MX2007001120A - Derivados de indolil alquil sustituidos como nuevos inhibidores de la histona desacetilasa. - Google Patents

Derivados de indolil alquil sustituidos como nuevos inhibidores de la histona desacetilasa.

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Holte Peter Ten
Patrick Rene Angibaud
Janine Arts
Marc Gustaaf Celine Verdonck
Bruno Roux
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Abstract

Esta invencion comprende los nuevos compuestos de formula (I) (ver formula (I)) donde R1, R2, R3, X y Y tienen significados definidos, que poseen actividad enzimatica inhibitoria de la histona desacetilasa; su preparacion, las composiciones que los contienen y su uso como un medicamento.

Description

DERIVADOS DE INDOLIL ALQUILAMINO SUSTITUIDOS COMO NUEVOS INHIBIDORES DE LA HISTONA DESACETILASA MEMORIA DESCRIPTIVA Esta invención se refiere a compuestos que tienen actividad inhibitoria de la enzima histona desacetilasa (HDAC). También se refiere a procesos para su preparación, a composiciones que las comprenden, así como a su uso, in vitro e in vivo, para inhibir HDAC y como medicamento, por ejemplo como medicamento para inhibir condiciones proliferativas, tales como cáncer y psoriasis. Las histonas nucleares se conocen como componentes dinámicos e integrales de la maquinaria responsable de la regulación de la transcripción genética y otros procesos templados por ADN tales como replicación, reparación, recombinación, y segregación cromosómica. Estas son la materia de las modificaciones postraslacionales que incluyen la acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinación y ribosilación del ADP. La(s) histona desacetilasa(s), referidas aquí como "HDAC", son enzimas que catalizan la eliminación de la modificación del acetilo de los residuos de lisina de las proteínas, incluyendo las histonas nucleosómicas centrales H2A, H2B, H3 y H4. En conjunto con la(s) histona(s) acetiltransferasa(s), referidas aquí como "HAT's", las HDAC's regulan el nivel de acetilación de las histonas. El equilibrio de acetilación de las histonas nucleosomales cumple un papel importante en la transcripción de muchos genes. La hipoacetilación de las histonas se asocia con la estructura de cromatina condensada, que produce la represión de la transcripción genética, mientras que las histonas acetiladas se asocian con una estructura de cromatina más abierta y con la activación de la transcripción. Se han descrito once HDAC's estructuralmente relacionadas que se dividen en dos clases. Las HDAC clase I consisten en HDAC's 1 , 2, 3, 8 y 1 1 , mientras que las HDAC's clase II consisten en HDAC's 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Los miembros de la tercera clase de HDAC's no están relacionados estructuralmente con las HDAC's de clase I y II. Las HDAC clase l/ll actúan por mecanismos dependientes del zinc, mientras que las HDAC's clase III son dependientes del NAD. Además de las histonas, otras proteínas han sido también substratos para la acetilación, en particular factores de transcripción tales como p53, GATA-1 y E2F; receptores nucleares tales como receptores glucocorticoideos, receptores tiroideos, receptores estrógenos, y proteínas reguladoras de los ciclos celulares tales como pRb. La acetílación de proteínas ha sido relacionada con la estabilización proteica, como la estabilización de p53, reclutamiento de cofactores y aumento de la unión al ADN. p53 es un supresor tumoral que puede inducir la detención del ciclo celular o la apoptosis en respuesta a una variedad de señales de estrés, tal como el daño del ADN. El principal objetivo para que p53 induzca la detención ciclo celular parece ser el gen 21. Después de su activación por la p53, el p21 ha sido identificado debido a su asociación con complejos ciclin/ciclina dependientes de quinasa que producen la detención el ciclo celular en las fases G1 y G2, su regulación a la alta durante la senescencia, y su interacción con el antígeno nuclear de las células proliferantes. El estudio de los inhibidores de HDAC's indica que ellos cumplen un papel importante en la detención del ciclo celular, diferenciación celular, apoptosis y la inversión de los fenotipos transformados. El inhibidor tricostatina A (TSA), por ejemplo, causa la detención celular en las fases G1 y G2, invierte los fenotipos transformados de diferentes líneas celulares, e induce la diferenciación de células leucémicas Friend y otras. Se ha reportado que el TSA (y la suberoilanilida de ácido hidróxamico, SAHA) inhiben el desarrollo celular, inducen la diferenciación terminal y evitan la formación de tumores en ratones (Finnin et al., Nature, 401 : 188-193, 1999). También se ha reportado que la tricostatina A es útil para el tratamiento de la fibrosis, p. ej. fibrosis hepática y cirrosis hepática. (Geerts et al., Solicitud de Patente Europea EP 0 827 742, publicada el 11 Marzo de 1998). El farmacóforo para los inhibidores de HDAC consiste de un dominio de unión metálico, el cual interactúa con el sitio activo de HDAC que contiene zinc, un dominio conector, y un dominio de reconocimiento de superficie o región terminal, que interactúa con residuos en el borde del sitio activo.
También se ha reportado que los inhibidores de HDAC inducen la expresión el gen p21. La activación transcripcional del gen p21 mediante estos inhibidores es promovida por la remodelación de la cromatina, en seguida de la acetilación de las histonas H3 y H4 en la región promotora de p21. Esta activación de p21 se produce de un modo independiente de p53 y de esta manera, los inhibidores de HDAC son operativos en las células con genes p53 mutados, un marcador de numerosos tumores. Además los inhibidores de HDAC pueden tener acciones indirectas tales como el aumento de la respuesta inmune del huésped y la inhibición de la angiogénesis del tumor y en consecuencia puede suprimir el crecimiento de los tumores primarios e impedir la metástasis. (Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309). En vista de lo anterior, los inhibidores de HDAC pueden tener gran potencial en el tratamiento de enfermedades o condiciones proliferativas de las células, incluyendo los tumores con genes p53 mutados. La Solicitud de Patente EP1472216publicada el 14 de agosto de 2003 describe hidroxamatos bicíclicos como inhibidores de la histona desacetilasa. Las Solicitudes de Patente EP1485099 EP1485348 EP1485353 EP1485354 EP1485364 EP1485365 EP1485370 EP1485378 publicadas el 18 de septiembre de 2003, entre otras, describen ácidos piperacinilpirimidinilhidróxamicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa; además, la EP1485365deschbe el R306465.
La Solicitud de Patente EP1492534publicada el 9 de octubre de 2003, describe compuestos de ácido carbámico que comprenden un enlace de piperacina, como inhibidores de HDAC. La Solicitud de Patente EP1495002publicada el 23 de octubre de 2003, describe compuestos de piperacinil fenil benzamida sustituidos, como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO04/009536 publicada el 29 de enero de 2004, describe derivados que contienen un alquilo conector entre el grupo arilo y el hidroxamato, como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente EP1525199publicada el 12 de febrero de 2004, describe hidroxamatos bicíclicos de (hetero)arilalquenilo sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO04/063146 publicada el 29 julio de 2004, describe derivados de N-hidroxi-benzamida con actividad antiínflamatoria y antitumoral. La Solicitud de Patente WO04/063169 publicada el 29 de Julio de 2004, describe derivados de aril hidroxamato sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO04/072047 publicada el 26 de agosto de 2004, describe indolas, bencimidazolas y naftiimidazolas como inhibidores de histona desacetilasa.
La Solicitud de Patente WO04/082638 publicada el 30 de septiembre de 2004, describe hidroxamatos ligados a sistemas de anillo heterocíclicos no aromáticos como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO04/092115 publicada el 28 Octubre de 2004, describe derivados de hidroxamato como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO05/028447 publicada el 31 de Marzo de 2005, describe benzoimidazolas como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patentes WO05/030704 y WO05/030705 publicadas el 7 de abril de 2005, describen benzamidas como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO05/040101 publicada el 6 de Mayo de 2005, describe hidroxamatos conectados a acilureas y a sulfonilureas como inhibidores de histona desacetilasa. La Solicitud de Patente WO05/040161 también publicada el 6 de Mayo de 2005, describe hidroxamatos ligados a biarílos como inhibidores de histona desacetilasa. Los compuestos de la presente invención difieren de la técnica anterior en la estructura, en su actividad farmacológica y/o en la potencia farmacológica. El problema que debe ser resuelto es proporcionar inhibidores de histona desacetilasa con elevada actividad enzimática y celular que tengan aumentada la biodisponibilidad y/o la potencia in vivo.
Los nuevos compuestos de la presente invención resuelven el problema descrito anteriormente. Los compuestos de la presente invención muestran una excelente actividad enzimática y celular inhibitoria de histona desacetilasa. Ellos tienen una gran capacidad para activar el gen p21 , tanto a nivel celular como in vivo. Tienen perfil farmacocinético deseable y baja afinidad por las enzimas P450, lo cual reduce el riesgo de interacción adversa fármaco-fármaco y permite un margen de seguridad más amplio. Otras características ventajosas de los presentes compuestos son la estabilidad metabólica, solubilidad y/o la capacidad de inducción de p21. Más en particular, los compuestos de la presente invención tienen aumentada la vida media en los hepatocitos de las ratas, tienen una mayor solubilidad/estabilidad en soluciones acuosas y/o tienen aumentada la capacidad de inducir al promotor p21 in vivo. Esta invención se refiere a los compuestos de la fórmula (I): las formas ?/-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, donde: cada n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y cuando n es 0, entonces se quiere significar un enlace directo; cada m es un número entero con valor 1 ó 2; cada X es independientemente N o CH; cada Y es independientemente O, S, o NR4; donde cada R4 es hidrógeno, alquilo de d-6, alquiloxi de C?-6-alquilo de C-?-6, cicloalquilo de C3.6, cicloalquilmetilo de C3-6, fenilalquilo de C1-6, -C(=O)- CHR5R6 o -S(=O)2-N(CH3)2; donde cada R5 y R6 es independientemente hidrógeno, amino, alquilo de C1.6 o aminoalquilo de C?-6, y cuando Y es NR4 y R2 está en la oposición 7 del indolilo, entonces R2 y R4 juntos pueden formar el radical bivalente -(CH2)2- (a-1), o -(CH2)3- (a-2); R1 es hidrógeno, alquilo de C1-6, hidroxialquilo de C?-6, alquilsulfonilo de C?-6, alquilcarbonilo de C?-6 o mono- o di(alquilo de C1. 6)arninosulfonilo; R2 es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo de C?-Q, ciano, alquenilo de C2-6, polihaloalquilo de C-?-6, nitro, fenilo, alquilcarbonilo de C?_6-, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilamino de C1-6, alquiloxi de C?-6 o mono- o di(alquilo de C1-6)amino; R3 es hidrógeno, alquilo de C?-6 o alquiloxi de y cuando R2 y R3 están sobre átomos de carbono adyacentes, pueden formar el radical bivalente -O-CH2-O-.
Las líneas dibujadas dentro de los sistemas de anillo bicícilicos indican que los enlaces pueden estar sujetos a cualquiera de los átomos adecuados del anillo de los sistemas de anillo bicíclicos. El término "inhibidor de histona desacetilasa" se usa para identificar un compuesto, que es capaz de interactuar con la histona desacetilasa y de inhibir su actividad, particularmente su actividad enzimática. La actividad enzimática inhibitoria de histona desacetilasa significa la reducción de la actividad enzimática de histona desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de la histona. Preferiblemente, tal inhibición es específica, es decir, el inhibidor de histona desacetilasa reduce la capacidad de la histona desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de una histona a una concentración menor que la concentración de inhibidor que se requiere para producir algún otro efecto biológico no relacionado. Como se usa en las definiciones precedentes y las mencionadas posteriormente halo es genérico para flúor, cloro, bromo y yodo; alquilo de C,^ son radicales de hidrocarburo saturados de cadena recta que tienen 1 ó 2 átomos de carbono tales como, p. ej. metilo o etilo; alquilo de C^g define al alquilo de C1 2 y a los radicales de hidrocarburo saturados de cadena recta y ramificada que tienen de 3 a 6 átomos de carbono tales como p. ej, propilo, butilo, 1-metiletilo, 2-metilpropilo, pentilo, 2-metil-butilo, hexilo, 2-metilpentilo y similares; y polihaloalquilo de C?-6 define al alquilo de C1-6 que contiene tres sustituyentes halo idénticos o diferentes, por ejemplo trifluorometilo; alquenilo de C2.6 define a radicales de hidrocarburo de cadena recta y ramificada que contienen un doble enlace y tienen de 2 a 6 átomos de carbono tal como, por ejemplo, etenilo, 2-propenilo, 3-butenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 3-metil-2-butenilo, y similares; cicloalquilo de C3-6 incluye grupos de hidrocarburos cíclicos que tienen 3 a 6 átomos de carbono, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciciohexilo, ciciohexenilo, y similares. Las sales de adición farmacéuticamente aceptables abarcan sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sales de adición de base farmacéuticamente aceptables. Se entiende que las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables son sales como las arriba mencionadas que comprenden formas de sales de adición de ácido no tóxicas terapéuticamente activas, las cuales pueden ser formadas a partir de los compuestos de la fórmula (I). Los compuestos de la fórmula (I) que tiene propiedades básicas se pueden convertir en sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables por tratamiento de la forma de base con un ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácidos hidrohálicos, p. ej. ácido clorhídrico o bromhídrico; sulfúrico; nítrico; fosfórico y otros ácidos similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acético, trifluoroacético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y otros ácidos similares. Los compuestos de la fórmula (I) que tiene propiedades acidas pueden convertirse en sus sales de adición de base farmacéuticamente aceptables mediante el tratamiento de la forma acida con una base orgánica o inorgánica adecuada. Las formas básicas de sales apropiadas comprenden por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, p. ej., sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, las sales con bases orgánicas, p. ej., sales de benzatina, ?/-metíl-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares. El término "sales de adición de ácido o de base" también comprende a los hidratos y a las formas de adición de solventes, las cuales pueden formarse a partir de los compuestos de la fórmula (I). Ejemplos de tales formas son hidratos, alcoholatos y similares. El término "formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de la fórmula (I)", como se usa aquí, define a todos los compuestos posibles formados por los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes y no intercambiables, que pueden poseer los compuestos de la fórmula (I). A menos que se mencione o indique de otra manera, la designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas, que el compuesto puede tener. Esta mezcla puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica del compuesto. Todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de la fórmula (I) tanto en su forma pura como en mezcla de unos con otros deben ser incluidas dentro de la competencia de la presente invención. Se entiende que las formas ?/-óxido de los compuestos de la fórmula (I) comprenden a los compuestos de la fórmula (I) en los que uno o varios átomos de nitrógeno se oxidan a los también llamados ?/-óxidos, en particular los ?/-óxidos en los que uno o más de los nitrógenos de piperidina, piperacina o piridacinilo están ?/-oxidados. Algunos de los compuestos de la fórmula (I) pueden existir también en sus formas tautoméricas. Aunque tales formas no estén indicadas de manera explícita en la fórmula mencionada anteriormente, se entiende que deben ser incluidas dentro de la competencia de la presente invención. Dondequiera que se haya empleado anteriormente el término "compuesto de la fórmula (I)" quiere decir que incluye también a las sales de adición farmacéuticamente aceptables y todas las formas estereoisómeras. Tal como aquí se usa, los términos "histona desacetilasa" y "HDAC" se refieren a cualquiera una familia de enzimas que elimina los grupos acetilo de los grupos e-amino de los residuos de lisina en la N-terminal de una histona. A menos que se indique de otra manera en el contexto, el término "histona" se refiere a cualquier histona proteica, incluyendo H1 , H2A, H2B, H3, H4, y H5, provenientes de cualquier especie. Las proteínas humanas HDAC o productos genéticos, incluyen, pero sin estar limitados, a: HDAC-1 , HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 HDAC-10 y HDAC-11. La histona desacetilasa puede también derivarse de una fuente protozoaria o fúngica. Un primer grupo de compuestos de interés consiste de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada R4 es hidrógeno, alquilo de C?-6, cícloalquilo de C3-6, cicloalquilmetilo de C3_6, -C(=O)-CHR5R6 or -S(=O)2-N(CH3)2; b) R1 es hidrógeno, alquilo de C?-6, hidroxialquilo de C1-6, alquilsulfonílo de C-?-6, o mono- o di(alquilo de C?-6)aminosulfonilo; o c) R3 es hidrógeno. Un segundo grupo de interés consiste de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada n es un número entero con valor de 0 ó 1 ; b) cada X es independientemente N; c) cada R4 es hidrógeno o alquilo de C1-6; d) R1 es hidrógeno, alquilo de C1-6 o hidroxialquilo de C1.6; o e) R2 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-6 o alquiloxi de C?-6. Un tercer grupo de interés consiste de aquellos compuestos de la fórmula (I) en las que se aplica una o más de las siguientes restricciones: a) cada n es un número entero con valor 0 ó 1 ; b) cada R4 es hidrógeno, alquilo de C1-6, alquiloxi de C^-alquilo de C?-6, cicloalquilo de C3-6 o fenilalquilo de C1.6; c) R1 es hidrógeno, alquilo de C?-6, hidroxialquilo de C1-6, alquilcarbonilo de C1-6 ó alquilsulfonilo de d-ß; o d) R2 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-6, ciano, nitro o alquiloxi de C?-6 Un cuarto grupo de interés consiste de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada n es un número entero con valor 0 ó 1 ; b) cada m es un número entero con valor 1 ; c) cada R4 es hidrógeno, alquiloxí de C1-6alquilo de C?-6, cicloalquilo de C3-6 o fenilalquilo de C1-6; c) R1 es hidrógeno, hidroxialquilo de C1-6, alquilcarbonilo de C?-6 ó alquilsulfonilo de C1-6; d) R2 es hidrógeno, halo, ciano, nitro o alquiloxi de C?.6¡ o e) R3 es alquiloxi de d-ß; o f) cuando R2 y R3 están en átomos de carbono adyacentes, pueden formar el radical bivalente -O-CH2-O-. Un quinto grupo de interés consiste de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que aplican una o más de las siguientes restricciones: a) cada n es un número entero con valor 1 ; b) cada m es un número entero con valor 1 ; c) cada X es independientemente N; d) cada Y es independientemente NR4; e) cada R4 es alquilo de C1-6; f) R1 es hidrógeno; g) R2 es hidrógeno o halo; o h) R3 es hidrógeno. Un grupo de compuestos preferidos consiste de los compuestos de la fórmula (I) en los que cada n es un número entero con valor 0 ó 1 ; cada R4 es hidrógeno, alquilo de d-6, alquiloxi de d-ßalquilo de C1-6, cicloalquilo de C3-6 o fenilalquilo de d-6; R1 es hidrógeno, alquilo de d-6, hídroxialquilo de d. 6, alquilcarbonilo de C?,6 ó alquilsulfonilo de d-ß; y R2 es hidrógeno, halo, alquilo de C?.6, ciano, nitro, polihaloalquilo de C1.6 ó alquiloxi de C1-6. Un grupo de compuestos más preferidos consiste de los compuestos de la fórmula (I) en los que cada n es un número entero con valor 1 ; cada m es un número entero con valor 1; cada X es independientemente N; cada Y es independientemente NR4; cada R4 es alquilo de C1-6; R1 es hidrógeno; R2 es hidrógeno o halo; y R3 es hidrógeno. Los compuestos más preferidos son el compuesto No.1a el compuesto No.30 el compuesto No.39y el compuesto No.50 Los compuestos de las fórmulas (I) y (II), sus sales y N- óxidos farmacéuticamente aceptables y sus formas estereoquímicamente isoméricas se pueden preparar de manera convencional. Los materiales de partida y algunos de los intermediarios son compuestos conocidos y disponibles en el comercio o pueden prepararse de acuerdo con procedimientos de reacción convencionales tal como se conocen en la técnica o están descritos en las Solicitudes de Patentes EP1485099 EP1485348 EP1485353 EP1485354 EP1485364 EP1485365 EP1485370 y EP1485378. Algunos métodos de preparación se describirán posteriormente aquí con más detalle. Otros métodos para obtener los compuestos finales de la fórmula (I) se describirán en los ejemplos. a) Los ácidos hidroxámicos de la fórmula (I) se pueden preparar medíante la reacción de un intermediario de la fórmula (II), donde Q es tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo, mencionados aquí como intermediarios de la fórmula (ll-a), con un ácido apropiado, tal como por ejemplo, ácido trifluoroacétíco. Esa reacción se lleva a cabo en un solvente apropiado, tal como por ejemplo, metanol o diclorometano. b) Alternativamente, los ácidos hidroxámícos de la fórmula (I) se pueden preparar mediante la reacción con un intermediario de la fórmula (II), donde Q es alquiloxicarbonilo de C1-2, mencionados aquí como intermediarios de la fórmula (ll-c), con hidroxílamina, en presencia de una base tal como por ejemplo hidróxido de sodio. Esa reacción se lleva a cabo en un solvente apropiado, tal como por ejemplo metanol. alquilo Los compuestos de la fórmula (I) también se pueden convertir unos en otros medíante reacciones conocidas en la técnica o por transformación de grupos funcionales. Varias de esas transformaciones ya se describieron anteriormente. Otros ejemplos son: hidrólisis de esteres carboxílícos para obtener el correspondiente ácido carboxílico o alcohol; hidrólisis de amidas para los correspondientes ácidos carboxílicos o aminas; hidrólisis de nitrilos para las correspondientes amidas; los grupos amino de los imidazolas o fenilo se pueden reemplazar por hidrógeno mediante reacciones de diazotacíón conocidas en la técnica y el subsiguiente reemplazo del grupo diazo por hidrógeno; los alcoholes se pueden convertir en esteres y éteres; las aminas primarias se pueden convertir en aminas secundarias o terciarias; los dobles enlaces se pueden hidrogenar a los correspondientes enlaces simples; un radical yodo sobre un grupo fenilo se puede convertir en un grupo éster mediante la inserción de un carbono en presencia de un catalizador de paladio adecuado. La presente invención también se refiere de un intermediario de la fórmula (II las formas ?/-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y sus formas estereoquímícamente isoméricas, donde: cada n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y cuando n es 0 entonces se requiere un enlace directo; cada m es un número entero con valor 1 ó 2; cada X es independientemente N o CH; cada Y es independientemente O, S, o NR4; en el que cada R4 es hidrógeno, alquilo de C1-6, alquiloxí de C1-6-alquilo de C-?-6, cicloalquilo de C3-6, cicloalquilmetilo de C3-6l fenilalquilo de C1-6, -C(=O)-CHR5R6 o -S(=O)2-N(CH3)2; donde cada R5 y R6 es independientemente hidrógeno, amino, alquilo de C1-6 o aminoalquilo de d-ß; y cuando Y es NR4 y R2 está en al posición 7 del indolilo entonces R2 y R4 juntos pueden formar el radical bivalente -(CH2)2- (a-1), o -(CH2)3- (a-2); R1 es hidrógeno, alquilo de d-6, hidroxialquilo de d-6, alquilsulfonilo de C?-6, alquilcarbonilo de d-6 o mono o di(alquílo de Ci. 6)aminosulfonilo; R2 es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo de d-6, ciano, alquenilo de C2-6, polihaloalquilo de C?-6, nitro, fenilo, alquilcarbonilo de C1-6, hidroxicarbonilo, alquilo de Ci-ßcarbonilamino, alquiloxi de C1-6, o mono o di(alquilo de C?.6)amino; R3 es hidrógeno, alquilo de C1-6, o alquiloxi de d-6; cuando R2 y R3 están sobre átomos de carbono adyacentes, pueden formar el radical bivalente -O-CH2-O-; y Q es alquiloxícarbonilo de d-2, hidroxicarbonilo o tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo. Los grupos de compuestos interesantes, preferidos, más preferidos y muy especialmente preferidos se pueden definir para los compuestos de la fórmula (II), de acuerdo con los grupos definidos para los compuestos de la fórmula (I). a) Los intermediarios de la fórmula (ll-a) se puede preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (III) con un intermediario de la fórmula (II), donde Q es hidroxicarbonilo, mencionado aquí como intermediario de la fórmula (ll-b), en presencia de reactivos apropiados tales como ?/'-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-dimetil-1 ,3-propanodiamina, monohidrocloruro (EDC) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol (HOBT). La reacción se puede llevar a cabo en presencia de una base tal como trietilamina, en un solvente adecuado tal como una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano. b) Los intermediarios de la fórmula (ll-a) también se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (VI) con el carboxaldehído apropiado de la fórmula (V), en donde t es un número entero con valor 0 ó 1 , y cuando t es 0 entonces se quiere significar un enlace directo, en presencia de un reactivo apropiado, tal como borohidruro de sodio, en un solvente adecuado tal como dicloroetano o metanol. c) Los intermediarios de la fórmula (ll-b) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (II), donde Q es metil- o etiloxicarbonilo (alquilo de C?-2), mencionados aquí como intermediarios de la fórmula (ll-c), con una solución acida apropiada, p. ej., ácido clorhídrico, o solución básica, p. ej., bromuro de hidrógeno o hidróxido de sodio, en un solvente adecuado p. ej., un alcohol, tal como etanol o propanol. alquilo L- d) Los intermediarios de la fórmula (ll-c) se pueden preparar mediante la reacción del éster etilo de ácido carboxílico de la fórmula (IV) con el carboxaldehído apropiado de la fórmula (V), en presencia de un reactivo apropiado tal como borohidruro de sodio p. ej., tetrahidroborato de sodio, en un solvente adecuado tal como un alcohol p. ej., metanol. alquilo C j.2 e) De forma idéntica, los intermediarios de la fórmula (ll-c) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (XIV) con el intermediario apropiado de la fórmula (XV), en presencia del reactivo apropiado, tal como borohidruro de sodio p. ej., tetrahidroborato de sodio, en un solvente adecuado tal como un alcohol, p. ej., metanol. f) Los intermediarios de la fórmula (ll-c) se pueden preparar también mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (X) con un intermediario de la fórmula (XI) donde W es un grupo saliente apropiado tal como, por ejemplo, halo, p. ej., flúor, cloro, bromo o yodo, o un radical sulfoniloxi tal como metilsulfoniloxi, 4-metilfenilsulfoniloxi y similares. La reacción se puede llevar a cabo en un solvente inerte a la reacción, tal como, por ejemplo, un alcohol, p. ej., metanol, etanol, 2-metoxi-etanol, propanol, butanol y similares; un éter, p. ej., 4,4-dioxano, 1 ,1'-oxibispropano y similares; una cetona, p. ej., 4-metil-2-pentanona; o N,N-dimetilformamída, nitrobenceno, acetonitrilo y similares. La adición de una base apropiada tal como, por ejemplo, un álcali o carbonato de metal alcalino terreo o carbonato de hidrógeno, p. ej., trietilamina o carbonato de sodio, se puede utilizar para atrapar el ácido que se libera durante el curso de la reacción. Se puede agregar una pequeña cantidad de un yoduro metálico apropiado, p. ej., yoduro de sodio o potasio, para promover la reacción. La agitación puede aumentar la velocidad de reacción. La reacción se puede llevar de una forma conveniente a una escala de temperatura entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción y, si se desea, la reacción se puede realizar a una mayor presión. alquilo C ?.2 g) De forma idéntica, los intermediarios de la fórmula (ll-c) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (XII) con un intermediario de la fórmula (XIII), donde W es un grupo saliente apropiado como se describió anteriormente. alquilo Los intermediarios de la fórmula (VI) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (Vil) con piperidina en un solvente adecuado, p. ej. diclorometano.
Los intermediarios de la fórmula (Vil) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (VIII) con un intermediario de la fórmula (III), en presencia de reactivos apropiados tales como ?/'-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-d¡metil-1 ,3-propanodiamina, monohidrocloruro (EDC) y 1-hidroxi-1/-/-benzotriazol (HOBT). La reacción se puede llevar a cabo en presencia de una base tal como tpetilamina en un solvente adecuado, tal como una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.
Los intermediarios de la fórmula (VIII) se pueden preparar mediante la reacción de un intermediario de la fórmula (IX) con un intermediario de la fórmula (IV), donde R1 es hidrógeno, mencionados aquí como intermediarios de la fórmula (IV-a), en presencia de hidróxido de sodio, en un solvente adecuado, tal como tetrahidrofurano, seguido de neutralización con ácido clorhídrico y la adición de carbonato de sodio.
Los compuestos de la fórmula (I) y algunos de los intermediarios puede tener al menos un centro estereogénico en su estructura. Este centro estereogéníco se puede presentar con configuración R o S.
Los compuestos de la fórmula (I) que se preparan con los procedimientos aquí descritos anteriormente son generalmente mezclas racémicas de enantiómeros, que se puede separar unos de los otros siguiendo procedimientos de resolución conocidos en la técnica. Los compuestos racémicos de la fórmula (I) su puede convertir en las formas de sales diastereoméricas correspondientes mediante la reacción con un ácido quiral adecuado. Esas formas de sales diastereoméricas se separan subsecuentemente, por ejemplo, por cristalización selectiva o fraccional y los enantiómeros se liberan de ahí a partir del álcali. Un modo alternativo de separar las formas enantioméricas de los compuestos de la fórmula (I) involucra la cromatografía líquida usando una fase quiral estacionaria. Esas formas isoméricas estereoquímícamente puras se pueden derivar de las formas isoméricas estereoquímicamente puras correspondientes de los materiales de partida apropiados, siempre que la reacción se produzca en forma estereoespecífica. Preferiblemente, si se desea un estereoisómero específico, ese compuesto se debería sintetizar mediante métodos de preparación estereoespecíficos. Estos métodos usarán, ventajosamente, matepales de partida enantioméricamente puros. Los compuestos de la fórmula (I), las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y las formas estereoisomérícas de los mismos tienen propiedades farmacológicas valiosas ya que tienen efectos inhibitorios sobre la histona desacetilasa (HDAC).
Esta invención proporciona un método para inhibir el desarrollo celular anormal, que incluye las células transformadas, mediante la administración de una cantidad efectiva de un compuesto de la invención. El desarrollo anormal de células se refiere al desarrollo celular independiente de los mecanismos reguladores normales (p. ej., pérdida de inhibición por contacto). Esto incluye la inhibición del desarrollo tumoral tanto en forma directa al causar detención del desarrollo celular, la diferenciación terminal y/o la apoptosis de las células cancerosas, como en forma indirecta por inhibición de la neovascularización tumoral. La invención también proporciona un método para inhibir el desarrollo tumoral mediante la administración de una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención a un sujeto, p. ej., un mamífero (y más particularmente a un humano) que necesite tal tratamiento. En particular, esta invención proporciona un método para inhibir el desarrollo tumoral mediante la administración de una cantidad efectiva de los compuestos de la presente invención. Ejemplos de tumores que se pueden inhibir, pero sin limitarse a éstos, son: cáncer de pulmón (p. ej., adenocarcinoma que incluye al cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer pancreático (p. ej., carcinoma pancreático tal como, por ejemplo, carcinoma pancreático exocrino), cáncer de colon (p. ej., carcinomas colorrectales, tal como, por ejemplo, adenocarcinoma y adenoma de colon), cáncer de próstata incluyendo la enfermedad avanzada, tumores hematopoyéticos, tumores de linaje linfoide (p. ej., leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt), leucemias mieloideas (por ejemplo, leucemia mielógena aguda (A ML)), cáncer folicular tiroideo, síndrome míelodisplástico (MDS), tumores de origen mesenquimal (p. ej., fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumores benignos de la piel (p. ej., queratoacantomas), carcinoma del seno (p. ej., cáncer avanzado del seno), carcinoma renal, carcinoma ováríco, carcinoma de vejiga y carcinoma epidérmico. Los compuestos de acuerdo con la invención se pueden usar con otros propósitos terapéuticos, por ejemplo: a) La sensibilización de tumores para la radioterapia mediante la administración de los compuestos acordes con la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para el tratamiento del cáncer; b) Tratamiento de artropatías y condiciones osteopatológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémíco; c) Inhibición de la proliferación de las células del músculo liso incluyendo trastornos vasculares proliferativos, aterosclerosis y restenosis; d) Tratamiento de condiciones inflamatorias y dérmicas tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, condición del huésped vs. injerto, conjuntivitis, asma, ARDS, condición de Behcets, rechazo al transplante, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, escleroderma, exantema, eccema, dermatomiosítis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica; e) Tratamiento de endometriosis, fibroides uterinos, hemorragia uterina disfuncional e hiperplasía endometrial; f) tratamiento de la vascularización ocular incluyendo las vasculopatías que afectan los vasos coroideos y retiñíanos; g) tratamiento de la disfunción cardiaca; h) Inhibición de las condiciones inmunosupresivas tal como el tratamiento de las infecciones con VIH; i) Tratamiento de la disfunción renal; j) Trastornos endocrinos supresores; k) Inhibición de la disfunción de la gluconeogénesis; I) Tratamiento de neuropatologías por ejemplo, enfermedad de Parkinson o neuropatologías que producen desórdenes cognitivos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o neuropatologías asociadas con la poliglutamina; m) Tratamiento de desórdenes psiquiátricos por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis; n) Inhibición de patologías neuromusculares, por ejemplo, esclerosis amilotrófica lateral; o) Tratamiento de atrofia muscular espinal; p) Tratamiento de otras condiciones patológicas que requieran tratamiento para potenciar la expresión de un gen; q) Mejora de la terapia genética; r) Inhibición de adipogénesis; s) Tratamiento de parasítosis tales como la malaria. Por lo tanto, la presente invención describe los compuestos de la fórmula (I) para uso medicinal tanto como el uso de estos compuestos de la fórmula (I) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una o más de las condiciones mencionadas antepormente. Los compuestos de la fórmula (I), las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y las formas estereoisoméricas de los mismos pueden tener propiedades diagnósticas valiosas ya que se pueden usar para la detección o identificación de HDAC en muestras biológicas que comprenden la detección o medición de la formación de complejos entre un compuesto etiquetado y una HDAC. Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos que sean etiquetados con agentes marcadores tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, etc. Ejemplos de radioisótopos incluyen 1 5l, 131l, 3H y 14C. Las enzimas se hacen usualmente detectables mediante la conjugación de un substrato apropiado, el cual a su vez cataliza una reacción detectable. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato deshidrogenasa, preferiblemente peroxidasa de rábano picante. Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, acuorina y luciferasa.
Las muestras biológicas se pueden definir como tejidos corporales o fluidos corporales. Ejemplos de fluidos corporales son líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, saliva y similares. En vista de la utilidad de sus propiedades farmacológicas, los compuestos se pueden formular en diferentes formas farmacéuticas de acuerdo con los propósitos de administración. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, una cantidad efectiva de un compuesto particular, en forma de sal de adición de ácidos o de base como ingrediente activo, se combina en una mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, portador puede adoptar una amplia variedad de formas que dependen de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas deseablemente son formas adecuadas de dosis unitarias, preferiblemente, para administración oral, rectal, percutánea, o por inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en forma de dosis orales, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos usuales, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares, en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o portadores sólidos tales como féculas, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares para el caso de polvos, pildoras, cápsulas y tabletas. Debido a su facilidad de administración, las tabletas y las cápsulas representan la forma de dosis unitaria por vía oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Para las composiciones de uso parenteral, el portador comprenderá generalmente, agua estéril, al menos en gran parte, aunque se pueden incluir otros ingredientes, por ejemplo para aumentar la solubilidad. Se pueden preparar, por ejemplo, soluciones inyectables en las cuales el portador comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y glucosa. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden emplearse portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. En las composiciones adecuadas para administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente para mejorar la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinados con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en una proporción menor, aditivos que no causen efectos perjudiciales a la piel. Esos aditivos pueden facilitar la administración en la piel y/o ser útiles para la preparación de las composiciones deseadas. Estas composiciones se pueden administrar de diferentes maneras, p. ej., como parches transdérmicos, como un 'spot-on', o como ungüentos. Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas de dosis unitarias por la facilidad de administración y la uniformidad de la dosificación. Las formas de dosis unitarias aquí usadas en la especificación y las reivindicaciones se refieren a unidades físicamente discretas como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de ingrediente activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador farmacéutico necesario. Ejemplos de tales formas de dosis unitarias son tabletas (incluyendo tabletas recubiertas o ranuradas), cápsulas, pildoras, polvos compactos, obleas, soluciones inyectables o suspensiones, cucharaditas, cucharadas y similares, y los segregados múltiples de los mismos. Los expertos en la técnica podrían determinar con facilidad la cantidad efectiva a partir de los resultados de los ensayos que se presentarán aquí posteriormente. En general se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva sería de aproximadamente 0.005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, y en particular de 0.005 mg/kg a 10 mg/kg peso corporal. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida en dos tres, cuatro o más subdosis en intervalos apropiados durante todo el día. Esas subdosis se pueden formular como formas de dosis unitarias, por ejemplo, que contienen 0.5 a 500 mg, y en particular 10 mg a 500 mg de ingrediente activo por unidad de dosis. Como otro aspecto de la presente invención, se puede contemplar una combinación de un inhibidor de HDAC con otro agente anticanceroso, especialmente para uso como medicina, más específicamente en el tratamiento de cáncer o de enfermedades relacionadas. Para el tratamiento de las condiciones mencionadas anteriormente, los compuestos de la invención se pueden usar en forma ventajosa en combinación con uno o más de otros agentes medicinales, más particularmente, con otros agentes anticancerosos. Ejemplos de agentes anticancerosos son: - compuestos de coordinación del platino, por ejemplo, cisplatino, carboplatino u oxaliplatino; - compuestos de taxano por ejemplo, paclitaxel o docetaxel; - inhibidores de topoisomerasa I tales como compuestos de camptotecina, por ejemplo, irinotecano o topotecano; -inhibidores de topoisomerasa II tales como derivados de podofilotoxinas tumorales por ejemplo, etoposida o teniposida; - alcaloides antitumorales de vinca por ejemplo, vinblastina, vincristina o vinorelbina; - derivados de nucleósidos antítumorales, 5-fluorouracilo, gemcitabina o capecitabína; - agentes alquilantes tales como mostaza de nitrógeno o nitrosourea por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucil, carmustina o lomustina; - derivados de antraciclína antitumorales por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicína o mitoxantrona; - anticuerpos HER2 por ejemplo, trastuzumab; - antagonistas de receptores de estrógenos o moduladores selectivos de los receptores de estrógeno por ejemplo, tamoxifén, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno; - inhibidores de aromatasa tales como exemestano, anastrozola, letrazola y vorozola; - agentes de diferenciación tales como agentes bloqueadores del metabolismo de los retinoides, la vitamina D y el ácido retinoico (RAMBA) por ejemplo, acutano; - inhibidores de metil transferasa del ADN por ejemplo, azacitidina; - inhibidores de quinasas por ejemplo, flavoperidol, imatinib mesilato o gefitinib; -inhibidores de farnesiltransferasa; - otros inhibidores de HDAC; - inhibidores de la vía ubiquitin-proteosómica por ejemplo, Velcade; o - Yondelis. El término "compuestos de coordinación de platino" se usa aquí para denominar a cualquier compuesto de coordinación de platino que inhiba el desarrollo de células tumorales, que proporcione el platino en forma de ion. El término "compuestos de taxano" indica una clase de compuestos que tienen el sistema de anillo de taxano y se relacionan o derivan de extractos de determinadas especies de árboles de tejo (Taxus). El término "inhibidores de topoisomerasa" se usa para indicar a las enzimas capaces de alterar la topología de ADN en las células eucaríóticas. Estos son críticos para funciones celulares importantes y para la proliferación celular. Hay dos clases de topoisomerasas en las células eucarióticas, llamadas tipo I y tipo II. La topoisomerasa I es una enzima monomérica con peso molecular aproximadamente de 100,000. La enzima se aglutina al ADN e introduce una ruptura transitoria de una hebra individual, desenrolla la doble hélice (o permite que se desenrolle) y subsecuentemente resella la ruptura antes de disociarse de la hebra de ADN. La topoisomerasa II tiene un mecanismo de acción similar que involucra la inducción de rupturas de la hebra de ADN o la formación de radicales libres. El término "compuestos de camptotecina" se usa para indicar a los compuestos se relacionan o derivan del compuesto padre de camptotecina, que es un alcaloide insoluble en agua derivado del árbol chino Capftothecin acuminata y del árbol de India Nothapodytes foetida. El término "compuestos de podofilotoxina" se usa para indicar a los compuestos relacionados o derivados de la podofilotoxina madre, la cual se extrae de la planta de mandragora. El término "alcaloides antitumorales de vinca" se usa para indicar a los compuestos relacionados o derivados de extractos de la planta de vinca (Vinca rosea). El término "agentes alquilantes" abarca un grupo de diversos productos químicos que tienen la característica común de que pueden aportar, en condiciones fisiológicas, grupos alquilo a macromoléculas biológicamente vitales tal como el ADN. En la mayoría de los agentes más importantes tales como las mostazas de nitrógeno y las nitrosoureas, las porciones activas alquilantes son generadas in vivo después de complejas reacciones degradantes, algunas de las cuales son enzimáticas. Las acciones farmacológicas más importantes de los agentes alquilantes son las que alteran los mecanismos fundamentales relacionados con la proliferación celular en particular la síntesis de ADN y la división celular. La capacidad de los agentes alquilantes de interferir con la función y la integridad del ADN en la proliferación rápida de los tejidos, proporciona el fundamento para sus aplicaciones terapéuticas y para la muchas de sus propiedades tóxicas. El término "derivados antitumorales de antraciclina" comprende antibióticos obtenidos del hongo Strep. peuticus var. caesius y sus derivados, caracterizados por tener una estructura de anillo de tetraciclina con un azúcar inusual, daunosamina, unido por un enlace glicosídico. Se ha demostrado que la amplificación de la proteína del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER 2) en carcinomas primarios del seno se correlaciona con un pronóstico pobre para ciertos pacientes. El trastuzumab es un anticuerpo lgG1 kappa monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante de alta pureza, que se aglutina con gran especificidad y afinidad al dominio extracelular del receptor de HER2. Muchos cánceres de seno tiene receptores de estrógenos y el desarrollo de estos tumores se puede estimular con estrógenos. Los términos "antagonistas de receptores de estrógenos" y "moduladores selectivos de los receptores de estrógeno" se usan para indicar los inhibidores competitivos de la aglutinación del estradiol a los receptores de estrógeno (ER). Los moduladores selectivos de los receptores de estrógeno, cuando se unen a los ER, inducen un cambio en la forma tpdimensional de la estructura del receptor, modulando su unión al elemento que responde a los estrógenos (ERE) en el ADN. En las mujeres posmenopáusicas, la fuente principal de estrógenos circulantes es a partir de la conversión de andrógenos adrenales y ováricos (androstenodiona y testosterona) a estrógenos (estrona y estradiol) mediante la enzima aromatasa en los tejidos periféricos. La pérdida de estrógenos a través de la inhibición o inactivación de la aromatasa es un tratamiento selectivo y efectivo para algunas pacientes posmenopáusicas con cáncer de seno hormonodependiente. El término "agente antiestrógeno" se usa aquí para incluir no sólo a los antagonistas de los receptores de estrógenos y los moduladores de los receptores selectivos de estrógenos, sino también a los inhibidores de aromatasa mencionados anteriormente. El término "agentes de diferenciación" abarca a los compuestos que pueden inhibir de distinta maneras la proliferación celular e inducir la diferenciación. Se sabe que la vitamina D y los retinoídes cumplen un papel importante en la regulación del crecimiento y la diferenciación de una amplia variedad de tipos celulares normales y malignos. Los agentes bloqueadores del metabolismo del acido retinoíco (RAMBA's) aumentan los niveles de ácidos retinoicos endógenos mediante la inhibición del catabolismo de los ácidos retinoicos mediado por el citocromo P450.
Los cambios de la metilación del ADN son una de las anormalidades más comunes en la neoplasia humana. La hipermetilación de los promotores de genes seleccionados está generalmente asociada con la inactivación de los genes implicados. El término "inhibidores de la metil transferasa del ADN" se usa para indicar compuestos que actúan a través de una inhibición farmacológica de la metil transferasa del ADN y la reactivación de la expresión del gen supresor del tumor. El término "inhibidores de quinasa" comprende a los potentes inhibidores de quinasas que están implicados en la evolución del ciclo celular y la muerte celular programada (apoptosis). El término" inhibidores de farnesiltransferasa" se usa para indicar a los compuestos diseñados para evitar la farnesilación de Ras y otras proteínas intracelulares. Se ha demostrado que estos compuestos tienen efecto sobre la proliferación y supervivencia de las células malignas. El término "otros inhibidores de HDAC" comprende, pero no está limitado a: - carboxilatos, por ejemplo, butirato, ácido cinámico, 4-fenilbutirato o ácido valproico; - ácidos hidroxámicos, por ejemplo, ácido hidróxamico de suberoilanilida (SAHA), piperacina que contiene análogos de SAHA, hidroxamato de biarilo A-161906 y sus carbozoliléteres, análogos de tetrahidropiridina y tetralona, aril-?/-hidroxicarboxamidas bicíclicas, piroxamida, CG-1521 , PXD-101 , ácido hidroxámico de sulfonamida, LAQ-824, LBH-589, tricostatina A (TSA), oxamflatin, scriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas con scriptaid, ácido cinámico de m-carboxi, ácido bishidroxámíco (CBHA), ácidos hidroxámicos del tipo CBHA, análogo del ácido trapoxin-hidroxámico, R306465 y ácidos benzoil- y heteroaril-hidroxámícos relacionados, aminosuberatos y malonildiamidas; - tetrapéptidos cíclicos, por ejemplo, trapoxina, apidicina, depsipeptida, compuestos relacionados con la espirucostatina, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos que contienen sulfhidrilos (SCOP's), tetrapéptidos cíclicos que contienen ácido hídroxámico (CHAP's), TAN-174's y azumamidas; - benzamidas, por ejemplo MS-275 o CI-994, o - depudecina. El término "inhibidores de la vía ubiquitin-proteosómica" se usa para identificar compuestos que inhiben la destrucción de las proteínas celulares meta en el proteosoma, incluyendo las proteínas reguladoras del ciclo celular. Para el tratamiento del cáncer los compuestos acordes con la presente invención se pueden administrar a los pacientes tal como se describió anteriormente, en conjunto con la irradiación. La irradiación quiere decir radiación ionizante y en particular radiación gamma, especialmente la que se emite mediante aceleradores lineales o mediante radionúclidos que son de uso común en la actualidad. La irradiación del tumor por medio de los radionúclidos puede ser externa o interna.
La presente invención también se refiere a una combinación de acuerdo con la invención de un agente anticanceroso y un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención. La presente invención también se refiere a una combinación de acuerdo con la invención para uso en terapia médica, por ejemplo, para inhibir el desarrollo de las células tumorales. La presente invención también se refiere a combinaciones acordes con la invención para inhibir el desarrollo de las células tumorales. La presente invención también se refiere a un método de inhibición del desarrollo de células tumorales en un sujeto humano, que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una combinación de acuerdo con la invención. Esta invención también proporciona un método para inhibir el desarrollo anormal de células, incluyendo las células transformadas, medíante la administración de una cantidad efectiva de una combinación de acuerdo con la invención. El otro agente medicinal y el inhibidor de HDAC se pueden administrar en forma simultánea (p. ej., en composiciones separadas o unitarias) o en forma secuencial en cualquier orden. En el último caso, los dos compuestos se administrarán en un periodo y en una cantidad y manera suficientes para asegurar que se alcanzará un efecto sinérgico o ventajoso. Se apreciará que el método preferible, el orden de administración y las respectivas cantidades de dosis y los regímenes para cada componente de la combinación, dependerán del otro agente medicinal y del inhibidor de HDAC en particular que sean administrados, de su vía de administración, del tumor particular que se trata y del huésped particular que está siendo tratado. El método óptimo, el orden de administración y las cantidades y el régimen de las dosis pueden ser fácilmente determinados por los expertos en la técnica mediante métodos convencionales bajo la perspectiva de la información aquí establecida. El compuesto de coordinación de platino se administra ventajosamente en una dosis de 1 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 50 a 400 mg/m2, particularmente para cisplatino en una dosis de cerca de 75 mg/m2 y para carboplatino de cerca de 300mg/m2 durante el curso del tratamiento. El compuesto de taxano se administra en forma ventajosa en una dosis de 50 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel en una dosis de cerca de 175 a 250 mg/m2 y para docetaxel de cerca de 75 a 150 mg/m2 durante el curso del tratamiento. El compuesto de camptotecina se administra en forma ventajosa con una dosis de 0.1 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, de 1 a 300 mg/m2, en particular para irínotecano en una dosis de aproximadamente 100 a 350 mg/m2 y para topotecano de cerca de 1 a 2 mg/m2 durante el curso del tratamiento.
El derivado de podofilotoxina antitumoral se administra en forma ventajosa con dosis de aproximadamente 30 a 300 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, de 50 a 250 mg/m2, en particular para etoposida en una dosis de aproximadamente 35 a 100 mg/m2 y para teniposida de cerca de 50 a 250 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los alcaloides antitumorales de vinca se administran en forma ventajosa en una dosis de cerca de 2 a 30 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, en particular para vinblastina en una dosis de cerca de 3 a 12 mg/m2, para vincristina en una dosis de cerca de 1 a 2 mg/m2, y para vinorrelbina en una dosis de cerca de 10 a 30 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los derivados de nucleósidos antitumorales se administran en forma ventajosa en una dosis de cerca de 200 a 2500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, de 700 a 1500 mg/m2, en particular para 5-FU en una dosis de 200 a 500 mg/m2, para gemcitabina en una dosis de cerca de 800 a 1200 mg/m2 y para capecitabina de cerca de 1000 a 2500 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los agentes alquilantes tales como mostaza de nitrógeno o nítrosourea se administran en forma ventajosa en una dosis de cerca de 100 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, de 120 a 200 mg/m2, en particular para ciclofosfamida en una dosis de cerca de 100 a 500 mg/m2, para clorambucil en una dosis de cerca de 0.1 a 0.2 mg/kg, para carmustina en una dosis de cerca de 150 a 200 mg/m2, y para lomustina en una dosis de cerca de 100 a 150 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los derivados de antraciclina antitumorales se administran en forma ventajosa en una dosis de cerca de 10 a 75 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, por ejemplo, de 15 a 60 mg/m2, en particular para doxorrubicina en una dosis de cerca de 40 a 75 mg/m2, para daunorrubicina en una dosis de cerca de 25 a 45 mg/m2, y para idarrubicina en una dosis de cerca de 10 a 15 mg/m2 durante el curso del tratamiento. El trastuzumab se administra en forma ventajosa en una dosis de cerca de 1 a 5 mg por metro cuadrado (mg/m2) del área superficial corporal, en particular de 2 a 4 mg/m2 durante el curso del tratamiento. Los agentes antiestrógenos se administran en forma ventajosa en una dosis de cerca de 1 a 100 mg diarios dependiendo del agente particular y de la condición que se esté tratando. El tamoxifén se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 5 a 50 mg, preferiblemente de 10 a 20 mg dos veces al día, y se continúa la terapia durante el tiempo suficiente para alcanzar y mantener un efecto terapéutico. El toremifeno se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 60 mg una vez al día, y se continúa la terapia durante el tiempo suficiente para alcanzar y mantener un efecto terapéutico. La anastrozola se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 1 mg una vez al día. El droloxífeno se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 20-100 mg una vez al día. El raloxifeno se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 60 mg una vez al día. El exemestano se administra en forma ventajosa por vía oral en una dosis de cerca de 25 mg una vez al día. Estas dosis se pueden administrar por ejemplo, una vez, dos veces o más durante el curso del tratamiento, el cual se puede repetir por ejemplo, cada 7,14, 21 ó 28 días. En vista de sus útiles propiedades farmacológicas, los componentes de las combinaciones de acuerdo con la invención, es decir, el agente medicinal adicional y el inhibidor de HDAC, se pueden formular en varias formas farmacéuticas de acuerdo con los propósitos de administración. Los componentes se pueden formular por separado o en una composición farmacéutica individual o unitaria que contenga a ambos componentes. La presente invención por consiguiente también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el otro agente medicinal y el inhibidor de HDAC junto con uno o más portadores farmacéuticos. La presente invención también se refiere a una combinación de acuerdo con la invención en forma de una composición farmacéutica que comprende un agente anticanceroso y un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención junto con uno o más portadores farmacéuticos. La presente invención también se refiere al uso de una combinación de acuerdo con la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para inhibir el desarrollo de las células tumorales.
La presente invención también se refiere a un producto que contiene como primer ingrediente activo un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención y como segundo ingrediente activo un agente antícáncer, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de pacientes que sufren de cáncer.
Parte experimental Los siguientes Ejemplos se proporcionan con propósitos ilustrativos. En adelante, "DCM" se define como diclorometano, "DIPE" se define como diisopropil éter, "DMA" se define como N,N-dimetilacetamida, "DMSO" se define como dimetiisulfóxido, "EDC" se define como monohidrocloruro de ?/'-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-dimet¡l-1 ,3-propanodiamina, "EtOAc" se define como acetato de etilo, "EtOH" se define como etanol, "HOBt" se define como 1-hidroxi-1/-/-benzotriazola, "MeOH" se define como metanol, "TFA" se define como ácido trifluoroacético y "THF" se define como tetrahidrofurano.
A. Preparación de los compuestos intermediarios EJEMPLO A1 a) Preparación del intermediario 1 Una mezcla de éster etilo del ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinocarboxílico, (0.0114 mol), 1 -metil-1 H-indol-3-carboxaldehído (0.017 mol) y MgSO4 (0.5 g) en MeOH (80 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 15 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó tetrahidroborato de sodio (0.018 mol) en porciones. La mezcla se agitó a temperatura ambiente 5 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, secó (MgSO4), filtró, y el solvente se evaporó. El residuo (6.6 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 94/6/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 4.3 g (90%) del intermediario 1. b) Preparación del intermediario 2 .Na Una mezcla del intermediario 1 (0.0037 mol) e hidróxido de sodio (0.0074 mol) en EtOH (60 ml) se agitó a 50°C durante 15 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se evaporó a sequedad, produciendo 1.5 g (100%) del intermediario 2. c) Preparación del intermediario 3 Se agregaron EDC (0.0075 mol), HOBt (0.0075 mol) y O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.015 mol) a temperatura ambiente a una mezcla del intermediario 2(0.005 mol) en DCM (100 ml) y THF (100 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a 40°C durante 4 horas, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, secó (MgSO4), filtró, y el solvente se evaporó. El residuo se purificó (4 g) por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 1g (42%) del intermediario 3. Una fracción (0.051 g) se cristalizó a partir de DIPE. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.03 g del intermediario 3 punto de fusión 70°C.
EJEMPLO A2 a) Preparación del intermediario 4 Una mezcla de éster etilo de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinocarboxílico (0.0072 mol) en THF (40 ml) e hidróxído de sodio 1 N (40 ml) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Se agregó ácido clorhídrico 1 N (40 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos. Se agregó carbonato de sodio (0.0216 mol). La mezcla se agitó durante 10 minutos. Se agregó en porciones 1-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi]-2,5-pirrolidinodiona (0.0072 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas, luego se enfrió a 0°C y se acidificó con ácido clorhídrico. El precipitado se filtró, lavó con éter dietilo y se secó, produciendo 4.1g (100%) del intermediario 4. b) Preparación del intermediario 5 Se agregaron trietílamina (0.02 mol), EDC (0.0082 mol) y HOBt (0.0082 mol) a temperatura ambiente a una mezcla del intermediario 4 (0.0068 mol) en DCM/THF (200 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0082 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 al 10%, se secó (MgSO ), filtró, y el solvente se evaporó. El residuo (4 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 3.4 g (89%) del intermediario s. c) Preparación del intermediario 6 Una mezcla del intermediario 5(0.0355 mol) y piperidina (0.089 mol) en DCM (400 ml) se agitó a 35°C durante 72 horas. El solvente se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 6.7 g (56%). Parte del residuo (0.79 g) se cristalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.62 g del intermediario 6 punto de fusión 129°C. d) Preparación del intermediario 7 Una mezcla del intermediario 6(0.0009 mol) y 5-cloro-1/-/-indol-3-carboxaldehído (0.0012 mol) en 1 ,2-dicloro-etano (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Se agregaron en porciones Tris(acetato-a-O)hidro-borato (1-), sodio (0.0013 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, se vertió en agua/NaOH 3N y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró, y el solvente se evaporó. El residuo (0.5 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5). Se recogieron dos fracciones y el solvente se evaporó, produciendo 0.07 g (16%) del intermediario 7.
EJEMPLO A3 a) Preparación del intermediario 8 Una solución de éster etilo de ácido 2-(metilsulfonil)-5-pirimidínocarboxílico (0.094 mol) en acetonitrilo (40 ml) se agregó a 10°C a una suspensión de 4-piperidinometanol (0.086 mol) y carbonato de potasio (0.172 mol) en acetonitrilo (200 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se llevó a temperatura ambiente, luego se agitó durante 4 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró, y el solvente se evaporó. El residuo (23 g) se cristalizó a partir de acetonitrilo/éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 7.8 g (34%) del intermediario 8. La capa madre se evaporó. El residuo (17 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (20-45 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 97/3/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 4.6 g (20%) del intermediario 8 punto de fusión 129°C. b) Preparación del intermediario 9 Tpetilamina (0 038 mol) y luego cloruro de metanosulfomlo (0 025 mol) se agregaron a 0°C a una solución del intermediario 8(0 0189 mol) en DCM (80 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a 0°C durante 2 horas y se vertió en agua con hielo La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 6 5 g (100%) del intermediario 9 c) Preparación del intermediario 10 Una mezcla del intermediario 9(0 0189 mol), ?/-met?l-1 -/-?ndola-3-etanamina (0 0172 mol) y carbonato de potasio (0 0344 mol) en acetonitplo (180 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 24 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó El residuo (8 5 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (70-200 µm) (eluyente DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0 a 97/3/0 1 ) Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 1 25 g (20%) del intermediario 10 d ) Pre pa ración de I j n termed ia rio 11 Una mezcla del intermediario 10(0.003 mol) e hidróxido de sodio (0.006 mol) en EtOH (80 ml) se agitó y sometió a reflujo durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se evaporó a sequedad, produciendo 1.3 g (100%) del intermediario 11 punto de fusión. >260°C. e) Preparación del intermediario 12 Se agregó EDC (0.0045 mol) y luego HOBt (0.0045 mol), a temperatura ambiente, a una mezcla del intermediario 11(0.003 mol) en THF (100 ml) y DCM (100 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.012 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (3 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 94/6/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo (0.82 g) se retiró con éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.78 g del intermediario 12 punto de fusión 154°C.
EJEMPLO A4 a) Preparación del intermediario 13 Una mezcla de éster etilo de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidínil]-5-pirimidinocarboxílico (0.0049 mol), metanosulfonato de 1 H-indol-3-etanol, (éster) (0.0054 mol) y carbonato de potasio (0.01 mol) en acetonitrilo (20 ml) se agitó y sometió a reflujo durante una noche, luego se enfrió, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (2.2 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.442 g (22%) del intermediario 13 punto de fusión 238°C. b ). P fe P a ra ci ó n del j i nterm ed I j a rio 14 Una mezcla del intermediario 13(0.0025 mol), (2-bromoetoxi)(1 ,1-dimetiletil)dimetíl-silano (0.0034 mol) y ?/-etil-?/-(1-metiletil)-2-propanamina (0.0038 mol) en DMSO (20 ml) se agitó a 50°C durante 15 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.7 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.76 g (54%) del intermediario 14. c) Preparación del intermediario 15 Una mezcla del intermediario 14(0.0013 mol) e hidróxido de sodio (0.0027 mol) en EtOH (40 ml) se agitó a 80°C durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se evaporó, produciendo 0.75 g (100%) del intermediario 15. d) Preparación del intermediario 16 Se agregaron EDC (0.002 mol) y luego HOBt (0.002 mol) a temperatura ambiente a una mezcla del intermediario 15(0.0013 mol) en THF (80 ml) y DCM (80 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0068 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.3 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.38 g del intermediario 16. e) Preparación del intermediario 17 Una mezcla del intermediario 16(0.0011 mol) y fluoruro de tetrabutilamonio (0.0032 mol) en THF (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 0.5 g (88%) del intermediario 17.
EJEMPLO A5 a) Preparación del intermediario 45 Una solución de éster metilo del ácido 2-cloro-5-pirimidinocarboxílíco (0.058 mol) en DMA (80 ml) se agregó por goteo a una solución de 4-pipep'dinometanamina (0.116 mol) y ?/-et¡ldiisopropilamina (0.145 mol) en DMA (150 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 30 minutos, se vertió en agua con hielo y se extrajo con EtOAc, luego con DCM. La capa orgánica se lavó con agua y se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de DIPE. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 10 g (65%) del intermediario 45. b) P repa ració n d el j ntermed ia rio 46 Una mezcla del intermediario 45 (0.0024 mol), 1-metil-5-nitro-1H-indol-3-carboxaldehído (0.0036 mol) y MgSO4 (0.25 g) en MeOH (80 ml) se agitó a 60°C durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó en porciones tetrahidroborato de sodio (0.0041 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.1 g) se cristalizó a partir de acetonitrilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.9 g (86%) del intermediario 46 punto de fusión: 150°C. c) Preparación del intermediario 47 Una mezcla del intermediario 46 (0 002 mol) e hidróxido de sodio (0 008 mol) en EtOH (60 ml) se agitó a 60°C durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó El residuo se absorbió en éter d ¡etilo El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0 6 g (67%) del intermediario 47 d) Preparación del intermediario 48 Se agregaron EDC (0 0019 mol) y HOBt (0 0019 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 47 (0 0013 mol) y tpetilamina (0 0039 mol) en DCM/THF (50/50) (100 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos Se agregó O-(tetrah?dro-2H-p?ran-2-?l)-hidrox?lam?na (0.0026 mol) La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.2 a 92/8/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.101g (15%) del intermediario 48.
EJEMPLO A6 a) Preparación del intermediario 49 Se agregó una solución de éster metilo de ácido 2-cloro-5-pirimidinocarboxílico (0.033 mol) en DCM (80 ml) a temperatura ambiente, a una solución de 4-piperidinometanol (0.066 mol) y ?/-etildiisopropilamina (0.083 mol) en DCM (100 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y 30 minutos, se vertió agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se absorbió en pentano. El precipitado se filtró y se secó, produciendo, 7.88 g (95%) del intermediario 49. b) Preparación del intermediario 50 Se agregó por goteo DMSO (0.058 mol) a -78°C a una solución de dicloruro de etanodioílo (0.0278 mol) en DCM (50 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó durante 15 minutos. Se agregó por goteo una solución del intermediario 49 (0.023 mol) en DCM (200 ml). La mezcla se agitó a -78°C durante 1 hora y 30 minutos. Se agregó por goteo trietilamina (0.118 mol). La mezcla se agitó a -78°C durante 1 hora, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo, 3.06 g (54%) del intermediario 50. c) Preparación del intermediario 51 El intermediario 50 (0.0122 mol) se agregó a 5°C a una solución de 1 -metil-1 H-indola-3-etanamina (0.0122 mol) en MeOH (270 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó unos pocos minutos. Se agregaron cianoborohidruro de sodio (0.0183 mol) y ácido acético (0.183 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en carbonato de potasio al 10% y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (4.9 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 97/3/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 1.2 g (24%) del intermediario 51. d) Preparación del intermediario 52 Una mezcla del intermediario 51(0.0009 mol) e hidróxido de sodio (0.0039 mol) en EtOH (60 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 15 horas, luego se evaporó a sequedad, produciendo el intermediario 52. Este intermediario se usó directamente el siguiente paso de la reacción. e) Preparación del intermediario 53 Se agregaron HOBt (0.0019 mol) y EDC (0.0019 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 52 (0.0009 mol) y O- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0019 mol) en DCM/THF (130 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.93 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 97/3/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.155 g (33%) del intermediario 53.
EJEMPLO A7 a) Preparación del intermediario 54 Una mezcla de éster etilo del ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinilj-5-pirimidinocarboxílíco (0.0038 mol), 1-etil-1/-/-indola-3-carboxaldehído (0.0049 mol) y Pd/C al 10% (0.5 g) en MeOH (20 ml) que contenía 1 ml de una solución de tiofeno al 10% en EtOH, se hidrogenó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo una presión de 3 bar, luego se filtró sobre celite. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo (1.8 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2 a 93/7/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.7 g (44%) del intermediario 54. b) Preparación del intermediario 55 Se agregó hidruro de sodio al 60% (0.009 mol) a 0°C a una solución del intermediario 54(0.0045 mol) en THF (50 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se agregó por goteo una solución de yodo-etano (0.0062 mol) en THF (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.6 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.16 g (8%) del intermediario 55. c) Preparación del intermediario 56 Una mezcla del intermediario 55 (0.0003 mol) e hidróxido de sodio (0.03 g) en EtOH (15 ml) se agitó a 80°C durante 6 horas, luego se evaporó a sequedad, produciendo 0.16 g (100%) del intermediario 56. d) Preparación del intermediario 57 Se agregaron EDC (0.0005 mol) y HOBt (0.0005 mol) a temperatura ambiente a una mezcla del intermediario 56 (0.0003 mol) en DCM (20 ml) y THF (20 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxílamina (0.0007 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.3 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.35). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.03 g (16%) del intermediario 57.
EJEMPLO A8 a) P repa ración del i i ntermed ¡ario 58 Se agregó hidruro de sodio (0.011 mol) a 5°C a una solución del intermediario 13 (0.0037 mol) en THF (30 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó durante 30 minutos. Luego se agregó por goteo una solución de yodometano (0.0081 mol) en THF (10 ml). La mezcla se agitó a 10°C durante 2 horas, luego se llevó a temperatura ambiente durante 1 hora y 30 minutos, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.7 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH3OH 98/2/0.1). Se recogieron dos fracciones y el solvente se evaporó, produciendo 0.265 g del intermediario 58 y 0.57 g (17%) del intermediario 10. b) Preparación del intermediario 59 Una mezcla del intermediario 58 (0.0006 mol) e hidróxido de sodio (0.0012 mol) en EtOH (30 ml) se agitó a 80°C durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente y el solvente se evaporó, produciendo 0.26 g (100%) del intermediario 59. c) Preparación del intermediario 60 Se agregaron EDC (0.0009 mol) y HOBt (0.0009 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 59 (0.0006 mol) en THF (30 ml) y DCM (30 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0012 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.6 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05 y 94/6/0.3). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.1 g (33%) del intermediario 60.
EJEMPLO A9 a) Preparación del intermediario 61 Se agregó DMSO (0.127 mol) a -78°C a una solución de dicloruro de etanodioílo (0.061 mol) en DCM (110 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó durante 15 minutos. Se agregó una solución del intermediario 8 (0.051 mol) en DCM (200 ml). La mezcla se agitó a -78°C durante 1 hora y 30 minutos. Se agregó por goteo trietilamina (0.26 mol). La mezcla se agitó a -78°C durante 15 minutos, luego se llevó a temperatura ambiente durante 2 horas y 30 minutos. Se agregó agua. La mezcla se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (14 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (20-45 µm) (eluyente: cidohexano/EtOAc 70/30). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo. 7.6 g (57%) del intermediario 61. b) Preparación del intermediario 62 Se agregaron cianoborohidruro de sodio (0.049 mol) y ácido acético (0.034 ml) a temperatura ambiente a una solución de 5-cloro-1-metil-1 H-lndola-3-etanamina (0.031 mol) e intermediario 61 (0.034 mol) en MeOH (700 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en carbonato de potasio al 10% y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (14.8 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (20-45 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 4.52 g (32%) del intermediario 62. c) Preparación del intermediario 63 Se agregó cloruro de metanosulfonilo (0.0049 mol) a 5°C a una solución del intermediario 62 (0.004 mol) y trietilamina (0.008 mol) en DCM (150 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (2.39 g) se absorbió en DIPE. El precipitado se filtró y secó, produciendo 1.78 g (84%) del intermediario 63 punto de fusión 162°C. d) Preparación del intermediario 64 Una mezcla del intermediario 63 (0.0032 mol) e hidróxido de sodio (0.0128 mol) en EtOH (150 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 5 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente y se absorbió en éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 1.57 g (99%) del intermediario 64 punto de fusión >260°C. e) Preparación del intermediario 65 Se agregaron EDC (0.0064 mol) y HOBt (0.0064 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 64 (0.0032 mol) en THF (160 ml) y DCM (160 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hídroxilamina (0.0064 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (2.77 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo (0.385 g) se cristalizó a partir de CH3CN/dietiléter. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.084 g del intermediario 65 punto de fusión 179°C.
EJEMPLO A10 a) Preparación del intermediario 66 Una solución de éster etilo del ácido 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinocarboxilico (0.094 mol) en acetonitrilo (240 ml) se agregó a temperatura ambiente a una solución de 1 ,1 -dimetiléster etilo de ácido 4-piperidinil-carbámico (0.078 mol) y carbonato de potasio (0.156 mol) en acetonitrilo (120 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche, se vertió en agua con hielo y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se cpstalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 14.4 g (53%) del intermediario 66 punto de fusión 160°C. b) Preparación del intermediario 67 Se agregó TFA (20 ml) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 66 (0.0225 mol) en DCM (110 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas, se vertió en agua y se alcalinizó con carbonato de potasio. La mezcla se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 5.5 g (98%) del intermediario 67.
EJEMPLO A11 a) Preparación del intermediario 68 Se agregó hidruro de sodio al 60% en aceite (0.0069 mol) a 0°C a una solución de éster etilo de ácido 2-metil-1/-/-indola-3-acético (0.0046 mol) en THF (10 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se agregó yodo-etano (0.006 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se vertió en EtOAc y NaCI saturado. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. El residuo (1.1 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: cicIohexano/EtOAc 80/20). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.73 g (65%) del intermediario 68. b) Preparación del intermediario 69 Se agregó por goteo una solución de hidruro de diisobutilaluminio en tolueno (0.0045 mol) a -78°C a una solución del intermediario 68 (0.003 mol) en DCM (15 ml) y 1 ,2-dimetoxietano (15 ml) (tamiz molecular: 3 ángstrom) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a -78°C durante 3 horas, luego se inactivo con HCl 3N y se extrajo con DCM. La capa orgánica se lavó con agua, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó a sequedad, produciendo 0.7 g (>100%) del intermediario 69. c) Preparación del intermediario 70 Se agregó etóxido de titanio (IV) (0.0023 mol) a una mezcla del intermediario 67 (0.0021 mol) y el intermediario 69 (0.0021 mol) en 1 ,2-dicloro-etano (25 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó en porciones Tris(acetato-a-O)hidroborato(1-), sodio (0.0023 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, luego se inactivo con NaHCO3 y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. El residuo (1.2 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.2 g (21 %) del intermediario 70. d) Preparación del intermediario 71 Na Una mezcla del intermediario 70(0 0004 mol) e hidróxido de sodio (0 0009 mol) en EtOH (30 ml) se agitó a 60°C durante una noche, luego se enfrió a temperatura ambiente y evaporó, produciendo 0 2 g (100%) del intermediario 71 e) Preparación del intermediario 72 Se agregó EDC (0 0007 mol) y HOBt (0 1 g) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 71 (0 0004 mol) y tpetilamina (0 0009 mol) en DCMA?F (40 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos Se agregó O-(tetrah?dro-2/-/-p?ran-2-?l)-h?drox?lam?na (0 0009 mol) La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó El residuo (0 4 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (5 µm) (eluyente DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1 a 90/10/1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.087 g (37%) del intermediario 72.
EJEMPLO A12 a) Preparación del intermediario 73 Se agregó el intermediario 50 (0.0046 mol) a 5°C a una solución de 6-metoxi-1 -metil-1 H-lndola-3-etanamina (0.0046 mol) en MeOH (100 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó durante 30 minutos. Se agregó en porciones cianoborohidruro de sodio (0.0068 mol) y luego ácido acético (0.0046 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en carbonato de potasio al 10% y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (4 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. Una parte (0.7 g) del residuo (2.2 g) se cristalizó a partir de acetonitrilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.43 g (61%) del intermediario 73 punto de fusión 122°C. b) Preparación del intermediario 74 Una mezcla del intermediario 73(0.0015 mol) e hidróxido de sodio (0.006 mol) en EtOH (90 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 8 horas, luego se evaporó a sequedad, produciendo el intermediario 74. c) Preparación del intermediario 75 Se agregaron HOBt (0.003 mol) y EDC (0.003 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 74 (0.0015 mol) y O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.003 mol) en THF/DCM (200 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.1 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (10 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 95/5/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo (0.24 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (10 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.17 g (21 %) del intermediario 75.
EJEMPLO A13 a) Preparación del intermediario 76 Una mezcla de 6-metoxi-1/-/-indola-3-etanamina (0.053 mol) y 1 ,3-isobenzofuranodiona (0.058 mol) en tolueno (130 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 48 horas, y luego se filtró. El filtrado se evaporó, produciendo 5.4 g (32%) del intermediario 76. b) Preparación del intermediario 77 Se agregó por goteo una solución del intermediario 76 (0.017 mol) en DMF (19 ml) a temperatura ambiente a una suspensión de hidruro de sodio (0.034 mol) en DMF (11 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 30 minutos. Se agregó 1-yodo-propano (0.034 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 15 minutos. Se agregó una solución saturada de NaCl. La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 4.9 g del intermediario 77. Este producto se usó directamente en el siguiente paso de la reacción. c) Preparación del intermediario 78 Una mezcla del intermediario 77(0.068 mol) y monohidrato de hidracina (0.068 mol) en EtOH (60 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 1 hora, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 3.53 g del intermediario 78. Este producto se usó directamente en el próximo paso de la reacción. d) Preparación del intermediario 79 Se agregaron cianoborohidruro de sodio (0.024 mol) y ácido acético (0.0167 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 61 (0.0167 mol) y el intermediario 78 (0.015 mol) en MeOH (380 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó durante 30 minutos, se vertió en carbonato de potasio al 10% y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (8.84 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 2.85 g (40%) del intermediario 79. e) Preparación del intermediario 80 Una mezcla del intermediario 79(0.0028 mol), yodo-etano (0.0056 mol) y trietilamina (0.0085 mol) en DMF (60 ml) se agitó a 50°C durante 7 horas, se vertió en agua con hielo y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó.
El residuo (1.8 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasíl (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH 100/0 a 95/5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 1.1 g (78%) del intermediario 80. f) Preparación del intermediario 81 Una mezcla del intermediario 80(0.0022 mol) e hidróxido de sodio (0.0088 mol) en EtOH (100 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 6 horas, luego se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se evaporó a sequedad. El residuo se absorbió en éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.965 g (88%) del intermediario 81 punto de fusión >260°C. q) Preparación del intermediario 82 Se agregaron EDC (0.0038 mol) y HOBt (0.0038 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 81 (0.0019 mol) en THF (100 ml) y DCM (100 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0038 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió en agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.2 g) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05 a 93/7/0.35). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.114 g del intermediario 82.
EJEMPLO A14 a) Preparación del intermediario 83 Una mezcla del intermediario 62 (0.0034 mol) e hidróxido de sodio (0.0134 mol) en EtOH (150 ml) se agitó a 80°C durante 3 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se absorbió en éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 1.18 g (78%) del intermediario 83 punto de fusión > 260°C. b) Preparación del intermediario 84 Se agregaron EDC (0.0052 mol) y HOBt (0.0052 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 83 (0.0026 mol) en THF (120 ml) y DCM (120 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-¡l)-hidroxilamina (0.0052 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 días, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (2 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo (0.75 g, 55%) se purificó por cromatografía de columna sobre cromasil (10 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH OH 96/4/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.625 g del intermediario 84. Este producto se usó directamente en el siguiente paso de la reacción.
EJEMPLO A15 Preparación del intermediario 85 4-Piperidinometanamina (0.65 mol) y carbonato de potasio (96 g) se agitaron en acetonitrilo (1000 ml) y luego se agregó por goteo una solución de éster etilo de ácido 2-(metilsulfoníl)-5-pir¡mid¡nocarboxílico (0.37 mol) en acetonitrilo (500 ml) a temperatura ambiente durante más de 1 hora. La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y el solvente se evaporó. El residuo se agitó en agua y la mezcla se extrajo con DCM (2 x 500 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (eluyente 1 : EtOAc/Hexano 1/1 ; eluyente 2: MeOH + pequeña cantidad de NH4OH). Se recogieron las fracciones de producto, se agitaron con una mezcla aguada de carbonato de potasio y la mezcla se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 31 g (32%) del intermediario 85.
EJEMPLO A16 a) Preparación del intermediario 86 Se agregó hidruro de sodio (0.0095 mol) a 5°C a una solución de 5-cloro-1/-/-indola-3-carboxaldehído (0.0056 mol) en THF (52 ml) bajo flujo de N2. La mezcla se agitó a 0°C durante 1 hora. Luego se agregó 1-yodo-propano (0.0067 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días, se vertió en agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó, produciendo 1.5 g del intermediario 86. Este producto se usó directamente en el siguiente paso de reacción. b) Preparación del intermediario 87 Se agregaron cianoborohidruro de sodio (0.0068 mol) y ácido acético (0.0046 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 85 (0.0042 mol) y el intermediario 86(0.0051 mol) en MeOH (120 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó y sometió a reflujo durante 2 días, luego se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en carbonato de potasio al 10% y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (2.42 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 1.2 g (60%) del intermediario 87. c) Preparación del intermediario 88 Una mezcla del intermediario 87(0.0025 mol) e hidróxido de sodio (0.01 mol) en EtOH (120 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 4 horas, luego se evaporó a sequedad. El residuo se absorbió en éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.845 g (72%) del intermediario 88 punto de fusión > 260°C. d) Preparación del intermediario 89 Se agregaron EDC (0.0036 mol) y HOBt (0.0036 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 88 (0.0018 mol) en THF (90 ml) y DCM (90 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó durante 30 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroxílamina (0.0036 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.3 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0.5). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.54 g (56%) del intermediario 89.
EJEMPLO A17 a) Preparación del intermediario 90 Se agregó cloruro de metanosulfonilo (0.004 mol) a 10°C a una solución de 1 ,2-dimetil-1 tf-indola-3-etanol (0.0026 mol) y trietilamina (0.008 mol) en DCM (10 ml) bajo flujo de N2 La mezcla se agitó a 10°C durante 4 horas. El solvente se evaporó a sequedad, produciendo el intermediario 90.
Este producto se usó directamente en el siguiente paso de reacción. b) Preparación del intermediario 91 Una mezcla del intermediario 85 (0.0054 mol), el intermediario 90(0.0075 mol) y carbonato de potasio (0.021 mol) en acetonitrilo (150 ml) se agitó y sometió a reflujo durante 2 días, luego se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en agua con hielo y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (1.88 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.15 g (7%) del intermediario 91. c) Preparación del intermediario 92 Una mezcla del intermediario 91(0.0003 mol) en hidróxido de sodio (0.0014 mol) y EtOH (20 ml) se agitó y sometió a reflujo durante un día, luego se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó a sequedad. El residuo se absorbió en éter dietilo. El precipitado se filtró y se secó, produciendo 0.12 g (82%) del intermediario 92 punto de fusión > 260°C. d) Preparación del intermediario 93 Se agregaron EDC (0.0005 mol) y HOBt (0.0005 mol) a temperatura ambiente a una solución del intermediario 92(0.0002 mol) en THF (15 ml) y DCM (15 ml). La mezcla se agitó durante 15 minutos. Se agregó O-(tetrahidro-2/-/-piran-2-il)-hidroxilamina (0.0005 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 dias, se vertió en agua con hielo y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO ), se filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0.14 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (10 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.3). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.035 g (25%) del intermediario 93.
El Cuadro F-1 enlista los intermediarios que se prepararon de acuerdo con alguno de los Ejemplos de arriba.
CUADRO F-1 (Intermediarios) B. Preparación de los compuestos finales EJEMPLO B1 Preparación del compuesto 1a Se agregó TFA (2 ml) a una mezcla del intermediario 3 (0.0006 mol) en MeOH (40 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 horas. El solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de EtOAc/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.31 g (86%) del compuesto 1 a, punto de fusión 130X.
Síntesis alternativa del compuesto 1 Preparación del compuesto 1b Se agregaron hidroxilamina (50% en agua, 7.5 ml) y luego NaOH 1 N (15 ml) a 10X, a una mezcla del intermediario 1 (0.0098 mol) en MeOH (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla se acidificó a pH 5-6 mediante añadiendo una solución de HCl 1 N. El precipitado se filtró, se lavó con éter dietilo y se secó. El residuo (4.5 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 90/10/1). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 3.1 g (80%). La sal de HCl se preparó sobre una fracción (0.5 g) en EtOH y el precipitado se filtró, se lavó con éter dietilo y se secó, produciendo 0.43 g del compuesto 1b punto de fusión 220X.
EJEMPLO B2 Preparación del compuesto 2 Se agregó TFA (0.5 ml) a una mezcla del intermediario 7(0.0001 mol) en MeOH (10 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de acetonitrilo/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.036 g (50%) del compuesto 2 punto de fusión 205X.
EJEMPLO B3 Preparación del compuesto 3 Se agregó TFA (5 ml) a temperatura ambiente a una mezcla del intermediario 12(0.0014 mol) en MeOH (100 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. El solvente se evaporó a sequedad.
El residuo se cristalizó a partir de EtOAc/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.545 g (74%) del compuesto 3 punto de fusión 121 X.
EJEMPLO B4 Preparación del compuesto 4 Se agregó TFA (0.5 ml) a una mezcla del intermediario 17(0.0009 mol) en MeOH (80 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. El solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.19 g (32%) del compuesto 4 punto de fusión 103X.
EJEMPLO B5 Preparación del compuesto 18 Una mezcla del intermediario 48(0.0002 mol) en TFA (0.75 ml) y MeOH (15 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.071 g (59%) del compuestos 18.
EJEMPLO B6 Preparación del compuesto 19 Una mezcla del intermediario 53 (0.0003 mol) in TFA (1 ml) y MeOH (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de MeOH/CH3CN/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.133 g (80%) del compuesto 19 punto de fusión 174X.
EJEMPLO B7 Preparación del compuesto 20 Una mezcla del intermediario 57 (0.00005 mol) en TFA (0.25 ml) y MeOH (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó. El residuo (0.04 g) se cristalizó a partir de CH3CN/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó. El residuo (0.04 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.02 g (80%) del compuesto 20 punto de fusión 90X.
EJEMPLO B8 Preparación del compuesto 21 Una mezcla del intermediario 60 (0.0001 mol) en TFA (0.5 ml) y MeOH (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El solvente se evaporó. El residuo (0.15 g) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice LiChroprep® NH2 (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó, produciendo 0.064 g (78%) del compuesto 21 punto de fusión 83X.
EJEMPLO B9 Preparación del compuesto 22 Una mezcla del intermediario 65 (0.002 mol) en TFA (6 ml) y MeOH (120 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de CH3CN/MeOH/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.9 g (87%) del compuesto 22 punto de fusión 183X.
EJEMPLO B10 Preparación del compuesto 23 Una mezcla del intermediario 72 (0.0001 mol) in TFA (0.5 ml) y MeOH (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. El solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.059 g (59%) del compuesto 23 punto de fusión 182X.
EJEMPLO B11 Preparación del compuesto 24 Una mezcla del intermediario 75 (0.0003 mol) en TFA (1 ml) y MeOH (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de MeOH/CH3CN/éter dietilo. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.147 g (78%) del compuesto 24 punto de fusión 160X.
EJEMPLO B12 Preparación del compuesto 25 Una mezcla del intermediario 82 (0.0009 mol) en TFA (2.5 ml) y MeOH (56 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/H2O 90/10/1 ). Se recogieron las fracciones puras y el solvente se evaporó. El residuo se cristalizó a partir de DIPE. El precipitado se filtró y secó, produciendo 0.286 g (53%) del compuesto 25 punto de fusión 80X.
EJEMPLO B13 Preparación del compuesto 26 Una mezcla del intermediario 84 (0.0012 mol) en TFA (3 ml) y MeOH (60 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de DCM/MeOH. El precipitado se filtró, se lavó con éter dietilo y se secó, produciendo 0.322 g (50%) del compuesto 26 punto de fusión 188X.
EJEMPLO B14 Preparación del compuesto 27 Una mezcla del intermediario 89 (0.001 mol) en TFA (2.5 ml) y MeOH (50 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, y luego se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó a partir de MeOH/CH3CN/éter dietilo. El precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó, produciendo 0.33 g (55%) del compuesto 27 punto de fusión 171X.
EJEMPLO B15 Preparación del compuesto 28 Una mezcla del intermediario 93 (0.00007 mol) en TFA (0.2 ml) y MeOH (4 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, y luego se evaporó a sequedad, produciendo 0.041 g (100%) del compuesto 28 punto de fusión 80X. En el Cuadro F-2 se enlistan los compuestos que se prepararon de acuerdo con uno de los Ejemplos de arriba. En los cuadros se usaron las siguientes abreviaturas: .C2HF3O2 significa sal de trifluoroacetato; p.f. significa punto de fusión.
CUADRO F-2 (Compuestos finales) C. EJEMPLO FARMACOLÓGICO La prueba in vitro para la inhibición de histona desacetilasa (ver Ejemplo C.1) mide la inhibición de la actividad enzimátíca de HDAC obtenida con los compuestos de la fórmula (I). La actividad celular de los compuestos de la fórmula (I) se determinó en células tumorales A2780 mediante un ensayo colorimétrico para la toxicidad o supervivencia celulares (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983) (ver Ejemplo C.2). La solubilidad de un compuesto mide la capacidad de un compuesto para permanecer en solución. En un primer método se mide la capacidad de un compuesto para permanecer en solución acuosa durante la dilución (ver Ejemplo C.3.a). Las soluciones de material prima de DMSO se diluyen con un solvente único de regulador acuoso en 3 pasos consecutivos. Para cada dilución se mide la turbiedad con un nefelómetro.
En un segundo método se puede medir la solubilidad de un compuesto a diferentes pH's con el uso de un detector quimioluminiscente de nitrógeno (ver Ejemplo C.3.b). La permeabilidad de un fármaco expresa su capacidad para moverse, desde un medio, hacia el interior otro o a través de otro. Específicamente, su capacidad para moverse al través de la membrana intestinal e ingresar al torrente sanguíneo y/o del torrente sanguíneo hacia su objetivo. La permeabilidad (ver Ejemplo C.4) se puede medir mediante una membrana artificial formada por una bicapa de fosfolípidos que actúa como un filtro inmóvil. En la prueba de la membrana artificial con filtro inmóvil, se forma un "sandwich" con una charola de 96 platinas de microtitulación y una charola filtro de 96 platinas, de manera tal que cada platina compuesta está dividida en dos cámaras con una solución donante en el fondo y una solución aceptante en la parte superior, separadas por un disco de microfiltración de 125 µm (poros de 0.45 µm), cubierto con solución de dioleoilfosfatidilcolina en dodecano al 2% (peso/v) bajo condiciones tales que la bicapa multilaminar se forme dentro de los canales de filtración cuando el sistema se pone en contacto con la solución acuosa del regulador. La permeabilidad de los compuestos a través de esta membrana artificial se mide en cm/s. El objetivo es determinar la permeación de los fármacos a través de una membrana artificial paralela a 2 pH diferentes: 4.0 y 7.4. La detección de los compuestos se realiza con espectrometría UV a una longitud de onda óptima de entre 250 y 500 nm.
El metabolismo de los fármacos significa que un compuesto liposoluble xenobiótico o endobiótico se transforman enzimáticamente en (un) metabolito(s) hidrosoluble(s) polar(es) y excretable(s). El principal órgano para el metabolismo de los fármacos es el hígado. Los productos metabólicos con frecuencia son menos activos que el fármaco padre, o inactivos. Sin embargo, algunos metabolitos pueden aumentar su actividad o efectos tóxicos. Por lo tanto el metabolismo de los fármacos puede incluir ambos procesos de "detoxificación" y "toxicación". Uno de los sistemas enzimáticos más importantes que determinan la capacidad del organismo de encargarse de los fármacos y productos químicos, está representado por las monooxigenasas del citocromo P450, que son enzimas dependientes de NADPH. La estabilidad metabólica de los compuestos se puede determinar in vitro mediante el uso de tejido subcelular humano (ver Ejemplo C.5.a.). Aquí, la estabilidad de los compuestos se expresa como % del fármaco metabolizado después de 15 minutos de incubación de estos compuestos con microsomas. La cuantificación de los compuestos se determinó mediante análisis LC-MS. La estabilidad metabólica de los compuestos también se puede determinar calculando de la vida media de los compuestos en los hepatocitos celulares de ratas (ver Ejemplo C.5.b.). Se ha demostrado que una amplia variedad de agentes antitumorales activan la proteína p21 , incluyendo los agentes que dañan el ADN y los inhibidores de histona desacetilasa. Los agentes que dañan el ADN activan el gen p21 mediante el supresor tumoral p53, mientras que los inhibidores de histona desacetilasa activan de forma transcripcional el gen de p21 por medio de la transcripción del factor Sp1. De esta manera, los agentes que dañan el ADN activan al promotor p21 mediante los elementos sensibles al p53 mientras que los inhibidores de histona desacetilasa activan al promotor p21 a través de los sitios sp1 (localizados en la región -60 bp a +40 bp relacionados con la caja TATA), y ambos conducen al aumento de la expresión de la proteína p21. Cuando el promotor p21 de la célula consiste de un fragmento del promotor p21 1300 bp que no comprende los elementos sensibles al p53, no responde por ende a los agentes que dañan el ADN. La capacidad de los compuestos para inducir el p21 se puede evaluar de varias maneras. Un primer método es tratar a las células tumorales con los compuestos de interés, y después la lisis de las células detecta la inducción del p21 con la prueba de inmunoabsorbencia ligado a enzimas (WAF1 ELISA de Oncogene). La prueba de p21 es una prueba inmune "sandwich" de enzimas que emplea anticuerpos monoclonales de ratón y policlonales de conejo. Un anticuerpo policlonal de conejo, específico para la proteína p21 humana, fue inmovilizado en la superficie de las platinas plásticas que se proporcionan en el kit. Cualquier p21 presente en la muestra de prueba se unirá al anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclonal detector biotinilado también reconoce proteínas p21 humanas, y se unirá a cualquier p21 que sea retenida por el anticuerpo de captura. El anticuerpo detector, a su vez, está unido a la estreptovidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. La peroxidasa de rábano cataliza la conversión del substrato cromogénico tetra-metilbencidina, desde una solución incolora hasta una solución azul (o amarilla después de la adición de reactivo de detención), cuya intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína p21 unida a la charola. El producto de reacción coloreado se cuantifica con un espectrofotómetro. La cuantificación se realiza mediante la construcción de una curva estándar usando las concentraciones conocidas de p21 (se proporcionan liofilizadas). Este ensayo puede medir la inducción de p21 como consecuencia del daño al ADN o como consecuencia de la inhibición de histona desacetilasa (ver Ejemplo C.6.a.). Otros métodos prueban la capacidad de los compuestos para inducir p21 como consecuencia de la inhibición de HDAC a nivel celular. Las células se pueden transfectar en forma estable con un vector de expresión que contenga fragmentos del promotor p21 de 1300 bp que no comprenda a los elementos sensibles al p53, y donde un aumento de la expresión de un gen reportero, comparado con los niveles de control, identifica los compuestos que tienen capacidad de inducción de p21. El gen reportero es una proteína fluorescente y la expresión del gen reportero se mide como la cantidad de luz fluorescente emitida. (Ver ejemplo C.6.b). El último método es un método in vivo en el que se usan ratones para rastrear la actividad farmacéutica de un compuesto. Las células tumorales transformadas en forma estable arriba descritas se pueden administrar a los ratones en una cantidad suficiente para producir la formación de un tumor. Una vez que las células tumorales tuvieron el tiempo suficiente para formar un tumor, puede administrarse a los animales un compuesto potencialmente activo, y el efecto de ese compuesto sobre las células tumorales se evalúa midiendo la expresión del gen reportero. La incubación con los compuestos farmacéuticos activos producirá un aumento de la expresión del gen reportero comparada con los niveles de control (ver Ejemplo C.6.c.) Los inhibidores específicos de HDAC no deberían inhibir a otras enzimas como las abundantes proteínas CYP P450. Las proteínas CYP P450 (expresadas en E coli) 3A4, 2D6 y 2C9 convierten sus substratos específicos en moléculas fluorescentes. La proteína CYP3A4 convierte la cumarina de 7-benciloxitrifluorometilo (BFC) en cumarina de 7-hidroxi-trifluorometilo. La proteína CYP2D6 convierte la 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC) en hidrocloruro de 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidrox¡-4-metilcumarina, y la proteína CYP2C9 convierte la cumarina de 7-metoxi-4-trifluorometilo (MFC) en cumarina de 7-hidroxi-trifluorometilo. Los compuestos que inhiben la reacción enzimática producirán una disminución de la señal fluorescente (ver Ejemplo C.7).
EJEMPLO C.1. Ensayo in Vitro de inhibición de histona desacetilasa EJEMPLO C.1.A. Ensayo In Vitro con substrato marcado con [3H] Extractos nucleares de HeLa (proveedor: Biomol) se incubaron a 60 µg/ml con 75 µM de substrato. Como substrato para medir la actividad de HDAC se usó un péptido sintético, p. ej. los aminoácidos 14-21 de la histona H4. El substrato se biotiniló en la porción NH2 terminal con espaciador de ácido 6-aminohexanoico, y se protegió la porción COOH terminal con un grupo amida y específicamente [3H] acetilado en la lisina 16. El substrato, biotin-(6-aminohexanoico)Gly-Ala-([3H]-acetil-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2), se agregó en un regulador que contenía Hepes 25 mM, sacarosa 1 M, 0.1 mg/ml de BSA y 0.01% de Tritón X-100 a pH 7.4. Después de 30 minutos la reacción de desacetilación se terminó con la adición de HCl y ácido acético (concentración final de 0.035 mM y 3.8 mM respectivamente). Después de detener la reacción, el acetato 3H libre se extrajo con acetato de etilo. Después de mezclar y centrifugar, se contó la radiactividad en una alícuota de la fase superior (orgánica), en un contador ß. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (que contenían extracto nuclear de HeLa y DMSO sin compuestos), una incubación en blanco (que contenía DMSO pero no tenía extracto nuclear HeLa ni compuestos) y muestras (que contenían compuestos disueltos en DMSO y extracto nuclear HeLa). En primera instancia, los compuestos se probaron a una concentración de 10~5 M. Cuando los compuestos mostraron actividad a 10"5 M, se hizo una curva de concentración-respuesta en la que se probaron los compuestos a concentraciones de entre 10"5 M y 10"12 M. En cada prueba, el valor en blanco se restó de los valores de control y de muestra. La muestra control representaba el 100% de desactilación del substrato. Para cada muestra la radiactividad se expresó como un porcentaje del valor promedio de los controles. Cuando era apropiado, los valores de IC50 (concentración del fármaco necesaria para reducir la cantidad de metabolitos al 50% del control) se computaron mediante análisis probit para datos graduados. Aquí los efectos de los compuestos de prueba se expresan como plC50 (el valor negativo del logaritmo del valor de la IC50) (ver Cuadro F-3).
EJEMPLO C.1. B. Ensayo In Vitro con substrato etiquetado con fluorescencia Se usó la prueba de actividad fluorescente HDAC/Drug Discovery Kit de Biomol (cat. No: AK-500-0001). La prueba de actividad fluorescente HDAC se basa en el substrato Fluor de Lys (Fluorogenic Histone deAcetylase Lysyl, 'lisil histona desacetilasa fluorogénica') y la combinación del desarrollador. El substrato Fluor de Lys, comprende una cadena lateral de lisina acetilada. La desacetilación del substrato sensibiliza al substrato de modo que, en un segundo paso, el tratamiento con el desarrollador Fluor de Lys produce un fluoróforo. Los extractos nucleares de HeLa (proveedor: Biomol) se incubaron a 60 µg/ml con 75 µM de substrato. Se agregó el substrato Fluor de Lys en un regulador que contenía Tris 25 mM, NaCI 137 mM, KCl 2.7 mM y MgCI2.6H O 1 mM a pH 7.4. Después de 30 min, se agregó 1 volumen del desarrollador. El fluoróforo se excitó con luz de 355 nm y la luz emitida (450 nm) se detectó en un lector de charolas fluorométrico. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (conteniendo extracto nuclear HeLa y regulador), una incubación en blanco (conteniendo regulador pero no tiene extracto nuclear HeLa) y muestras (conteniendo compuesto disuelto en DMSO y luego diluido en regulador y extracto nuclear HeLa). En primera instancia, los compuestos se probaron a una concentración de 10"5 M. Cuando los compuestos mostraron actividad a 10~5 M, se hizo una curva de concentración-respuesta donde los compuestos se probaron a concentraciones de entre 10'5 M y 10"9 M. Todas las muestras se probaron cuatro veces. En cada prueba, el valor en blanco se restó de los valores de los controles y las muestras. La muestra control representaba el 100% de desactilación. Para cada muestra la fluorescencia se expresó como un porcentaje del valor promedio de los controles. Cuando era apropiado, los valores de IC50 (concentración del fármaco necesaria para reducir la cantidad de metabolitos al 50% del control) se computaron mediante análisis probit para datos graduados. Aquí los efectos de los compuestos de prueba se expresan como plC5o (el valor negativo del logaritmo del valor de la IC50) (ver Cuadro F-3).
EJEMPLO C.2 Determinación de la actividad antiproliferativa de las células A2780 Todos los compuestos probados se disolvieron en DMSO y luego se hicieron diluciones en el medio de cultivo. Las concentraciones finales de DMSO nunca se excedieron del 0.1 % (v/v) en las pruebas de proliferación celular. Los controles contenían células A2780 y DMSO sin compuestos y los blancos contenían DMSO pero no células. Se disolvió MTT a 5 mg/ml en PBS. Se preparó un regulador de glicina que comprendía glicina 0.1 M y NaCI 0.1 M regulado a pH 10.5 con NaOH (1 N) (todos los reactivos eran de Merck). Las células humanas de carcinoma ovárico A2780 (un amable obsequio del Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cáncer Centre, Pennsylvania, USA]) se cultivaron en el medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50 µg/ml de gentamicina y suero fetal de becerro al 10 %. Las células se conservaron de forma habitual como cultivos de monocapas a 37X en una atmósfera humidificada de CO al 5 %. Las células se trasladaron una vez por semana usando una solución de tripsinan/EDTA con una relación de corte de 1 :40. Todos los medios y suplementos se obtuvieron de Life Technologies. Las células estaban libres de contaminación con micoplasmas lo cual se determinó mediante el equipo de prueba genética de cultivo de micoplasma en tejidos (proveedor: BioMérieux). Las células se sembraron en charolas de cultivo de 96 platinas en NUNC™ (proveedor: Life Technologies) y se permitió que se adhirieran al plástico durante una noche. Las densidades usadas para colocar en las charolas fueron de 1500 células por platina en un volumen total de 200 µl de medio. Después de la adhesión de las células a las charolas, se cambió el medio y se agregaron fármacos y/o solventes a un volumen final de 200 µl. Luego de cuatro días de incubación, el medio se reemplazó con 200 µl de medio fresco y se evaluaron la densidad y la viabilidad celulares por medio de una prueba basada en MTT. Se agregaron 25 µl de solución MTT a cada platina y las células se incubaron después durante 2 horas a 37X. Luego se aspiró con cuidado el medio y el producto de formazan de MTT azul se solubilizó mediante el agregado de 25 µl de regulador de glicina seguido por 100 µl de DMSO. Las microcharolas de prueba se agitaron durante 10 minutos en un agitador de microcharola y se midió la absorbencia 540 nm con un espectrofotómetro Emax de 96 platinas (proveedor: Sopachem). En un experimento, los resultados para cada condición experimental son la media de las platinas por triplicado. Para el propósito de rastreo inicial, los compuestos se probaron con una concentración fija única de 10"6 M. Para los compuestos activos, los experimentos se repitieron para establecer curvas completas de concentración-respuesta. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (que no contenían fármaco) y una incubación en blanco (que no contenía células ni fármaco). El valor en blanco se restó de los valores de todos los controles y las muestras. Para cada muestra, el valor medio de desarrollo celular (en unidades de absorbencia) se expresó como un porcentaje del valor medio del desarrollo celular del control. Los valores de IC50 (concentración de fármaco que se necesita para reducir el desarrollo celular al 50% del control) se computaron mediante análisis probit para datos graduados (Finney, D.J., Probit Analyses, 2nd Ed. Capítulo 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Aquí se expresaron los efectos de los compuestos de prueba como plC5o (el valor negativo del logaritmo del valor de IC5o) (ver tabla F-3).
EJEMPLO C.3 Solubilidad/Estabilidad C.3.1. Solubilidad en medio acuoso En el primer paso de dilución, 10 µl de una solución concentrada de los compuestos activos, solubilizado en DMSO (5 mM), se agregaron a 100 µl de regulador de citrato de fosfato pH 7.4 y se mezclaron. En el segundo paso de dilución, una alícuota (20 µl) del primer paso de dilución se dispensó después en 100 µl del regulador de citrato de fosfato pH 7.4 y se mezclaron. Finalmente, en el tercer paso de dilución, una muestra (20 µl) del segundo paso de dilución se diluyó además en 100 µl regulador de citrato de fosfato pH 7.4, y se mezcló. Todas las diluciones se realizaron en charolas de 96 platinas. Inmediatamente después del último paso de dilución se midió con un nefelómetro la turbiedad de los tres pasos consecutivos de dilución. La dilución se hizo por triplicado para cada compuesto para excluir errores ocasionales. Se llevó al cabo una categorización de tres clases basadas en las mediciones de turbiedad. Los compuestos de alta solubilidad obtuvieron un puntaje de 3 y para estos compuestos la primera dilución es límpida. Los compuestos con solubilidad media obtuvieron un puntaje de 2. Para estos compuestos la primera dilución no es límpida y la segunda es límpida. Los compuestos con baja solubilidad obtuvieron un puntaje de 1 y para estos compuestos ambas diluciones primera y segunda no son límpidas (ver Cuadro F-3).
C.3.b. Solubilidad/estabilidad a diferentes pH's También se puede medir la solubilidad de un compuesto, a diferentes pH, por medio de un detector quimioluminiscente de nitrógeno (ver Cuadro F-3).
EJEMPLO C.4 Análisis de la permeabilidad de la membrana artificial paralela Las muestras de materia prima (alícuotas de 10 µl de una solución 5 mM de materia prima en 100% de DMSO) se diluyeron en una platina profunda o en una charola de premezcla que contenía 2 ml de un sistema de regulador acuoso a pH 4 o pH 7.4 (Sistema de Solución Concentrada PSR4 (plON)). Antes, las muestras se agregaron a la charola de referencia, se agregaron 150 µl de regulador a las platinas y se llevó a cabo una medición de UV en blanco. Luego se desechó el regulador y la charola se usó como charola de referencia. Toda las mediciones se hicieron en charolas resistentes al UV (proveedor: Costar o Greiner). Después de la medición en blanco de la charola de referencia, se agregaron 150 µl de las muestras diluidas a la charola de referencia y se agregaron 200 µl de las muestras diluidas a la charola donante 1. Una charola aceptante con filtro (proveedor: Millipore, tipo: MAIP N45) se cubrió con 4 µl de la solución para formar la membrana artificial (1 ,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-fosofocolina en dodecano que contenía 2,6-d¡Xerbutil-4-metilfenol al 0.1 %) y se colocó en la parte superior de la charola donante 1 para formar un "sandwich". El regulador (200 µl) se dispensó en las- platinas aceptantes, sobre la parte superior. El sandwich se cubrió con una tapa y se almacenó durante 18 horas a temperatura ambiente, en la oscuridad. Se realizó la medición en blanco de la charola aceptante 2 mediante la adición de 150 µl de regulador a las platinas, seguido por una medición de UV. Después de la medición del blanco de la charola aceptante 2, se desechó el regulador y se transfirieron 150 µl de la solución aceptante de la charola aceptante con filtro 1 a la charola aceptante 2. Luego la charola aceptante con filtro 1 se retiró del sandwich. Luego, la medición en blanco de la charola donante 2 (ver arriba) y 150 µl de la solución donante, se transfirieron de la charola donante 1 a la charola donante 2. Los espectros UV de la charola donante 2, la charola aceptante 2 y las platinas de la charola de referencia se rastrearon con un SpectraMAX 190. Todos los espectros se procesaron para calcular la permeabilidad con el Software Command PSR4p. Todos los compuestos se midieron por triplicado. Como estándares en cada experimento se usaron carbamacepina, griseofulvin, acicloguanisina, atenolol, furosemida y clorotiazida. Los compuestos se dividieron en 3 categorías de acuerdo con su permeabilidad baja (efecto medio <0.5 x 10"6 cm/s; puntaje 1), permeabilidad media (1 x 10~6 cm/s > efecto medio >0.5 x 10~6 cm/s; puntaje 2), o permeabilidad alta (> 1 x 10~6 cm/s; puntaje 3).
EJEMPLO C.5 Estabilidad metabólica Eiemplo C.5.a. Se hicieron preparaciones de tejidos subcelulares de acuerdo con Gordo et al. (Xenobiotica 5: 453-462, 1975) mediante la separación por centrifugación después de la homogenización mecánica del tejido. El tejido hepático se enjuagó con regulador Tris-HCl 0.1 M helado (pH 7.4) para lavar el exceso de sangre. Luego se secó, se pesó y se cortó de manera grosera con tijeras quirúrgicas. Los fragmentos de tejido se homogenizaron en 3 volúmenes de regulador fosfato 0.1 M helado (pH 7.4) usando un Potter-S (Braun, Italia) equipado con un mortero de Teflon o un homogeneizador Sorvall Omni-Mix, para 7 x 10 sec. En ambos casos, los recipientes se conservaron en/sobre hielo durante todo el proceso de homogeneización. Los homogenatos de tejido se centrifugaron a 9000 x g durante 20 minutos a 4X usando una centrífuga Sorvall o una ultracentrifuga Beckman. El flotante resultante se almacenó a -80 °C y se denominó 'S9'. La fracción S9 después se puede centrifugar a 100,000 x g durante 60 minutos (4°C) usando una ultracentrífuga Beckman. El flotante resultante se aspiró con cuidado, se dividió en alícuotas y se denominó 'citosol'. El precipitado se resuspendió en regulador fosfato 0.1 M (pH 7.4) en un volumen final de 1 ml por 0.5 g de peso del tejido original y se denominó 'microsomas'. Todas las fracciones subcelulares se dividieron en alícuotas, e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Para las muestras de prueba, la mezcla de incubación contenía PBS (0.1 M), compuesto (5 µM), microsomas (1 mg/ml) y un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 0.8 mM, cloruro de magnesio 0.8 mM y 0.8 unidades de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato). Las muestras de control contenían el mismo material pero los microsomas se reemplazaron con microsomas inactivados por calor (10 minutos a 95 grados Celsius). La recuperación de los compuestos de las muestras de control fue siempre del 100%. Las mezclas se preíncubaron durante 5 minutos a 37 grados Celsius. La reacción comenzó a tiempo cero (t = 0) con la adición de NADP 0.8 mM y las muestras se incubaron durante 15 minutos (t = 15). La reacción se terminó con la adición de 2 volúmenes de DMSO. Luego las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 900 x g y los flotantes se almacenaron a temperatura ambiente durante un tiempo no mayor de 24 horas antes del análisis. Todas las incubaciones se realizaron por duplicado. El análisis de los flotantes se realizó con análisis LC-MS. La lixiviación de muestras se realizó en Xterra MS C18 (50 x 4.6 mm, 5 µm, Waters, US). Se usó un sistema de HPLC Alliance 2790 (proveedor: Waters, US). La lixiviación se realizó con regulador A (acetato de amonio 25 mM (pH 5.2) en H O/acetonitrilo (95/5)), el solvente B fue acetonitrilo y el solvente C metanol con un caudal de flujo de 2.4 ml/min. El gradiente empleado consistió en aumentar la concentración de la fase orgánica desde 0% hasta 50% de B y 50% de C en 5 minutos, hasta 100% de B en 1 minuto de forma lineal y la concentración de la capa orgánica se mantuvo estacionaria durante 1.5 minutos adicionales. El volumen total de inyección de las muestras fue de 25 µl. Se usó como detector un espectrómetro de masa triple cuadripolar Quattro (proveedor: Micromass, Manchester, UK) equipado con fuente ESI. La fuente y la temperatura de desolvatación se fijaron en 120 y 350°C respectivamente y se usó nitrógeno como gas nebulizador y de secado.
Los datos se obtuvieron en modo de barrido positivo (reacción de ion único). El voltaje del cono se fijó en 10 V y el tiempo de residencia fue de 1 segundo. La estabilidad metabólica se expresó como % de metabolismo del compuesto después de 15 minutos de incubación en presencia de microsomas activos (E(act)) (% de metabolización = 100% -((Corriente Iónica Total (TIC) de E(actividad) a t=15 / TIC de E(actividad) a t=0) x 100). Los compuestos que tenían un porcentaje de metabolismo menor del 20% se definieron como de alta estabilidad metabólica. Los compuestos que tuvieron un metabolismo entre 20 y 70% se definieron como de estabilidad intermedia y los compuestos que presentaron un porcentaje de metabolismo mayor de 70 se definieron como de baja estabilidad metabólica. Siempre se incluyeron tres compuestos de referencia al realizar un rastreo de estabilidad metabólica. El Verapamil se incluyó como un compuesto con baja estabilidad metabólica (% de metabolismo = 73%). El Cisapride se incluyó como compuesto con estabilidad metabólica media (% de metabolismo de 45%) y el propanol se incluyó como compuesto con estabilidad metabólica intermedia a alta (25% de metabolismo). Estos compuestos de referencia se usaron para validar la prueba de estabilidad metabólica.
C.5.b: Estabilidad metabólica con cultivos celulares de hepatocitos de rata. Se aislaron hepatocitos de rata de ratas macho Sprague Dowley. Los compuestos se disolvieron hasta una solución de inicio 5 mM en DMSO al 100% y se incubaron hasta una concentración final de 5 µM a 0, 15, 30, 60 y 120 minutos con cultivos celulares de hepatocitos de rata (0.5 millón de células viables/0.5 ml) usando charolas de 24 platinas. Las muestras se prepararon para LC-MS con la adición de dos volúmenes de DMSO. Las muestras se agitaron vigorosamente y después se centrifugaron a 900 g durante 10 minutos (temperatura ambiente). Todos los experimentos se llevaron al cabo por triplicado. Se analizaron 50 µl del flotante resultante con LC-MS. Para LC-MS, la lixiviación de las muestras se realizó sobre una columna de Hypersil BDS C18 (50 x 4.6 mm, 5 µm, Thermohypersil, UK). El sistema de HPLC comprendía un sistema se entrega Surveyor (Surveyor Inc., San José, US) equipado con dispositivo de muestreo automático Surveyor. La lixiviación se realizó con regulador A (acetato de amonio 10 mM (pH 6.9) en H2O/acetonitrilo (95:5)) y solvente B (acetonitrilo) a un caudal de flujo de 1.2 ml/min. El gradiente empleado fue de 0.5 min del solvente A como condición inicial seguida por concentraciones crecientes de la fase orgánica, desde 0 % de B hasta 95% de B durante 2 minutos en forma lineal. Esta fase se mantuvo estacionaria durante más de 2 minutos y se redujo otra vez a 0% de B en 0.5 minutos. El volumen total de inyección de las muestras fue de 50 µl. La temperatura del horno de la columna se mantuvo a 40X. El flujo de LC se dividió para la detección MS y 01 ml se dejaron en la fuente.
Se usó para la detección un espectrómetro de masa triple cuadripolar TSQ Quantum (Thermofinnigan, LaJolla, US) equipado con fuente ESI. El voltaje de la fuente se ajustó a 3800 voltios, la temperatura de capilaridad a 300X. El espectrómetro de masa se operó en modo de ion positivo en SIM ajustado a la masa de M+H con una amplitud de barrido de 1 Da a los fines de la cuantificación. El instrumental de control, la obtención y procesamiento de datos se llevaron al cabo usando el software Xcalibur (ThermoFinnigan, San José, CA, US). La estabilidad metabólica de los compuestos en los hepatocitos de rata se expresó como vida media in vitro. Como referencia, se usó el compuesto R306465 (Solicitud de Patente WO03/76422) (vida media in vitro: 8 min). Se probaron el compuesto 1 y el compuesto 5, y tuvieron una vida media in vitro de 81 minutos y 60 minutos, respectivamente.
EJEMPLO C.6 Capacidad de inducción de p21 Eiemplo C.6.a. Ensayo de inmunoabsorbencia ligado a enzimas para p21 El siguiente protocolo se ha aplicado para determinar el nivel de expresión de la proteína p21 human en células de carcinoma ovárico A2780. Las células A2780 (20,000 células/180 µl) se sembraron en charolas de 96 microplatinas en el medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 50 µg/ml de gentamicina y suero fetal de becerro al 10%. 24 horas antes de la lisis de las células, se agregaron los compuestos a las concentraciones finales de 10~5, 10"6, 10~7 y 10"8 M. Todos los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO y luego se hicieron diluciones en el medio de cultivo. 24 horas después de la adición los compuestos, se eliminaron los flotantes de las células. Las células se lavaron con 200 µl de PBS helado. Las platinas se aspiraron y se agregaron 30 µl de regulador de lisis (Tris. HCl 50 mM (pH 7.6), NaCI 150 mM, Nonidet p40 al 1% y glicerol al 10%). Las charolas se incubaron durante una noche a -70 °C. Se retiró de la bolsa de papel el número apropiado de platinas de microtitulación, y se colocaron en un receptáculo de platinas vacío. Se preparó una solución de trabajo (1x) del regulador de lavado (concentrado para lavado de charolas 20x: 100 ml de la solución de PBS concentrada 20 veces y tensioactivo. Contiene cloroacetamida al 2%). El estándar liofilizado de p21WAF se reconstituyó con H2O destilada y después se diluyó con diluyente de muestras (proporcionado en el kit) Las muestras se prepararon con una dilución de 1 :4 en el diluyente de muestras. Las muestras (100 µl) y los estándares de p21WAF1 (100 µl) se pipetearon en las platinas adecuadas y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las platinas se lavaron 3 veces con el regulador de lavado 1x y luego se pipetearon en cada platina 100 µl del reactivo de anticuerpo detector (una solución de anticuerpo monoclonal p21WAF1 biotinilado). Las platinas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se lavaron tres veces con regulador de lavado 1x. El conjugado 400x (conjugado de estreptoavidina-peroxidasa: solución concentrada 400 veces) se diluyó y se agregaron a las platinas 100 µl de la solución 1x. Las platinas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lavaron 3 veces con regulador de lavado 1x y 1 vez con H2O destilada. La solución de substrato (substrato cromogénico) (100 µl) se agregó a las platinas y estas se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La solución de detención se agregó a cada platina en el mismo orden en que previamente se agregó la solución de substrato. Se midió la absorbencia de cada platina usando un lector de charolas espectrofotométrico con longitudes de onda duales de 450/595 nm. Para cada experimento, se corrieron en paralelo los controles (no contenían fármaco) y la incubación en blanco (no contenía células ni fármaco). El valor en blanco se restó de todos los valores de los controles y las muestras. Para cada muestra, el valor de inducción de p21WAF1 (en unidades de absorbencia) se expresó como el porcentaje del valor para el p21WAF1 presente en el control. El porcentaje de inducción mayor a 130% se definió como inducción significativa. Se probaron nueve compuestos y todos mostraron inducción significativa a una concentración 10"6 M.
Eiemplo C.6.b. Método celular Las células A2780 (ATCC) se cultivaron en el medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM y gentamicina a 37°C en un incubador humidificado con CO2 al 5%. Todas las soluciones de cultivo celular son proporcionadas por Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Otros materiales son proporcionados por Nunc. El ADN genómico se extrajo de las células proliferantes A2780 y se usó como plantilla para el aislamiento de la PCR alojada en el promotor p21. La primera amplificación se realizó para 20 ciclos a una temperatura de recocido de 55X usando el par de oligonucleótidos GAGGGCGCGGTGCTTGG y TGCCGCCGCTCTCTCACC con el ADN genómico como plantilla. El fragmento resultante de 4.5 kb que contenía el fragmento -4551 a +88 relacionado con la caja TATA se reamplificó con los oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC para 20 ciclos con recocido a 88X, produciendo un fragmento de 4.5 kb, y subsecuentemente con el par de oligonucleótidos TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con recocido a 88X, produciendo un fragmento de 1.3 kb que contenía el fragmento -1300 a +88 relacionado con la caja TATA. Los sitios de restricción Xhol y Kpnl presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) se usaron para subclonacíón. El reportero de luciferasa se eliminó de la pGL3 básica y se remplazó con el indicador Zs Verde (proveniente del plásmido pZsVerde1-N1) en los sitios de restricción Kpnl y Xbal. La pGL3-básica-ZsVerde-1300 se construyó por medio de la inserción del fragmento de 1.3 kb mencionado arriba de la región promotora de p21 humana dentro de la pGL3-básica-ZsVerde en los sitios Xhol y Kpnl. Todas las enzimas de restricción son proporcionadas por Boehringer Manheim (Alemania). Las células A2780 se inocularon en una charola de 6 platinas con una densidad de 2 x 105 células, se incubaron durante 24 horas, y se transfectaron con 2 µg de pGL3-básica-ZsVerde-1300 y 0.2 µg del nuevo vector pSV2 usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Bruselas, Bélgica) tal como lo describe el fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días con G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y se desarrollaron suspensiones celulares simples. Después de tres semanas, se obtuvieron clones simples. Los clones seleccionados A2780 se expandieron y se sembraron a razón de 10,000 células por platina en la charola de 96 platinas. 24 horas después de la siembra, las células se trataron durante 24 horas adicionales con los compuestos (que afectan los sitios sp1 de la región proximal del promotor p21 ). Luego, las células se fijaron con PFA al 4% durante 30 minutos y se tiñeron con colorante de Hoechst. La activación del promotor p21 llevó a la producción de ZsVerde y por lo tanto a la fluorescencia, que se detectó con un Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Bruselas, Bélgica). Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (no contenían fármaco) y una incubación en blanco (no contenía células ni fármacos). El valor en blanco se restó de todos los valores de controles y muestras. Para cada muestra, el valor para la inducción de p21 se expresó como el porcentaje del valor para el p21 presente en el control. El porcentaje de inducción mayor de 130 % se definió como inducción significativa. Se probaron setenta y un compuestos y todos presentaron inducción significativa a una concentración de 10"6 M.
Ejemplo C.6.C.: Método in vivo Un clon seleccionado se inyectó por vía subcutánea (107 células/200 µl) en el flanco de ratones lampiños y se obtuvo un tumor de calibre mensurable después de 12 días. A partir del día 12, a los animales se les dosificó por vía oral o intravenosa, en forma diaria durante 6 días, solvente y el compuesto 20-40 pfk (4-10 animales cada uno). Se evaluó la fluorescencia de los tumores por medio del sistema de imágenes corporales totales automatizadas de desarrollo propio (Estereomicroscopio fluorescente tipo Olimpus® SZX12 equipado con un filtro GFP y acoplado a una cámara CCD tipo JAI® CV-M90, controlado por un paquete de software basado en el IMAQ Vision Software de National Instruments®). El compuesto R306465 (Solicitud de Patente WO03/76422) se usó como referencia. Los compuestos se clasificaron en inactivos (sin fluorescencia mensurable), más débil, idéntico o mejor que R306465. El compuesto 1 se probó, y resultó mejor que elR306465.
EJEMPLO C.7 Capacidad de inhibición de P450 Todos los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO (5 mM) y la dilución posterior a la concentración de 5 x 10"4 M se hizo con acetonitrilo. Más diluciones se hicieron en regulador de prueba (regulador de fosfato de NaK 0.1 M, pH 7.4) y la concentración final del solvente nunca fue mayor del 2%. La prueba para la proteína CYP3A4 comprende, por platina, 15 pmol de P450/mg de proteína (en regulador de fosfato de NaK 0.01 M + 1.15% de KCl), un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 3.3 mM, dehidrogenasa de glucosa-6Xosfato 0.4 U/ml, NADP 1.3 mM y MgCI2.6H2O 3.3 mM en regulador de prueba) y los compuestos en un volumen total de prueba de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C la reacción enzimática se inició con la adición de 150 µM del substrato con sonda fluorescente BFC en regulador de prueba. Después de unaJncubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se terminó después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se realizaron a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. En este experimento se incluyó quetoconazola (valor de IC50 = 3 X 10"8 M) como compuesto de referencia. La prueba para la proteína CYP2D6 comprende, por platina, 6 pmol de P450/mg de proteína (en regulador de fosfato de NaK 0.01 M + KCl al 1.15%), un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 0.41 mM, dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato 0.4 U/ml, NADP 0.0082 mM y MgCI2.6H2O 0.41 mM en regulador de prueba) y los compuestos en un volumen total de prueba de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C se inició la reacción enzimática con la adición de 3 µM del substrato AMMC con sonda fluorescente en regulador de prueba. Después de una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se realizaron a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. En este experimento se incluyó quinidina como compuesto de referencia (valor de IC50 <5 X 10"8 M). La prueba para la proteína CYP2C9 comprende, por platina, 15 pmol de P450/mg de proteína (en regulador de fosfato de NaK 0.01 M + KCl a 1.15%), un sistema generador de NADPH (Glucosa-6-fosfato 3.3 mM, dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato 04 U/ml, NADP 1.3 mM y MgCI2.6H2O 3.3 mM en regulador de prueba), y compuesto en un volumen total de prueba de 100 µl. Después de 5 minutos de preincubación a 37°C la reacción enzimática se inició con la adición de 200 µM del substrato MFC con sonda fluorescente en regulador de prueba. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se terminó después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. En este experimento se incluyó sulfafenazola como compuesto de referencia (valor de IC50 = 6.8 X 10"7 M). Para los propósitos de rastreo inicial, los compuestos se probaron a una concentración única fijada en 1 X 10"5 M. Para los compuestos activos, los experimentos se repitieron para establecer la curva completa de concentración-respuesta. Para cada experimento, se corrieron en paralelo controles (no contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (no contenía enzimas ni fármacos). Todos los compuestos se probaron por cuadruplicado. El valor en blanco se restó de todos los valores de controles y muestras. Para cada muestra, el valor medio de la actividad de P450 de la muestra (en unidades de fluorescencia relativa) se expresó como un porcentaje del valor medio de la actividad del P450 del control. El porcentaje de inhibición se expresó como 100% menos el valor medio de la actividad de P450 de la muestra. Cuando fue apropiado, se calcularon los valores de IC50 (concentración del fármaco que se necesita para reducir la actividad de P450 al 50% del control).
CUADRO F-3 listado de resultados de los compuestos que se probaron de acuerdo con los ejemplos C.1. a.. C.l.b, C.2, C.3.a. y C.3.b D. EJEMPLO DE COMPOSICIÓN Tabletas recubiertas con película Preparación del núcleo de la tableta Una mezcla de 100 g del compuesto de la fórmula (I), 570 g de lactosa y 200 g de fécula se mezclaron bien y se humectaron con una solución de 5 g de dodecil sulfato de sodio y 10 g de polivinil-pirrolidona en cerca de 200 ml de agua. La mezcla de polvo húmedo se tamizó, secó y se tamizó otra vez. Luego se agregaron 100 g de celulosa microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Todo se mezcló bien y se comprimió en tabletas, obteniéndose 10,000 tabletas, cada una conteniendo 10 mg de un compuesto de la fórmula (I).
Cubierta A una solución de 10 g de metil celulosa en 75 ml de metanol desnaturalizado se añadió una solución de 5 g de etil celulosa en 150 ml de diclorometano. Luego se agregaron 75 ml de diclorometano y 2.5 ml de 1 ,2,3-propanotriol y se fundieron 10 g de polietileno glicol y se disolvieron en 75 ml de diclorometano. Esta última solución se agregó a la anterior y luego se agregaron 2.5 g de octadenoato de magnesio, 5 g de polivinil-pirrolidona y 30 ml de suspensión concentrada de color y toda la mezcla se homogeneizó. Con la mezcla asi obtenida, se recubrieron los núcleos de las tabletas en un aparato de recubrimiento.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la fórmula (I), las formas ?/-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, donde: cada n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y cuando n es 0, entonces se quiere significar un enlace directo; cada m es un número entero con valor 1 ó 2; cada X es independientemente N o CH; cada Y es independientemente O, S, o NR4; donde cada R4 es hidrógeno, alquilo de d-6, alquiloxi de C?_6-alquilo de C?-6, cicloalquilo de C3-6, cicloalquilmetilo de C3-6, fenilalquilo de C-?-6, -C(=O)-CHR5R6 o -S(=O)2-N(CH3)2; donde cada R5 y R6 es independientemente hidrógeno, amino, alquilo de C?-6 o aminoalquilo de C1-6, y cuando Y es NR4 y R2 está en la oposición 7 del indolilo, entonces R2 y R4 juntos pueden formar el radical bivalente -(CH2)2- (a-1), o -(CH2)3- (a-2); R1 es hidrógeno, alquilo de Ci. 6, hidroxialquilo de C1-6, alquilsulfonilo de C1.6, alquilcarbonilo de Ci-ß o mono- o di(alquilo de C?-6)aminosulfonilo; R2 es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo de C1-6, ciano, alquenilo de C2-6, polihaloalquilo de C1-6, nitro, fenilo, alquilcarbonilo de C?-6, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilamino de C?-6, alquiloxi de C1-6 o mono- o di(alquilo de C?-6)amino; R3 es hidrógeno, alquilo de C1-6 o alquiloxi de C1-6; y cuando R2 y R3 están en átomos de carbono adyacentes, pueden formar el radical bivalente -O-CH2-O-.
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: cada n es un número entero con valor de 0 ó 1 ; cada R4 es hidrógeno, alquilo de C1-6, alquiloxi de C?-6alquilo de C?-6, cicloalquilo de C3-6 o fenilalquilo de C?-6; R1 es hidrógeno, alquilo de C?-6, hidroxialquilo de C?_6, alquilcarbonilo de C?_6 o alquilsulfonilo de C^; y R2 es hidrógeno, halo, alquilo de C?-6, ciano, nitro, polihaloalquilo de C?-6 o alquiloxi
3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque cada n es un número entero con valor 1; cada m es un número entero con valor 1 ; cada X es independientemente N; cada Y es independientemente NR4; cada R4 es alquilo de C?-6; R1 es hidrógeno; R2 es hidrógeno o halo; y R3 es hidrógeno.
4. El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 3, donde el compuesto es el compuesto No. 1 a el compuesto No. 30 el compuesto No. 39y el compuesto No. 50.
5. Una composición farmacéutica que comprende portadores farmacéuticamente aceptables y como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se mezclan íntimamente los portadores farmacéuticamente aceptables y un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado además porque se usa como medicamento.
8. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
9. Una combinación de un agente anticáncer y un inhibidor de HDAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10. Un procedimiento para preparar un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: a) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (II), donde Q es tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo, denominado aquí intermediario de la fórmula (ll-a), con un ácido apropiado, tal como por ejemplo, ácido trifluoroacético, para producir un ácido hidróxamico de la fórmula (I): b) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (II), donde Q es alquiloxicarbonilo de C?- , denominado aquí intermediario de la fórmula (II-c), con hidroxilamina, en presencia de una base y un solvente apropiado, con la producción de un ácido hidroxámico de la fórmula (I):
11. Un compuesto de la fórmula (II), las formas ?/-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, donde: n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y cuando n es 0, entonces se quiere significar un enlace directo; cada m es un número entero con valor 1 ó 2; cada X es independientemente N o CH; cada Y es independientemente O, S, o NR4; donde cada R4 es hidrógeno, alquilo de C?_6, alquíloxi de Ci-ßalquilo de C?-6, cicloalquilo de C3-6, cicloalquilmetilo de C3-6, fenilalquilo de C?.6, -C(=O)-CHR5R6 o -S(=O)2-N(CH3)2; donde cada R5 y R6 es independientemente hidrógeno, amino, alquilo de C?-6 o aminoalquilo de C1-6; y cuando Y es NR4 y R2 está en la posición 7 del indolilo, entonces R2 y R4 juntos pueden formar el radical bivalente -(CH2)2- (a-1), o -(CH )3- (a-2); R1 es hidrógeno, alquilo de C?_ 6, hidroxialquílo de C?-6, alquilsulfonilo de d-6, alquilcarbonilo de C?-6 o mono- o di(alquilo de C1-6)aminosulfonilo; R2 es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo de C1-6, ciano, alquenilo de C2-6, polihaloalquilo de C1-6, nitro, fenilo, alquilcarbonilo de C-?-6, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilamino de C1-6, alquiloxi de C?.6, o mono- o di(alquilo de C^amino; R3 es hidrógeno, alquilo de C1.6 o alquiloxi de cuando R2 y R3 están en átomos adyacentes de carbono, pueden formar el radical bivalente -O-CH2-O-; y Q es alquiloxicarbonilo de C-i. 2, hidroxicarbonilo o tetrahidropiraniloxi-aminocarbonilo.
12. Un procedimiento para preparar un compuesto de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado porque: a) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula (II), donde Q es hidroxicarbonilo, denominado aquí compuesto de la fórmula (ll-b), con un intermediario de la fórmula (III) en presencia de reactivos apropiados tales como monohidrocloruro de ?/'-(etilcarbonimidoil)-?/,?/-dimetil-1 ,3-propanodiamina (EDC) y 1-hidroxi-1H-benzotriazola (HOBT) con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-a): b) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (VI) con el carboxaldehído apropiado de la fórmula (V), donde t es un número entero con valor 0 ó 1 , y cuando t es 0, entonces se quiere significar un enlace directo, en presencia de un reactivo apropiado, con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-a): c) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula (II), donde Q es metilo- o etiloxicarbonilo- (alquilo de C?-2), denominado aquí compuesto de la fórmula (ll-c), con una solución acida o básica apropiada, con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-b): d) se hace reaccionar el éster de etilo del ácido carboxílico de la fórmula (IV) con el carboxaldehído apropiado de la fórmula (V), en presencia de un reactivo apropiado, con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-c): e) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (XIV) con el intermediario apropiado de la fórmula (XV), en presencia de un reactivo apropiado, en un solvente adecuado, con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-c): f) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (X) con un intermediario de la fórmula (XI) donde W es un grupo saliente apropiado tal como, por ejemplo, halo, por ejemplo flúor, cloro, bromo o yodo, o un radical sulfoniloxi tal como metilsulfoniloxi, con la formación de un compuesto de la fórmula (II- c), o g) se hace reaccionar un intermediario de la fórmula (XII) con un intermediario de la fórmula (XIII), donde W es un grupo saliente apropiado como se describió arriba, con la formación de un compuesto de la fórmula (ll-c):
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