、鹼及鹼土金屬鹽類，例如：鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽類及類似物，以有機鹼處理的鹽類，例如：苄星青(benzathine)、N－甲基－D－葡糖胺、海巴明(hydrabamine)鹽類；及具胺基酸的鹽類，例如：精胺酸、離胺酸及類似物。

用語”酸或鹼加成鹽類”也包含水合物及溶劑加成形式，其為式(I)化合物能形成的。此類型式的實例是例如：水合物及醇化物及類似物。

如在此所用之用語”式(I)化合物之立體化學異構形式”定義所有可能由相同序列之鍵結、但具有不同三維結構所鍵結之相同原子所製成的化合物，其為不可互相交換的，其為式(I)化合物可擁有的。除非另外提及或指出，化合物的化學名稱包含所有可能立體化學異構形式的混合物，其為該化合物可擁有的。該混合物可包含該化合物的基本分子結構的所有非對映異構物及/或對映異構物。式(I)化合物之所有立體化學異構形式，純形式或互相的混合物兩者，意欲包含在本發明的範疇。

式(I)化合物之N－氧化物形式意為包含其中一或幾個氮原子被氧化成所謂N－氧化物的那些式(I)化合物，特別是其中一或多個哌啶、六氫吡基或噠嗪基－氮被N－氧化的那些N－氧化物。

一些式(I)化合物也可以其互變形式存在。此類形式雖然未明顯地在上式中被指出，意欲被包括在本發明的範疇。

在此後所用處，用語”式(I)化合物”意為也包括醫藥可接受加成鹽類及所有立體異構形式。

如在此所用，用語”組蛋白去乙醯基酶”及”HDAC”意欲指為從在組蛋白N－終端上離胺酸殘基之ε－胺基團移除乙醯基團的任何一族酵素。除非另外以內容指出，用語”組蛋白”意為指來自任何物種的任何組蛋白蛋白質，包括H1、H2A、H2B、H3、H4及H5。人類HDAC蛋白質或基因產物包括、但不限於：HDAC－1、HDAC－2、HDAC－3、HDAC－4、HDAC－5、HDAC－6、HDAC－7、HDAC－8、HDAC－9、HDAC－10及HDAC－11。組蛋白去乙醯基酶也可自原生動物或真菌來源衍生。

第一個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)R¹ 是苯基或萘基，以一或兩個各獨立選自C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基、羥羰基、C_{1 － 6} 烷氧基甲基、C_{1 － 6} 烷基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基或C_{1 － 6} 烷基胺基磺醯基；或b)R² 是－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ ；c)R⁴ 是C_{1 － 6} 烷基。

第二個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)R¹ 是苯基或萘基或雜環基；其中各該苯基是以一或兩個各獨立選自芳基、羥基、胺基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基、C_{1 － 6} 烷氧基羰基、羥基C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基甲基、胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基、C_{1 － 6} 烷基胺基磺醯基或雜環基；或b)R² 是－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ ；c)R⁴ 是C_{1 － 6} 烷基。

第三個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)R¹ 是苯基或萘基或雜環基；其中各該苯基是以一或兩個各獨立選自C_{1 － 6} 烷基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基甲基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基或C_{1 － 6} 烷基胺基磺醯基；或b)R² 是－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ ；c)R⁴ 是C_{1 － 6} 烷基。

第四個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、六氫吡基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基、硫基嗎啉基、咪唑基或三唑基；b)各R⁶ 是獨立選自羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、胺基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基、C_{1 － 6} 環烷基胺基、六氫吡基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基或硫基嗎啉基；或c)R⁴ 是氫。

第五個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)各X為N；b)R¹ 是苯基、或視情況以鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、多鹵基C_{1 － 6} 烷基或芳基取代的苯基；c)R² 是－CH₂ －R⁵ 或－C(＝O)－R⁶ ；d)各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基羰基氧基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基或咪唑基；e)各R⁶ 是獨立選自C_{1 － 6} 烷基胺基、C_{1 － 6} 環烷基胺基、羥基C_{1 － 6} 烷基胺基、二(C_{1 － 6} 烷基)胺基C_{1 － 6} 烷基胺基或嗎啉基；f)R³ 是氫；或g)R⁴ 是氫或C_{1 － 6} 烷基。

第六個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)各R⁶ 是獨立選自C_{1 － 6} 烷基胺基、C_{1 － 6} 環烷基胺基、二(C_{1 － 6} 烷基)胺基C_{1 － 6} 烷基胺基或嗎啉基；第七個有興趣化合物族群是由式(I)化合物組成，其中加上一或多個下列限制：a)各X為N；b)R¹ 是苯基或以鹵基取代的苯基；c)R² 是－CH₂ －R⁵ ；d)各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、或C_{1 － 6} 烷基羰基氧基；e)R³ 是氫；或f)R⁴ 是氫。

一群較佳化合物是由那些式(I)化合物組成，其中各X為N；R¹ 是苯基、或視情況以鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、多鹵基C_{1 － 6} 烷基或芳基取代的苯基；R² 是－CH₂ －R⁵ 或－C(＝O)－R⁶ ；各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基羰基氧基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基或咪唑基；各R⁶ 是獨立選自C_{1 － 6} 環烷基胺基、羥基C_{1 － 6} 烷基胺基、二(C_{1 － 6} 烷基)胺基C_{1 － 6} 烷基胺基或嗎啉基；R³ 是氫且R⁴ 是氫或C_{1 － 6} 烷基。

另一群較佳化合物是由那些式(I)化合物組成，其中R² 是－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ 。

另一群更佳化合物是由那些式(I)化合物組成，其中各X為N；R¹ 是苯基、或視情況以鹵基取代的苯基；R² 是－CH₂ －R⁵ ；各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基或C_{1 － 6} 烷基羰基氧基；R³ 是氫且R⁴ 是氫。

最佳化合物是由1號化合物、8號化合物、11號化合物、9號化合物、33號化合物、34號化合物及7號化合物和25號化合物。

式(I)化合物及醫藥可接受加成鹽類和其N－氧化物及立體化學異構形式，可以習用方式製備。起始物質及一些中間體為已知化合物，並且為商業可得的、或可根據一般此藝中已知的習用反應步驟製備。

一些製備方法會更詳細地在此後敘述。用來獲得最終式(I)化合物的其他方法在實例中被敘述。

a)式(I)之異羥肟酸可藉著將式(II)中間體與例如：三氟醋酸的適當酸反應而製備。該反應在例如：甲醇或二氯甲烷的適當溶劑中進行。

b)在例如：N’ －(乙基伸亞胺醯基(carbonimidoyl))－N,N －二甲基－1,3－丙烷二胺單氫氯酸鹽(EDC)及1－羥基－1H －苯並三唑(HOBT)之適當試劑的存在下，式(II)中間體可藉著將式(III)中間體與式(IV)中間體反應而製備。該反應可在如：三乙基胺之鹼的存在下、在如：二氯甲烷及四氫呋喃之混合物的適當溶劑中進行。

c)在另一個方法中，其中R⁴ 為氫之式(II)中間體在此被稱為式(II－a)中間體，可以單一步驟製備，是藉著式(XI)中間體與1,4－二噁烷－2,5－二醇、及其中R¹ 如上定義之式(VII)適當硼酸，在例如：乙醇之醇類的適當溶劑中反應。

d)式(III)中間體可藉著式(V)中間體與例如：鹽酸之適當酸性溶液、或在例如：溴化氫或氫化之適當鹼性溶液，在例如：乙醇或丙醇之醇類的適當溶劑中反應。

本發明也係關於式(V)化合物： 其N－氧化物形式、醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式，其中各X是獨立為N或CH；R¹ 是苯基、萘基或雜環基；其中該苯基或萘基各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、多鹵基C_{1 － 6} 烷基、芳基、羥基、氰基、胺基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基、羥羰基、C_{1 － 6} 烷氧基羰基、羥基C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基甲基、胺甲基、C_{1 － 6} 烷基胺甲基、C_{1 － 6} 烷基羰基胺甲基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基、C_{1 － 6} 烷基胺基磺醯基或雜環基的取代基取代；R² 是氫、－CH₂ －R⁵ 、三氟甲基、－C(＝O)－R⁶ 、或－CH₂ －NR⁷ R⁸ ；其中各R⁵ 獨立選自氫、羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷氧基C_{1 － 6} 烷氧基、C_{1 － 6} 烷基羰基氧基、六氫吡基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基、硫基嗎啉基、咪唑基或三唑基；各R⁶ 是獨立選自羥基、C_{1 － 6} 烷氧基、胺基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基、C_{1 － 6} 環烷基胺基、羥基C_{1 － 6} 烷基胺基、六氫吡基、單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基C_{1 － 6} 烷基胺基、N－甲基六氫吡基、嗎啉基或硫基嗎啉基；各R⁷ 及R⁸ 獨立選自氫、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷基羰基、C_{1 － 6} 烷基磺醯基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基磺醯基；R³ 是氫、羥甲基、胺甲基或單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基甲基；R⁴ 是氫或C_{1 － 6} 烷基；在上述中的芳基為苯基或萘基；其中該苯基或萘基各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、三氟甲基、氰基或羥基羰基的取代基取代；在上述中的雜環基為呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二噁茂基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、六氫吡啶基、二噁烷基、嗎啉基、二硫基、硫基嗎啉基、吡噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三硫基、吲哚嗪基、吲哚基、吲哚啉基、苯並呋喃基、苯並噻吩基、吲唑基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、啉基、呔基、喹唑啉基、喹噁啉基或萘啶基；其中該雜環各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_{1 － 6} 烷基、C_{1 － 6} 烷氧基、氰基、胺基、單－或二(C_{1 － 6} 烷基)胺基的取代基取代。

有興趣的、較佳及更佳和最佳化合物的族群可以對式(V)化合物定義，是根據對式(I)化合物所定義的族群。

新穎的式(V)化合物可以如下製備：a)將其中R² 是－CH₂ OH且R⁴ 是氫的式(V)中間體，在此被稱為式(V－a)中間體，經由此藝已知的反應或官能基團轉換，而轉化成式(V－b)中間體。例如：式(V－a)的醇類可被轉化成胺類、酯類及醚類。胺類可被轉變成相對應的醯胺類，並且主要胺類可轉化成二級或三級胺類。

b)新穎的式(V－a)中間體可以單一步驟製備，是藉著式(VI)中間體與1,4－二噁烷－2,5－二醇、及其中R¹ 如上定義之式(VII)適當硼酸，在例如：乙醇之醇類的適當溶劑中反應。

c)新穎的式(V－b)中間體可藉著式(VI)中間體與式(VIII)適當酮、在如：肆(乙醇根(ethanolato))鈦或硼氫化鈉之適當試劑的存在下、在例如：1,2－二氯乙烷的適當溶劑中反應而被製備

d)其中R² 是－COOH的新穎式(V)中間體，在此被稱為式(V－c)中間體，可以單一步驟製備，是藉著式(VI)中間體與2－氧代－丙酸、及其中R¹ 如上定義之式(VII)適當硼酸，在例如：1,2－二氯甲烷的適當溶劑中反應。

式(XI)中間體可藉著式(IX)中間體與哌啶、在例如：二氯甲烷的適當溶劑中反應而被製備。

在例如：N’ －(乙基伸亞胺醯基)－N,N －二甲基－1,3－丙烷二胺單氫氯酸鹽(EDC)及1－羥基－1H －苯並三唑(HOBT)之適當試劑的存在下，式(IX)中間體可藉著式(X)中間體與式(IV)中間體反應而被製備。該反應可在如：三乙基胺之鹼的存在下、在如：二氯甲烷及四氫呋喃之混合物的適當溶劑中進行。

式(X)中間體可藉著在氫氧化鈉的存在下、在如：四氫呋喃的適當溶劑中，將式(VI)中間體與式(XII)中間體反應、續以鹽酸中和及碳酸鈉添加而被製備。

式(I)化合物及一些中間體可在其結構中具有至少一個立體中心。此立體中心可以R或S型態存在。

如在此上述製程中製備的式(I)化合物，一般為對映異構物的消旋混合物，其可從互相遵循之此藝中已知的解析步驟分離。式(I)的消旋化合物可以與適當對掌酸反應而被轉化成相對應的非對映異構鹽形式。該非對映異構鹽形式接著被分離，例如：是藉著選擇性或分部結晶，並且對映異構物從鹼中被釋出。另一個式(I)化合物之對映異構形式的分離方式牽涉到使對掌固定相的液態色層分析。該純立體化學異構形式也可自適當起始物質之相對應純立體化學異構形式衍生，其限制條件是反應是立體特定性地發生。較佳地，若特定立體異構物為想要的，該化合物以製備的立體特定方法合成。這些方法會優越地使用對映異構上為純的起始物質。

式(I)化合物、其醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式具有有價值的醫藥性質，其中其具有組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制效力。

本發明提供一種方法來抑制細胞的不正常生長，包括經轉換細胞，是藉著投藥有效份量的本發明化合物。細胞的不正常生長意指不依賴正常調節機制的細胞生長(例如：喪失接觸抑制)。此包括直接導致癌症細胞之生長停止、終端分化及/或凋亡、及間接由抑制腫瘤之新血管的腫瘤抑制。

本發明也提供一種方法來抑制腫瘤生長，是藉著投藥有效份量的本發明化合物給需要此治療之病患，例如：一種哺乳動物(並且更特別為人類)。特別地，本發明提供一種方法來抑制腫瘤的生長，是藉著投藥有效份量的本發明化合物。可被抑制之腫瘤的實例包括、但不限於：肺癌(例如：腺癌，並且包括非小細胞肺癌)、胰臟癌(例如：胰臟惡性腫瘤，例如：外分泌胰臟惡性腫瘤)、結腸癌(例如：結腸直腸惡性腫瘤，例如：結腸腺癌及結腸腺腫瘤)；前列腺癌，包括已進展的疾病、淋巴系統(lymphoid lineage)的造血腫瘤(例如：急性淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、受伯奇氏(Burkitt's)淋巴瘤)；脊椎白血病(例如：急性淋巴性白血病(AML))、甲狀腺毛囊癌症、骨髓增生異常症候群MDS)、間葉源起的腫瘤(例如：纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎瘤(teratocarinomas)、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、皮膚良性腫瘤(例如：角化棘皮瘤)、乳房惡性腫瘤(例如：進展性乳癌)、腎臟惡性腫瘤、卵巢惡性腫瘤、膀胱惡性腫瘤及上皮惡性腫瘤。

根據本發明之化合物可被用於其他治療目的，例如：a)使腫瘤對輻射治療敏感化，藉著在用於治療癌症之腫瘤輻射之前、期間或之後投藥根據本發明之化合物；b)治療關節病及骨骼病理症狀，如：類風濕性關節炎、骨關節炎、少年關節炎、痛風、多重關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性脊椎炎及系統性紅斑性狼瘡；c)抑制平滑肌細胞增生，包括血管增生不適症、動脈硬化及再阻塞；d)治療發炎症狀及皮膚症狀，如：結腸潰瘍、克羅恩(Crohn's)疾病、過敏性鼻炎、移植對宿主疾病、結膜炎、氣喘、ARDS、Bahcet’s疾病、移植排斥、蕁麻疹、過敏性皮炎、斑禿、硬皮病、疹病、濕疹、皮膚肌炎、面皰、糖尿病、系統性紅斑性狼瘡、山崎(Kawasaki’s)症、多重硬化症、肺氣腫、囊腫纖維症及慢性支氣管炎；e)治療子宮內膜異位症、子宮纖維瘤、功能障礙的子宮流血及子宮內膜增生；f)治療眼睛血管化(ocular vacularisation)，包括影響視網膜及脈絡膜血管的血管病變；g)治療心臟功能障礙；h)抑制免疫壓制性症狀，如：治療HIV感染；i)治療腎臟功能障礙；j)壓制內分泌不適；k)抑制醣質新生的功能障礙；l)治療神經病理，例如：柏金氏(Parkinson’s)症或造成認知症狀的神經病理，例如：老人癡呆症或聚穀胺酸相關的神經元疾病；m)治療精神症狀，例如：精神分裂、躁鬱症、憂鬱症、焦慮及精神病；n)抑制神經肌肉病理，例如：肌萎縮性脊髓側索硬化症；o)治療脊椎肌肉萎縮；p)治療其他可對治療改善的病理症狀，是藉著基因的增強表現；q)增進基因治療；r)抑制脂肪生成作用；s)治療寄生蟲病，如：瘧疾。

因此，本發明揭示式(I)化合物用做醫藥品的用途、及式(I)化合物用來製造用於治療一或多個上述症狀之醫藥品的用途。

式(I)化合物、其醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式可具有有價值的診斷性質，其中其可被用來偵測或鑑別在生物樣本中的HDAC，包含在經標示化合物及HDAC之間錯合物形成的偵測或測量。

偵測或鑑別方法可使用如：輻射同位素、酵素、螢光物質、發光物質等之經標示試劑標示的化合物。輻射同位素的實例包括：^{1 2 5} I、^{1 3 1} I、³ H及^{1 4} C。酵素通常是以適當基材的共軛而變成可偵測的，該基材依序催化一個可偵測的反應。其實例包括例如：β－半乳糖酶、β－葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶及順丁烯二酯脫氫酶，較佳為辣根過氧化酶。發光物質包括例如：發光氨(luminol)、發光氨衍生物、螢光素、水母發光蛋白(aequorin)及螢光酵素(luciferase)。

生物樣本可被定義為身體組織或體液。體液的實例為腦脊液、血液、血漿、血清、尿液、痰、唾液及類似物。

以有用藥學性質的觀點，目標化合物可被調配成用於投藥目的的各種醫藥形式。

為製備本發明之醫藥組成物，為活性成份之有效份量鹼或酸加成鹽形式的特別化合物，在緊密混合物中與醫藥可接受載劑組合，該載劑可採用廣泛種類的形式，取決於所要投藥的製劑形式。這些醫藥組成物理想地為適於口服、直腸、穿皮或非腸胃注射之投藥的單一劑量形式。例如：在製備口服劑量形式的組成物當中，在如：懸浮液、糖漿、丹液及溶液之口服液態製劑；或如：澱粉、糖類、高嶺體、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及類似物之固體載劑的情況下；在粉末、藥丸、膠囊及藥片的情況下；可使用任何的經常醫藥媒介物，例如：水、二醇類、油類、醇類及類似物。

因其投藥的容易性，藥片及膠囊代表最優越的口服劑量單位形式，在該情況下，明顯地使用固體醫藥載劑。對非腸胃組成物而言，載劑通常包含經消毒的水、至少大部份，例如：可包括其他成份來輔助溶解度。例如：可注射溶液可被製備，其中載劑包括食鹽水溶液、葡萄糖溶液、或食鹽水及葡萄糖溶液的混合物。可注射懸浮液也可被製備，在該情況下，適當的液態載劑、懸浮劑及類似物可被使用。在適於穿皮投藥的組成物中，載劑視情況地包含滲透壓增進劑及/或適當濕潤劑，視情況地與適當小部份的任何天然添加物組合，該添加物不對皮膚導致重大的有害效果。該添加物可加速皮膚投藥及/或可幫助用來製備所要的組成物。這些組成物可以各種方式投藥，例如：為經皮貼片、為滴劑(spot－on)或軟膏。

特別優越的是調配前述、容易投藥之劑量單位形式及劑量均勻性的醫藥組成物。在此說明書及申請專利範圍中所用的劑量單位形式意指適於單元劑量的物理上分別單元，包含計算產生所要之治療效果的預先測定份量活性成份，及所需之醫藥載劑。此類劑量單位形式的實例是藥片(包括有刻痕或經塗覆的藥片)、膠囊、藥丸、粉末包裝、圓片、可注射溶液或懸浮液、茶匙包裝及湯匙包裝及類似物、和其經分裝的多重包。

習知此藝者能容易地從在此後呈現的測試結果來測量有效份量。一般，考慮治療有效份量是從0.005毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重，並且特別是從0.005毫克/公斤體重至10毫克/公斤體重。適當的是在當天之適當間隔下投藥二、三、四或多個次劑量的所需劑量。該次劑量可以調配成單元劑量形式，例如：每單元劑量形式包含0.5至500毫克，並且特別是10毫克至500毫克的活性成份。

在本發明的另一個觀點中，HDAC抑制劑與另一個抗癌試劑的組合被研究，特別是用作醫藥品，更特定是在治療癌症或相關疾病。

對於上述症狀的治療，本發明之化合物可優越地與一或多個其他藥物試劑組合使用，更特別地與其他抗癌試劑組合。抗癌試劑的實例：－鉑配位化合物，例如：順鉑、奧沙利鉑(carboplatin)或oxalyplatin；－紫杉醇化合物，例如：紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel)；－拓樸異構酶I抑制劑，如：喜樹鹼(camptothecin)化合物，例如：愛萊諾迪肯(irinotecan)或排列替康(topotecan)；－拓樸異構酶II抑制劑，如：抗腫瘤鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物，例如：依託泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide)；－抗腫瘤長春鹼類，例如：長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine)或長春花(vinorelbine)；－抗腫瘤核苷衍生物，例如：5－氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他汀(gemcitabine)或截瘤達(capecitabine)；－烷化試劑，如：氮芥氣或亞硝基尿素，例如：cholophosphamide、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、卡莫司汀(carmustine)或羅氮芥(lomustine)；－抗腫瘤小紅莓(anthracycline)衍生物，例如：柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)；－HER2抗體，例如：曲妥珠(Trastuzumab)；－雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調節劑，例如：三苯氧胺(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、氟維司群(faslodex)或拉樂西芬(raloxifene)；－芳香酶抑制劑，如：福美斯坦(formestane)及依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrazole)、莫達非尼(letrozole)及伏立康唑(vorozole)；－分化試劑，如：視黃素類(retinoids)、維他命D及維甲(retinoic)酸代謝阻斷劑(RAMBA)，例如：同維甲酸(accutane)；－DNA甲基轉移酶抑制劑，例如：氮雜胞苷(azacytidine)；－激酶抑制劑，例如：flavoperidol、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)或吉非替尼(gefitinib)；－法呢酯(farnesyl)轉移酶抑制劑；－其他HDAC抑制劑－泛素－蛋白水解酶路徑的抑制劑，例如：萬科(Velcade)；或－Yondelis。

在此所用之用語”鉑配位化合物”代表任何腫瘤細胞生長抑制鉑配位化合物，其以離子形式提供鉑。

用語”紫杉醇(taxane)化合物”指出具有紫杉醇環系統的一類化合物，並且細關於或衍生自某些杉樹物種(Taxus)的萃取物。

用語”拓樸異構酶抑制劑”被用來指出能夠改變在真核細胞細胞中的DNA拓樸。其對重要細胞功能及細胞增生是關鍵的。在真核細胞細胞中有兩類拓樸異構酶抑制劑，命名為第I型及第II型。拓樸異構酶I是一種約100,000分子量的單體酵素。該酵素鍵結到DNA並且導入一個過渡單股斷裂、雙股螺旋不捲曲成股(或容許其不捲曲成股)及在從DNA股分解之前的後續再封閉。拓樸異構酶II是牽涉到DNA股斷裂之引發、或游離基團形成作用的類似機制。

用語”喜樹鹼化合物”被用來指出相關於或衍生自母系喜樹鹼化合物的化合物，其為一種衍生自中國樹Camptothecin acuminate及印度樹清脆枝的非水溶性鹼(Nothapodytes foetida)。

用語”鬼臼毒素衍生物”被用來指出相關於或衍生自母系鬼臼毒素的化合物，其是從曼陀羅草植物萃取。

用語“抗腫瘤長春鹼類”被用來指出相關於或衍生自玉黍螺(periwinkle)植物(日日春(Vinca rosea))之萃取刺的化合物。

用語”烷化試劑”包含一廣泛族群的化學品，其具有的一般特性為其在生理條件下，具有將烷基基團加於如DNA之生物活性大分子上的能力。具大部份的更重要試劑，如：氮芥氣及亞硝基尿素，活性烷化分子團在錯合物分解反應之後於活體中產生，其一些為酵素性的。烷化試劑的最重要醫藥作用是干擾與細胞增生相關之基本機制的那些，特別是DNA合成及細胞分裂。烷化試劑干擾DNA功能及快速增生組織之整體性的能力，提供其治療用途及其許多毒性性質的基礎。

用語”抗腫瘤蒽環類抗生素(anthracycline)衍生物”包含自真菌Strep.Peuticus var.caesius 及其衍生物所獲得之抗生素，其特徵在於具有具不尋常糖：duanosamine而附於糖苷聯結之四環素環結構。

在主要乳房惡性腫瘤中之人類上皮生長因子受體2蛋白質(HER2)的放大，已顯示與某些病患之不良臨床預後相關。曲妥珠是高度純化重組DNA衍生人化單株IgGl κ抗體，其具高親和性鍵結並且對HER2受體之細胞外區域的特定性。

許多乳癌具有雌激素受體，並且這些腫瘤的生長可以雌激素刺激。用語”雌激素受體拮抗劑”及”選擇性雌激素受體調節劑”被用來指出鍵結到雌激素受體(ER)之雌二醇的競爭抑制劑。當鍵結到ER時，選擇性雌激素受體調節劑引發在受體之三維形狀上的改變，調節其鍵結到在DNA上的雌激素反應性元素(ERE)。

在停經後婦女中，循環性雌激素的主要來源是來自腎上腺及卵巢雄激素(雄烯二酮及睪丸固酮)藉芳香酶酵素在週圍組織中而轉換成雌激素(雌三醇及雌二醇)。

經由芳香酶抑制或失活的雌激素缺乏，是一種對一些具荷爾蒙依賴性乳癌之停經後病患有效且選擇性的治療。

用語”抗雌激素試劑”在此被用來不只包括雌激素受體拮抗劑及選擇性雌激素受體調節劑，也包括如上討論的芳香酶抑制劑。

用語”分化試劑”包含以各種方式能抑制細胞增生及引發分化的化合物。維他命D及視黃素類已知在調節廣泛種類之正常及惡性細胞種類的生長及分化上扮演主要角色。視黃酸代謝阻斷試劑(RAMBA’s)藉著抑制細胞色素P450調節之視黃酸類糖分解代謝(catabolism)而增加內生視黃酸的份量。

DNA甲基化改變是在人類贅瘤上最一般的不正常現象。在所選基因之促進劑內的過度甲基化，通常與牽涉到之基因的失活相關。用語”DNA甲基轉移酶抑制劑”被用來指出經由醫藥抑制DNA甲基轉移酶及再活化腫瘤壓抑基因表現而作用的化合物。

用語”激酶抑制劑”包含牽涉到細胞循環進展及程式化細胞死亡(凋亡)之有潛力激酶的抑制劑。

用語”法呢酯轉移酶抑制劑”被用來指出被稱為能避免Ras及其他細胞內蛋白質之法尼基化(farnesylation)的化合物。其已顯示在惡性細胞增生及存活上具有效果。

用語”其他HDAC抑制劑”包含、但不限於：－羧酸酯，例如：丁酸酯、肉桂酸、4－苯基丁酸酯或丙戊酸；－異羥肟酸類，例如：syberoylanilide異羥肟酸(SAHA)、含SAHA類似物之六氫吡，雙芳基異羥肟酸酯A－161906及其carbozolylether－、四氫吡啶－及萘滿酮(tetralone)－類似物、二環芳基－N －羥基羧醯胺類，pyroxamide、CG－1521、PXD－101、磺醯胺異羥肟酸、LAQ－824、LBH－589、曲古柳菌素A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、scriptaid相關的三環化合物、間－羧基肉桂酸雙異羥肟酸(CBHA)、似CBHA的異羥肟酸、trapoxin－異羥肟酸類似物、R306465及相關苯醯基及雜芳基異羥肟酸、胺基辛二酸鹽及丙二醯胺類；－環狀四胜肽類，例如：trapoxin、apidicin、縮肽(depsipeptide)、spiruchostatin相關化合物、RedFK－228、含硫氫基(sulfhydryl)的環狀四胜肽(SCOPs)、含環狀四胜肽的異羥肟酸(CHAPs)、TAN－174s及azumamides；－苯醯胺類，例如：MS－275或CI－994，或－depudecin。

用語”泛素－蛋白質體(proteasome)路徑的抑制劑被用來鑑別在蛋白質體中抑制細胞性蛋白質之標的破壞的化合物，包含細胞週期調節蛋白質。

對於治療癌症，根據本發明之化合物可被投藥給上述的病患，與輻射共同使用。輻射意為離子化輻射，並且特別是γ輻射，特別是以線性加速器釋出的或今日一般使用的放射性核素(radionuclides)。以放射性核素之腫瘤輻射可為外部或內部的。

本發明也係關於根據本發明之抗癌症試劑及根據本發明之HDAC抑制劑的組合。

本發明也係關於根據本發明之抑制腫瘤細胞生長的組合。

本發明也係關於一種在人類病患中抑制腫瘤細胞生長的方法，其包含投藥給病患有效份量之根據本發明的組合。

本發明進一步提供抑制包括經轉型細胞之不正常細胞生長的方法，是藉著投藥有效份量之根據本發明的組合。

其他藥物試劑及HDAC抑制劑可被同時(例如：分別或單元組成物)或以任何順序連續投藥。在後者的情況下，兩個化合物會在一段時間內投藥，並且份量及方式是足以確保達到優越或協同效果。明白的是：對組合之各組份的較佳方法及投藥順序和相關劑量份量及攝取法，是取決於被投藥的其他特別藥物試劑及HDAD抑制劑、其投藥路徑、被治療之特別腫瘤及被治療之特別宿主。投藥的最佳方法及順序和劑量份量及攝取法，可容易地由習知此藝者使用習用方法及在此所示之資訊的觀點測定。

鉑配位化合物是優越地以身體表面積每平方公尺1至500毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：50至400毫克/平方公尺，特別是每次治療對順鉑的劑量是約75毫克/平方公尺，並且對奧沙利鉑是約300毫克/平方公尺。

紫杉醇化合物是優越地以身體表面積每平方公尺50至400毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：75至250毫克/平方公尺，特別是每次治療對紫杉醇的劑量是約175至250毫克/平方公尺，並且對多烯紫杉醇是約75至150毫克/平方公尺。

喜樹鹼化合物是優越地以身體表面積每平方公尺0.1至400毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：1至300毫克/平方公尺，特別是每次治療對愛萊諾迪肯的劑量是約100至350毫克/平方公尺，並且對排列替康的劑量是約1至2毫克/平方公尺。

抗腫瘤鬼臼毒素衍生物是優越地以身體表面積每平方公尺30至300毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：50至250毫克/平方公尺，特別是每次治療對依託泊苷的劑量是約35至100毫克/平方公尺，並且對替尼泊苷的劑量是約50至250毫克/平方公尺。

抗腫瘤長春鹼是優越地以身體表面積每平方公尺2至30毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，特別是每次治療對長春鹼的劑量是約3至12毫克/平方公尺，對長春新鹼的劑量是約1至2毫克/平方公尺，並且對長春花的劑量是約10至30毫克/平方公尺。

抗腫瘤核苷衍生物是優越地以身體表面積每平方公尺200至2500毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：700至1500毫克/平方公尺，特別是每次治療對5－FU的劑量是約200至500毫克/平方公尺，對吉西他汀的劑量是約800至1200毫克/平方公尺，並且對截瘤達的劑量是約1000至2500毫克/平方公尺。

烷化試劑是優越地以身體表面積每平方公尺100至500毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：120至200毫克/平方公尺，特別是每次治療對氯磷醯胺(cholophosphamide)的劑量是約100至500毫克/平方公尺，對苯丁酸氮芥的劑量是約0.1至0.2毫克/公斤，並且對卡莫司汀的劑量是約150至200毫克/平方公尺，並且對羅氮芥的劑量是約100至150毫克/平方公尺。

抗腫瘤蒽環類抗生素(anthracycline)衍生物是優越地以身體表面積每平方公尺10至75毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，例如：15至60毫克/平方公尺，特別是每次治療對多柔比星的劑量是約40至75毫克/平方公尺，對柔紅黴素的劑量是約25至45毫克/公斤，並且伊達比星的劑量是約10至15毫克/平方公尺。

曲妥珠是優越地以身體表面積每平方公尺1至5毫克(毫克/平方公尺)劑量投藥，特別是每次治療2至4毫克/平方公尺。

抗雌激素試劑是優越地以每日約1至100毫克的劑量投藥，取決於特別試劑及要治療的症狀。三苯氧胺是優越地以5至50毫克劑量口服投藥，較佳為每日兩次10至20毫克，連續治療足夠時間，以達到並維持治療效果。托瑞米芬是優越地以每日一次約60毫克劑量口服投藥，連續治療足夠時間，以達到並維持治療效果。阿那曲唑是優越地以每日一次約1毫克劑量口服投藥。屈洛昔芬是優越地以每日一次約20－100毫克劑量口服投藥。拉樂西芬是優越地以每日一次約60毫克劑量口服投藥。依西美坦是優越地以每日一次約25毫克劑量口服投藥。

這些劑量可以每次治療例如一次、兩次或多次投藥，其可重覆例如：每7、14、21或28天。

以其有用藥理性質的觀點，根據本發明之組份的組合，即：其他藥物試劑及HDAC抑制劑，可以對投藥目的被調配成各種醫藥形式。組份可被分別調配成各別醫藥組成物，或包含兩個組份的單元醫藥組合物。

因此本發明也係關於一種醫藥組合物，包含其他藥物試劑及HDAC抑制劑，與一或多種醫藥載劑一起。

本發明也係關於根據本發明之醫藥組合物形式的組合，包含抗癌症試劑及根據本發明之HDAC抑制劑，一或多種醫藥載劑一起。

本發明進一步係關於根據本發明之組合的用途，用在製造抑制腫瘤細胞生長的醫藥組合物上。

本發明進一步係關於一種包含根據本發明之HDAC抑制劑作為第一活性成份、及一種抗癌症試劑作為第二活性成份的產品，作為同時、分別或連續用來治療遭受癌症病患之治療的組合製劑。

實驗部份

下列實例被提供為說明的目的。

此後，”EDC”被定義為N’ －(乙基伸亞胺醯基)－N,N －二甲基－1,3－丙烷二胺單氫氯酸鹽，”DCM”被定義為二氯甲烷，”DIPE”被定義為二異丙基醚。”DMF”被定義為N,N－二甲基甲醯胺，”EtOAc”被定義為醋酸乙酯，”EtOH”被定義為乙醇，”HOBT”被定義為1－羥基－1H －苯並三唑，”MeOH”被定義為甲醇，”TFA”被定義為三氟醋酸，及”THF”被定義為四氫呋喃。

A.中間體化合物的製備 實例A1

a)中間體1的製備

2－(1－六氫吡基)－5－嘧啶羧酸乙酯(0.016莫耳)、(2－苯基乙烯基)－硼酸(0.016莫耳)及1,4－二噁烷－2,5－二醇(0.016莫耳)在EtOH(250毫升)中的混合物，在室溫下攪拌2天，並且然後溶劑被蒸發(真空)。殘餘物在DCM及水中溶解，並且有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析在氧化矽膠(15－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 97/1)。純的部份被蒸發，產生4克(61%)的中間體1，熔點128℃。

相對應於中間體1之酯類可以對掌色層分析分離。

b)中間體2的製備

中間體1(0.0007莫耳)在1當量濃度氫氧化鈉(10毫升)及THF(20毫升)的混合物中，在室溫下攪拌48小時。添加1當量濃度鹽酸(10毫升)。溶劑被蒸發。沉澱物被過濾，以水、然後以DIPE洗滌並且乾燥，產生0.2克(72%)的中間體2，熔點232℃。

c)中間體3的製

三乙基胺(0.012莫耳)、N’ －(乙基碳亞醯胺基)－N,N －二甲基－1,3－丙烷二胺(0.00593莫耳)、1－羥基－1H －苯並三唑(0.00593莫耳)及O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.00593莫耳)，被添加到中間體2(0.00395莫耳)在DCM(70毫升)及THF(70毫升)的混合物中，然後反應混合物在室溫下攪拌3天。添加H₂ O。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析上純化(梯度沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 97/3/0.1)。產物部份被收集並且有機溶劑被蒸發，產生1.5克(84%)的中間體3。

實例A2

a)中間體4的製備

2－(1－六氫吡基)－5－嘧啶羧酸乙酯(0.0042莫耳)、1,4－二噁烷－2,5－二醇(0.0042莫耳)及(E)－[2－(4－氯苯基)乙烯基]－硼酸(0.0042莫耳)在EtOH(100毫升)中的混合物，在室溫下攪拌72小時，被倒入水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(1.8克)以管柱色層分析在氧化矽膠(15－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 97/3/0.1)。兩個部份被收集並且有機溶劑被蒸發，產生0.85克F1(油狀)及0.25克F2(全部產率：63%)。F1從2－丙酮/DIPE結晶。沉澱物被過濾並且乾燥，產生0.6克的中間體4，熔點110℃。

b)中間體5的製

甲烷磺醯氯(0.0012莫耳)在5℃、N₂ 流下被添加到中間體4(0.0006莫耳)及三乙基胺(0.0024莫耳)於THF(15毫升)的溶液裡。混合物被帶到室溫，然後攪拌1小時，並且被倒入冰水中。混合物以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發，產生0.3克的中間體5。此產物被直接用於下一個反應步驟中。

c)中間體6的製備

在乙腈(30毫升)中之中間體5(0.0006莫耳)、嗎啉(0.0009莫耳)及碳酸鉀(0.0016莫耳)的混合物，在80℃下攪拌15小時，被倒入水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.27克)以管柱色層分析在氧化矽膠(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 100/0至90/10)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.085克(29%)的中間體6。

d)中間體7的製備

中間體6(0.0002莫耳)在1當量濃度氫氧化鈉(1.5毫升)及THF(3毫升)的混合物中，在室溫下攪拌72小時。添加1當量濃度鹽酸(1.5毫升)。混合物被蒸發至乾，產生中間體7。此產物被直接用於下一個反應步驟中。

e)中間體8的

中間體7(0.0002莫耳)、O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0002莫耳)、EDC(0.0002莫耳)、HOBT(0.0002莫耳)及三乙基胺(0.0002莫耳)的混合物，在室溫下攪拌48小時，被倒入水中，並且以EtOAc萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.095克)以管柱色層分析在氧化矽膠(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 97/3/0.1)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.04克(41%)的中間體8。

實例A3

a)中間體11的製

乙基鈦(0.0085莫耳)在室溫、N₂ 流下被添加到2－(1－六氫吡基)－5－嘧啶羧酸乙酯(0.0042莫耳)及4－苯基－3－丁烯－2－酮(0.0051莫耳)的溶液中。混合物在室溫下攪拌24小時，添加NaBH(OAc)₃ (0.0085莫耳)。混合物被攪拌5小時並且被倒入冰水中。添加DCM。混合物在寅氏鹽上過濾。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(1.6克)以管柱色層分析在迪馬(kromasil)(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 100/0至95/5)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.12克(8%)的中間體11。

b)中間體12的製備

中間體11(0.0003莫耳)及氫氧化鈉(0.0013莫耳)在EtOH(15毫升)中的混合物被攪拌並回流3小時，然後被冷卻到室溫，並且蒸發至乾。殘餘物在二乙醚中溶解。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.12克(100%)的中間體12，熔點>260℃。

c)中間體13的製備

EDC(0.0006莫耳)及HOBT(0.0006莫耳)在室溫、N₂ 流下被添加到中間體12(0.0003莫耳)在THF(15毫升)及DCM(15毫升)的溶液中。混合物被攪拌15分鐘。O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0006莫耳)被添加。混合物在室溫下攪拌48小時、被倒入冰水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析在迪馬(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 100/0至95/5)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.1克(70%)的中間體13。

實例A4

a)中間體14的製備

2－(1－六氫吡基)－5－嘧啶羧酸乙酯(0.059莫耳)在THF(300毫升)及1當量濃度氫氧化鈉(300毫升)中的混合物，在室溫下被留置隔夜，並且然後攪拌。添加1當量濃度鹽酸(300毫升)，並且混合物被攪拌10分鐘。添加碳酸鈉(0.178莫耳)，並且所得混合物在室溫下被攪拌10分鐘，然後以小部份地添加1－[[(9－芴基－9－基甲氧基)羰基]氧基]－2,5－四氫吡啶二酮(0.059莫耳)，並且反應混合物在室溫下被攪拌15分鐘。混合物以濃HCl酸化，並且沉澱物被過濾掉(真空)，產生22.5克(90%)的中間體14，熔點218.5－221.2℃。

b)中間體15的製備

三乙基胺(0.069莫耳)、然後EDC(0.0303莫耳)及HOBT(0.0303莫耳)，續以O－(四氫＝2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0303莫耳)，被添加到中間體14(0.0233莫耳)在DCM/THF(500毫升)的混合物中，並且反應混合物在室溫下攪拌18小時。混合物以DCM稀釋並且以水洗滌。有機層被分離，並且以10%碳酸鈉溶液洗滌。經分離之有機層被乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物以快速管柱色層分析純化(沖提液：在100分鐘中DCM/MeOH 100/0→975/25)。產物部份被收集並且溶劑被蒸發，產生84克(68%)的中間體15。

c)中間體16的製備

中間體15(0.016莫耳)在吡啶(0.040毫升)及DCM(200毫升)中的混合物，在室溫下被攪拌隔夜，並且反應混合物以水萃取，然後水層被濃縮並且與乙腈共同蒸發。殘餘物(35克)以快速管柱色層分析純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₃ 95/5/05)。產物部份被收集並且溶劑被蒸發，產生25克(50%)的中間體16，熔點70.8－93.9℃。

d)中間體17的製

中間體16(0.002莫耳)、(E)－[2－(4－氟苯基)乙烯基]－硼酸(0.002莫耳)及1,4－二噁烷－2,5－二醇(0.002莫耳)在EtOH(25毫升)中的混合物，在室溫下攪拌15小時、被倒到冰上。添加NAHCO₃ 。混合物以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.68克)以管柱色層分析在迪馬(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 100/0至90/10)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生027克(29%)的中間體17，熔點90℃。

實例A5

a)中間體18的製備

2－氧代－丙酸(0.0169莫耳)、然後2－(1－六氫吡基)－5－嘧啶羧酸乙酯(0.0169莫耳)被添加到[2－(4－氟苯基)乙烯基]－硼酸(0.0169莫耳)在DCM(150毫升)中的溶液中。混合物在室溫下被攪拌15小時。添加2－氧代－丙酸(0.4當量)及[2－(4－氟苯基)乙烯基]－硼酸(0.1當量)。混合物在室溫下被攪拌15小時，有機層以水洗滌、乾燥(MgSO₄ )並且溶劑被蒸發。殘餘物(7.7克)以管柱色層分析在氧化矽膠(15－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 92/8/0.1)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發。此殘餘物(6克)被溶解於3當量濃度HCl中。混合物在室溫下被攪拌2小時。沉澱物被過濾，以水(最小量)洗滌並且乾燥，產生2.8克(36%)的中間體18。

b)中間體19的製備

HOBT(0.0022莫耳)、然後EDC(0.0022莫耳)被添加到中間體18(0.0015莫耳)、N’ －甲基－甲烷胺(0.0022莫耳)及三乙基胺(0.0075莫耳)於DCM/THF(40毫升)的溶液裡。混合物在室溫被攪拌24小時，被倒入水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物被溶解於DIPE中。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.58克(85%)的中間體19，熔點195℃。

c)中間體20的製備

中間體19(0.0011莫耳)及氫氧化鋰(0.0023莫耳)在THF(20毫升)及水(10毫升)中的混合物，在室溫下攪拌15小時。添加3當量濃度HCl中。THF被蒸發。沉澱物被過濾，以水、然後二乙醚洗滌並且乾燥，產生0.45克(82%)的中間體20。

d)中間體21的

HOBT(0.0014莫耳)、然後EDC(0.0014莫耳)在室溫下被添加到中間體20(0.0009莫耳)、O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0014莫耳)及三乙基胺(0.0043莫耳)於DCM/THF(50/50，75毫升)的溶液裡。混合物在室溫被攪拌48小時，被倒入水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.7克)以管柱色層分析在氧化矽膠(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 99/1/0.1至94/6/0.6)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.38克(75%)的中間體21。

實例A6

a)中間體22

氫化鈉60%(0.0085莫耳)被分部份在5℃下被添加到中間體1(0.0065莫耳)在THF(60毫升)的溶液中。混合物在5℃下攪拌15分鐘。碘基甲烷(0.0078莫耳)在THF(5毫升)的溶液被逐滴添加。混合物在5℃下攪拌1小時，然後在室溫被攪拌5小時、被倒入水中，並且以EtOAc萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(1.75克)以管柱色層分析在氧化矽膠(15－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 99/1)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.87克(34%)的中間體22。

b)中間體23的製

中間體22(0.0027莫耳)及氫氧化鋰單水合物(0.0055莫耳)在THF(40毫升)及水(20毫升)中的混合物，在室溫下攪拌48小時、以1當量濃度HCl酸化。THF被蒸發。沉澱物被過濾，以最小量的水洗滌並且乾燥，產生0.91克(83%)的中間體23。

c)中間體24的製備

HOBT(0.0033莫耳)、然後EDC(0.0033莫耳)在室溫N₂ 流下被添加到中間體23(0.0022莫耳)、O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0033莫耳)及三乙基胺(0.01莫耳)於DCM/THF(90毫升)的溶液裡。混合物在室溫被攪拌48小時，被倒入水中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物(1.3克)以管柱色層分析在氧化矽膠(15－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 97/3/0.1)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發，產生0.93克(89%)的中間體24。

實例A7

a)中間體25的製

2－(1－六氫吡基)－5－吡啶羧酸乙酯(0.0085莫耳)、1,4－二噁烷－2,5－二醇(0.0093莫耳)及(E)－[2－(4－氯苯基)乙烯基]－硼酸(0.0042莫耳)在EtOH(200毫升)中的混合物，在室溫下攪拌15小時，然後過濾。濾液被蒸發。殘餘物被溶解於EtOAc。有機層以飽和NaCl洗滌、乾燥(MgSO₄ )、過濾並且溶劑被蒸發。殘餘物(3.3克)溶解在二乙醚中，並且在5℃下被逐滴添加在異丙醇(2毫升)中之5－6當量濃度HCl(10毫升)。沉澱物被過濾、以二乙醚洗滌並且乾燥。此部份被溶解於水中，K2CO3被添加，並且混合物以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發，產生2.7克(79%)的中間體25。

b)中間體26的製備

中間體25(0.002莫耳)及氫氧化鋰(0.004莫耳)在水(20毫升)及THF(40毫升)中的混合物，在室溫下攪拌15小時。混合物濃縮。添加3當量濃度鹽酸中。沉澱物被過濾，以水、然後二乙醚洗滌並且乾燥，產生0.52克(63%)的中間體26。

c)中間體27的製備

三乙基胺(0.0057莫耳)、N’ －(乙基碳亞醯胺基)－N,N －二甲基－1,3－丙烷二胺(0.0019莫耳)、1－羥基－1H －苯並三唑(0.0019莫耳)及O－(四氫－2H－吡喃－2－基)－羥基胺(0.0019莫耳)，被添加到中間體26(0.0012莫耳)在DCM(50毫升)及THF(50毫升)的混合物中。反應混合物在室溫下攪拌24小時，被倒入H₂ O中，並且以DCM萃取。有機層被分離、乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析在氧化矽膠上純化(梯度沖提液：DCM/MeOH/NH₄ OH 95/5/0.2)。產物部份被收集並且有機溶劑被蒸發，產生0.55(91%)。此殘餘物被溶解於二乙醚中，沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.5克的中間體27，熔點133℃。

實例A8

a)中間體28及29的製備 中間體28：游離鹼中間體29：C₂ H₂ O₄ (1：1)

醋酸酐(0.014莫耳)被逐滴添加在5℃下被添加到中間體3(0.0014莫耳)、4－N－N－二甲基胺基吡啶(0.0095克)及吡啶(2.5毫升)在DCM(14毫升)的混合物中。混合物在室溫下攪拌24小時、濃縮、被溶解於水中，並且以醋酸乙酯萃取。有機層被乾燥(MgSO₄ )、過濾掉並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析在氧化矽膠(5微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH 95/5)。純的部份被收集並且有機溶劑被蒸發，產生0.48克(58%)的中間體28。草酸鹽在一個部份(0.05克)製備，並從2－丙酮/二乙醚結晶。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.042克的中間體29，熔點154℃。

表F－1列出中間體根據上述實例之一製備。

表F－1(中間體)

B.最終產物的製備 實例B1

化合物1的製備

在TFA(2.5毫升)及MeOH(50毫升)中之中間體3(0.00121莫耳)的混合物被攪拌48小時，並且溶劑被蒸發。殘餘物以管柱色層分析在氧化矽膠LiChroprepNH₂ (25－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/H₂ O 80/20/2)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發。殘餘物被溶解於二乙醚中，並且然後沉澱物被過濾並且乾燥(真空)，產生0.26克(64%)的化合物1，熔點187℃。

實例B2

化含物2的製備

在三氟醋酸(0.2毫升)及MeOH(4.5毫升)中之中間體8(0.00007莫耳)的混合物在室溫下被攪拌96小時。溶劑被蒸發至乾。殘餘物從二乙醚/2－丙酮結晶。沉澱物被過濾並且乾燥，產生0.025克(57%)的化合物2，熔點135℃。

實例B3

化合物7的製備

在TFA(0.5毫升)及MeOH(10毫升)中之中間體13(0.0002莫耳)的混合物在室溫下被攪拌48小時，然後溶劑被蒸發至乾。殘餘物從二乙醚結晶。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.044克(44%)的化合物7，熔點161℃。

實例B4

化合物8的製

在TFA(1.2毫升)及MeOH(24毫升)中之中間體17(0.0005莫耳)的混合物在室溫下被攪拌5天。溶劑被蒸發至乾。殘餘物(0.26克)以管柱色層分析在氧化矽膠LiChroprepNH₂ (25－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/H₂ O 70/30/3)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.16克)從二乙醚結晶。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.13克(66%)的化合物8，熔點180℃。

實例B5

化合物9的製備

在TFA(1毫升)及MeOH(20毫升)中之中間體28(0.0005莫耳)的混合物在室溫下被攪拌96小時，然後被蒸發。殘餘物(0.23克)以管柱色層分析在氧化矽膠LiChroprepNH₂ (25－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/H₂ O 80/20/2)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.106克)從二乙醚/DIPE結晶。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.067克(34%)的化合物9，熔點161℃。

實例B6

化合物10的製備

在TFA(1.9毫升)在5℃下被逐滴添加在MeOH(38毫升)中之中間體21(0.0007莫耳)的溶液中。混合物在室溫下被攪拌48小時，然後被蒸發至乾。殘餘物從二乙醚/CH₃ CN結晶。沉澱物被過濾、以二乙醚洗滌並且乾燥，產生0.24克(62%)的化合物10，熔點146℃。

實例B7

化合物11的製

在TFA(4.4升)及MeOH(87毫升)中之中間體24(0.0018莫耳)的混合物在室溫下被攪拌4天，然後被蒸發至乾。殘餘物(1.05克)以管柱色層分析在氧化矽膠LiChroprepNH₂ (25－40微米)上純化(沖提液：DCM/MeOH/H₂ O 80/20/2)。純的部份被收集並且溶劑被蒸發。殘餘物(0.634克)被溶解二乙醚中。沉澱物被過濾掉並且乾燥，產生0.43克的化合物11，熔點212℃。

實例B8

化合物31的製備

在三氟醋酸(3毫升)及MeOH(60毫升)中之中間體27(0.0011莫耳)的混合物在室溫下被攪拌48小時。溶劑被蒸發至乾。殘餘物從二乙醚結晶。沉澱物被過濾並且乾燥，產生0.515克(89%)的化合物31，熔點145℃。

表F－2列出化合物根據上述實例之一製備。下列縮寫被用於表中：.C₂ HF₃ O₂ 代表三氟醋酸。

C.藥理實例

用來抑制組蛋白去乙醯基酶(見實例C.1)的試管中分析方法，測量以式(I)化合物獲得之HDAC酵素活性的抑制。

式(I)化合物之細胞活性在A2780腫瘤細胞上、使用色度分析方法來測量細胞毒性或存活率(Mosmann Tim,Journal of Immunological Methods 65：55－63,1983)(見實例C.2)。

化合物的溶解度測量化合物留在溶液中的能力。在第一個方法中，化合物留在水溶液中的能力在稀釋(見實例C.3)被測量。DMSO－母液以單一水性緩衝溶劑以3個連續步驟被稀釋。對每一個稀釋混濁度以散光儀測量。

在第二個方法中，化合物留在不同pH的溶解度可使用化學螢光氮偵測器(見實例C.3.b)測量。

藥物滲透性表現其從一個介質到另一個的能力。特別是其自腸膜移動到血流及/或自血流到目標的能力。滲透性(見實例C.4)可經由濾器固定人造膜磷脂質雙層的形成來測量。在濾器固定人造膜分析方法中，”三明治”以96孔微滴定板及96孔濾器板形成，使得各複合孔被分成底部具捐贈者溶液及上面為接受者溶液的兩室，以2%(重量/體積)十一烷溶液或二油基磷脂醯基膽鹼塗覆的125微米微濾器碟(0.45微米孔徑)分離，當系統接觸水性緩衝溶液時，在多重薄板雙層的條件下形成濾器隧道。化合物經由此人造膜的滲透性以公分/秒測量。目的是尋求藥物經由平行人造膜在2個不同pH：4.0及7.4的滲透性。化合物偵測以UV光譜在250及500毫微米之間的最佳波長下進行。

藥物的代謝意為脂質溶解降解外來或生物內生的化合物，被酵素轉型成(a)極性、水溶性、及可分泌的代謝物。藥物代謝的主要器官為肝臟。代謝產物通常為比母藥物不活性、或失去活性。然而，一些代謝物可具有增進的活性或毒性效果。因此藥物代謝可包括”解毒作用(detoxication)”及”中毒作用(toxication)”兩種方法。測量微生物以藥物及化學品治療之能力的主要酵素系統之一，是以cytochrome P450單氧酶代表，其為依賴NADPH的酵素。化合物的代謝穩定性可在試管使次細胞人類組織中(見實例C.5.a)測量。在此的化合物代謝穩定性在這些化合物以微粒體培養15分鐘之後，以藥物代謝的%表示。化合物的定量以LC－MS分析測量。化合物的代謝穩定性也可以計算在老鼠肝臟細胞中的化合物的半衰期測量(見實例C.5.b)。

已顯示廣泛種類的抗腫瘤試劑活化p21蛋白質，包括DNA損壞試劑及組蛋白去乙醯基酶抑制劑。DNA損壞試劑經由腫瘤壓制劑p53活化p21基因，而組蛋白去乙醯基酶抑制劑轉錄地經由轉錄因子Sp1活化p21基因。因此，DNA損壞試劑經由p53反應性元素活化p21啟動子，而組蛋白去乙醯基酶抑制劑經由sp1位置(座落在－60 bp至＋40 bp區域、相對於TATA盒)活化p21啟動子，兩者導致p21蛋白質的增加表現。當在細胞中之p21啟動子由不包含p53反應性元素之p21 1300 bp啟動子片斷組成時，因此其對DNA損壞試劑無反應性。化合物引發p21的能力可以幾種方式評估。第一個方法是以有興趣的化合物治療腫瘤細胞，並且在細胞裂解(lysis)之後，偵測以p21酵素聯結之免疫吸收分析方法(Oncogene之WAF1 ELISA)的p21引發。對人類p21蛋白質特定的兔子多株抗體已被固定到提供在工具組中之塑膠孔的表面。在樣本中呈現之要被分析的任何p21，會鍵結到捕捉抗體。生物素化的偵測器單株抗體也認知人類p21蛋白質，並且會鍵結到被捕捉抗體留持的任何p21。依序地，偵測器抗體被辣根過氧化酶綴合的鏈酶親和素鍵結。辣根過氧化酶催化呈色基質四甲基聯苯胺(benzidine)的轉換，從無色溶液成為藍色溶液(或在添加停止試劑之後為黃色)，其強度是與鍵結到板上之p21蛋白質份量成比例。顏色反應產物使用光譜儀定量。定量以使已知濃度的p21(以凍乾提供)建立標準曲線而達成。此分析方法測量p21引發為DNA損壞或組蛋白去乙醯基酶抑制劑的結果(見實例C.6.a)。

另一個方法測試化合物在細胞層次引發p21為HDAC抑制之後果的能力。細胞可被穩定地以包含p21 1300bp、但不包含p53反應性元素之啟動子片斷的表現載體轉染，並且與控制層次比較，其中受體基因表現的增加鑑別出該化合物具有p21引發能力。報告者基因是螢光蛋白質，並且該報告者基因的表現以釋出之螢光的份量測量(見實例C.6.b)。最後一個方法是一個在活體中方法，其中老鼠被用來篩選化合物的醫藥活性。上述穩住轉染腫瘤細胞可以足以影響腫瘤之生產的份量投藥給老鼠。在腫瘤細胞具有足夠的時間形成腫瘤之後，有潛力的活性化合物可投藥給動物，並且該化合物在腫瘤細胞的影響以報告者基因之表現的測量評估。與控制層次比較(見實例C.6.c)，以醫藥活性化合物培養會造成報告者基因表現的增加。

特定HDAC抑制劑必須不抑制像是大量CYP P450蛋白質的其他酵素。CYP P450(大腸桿菌表現的)蛋白質3A4、2D6 en 2C9轉化其特定基質成為螢光分子。CYP3A4蛋白質轉化7－苄基氧基－三氟甲基香豆素(BFC)成為7－羥基－三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白質轉化3－[2－(N,N－二乙基－N－甲基胺基)乙基]－7－甲氧基－4－甲基香豆素(AMMC)成為3－[2－(N,N－二乙基)乙基]－7－羥基－4－甲基香豆素氫氯酸鹽，並且CYP2C9蛋白質轉化7－甲氧基－4－三氟甲基香豆素(MFC)成為7－羥基－4－三氟甲基香豆素。抑制酵素反應的化合物會造成螢光訊號的減少(見實例C.7)。

實例C.1：對組蛋白去乙醯基酶之抑制的試管中分析方法

使用Biomol(目錄號碼：AK－500－0001)之HDAC螢光活性分析方法/藥物發現工具。HDAC螢光活性分析方法是以Fluor de Lys(螢光組蛋白去乙醯基酶離胺基，Fluor ogenic Hostonede AcetylaseLys yl)基質及顯影劑組合為基礎。Fluor de Lys基質包含去乙醯基化離胺酸支鏈。基質之去乙醯基化敏感化基質，使得在第二步驟中，以Fluor de Lys顯影劑產生螢光物質。

HeLa核萃取物(供應者：Biomol)在60微克/毫升下、以75微莫耳濃度的基質培養。Fluor de Lys基質被添在含25毫莫耳濃度Tris、137毫莫耳濃度NaCl、2.7毫莫耳濃度KCl及1毫莫耳濃度MgCl₂ .6H₂ O的緩衝液中、在pH7.4下培養，添加1體積的顯影劑。螢光物質以355毫微米的光激發，並且釋出光(450毫微米)在螢光板讀計上偵測。對各實驗而言，控制組(含HeLa核萃取物及緩衝液)、空白培養(含緩衝液、但無HeLa核萃取物)及樣本(含溶解於DMSO之化合物，並且進一步在緩衝液及HeLa核萃取物中稀釋)平行進行。在第一例中，化合物在10^{－ 5} 莫耳濃度的濃度下被測試。當化合物顯示在10^{－ 5} 莫耳濃度的活性時，獲得濃度反應曲線，其中化合物在10^{－ 5} 莫耳濃度及10^{－ 9} 莫耳濃度的濃度下測試。所有的樣本被測試4次。在各測試中，空白值從兩個控制組及樣本值減去。控制組樣本代表100%的基質去乙醯基化。對各樣本，螢光以控制組之平均值的百分比表示。當適當IC_{5 0} 值(需要減少代謝物份量到50%控制組的藥物濃度)，使用對分等資料之probit分析計算。在此測試化合物的影響以pIC_{5 0} 表示(IC_{5 0} 值的負對數值)(見表F－3)。

實例C.2：在A2780細胞上的抗增生活性的測量

所有化合物被溶解在DMSO中，並且進一步稀釋在培養介質中。在細胞增生分析方法中最終DMSO濃度決不超過0.1%(體積/體積)。控制組含A2780細胞及DMSO、無化合物，並且及空白組含DMSO、但無細胞。MTT被溶解在5毫克/毫升的PBS中。製備胺基乙酸緩衝液包含0.1莫耳濃度的胺基乙酸及0.1莫耳濃度的NaCl，以NaOH緩衝到pH 10.5(1當量濃度)(所有的試劑是來自Merck)。

人類A2780卵巢惡性腫瘤細胞(一種禮物來自T.C.Hamilton醫師[Fox Chase Cancer Centre,Pennsylvania,USA])在PRMI 1640介質中培養，以2毫莫耳濃度L－谷胺酸、50微克/毫升慶大酶素(gentamicin)及10%胚胎牛血清補充。

細胞被習慣性地保持為在37℃下、在人類化5%CO₂ 氣壓下單層培養。細胞一週一次被通過，使用trypsin/EDTA溶液以1：40分裂比率。所有的介質及補充物從Life Technologies獲得。細胞是無黴漿菌汙染，使用Gen－Probe Mycoplasma Tissue Culture工具組(供應者：BioMrieus)測量。

細胞被種在NUNU^{T M} 96孔培養板上(供應者：Life Technologies)，並且容許黏附到塑膠上隔夜。對板所使用之密度為總體積200微生介質中每孔1500細胞。在細胞黏附於板上之後，介質被改變並且藥物及/或溶劑被添加到最終體積為200微升。在培養四天之後，介質以200微升新鮮介質置換，並且細胞密度及存活性使用MTT為基礎的分析方法評估。對各孔添加25微升的MTT溶液，並且細胞被進一步在37℃下培養2小時。然後介質被小心地送氣，並且藍色MTT－甲簪(formazan)產物添加25微升的胺基乙酸緩衝液、續以100微升DMSO而被溶解。微測試板在微板搖晃器上搖晃10分鐘，並且在540毫微米的吸收使用Emax 96孔光譜儀(供應者：Sopachem)測量。在實驗爭，對各實驗條件的結果為3個重覆孔的平均。對起初篩選目的而言，化合物在10^{－ 6} 莫耳濃度的單一固定濃度下被測試。對活性化合物而言，實驗被重覆，以建立完全濃度反應曲線。對各實驗而言，控制組(不含藥物)及空白培養(不含細胞或藥物)被平行進行。空白值從所有控制組及樣本值減去。對各樣本而言，細胞生長的平均值(以吸收單位計)以控制組之細胞生長平均值的百分比表現。當適當時，IC_{5 0} 值(需要減少代謝物份量到50%控制組的藥物濃度)，IC_{5 0} 值(需要細胞生長到控制組50%的藥物濃度)使用對分等資料之probit分析計算(Finney,D.J.Probit Analyses，第2版，Graded Responses第10章，Cambridge Univeristy Press,Cambridge 1962)。在此測試化合物的影響以pIC_{5 0} 表示(IC_{5 0} 值的負對數值)(見表F－3)。

實例C.3：溶解度/穩定性

C.3.a.：在水性介質中的動力溶解度在第一稀釋步驟中，活性化合物溶解於DMSO(5毫莫耳濃度)之10微升濃母液，被添加到100微升磷酸鹽檸檬酸鹽pH 7.4緩衝液中並且混合。在第二稀釋步驟中，部份(20微升)的第一稀釋步驟被進一步分散於100微升磷酸鹽檸檬酸鹽pH 7.4緩衝液中並且混合。最後，在第三稀釋步驟中，樣本(20微升)的第二稀釋步驟被進一步稀釋在100微升磷酸鹽檸檬酸鹽pH 7.4緩衝液中並且混合。所有的稀釋在96孔板上進行。在最後一個稀釋步驟立即之後，三個連續稀釋步驟的混濁度以散光儀測量。對各化合物進行三回稀釋，以排除偶發錯誤。在混濁度測量為基礎下，排名以3類被進行。有高溶解度的化合物獲得分數3，並且對此化合物的第一稀釋液為澄清的。具中溶解度的化合物獲得分數2。對這些化合物而言，第一稀釋液不是澄清的，並且第二稀釋液為澄清的。具低溶解度的化合物獲得分數1。對這些化合物而言，第一及二稀釋液不是澄清的(見表F－3)。

C.3.b.溶解度 化合物在不同pH的溶解度也可以使用化學螢光氮偵測器測量(見表F－3)。

實例C.4：平行人造膜滲透性分析

母液樣本(10微升母液在100%DMSO之5毫莫耳濃度的部份)，在含2毫升水性緩衝液系統之pH 4或pH 7.4(PSR4系統溶液濃縮液(pION))的深孔或預先混合板中稀釋。在樣本添加到參考板之前，150微升緩衝液被添加到孔中，並且進行空白UV測量。之後，緩衝液被丟棄，並且該板被用做參考板。所有的測量在抗UV板中進行(供應者：Costar或Greiner)。

在參考板之空白測量之後，150微升的經稀釋樣本被添加到參考板上，並且添加200微升的經稀釋樣本到捐贈者板1。接受者過濾板1(供應者：Millipore，種類：MAIP N45)以4微升形成人造膜的溶液塗覆(在十一烷中的1,2－二油基－sn－Glycer－3－磷基膽鹼，含0.1% 2,6－二－第三－丁基－4－甲基酚，並且置於捐贈者板1的頂部，形成”三明治”。緩衝液(200微升)被分散在頂部的接受者孔。三明治以蓋子覆蓋，並且在黑暗中、室溫下18小時。

接受者板2之空白測量經由添加150微升的緩衝液到孔中而被測量，續以UV測量。在接受者板2的空白測量之後，緩衝液被丟棄，並且150微升的接受者溶液從接受者過濾板1被轉移到接受者板2。然後接受者過濾板從三明治移除。在捐贈者板2的空白測量之後(見上述)，150微升的捐贈者溶液從捐贈者板1被轉移到捐贈者板2。捐贈者板2、接受者板2及參考板之UV光譜被篩選(具SpectraMax 190)。所有的光譜以PSR4p Command Software進行滲透性的計算。所有化合物被測量三次。痛痙丁(Carbamazepine)、灰黃黴素(griseofulvin)、acyloguanisine、阿替洛爾(atenolol)、呋塞米(furosemide)及氯噻嗪(chlorothiazide)在各實驗中被用做標準物。化合物以具有低滲透性(平均影響<0.5x10^{－ 6} 公分/秒；分數1)、中滲透性(1x10^{－ 6} 公分/秒>平均影響>0.5x10^{－ 6} 公分/秒；分數2)或高滲透性(1x10^{－ 6} 公分/秒；分數3)而被分3類排名。

實例C.5：代謝溶解度

實例C.5.a. 次細胞組織是根據Gorrod等人(Xenotiotica 5：453－462,1975)製備，在機械均質組織之後以離心分離。肝組織以冰冷0.1莫耳濃度Tris－HCl(pH 7.4)緩衝液洗滌，洗掉過量血液。然後組織被快速乾燥(blotted dry)、稱重並使用手冊剪刀粗切。組織碎片在3體積冰冷0.1莫耳濃度磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中、使用配備鐵氟龍(Telfon)杵或Sorvall Omni－Mix均質器的Potter－S(Braun,Italy)、以7×10秒均質化。在兩個情況下，容器在均質製程期間被保持在冰中/上。

組織均質物在9000x g、4℃下、使用Sorvall離心機或Beckman Ultracentrifuge離心20分鐘。所得之上清液被儲存在－80℃並且被稱為’S9’。

S9部份可再於100.000x g(4℃)下、使用Beckman抄離心機離心60分鐘。所得之上清液被小心地送氣、分成幾個部份並且被稱為’胞質深膠(cytokol)’。該錠狀物再被懸浮於每0.5原始組織重量最終體積1毫升裡的0.1莫耳濃度磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中，並且被稱為’微粒體’。

所有的次細胞部份被分成幾個部份、立刻冷卻在液氮中並且被儲存在－80℃下直到使用。

對被測試之樣本而言，培養包含PBS(0.1莫耳濃度)、化合物(5微莫耳濃度)、微粒體(毫克/毫升)及NADPH產生系統(0.8毫莫耳濃度葡萄糖－6－磷酸鹽)、0.8毫莫耳濃度氯化鎂及0.8單位葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶)混合物。控制組樣本包含相同物質，但微粒體以熱失活的(在攝氏95度下10分鐘)微粒體置換。在控制組樣本中之化合物回收總是100%。

混合物在攝氏37度下預先培養5分鐘。反應在時間點(t＝0)以添加0.8毫莫耳濃度NADP開始，並且樣本被培養15分鐘(t＝15)。反應以添加2體積的DMSO中止。然後樣本在900x g下離心，並且上清液在分析前被儲存在室溫下不超過24小時。所有的培養進行兩次。上清液的分析以LC－MS分析進行。樣本的沖提在Xterra MS C18(50×4.6毫米、5微米、Waters,US)上進行。使用Alliance 2790(供應者：Waters,US)HPLC系統。沖提是以緩衝液A(在H₂ O/乙腈(95/5)中的25毫莫耳濃度醋酸銨(pH 5.2))、為乙腈的溶液B及為甲醇的溶液C，流速2.4毫升/分鐘。所用的梯度是在5分鐘內以線性方式，增加有機相濃度從0%至50%B及50%C，到在1分鐘內高至100%B，並且有機相濃度被保持固定再1.5分鐘。樣本之總注射體積為25微升。

配有ESI來源的Quattro(供應者：Micromass,Manchester,UK)三重四極桿e質譜儀被用做偵測器。來源及去溶解化溫度是分別定在120及350℃，並且氮氣被用做噴霧器及乾燥氣體。資料以正向掃瞄模式(單一離子反應)收集。圓錐形伏特被定在10伏特，並且停駐時間為1秒。

代謝溶解度以在活性微粒體存在下培養15分鐘之後化合物的代謝%表示(E(act))(代謝%＝100%－(()x 100)。具有百分比代謝低於20%的化合物被定義為高代謝穩定的。具有百分比代謝在20%及70%之間的化合物被定義為中代謝穩定的，並且顯示百分比代謝高於70%的化合物被定義為低代謝穩定的。不論代謝穩定性篩選的進行，三個參考化合物總被包括。維拉帕米(Verapamil)被包括為低代謝穩定的化合物(代謝%＝73%)。西沙必利(Cisapride)被包括為中代謝穩定的化合物(代謝% 45%)，並且丙醇被包括為高代謝穩定的化合物(25%代謝%)。這些參考化合物被用來確認代謝穩定性分析方法。

實例C.5.b.老鼠肝細胞培養的代謝穩定性 老鼠肝細胞是自公的Sprague Dowley老鼠單離。化合物溶解到在100%DMSO中的5毫莫耳濃度母液裡，並且在最終濃度5微莫耳濃度中與老鼠肝細胞培養物(0.5百萬活細胞/0.5毫升)、使用24孔板培養0、15、30、60及120分鐘。

樣本以添加兩體積的DMSO而對LC－MS製備。樣本被完全地搖晃並且接著在900g下離心10分鐘(室溫)。所有的實驗被進行三次。所得上清液50微升被以LC－MS分析。

對LC－MS而言，樣本的沖提在Hypersil BDS C18管柱上(50×4.6毫米，5微米，Thermohypersil,UK)進行。HPLC系統包含配備有Surveyor自動取樣裝置的Surveyor傳遞系統(Surveyor Inc.,San JoSe,US)。沖提是緩衝液A(在H₂ O/乙腈(95/5)中之10毫莫耳濃度醋酸銨(pH 6.9))及溶劑B(乙腈)，流速1.2毫升/分鐘。所用的梯度是0.5分鐘溶劑A作為開始條件，續以線性方式在2分鐘內增加有機相濃度從0%B直到95%B。該相被保持固定再1.5分鐘，並且在0.5分鐘內再減少到0%B。

樣本之總注射體積為50微升。管柱烘箱溫度被保持在40℃。LC流動對MS偵測分流，並且0.1毫升進到來源。配備ESI來源的三重四極桿(quadrupol)質譜TQS Quantum(Thermofinnigan,LaJolla,USA)質譜被用來偵測。來源伏特被定為3800伏特，毛細管溫度300℃。質譜儀以SIM之正向掃瞄模式操作，被調整到M＋H質量具掃瞄寬度1道耳頓(Da)，用於定量目的。儀器控制、資料收集及處理使用Xcalibur軟體(ThermoFinniga,San Jose,CA,U.S.A.)進行。在老鼠肝細胞中之化合物的代謝穩定性以試管中的半衰期表示。

作為參考，使用化合物R306465(WO03/76422)(試管中的半衰期：8分鐘)。本發明的化合物4被測試，並且具有試管中的半衰期：23分鐘)。

實例C.6：p21引發能力

實例C.6.a.p21酵素聯結之免疫吸收分析方法 下列步驟已被用於測試在人類A2780卵巢惡性腫瘤細胞中的p21蛋白質表現程度。A2780細胞(20000個細胞/180微升)被種於在PRMI 1640介質的96孔板中，以2毫莫耳濃度L－谷胺酸、50微克/毫升慶大酶素及10%胚胎牛血清補充。在細胞裂解的24小時之前，化合物添加的最終濃度為10^{－ 5} 、10^{－ 6} 、10^{－ 7} 及10^{－ 8} 莫耳濃度。所有被測試的化合物被溶解於DMSO中，並且再稀釋在培養介質中。在添加化合物的24小時之後，上清液從細胞移除。細胞以200微生冰冷PBS洗滌。孔被送氣並且添加30微升的裂解緩衝液(50毫莫耳濃度Tris.HCl(pH 7.6)、150毫莫耳濃度NaCl、1% Nonidet p40及10%甘油)。該板在~70℃下被培養隔夜。

適當數目的微滴定孔從箔囊(foil pouch)中被移除，並且被置於空的孔支持架。製備洗滌緩衝液(20x板洗滌濃縮液：100毫升的20倍PBS及界面活性劑的濃縮溶液，含2%氯乙醯胺)的工作溶液(1x)。經凍乾的p21 WAF標準物與蒸餾H₂ O重組，並且再以樣本稀釋劑稀釋(在工具組中提供)。

樣本在樣本稀釋劑中以其1：4稀釋而製備。樣本(100微升)及P21 WAF1標準物(100微升)被滴到適當孔中，並在室溫下培養2小時。該孔以1x洗滌緩衝液洗滌3次，並且然後將100微升的偵測器抗體試劑(生物素化單株p21 WAF1抗體)滴動各孔中。該孔在室溫下被培養1小時，並且然後以1x洗滌緩衝液洗滌3次。400x綴合物(過氧化酶鏈酶親和素綴合物：400倍濃縮溶液)被稀釋，並且添加100微升的1x溶液到孔中。該孔在室溫下被培養30分鐘，並且然後以1x洗滌緩衝液洗滌3次及蒸餾H₂ O 1次。基質溶液(呈色基質)(100微升)被添加到各孔，並且該孔在黑暗中、室溫下被培養30分鐘。停止溶液以與前面添加基質溶液的相同順序被添加到各孔中。在各孔中的吸收使用光譜板讀計在450/595毫微米的雙重波長下測量。對各實驗而言，控制組(不含藥物)及空白培養(不含細胞或藥物)平行進行。空白值從所有控制及樣本值中減去。對各樣本而言，p21 WAF1引發值(以吸收單位計)以在控制組中存在之p21 WAF1值的百分比表示。百分比引發高於130%被定義為重大引發。四個化合物被測量，並且都顯示重大引發。

實例C.6.b.細胞方法 A2780細胞(ATCC)在PRMI 1640介質中、在37℃下濕度培養器中以5%CO₂ 培養，以10%FCS、2毫莫耳濃度L－谷胺酸、慶大酶素補充。其他物質由Nunc提供。

基因體DNA從增生A2780細胞中萃取，並且對p21促進子之巢式(nested)PCR單離用做模板。第一次放大在55℃退火溫度下以20個循環進行，使用具基因體DNA做模板之寡核苷對GAGGGCGCGGTGCTTGG及TGCCGCGCTCTCTCACC。包含相對於TATA盒之－4451至＋88片斷的所得4.5 kb片斷，被再與寡核苷TCGGGTACC GAGGGCGCGGTGCTTGG及ATACTCGAG TGCCGCCGCTCTCTCACC放大，在88℃下退火20個循環，包含相對於TATA盒之－1300至＋88片斷的所得1.3 kb片斷。存在於寡核苷(畫底線序列)之限制位置XhoI及KpnI被用來次複製(subcloing)。

螢光酵素報告者從pGL3鹼性移除，並且在XhoI及KpnI限制位置上以ZSGreen報告者(來自pZsGreen－N1質體)置換。pGL3－鹼性－ZsGreen－1300經由人類p21促進子區域之上述1.3 kb片斷插入，而被建構到XhoI及KpnI限制位置上。所有限制酵素由Boehringer Manheim(德國)提供。A2780細胞以2×10⁵ 個細胞的密度被置於6孔板上、培養24小時，並且以2微克的pGL3－鹼性－ZsGreen－1300及0.2微克的pSV2neo引子轉染，藉著使用由製造商敘述的Lipofectamine 2000(Invitrogen,Brussels,Belgium)。經轉染的細胞以G418(Gibco－BRL,Gaithersburg,MD)被選擇10天，並且單一細胞懸浮液被生長。在三週後，獲得單一複製物。

A2780所選之選殖物被擴張，並且以每孔10000細胞種到96孔板上。在種下24小時之後，細胞以化合物再處理24小時(在接近p21促進子區域中影響sp1位置)。接著，細胞以4%PFA被固定30分鐘，並且以Hoechst染料復染劑(counterstain)。p21促進子活化導致ZsGreen生長，並且因此螢光以Ascent Fluoroskan(Thermo Labsystems,Brussels,Belgium)監測。

對各實驗而言，控制組(不含藥物)及空白培養(不含細胞或藥物)平行進行。空白值從所有控制組及樣本值減去。對各樣本而言，p21引發值以存在於控制組之p21值的百分比表示。百分比引發高於130%被定義為顯著之引發。

二十六個化合物被測量，且都顯示顯著之引發。

實例C.6.c.活體方法 所選之選殖物被皮下注射(10⁷ 個細胞/200微升)到裸鼠的側面，並且兩腳規可測試腫瘤在12天之後獲得。從第12天起，動物被口服或靜脈地在6天期間每日以溶劑及20－40 mpk化合物(各4－10個動物)施用劑量。腫瘤以在自家發展之自行整體影像系統(Automated Whole Body Imaging System)(配備GFP濾器之螢光立體顯微鏡種類OlymupusSZX12，並且偶合對CCD照相機種類J21CV－M90，以來自National Instruments的IMAQ Vision Software基礎套裝軟體控制)對螢光評估。使用化合物R306465(WO03/76422)(試管中的半衰期：8分鐘)做為參考。化合物被排名為不具活性(無螢光可測量的)、比R306465較弱、相同或較佳。化合物1被測試，並且在口服投藥之後比R306465更佳。

實例C.7：P450抑制能力

被測試之所有化合物被溶解於DMSO(5毫莫耳濃度)，並且進一步在乙腈中稀釋到5×10^{－ 4} 莫耳濃度。進一步的稀釋是在分析緩衝液(0.1莫耳濃度NaK磷酸鹽緩衝液pH 7.4)中完成，並且最終濃度是決不高於2%。

對CYP3A4蛋白質的分析方法包含每孔15毫微莫耳P450/毫克蛋白質(在0.01莫耳濃度NaK磷酸鹽緩衝液＋1.15%KCl)、NADPH產生系統(在分析緩衝液中3.3毫莫耳濃度葡萄糖－6－磷酸鹽、0.4 U/毫升葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶、1.3毫莫耳濃度NADP及3.3毫莫耳濃度MgCl₂ .6H₂ O)及在總分析體積100微升中的化合物。在37℃下預先培養5分鐘之後，酵素反應以添加在分析緩衝液中之150微莫耳濃度的螢光探針基質BFC開始。在室溫下培養30分鐘之後，反應在添加2體積乙腈之後被終止。螢光測量在激發波長405毫微米及釋出波長535毫微米下進行。酮康唑(Ketoconazole)(IC_{5 0} 值＝3×10^{－ 8} 毫莫耳濃度)在使實驗中被包括做為參考物質。對CYP3A4蛋白質的分析方法包含每孔6毫微莫耳P450/毫克蛋白質(在0.01莫耳濃度NaK磷酸鹽緩衝液＋1.15%KCl)、NADPH產生系統(在分析緩衝液中0.41毫莫耳濃度葡萄糖－6－磷酸鹽、0.4 U/毫升葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶、0.0082毫莫耳濃度NADP及0.41毫莫耳濃度MgCl₂ .6H₂ O)及在總分析體積100微升中的化合物。在37℃下預先培養5分鐘之後，酵素反應以添加在分析緩衝液中之3微莫耳濃度的螢光探針基質AMMC開始。在室溫下培養45分鐘之後，反應在添加2體積乙腈之後被終止。螢光測量在激發波長405毫微米及釋出波長460毫微米下進行。奎內定(Quinidine)(IC_{5 0} 值<5×10^{－ 8} 毫莫耳濃度)在使實驗中被包括做為參考物質。

對CYP2C9蛋白質的分析方法包含每孔15毫微莫耳P450/毫克蛋白質(在0.01莫耳濃度NaK磷酸鹽緩衝液＋1.15%KCl)、NADPH產生系統(在分析緩衝液中3.3毫莫耳濃度葡萄糖－6－磷酸鹽、0.4U/毫升葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶、1.3毫莫耳濃度NADP及3.3毫莫耳濃度MgCl₂ .6H₂ O)及在總分析體積100微升中的化合物。在37℃下預先培養5分鐘之後，酵素反應以添加在分析緩衝液中之200微莫耳濃度的螢光探針基質MFC開始。在室溫下培養30分鐘之後，反應在添加2體積乙腈之後被終止。螢光測量在激發波長405毫微米及釋出波長535毫微米下進行。磺胺苯比唑(Sulfaphenazole)(IC_{5 0} 值＝6.8×10^{－ 7} 毫莫耳濃度)在使實驗中被包括做為參考物質。

對起初篩選目的而言，化合物在單一固定濃度1×10^{－ 5} 莫耳濃度下被測試。對活性化合物而言，實驗被重覆以建立完整的濃度反應曲線。對各實驗而言，控制組(不含藥物)及空白培養(不含酵素或藥物)被平行進行。所有化合物被分析四次。空白值從所有控制組及樣本值減去。對各樣本而言，樣本之P450活性的平均值(相對於螢光單位)以控制組之P450活性的平均值百分比表示。百分比抑制以100%減去樣本之P450活性的平均值來表示。當適當時，IC_{5 0} 值(需要減少P450活性到50%控制組的藥物濃度)被計算。

D.組成物實例：薄膜塗覆的藥片

製備藥片核心 100克式(I)化合物、570克乳糖及200克澱粉的混合物被良好地混合，並且之後以5克十一烷基硫酸鈉及10克聚乙烯基－四氫吡咯酮在約200毫升水中的溶液濕潤。濕粉末混合物被過篩、乾燥並且再過篩。然後添加100克微結晶纖維素及15克氫化蔬菜油。整體被良好地混合，並且被壓成藥片，產生10.000個藥片，各包含10毫克的式(I)化合物。

塗層 對在75毫升變性乙醇中的10克甲基纖維素溶液，添加5克乙基纖維素在150毫升二氯甲烷中的溶液。然後添加75毫升二氯甲烷及2.5毫升1,2,3－丙烷三醇，10克聚乙二醇被熔化並且溶解於75毫升二氯甲烷中。後者溶液被添加到前者，並且然後添加2.5克的十八烷酸鎂、5克的聚乙烯基－四氫吡咯酮及30毫升的濃縮有色懸浮液，並且整體被均質化。因此藥片核心以所獲得之混合物在塗覆裝置中被塗覆。

Claims (12)

1. 一種式(I)化合物， 其N-氧化物形式、醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式，其中各X是獨立為N或CH；R¹ 是苯基；其中該苯基視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、多鹵基C_1-6 烷基、芳基、羥基、氰基、胺基、C_1-6 烷基羰基胺基、C_1-6 烷基磺醯基胺基、羥羰基、C_1-6 烷氧基羰基、羥基C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基甲基、胺甲基、C_1-6 烷基胺甲基、C_1-6 烷基羰基胺甲基、C_1-6 烷基磺醯基胺基甲基、胺基磺醯基、C_1-6 烷基胺基磺醯基或雜環基的取代基取代；R² 是氫、-CH₂ -R⁵ 、三氟甲基、-C(=O)-R⁶ 、或-CH₂ -NR⁷ R⁸ ；其中各R⁵ 獨立選自氫、羥基、C_1-6 烷氧基、C_1-6 烷氧基C_1-6 烷氧基、C_1-6 烷基羰基氧基、六氫吡基、N-甲基六氫吡基、嗎啉基、硫基嗎啉基、咪唑基或三唑基；各R⁶ 是獨立選自羥基、C_1-6 烷氧基、胺基或單-或二(C_1-6 烷基)胺基、C_1-6 環烷基胺基、羥基C_1-6 烷基胺基、六氫吡基、單-或二(C_1-6 烷基)胺基C_1-6 烷基胺基、N-甲基六氫吡基、嗎啉基或硫基嗎啉基； 各R⁷ 及R⁸ 獨立選自氫、C_1-6 烷基、C_1-6 烷基羰基、C_1-6 烷基磺醯基或單-或二(C_1-6 烷基)胺基磺醯基；R³ 是氫、羥甲基、胺甲基或單-或二(C_1-6 烷基)胺基甲基；R⁴ 是氫或C_1-6 烷基；在上述中的芳基為苯基或萘基；其中該苯基或萘基各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、三氟甲基、氰基或羰基羰基的取代基取代；在上述中的雜環基為呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二噁茂基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、六氫吡啶基、二噁烷基、嗎啉基、二硫基(dithianyl)、硫基嗎啉基、吡噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三硫基、吲哚嗪基、吲哚基、吲哚啉基、苯並呋喃基、苯並噻吩基、吲唑基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、啉基、呔基、喹唑啉基、喹噁啉基或萘啶基；其中該雜環各視情況以一或兩個各獨立選自鹵基、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、氰基、胺基、單-或二(C_1-6 烷基)胺基的取代基取代。
2. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中：各X為N；R¹ 是苯基、或視情況以鹵基、C_1-6 烷基、 C_1-6 烷氧基、多鹵基C_1-6 烷基或芳基取代的苯基；R² 是-CH₂ -R⁵ 或-C(=O)-R⁶ ；各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_1-6 烷氧基、C_1-6 烷氧基C_1-6 烷氧基、C_1-6 烷基羰基氧基、N-甲基六氫吡基、嗎啉基或咪唑基；各R⁶ 是獨立選自C_1-6 烷氧基胺基、C_1-6 環烷基胺基、羥基C_1-6 烷基胺基、二(C_1-6 烷基)胺基C_1-6 烷基胺基或嗎啉基；R³ 是氫；並且R⁴ 是氫或C_1-6 烷基。
3. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中：各X為N；R¹ 是苯基、或視情況以鹵基取代的苯基；R² 是-CH₂ -R⁵ ；各R⁵ 是獨立選自氫、羥基、C_1-6 烷氧基或C_1-6 烷基羰基氧基；R³ 是氫；並且R⁴ 是氫。
4. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物為1號化合物、8號化合物、11號化合物、9號化合物、33號化合物、34號化合物及7號化合物或25號化合物。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的化合物，用做醫藥品。
6. 一種醫藥組成物，包含醫藥可接受載劑及作為活性成份的治療有效份量之申請專利範圍第1至4項中的化合物。
7. 一種製備如申請專利範圍第6項中之醫藥組成物的方 法，其中該醫藥可接受載劑及申請專利範圍第1至4項中的化合物被緊密混合。
8. 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物的用途，用來製造用於治療增生疾病的醫藥品。
9. 一種抗癌藥物及如申請專利範圍第1至4項中任一項的HDAC抑制劑之組合。
10. 一種製備如申請專利範圍第1項中之化合物的方法，其特徵在於將式(II)中間體與適當酸反應，產生式(I)的羥肟酸， 其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及X具有如申請專利範圍第1至4項中任一項所定義之意義。
11. 一種式(V)化合物， 其N-氧化物形式、醫藥可接受加成鹽類及立體化學異構形式，其中 R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及X具有如申請專利範圍第1至4項中任一項所定義之意義。
12. 一種製備如申請專利範圍第11項中之化合物的方法，是藉著a)將其中R² 是-CH₂ OH且R⁴ 是氫的式(V)化合物，在此被稱為式(V-a)化合物，經由此藝已知的反應或官能基團轉換，轉化成式(V)化合物，其中R² 不是-CH₂ OH，在此被稱為式(V-b)化合物； b)以單一步驟製備式(V-a)化合物，是藉著式(VI)中間體與1,4-二噁烷-2,5-二醇、及其中R¹ 如上定義之式(VII)適當硼酸反應；或 c)製備式(V-b)化合物，是藉著式(VI)中間體與其中R¹ 及 R² 如上定義之式(VIII)適當酮反應； d)製備式(V)化合物，其中R² 是-COOH，在此被稱為式(V-c)化合物，可以單一步驟藉著式(VI)中間體與2-氧代-丙酸、及其中R¹ 如上定義之式(VII)適當硼酸，在適當溶劑中反應，並且經由此藝已知的反應或官能基團轉換，進一步轉化成(V)中間體，其中R² 是-C(=O)-R⁶ 。