CN1993353B - 作为组蛋白脱乙酰基酶新抑制剂的取代的吲哚基烷基氨基衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明包括式(I)具有组蛋白脱乙酰基酶抑制酶活性的新化合物，其中R¹、R²、R³、X和Y具有所述定义；它们制备、含它们的组合物和它们作为药物的用途。

Description

作为组蛋白脱乙酰基酶新抑制剂的取代的吲哚基烷基氨基衍生物

本发明涉及具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。还涉及它们的制备方法、含有它们的组合物以及它们在体外和体内抑制HDAC的用途和作为药物的用途，例如用作抑制诸如癌症和牛皮癣的增殖病症的药物。

已知细胞核组蛋白是负责调节基因转录和其它DNA模制过程(诸如复制、修复、重组和染色体分离)的组织的整合和动力成分。其用于转译后的修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化。

组蛋白脱乙酰基酶在此称为“HDAC”，是催化除去蛋白质赖氨酸残基上的乙酰基修饰的酶，包括核心核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4。HDAC与在此称为“HAT”的组蛋白转乙酰酶一起调节组蛋白乙酰化的水平。核小体组蛋白乙酰化的平衡在许多基因的转录中起重要作用。组蛋白的低乙酰化与凝聚染色质结构有关，导致基因转录的抑制，而乙酰化的组蛋白与更多染色质结构的打开和转录的活化有关。

已知在结构上相关的十一种HDAC炳将其分为两类。I类HDAC由HADC 1、2、3、8和11组成，而II类HADC由HDAC 4、5、6、7、9和10组成。第三类HDAC在结构上与I类和II类HDAC不相关。I/II类HDAC按照锌-依赖的机理起作用，而III类HDAC是NAD-依赖的。

除组蛋白之外，其它的蛋白质也是乙酰化的底物，特别是转录因子，诸如p53、GATA-1和E2F；核受体，诸如糖皮质激素受体、甲状腺受体、雌激素受体；和细胞-周期调节蛋白质，诸如pRb。乙酰化的蛋白质已经与蛋白质稳定相联，如p53稳定、辅因子的补充和增强的DNA结合。p53是肿瘤抑制基因，可根据许多应力信号(诸如DNA损伤DNA损伤)诱导细胞周期停滞或细胞程序死亡。对于p53诱导的细胞周期停滞，主要的靶标似乎是p21基因。除了被p53活化，已经通过p21与细胞周期蛋白/依赖细胞周期蛋白的激酶配合物的结合证明其导致细胞周期停滞在G1和G2相，在衰老期间向上调节，以及与增殖细胞核抗原相互作用。

HDAC抑制剂的研究指出其在细胞周期停滞、细胞分化、细胞程序死亡和转化的显型的反转中起重要作用。

例如，抑制剂Trichostatin A(TSA)导致细胞周期停滞在G1和G2相、恢复不同细胞系的转化的显型和诱导Friend白血病细胞的分化等。已经报道了TSA(和辛二酰基苯胺异羟肟酸SAHA)抑制细胞生长、诱导终末分化和阻止小鼠体内肿瘤的形成(Finnin等人，Nature，401：188-193，1999)。

还报道了Trichostatin A用于纤维化的治疗，例如肝脏纤维化和肝硬化。(Geerts等人，欧洲专利申请EP 0827742，1998年3月11日公开)。

HDAC抑制剂的药效基团由与HDAC的含锌活性位点相互作用的金属结合区、连接区和与活性点边缘上的残基相互作用的表面识别区或封端区组成。

还报道过HDAC的抑制剂诱导p21基因表达。通过染色质重制，然后乙酰化在p21启动子区域中的组蛋白H3和H4，促进了借助这些抑制剂的p21基因转录激活。这种p21的活化以不依赖p53的方式发生，因此HDAC抑制剂在具有突变的p53基因的细胞中起作用，突变的p53基因是许多肿瘤的检验标记。

此外，HDAC抑制剂可以具有间接的活性，诸如增加主体的免疫应答和抑制肿瘤的血管生成，因此可以抑制原发肿瘤的生长和阻碍转移(Mai等人，Medicinal Research Reviews，25：261-309)。

鉴于如上所述，HDAC抑制剂在细胞增殖疾病或病症(包括具有突变p53基因的肿瘤)的治疗中可能具有巨大的潜能。2003年8月14日公开的专利申请EP 1472216公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的双环异羟肟酸。

此外，在2003年9月18日公开的专利申请EP 1485099、EP 1485348、EP 1485353、EP 1485354、EP 1485364、EP 1485365、EP 1485370、EP 1485378中公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌嗪基嘧啶基异羟肟酸，而EP 1485365公开了R306465。

在2003年10月9日公开的专利申请EP 1492534公开了作为HDAC抑制剂的含有哌嗪连接基团的氨基甲酸化合物。

在2003年10月23日公开的专利申请EP 1495002公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌嗪基苯基苯甲酰胺化合物。

2004年1月29日公开的专利申请WO04/009536公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的衍生物，在芳基基团和异羟肟酸之间含有烷基连接基。

2004年2月12日公开的专利申请EP 1525199公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的(杂)芳基烯基取代的双环异羟肟酸。

2004年7月29日公开的专利申请WO04/063146公开了具有抗炎和抗肿瘤活性的N-羟基-苯甲酰胺衍生物的衍生物。

2004年7月29日公开的专利申请WO04/063169公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的芳基异羟肟酸衍生物。

2004年8月26日公开的专利申请WO04/072047公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吲哚、苯并咪唑和萘并咪唑。

2004年9月30日公开的专利申请WO04/082638公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的、连接到非芳香的杂环体系的异羟肟酸。

2004年10月28日公开的专利申请WO04/092115公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的异羟肟酸衍生物。

2005年3月31日公开的专利申请WO05/028447公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯并咪唑。

2005年4月7日公开的专利申请WO05/030704和WO05/030705公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯甲酰胺。

2005年5月6日公开了专利申请WO05/040101公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的酰基脲连接的和磺酰脲连接的异羟肟酸。

2005年5月6日公开的专利申请WO05/040161公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的联芳基连接的异羟肟酸。

本发明的化合物在结构上、药理学活性和/或药理学效价方面与先有技术不同。要解决的问题是提供具有高酶催化活性和细胞活性的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，起具有提高的生物利用度和/或体内效价。

本发明的新化合物解决了上述问题。本发明的化合物显示了出色的组蛋白脱乙酰基酶抑制酶催化活性和细胞活性。在细胞的内和体内水平，其均具有很高的p21基因活化能力。它们具有所希望的药物代谢动力学分布图和对P450酶的低亲合性，这降低了药物-药物相互作用的风险，并具有较宽的安全界限。

本发明的化合物的有益特性是代谢稳定性、溶解度和/或p21感应性能。更特别的是本发明的化合物在大鼠肝细胞内具有增长的半衰期、在水溶液中具有提高的溶解度/稳定性和/或在体内具有提高的p21启动子诱导性能。

本发明涉及式(I)化合物

其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中

每个n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；

每个m是整数1或2；

每个X独立地是N或CH；

每个Y独立地是O、S或NR⁴；其中每个R⁴是氢，C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_3-6环烷基甲基、苯基C_1-6烷基、-C(＝O)-CHR⁵R⁶或-S(＝O)₂-N(CH₃)₂；其中每个R⁵和R⁶独立地是氢、氨基、C_1-6烷基或氨基C_1-6烷基；和

当Y是NR⁴和R²是在吲哚基的7-位时，R²和R⁴可一起形成二价基团

-(CH₂)₂-    (a-1)或

-(CH₂)₃-    (a-2)

R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基或单或二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

R²是氢、羟基、氨基、卤代基、C_1-6烷基、氰基、C_2-6烯基、多卤代C_1-6烷基、硝基、苯基、C_1-6烷基羰基、羟基羰基、C_1-6烷基羰基氨基、C_1-6烷氧基或单或二(C_1-6烷基)氨基；

R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；和

当R²和R³在相邻碳原子上时，其可形成二价基团-O-CH₂-O-。

从取代基画入双环体系中的直线表示所述的键可以连接到双环体系中任何合适的环原子上。

术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂”用来表示能够与组蛋白脱乙酰基酶相互作用并抑制其活性、更具体地讲是抑制其酶活性的化合物。抑制组蛋白脱乙酰基酶酶活性意味着降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力。优选这样抑制是特定的，即，所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂在一定浓度下降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力，所述的浓度低于该抑制剂产生其它不相关生物效应的浓度。

在上述定义和在下文中所用的卤代是一般指氟代、氯代、溴代和碘代；C_1-2直链饱和烃基团具有1或2个碳原子，诸如例如甲基或乙基；C_1-6烷基是指C_1-2烷基和具有3-6个碳原子的直链或支链的饱和烃基，诸如例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、己基、2-甲基苯基等；和多卤代C_1-6烷基表示含有三个相同或不同卤代取代基，例如三氟甲基；C_2-6烯基表示含一个双键的直链和支链烃基并具有2到6个碳原子，诸如例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-丁烯基等；C_3-6环烷基包括具有3到6个碳的环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基等。

药学上可接受的加成盐包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。在上文提到的药学上可接受的酸加成盐是指包括式(I)化合物能形成的治疗活性的无毒的酸加成盐形式。具有碱性的式(I)化合物可以通过将所述碱形式用合适的酸处理转化为它们的药学上可接受的酸加成盐。合适的酸包括例如无机酸，如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸；或有机酸，诸如例如乙酸、三氟醋酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。具有酸性的式(I)化合物通过将所述酸形式用合适的有机或无机碱处理可转化为它们药学上可接受的碱加成盐。合适的碱盐形式包括例如铵盐、碱金属盐和碱土碱金属盐(例如锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)、与有机碱形成的盐(例如苄星青霉素盐、N-甲基-D-葡糖胺盐、hydrabamine盐)以及与诸如精氨酸、赖氨酸等氨基酸形成的盐。

术语“酸或碱加成盐”还包括式(I)化合物能形成的水合物和溶剂加成形式。这类形式的实例例如是水合物、醇化物等。

这里使用的术语“式(I)化合物的立体化学异构形式”定义为所有式(I)化合物可能具有的、由相同原子以相同键序组成但是具有不同的不可互换的三维结构的可能的化合物。除非另作说明或指示，化合物的化学命名包括所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构形式的混合物。所述混合物可能含所述化合物基本分子结构的所有非对应异构体和/或对映异构体。式(I)化合物的所有立体化学异构形式的纯净形式或彼此混合形式均包括在本发明的范围内。

式(I)化合物的N-氧化物形式包括那些式(I)化合物，其中一个或一些氮原子被氧化成所谓的N-氧化物，特别是其中哌啶基、哌嗪基或哒嗪基的一个或多个氮被氧化的那些N-氧化物。

一些式(I)化合物可能还以其互变异构形式存在。尽管这类形式未在上式中明确指出，但是也包括在本发明范围内。

在下文中无论何时使用，术语“式(I)化合物”还包括药学上可接受的加成盐和所有的立体异构形成。

这里使用的术语“组蛋白脱乙酰基酶”和“HDAC”用于表示从在组蛋白N-末端的赖氨酸残基的ε-氨基除去乙酰基的一系列酶的任何一种。除非上下文另有说明，术语″组蛋白″用于表示来自任何物种的任何组蛋白蛋白质，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白质或基因产品非限制性地包括HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。所述组蛋白脱乙酰基酶还可来自原生动物或真菌来源。

第一组重要化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：

a)每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_3-6环烷基甲基、-C(＝O)-CHR⁵R⁶或-S(＝O)₂-N(CH₃)₂；

b)R¹是氢、或单或二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；或

c)R³是氢。

第二组重要化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：

a)每个n是0或1的整数；

b)每个X独立地是N；

c)每个R⁴是氢或C_1-6烷基；

d)R¹是氢、C_1-6烷基或羟基C_1-6烷基；或e)R²是氢、卤代、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

第三组重要化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：

a)每个n是0或1的整数；

b)每个R⁴是氢、C_3-6环烷基或苯基C_1-6烷基；

c)R¹是氢，或

d)R²是氢、卤代、C_1-6烷基、氰基、硝基或C_1-6烷氧基。

第四组重要化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：

a)每个n是0或1的整数；

b)每个m是整数1；

c)每个R⁴是氢，或

c)R¹是氢、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基或

d)R²是氢、卤代、氰基、硝基或C_1-6烷氧基；或

e)R³是C_1-6烷氧基；或

f)当R²和R³在相邻碳原子上时，其可形成二价基团-O-CH₂-O-。

第五组重要化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：

a)每个n是0或1的整数；

b)每个m是整数1；

c)每个X独立地是N

d)每个Y独立地是NR⁴；

e)每个R⁴是C_1-6烷基；

f)R¹是氢；

g)R²是氢或卤代；或

h)R³是氢。

一组优选的化合物包括那些式(I)化合物，其中每个n是整数0或1；每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_3-6环烷基或苯基C_1-6烷基；R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基或C_1-6烷基磺酰基；和R²是氢、卤代、C_1-6烷基、氰基、硝基、多卤代C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

一组优选的化合物包括那些式(I)化合物，其中每个n是整数1；每个m是整数1；每个X独立地是N；每个Y独立地是NR⁴；每个R⁴是C_1-6烷基；R¹是氢；R²是氢或卤代；和R³是氢。

最优选化合物是化合物No.1a、化合物No.30、化合物No.39和化合物No.50。

式(I)和(II)化合物、它们的药学上可接受的盐和N-氧化物及其立体化学异构形式可用常规方法制备。原料和一些中间体是已知化合物，可从市场购买或可根据本领域公知的常规反应方法制备，或如专利申请EP 1485099、EP 1485348、EP 1485353、EP 1485354、EP1485364、EP 1485365、EP 1485370和EP 1485378所述制备。一些制备方法将在下文中更详细地描述。用于得到最终式(I)化合物的其它方法在实施例中描述。

a)式(I)的异羟肟酸可以通过Q是四氢吡喃基氧基氨基羰基的式(II)中间体(在此称为式(II-a)中间体)与诸如例如三氟乙酸的合适的酸反应制备。所述反应在合适的溶剂中进行，诸如例如甲醇或二氯甲烷。

b)或者，式(I)的异羟肟酸可以通过其中Q是C_1-2烷氧基羰基的式(II)中间体(在此称为中间体式(II-c))与羟胺在诸如例如氢氧化钠的碱存在下反应制备。所述反应在合适的溶剂中进行，诸如例如甲醇或二氯甲烷。

式(I)化合物还可经本领域已知的反应或官能团变换彼此转化。在上文已经描述了许多这样的变换。其它实例是羧酸酯水解形成相应的羧酸或醇；酰胺水解形成相应的羧酸或胺；腈水解形成相应的酰胺；用本领域已知的重氮化反应然后用氢置换所述重氮基可将在咪唑或苯基上的氨基替换为氢。醇可以转化为酯和醚；伯胺可以转化为仲胺或叔胺；双键可以氢化成相应的单键；苯基上的碘代基可通过在合适的钯催化剂存在下插入一氧化碳转化为酯基。

本发明还涉及式(II)中间体

其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和其立体化学异构形式，其中

每个n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；

每个m是整数1或2；

每个X独立地是N或CH；

每个Y独立地是O、S或NR⁴；其中每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_3-6环烷基甲基、苯基C_1-6烷基、-C(＝O)-CHR⁵R⁶或-S(＝O)₂-N(CH₃)₂；

其中每个R⁵和R⁶独立地是氢、氨基、C_1-6烷基或氨基C_1-6烷基；和

当Y是NR⁴和R²是在吲哚基的7-位时，R²和R⁴可一起形成二价基团

-(CH₂)₂-    (a-1)或

-(CH₂)₃-    (a-2)；

R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基或单或二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

R²是氢、羟基、氨基、卤代、C_1-6烷基、氰基、C_2-6烯基、多卤代C_1-6烷基、硝基、苯基、

C_1-6烷基羰基、羟基羰基、C_1-6烷基羰基氨基、C_1-6烷氧基或单或二(C_1-6烷基)氨基；

R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；

当R²和R³在相邻的碳原子上时，它们可以形成二价基-O-CH₂-O-；和

Q是C_1-2烷氧基羰基、羟基羰基或四氢吡喃基氧基氨基羰基。

根据对于式(I)化合物的基团定义，可定义式(II)化合物的重要的、优选的、更优选的和最优选的组。

a)式(II-a)中间体可通过式(III)中间体与其中Q是羟基羰基的式(II)的中间体(在此称为式(II-b)中间体)在合适的试剂存在下反应制备，所述合适的试剂诸如N′-(ethylcarbonimidoyl)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一氢氯化物(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)。所述反应可以在诸如三乙胺的碱存在下、在诸如二氯甲烷和四氢呋喃的混合物的合适溶剂中进行。

b)式(II-a)中间体还可通过式(VI)中间体与合适的式(V)醛在诸如硼氢化钠的合适试剂存在下在诸如二氯乙烷或甲醇的合适溶剂中反应制备，式(V)中t是整数0或1，并且当t是0时表示直接键。

c)式(II-b)中间体可以通过其中Q是甲基-或乙氧基羰基(C_1-2烷基)的式(II)中间体(在此称为式(II-c)中间体)与例如盐酸的合适的酸性溶液或与溴化氢或氢氧化钠的碱性溶液在合适的溶剂中反应制备，合适的溶剂例如是醇，诸如乙醇或丙醇。

d)式(II-c)中间体可以通过式(IV)羧酸乙酯与合适的式(V)醛在合适的试剂存在下在合适的溶剂中反应制备，合适的试剂诸如是硼氢化钠，例如四硼氢化钠，合适的溶剂诸如是醇，例如甲醇。

e)以相同的方法，式(II-c)中间体可以通过式(XIV)中间体与合适的式(XV)中间体在合适的试剂存在下在合适的溶剂中反应制备，合适的试剂诸如是硼氢化钠，例如四硼氢化钠，合适的溶剂诸如是醇，例如甲醇。

f)式(II-c)中间体还可以通过式(X)中间体与式(XI)中间体反应制备，式(XI)中的W是合适的离去基团，诸如例如卤代，如氟代、氯代、溴代或碘代，或是磺酰氧基基团，如甲基磺酰氧基、4-甲基苯磺酰氧基等。所述反应可以在反应惰性的溶剂中进行，例如醇，如甲醇、乙醇、2-甲氧基-乙醇、丙醇、丁醇等；醚，例如4、4-二恶烷、1，1′-氧基二丙烷等。酮，例如4-甲基-2-戊酮；或N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、乙腈等。可加入合适的碱，例如碱金属或土碱金属碳酸酯或氢碳酸酯，例如三乙胺或碳酸钠，用于捕获反应期间释放出的酸。可加入少量合适的金属碘化物，例如碘化钠或碘化钾，促进所述反应。搅拌可提高反应的速度。所述反应可方便地在室温和反应混合物回流温度的温度范围进行，如果需要，反应可在加压下进行。

g)用相同的方法，式(II-c)中间体可以通过式(XII)中间体与其中W是如上所述合适的离去基团的式(XIII)中间体反应制备。

式(VI)中间体可以通过式(VII)中间体与哌啶在例如二氯甲烷的合适的溶剂中反应制备。

式(VII)中间体可以通过式(VIII)中间体与式(III)中间体在合适的试剂存在下反应制备，所述合适的试剂诸如是N′-(ethylcarbonimidoyl)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一氢氯化物(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)。所述反应可以在诸如三乙胺的碱存在下、在诸如二氯甲烷和四氢呋喃的混合物的合适溶剂中进行。

式(VIII)中间体的制备可以通过式(IX)中间体与其中R¹是氢的式(IV)中间体(在此称为式(IV-a)中间体)在氢氧化钠存在下在诸如四氢呋喃的合适的溶剂中反应，然后用盐酸中和，并加入碳酸钠。

式(I)化合物和一些中间体可能在其结构中具有至少一个立体中心。该立体中心可以R或S构行存在。

在上述方法中制备的式(I)化合物通常是对映异构体的外消旋混合物，所述对映异构体可用本领域已知的拆分方法彼此分离。式(I)的外消旋化合物可通过与合适的手性酸反应转化为相应的非对映体盐形式。随后分离所述非对映体盐形式，例如通过选择结晶或分级结晶，然后用碱释出对映异构体。分离式(I)化合物对映异构体形式的另一种方法涉及用手性固定相的液相色谱。所述纯立体化学异构形式还可从合适原料的相应纯立体化学异构形式获得，条件是反应立体选择性地发生。如果需要特定的立体异构体，优选通过立体有择的制备方法合成所述化合物。这些方法使用对映异构纯的原料是有利的。

式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式具有重要的药理学特性，因为它们具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制效果。

本发明提供了一种通过有效量的本发明化合物的给药抑制细胞(包括转化的细胞)异常生长的方法。细胞的异常生长指的是不受正常调节机制(例如接触抑制丧失)支配的细胞生长。这包括肿瘤生长的抑制，通过导致癌细胞生长停滞、终末分化和/或细胞程序死亡而直接抑制，以及抑制肿瘤的新血管形成而间接抑制。

本发明还提供一种通过有效量的本发明化合物对受治疗者的给药抑制肿瘤生长的方法，受治疗者例如是需要这类治疗的哺乳动物(特别是人)。特别是，本发明提供了一种通过有效量的本发明化合物的给药抑制肿瘤生长的方法。可抑制的肿瘤非限制性的例子是肺癌(例如腺癌，并且包括非小细胞肺癌)、胰癌(例如，胰腺癌，诸如例如外分泌胰腺的癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，诸如例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、前列腺癌(包括前期病变)、淋巴系统的造血肿瘤(例如，急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏肿瘤)、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、甲状腺小囊癌、脊髓发育不良综合症(MDS)、间质源性肿瘤(例如，纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如，角化棘皮瘤)、乳房癌(例如，前期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。

根据本发明的化合物可以用于其它的治疗目的，例如：

a)在用于治疗癌症的对肿瘤放射照射之前、期间或之后通过根据本发明化合物的给药促进肿瘤对放射疗法的敏感性；

b)治疗关节病和骨病理学病症，如类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年关节炎、痛风、多发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮；

c)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖病症、动脉粥样硬化和再狭窄；

d)治疗炎症和与皮肤有关的病症，如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、过敏性鼻炎、graft vs.host疾病、结膜炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、贝切特氏病、移植排斥反应、uticaria、过敏性皮炎、斑秃、硬皮病、皮疹、湿疹、皮肌炎、痤疮、糖尿病、全身性红斑狼疮、川崎病、多发性硬化、肺气肿、囊性纤维化和慢性支气管炎；

e)治疗子宫内膜异位、子宫的纤维化、功能性月经失调和子宫内膜增生；

f)治疗眼的血管化，包括视网膜的血管化损伤(vasculopathyaffecting retinal)和脉络膜血管症(choroidal vessels)；

g)治疗心脏功能紊乱；

h)抑制免疫抑制症状，如治疗艾滋病病毒感染；

i)治疗肾功能紊乱；

j)抑制内分泌异常；

k)抑制葡糖异生作用的功能紊乱；

l)治疗神经病，如帕金森氏症，或治疗导致认知异常的神经病，例如阿尔茨海默氏病或与神经元疾病相关的polyglutamine；

m)治疗精神错乱，例如精神分裂症、双极异常、抑郁症、焦虑和精神异常；

n)抑制神经肌肉的病变，例如肌萎缩性侧索硬化；

o)治疗脊髓性肌萎缩；

p)治疗其它的受基因加强表达治疗作用的病症；

q)加强基因疗法；

r)抑制脂肪生成；

s)治疗寄生虫病，如疟疾。

因此，本发明公开了式(I)化合物作为药物的用途，以及这些式(I)化合物生产治疗一种或多种上述病症的药物的用途。

式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和其立体异构形式具有重要的诊断特性，因为它们可用于测定或确定生物样品中的HDAC，包括检测或测定在标记化合物和HDAC之间配合物的形成。

所述检测或确定方法可以使用用标记试剂标记的的化合物，标记试剂例如是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³H和¹⁴C。酶通常通过合适底物的共轭接着催化可检测反应得以可测。酶的实例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化酶。发光物质包括例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、莹光素、水母发光蛋白和荧光素酶。

生物样品可以定义为体组织或体液。体液的例子是脑脊液、血液、血浆、血清、尿、痰液、唾液等。

考虑到本发明化合物有用的药理学特性，其可配制到多种药物形式中用于给药。为了制备本发明的药物组合物，有效量特定的化合物以碱或酸加成盐的形式作为活性成分与药学上可接受的载体完全混合，载体可以采用多种形式，取决于希望给药的制剂的形式。这些药物组合物理想地是适合的单元剂型，优选用于口服、直肠给药、经皮给药或肠道外注射。例如，在口服剂型组合物的制备中，可使用任何常用的药物介质，诸如，例如在口服液体药剂的情况下，例如悬浮液、糖浆剂、酏剂和溶液，使用水、二醇、油、醇等；在粉末、丸、胶囊和片的情况下，使用固体载体，如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、结合剂、崩解剂等。

由于给药容易，片剂和胶囊是最有利的口服单位剂型，在这样的情况下，显然使用的是固体药物载体。对于肠道外给药的组合物，虽然可以包括其它成分，例如助溶成分，但是载体通常含有无菌水，至少占大部分。例如，可制备可注射的溶液，其中载体包括生理盐水、葡萄糖溶液或生理盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可制备可注射的悬浮液，在这样的情况下，可使用合适的液体载体、助悬剂等。在适用于经皮给药的组合物中，载体任选含有渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选与比例较小的任何性质的合适添加剂结合，添加剂对皮肤不产生显著的有害影响。所述添加剂可促进对皮肤的给药和/或有助于制备所需组合物。这些组合物可以多种方式给药，例如作为透过皮肤起作用的贴片、作为滴剂(spot-on)或作为软膏。

以剂量单元形式配制上述药物组合物对于方便给药和用量的一致性是特别有益的。在说明书和权利要求中所用的单位剂型指的是物理上地不连续的、合适作为单位剂量的单位，每个单位含有预定量的活性成分，适于产生所需的治疗效果，并与需要的药物载体结合。这样的单位剂型的例子是片剂(包括划线片剂或糖衣片剂)、胶囊、丸、粉剂包、扁囊剂、可注射的溶液或悬浮液、茶匙剂、汤匙剂等，及其分隔开的多重剂量组合。从在下文中提供的测试结果，本领域技术人员可以容易地确定有效量。通常，治疗有效量可以从0.005毫克/公斤体重到100毫克/公斤体重，特别是从0.005毫克/公斤体重到10毫克/公斤体重。在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔给药可能是适当的。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有含0.5-500毫克、特别是10-500毫克的活性成分。

作为本发明的另一个方面，提出了HDAC-抑制剂与另外的抗癌剂结合，特别是用作药物，更准确地说是在癌症或相关疾病的治疗中。

对于上述病症的治疗，本发明的化合物可有利地与一种或多种其它药剂联合使用，更具体地讲是与其它的抗癌剂联合使用。抗癌症剂的实例是：

-铂配位化合物，例如顺氯氨铂、卡铂(carboplatin)或草酸铂(oxalyplatin)；

-紫杉烷化合物，如紫杉醇(paclitaxel)或docetaxel；

-拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物，例如irinotecan或topotecan；

-拓扑异构酶II抑制剂，如抗肿瘤鬼臼霉素衍生物，例如鬼臼亚乙苷或表鬼臼毒噻吩糖苷；

-抗肿瘤长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱或vinorelbine；

-抗肿瘤核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶、gemcitabine或capecitabine；

-烷基化剂，如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、亚硝脲氮芥或环己亚硝脲；

-抗肿瘤蒽环素(anthracycline)衍生物，例如道诺红菌素、阿霉素(doxorubicin)、idarubicin或米托蒽醌；

-HER²抗体，例如trastuzumab；

-雌激素受体拮抗剂或选择性的雌激素受体调节剂，例如三苯氧胺、toremifene、droloxifene、faslodex或raloxifene；

-芳环转化酶(aromatase)抑制剂，如exemestane、anastrozole、letrazole和vorozole；

-分化剂，如类视黄醇、维生素D和维甲酸代谢作用阻滞剂(RAMBA)，例如accutane；

-DNA转甲基酶抑制剂，例如氮胞苷；

-激酶抑制剂，如flavoperidol、imatinib甲磺酸盐或gefitinib；

-法尼基转化酶(farnesyltransferase)抑制剂；

-其它的HDAC抑制剂；

-泛素-蛋白酶体途径抑制剂，例如Velcade；或-yondelis。

在此所用的术语″铂配位化合物″表示任何任何抑制肿瘤细胞生长的铂配位化合物，其提供离子形式的铂。

术语“紫杉烷化合物”表示具有紫杉烷环系的一类化合物，其与紫杉属(Taxus)某些树种的萃取物相关或由所述萃取物衍生。

术语“拓扑异构酶抑制剂”用于表示能够改变真核细胞内DNA拓扑结构的酶。它们对于重要的细胞功能和细胞增殖很关键。在真核细胞中有两种类型的拓扑异构酶，即，I型和II型。拓扑异构酶I是大约100,000分子量的单体酶。所述酶与DNA结合并引入一个暂时性单链缺口，解开双螺旋(或使其解开)，然后经缺口再次封闭，之后从DNA链上分离。拓扑异构酶II具有类似的作用机理，包括引入DNA链的缺口或形成自由基。

术语“喜树碱化合物”用于表示与母体喜树碱化合物相关或由其衍生的化合物，母体喜树碱化合物是从中国树种Camptothecinacuminata和印度树种Nothapodytes foetida获得的不溶于水的生物碱。

术语“鬼臼霉素化合物”用于表示与母体鬼臼霉素有关或由其衍生的化合物，鬼臼霉素萃取自曼德拉草植物(mandrake)。

术语“抗肿瘤长春花生物碱”用于表示与长春花植物(Vincarosea)的萃取物有关或由其衍生的化合物。

术语“烷基化剂”包括不同类的化学试剂，其具有共同的特性，即，其具有在生理条件下给生物学生命大分子(诸如DNA)提供烷基的能力。对于大多数更重要的试剂，诸如氮芥类和亚硝基脲类，在复杂的降解反应之后在体内生成活性的烷基化片断，其中一些降解反应是酶催化的。烷基化剂最重要的药理作用是干扰涉及细胞增殖基本进程，特别DNA合成和细胞分裂。烷基化剂能够干扰迅速增殖的组织中DNA功能和完整性，这提供为其治疗应用和其许多的毒性提供了基础。

术语“抗肿瘤蒽环素衍生物”包括从真菌Strep.peuticus var.caesius获得的抗生素及其衍生物，其特征在于具有四环素环结构，通过糖苷键连接一个特殊的糖：daunosamine。

已经指出在原发性乳房癌中人表皮生长因子受体2蛋白质(HER 2)的扩增与某些患者的不良临床预后结果有关。Trastuzumab是一种高度纯化重组DNA-衍生的拟人化(humanized)单克隆IgG1-k抗体，其高亲合性和高特异性地与HER2受体的胞外域结合。

许多乳腺癌具有雌激素受体，雌激素可促进这些肿瘤的生长。术语“雌激素受体拮抗剂”和“选择性雌激素受体调节剂”用来表示与雌激素受体(ER)结合的雌二醇的竞争性抑制物。选择性的雌激素受体调节剂与ER结合时，导致受体的三维形状改变，调节其与雌激素效应元件(ERE)在DNA上的结合。

在绝经后妇女中，循环的雌激素的主要来源是肾上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睾丸激素)在周围组织中通过aromatase酶转化为雌激素(雌甾酮和雌二醇)。通过aromatase抑制或钝化导致雌激素损失对于一些患有激素依赖性乳腺癌的患者是有效的和选择性的治疗。

在此使用的术语“抗雌激素剂”不但包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括如上所述的aromatase抑制剂。

术语“分化剂“包括可以多种方式抑制细胞增殖和诱导分化的化合物。已知在多种正常和恶性细胞类型的生长调节和分化中，维生素D和类视黄醇起了重要的作用。维甲酸代谢阻滞剂(RAMBA′s)通过抑制维甲酸的细胞色素P450-调节的分解代谢提高内源性维甲酸的水平。

DNA甲基化变化属于人类肿瘤形成中最常见的异常。在选择的基因的启动子中，高甲基化通常与所涉及基因的钝化有关。术语“DNA甲基转移酶抑制剂”用来表示通过DNA转甲基酶的药理学抑制和肿瘤抑制基因表达的再活化起作用的化合物。

术语“激酶抑制剂”包括激酶的有效抑制剂，起涉及细胞周期发展和细胞程序死亡(apoptosis)。

术语“法尼基转移酶抑制剂”用来表示被设计用于阻止Ras和其它细胞内蛋白质的法尼基化的化合物。它们已经显示出对恶性细胞增殖和存活的作用。

术语“其它的HDAC抑制剂”非限制性的包括：

-羧酸酯，例如丁酸酯、肉桂酸、4-甲基丁酸酯或二丙基戊酸；

-异羟肟酸，例如辛二酰基苯胺异羟肟酸(SAHA)、含哌嗪的SAHA类似物、联芳基异羟肟酸A-161906及其咔唑基醚类似物、四氢吡啶类似物和四氢萘酮类似物、双环芳基N-羟基羧酰胺、pyroxamide、CG-1521、PXD-101、磺酰胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、trichostatin A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、与scriptaid相关的三环分子、间-羧基肉桂酸二异羟肟酸(CBHA)、CBHA状异羟肟酸、trapoxin-异羟肟酸类似物、R306465和相关的苯甲酰基异羟肟酸和杂芳基异羟肟酸、氨基辛二酸酯和丙二酰基二酰胺；

-环状四肽，例如trapoxin、apidicin、depsipeptide、spiruchostatin-相关的化合物、RedFK-228、含sulfhydryl的环状四肽(SCOPs)、含异羟肟酸的环状四肽(CHAPs)、TAN-174s和azumamides；

-苯甲酰胺，例如MS-275或CI-994，或

-depudecin。

术语“泛素-蛋白酶体通道抑制剂”用于表示抑制蛋白酶体内细胞蛋白质(包括细胞周期调节蛋白质)的靶标破坏的化合物。

为了治疗癌症，根据本发明的化合物可与放射同时使用，对如上所述的患者给药。放射的意思是指电离辐射，并且特别是伽马辐射，尤其是通过直线加速器或通过现在通用的放射性核素发射的射线。通过放射性核素对肿瘤辐照可以是外部的或内部的。

本发明还涉及抗癌剂和本发明的HDAC抑制剂的根据本发明的组合物。

本发明还涉及根据本发明的组合物，其用于医药治疗，例如抑制肿瘤细胞的生长。

本发明还涉及根据本发明的组合物，其用于抑制肿瘤细胞的生长。

本发明还涉及抑制受治疗的人体内肿瘤细胞生长的方法，其包括给予受治疗者有效量根据本发明的组合物。

本发明进一步提供了一种抑制细胞异常生长的方法，包括通过给予有效量本发明组合物转化细胞。

其它的药剂和HDAC抑制剂可以同时(例如，作单独的或整体的组合物方式)给药或以任一顺序相继给药。就后一种情况而言，两种化合物可在一个周期那足以保证实现有益效果或协同效应的量和方式给药。应理解到优选的给药方法和组合物各个成分的各自剂量和状态取决于所给药的特定其它药剂和HDAC抑制剂、它们的给药途径、所治疗的特定肿瘤和被治疗的特定主体。最恰当给药方法和剂量以及状态可容易地由本领域技术人员用常规方法并考虑在此所列出的信息确定。

铂配位化合物有利地以每平方米体表面积1-500毫克的剂量给药，例如50-400mg/m²，特别地，每个疗程顺氯氨铂给药的剂量为约75mg/m²，对于carboplatin，给药剂量为约300mg/m²。

紫杉烷化合物有利地以每平方米体表面积50-400毫克的剂量给药，例如75-250mg/m²，特别地，每个疗程紫杉醇给药的剂量为约175-250mg/m²，对于docetaxel，给药剂量为约75-150mg/m²。

喜树碱化合物有利地以每平方米体表面积0.1-400毫克的剂量给药，例如1-300mg/m²，特别地，每个疗程irinotecan给药的剂量为约100-350mg/m²，对于topotecan，给药剂量为约1-2mg/m²。

抗肿瘤鬼臼霉素衍生物有利地以每平方米体表面积30-300毫克的剂量给药，例如50-250mg/m²，特别地，每个疗程鬼臼亚乙苷给药的剂量为约35-100mg/m²，对于表鬼臼毒噻吩糖苷，给药剂量为约50-250mg/m²。

抗肿瘤长春花生物碱有利地以每平方米体表面积2-30毫克的剂量给药，特别地，每个疗程长春花碱给药的剂量为约3-12mg/m²，对于长春新碱，给药的剂量为约1-2mg/m²，对于vinorelbine，给药剂量为约10-30mg/m²。

抗肿瘤核苷衍生物有利地以每平方米体表面积200-2500毫克的剂量给药，例如700-1500mg/m²，特别地，每个疗程5-氟尿嘧啶给药的剂量为200-500mg/m²，对于gemcitabine，给药的剂量为约800-1200mg/m²，对于capecitabine，给药剂量为约1000-2500mg/m²。

烷基化剂，如氮芥子气或亚硝基脲，有利地以每平方米体表面积100-500毫克的剂量给药，例如120-200mg/m²，特别地，每个疗程环磷酰胺给药的剂量为约100-500mg/m²，对于苯丁酸氮芥，给药的剂量为约0.1-0.2mg/kg，对于亚硝脲氮芥，给药剂量为约150-200mg/m²，对于环己亚硝脲，给药的剂量为约100-150mg/m²。

抗肿瘤蒽环素衍生物有利地以每平方米体表面积10-75毫克的剂量给药，例如15-60mg/m²，特别地，每个疗程阿霉素给药的剂量为40-75mg/m²，对于道诺红菌素，给药的剂量为约25-45mg/m²，对于idarubicin，给药剂量为约10-15mg/m²。

trastuzumab有利地以每平方米体表面积1-5毫克的剂量给药，特别是每个疗程2-4mg/m²。

根据特定的药剂和被治疗的症状，抗雌激素药剂有利地以每天约1-100毫克的剂量给药。他莫昔芬(Tamoxifen)有利地以5-50毫克的剂量口服给药，优选10-20毫克每天两次，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗效果。Toremifene有利地以约60毫克的剂量一天一次经口给药，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗效果。Anastrozole有利地以约1毫克的剂量一天一次经口给药。Droloxifene有利地以约20-100mg的剂量一天一次经口给药。Raloxifene有利地以约60毫克的剂量一天一次经口给药。Exemestane有利地以约25毫克的剂量一天一次经口给药。

这些剂量可以每疗程例如一次、两次或多次给药，其可例如每隔7天、14天、21天或28天重复。

考虑到本发明组合物有用的药理学特性，所述组合物的成分，即，另一药剂和所述HDAC抑制剂处于给药目的可配制城多种药物形式。所述成分可在单独的药物组合物中配制，或配制城含有这两种成分的整体药物组合物。

本发明因此还涉及药物组合物，其含有与一种或多种药物载体在一起的另一药剂和所述的HDAC抑制剂。本发明还涉及药物组合物形式的根据本发明的组合物，其含有与一种或多种药物载体在一起的抗癌剂和根据本发明的HDAC抑制剂。

本发明进一步涉及根据本发明的组合物在生产抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。

本发明进一步涉及一种产品，其含有作为第一活性成分的根据本发明的HDAC抑制剂和作为第二活性成分的抗癌剂，所述产品为结合的制剂，用于同时、单独或相继用于遭受癌症困扰的患者的治疗。

实验部分

提供下列实施例用于具体说明。在下文中，″DCM″定义为二氯甲烷、″DIPE″定义为二异丙醚、″DMA″定义为N，N-二甲基乙酰胺、″DMSO″定义为二甲亚砜、″EDC″定义为N-(ethylcarbonimidoyl)-N，N-二甲基1，3-丙二胺一氢氯化物、″EtOAc″定义为乙酸乙酯、″EtOH″″定义为乙醇、″HOBt″定义为1-羟基-1H-苯并三唑、″MeOH″定义为甲醇、″TFA″定义为三氟乙酸和″THF″定义为四氢呋喃。

A.中间体化合物的制备

实施例A1

a)中间体1的制备

2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0114mol)、1-甲基-1H-吲哚-3-醛(0.017mol)和MgSO₄(0.5g)在甲醇(80ml)中的混合物搅拌并回流15小时，然后冷却至室温。分批加入四氢硼酸钠(0.018mol)。混合物在室温下搅拌5小时，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(6.6g)通过柱色谱在硅胶上(15-40μm)提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH94/6/0.5)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到4.3g(90％)的中间体1。

b)中间体2的制备

中间体1(0.0037mol)和氢氧化钠(0.0074mol)在EtOH(60ml)中的混合物在50摄氏度搅拌15小时，然后冷却至室温，蒸发溶剂直到干燥，得到1.5g(100％)中间体2。

c)中间体3的制备

在室温下向中间体2(0.005mol)在DCM(100ml)和THF(100ml)中的混合物中在氮气流下加入EDC(0.0075mol)，然后加入HOBt(0.0075mol)，再加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.015mol)。混合物在40摄氏度搅拌4小时，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(4g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5)。收集纯馏分，蒸发溶剂得到1g(42％)的中间体3。馏分(0.051g)从DIPE结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.03g中间体3，熔点70摄氏度。

实施例A2

a)中间体4的制备

2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0072mol)在THF(40ml)和1N的氢氧化钠(40ml)中在室温下搅拌过夜。加入1N的盐酸(40ml)。混合物搅拌10分钟。加入碳酸钠(0.0216mol)。搅拌混合物10分钟。分批加入1-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧化]-2，5-吡咯烷二酮(0.0072mol)。混合物在室温下搅拌6小时，然后冷却至0摄氏度，用盐酸酸化。过滤沉淀物，用乙醚洗涤并干燥，得到4.1g(100％)的中间体4。

b)中间体5的制备

在室温下，向中间体4(0.0068mol)在DCM/THF(200ml)中的混合物中在氮气流下加入三乙胺(0.02mol)、EDC(0.0082mol)和HOBt(0.0082mol)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0082mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。用10％的NaHCO₃洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(4g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到3.4g(89％)的中间体5。

c)中间体6的制备

中间体5(0.0355mol)和哌啶(0.089mol)在DCM(400ml)中的混合物在35摄氏度搅拌72小时。蒸发溶剂。残余物通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 80/20/2)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到6.7g(56％)。残余物的一部分(0.79g)从乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.62g的中间体6，熔点129摄氏度。

d)中间体7的制备

中间体6(0.0009mol)和5-氯-1H-吲哚-3-醛(0.0012mol)在1，2-二氯乙烷(30ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。分批加入三(acetato-α-O)氢硼酸(1-)钠(0.0013mol)。混合物在室温下搅拌4小时，倾入水/3N的NaOH中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.5g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯，(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 93/7/0.5)。收集两个馏分，蒸发溶剂，得到0.07g(16％)的中间体7。

实施例A3

a)中间体8的制备

将2-(甲磺酰基)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.094mol)在乙腈(40ml)中的溶液在10摄氏度在氮气流下加入4-哌啶甲醇(0.086mol)和碳酸钾(0.172mol)在乙腈(200ml)中的悬浮液中。混合物温热到室温，然后搅拌4小时，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(23g)从乙腈/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到7.8g(34％)的中间体8。蒸发母液层。残余物(17g)通过柱色谱在硅胶(20-45μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到4.6g(20％)。

b)中间体9的制备

在0摄氏度，向中间体8(0.0189mol)在DCM(80ml)中的溶液在氮气流下加入三乙胺(0.038mol)，然后加入甲磺酰氯(0.025mol)。混合物在0摄氏度搅拌2小时，倾入冰水中。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂，得到6.5g(100％)的中间体9。

c)中间体10的制备

中间体9(0.0189mol)、N-甲基-1H-吲哚-3-乙胺(0.0172mol)和碳酸钾(0.0344mol)在乙腈(180ml)中的混合物搅拌并回流24小时，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(8.5g)通过柱色谱在硅胶(70-200μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0至97/3/0.1)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到1.25g(20％)的中间体10。

d)中间体11的制备

中间体10(0.003mol)和氢氧化钠(0.006mol)在EtOH(80ml)中的混合物搅拌并回流过夜，然后冷却至室温，蒸发溶剂直到干燥，得到1.3g(1000％)中间体11，mp.＞260摄氏度。

e)中间体12的制备

在室温下，向中间体11(0.003mol)在THF(100ml)中的混合物在氮气流下加入EDC(0.0045mol)，然后加入HOBt(0.0045mol)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.012mol)。混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(3g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 94/6/0.1)。收集纯馏分，蒸发溶剂。残余物(0.82g)置于乙醚中。滤出沉淀物并干燥，得到0.78g的中间体12，熔点154摄氏度。

实施例A4

a)中间体13的制备

2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0049mol)、1H-吲哚-3-乙醇甲烷磺酸酯(0.0054mol)和碳酸钾(0.01mol)在乙腈(20ml)中的混合物搅拌并且回流过夜，然后冷却，倾入冰水，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(2.2g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液方：DCM/MeOH/NH₄OH96/4/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.442g(22％)的中间体13，熔点238摄氏度。

b)中间体14的制备

中间体13(0.0025mol)、(2-溴乙氧基)(1，1-二甲乙基)二甲基硅烷(0.0034mol)和N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺(0.0038mol)在DMSO(20ml)中的混合物在50摄氏度搅拌15小时，然后冷却至室温，倾入冰水中并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.7g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.76g(54％)的中间体14。

c)中间体15的制备

中间体14(0.0013mol)和氢氧化钠(0.0027mol)在EtOH(40ml)中的混合物在80摄氏度搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发溶剂，得到0.75g(100％)的中间体15。

d)中间体16的制备

在室温下，向中间体15(0.0013mol)在THF(80ml)中的混合物在氮气流下加入EDC(0.002mol)，然后加入HOBt(0.002mol)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0068mol)。混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.3g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.38g的中间体16。

e)中间体17的制备

中间体16(0.0011mol)和氟化四丁铵(0.0032mol)在THF(10ml)中的混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中并用EtOAc萃取。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂，得到0.5g(88％)的中间体17。

实施例A5

a)中间体45的制备

2-氯-5-嘧啶羧酸甲酯(0.058mol)在DMA(80ml)中的溶液在氮气流下滴加至4-哌啶甲胺(0.116mol)和N-乙基二异丙胺(0.145mol)在DMA(150ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌1小时30分钟，倾入冰水中，用EtOAc萃取，然后用DCM萃取。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物从DIPE结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到10g(65％)的中间体45。

b)中间体46的制备

中间体45(0.0024mol)、1-甲基-5-硝基-1H-吲哚-3-醛(0.0036mol)和MgSO₄(0.25g)在甲醇(80ml)中的混合物在60摄氏度搅拌过夜，然后冷却至室温。分批加入四氢硼酸钠(0.0041mol)。混合物在室温下搅拌18小时，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物的一部分(1.1g)从乙腈结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到0.9g(86％)的中间体46，熔点：150摄氏度。

c)中间体47的制备

中间体46(0.002mol)和氢氧化钠(0.008mol)在EtOH(60ml)中的混合物在60摄氏度搅拌过夜，然后冷却至室温并且蒸发。残余物吸收于乙醚中。滤出沉淀物并且干燥，得到0.6g(67％)的中间体47。

d)中间体48的制备

在室温下，向中间体47(0.0013mol)和三乙胺(0.0039mol)在DCM/THF(50/50)(100ml)中的溶液中在氮气流下加入EDC(0.0019mol)和HOBt(0.0019mol)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0026mol)。混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.2至92/8/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.101g(15％)的中间体48。

实施例A6

a)中间体49的制备

2-氯-5-嘧啶羧酸甲酯(0.033mol)在DCM(80ml)中的溶液在室温下在氮气流下家至4-哌啶甲醇(0.066mol)和N-乙基二异丙胺(0.083mol)在DCM(100ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌3小时30分钟，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物吸收于戊烷中。滤出沉淀物并且干燥，得到7.88g(95％)的中间体49。

b)中间体50的制备

将DMSO(0.058mol)在-78摄氏度在氮气流下滴加到ethanedioyl二氯化物(0.0278mol)在DCM(50ml)中的溶液中。搅拌混合物15分钟。滴加中间体49(0.023mol)在DCM(200ml)中的溶液。混合物在-78摄氏度搅拌1小时30分钟。滴加三乙胺(0.118mol)。混合物在-78摄氏度下搅拌1小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物从乙醚结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到3.06g(54％)的中间体50。

c)中间体51的制备

中间体50(0.0122mol)在5摄氏度在氮气流下加到1-甲基-1H-吲哚-3-乙胺(0.0122mol)在甲醇(270ml)中的溶液中。搅拌混合物几分钟。加入氰基硼氢钠(0.0183mol)和乙酸(0.0183mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入10％的碳酸钾中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(4.9g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到1.2g(24％)的中间体51。

d)中间体52的制备

中间体51(0.0009mol)和氢氧化钠(0.0039mol)在EtOH(60ml)中的混合物搅拌并且回流15小时，然后蒸发直到干燥，得到中间体52。该中间体直接用于之后的反应步骤。

e)中间体53的制备

在室温下向中间体52(0.0009mol)和O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0019mol)在DCM/THF(130ml)中的溶液加入HOBt(0.0019mol)，然后加入EDC(0.0019mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.93g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.155g(33％)的中间体53。

实施例A7

a)中间体54的制备

2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0038mol)、1-乙基-1H-吲哚-3-醛(0.0049mol)和10％的Pd/C(0.5g)在含1ml 10％噻吩EtOH溶液的甲醇(20ml)中的混合物在室温和3大气压力下氢化24小时，然后用硅藻土过滤。蒸发溶剂直到干燥。残余物(1.8g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH95/5/0.2至93/7/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.7g(44％)的中间体54。

b)中间体55的制备

60％的氢化钠(0.009mol)在0摄氏度在氮气流下加入到中间体54(0.0045mol)在THF(50ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌1小时。滴加碘代乙烷(0.0062mol)在THF(10ml)中的溶液。混合物在室温下搅拌过夜，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.6g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.16g(8％)的中间体55。

c)中间体56的制备

中间体55(0.0003mol)和氢氧化钠(0.03g)在EtOH(15ml)中的混合物在80摄氏度搅拌6小时，然后蒸发直到干燥为止，得到0.16g(100％)的中间体56。

d)中间体57的制备

在室温下，向中间体56(0.0003mol)在DCM(20ml)和THF(20ml)中的混合物中在氮气流下加入EDC(0.0005mol)和HOBt(0.0005mol)。搅拌混合物15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0007mol)。混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.3g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 93/7/0.35)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.03g(16％)的中间体57。

实施例A8

a)中间体58的制备

氢化钠(0.011mol)在5摄氏度在氮气流下加入到中间体13(0.0037mol)在THF(30ml)中的溶液中。搅拌混合物30分钟。滴加碘代甲烷(0.0081mol)在THF(10ml)中的溶液。混合物在10摄氏度下搅拌2小时，然后温热到室温1小时30分钟，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.7g)通过柱色谱在kromasil(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1)。收集两个馏分并且蒸发溶剂，得到0.265g的中间体58和0.57g(17％)的中间体10。

b)中间体59的制备

中间体58(0.0006mol)和氢氧化钠(0.0012mol)在EtOH(30ml)中的混合物在80摄氏度搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发溶剂，得到0.26g(100％)的中间体59。

c)中间体60的制备

在室温下，向中间体59(0.0006mol)在THF(30ml)和DCM(30ml)中的溶液中在氮气流下加入EDC(0.0009mol)和HOBt(0.0009mol)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0012mol)。混合物在室温下搅拌24小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.6g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 99/1/0.05)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.1g(33％)的中间体60。

实施例A9

a)中间体61的制备

将DMSO(0.127mol)在-78摄氏度在氮气流下加到ethanedioyl二氯化物(0.061mol)在DCM(110ml)中的溶液中。搅拌混合物15分钟。滴加中间体8(0.051mol)在DCM(200ml)中的溶液。混合物在-78摄氏度搅拌1小时30分钟。滴加三乙胺(0.26mol)。混合物在-78摄氏度搅拌15分钟，然后恢复到室温2小时30分钟。加入水。用DCM萃取混合物。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(14g)通过柱色谱在硅胶(20-45μm)上提纯(洗脱液：环己烷/EtOAc 70/30)。收集纯馏分并且并蒸发溶剂，得到7.6g(57％)的中间体61。

b)中间体62的制备

氰基硼氢钠(0.049mol)和乙酸(0.034ml)在室温下在氮气流下加到5-氯-1-甲基-1H-吲哚-3-乙胺(0.031mol)和中间体61(0.034mol)在甲醇(700ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌24小时，倾入10％的碳酸钾中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(14.8g)通过柱色谱在硅胶(20-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到4.52g(32％)的中间体62。

c)中间体63的制备

在5摄氏度，向中间体62(0.004mol)和三乙胺(0.008mol)在DCM(150ml)中的溶液加入甲磺酰氯(0.0049mol)。混合物在室温下搅拌24小时，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(2.39g)吸收在DIPE中。滤出沉淀物并且干燥，得到1.78g(84％)的中间体63，熔点162摄氏度。

d)中间体64的制备

中间体63(0.0032mol)和氢氧化钠(0.0128mol)在EtOH(150ml)中的混合物搅拌并且回流5小时，冷却至室温，吸收在乙醚中。滤出沉淀物并且干燥，得到1.57g(99％)的中间体64，熔点＞260摄氏度。

e)中间体65的制备

在室温下，向中间体64(0.0032mol)在THF(160ml)和DCM(160ml)中的溶液中在氮气流下加入EDC(0.0064mol)和HOBt(0.0064mol)。在室温下搅拌混合物30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0064mol)。混合物在室温下搅拌3天，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(2.77g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂。残余物(0.3655g)从CH₃CN/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.084g的中间体65，熔点179摄氏度。

实施例A10

a)中间体66的制备

在室温下，在氮气氮气下，将2-(甲磺酰基)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.094mol)在乙腈(240ml)中的溶液加入4-哌啶基-氨基甲酸1，1-二甲乙基酯(0.078mol)和碳酸钾(0.156mol)在乙腈(120ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌过夜，倾入冰水中，用EtOAc萃取。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物从乙醚结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到14.4g(53％)的中间体66，熔点160摄氏度。

b)中间体67的制备

在室温下将TFA(20ml)加入中间体66(0.0225mol)在DCM(110ml)中的溶液中。T混合物在室温下搅拌15小时，倾入水中，用碳酸钾碱化。用DCM萃取混合物。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂，得到5.5g(98％)的中间体67。

实施例A11

a)中间体68的制备

将在油中60％的氢化钠(0.0069mol)在0摄氏度在氮气流下加入2-甲基-1H-吲哚-3-乙酸乙酯(0.0046mol)在THF(10ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌1小时。加入碘代乙烷(0.006mol)。混合物在室温下搅拌18小时，倾入EtOAc和饱和的NaCl中。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂直到干燥。残余物(1.1g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：环己烷/EtOAc 80/20)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.73g(65％)的中间体68。

b)中间体69的制备

二异丁基氢化铝在甲苯(0.0045mol)中的溶液在-78摄氏度在氮气流下滴加到中间体68(0.003mol)在DCM(15ml)中的溶液中(分子筛：3埃)。混合物在-78摄氏度下搅拌3小时，然后用3N的HCl猝灭，用DCM萃取。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂直到干燥，得到0.7g(＞100％)的中间体69。

c)中间体70的制备

乙醇钛(IV)(0.0023mol)加入到中间体67(0.0021mol)和中间体69(0.0021mol)在1，2-二氯乙烷(25ml)中的混合物中。在室温下搅拌混合物30分钟。分批加入三(acetato-α-O)硼氢化(1-)钠(0.0023mol)。混合物在室温下搅拌18小时，然后用NaHCO₃猝灭，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂直到干燥。残余物(1.2g)通过柱色谱在硅胶(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.2g(21％)的中间体70。

d)中间体71的制备

中间体70(0.0004mol)和氢氧化钠(0.0009mol)在EtOH(30ml)中的混合物在60摄氏度搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发，得到0.2g(100％)的中间体71。

e)中间体72的制备

在室温下，向中间体71(0.0004mol)和三乙胺(0.0009mol)在DCM/THF(40ml)中的溶液中在氮气流下加入EDC(0.0007mol)和HOBt(0.1g)。混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0009mol)。混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.4g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH98/2/0.1至90/10/1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.087g1g(37％)的中间体72。

实施例A12

a)中间体73的制备

中间体50(0.0046mol)在5摄氏度下在氮气流下加到6-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-乙胺(0.0046mol)在甲醇(100ml)中的溶液中。搅拌混合物30分钟。分批加入氰基硼氢化钠(0.0068mol)，然后分批加入乙酸(0.0046mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入10％的碳酸钾中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(4g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂。残余物(2.2g)的一部分(0.7g)从乙腈结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到0.43g(61％)的中间体73，熔点122摄氏度。

b)中间体74的制备

中间体73(0.0015mol)和氢氧化钠(0.006mol)在EtOH(90ml)中的混合物搅拌并且回流8小时，然后蒸发直到干燥，得到中间体74。

c)中间体75的制备

在室温下，在氮气流下向中间体74(0.0015mol)和O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.003mol)在THF/DCM(200ml)中的溶液加入HOBt(0.003mol)，然后加入EDC(0.003mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.1g)通过柱色谱在硅胶(10μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂。残余物(0.24g)通过柱色谱在硅胶(10μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH95/5/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.17g(21％)的中间体75。

实施例A13

a)中间体76的制备

6-甲氧基-1H-吲哚-3-乙胺(0.053mol)和1，3-异苯并呋喃二酮(0.058mol)在甲苯(130ml)中的混合物搅拌并且回流48小时，然后过滤。蒸发滤液，得到5.4g(32％)的中间体76。

b)中间体77的制备

中间体76(0.017mol)在DMF(19ml)中的溶液在室温下在氮气流下滴加至氢化钠(0.034mol)在DMF(11ml)中的悬浮液中。混合物在室温下搅拌1小时30分钟。加入1-碘代丙烷(0.034mol)。混合物在室温下搅拌1小时15分钟。加入饱和的NaCl。用EtOAc萃取混合物。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂，得到4.9g的中间体77。该产品直接用于之后的反应步骤。

c)中间体78的制备

中间体77(0.068mol)和肼一水合物(0.068mol)在EtOH(60ml)中的混合物搅拌并且回流1小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂，得到3.53g的中间体78。该产品直接用于之后的反应步骤。

d)中间体79的制备

氰基硼氢钠(0.024mol)和乙酸(0.0167mol)在室温下在氮气流下加到中间体61(0.0167mol)和中间体78(0.015mol)在甲醇(380ml)中的溶液中。混合物搅拌30分钟，倾入10％的碳酸钾中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(8.84g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到2.85g(40％)的中间体79。

e)中间体80的制备

中间体79(0.0028mol)、碘代乙烷(0.0056mol)和三乙胺(0.0085mol)在DMF(60ml)中的混合物在50摄氏度搅拌7小时，倾入冰水中并用EtOAc萃取。用水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.8g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH 100/0至95/5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到1.1g(78％)的中间体80。

f)中间体81的制备

中间体80(0.0022mol)和氢氧化钠(0.0088mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌并且回流6小时，然后在室温下搅拌过夜，蒸发直到干燥。残余物吸收于乙醚中。滤出沉淀物并且干燥，得到0.965g(88％)的中间体81，熔点＞260摄氏度。

g)中间体82的制备

在室温下，向中间体81(0.0019mol)在THF(100ml)和DCM(100ml)中的溶液中在氮气流下加入EDC(0.0038mol)和HOBt(0.0038mol)。在室温下搅拌混合物30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0038mol)。混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.2g)通过柱色谱在kromasil(5μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 99/1/0.05至93/7/0.35)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.114g的中间体82。

实施例A14

a)中间体83的制备

中间体62(0.0034mol)和氢氧化钠(0.0134mol)在EtOH(150ml)中的混合物在80摄氏度搅拌3小时，然冷却至室温，蒸发直到干燥。残余物吸收于乙醚中。滤出沉淀物并且干燥，得到1.18g(78％)的中间体83，熔点＞260摄氏度。

b)中间体84的制备

在室温下，在氮气流下向中间体83(0.0026mol)在THF(120ml)和DCM(120ml)中的溶液中加入EDC(0.0052mol)和HOBt(0.0052mol)。在室温下搅拌混合物30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0052mol)。混合物在室温下搅拌6天，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(2g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂。残余物(0.75g，55％)通过柱色谱在kromasil(10μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.625g的中间体84。该产品直接用于之后的反应步骤。

实施例A15

中间体81的制备

4-哌啶甲胺(0.65mol)和碳酸钾(96g)在乙腈(1000毫升)中搅拌，然后在室温用1小时滴加2-(甲磺酰基)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.37mol)在乙腈(500毫升)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌过夜，蒸发溶剂。残余物水中搅拌，混合物用DCM(2×500毫升)萃取。分离有机层，用水洗涤，干燥(MgSO₄)，滤出，蒸发溶剂。残余物通过柱色谱在硅胶上提纯(洗脱液1：EtOAc/己烷1/1；洗脱液2：MeOH+少量的NH₄OH)。收集产品馏分，与碳酸钾悬浮液一起搅拌，混合物用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，滤出并蒸发溶剂，得到31g(32％)的中间体85。

实施例16

a)制备中间体86

氢化钠(0.0095mol)在5摄氏度在氮气流下加到5-氯-1H-吲哚-3-羧醛(0.0056mol)在THF(270ml)中的溶液中。混合物在0摄氏度搅拌1小时。加入1-碘代丙烷(0.0067mol)。混合物在室温下搅拌2天，倾入水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发溶剂，得到1.5g的中间体86。该产品直接用于之后的反应步骤。

b)制备中间体87

氰基硼氢钠(0.0068mol)和乙酸(0.0046mol)在室温下在氮气流下加到中间体85(0.0042mol)和中间体86(0.0051mol)在甲醇(120ml)中的溶液中。混合物在室温下搅拌回流2天，然后冷却至室温，倾入碳酸钾10％中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(2.42g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到1.2g(60％)的中间体87。

c)中间体88的制备

中间体87(0.0025mol)和氢氧化钠(0.01mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌并回流4小时，然后蒸发直到干燥。残余物吸收于乙醚中。滤出沉淀物并干燥，得到0.845g(72％)的中间体88，熔点＞260摄氏度。

d)中间体89的制备

在室温下，在氮气流下向中间体88(0.0018mol)在THF(90ml)和DCM(90ml)中的溶液中加入EDC(0.0036mol)和HOBt(0.0036mol)。搅拌混合物30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0036mol)。混合物在室温下搅拌3天，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.3g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 92/8/0.5)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.54g(56％)的中间体89。

实施例A17

a)中间体90的制备

在10摄氏度在氮气流下将甲磺酰氯(0.004mol)加入1，2-二甲基-1H-吲哚-3-乙醇(0.0026mol)和三乙基胺(0.008mol)在DCM(10ml)中的溶液中。在10摄氏度搅拌混合物4小时。蒸发溶剂直到干燥，得到中间体90。该产品直接用于之后的反应步骤。

b)中间体91的制备

中间体85(0.0054mol)、中间体90(0.0075mol)和碳酸钾(0.021mol)在乙腈(150ml)中的混合物搅拌回流2天，然后冷却至室温，倾入冰水中，用EtOAc萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(1.88g)通过柱色谱在硅胶(15-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.15g(7％)的中间体91。

c)中间体92的制备

中间体91(0.0003mol)和氢氧化钠(0.0014mol)在EtOH(20ml)中的混合物搅拌回流1天，然冷却至室温，蒸发直到干燥。残余物吸收于乙醚中。滤出沉淀物并干燥，得到0.12g(82％)的中间体92，熔点＞260摄氏度。

d)中间体92的制备

在室温下，向中间体92(0.0002mol)在THF(15ml)和DCM(15ml)中的溶液中加入EDC(0.0005mol)和HOBt(0.0005mol)。搅拌混合物15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0005mol)。混合物在室温下搅拌4天，倾入冰水中，用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发溶剂。残余物(0.14g)通过柱色谱在硅胶(10μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.3)。收集纯馏分并且蒸发溶剂，得到0.035g(25％)的中间体93。

表F-1列出了根据上述实施例之一制备的中间体。

表F-1(中间体)

B.最终化合物的制备

实施例B1

化合物1a的制备

TFA(2ml)加入到中间体3(0.0006mol)在甲醇(40ml)中的混合物中。混合物在室温下搅拌30小时。蒸发溶剂。残余物从EtOAc/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.31g(86％)的化合物1a，熔点130摄氏度。

化合物1的另一种合成方法

化合物1b的制备

羟胺(在水中50％，7.5ml)和1N的NaOH(15ml)在10摄氏度先后加入到中间体1(0.0098mol)在甲醇(10ml)中的混合物中。在室温下搅拌混合物24小时。通过加入1N的HCl溶液酸化混合物至pH5-6。滤出沉淀物，用乙醚洗涤，然后干燥。残余物(4.5g)通过柱色谱在硅胶LiChroprepNH₂(25-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/H₂O90/10/1)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到3.1g(80％)。用一部分(0.5g)在EtOH中制备HCl盐，滤出沉淀物，用乙醚洗涤，干燥后得到0.43g的化合物1b，熔点220摄氏度。

实施例B2

化合物2的制备

TFA(0.5ml)加入到中间体7(0.0001mol)在甲醇(10ml)中的混合物中，混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂。残余物从乙腈/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.036g1g(50％)的化合物2，熔点205摄氏度。

实施例B3

化合物3的制备

TFA(5ml)在室温下加入到中间体12(0.0014mol)在甲醇(100ml)中的混合物中。混合物在室温下搅拌48小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物从EtOAc/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.545gg(74％)的化合物3，熔点121摄氏度。

实施例B4

化合物4的制备

TFA(0.5ml)加入到中间体17(0.0009mol)在甲醇(80ml)中的混合物中。混合物在室温下搅拌4天。蒸发溶剂。残余物从乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.19g(32％)的化合物4，熔点103摄氏度。

实施例B5

化合物18的制备

中间体48(0.0002mol)在TFA(0.75ml)和甲醇(15ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂。残余物从乙醚结晶。滤出沉淀物并且干燥，得到0.071g(59％)的化合物18。

实施例B6

化合物19的制备

中间体53(0.0003mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物从MeOH/CH₃CN/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.133g(80％)的化合物19，熔点174摄氏度。

实施例B7

化合物20的制备

中间体57(0.00005mol)在TFA(0.25ml)和MeOH(10ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂。残余物(0.04g)从乙腈/乙醚结晶。滤出沉淀物，然后干燥。残余物(0.04g)通过柱色谱在硅胶LiChroprep

NH₂(25-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/H₂O80/20/2)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到0.02g(80％)的化合物20，熔点90摄氏度。

实施例B8

化合物21的制备

中间体60(0.0001mol)在TFA(0.5ml)和MeOH(10ml)中的混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂。残余物(0.15g)通过柱色谱在硅胶LiChroprep

NH₂(25-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/H₂O80/21/2)。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到0.064g(78％)的化合物21，熔点83摄氏度。

实施例B9

化合物22的制备

中间体65(0.002mol)在TFA(6ml)和MeOH(120ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物从CH₃CN/MeOH/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.9g(87％)的化合物22，熔点183摄氏度。

实施例B10

化合物23的制备

中间体72(0.0001mol)在TFA(0.5ml)和MeOH(10ml)中的混合物在室温搅拌48小时。蒸发溶剂。残余物从乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.059g(59％)的化合物23，熔点182摄氏度。

实施例B11

化合物24的制备

中间体75(0.0003mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物从MeOH/CH₃CN/乙醚结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.147g(78％)的化合物24，熔点160摄氏度。

实施例B12

化合物25的制备

中间体82(0.0009mol)在TFA(2.5ml)和MeOH(56ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物通过柱色谱在硅胶(25-40μm)上提纯(洗脱液：DCM/MeOH/H₂O 90/10/1)。收集纯馏分并且蒸发溶剂。残余物从DIPE结晶。滤出沉淀物并干燥，得到0.286g(53％)的化合物25，熔点80摄氏度。

实施例B13

化合物26的制备

中间体84(0.0012mol)在TFA(3ml)和MeOH(60ml)中的混合物在室温搅拌24小时。蒸发溶剂直到干燥。残余物从DCM/MeOH结晶。滤出沉淀物，用乙醚洗涤，然后干燥，得到0.322g(50％)的化合物26，熔点188摄氏度。

实施例B14

化合物27的制备

中间体89(0.001mol)在TFA(2.5ml)和MeOH(50ml)中的混合物在室温搅拌24小时，然后蒸发直到干燥。残余物从MeOH/CH₃CN/乙醚结晶。滤出沉淀物，用水洗涤，然后干燥，得到0.33g(55％)的化合物27，熔点171摄氏度。

实施例B15

化合物28的制备

中间体93(0.00007mol)在TFA(0.2ml)和甲醇(4ml)中的混合物在室温搅拌3天，然后蒸发直到干燥，得到0.041g(100％)的化合物28，熔点80摄氏度。

表F-2列出了根据上述实施例之一制备的化合物。下列缩写用于所述表格：C₂HF₃O₂表示三氟醋酸盐；mp.表示熔点。

表F-2(最终化合物)

C.药理学实施例：

对于抑制组蛋白脱乙酰基酶的体外试验(参见实施例C.1)测定了由式(I)化合物得到的HDAC酶活性抑制。

式(I)化合物的细胞活性在A2780肿瘤细胞上用测定细胞毒性或存活率的比色试验确定(Mosmann Tim，Journal of ImmunologicalMethods 65：55-63，1983)(参见实施例C.2)。

化合物的溶解度测定的是化合物保持在溶液中的能力。在第一种方法中，测定化合物在稀释时保留在在水溶液中的能力(见实施例C.3.a)。DMSO-原液以三个连续的步骤用单一的含水缓冲剂溶剂稀释。用浊度计测定每一稀释物的混浊度。

在第二种方法种，用化学发光氮气检测器可测定化合物在不同pH值的溶解度(参见实施例C.3.b)。

药物渗透性表示其从一种介质进入或通过另一种介质的能力。具体而言，是其穿过肠膜进入进入和/或从血流进入靶体的能力。渗透性(参见实施例C.4)可以通过形成滤过固定的人工膜磷脂双层测定。在滤过固定的人工膜试验中，用96孔微滴定板和96孔滤板形成“夹心”，从而每个组成的孔被分成双室，供体溶液在底部，受体溶液在上部，用涂敷了2％(wt/v)二油酰基磷脂酰基-胆碱的十二烷溶液的125微米微过滤片(孔径0.45微米)分隔，当该体系接触含水缓冲溶液时，滤片通道内部形成多层双分子层。化合物通过该人工膜的渗透性按cm/s计量。目的在于寻找在4.0和7.4两个不同的pH值通过平行人工膜的药物的渗透性。用UV-分光光度法在250和500nm之间的最佳波长检测化合物。

药物的代谢作用是指脂类可溶的异生化合物或生物内生的化合物经酶催化转化城极性、水溶性的和可排泄的一种或多种代谢产物。药物代谢的主要器官是肝脏。代谢产物往往比母体药物活性小或是非活性的。但是，一些代谢产物可能具有增强的活性或毒性作用。因此，药物代谢可包括“解毒”和“中毒”两种过程。确定生物处理药物和化学试剂能力的主要酶系之一代表性的是细胞色素P450单氧化酶，其为NADPH依赖的酶。化合物的代谢稳定性可以在体外借助于亚细胞的人类组织(见实施例C.5.a)确定。此时，化合物的代谢稳定性可以表示为这些化合物与微粒体培养15分钟后代谢的药物的百分比。化合物的定量通过LC-MS分析确定。化合物的代谢稳定性还可以通过计算大鼠肝细胞内化合物的半衰期确定(参见实施例C.5.b)。

已经表明多种抗肿瘤剂活化p21蛋白质，包括DNA损伤剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。DNA损伤剂通过肿瘤抑制基因p53活化p21基因，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂经转录因子Sp1转录性地活化p21基因。因此，DNA损伤剂通过p53效应元件活化p21启动子，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂通过spl位点(位于相对于TATA box-60bp至+40bp区域)活化p21启动子，导致p21蛋白质的表达提高。当细胞中的p21启动子由未含有p53效应元件的p21 1300bp启动子片段组成时，其相应地对DNA损伤剂没有响应。可以多种方式评价化合物诱导p21的性能。第一种方法是用所研究的化合物处理肿瘤细胞，细胞溶胞后用p21酶标记免疫分析法(WAFl ELISA of Oncogene)测定p21的诱导作用。所述p21试验是使用小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的″夹心″酶免疫分析法。对于人p21蛋白质特异性的兔多克隆抗体已经固定到试剂盒提供的塑料孔板的表面上。检验样品中存在的任何p21会与捕捉抗体结合。生物素化的检测单克隆抗体还可识别人p21蛋白质，并且与已经被捕捉抗体保留的任何p21结合。所述检测抗体接着通过辣根过氧化酶共轭的抗生蛋白链菌素结合。辣根过氧化酶催化显色底物四甲基联苯胺从无色溶液到蓝色溶液的转化(或加入停止试剂后转为黄色)，颜色的强度与和板结合的p21蛋白质的量成正比。用分光光度计测定显色反应产物。通过用已知浓度的p21(以冷冻干燥物提供)制作标准曲线进行定量。该试验可以测定p21诱导作用是DNA损伤的结果或是组蛋白脱乙酰基酶抑制的结果(参见实施例C.6.a)。

另一种方法测试化合物在细胞水平抑制HDAC的结果由此确定其诱导p21的性能。所述细胞可被含p21 1300bp启动子片段而不含p53效应元件的表达载体稳定转染，由其中与对照水平相比提高的指示基因表达确定化合物具有p21诱导性能。指示基因是荧光蛋白质，指示基因的表达以发射的荧光的量测定(参见实施例C.6.b)。最后一种方法是体内方法，其中使用小鼠筛选化合物的药物活性。可以将上述稳定转化的肿瘤细胞以足够引起肿瘤产生的量施用给小鼠。在肿瘤细胞有充足的时间形成肿瘤后，将有潜力的活性化合物施用给所述动物，通过测定指示基因的表达评价所述化合物对肿瘤细胞的作用。与药物活性化合物一起培养会导致与对照水平相比提高了的指示基因表达(参见实施例C.6.c.)。

特定的HDAC抑制剂不应抑制其它的酶，例如大量的CYP P450蛋白质。CYP P450(大肠杆菌表达的)蛋白质3A4、2D6 en 2C9将其特定的底物转化为荧光分子。CYP3A4蛋白质将7-苄氧基-三氟甲基三氟甲基(BFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白质将3-[2-(N，N-二乙基-N-甲氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)转化为3-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-7-羟基-4-甲基香豆素盐酸盐，CYP2C9蛋白质将7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。化合物抑制所述的酶促反应将导致荧光信号的降低(参见实施例C.7)。

实施例C1.：对于组蛋白脱乙酰基酶抑制的体外试验：

实施例C.1.a.：用[³H]标记的底物进行体外试验：

HeLa细胞核萃取物(供应商：Biomol)以60μg/ml量与75μm的底物一起培养。作为用于测定HDAC活性的底物，使用合成肽，即，组蛋白H4的氨基酸14-21。所述底物在氨基端部被6-氨基己酸间隔基生物素化，COOH-端部通过酰胺基保护，并且特别是在赖氨酸16上[³H]乙酰化。底物，生物素-(6-氨基己酸)Gly-Ala-([³H]-乙酰基-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH₂)加入到缓冲剂中，缓冲剂含有25mMHepes、1M蔗糖、0.1毫克/毫升BSA和0.01％氚核X-100，pH为7.4。30分钟后，脱乙酰反应通过加入HCl和乙酸(最后浓度分别为0.035mM和3.8mM)终止。在停止所述反应后，用醋酸乙酯萃取游离的³H-乙酸盐。在混合和离心后，在β计数器上计算在上层(有机)相等分试样的放射性强度。对于每个试验，对照(含HeLa细胞核萃取物和DMSO，不含化合物)、空白培养(含DMSO，但是不含HeLa细胞核萃取物或化合物)和样品(含溶于DMSO和HeLa细胞核萃取物的化合物)并行进行。在第一个例子中，化合物在10^-5M的浓度测试。当所述化合物在10^-5M显示活性时，产生浓度-响应曲线，其中化合物在10^-5M和10^-12M之间的浓度测试。在每个测试中，从对照和样品数值扣除空白值。对照样品表示底物100％脱乙酰化。对于每个样品，放射性强度可以表示为对照平均值的百分比。如果合适，IC₅₀值(将代谢产物的量降低至对照的50％所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算。在此，测试化合物的作用可以表示为pIC₅₀(IC₅₀值的负对数值)(参见表F-3)。

实施例C.1.b：用荧光标记的底物进行体外试验：

使用Biomol(cat.No AK-500-0001)的HDAC荧光活性试验/药物发现试剂盒。HDAC荧光活性试验基于Fluor de Lys(荧光基因组蛋白deAcetylase Lysyl)底物和显影剂组合物。Fluor de Lys底物含有乙酰化赖氨酸侧链。底物的脱乙酰作用使所速底物具有感光性，从而再第二个步骤中，用Fluor de Lys显影剂处理生成荧光团。

HeLa细胞核萃取物(供应商：Biomol)以60μg/ml量与75μm的底物一起培养。将Fluor de Lys底物加入到缓冲剂中，所述缓冲剂含25mMTris、137mM NaCl、2.7mM KCl和1mM MgCl₂.6H₂O，pH值7.4。30分钟后，加入1体积显影剂。用355nm光激发荧光团，在荧光板检测器上检测发射光(450nm)。对于每个试验，对照(含HeLa细胞核萃取物和缓冲剂)、空白培养(含缓冲剂，但是不含HeLa细胞核萃取物)和样品(含溶于DMSO并进一步在缓冲剂中稀释的化合物和HeLa细胞核萃取物)并行进行。在第一个例子中，化合物在10^-5M的浓度测试。当所述化合物在10^-5M显示活性时，产生浓度-响应曲线，其中化合物在10^-5M和10^-9M之间的浓度测试。所有样品测试4次。在每个测试中，从对照和样品数值扣除空白值。对照样品表示底物100％脱乙酰化。对于每个样品，荧光可以表示为对照平均值的百分比。如果合适，IC₅₀值(将代谢产物的量降低至对照的50％所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算。在此，测试化合物的作用可以表示为pIC₅₀(IC₅₀值的负对数值)(参见表F-3)。

实施例C.2：在A2780细胞上测定抗增殖活性

测试的所有化合物溶于DMSO并进一步用培养液稀释。在细胞增殖试验中，最终的DMSO浓度从不超过0.1％(v/v)。对照样品含A2780细胞和DMSO，不含化合物；空白样品含DMSO，但是不含细胞。MTT以5mg/ml溶于PBS。制备由0.1M甘氨酸和0.1M NaCl组成的甘氨酸缓冲剂，用NaOH(1N)缓冲到pH 10.5(所有试剂来自于Merck)。人A2780卵巢癌细胞(T.C.Hamilton博士[Fox Chase Cancer Centre，Pennsylvania，USA]热心捐赠)在补充了2mM L-谷氨酸盐、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640介质中培养。细胞作为单层细胞培养常规保持在37摄氏度、湿润的5％CO₂气氛中。细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液以1∶40的分流比每周传代一次。所有介质和添加剂从LifeTechnologies获得。用Gen-Probe类菌质体组织培养试剂盒(供应商：BioMerieux)确定细胞无枝原体污染。

将细胞接种到NUNC^TM96-孔培养皿(供应商：Life Technologies)中，使其附着在塑料板上过夜。接种密度为每孔1500个细胞，介质总体积为200μl。在细胞粘到所述的板以后，介质被改变，加入药物和/或溶剂得到最终体积200μl。然后培养四天，用200μl鲜艳的介质替代介质，用基于MTT的试验评价细胞密度和活力。向每个孔中加入25μl的MTT溶液，在37摄氏度进一步培养所述细胞2小时。然后小心地吸出所述介质，加入25μl甘氨酸缓冲液，然后加入100μl的DMSO将蓝色MTT-甲腊产物溶解。在微板振荡器上振动微量培养板10分钟，用Emax 96-孔分光光度计(供应商：Sopachem)在540nm测定吸光度。在一个试验中，每次试验条件的结果为3个平行测定孔的平均值。出于最初的筛选目的，化合物在单一固定的10^-6M浓度测试。对于活性化合物，重复实验以建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养并行运行。从所有的对照和样本数值减去空白试验值。对于每个样本，细胞生长的平均值(在吸光元件中)表示为对照样细胞生长平均值的百分比。如果合适，IC₅₀值(将代谢产物的量降低至对照的50％所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算(Finney，D.J.，Probit Analyses，2nd Ed.Chapter 10，GradedResponses，Cambridge University Press，Cambridge 1962)。在此，测试化合物的作用可以表示为pIC₅₀(IC₅₀值的负对数值)(参见表F-3)。

实施例C.3：溶解度/稳定性

C.3.1在含水介质中的溶解度

在第一稀释步骤中，溶解在DMSO(5mM)中的活性化合物浓缩原液10μl加入到pH 7.4的100μl磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中并混合。在第二稀释步骤中，第一稀释步骤的等分样品(20μl)进一步溶于100μlpH 7.4的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中并混合。最后，在第三稀释步骤中，第二稀释步骤的样品20μl进一步在pH 7.4的100μl磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中稀释并混合。所有稀释在96孔板中进行。在最后的稀释步骤后立即用浊度计测定所述三个连续稀释步骤的混浊度。对于每种化合物进行一式三份的稀释以免随机误差。基于所述浊度测定进行三级分类排序。具有高溶解度的化合物得3分，对于这类化合物的第一次稀释物为澄清的。具有中等溶解度的化合物得2分。对于这类化合物的第一次稀释物不澄清，第二次稀释物为澄清的。具有低溶解度的化合物得1分，对于这些化合物第一次和第二次得稀释物不澄清(见表F-3)。

C.3.b在不同pH值得溶解度/稳定性

化合物在不同pH值的溶解度还可以使用化学发光的氮气检测器测定(见表F-3)。

实施例C.4：平行人工膜渗透性分析

原液样品(10μl5mM原液的等分样品在100％DMSO中)在深的孔板或预混合板中的含2mlpH 4或pH 7.4的含水缓冲系统中稀释。在样品加入到所述基准板前，将150μl的缓冲液加入到孔中，测定空白样的UV。此后，弃去所述缓冲液，所述板用作基准板。所有测定在UV-基准板(供应商：Costar或Greiner)中进行。在基准板的空白测定之后，将150μl的稀释样品加到基准板，将稀释的样品200μl加入到供体板1。受体滤板1(供应商：Millipore，型号：MAIP N45)用4μl形成人工膜的溶液(1，2-二油酰基-sn Glycer-3-胆碱磷酸在十二烷中，含0.1％2，6-二叔丁基-4-甲酚)涂敷，置于供体板1的上部形成″夹心″。将缓冲液(200μl)分配到上方的受体孔中。夹心用盖板覆盖，在室温下在黑暗中储藏18小时。

受体板2的空白测定通过在孔中加入150μl的缓冲液然后进行UV测定进行。在受体板2空白测定之后，弃去缓冲液，将150μl的受体溶液从受体滤板1转移到受体板2。然后除去受体滤板1形成夹心。在供体板2的空白测定之后(参见上文)，150μl的供体溶液从供体板1转移到供体板2。扫描(使用SpectraMAX 190)供体板2、受体板2和基准板孔的紫外线吸收光谱。所有的光谱用PSR⁴p Command软件计算渗透性。所有化合物计算三次。在每次试验中使用酰胺咪嗪、灰黄霉素、acycloguanisine、氨酰心安、呋喃苯胺酸和氯噻嗪用作标准。化合物分三类排序，即，具有低渗透率(平均效果＜0.5×10^-1cm/s；分数1)、中等渗透率(1×10^-6cm/s＞平均效果＞0.5×10^-6cm/s；分数2)或强渗透率(≥1×10^-6cm/s；分数3)。

实施例C.5：代谢稳定性

实施例C.5.a.

根据Gorrod等人(Xenobiotica 5：453-462，1975)在机械均化组织之后通过离心分离制备亚细胞组织制剂。肝脏组织在冰冷的0.1M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中漂洗以洗涤过量的血液。然后吸干组织、称重和用手术剪粗粗地切碎。组织碎片用装配了Teflon杵的Potter-S(Braun，意大利)或者Sorvall Omni-混合匀浆器在3体积冰冷的0.1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中均化7×10秒。在两个例子中，容器在所述均化步骤期间被保存在冰上或冰内。组织匀浆在9000xg在4摄氏度用Sorvall离心机或Beckman超离心机离心20分钟。得到的上层清液在-80摄氏度储藏并标记为″S9″。

S9部分可以用Beckman超离心机在100.000xg进一步离心60分钟(4摄氏度)。得到的上层清液被小心地吸出，等分并表示为″细胞溶质″。所述颗粒被重新悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，每0.5g原始组织重量最终体积为1ml，表示为″微粒体″。

所有亚细胞部分被等分试样，立即在液氮中冰冻，在-80摄氏度储藏直到使用。对于要被测试样品，培养混合物含PBS(0.1M)、化合物(5μm)、微粒体(1mg/ml)和NADPH-生成系统(0.8mM葡糖-6-磷酸、0.8mM氯化镁和0.8单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。对照样品含相同物质，但是所述微粒体被加热失活(在95摄氏度10分钟)的微粒体替代。在对照样品中回收的化合物总是100％。

混合物在37摄氏度预培养5分钟。反应在0时间点(t＝0)通过添加0.8mM NADP启动，样品培养15分钟(t＝15)。反应通过加入2体积的DMSO终止。然后样品在900xg离心10分钟，在分析前，上层清液在室温下储藏不超过24小时。所有培养被在duplo中进行。上层清液的分析用LC-MS分析仪进行。样品的洗脱在Xterra MS Cl 8(50×4.6mm，5μm，Waters，US)上进行。使用Alliance 2790(供应商：Waters，US)HPLC体系。用缓冲液A(在H₂O/乙腈(95/5)中25mM的乙酸铵(pH5.2))、溶剂B乙腈和溶剂C甲醇以2.4毫升/分钟的流速洗脱。使用的梯度是以线性方式在5分钟内有机相浓度从0％提高至50％B和50％C，在1分钟内提高到100％B，有机相浓度再保持稳定1.5分钟。样品的总注射体积是25ul。用配备了ESI源的Quattro(supplier：Micromass，Manchester，UK)三重四极质谱仪用作检测器。所述源和脱溶剂温度分别设定在120和350摄氏度，用氮气作为气雾剂和干燥气体。以正扫描方式(单一离子交换反应)方式获取数据。锥体电压设定在10V，停留时间1秒。代谢的稳定性可以表示为化合物在活性微粒体(E(活性的))存在下培养在15分钟之后的％代谢(％代谢＝100％-((在t＝15时E(活性的)的总离子电流(TIC)/在t＝0时E(活性的)的TIC))×100)。

具有t＝0时E(活性的)的TIC代谢百分比小于20％的化合物定义为高代谢稳定的。具有在20和70％代谢百分比的化合物定义为中等稳定的，代谢百分比高于70％的化合物定义为低代谢稳定的。当进行代谢稳定性筛选时，总是包括三个参考化合物。Verapamil作为具有低代谢稳定性(％代谢＝73％)的化合物被包括在内。Cisapride作为中等代谢稳定性(％代谢＝45％)的化合物被包括在内。丙醇作为中等至高代谢稳定性(25％代谢)的化合物被包括在内。这些参考化合物用来确认所述的代谢稳定性试验。

C.5.b：用大鼠肝细胞培养物测定代谢稳定性

从雄性Sprague Dowley大鼠分离大鼠肝细胞。化合物溶于100％DMSO中形成5mM原液，在5μm的最后浓度和大鼠肝细胞细胞培养物(0.5百万活细胞/0.5毫升)用24孔板培养0、15、30、60和120分钟。

通过添加2体积的DMSO制备用于LC-MS的样品。将所述样品充分振动，随后在900g离心10分钟(室温)。所有试验进行一式三份。得到的上层清液50μl用LC-MS分析。

对于LC-MS，在Hypersil BDS Cl 8柱(50×4.6mm，5μm，Thermohypersil，UK)上进行样品的洗脱。HPLC体系包括Surveyor输送系统(Surveyor Inc.，San Jose，US)，装备了Surveyor自动取样器装置。使用缓冲液A(在H₂O/乙腈(95∶5)中的10mM乙酸铵(pH6.9))和溶剂B(乙腈)在1.2毫升/分钟的流速洗脱。使用的梯度为开始条件下溶剂A0.5分钟，然后以线性方式提高有机相浓度，用2分钟从0％B提高到95％B。该相再保持稳定2分钟，然后在0.5分钟内再次降低到0％B。

样品的总注射体积为50μl。柱加热炉的温度保持在40摄氏度。分裂LC流用于MS检测，0.1ml进入所述源。配备了ESI源的三重四极质谱仪TSQ Quantμm(Thermofinnigan，LaJoIIa，USA)质谱仪用于检测。源电压设定在3800伏，毛细管温度在300摄氏度。为了定量评价，质谱仪以阳离子模式在调节到M+H质量的SIM中操作，扫描宽度1Da。仪器控制、数据收录和处理用Xcalibur软件(ThermoFinnigan，San Jose，CA，U.S.A)进行。在大鼠肝细胞中化合物的代谢稳定性可作为体外半衰期表示。

化合物R306465(WO03/76422)作为参考使用(体外半衰期：8分钟)。测试了化合物1和化合物5，其分别具有81分钟和60分钟的体外半衰期。

实施例C.6：p21诱导性能

实施例c.6.a.：p.21酶标记免疫分析法

用以下方法在人A2780卵巢癌细胞中确定p21蛋白质表达水平。A2780细胞(20000细胞/180μl)接种到96微孔滴定板的RPMI 1640介质中，所述的RPMI 1640介质补充了2mM L-谷氨酸盐、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清。在细胞溶胞前24小时，以10^-5M、10^-6M、10^-7M和10^-8M的最后浓度加入化合物。所有被测试的化合物溶于DMSO，用培养液进一步稀释。在加入化合物后24小时，从细胞上去掉上层清液。细胞用200μl冰冷的PBS洗涤。吸清所述孔，加入30μl的溶胞缓冲液(50mM的Tris.HCl(pH7.6)、150mM的NaCl、1％的Nonidet p40和10％的甘油)。所述板在-70摄氏度培养过夜。

将适合数量的微滴定孔从金属箔包装中取出，置入空孔固定器中。制备洗涤缓冲液(20x分析板洗涤浓缩液：100ml PBS和表面活性剂的20倍浓溶液。含2％的氯乙酰胺)的工作溶液(1x)。冷冻干燥的p2 WAF标准物用蒸馏水复原，进一步用样品稀释剂(在所述试剂盒中提供)进一步稀释。

通过在样品稀释剂中以1∶4的比例稀释制备样品。样品100μl和p2IWAFI标准物(100μl)用移液管移入合适的孔并在室温下培养2小时。与1x洗涤缓冲液洗涤所述孔3次，然后将100μl的检验抗体试剂(生物素化的单克隆p2 IWAFl抗体的溶液)用移液管移入每个孔。所述wells在室温下培养1小时，然后用1x洗涤缓冲液洗涤3次。稀释400x共轭物(过氧化物酶抗生物素共轭物：400倍浓溶液)，将100μl的1x溶液加入到所述孔。所述孔在室温下培养30分钟，然后用1x洗涤缓冲液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次。底物溶液(显色底物)(100μl)加入到所述孔中，在室温下在黑暗中培养所述孔30分钟。按早先加入底物溶液的相同的顺序将停止溶液加入到每个孔。用分光光度计板计数器在450/595nm双波长测定每个孔的吸光度。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养并行运行。从所有的对照和样本数值扣除空白试验值。对于每一样品，p2 IWAFl诱导作用(以吸光度为单位)可以表示为对照样p2 IWAFl值的百分比。诱导百分比高于130％的定义为具有显著诱导作用。测试九个化合物，均在10^-6M显示出显著的诱导作用。

实施例C.6.b.：细胞方法

A2780细胞(ATCC)在RPMI 1640介质中在37摄氏度在湿润的培养箱中在5％CO2中培养，所述RPMI 1640介质补充了10％的FCS、2mM的L-谷氨酸盐和庆大霉素。所有细胞培养溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它材料由Nunc提供。

从增殖的A2780细胞提取基因组的DNA，用作p21启动子嵌套式聚合酶链反应分离的模板。第一次扩增用低聚核苷酸成对GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC，以基因组的DNA作为模板，在55摄氏度的粘结温度(annealing temperature)进行20个周期。得到的4.5kb片段包含相对于TATA匣-4551至+88的片段，用低聚核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88摄氏度的粘结温度再扩增20个周期，得到4.5kb片段，随后用低聚核苷酸对TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88摄氏度的粘结温度扩增20个周期，得到包含相对于TATA匣-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苷酸(加下划线的序列)中的限制酶切位点Xhol和Kpnl用于亚克隆。

从pGL3-basic去掉荧光素酶指针，在Kpnl和Xbal限制酶切位点用zsGreen指针(来自pZsGreenl-Nl质粒)替代。通过将上述人p21启动子区域的1.3kb片段在Xhol和Kpnl位点插入pGL3-basic-ZsGreenp构成GL3-basic-ZsGreen-1300。所有限制性内切酶由BoehringerManheim(德国)提供。A2780细胞以2×10⁵细胞的密度涂敷在6孔板中，培养24小时，通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Brussels，Belgiμm)如制造商所述用2μg的pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2μg的pSV2neo介体转染。用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)选择所述转染的细胞10天，取单细胞悬浮液生长。3周后，得到单克隆。

扩增A2780选择的克隆，以每孔10000细胞接种在96孔板中。接种24小时后，用化合物再处理细胞24小时(影响邻近p21启动子区域的sp1位点)。随后，用4％PFA固定细胞30秒，用Hoechst染料染色。p21启动子活化导致ZsGreen产生，并因此发荧光，通过AscentFluoroskan(Thermo Labsystems，Brussels，Belgiμm)检测。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养并行运行。从所有的对照和样本数值扣除空白试验值。对于每个样品，p21诱导值可以表示为对照样p21值的百分比。诱导百分比高于130％的定义为显著诱导。测试了71种化合物，在10^-6M均显示出显著的诱导作用。

实施例C.6.c.：体内方法

将选择的克隆皮下注入(10细胞/200μl)裸鼠的侧腹，12天后得到可用卡尺测量到的肿瘤。从第12天起，对动物经口或经静脉每天施用溶剂和20-40mpk化合物(每组4-10只动物)。通过自制的自动整体成像系统(Olympus(R)型SZX12荧光立体显微镜，装备了GFP滤片，并与JAI(R)CV-M90型CCD照相机组合，用基于来自NationalInstrμments(R)的IMAQ Vision软件的软件包控制)。使用化合物R306465(WO03/76422)作为参照。化合物分级为无活性(没有发可测量的荧光)、较弱、与R306465相同或超过R306465。测试化合物1，优于R306465

实施例C.7：P450抑制能力

所有被测试的化合物溶于DMSO(5mM)，在乙腈中进一步稀释到5×10^-4M。在试验缓冲液中制备进一步的稀释物(0.1M NaK磷酸盐缓冲液pH 7.4)，最终的溶剂浓度不高于2％。

对CYP3A4蛋白质的分析包括每孔15pmol P450/mg蛋白质(在分析缓冲液中，0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl)、NADPH发生系统(3.3mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mM NADP和3.3mM MgCl₂1OH₂O)和化合物，总分析体积为100μl。在37摄氏度预保温5分钟后，加入在分析缓冲液中150μm的荧光探针底物BFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm的激发波长和535nm的发射波长进行荧光测定。酮康唑(IC₅₀值＝3×10^-8M)作为该试验的参考化合物。对CYP2D6蛋白质的分析包括每孔6pmol P450/mg蛋白质(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl)、NADPH发生系统(在分析缓冲液中0.41mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.0082mM NADP和0.41mM MgCl₂.6H₂O)和化合物，总分析体积100μl。在37摄氏度预保温5分钟后，加入在分析缓冲液中3μm的荧光探针底物AMMC启动酶促反应。在室温下培养45分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm的激发波长和460nm的发射波长进行荧光测定。奎尼丁(IC₅₀值5×10^-8M)作为该试验的参考化合物。对CYP2C9蛋白质的分析包括每孔15pmol P450/mg蛋白质(在0.01MNaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH发生系统(在分析缓冲液中3.3mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mMNADP和3.3mM MgCl₂.6H₂O)和化合物，总分析体积100μl。在37摄氏度预保温5分钟后，加入在分析缓冲液中200μm的荧光探针底物MFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm的激发波长和535nm的发射波长进行荧光测定。磺胺苯吡唑(IC₅₀值＝6.8×10^-7M)作为该试验的参考化合物。为了初步筛选的目的，化合物在单一固定的浓度的1×10^-5M测试。对于活性化合物，重复试验建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含酶或药物)的培养并行运行。所有化合物一式四份地分析。从所有的对照和样本数值减去空白试验值。对于每个样本，样品的P450活性平均值(以相对荧光度为单位)表示为对照样P450活性平均值的百分比。抑制百分比可以表示为100％减去样品P450活性平均值。如果合适，计算IC₅₀值(将P450活性降低到对照样的50％所需的药物的浓度)。

表F-3：化合物根据实施例CIa、C.l.b、C.2、C.3.a.和C.3.b测试的结果。

化合物编号	酶活性plC50C.1.a.	酶活性plC50C.1.b	细胞活性plC50C.2	溶解度C.3.a.	溶解度C.3.b.pH＝2.3(mg/ml)
						5	8.6		6.5		2.0
1a	8.8	9.2	8.2	3	1.4
						6	8.2		6.3
7	8.5		6.1
						3	8.5		6.7
4	8.7		7.0	3
						17		7.8	6.8
8		8.3	7.1		2.4
						9		8.3	7.1

10		8.1	7.5	3	3.7
						16		8.6	7.1	3
11		8.2	7.5	3	2.8
						2		8.4	7.5	3
15		8.5	7.5
						14		8.4	7.4		1.7
13		6.0	7.5	3
						12		8.2	7.1	3
35		8.2	6.7
						68		＞9.0	7.2		2.5
63		＞9.0	7.5
						67		8.3	7.5		1.9
76		7.8	6.7
						72		7.9	6.8
80		7.8	7.1
						34		8.4	7.5
33		10.0	7.5		1.6
						32		8.0	8.4		1.5
21		8.5	7.6		1.9
						49		8.7	7.5		3.3

53		10.0	8.0
						20		9.5	8.1		2.7
64		8.9	7.8
						62		9.5	8.0
28		8.1	7.1
						61		8.9	7.6
60		8.7	6.9		3.1
						59		9.0	7.7
58		10.0	5.8
						19		8.0	7.1
24		7.6	6.5		1.6
						57		10.2	7.6		2.8
56		9.2	7.6
						55		10.1	7.8		2.0
54		10.2	7.9

化合物编号	酶活性plC50C.1.a.	酶活性plC50C.1.b	细胞活性plC50C.2	溶解度C.3.a.	溶解度C.3.b.pH＝2.3(mg/ml)
						52		10.3	8.1
51		9.8	8.0

50		8.6	7.6		2.4
						48		＞9.0	8.2
66		＞9.0	7.4		1.7
						73		7.9	7.1
47		8.8	8.0		4.0
						74		8.2	7.1
46		9.0	8.0
						31		8.2	7.4
75		7.3	7.1
						27		＞9.0	8.0
45		9.0	6.7		1.7
						44		8.2	7.4		1.8
43		8.5	7.8		2.1
						29		7.9	6.9
42		8.3	7.5
						71		7.5	6.5
70		8.5	6.8
						69		7.6	6.7
25		7.6	7.0
						41		8.4	5.8

40		8.5	7.5
						23		8.4	7.5
22		9.1	7.2
						26		＞9.0	7.5
65		＞9.0	7.5		1.6
						39		9.0	7.5		2.0
30		9.0	7.5		2.1
						38		＞9.0	7.5
37		8.6	7.5
						36		8.7	8.6		2.5
79		8.4	8.1		2.7
						18		8.3	8.0
81		8.9	7.5

D.组合物实施例：包膜片剂

片芯的制备

100g式(I)化合物、570克乳糖和200克淀粉的混合物充分混合，然后用5克十二烷基硫酸盐钠和10g聚乙烯基吡咯烷酮在约200毫升水中的溶液湿润。筛分湿粉末混合物，干燥，然后再次筛分。然后加入100g微晶纤维素和15g氢化植物油。全部混合均匀，压成片，得到10000片，每片包括10mg的式(I)化合物。

包衣

向10g甲基纤维素在75毫升变性乙醇中的溶液加入5g乙基纤维素在150ml二氯甲烷中的溶液。然后加入75毫升的二氯甲烷和2.5毫升1，2，3-丙二醇。熔融10g的聚乙二醇，溶于75毫升二氯甲烷。将后一溶液加入前者，然后加入2.5g十八碳酸镁、5g聚乙烯吡咯烷酮和30毫升浓染料悬浮液，全部材料匀浆。用这样得到的混合物在包衣设备中将片芯包衣。

Claims (14)

1.式(I)化合物，

或其药学上可接受的加成盐，其中

每个n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；

每个m是整数1或2；

每个X独立地是N或CH；

每个Y独立地是O、S或NR⁴；其中

每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_3-6环烷基甲基、苯基C_1-6烷基、-C(＝O)-CHR⁵R⁶或-S(＝O)₂-N(CH₃)₂；

其中

每个R⁵和R⁶独立地是氢、氨基、C_1-6烷基或氨基C_1-6烷基；和

当Y是NR⁴和R²是在吲哚基的7-位时，R²和R⁴可一起形成二价基团

-(CH₂)₂-或

-(CH₂)₃-

R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基或单或二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

R²是氢、羟基、氨基、卤代基、C_1-6烷基、氰基、C_2-6烯基、多卤代C_1-6烷基、硝基、苯基、C_1-6烷基羰基、羟基羰基、C_1-6烷基羰基氨基、C_1-6烷氧基或单或二(C_1-6烷基)氨基；

R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；和

当R²和R³在相邻碳原子上时，其可形成二价基团-O-CH₂-O-。

2.根据权利要求1的化合物，其中

每个n是0或1的整数；每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_3-6环烷基或苯基C_1-6烷基；R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基或C_1-6烷基磺酰基；和R²是氢、卤代、C_1-6烷基、氰基、硝基、多卤代C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

3.根据权利要求1或2的化合物，其中

每个n是整数1；每个m是整数1；每个X独立地是N；每个Y独立地是NR⁴；每个R⁴是C_1-6烷基；R¹是氢；R²是氢或卤代；和R³是氢。

4.根据权利要求1或2的化合物，其中所述化合物是化合物No.1a、化合物No.30、化合物No.39和化合物No.50

5.药物组合物，包括药学上可接受的载体和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1-4任一项的所述化合物。

6.制备权利要求5所述药物组合物的方法，其中将药学上可接受的载体和权利要求1-4任一项的所述化合物密切混合。

7.权利要求1-4任一项所述的化合物用于生产治疗增殖疾病的药物的用途。

8.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于

a)Q是四氢吡喃基氧基氨基羰基的式(II)中间体，在此称为式(II-a)中间体，与合适的酸反应制备式(I)的异羟肟酸，

b)Q是C_1-2烷氧基羰基的式(II)中间体，在此称为中间体式(II-c)，与羟胺在碱存在下并在合适的溶剂中反应制备式(I)的异羟肟酸

9.权利要求8的的方法，其中所述合适的酸为三氟乙酸。

10.式(II)化合物，

或其药学上可接受的加成盐，其中

每个n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；

每个m是整数1或2；

每个X独立地是N或CH；

每个Y独立地是O、S或NR⁴；其中每个R⁴是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_3-6环烷基甲基、苯基C_1-6烷基、-C(＝O)-CHR⁵R⁶或-S(＝O)₂-N(CH₃)₂；

其中每个R⁵和R⁶独立地是氢、氨基、C_1-6烷基或氨基C_1-6烷基；和

当Y是NR⁴和R²是在吲哚基的7-位时，R²和R⁴可一起形成二价基团-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-；

R¹是氢、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基或单或二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

R²是氢、羟基、氨基、卤代、C_1-6烷基、氰基、C_2-6烯基、多卤代C_1-6烷基、硝基、苯基、C_1-6烷基羰基、羟基羰基、C_1-6烷基羰基氨基、C_1-6烷氧基或单或二(C_1-6烷基)氨基；

R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；

当R²和R³在相邻的碳原子上时，它们可以形成二价基-O-CH₂-O-；和

Q是C_1-2烷氧基羰基、羟基羰基或四氢吡喃基氧基氨基羰基。

11.制备权利要求10所述化合物的方法，其特征在于

a)其中Q是羟基羰基的式(II)化合物，在此称为式(II-b)化合物，与式(III)中间体在合适的试剂存在下反应形成式(II-a)化合物；

b)式(VI)中间体与合适的式(V)醛在合适的试剂存在下反应形成式(II-a)化合物，式(V)中t是整数0或1，并且当t是0时表示直接键；

c)Q是甲基-或乙氧基羰基(C_1-2烷基)的式(II)化合物，在此称为式(II-c)化合物，与合适的酸性溶液或与碱性溶液反应形成式(II-b)化合物；

d)式(IV)羧酸乙酯与合适的式(V)醛在合适的试剂存在下反应形成式(II-c)化合物；

e)式(XIV)中间体与合适的式(XV)中间体在合适的试剂存在下在合适的溶剂中反应形成式(II-c)化合物；

f)式(X)中间体与式(XI)中间体反应形成式(II-c)化合物，式(XI)中的W是合适的离去基团；

g)式(XII)中间体与其中W是如上所述合适的离去基团的式(XIII)中间体反应形成式(II-c)化合物

12.权利要求11所述的方法，其中所述步骤a)中合适的试剂为N′-(乙基亚氨酰基)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一盐酸盐或1-羟基-1H-苯并三唑；所述合适的离去基团为卤代或磺酰氧基基团。

13.权利要求12所述的方法，其中所述卤代为氟代、氯代、溴代或碘代。

14.权利要求12所述的方法，其中所述磺酰氧基基团为甲基磺酰氧基。