PT1781639E - Derivados de indolil alquil amina substituídos como novos inibidores de histona-desacetilase - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE INDOLIL ALQUIL AMINA SUBSTITUÍDOS COMO NOVOS INIBIDORES DE HISTONA-DESACETILASE"

Esta invenção refere-se a compostos possuindo atividade enzimática de inibição de histona-desacetilase (HDAC). Ela refere-se ainda a processos para a sua preparação, a composições compreendendo-os, bem como à sua utilização, tanto in vitro como in vivo, para inibir a HDAC e como um medicamento, por exemplo como um medicamento para inibir condições proliferativas, tais como cancro e psoríase.

As histonas nucleares são conhecidas como componentes integrantes e dinâmicos da maquinaria responsável pela regulação da transcrição de genes e outros processos modelados pelo ADN tais como replicação, reparação, reassociação e segregação de cromossomas. Elas são objeto de modificações pós-tradução incluindo acetilação, fosforilação, metilação, ubiquitinação e ADP-ribosilação. A(s) histona-desacetilase(s) , aqui referidas como "HDACs", são enzimas que catalisam a remoção da modificação acetilo em residuos de lisina de proteínas, incluindo as histonas nucleossomais nucleares H2A, H2B, H3 e H4. Em conjunto com a(s) histona-acetiltransferase(s) , aqui referidas como "HATs", as HDACs regulam o nível de acetilação das histonas. 0 equilíbrio de acetilação das histonas nucleossomais desempenha um papel importante na transcrição de muitos genes. A hipoacetilação de histonas está associada a uma estrutura de cromatina condensada que resulta na repressão da transcrição de genes, enquanto que as histonas acetiladas estão associadas a uma estrutura de cromatina mais aberta e à ativação da transcrição. 2

Foram descritas onze HDACs estruturalmente relacionadas e caem em duas classes. As HDACs de classe I consistem de HDAC 1, 2, 3, 8 e 11 enquanto que as HDACs de classe II consistem de HDAC 4, 5, 6, 7, 9 e 10. Os membros de uma terceira classe de HDACs não são estruturalmente relacionados com as HDACs de classe I e classe II. As HDACs de classe I/II funcionam por mecanismos dependentes de zinco, enquanto que as HDACs de classe III são dependentes de NAD.

Além das histonas, outras proteínas também são substrato de acetilação, em particular os fatores de transcrição tais como p53, GATA-1 e E2F; os recetores nucleares tais como o recetor de glucocorticoides, os recetores da tireoide, os recetores de estrogénio; e as proteínas de regulação do ciclo celular tal como a pRb. A acetilação de proteínas foi relacionada com a estabilização de proteínas, tal como a estabilização da p53, o recrutamento de cofatores e o aumento da ligação a ADN. A p53 é um supressor de tumores que pode induzir a paragem do ciclo celular ou apoptose em resposta a uma variedade de sinais de stress, tais como danos no ADN. O alvo principal para a paragem do ciclo celular induzida pela p53 parece ser o gene p21. A seguir à sua ativação pela p53, o p21 foi identificado devido à sua associação com complexos de ciclina/cinase dependente de ciclina que resultam na paragem do ciclo celular em ambas as fases G1 e G2, na sua regulação positiva durante a senescência e na sua interação com o antigénio nuclear da célula em proliferação. O estudo de inibidores de HDACs indica que eles desempenham um papel importante na paragem do ciclo celular, diferenciação celular, apoptose e inversão de fenótipos transformados. 3

Por exemplo, o inibidor Tricostatina A (TSA) origina a paragem do ciclo celular em ambas as fases G1 e G2, inverte o fenótipo transformado de linhas de células diferentes e induz a diferenciação de células de leucemia de Friend e outras. Foi descrito que a TSA (e ácido suberoilanilida hidroxâmico SAHA) inibe o crescimento de células, induz a diferenciação terminal e previne a formação de tumores em ratos (Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).

Também foi descrito que a Tricostatina A é útil no tratamento de fibrose, por exemplo de fibrose hepática e cirrose hepática. (Geerts et al., Pedido de Patente Europeia EP 0 827 742, publicado em 11 de março de 1998). O farmacóforo para inibidores de HDAC consiste de um dominio de ligação de metal, que interage com o sitio ativo contendo zinco das HDACs, um dominio de unidade de ligação, e um dominio de reconhecimento de superfície ou região de terminação, o qual interage com resíduos na orla do sítio ativo.

Também foram descritos inibidores de HDACs para induzir a expressão do gene p21. A ativação transcricional do gene p21 por estes inibidores é promovida pela remodelação da cromatina, após acetilação das histonas H3 e H4 na região promotora do p21. Esta ativação do p21 ocorre de uma maneira independente da p53 e, assim, os inibidores de HDAC estão operacionais em células com genes p53 mutados, um marca distintiva de um grande número de tumores.

Além disso os inibidores de HDAC podem ter atividades indiretas tais como o aumento da resposta imunológica do hospedeiro e a inibição da angiogénese de tumores e, deste 4 modo, podem suprimir o crescimento de tumores primários e impedir metástases (Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309).

Face ao descrito acima, os inibidores de HDAC podem ter um grande potencial no tratamento de doenças ou condições proliferativas celulares, incluindo tumores com genes p53 mutados. O pedido de patente EP1472216 publicado em 14 de agosto de 2003, divulga hidroxamatos biciclicos como inibidores de histona-desacetilase.

Os pedidos de patente EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, EP1485378 publicados em 18 de setembro de 2003, entre outros, divulgam ácidos piperazinilpirimidinil-hidroxâmicos substituídos como inibidores de histona-desacetilase, além disso a EP1485365 divulga o R306465. O pedido de patente EP1492534 publicado em 9 de outubro de 2003, divulga compostos de ácido carbâmico compreendendo uma ligação piperazina, como inibidores de HDAC. O pedido de patente EP1495002 publicado em 23 de outubro de 2003, divulga compostos de piperazinil fenil benzamida substituída, como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente W004/009536 publicado em 29 de janeiro de 2004, divulga derivados contendo uma unidade de ligação alquilo entre o grupo arilo e o hidroxamato, como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente EP1525199 publicado em 12 de fevereiro de 2004, divulga hidroxamatos biciclicos substituídos com (hetero)arilalcenilo, como inibidores de histona-desacetilase . 5 0 pedido de patente W004/063146 publicado em 29 de julho de 2004, divulga derivados de N-hidroxi-benzamida com atividade anti-inflamatória e antitumoral. O pedido de patente W004/063169 publicado em 29 de julho de 2004, divulga derivados de aril hidroxamato substituídos como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente W004/072047 publicado em 26 de agosto de 2004, divulga indoles, benzimidazoles e naftimidazoles como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente WO04/082638 publicado em 30 de setembro de 2004, divulga hidroxamatos ligados a sistemas de anel heterocíclico não aromático como inibidores de histona- desacetilase . O pedido de patente W004/092115 publicado em 28 de outubro de 2004, divulga derivados de hidroxamato como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente WO05/028447 publicado em 31 de março de 2005, divulga benzimidazoles como inibidores de histona-desacetilase .

Os pedidos de patente W005/030704 e W005/030705 publicados em 7 de abril de 2005, divulga benzamidas como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente W005/040101 publicado em 6 de maio de 2005, divulga hidroxamatos ligados a acilureia e ligados a sulfonilureia como inibidores de histona-desacetilase. O pedido de patente W005/040161 também publicado em 6 de maio de 2005, divulga hidroxamatos ligados a biarilos como inibidores de histona-desacetilase.

Os compostos da presente invenção diferem da técnica precedente em termos de estrutura, na sua atividade farmacológica e/ou potência farmacológica. 6 0 problema a ser resolvido é proporcionar inibidores de histona-desacetilase com atividade enzimática e celular alta que têm uma maior biodisponibilidade e/ou potência in vivo.

Os novos compostos da presente invenção resolvem o problema descrito acima. Os compostos da presente invenção mostram excelente atividade enzimática e celular de inibição da histona-desacetilase. Eles têm uma alta capacidade para ativar o gene p21, tanto ao nivel celular como in vivo. Eles têm um perfil farmacocinético conveniente e afinidade baixa para as enzimas P450, o que reduz o risco de interação fármaco-fármaco desfavorável permitindo também uma margem de segurança maior.

As caracteristicas vantajosas dos presentes compostos são estabilidade metabólica, solubilidade e/ou capacidade de indução de p21. Mais em particular, os compostos da presente invenção têm maiores semividas em hepatócitos de ratazana, têm uma maior solubilidade/estabilidade em soluções aquosas e/ou têm melhores capacidades de indução do promotor p21 in vivo.

Esta invenção refere-se a compostos de fórmula (I)

às formas IV-óxido, aos sais de adição f armaceuticamente aceitáveis e às formas estereoquimicamente isoméricas destes, em que 7 cada n é um número inteiro com valor 0, 1 ou 2 e quando n é 0 então é pretendida uma ligação direta; cada m é um número inteiro com valor 1 ou 2; cada X é independentemente N ou CH; cada Y é independentemente O, S ou NR4; em que cada R4 é hidrogénio, alquiloCi_6, alquiloxiCi-6alquiloCi-6, cicloalquiloC3_6, cicloalquilC3_6metilo, fenilalquiloCi-6, -C (=0)-CHR5R6 ou -S (=0) 2_N (CH3) 2; em que cada R5 e R6 é independentemente hidrogénio, amino, alquiloCi-6 ou aminoalquiloCi-6; e quando Y é NR4 e R2 está na posição 7 do indolilo então R2 e R4 podem formar, em conjunto, o radical bivalente -(CH2)2- (a-1), ou -(CH2)3- (a-2); R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi_6Sulf onilo, alquilCi-6carbonilo ou mono- ou di (alquilCi_6) aminossulfonilo; R2 é hidrogénio, hidroxilo, amino, halo, alquiloCi-6, ciano, alceniloC2_6, poli-haloalquiloCi-6, nitro, fenilo, alquilCi_6carbonilo, hidroxicarbonilo, alquilCi-6carbonilamino, alquiloxiloCi-6, ou mono- ou di (alquilCi-6) amino; R3 é hidrogénio, alquiloCi_6 ou alquiloxiloCi_6; e quando R2 e R3 estão em átomos de carbono adjacentes, eles podem formar o radical bivalente -O-CH2-O-.

As linhas desenhadas para dentro dos sistemas de anel biciclico a partir de substituintes indicam que as liqações podem estar ligadas a qualquer um dos átomos endociclicos adequados do sistema de anel biciclico. 0 termo "inibidor de histona-desacetilase" ou "inibidor de histona-desacetilase" é utilizado para identificar um composto, que é capaz de interagir com uma histona-desacetilase e inibir a sua atividade, mais particularmente a sua atividade enzimática. Atividade enzimática de inibição da histona-desacetilase significa reduzir a capacidade de uma histona-desacetilase para remover um grupo acetilo a partir de uma histona. Preferencialmente, essa inibição é especifica, isto é, o inibidor de histona-desacetilase reduz a aptidão de uma histona-desacetilase para remover um grupo acetilo a partir de uma histona a uma concentração que é inferior à concentração de inibidor que é necessário para produzir algum outro efeito biológico não relacionado.

Como utilizado nas definições precedentes e a seguir, halo é genérico para flúor, cloro, bromo e iodo; alquiloCi-2 para radicais de hidrocarboneto saturado de cadeia linear possuindo 1 ou 2 átomos de carbono tais como, por exemplo metilo ou etilo; alquiloCi_6 define alquiloCi_2 e radicais de hidrocarboneto saturado de cadeia linear e ramificada possuindo de 3 a 6 átomos de carbono tais como, por exemplo propilo, butilo, 1-metiletilo, 2-metilpropilo, pentilo, 2-metil-butilo, hexilo, 2-metilpentilo e semelhantes; e poli-haloalquiloCi-6 define alquiloCi_6 contendo três substituintes halo idênticos ou diferentes por exemplo 9 trifluorometilo; alceniloC2-6 define radicais de hidrocarboneto de cadeia linear e ramificada contendo uma ligação dupla e possuindo de 2 a 6 átomos de carbono tais como, por exemplo, etenilo, 2-propenilo, 3-butenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 3-metil-2-butenilo e semelhantes; cicloalquiloC3_6 inclui grupos hidrocarboneto cíclicos possuindo de 3 a 6 carbonos, tais como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexenilo e semelhantes.

Os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis abrangem sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis como mencionados acima destinam-se a compreender as formas de sal de adição de ácido não tóxicas terapeuticamente ativas, que os compostos de fórmula (I) são capazes de formar. Os compostos de fórmula (I) que têm propriedades básicas podem ser convertidos nos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis tratando a referida forma de base com um ácido apropriado. Os ácidos apropriados compreendem, por exemplo, ácidos inorgânicos tais como os ácidos halídricos, por exemplo ácido clorídrico ou bromídrico; sulfúrico; nítrico; fosfórico e ácidos semelhantes; ou ácidos orgânicos tais como, por exemplo, acético, trifluoroacético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (isto é, ácido butanodióico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfónico, etanossulfónico, benzenossulfónico, p-toluenossulfónico, ciclâmico, salicilico, p-amino-salicílico, pamóico e ácidos semelhantes.

Os compostos de fórmula (I) que têm propriedades ácidas podem ser convertidos nos seus sais de adição de base 10 farmaceuticamente aceitáveis tratando a referida forma de ácido com uma base orgânica ou inorgânica adequada. As formas de sal de base apropriadas compreendem, por exemplo, os sais de amónio, os sais de metais alcalinos e alcalinoterrosos, por exemplo os sais de litio, sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, sais com bases orgânicas, por exemplo os sais de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, e os sais com aminoácidos tais como, por exemplo, arginina, lisina e semelhantes. O termo "sais de adição de ácido ou base" também compreende os hidratos e as formas de adição de solvente, que os compostos de fórmula (I) são capazes de formar. Exemplos de tais formas são por exemplo os hidratos, alcoolatos e semelhantes. O termo "formas estereoquimicamente isoméricas de compostos de fórmula (I)", como aqui utilizado, define todos os compostos possíveis constituídos pelos mesmos átomos ligados pela mesma sequência de ligações mas possuindo estruturas tridimensionais diferentes, que não são intermutáveis, que os compostos de fórmula (I) podem possuir. A menos que mencionado ou indicado de outro modo, a designação química de um composto abrange a mistura de todas as formas estereoquimicamente isoméricas possíveis, que o referido composto pode possuir. A referida mistura pode conter todos os diastereómeros e/ou enantiómeros da estrutura molecular básica do referido composto. Todas as formas estereoquimicamente isoméricas dos compostos de fórmula (I) na forma pura ou misturadas umas com as outras destinam-se a estar abrangidas no âmbito da presente invenção. 11

As formas de N-óxido dos compostos de fórmula (I) destinam-se a compreender aqueles compostos de fórmula (I) em que um ou vários átomos de azoto são oxidados ao chamado IV-óxido, em particular aqueles N-óxidos em que um ou mais azotos de piperidina, piperazina ou piridazinilo estão N-oxidados.

Alguns dos compostos de fórmula (I) também podem existir nas suas formas tautoméricas. Tais formas embora não explicitamente indicadas na fórmula acima destinam-se a estar incluidas no âmbito da presente invenção.

Sempre que utilizado a seguir, o termo "compostos de fórmula (1)" destina-se a incluir também os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e todas as formas estereoisoméricas.

Como aqui utilizado, os termos "histona-desacetilase" e "HDAC" destinam-se a referir qualquer de uma familia de enzimas que remove grupos acetilo dos grupos amino ε de residuos de lisina na extremidade N-terminal de uma histona. Salvo indicação em contrário pelo contexto, o termo "histona" destina-se a referir qualquer proteina histona, incluindo Hl, H2A, H2B, H3, H4 e H5, de qualquer espécie. As proteínas ou produtos génicos de HDAC humana, incluem, mas se limitam a, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 HDAC-10 e HDAC-11. A histona-desacetilase também pode ser derivada de uma fonte protozoário ou fúngica.

Um primeiro grupo de compostos interessantes é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das restrições seguintes: 12 a) cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, cicloalquiloC3-6, cicloalquilC3-6metilo, -C (=0) -CHR5R6 ou -S (=0) 2-N (CH3) 2; b) R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi_6Sulf onilo, ou mono- ou di (alquilCi-6) aminossulfonilo/ ou c) R3 é hidrogénio.

Um segundo grupo de compostos interessantes é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das restrições seguintes: a) cada n é um número inteiro com valor 0 ou 1; b) cada X é independentemente N; c) cada R4 é hidrogénio ou alquiloCi_6; d) R1 é hidrogénio, alquiloCi-6 ou hidroxialquiloCi-6/ ou e) R2 é hidrogénio, halo, alquiloCi-6 ou alquiloxiloCi-6·

Um terceiro grupo de compostos interessantes é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das restrições seguintes: a) cada n é um número inteiro com valor 0 ou 1; b) cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi-6alquiloCh-6, cicloalquiloC3_6 ou fenilalquiloCi-6 ; c) R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi_6carbonilo ou alquilCi_6Sulfonilo; ou d) R2 é hidrogénio, halo, alquiloCi_6, ciano, nitro ou alquiloxiloCi-6.

Um quarto grupo de compostos interessantes é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das restrições seguintes: a) cada n é um número inteiro com valor 0 ou 1; 13 b) cada m é um número inteiro com valor 1/ c) cada R4 é hidrogénio, alquiloxiCi-6alquiloCi-6, cicloalquiloC3-6 ou fenilalquiloCi-6; c) R1 é hidrogénio, hidroxialquiloCi_6, alquilCi-6carbonilo ou alquilCi_6Sulfonilo; d) R2 é hidrogénio, halo, ciano, nitro ou alquiloxiloCi_6; ou e) R3 é alquiloxiloCi-6; ou f) quando R2 e R3 estão em átomos de carbono adjacentes, eles podem formar o radical bivalente -O-CH2-O-.

Um quinto grupo de compostos interessantes é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que se aplicam uma ou mais das restrições seguintes: a) cada n é um número inteiro com valor 1; b) cada m é um número inteiro com valor 1; c) cada X é independentemente N; d) cada Y é independentemente NR4; e) cada R4 é alquiloCi-6/ f) R1 é hidrogénio; g) R2 é hidrogénio ou halo; ou h) R3 é hidrogénio.

Um grupo de compostos preferidos é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que cada n é um número inteiro com valor 0 ou 1; cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi-6alquiloCi_6, cicloalquiloC3-6 ou fenilalquiloCi-6; R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi_6f alquilCi_6carbonilo ou alquilCi-6Sulfonilo; e R2 é hidrogénio, halo, alquiloCi-6, ciano, nitro, poli-haloalquiloCi-6 ou alquiloxiloCi-6 · 14

Um grupo de compostos mais preferidos é constituído por aqueles compostos de fórmula (I) em que cada n é um número inteiro com valor 1/ cada m é um número inteiro com valor 1/ cada X é independentemente N; cada Y é independentemente NR4; cada R4 é alquiloCi-6/ R1 é hidrogénio; R2 é hidrogénio ou halo; e R3 é hidrogénio.

Os compostos muito preferidos são composto n° la, composto n° 30, composto n° 39 e composto n° 50 HO ^ O | F H ir N N H jj^ C2HF3O2; Composto la C2HF3O2 (1:1); composto 30 H°'!íV| 1 F „ rVcrs^o> Η(ΤΝγ^Ν o C2HF3O2 (1:1); composto 3 9 composto 50

Os compostos de fórmula (I) e (II), seus sais f armaceuticamente aceitáveis e N-óxidos e formas estereoquimicamente isoméricas destes podem ser preparados de modo convencional. Os materiais de partida e alguns dos intermediários são compostos conhecidos e estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados de acordo com procedimentos reacionais convencionais como geralmente conhecido na técnica ou como descrito nos pedidos de patente EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370 e EP1485378. Alguns métodos de preparação serão descritos a seguir em mais pormenor. Nos exemplos são descritos outros métodos para obter compostos finais de fórmula (I). 15 a) Os ácidos hidroxâmicos de fórmula (I) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (II), em que Q é tetra-hidropiraniloxiaminocarbonilo, aqui referido como intermediários de fórmula (ΙΙ-a), com um ácido apropriado, tal como por exemplo, ácido trifluoroacético. A referida reação é realizada num solvente apropriado, tal como, por exemplo, metanol ou diclorometano.

b) Alternativamente, os ácidos hidroxâmicos de fórmula (I) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (II), em que Q é alquiloxiCi_2carbonilo, aqui referido como intermediários de fórmula (II-c), com hidroxilamina, na presença de uma base tal como por exemplo hidróxido de sódio. A referida reação é realizada num solvente apropriado, tal como, por exemplo, metanol.

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Os compostos de fórmula (I) também pode ser convertidos uns nos outros via reações ou transformações de grupo funcional conhecidas na técnica. Um número de tais transformações já estão descritas acima. Outros exemplos são a hidrólise de ésteres carboxilicos ao correspondente ácido carboxilico ou álcool; hidrólise de amidas aos correspondentes ácidos carboxilicos ou aminas; hidrólise de nitrilos às correspondente amidas; os grupos amino no imidazole ou fenilo podem ser substituídos por um hidrogénio por reações de diazotação conhecidas na técnica e substituição subsequente do grupo diazo por hidrogénio; os álcoois podem ser convertidos em ésteres e éteres; as aminas primárias podem ser convertidas em aminas secundárias ou terciárias; as ligações duplas podem ser hidrogenadas à correspondente ligação simples; um radical iodo num grupo fenilo pode ser convertido num grupo éster por inserção de monóxido de carbono na presença de um catalisador de paládio adequado. A presente invenção refere-se também a intermediários de fórmula (II)

às formas N-óxido, aos sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e às formas estereoquimicamente isoméricas destes, em que cada n é um número inteiro com valor 0, 1 ou 2 e quando n é 0 então é pretendida uma ligação direta; cada m é um número inteiro com valor 1 ou 2; 17 cada X é independentemente N ou CH; cada Y é independentemente O, S ou NR4; em que cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi_6alquiloCi-6, cicloalquiloC3-6, cicloalquilC3-6metilo, fenilalquiloCi-6, -C (=0)-CHR5R6 ou -S (=0) 2-N (CH3) 2/ em que cada R5 e R6 é independentemente hidrogénio, amino, alquiloCi-6 ou aminoalquiloCi-6/ e quando Y é NR4 e R2 está na posição 7 do indolilo, então R2 e R4 podem formar, em conjunto, o radical bivalente - (CH2) 2- (a-1), ou (a-2) ; - (CH2) 3- R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi_6Sulf onilo, alquilCi_6carbonilo ou mono- ou di (alquilCi-6) aminossulfonilo; R2 é hidrogénio, hidroxilo, amino, halo, alquiloCi-6, ciano alceniloC2-6, poli-haloalquiloCi-6, nitro, fenilo alquilCi_6carbonilo, alquilCi_6carboni lamino, alquiloxiloCi-6 di (alquilCi-6) amino; hidroxicarbonilo ou mono- ou R3 é hidrogénio, alquiloCi-6 ou alquiloxiloCi-6; quando R2 e R3 estão em átomos de carbono adjacentes, eles podem formar o radical bivalente -0-CH2-0-; e 18 Q é alquiloxiCi-2carbonilo, hidroxicarbonilo ou tetra-hidropiraniloxiaminocarbonilo.

Podem ser definidos grupos de compostos interessantes, preferidos, mais preferidos e muito preferidos para os compostos de fórmula (II), de acordo com os grupos definidos para os compostos de fórmula (I). a) Os intermediários de fórmula (ΙΙ-a) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (III) com um intermediário de fórmula (II), em que Q é hidroxicarbonilo, aqui referido como intermediários de fórmula (ΙΙ-b), na presença de reagentes apropriados tais como monocloridrato de Ν' - (etilcarbonimidoil)-N, N-dimetil-1,3-propanodiamina, (EDO) e l-hidroxi-lH-benzotriazole (HOBT) . A reação pode ser realizada na presença de uma base tal como trietilamina, num solvente adequado, tal como, uma mistura de diclorometano e tetra-hidrofurano.

b) Os intermediários de fórmula (ΙΙ-a) também podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (VI) com o carboxaldeido de fórmula (V) apropriado, em que t é um número inteiro com valor 0 ou 1, e quando t é 0 então é pretendida uma ligação direta, na presença de um reagente 19 apropriado, tal como um boro-hidreto de sódio, num solvente adequado tal como dicloroetano ou metanol. 19

c) Os intermediários de fórmula (ΙΙ-b) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (II), em que Q é metil- ou etiloxicarbonilo (alquiloCi-2) , aqui referido como intermediários de fórmula (II-c), com uma solução ácida apropriada, por exemplo ácido clorídrico, ou solução básica, por exemplo brometo de hidrogénio ou hidróxido de sódio, num solvente adequado por exemplo um álcool, tal como etanol ou propanol. áíquííCj.7 %

d) Os intermediários de fórmula (II-c) podem ser preparados fazendo reagir o éster etílico de ácido carboxílico da fórmula (IV) com o carboxaldeído de fórmula (V) apropriado, na presença de um reagente apropriado, tal como um boro-hidreto de sódio por exemplo tetra-hidroborato de sódio, 20 num solvente adequado tal como um álcool por exemplo metanol.

e) De uma maneira idêntica, os intermediários de fórmula (II-c) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (XIV) com o intermediário de fórmula (XV) apropriado, na presença de um reagente apropriado, tal como um boro-hidreto de sódio por exemplo tetra-hidroborato de sódio, num solvente adequado tal como um álcool por exemplo metanol.

f) Os intermediários de fórmula (II-c) também podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (X) com um intermediário de fórmula (XI) em que W é um grupo de saida apropriado tal como, por exemplo, halo, por exemplo flúor, cloro, bromo ou iodo, ou um radical sulfoniloxilo tal como metilsulfoniloxilo, 4-metilfenilsulfoniloxilo e 21 semelhantes. A reação pode ser realizada num solvente inerte à reação tal como, por exemplo, um álcool, por exemplo metanol, etanol, 2-metoxi-etanol, propanol, butanol e semelhantes/ um éter, por exemplo 4,4-dioxano, 1,1'-oxibispropano e semelhantes; uma cetona, por exemplo 4-metil-2-pentanona; ou N,N-dimetilformamida, nitrobenzeno, acetonitrilo e semelhantes. A adição de uma base apropriada tal como, por exemplo, um carbonato ou hidrogenocarbonato de metal alcalino ou alcalinoterroso, por exemplo trietilamina ou carbonato de sódio, pode ser utilizada para capturar o ácido que é libertado durante o decorrer da reação. Pode ser adicionada uma pequena quantidade de um iodeto de metal apropriado, por exemplo, iodeto de sódio ou potássio para promover a reação. A agitação pode melhorar a velocidade da reação. A reação pode ser convenientemente realizada a uma temperatura que varia entre a temperatura ambiente e a temperatura de refluxo da mistura reacional e, se desejado, a reação pode ser realizada a uma pressão aumentada.

R aíquiiCj

R (CH2)n—N—(CHjXíj- f (Π-c)

g) De uma maneira idêntica, os intermediários de fórmula (II-c) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (XII) com um intermediário de fórmula (XIII), em que W é um grupo de saida apropriado como descrito acima. 22 àlquiíC,4s-

D

(XÍIÍ) aiquilCj.j ""0'

Os intermediários de fórmula (VI) podem ser preparados fazendo reagir o intermediário de fórmula (VII) com piperidina num solvente adequado por exemplo diclorometano.

Os intermediários de fórmula (VII) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (VIII) com um intermediário de fórmula (III), na presença de reagentes apropriados tais como monocloridrato de Ν'-(etilcarbonimidoil)-N, N-dimetil-1,3-propanodiamina (EDO) e 1-hidroxi-lfí-benzotriazole (HOBT). A reação pode ser realizada na presença de uma base tal como trietilamina, num solvente adequado, tal como, uma mistura de diclorometano e tetra-hidrofurano. 23

Os intermediários de fórmula (VIII) podem ser preparados fazendo reagir um intermediário de fórmula (IX) com um intermediário de fórmula (IV), em que R1 é hidrogénio, aqui referido como intermediários de fórmula (IV-a), na presença de hidróxido de sódio, num solvente adequado, tal como tetra-hidrofurano, seguida de neutralização com ácido cloridrico e adição de carbonato de sódio.

Os compostos de fórmula (I) e alguns dos intermediários podem ter pelo menos um centro estereogénico na sua estrutura. Este centro estereogénico pode estar presente numa configuração R ou S. 24

Os compostos de fórmula (I) como preparados nos processos descritos acima são geralmente misturas racémicas de enantiómeros, os quais podem ser separados um do outro segundo procedimentos de resolução conhecidos na técnica. Os compostos racémicos de fórmula (I) podem ser convertidos nas correspondentes formas de sal diastereoméricas por reação com um ácido quiral adequado. As referidas formas de sal diastereoméricas são subsequentemente separadas, por exemplo, por cristalização seletiva ou fracionada e os enantiómeros são libertados daquelas por um álcali. Uma maneira alternativa de separar as formas enantioméricas dos compostos de fórmula (I) envolve cromatografia liquida utilizando uma fase estacionária quiral. As referidas formas estereoquimicamente isoméricas puras também podem ser derivadas das correspondentes formas estereoquimicamente isoméricas puras dos materiais de partida apropriados, desde que a reação ocorra estereoespecificamente. Preferencialmente, se é desejado um estereoisómero especifico, o referido composto seria sintetizado por métodos de preparação estereoespecificos. Estes métodos utilizarão vantajosamente materiais de partida enantiomericamente puros.

Os compostos de fórmula (I) , os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereoisoméricas destes têm propriedades farmacológicas valiosas por terem um efeito inibidor da histona-desacetilase (HDAC).

Esta invenção proporciona um método para inibir o crescimento anormal de células, incluindo células transformadas, administrando uma quantidade eficaz de um composto da invenção. Crescimento anormal de células refere-se ao crescimento de células independente dos mecanismos reguladores normais (por exemplo perda de 25 inibição por contacto). Isto inclui a inibição do crescimento de tumores tanto diretamente provocando a paragem do crescimento, a diferenciação terminal e/ou apoptose de células cancerosas, e indiretamente, inibindo a neovascularização de tumores.

Esta invenção também proporciona um método para inibir o crescimento de tumores administrando uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por exemplo um mamífero (e mais particularmente um humano) necessitado desse tratamento. Em particular, esta invenção proporciona um método para inibir o crescimento de tumores através da administração de uma quantidade eficaz dos compostos da presente invenção. Exemplos de tumores que podem ser inibidos, mas não se limitam a, cancro do pulmão (por exemplo adenocarcinoma e incluindo cancro das células não pequenas do pulmão), cancros pancreáticos (por exemplo carcinoma pancreático tal como, por exemplo carcinoma pancreático exócrino), cancros do cólon (por exemplo carcinomas colorretais, tais como, por exemplo, adenocarcinoma do cólon e adenoma do cólon), cancro da próstata incluindo a doença avançada, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide (por exemplo leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt), leucemias mieloides (por exemplo, leucemia mieloide aguda (AML)), cancro folicular da tireoide, síndrome mielodisplásica (MDS), tumores de origem mesenquimal (por exemplo fibrossarcomas e rabdomiossarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumor benigno da pele (por exemplo queratocantomas), carcinoma da mama (por exemplo cancro da mama avançado), carcinoma do rim, carcinoma do ovário, carcinoma da bexiga e carcinoma epidérmico. 26 0 composto de acordo com a invenção pode ser utilizado para outros fins terapêuticos, por exemplo: a) a sensibilização de tumores à radioterapia administrando o composto de acordo com a invenção antes, durante ou após irradiação do tumor para o tratamento cancro; b) tratamento de artropatias e condições osteopatológicas tais como artrite reumatoide, osteoartrite, artrite juvenil, gota, poliartrite, artrite psoriática, espondilite anquilosante e lúpus eritematoso disseminado; c) inibição da proliferação de células do músculo liso incluindo distúrbios vasculares proliferativos, aterosclerose e restenose; d) tratamento de condições inflamatórias e condições dérmicas tais como colite ulcerosa, doença de Crohn, rinite alérgica, doença do enxerto contra o hospedeiro, conjuntivite, asma, ARDS, doença de Behcet, rejeição de transplante, urticária, dermatite alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczema, dermatomiosite, acne, diabetes, lúpus eritematoso sistémico, doença de Kawasaki, esclerose múltipla, enfisema, fibrose quistica e bronquite crónica; e) tratamento de endometriose, fibromas uterinos, sangramento uterino disfuncional e hiperplasia do endométrio; f) tratamento de vascularização ocular incluindo vasculopatia que afeta os vasos retinianos e coroidais; g) tratamento de uma disfunção cardiaca; h) inibição de condições imunossupressoras tais como o tratamento de infeções por HIV; i) tratamento de disfunção renal; j) supressão de distúrbios endócrinos; k) inibição da disfunção de gliconeogénese; 27 l) tratamento de uma neuropatologia por exemplo doença de Parkinson ou uma neuropatologia que resulta num distúrbio cognitivo, por exemplo, doença de Alzheimer ou doenças neuronais relacionadas com poliglutamina; m) tratamento de distúrbios psiquiátricos por exemplo esquizofrenia, distúrbio bipolar, depressão, ansiedade e psicose; n) inibição de uma patologia neuromuscular, por exemplo, esclerose lateral amiotrófica; o) tratamento de atrofia muscular espinhal; p) tratamento de outras condições patológicas recetivas a tratamento através da potenciação da expressão de um gene; q) melhoramento da terapia de genes; r) inibição de adipogénese; s) tratamento de parasitose tal como a malária.

Assim, a presente invenção divulga os compostos de fórmula (I) para serem utilizados como um fármaco, bem como a utilização destes compostos de fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento uma ou mais das condições supramencionadas.

Os compostos de fórmula (I), os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e formas estereoisoméricas destes podem ter propriedades diagnósticas valiosas pelo facto de poderem ser utilizados para detetar ou identificar uma HDAC numa amostra biológica compreendendo detetar ou medir a formação de um complexo entre um composto marcado e uma HDAC.

Os métodos de deteção ou identificação podem utilizar compostos que estão marcados com agentes de marcação tais como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias luminosas, etc. Os exemplos de radioisótopos 28 incluem 125I, 131I, 3H e 14C. As enzimas são geralmente tornadas detetáveis por conjugação de um substrato apropriado, o qual, por sua vez, catalisa uma reação detetável. Exemplos daquelas incluem, por exemplo, beta-galactosidase, beta-glucosidase, fosfatase alcalina, peroxidase e malato-desidrogenase, preferencialmente peroxidase de rábano silvestre. As substâncias luminosas incluem, por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, aequorina e luciferase.

As amostras biológicas podem ser definidas como tecido corporal ou fluidos corporais. Exemplos de fluidos corporais são liquido cefalorraquidiano, sangue, plasma, soro, urina, expetoração, saliva e semelhantes.

Face às suas propriedades farmacológicas úteis, os compostos objeto podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para fins de administração.

Para preparar as composições farmacêuticas desta invenção, uma quantidade eficaz de um composto particular, na forma de base ou sal de adição de ácido, como o ingrediente ativo é combinado em mistura íntima com um veículo farmaceuticamente aceitável, veículo esse que pode tomar uma grande variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração. Estas composições farmacêuticas estão, de modo desejável, na forma de dosagem unitária adequada, preferencialmente, para administração por via oral, por via retal, por via percutânea ou por injeção parentérica. Por exemplo, ao preparar as composições na forma de dosagem oral, pode utilizar-se qualquer um dos meios farmacêuticos habituais, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois e semelhantes no caso de preparações orais líquidas tais como suspensões, 29 xaropes, elixires e soluções; ou veiculos sólidos tais como amidos, açúcares, caulino, lubrificantes, aglutinantes, desintegrantes e semelhantes no caso de pós, pílulas, cápsulas e comprimidos.

Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma unitária de dosagem oral mais vantajosa, em cujo caso são obviamente utilizados veículos farmacêuticos sólidos. Para composições parentéricas, o veículo compreenderá geralmente água estéril, pelo menos em grande parte, embora possam ser incluídos, por exemplo, outros ingredientes para ajudar à solubilidade. Por exemplo, podem ser preparadas soluções injetáveis, nas quais o veículo compreende soro fisiológico, solução de glucose ou uma mistura de soro fisiológico e solução de glucose. Também podem ser preparadas suspensões injetáveis em cujo caso podem ser utilizados veículos líquidos, agentes de suspensão apropriados e semelhantes. Nas composições adequadas para administração percutânea, o veículo compreende opcionalmente um promotor de penetração e/ou um humectante adequado, opcionalmente combinado com aditivos adequados de qualquer natureza em proporções mais pequenas, aditivos esses que não provocam um efeito prejudicial significativo na pele. Os referidos aditivos podem facilitar a administração na pele e/ou podem ser úteis para preparar as composições desejadas. Estas composições podem ser administradas de várias maneiras, por exemplo, como um adesivo transdérmico, como uma unção puntiforme ou como uma pomada. É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas supramencionadas na forma unitária de dosagem para facilidade a administração e uniformidade da dosagem. Forma unitária de dosagem como utilizada na especificação e 30 nas reivindicações aqui refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo farmacêutico necessário. Exemplos de tais formas unitárias de dosagem são os comprimidos (incluindo comprimidos com ranhura ou revestidos), cápsulas, pilulas, saquetas com pó, hóstias, soluções ou suspensões injetáveis, medidas de colher de chá cheia, medidas de colher de sopa cheia e semelhantes, e múltiplos segregados destes.

Os especialistas na técnica poderiam determinar facilmente a quantidade eficaz a partir dos resultados dos ensaios apresentados a seguir. Em geral, considera-se que uma quantidade terapeuticamente eficaz seria desde 0,005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, e em particular desde 0,005 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Pode ser apropriado administrar a dose necessária como duas, três, quatro ou mais sub-doses em intervalos apropriados ao longo do dia. As referidas sub-doses podem ser formuladas como formas de dosagem unitária, por exemplo, contendo 0,5 a 500 mg, e em particular 10 mg a 500 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária.

Como outro aspeto da presente invenção é considerada uma associação de um inibidor de HDAC com outro agente anticancerigeno, especialmente para ser utilizado como um medicamento, mais especificamente no tratamento de cancro ou doenças relacionadas.

Para o tratamento das condições acima, os compostos da invenção podem ser vantajosamente utilizados em associação com um ou mais de outros agentes medicinais, mais 31 particularmente, com outros agentes anticancerigenos. São exemplos de agentes anticancerigenos: compostos de coordenação de platina por exemplo cisplatina, carboplatina ou oxaliplatina; compostos de taxano por exemplo paclitaxel ou docetaxel; inibidores da topoisomerase I tais como compostos de camptotecina por exemplo irinotecano ou topotecano; inibidores da topoisomerase II tais como derivados de podofilotoxina antitumorais por exemplo etoposido ou teniposido; alcaloides de vinca antitumorais por exemplo vinblastina, vincristina ou vinorelbina; derivados de nucleósidos antitumorais por exemplo 5-fluorouracilo, gencitabina ou capecitabina; agentes alquilantes tais como mostarda de azoto ou nitrosoureia por exemplo ciclofosfamida, clorambucil, carmustina ou lomustina; derivados de antraciclina antitumorais por exemplo daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina ou mi toxantrona; anticorpos contra HER2 por exemplo trastuzumab; antagonistas do recetor de estrogénio ou moduladores seletivos do recetor de estrogénio por exemplo tamoxifeno, toremifeno, droloxifeno, faslodex ou raloxifeno; inibidores de aromatase tais como exemestano, anastrozole, letrazole e vorozole; agentes de diferenciação tais como retinoides, vitamina D e agentes bloqueadores do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA) por exemplo accutane; inibidores de metil-transferase do ADN por exemplo azacitidina; 32 inibidores de cinase por exemplo flavoperidol, mesilato de imatinib ou gefitinib; inibidores de farnesil-transferase; outros inibidores de HDAC; inibidores da via de ubiquitina-proteassoma por exemplo Velcade; ou Yondelis. 0 termo "composto de coordenação de platina" é aqui utilizado para denotar qualquer composto de coordenação de platina que inibe o crescimento de células tumorais, o qual proporciona platina na forma de um ião. 0 termo "compostos de taxano" indica uma classe de compostos possuindo o sistema de anel de taxano e relacionado ou derivado de extratos de certas espécies de árvores de teixo (Taxus). 0 termo "inibidores de topisomerase" é utilizado para indicar enzimas que são capazes de alterar a topologia do ADN em células eucariotas. Elas são criticas para funções celulares importantes e para a proliferação celular. Existem duas classes de topoisomerases nas células eucariotas, nomeadamente as de tipo I e tipo II. A topoisomerase I é uma enzima monomérica de aproximadamente 100 000 de peso molecular. A enzima liga-se ao ADN e introduz uma quebra de cadeia simples transitória, desenrola a hélice dupla (ou permite que se desenrole) e fecha subsequentemente a quebra antes de se dissociar da cadeia de ADN. A topisomerase II tem um mecanismo de ação semelhante que envolve a indução de quebras da cadeia de ADN ou a formação de radicais livres. 33 0 termo "compostos de camptotecina" é utilizado para indicar compostos que estão relacionados ou são derivados do composto parental camptotecina que é um derivado de alcaloide insolúvel em água da árvore chinesa Camptotecina acuminata e da árvore indiana Nothapodytes foetida. 0 termo "compostos de podofilotoxina" é utilizado para indicar compostos que estão relacionados ou são derivados da podofilotoxina parental, a qual é extraída da planta mandrágora. 0 termo "alcaloides de vinca antitumorais" é utilizado para indicar compostos que estão relacionados ou são derivados de extratos da planta pervinca (Vinca rosea). 0 termo "agentes alquilantes" abrange um grupo diversificado de substâncias químicas que têm a característica comum de terem a capacidade de contribuir, em condições fisiológicas, com grupos alquilo para macromoléculas biologicamente vitais tais como o ADN. Na maioria dos agentes importantes, tais como as mostardas de azoto e as nitrosoureias, as unidades de alquilação ativas são geradas in vivo após reações degradativas complexas, algumas das quais são enzimáticas. As ações farmacológicas mais importante dos agentes alquilantes são aquelas que perturbam o mecanismos fundamental relacionado com a proliferação celular em particular a síntese de ADN e a divisão celular. A capacidade dos agentes alquilantes para interferir coma função e integridade do ADN em tecidos em proliferação rápida proporciona a base para as suas aplicações terapêuticas e para muitas das suas propriedades tóxicas. 34 0 termo "derivados de antraciclina antitumorais" compreendem antibióticos obtidos a partir do fungo Strep. peuticus var. caesius e seus derivados, caracterizados por possuírem uma estrutura de anel de tetraciclina com um açúcar invulgar, daunosamina, ligado por uma ligação glicosidica.

Foi demonstrado que a amplificação da proteina do recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER 2) em carcinomas primários da mama correlaciona com um mau prognóstico clinico para certos doentes. 0 trastuzumab é um ADN recombinante extremamente purificado derivado do anticorpo monoclonal IgG 1 kappa humanizado que se liga com alta afinidade e especificidade ao dominio extracelular do recetor HER2.

Muitos cancros da mama têm recetores de estrogénio e o crescimento destes tumores pode ser estimulado pelo estrogénio. Os termos "antagonistas do recetor de estrogénio" e "moduladores seletivos do recetor de estrogénio" são utilizados para indicar inibidores competitivos da ligação de estradiol ao recetor de estrogénio (ER) . Os moduladores seletivos do recetor de estrogénio, quando ligados ao ER, induzem uma alteração na forma tridimensional do recetor, modulando a sua ligação ao elemento sensível a estrogénio (ERE) no ADN.

Em mulheres pós-menopáusicas, a principal fonte de estrogénio circulante é a conversão de androgénios suprarrenais e ovarianos (androstenodiona e testosterona) em estrogénios (estrona e estradiol) pela enzima aromatase em tecidos periféricos. A privação de estrogénio através da inibição ou inativação da aromatase é um tratamento eficaz 35 e seletivo para algumas doentes pós-menopáusicas com cancro da mama hormonodependente. 0 termo "agente antiestrogénio" é aqui utilizado para incluir não só os antagonistas do recetor de estrogénio e moduladores seletivos do recetor de estrogénio mas também os inibidores de aromatase como discutidos acima. 0 termo "agentes de diferenciação" abrangem compostos que podem, de várias maneiras, inibir a proliferação celular e induzir a diferenciação. Sabe-se que a vitamina D e os retinoides desempenham um papel principal na regulação do crescimento e diferenciação de uma grande variedade de tipos de células normais e malignas. Os agentes bloqueadores do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA's) aumentam os niveis de ácidos retinóicos endógenos inibindo o catabolismo de ácidos retinóicos mediado pelo citocromo P450 .

As alterações de ADN por metilação estão entre as anormalidades mais comuns na neoplasia humana. A hipermetilação em promotores de genes selecionados está geralmente associada a inativação dos genes envolvidos. 0 termo "inibidores de metil-transferase do ADN" é utilizado para indicar compostos que atuam através da inibição farmacológica da metil-transferase do ADN e reativação da expressão do gene supressor de tumores. 0 termo "inibidores de cinase" compreende inibidores potentes das cinases que estão envolvidas na progressão do ciclo celular e morte celular programada (apoptose). 0 termo "inibidores da farnesil-transferase" é utilizado para indicar compostos que foram concebidos para prevenir a 36 farnesilação de Ras e outras proteínas intracelulares. Foi demonstrado que aqueles têm efeito na proliferação e sobrevivência de células malignas. 0 termo "outros inibidores de HDAC" compreende mas não se limita a: carboxilatos por exemplo butirato, ácido cinâmico, 4-fenilbutirato ou ácido valpróico; ácidos hidroxâmicos por exemplo ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), análogos de SAHA contendo piperazina, biaril-hidroxamato A-161906 e seus análogos de éter de carbozolilo, tetra-hidropiridina e tetralona, aril-N-hidroxicarboxamidas bicíclicas, piroxamida, CG-1521, PXD-101, ácido sulfonamida hidroxâmico, LAQ-824, LBH-589, tricostatina A (TSA), oxamflatina, escriptaide, moléculas tricíclicas relacionadas com escriptaide, ácido m-carboxi-cinâmico bis-ácido hidroxâmico (CBHA), ácidos hidroxâmicos tipo CBHA, análogo de ácido trapoxina-hidroxâmico, R306465 e ácidos benzoil- e heteroaril-hidroxâmicos relacionados, aminossuberatos e malonildiamidas; tetrapéptidos cíclicos por exemplo trapoxina, apidicina, depsipéptido, compostos relacionados com espirucostatina, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos contendo sulfidrilo (SCOPs), tetrapéptidos cíclicos contendo ácido hidroxâmico (CHAPs), TAN-174s e azumamidas; benzamidas por exemplo MS-275 ou CI-994, ou depudecina. O termo "inibidores da via de ubiquitina-proteassoma" é utilizado para identificar compostos que inibem a destruição direcionada de proteínas celulares no proteassoma, incluindo proteínas reguladoras do ciclo celular. 37

Para o tratamento de cancro os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados a um doente como descrito acima, conjuntamente com irradiação. Irradiação significa radiação ionizante e em particular radiação gama, especialmente a emitida por aceleradores lineares ou por radionuclideos que são, hoje em dia, de utilização comum. A irradiação do tumor com radionuclideos pode ser externa ou interna. A presente invenção também se refere a uma associação de acordo com a invenção de um agente anticancerigeno e um inibidor de HDAC de acordo com a invenção. A presente invenção também se refere a uma associação de acordo com a invenção para ser utilizada em terapia médica por exemplo para inibir o crescimento de células tumorais. A presente invenção também se refere a uma associação de acordo com a invenção para inibir o crescimento de células tumorais. A presente invenção também se refere a um método de inibição do crescimento de células tumorais num individuo humano, o qual compreende administrar ao individuo uma quantidade eficaz de uma associação de acordo com a invenção.

Esta invenção proporciona ainda um método para inibir o crescimento anormal de células, incluindo células transformadas, administrando uma quantidade eficaz de uma associação de acordo com a invenção. 38 0 outro agente medicinal e o inibidor de HDAC podem ser administrados simultaneamente (por exemplo em composições separadas ou unitárias) ou sequencialmente por qualquer ordem. No último caso, os dois compostos serão administrados dentro de um período e numa quantidade e modo que é suficiente para garantir que é conseguido um efeito vantajoso ou sinérgico. Entender-se-á que o método e ordem de administração preferidos e as respetivas quantidades e regimes de dosagem para cada componente da associação dependerão do outro agente medicinal e do inibidor de HDAC particulares a serem administrados, da sua via de administração, do tumor particular a ser tratado e do hospedeiro particular a ser tratado. 0 método e ordem de administração ótimos e as quantidades e regime de dosagem podem ser facilmente determinados pelos especialistas na técnica utilizando métodos convencionais e face à informação aqui fornecida. 0 composto de coordenação de platina é vantajosamente administrado numa dosagem de 1 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 50 a 400 mg/m2, em particular para a cisplatina numa dosagem de cerca de 75 mg/m2 e para a carboplatina a cerca de 300 mg/m2 por ciclo de tratamento. O composto de taxano é vantajosamente administrado numa dosagem de 50 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 75 a 250 mg/m2, em particular para o paclitaxel numa dosagem de cerca de 175 a 250 mg/m2 e para o docetaxel a cerca de 75 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamento. O composto de camptotecina é vantajosamente administrado numa dosagem de 0,1 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de 39 área de superfície corporal, por exemplo 1 a 300 mg/m2, em particular para o irinotecano numa dosagem de cerca de 100 a 350 mg/m2 e para o topotecano a cerca de 1 a 2 mg/m2 por ciclo de tratamento. O derivado de podofilotoxina antitumoral é vantajosamente administrado numa dosagem de 30 a 300 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 50 a 250 mg/m2, em particular para o etoposido numa dosagem de cerca de 35 a 100 mg/m2 e para o teniposido a cerca de 50 a 250 mg/m2 por ciclo de tratamento. O alcaloide de vinca antitumoral é vantajosamente administrado numa dosagem de 2 a 30 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, em particular para a vinblastina numa dosagem de cerca de 3 a 12 mg/m2 , para a vincristina numa dosagem de cerca de 1 a 2 mg/m2 e para a vinorelbina numa dosagem de cerca de 10 a 30 mg/m2 por ciclo de tratamento. O derivado de nucleósido antitumoral é vantajosamente administrado numa dosagem de 200 a 2500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 700 a 1500 mg/m2, em particular para o 5-FU numa dosagem de 200 a 500mg/m2, para a gencitabina numa dosagem de cerca de 800 a 1200 mg/m2 e para a capecitabina a cerca de 1000 a 2500 mg/m2 por ciclo de tratamento.

Os agentes alquilantes tais como a mostarda de azoto ou a nitrosoureia são vantajosamente administrados numa dosagem de 100 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 120 a 200 mg/m2, em particular para a ciclofosfamida numa dosagem de cerca de 100 a 500 mg/m2, para o clorambucil numa dosagem de cerca 40 de 0,1 a 0,2 mg/kg, para a carmustina numa dosagem de cerca de 150 a 200 mg/m2 e para a lomustina numa dosagem de cerca de 100 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamento. O derivado de antraciclina antitumoral é vantajosamente administrado numa dosagem de 10 a 75 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo 15 a 60 mg/m2, em particular para a doxorrubicina numa dosagem de cerca de 40 a 75 mg/m2, para a daunorrubicina numa dosagem de cerca de 25 a 45mg/m2 e para a idarrubicina numa dosagem de cerca de 10 a 15 mg/m2 por ciclo de tratamento. 0 trastuzumab é vantajosamente administrado numa dosagem de 1 a 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, particularmente 2 a 4 mg/m2 por ciclo de tratamento. O agente antiestrogénio é vantajosamente administrado numa dosagem de cerca de 1 a 100 mg diários dependendo do agente particular e da condição a ser tratada. O tamoxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de 5 a 50 mg, preferencialmente 10 a 20 mg duas vezes por dia, prosseguindo a terapia por tempo suficiente para alcançar e manter um efeito terapêutico. O toremifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez por dia, prosseguindo a terapia por tempo suficiente para alcançar e manter um efeito terapêutico. O anastrozole é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 1 mg uma vez por dia. O droloxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 20-100 mg uma vez por dia. O raloxifeno é vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez por dia. O exemestano é 41 vantajosamente administrado por via oral numa dosagem de cerca de 25 mg uma vez por dia.

Estas dosagens podem ser administradas por exemplo uma vez, duas vezes ou mais por ciclo de tratamento, a gual pode ser repetido, por exemplo, a cada 7, 14, 21 ou 28 dias.

Face às suas propriedades farmacológicas úteis, os componentes das associações de acordo com a invenção, isto é, o outro agente medicinal e o inibidor de HDAC podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para efeitos de administração. Os componentes podem ser formulados separadamente em composições farmacêuticas individuais ou numa composição farmacêutica unitária contendo ambos os componentes.

Por conseguinte, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o outro agente medicinal e o inibidor de HDAC em conjunto com um ou mais veiculos farmacêuticos. A presente invenção também se refere a uma associação de acordo com a invenção na forma de uma composição farmacêutica compreendendo um agente anticancerigeno e um inibidor de HDAC de acordo com a invenção em conjunto com um ou mais veiculos farmacêuticos. A presente invenção refere-se ainda à utilização de uma associação de acordo com a invenção no fabrico de uma composição farmacêutica para inibir o crescimento de células tumorais. A presente invenção refere-se ainda a um produto contendo como primeiro ingrediente ativo um inibidor de HDAC de 42 acordo com a invenção e como segundo ingrediente ativo um agente anticancerigeno, como uma preparação de associação para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento de doentes que sofrem de cancro.

Parte experimental

Os exemplos que se seguem são proporcionados para efeitos de ilustração. A seguir, "DCM" é definido como diclorometano, "DIPE" é definido como éter diisopropilico, "DMA" é definido como N,N-dimetilacetamida, "DMSO" é definido como dimetilsulfóxido, "EDO" é definido como monocloridrato de Ν' - (etilcarbonimidoil) -N, IV-dimetil-1,3-propanodiamina, "AcOEt" é definido como acetato de etilo, "EtOH" é definido como etanol, "HOBt" é definido como l-hidroxi-lH-benzotriazole, "MeOH" é definido como metanol, "TFA" é definido como ácido trifluoroacético e "THF" é definido como tetra-hidrofurano.

A. Preparação dos compostos intermediários Exemplo AI a) Preparação do intermediário 1

o

Uma mistura de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinacarboxílico, éster etilico (0,0114 mol), 1-metil-lfí-indole-3-carboxaldeído (0,017 mol) e MgS04 (0,5 g) em 43

MeOH (80mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 15 horas, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. Foi adicionado tetra-hidroborato de sódio (0,018 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente 5 horas, vertida para água e extraida com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (6,6g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 94/6/0,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 4,3g (90%) de intermediário 1. b) Preparação do intermediário 2

.Na

Uma mistura de intermediário 1 (0,0037 mol) e hidróxido de sódio (0,0074 mol) em EtOH (60 mL) foi agitada a 50°C durante 15 horas, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e o solvente foi evaporado até à secura, produzindo l,5g (100%) de intermediário 2. c) Preparação do intermediário 3

o

Adicionou-se EDC (0,0075 mol), em seguida HOBt (0,0075 mol) depois O-(tetra-hidro-2fí-piran-2-il)-hidroxilamina (0,015 mol) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 2 (0,005 mol) em DCM (100 mL) e THF (100 mL) sob fluxo de 44 N2. A mistura foi agitada a 40°C durante 4 horas, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (4g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/Me0H/NH40H 96/410,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo lg (42%) de intermediário 3. Uma fração (0,051 g) foi cristalizada de DIPE. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,03g de intermediário 3, ponto de fusão 70°C.

Exemplo A2 a) Preparação do intermediário 4

Uma mistura de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,0072 mol) em THF (40 mL) e hidróxido de sódio IN (40 mL) foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Foi adicionado ácido clorídrico IN (40 mL) . A mistura foi agitada durante 10 minutos. Foi adicionado carbonato de sódio (0,0216 mol). A mistura foi agitada durante 10 minutos. Foi adicionada 1-[[(9-ff-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona (0,0072 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 6 horas, em seguida arrefecida até 0°C e acidificada com ácido clorídrico. O precipitado foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco, produzindo 4,lg (100%) de intermediário 4. b) Preparação do intermediário 5 45 ο

Adicionou-se trietilamina (0,02 mol), EDC (0,0082 mol) e HOBt (0,0082 mol) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 4 (0,0068 mol) em DCM/THF (200 mL) sob fluxo

de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2lí-piran-2-il) -hidroxilamina (0,0082 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com NaHCCt 10%, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (4g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 3,4g (89%) de intermediário 5. c) Preparação do intermediário 6

o

Uma mistura de intermediário 5 (0,0355 mol) e piperidina (0, 089 mol) em DCM (400 mL) foi agitada a 35°C durante 72 horas. O solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 80/20/2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 6,7g (56%). Parte do resíduo (0,7 9g) foi cristalizado de éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0, 62g de intermediário 6, ponto de fusão 129°C. 46 d) Preparação do intermediário 7

Cl

Uma mistura de intermediário 6 (0,0009 mol) e 5-cloro-lH- indole-3-carboxaldeído (0,0012 mol) em 1,2-dicloro-etano (30 mL) foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Foi adicionado tris(acetato-α-Ο)hidro-borato(1-), sódio (0,0013 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, vertida para água/NaOH 3N e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,5 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente DCM/MeOH/NlUOH 93/7/0,5). Foram recolhidas duas frações e o solvente foi evaporado, produzindo 0,07g (16%) de intermediário 7 .

Exemplo A3 a) Preparação do intermediário 8

---’

Uma solução de ácido 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,094 mol) em acetonitrilo (40 mL) foi adicionada a 10°C a uma suspensão de 4-piperidinametanol (0,086 mol) e carbonato de potássio (0,172 mol) em acetonitrilo (200 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi trazida até à temperatura ambiente, em seguida 47 agitada durante 4 horas, vertida para água e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCU) , filtrada e o solvente foi evaporado. 0 resíduo (23 g) foi cristalizado de acetonitrilo/éter dietílico. 0 precipitado foi filtrado e seco, produzindo 7,8g (34%) de intermediário 8. A camada-mãe foi evaporada. 0 resíduo (17g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (20-45ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 4,6g (20%) de intermediário 8, ponto de fusão 12 9 ° C. b) Preparação do intermediário 9 o

O

Adicionou-se trietilamina (0,038 mol), em seguida cloreto de metanossulfonilo (0,025 mol) a 0°C a uma solução de intermediário 8 (0,0189 mol) em DCM (80 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada a 0°C durante 2 horas e vertida para água gelada. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 6,5g (100%) de intermediário 9. c) Preparação do intermediário 10

H

O 48

Uma mistura de intermediário 9 (0,0189 mol), N-metil-lH- indole-3-etanamina (0,0172 mol) e carbonato de potássio (0,0344 mol) em acetonitrilo (180 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 24 horas, vertida para água e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (8,5g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (70-200ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0 a 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo l,25g (20%) de intermediário 10. d) Preparação do intermediário 11

H

o

Na

Uma mistura de intermediário 10 (0,003 mol) e hidróxido de sódio (0,006 mol) em EtOH (80 mL) foi agitada e submetida a refluxo de um dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e o solvente foi evaporado até à secura, produzindo l,3g (100%) de intermediário 11, p.f. >2 60 °C. e) Preparação do intermediário 12

H

O 49

Adicionou-se EDC (0,0045 mol) em seguida HOBt (0,0045 mol) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 11 (0,003 mol) em THF (100 mL) e DCM (100 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada O- (tetra-hidro-2íí-piran-2-il) -hidroxilamina (0,012 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (3g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40ym)(eluente: DCM/MeOHNH4OH 94/6/0,1;). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. O residuo (0,82g) foi retomado em éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,78g de intermediário 12, ponto de fusão 154°C.

Exemplo A4 a) Preparação do intermediário 13

H

o

Uma mistura de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinacarboxí lico, éster etílico (0,0049 mol), 1H-indole-3-etanol, metanossulfonato (éster) (0,0054 mol) e carbonato de potássio (0,01 mol) em acetonitrilo (20 mL) foi agitada e submetida a refluxo de um dia para o outro, em seguida arrefecida, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (2,2g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel 50 (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,442g (22%) de intermediário 13, ponto de fusão 238 °C. b) Preparação do intermediário 14

H

Uma mistura de intermediário 13 (0,0025 mol), (2-

bromoetoxi) (1, 1-dimetiletil)dimetil-silano (0,0034 mol) e N-etil-N- (1-metiletil)-2-propanamina (0,0038 mol) em DMSO (20 mL) foi agitada a 50°C durante 15 horas, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,7g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,76g (54%) de intermediário 14. c) Preparação do intermediário 15

H

Uma mistura de intermediário 14 (0,0013 mol) e hidróxido de sódio (0,0027 mol) em EtOH (40 mL) foi agitada a 80°C de um 51 dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e o solvente foi evaporado, produzindo 0,75g (100%) de intermediário 15. d) Preparação do intermediário 16

H

Adicionou-se EDC (0,002 mol) em seguida HOBt (0,002 mol) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 15 (0,0013 mol) em THF (80 mL) e DCM (80 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2ií-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0068 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCg), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,3g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym )(eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,38g de intermediário 16. e) Preparação do intermediário 17

H

O

Uma mistura de intermediário 16 (0,0011 mol) e fluoreto de tetrabutilamónio (0,0032 mol) em THF (10 mL) foi agitada à 52 temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraida com AcOEt. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 0,5g (88%) de intermediário 17.

Exemplo A5 a) Preparação do intermediário 45 o

Uma solução de ácido 2-cloro-5-pirimidinacarboxilico, éster metilico (0,058 mol) em DMA (80 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de 4-piperidinametanamina (0,116 mol) e N-etildiisopropilamina (0,145 mol) em DMA (150 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e 30 minutos, vertida para água gelada e extraida com AcOEt, em seguida com DCM. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo foi cristalizado de DIPE. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo lOg (65%) de intermediário 45. b) Preparação do intermediário 46 o,

o V-o 53

Uma mistura de intermediário 45 (0,0024 mol), l-metil-5- nitro-lfí-indole-3-carboxaldeído (0,0036 mol) e MgS04 (0,25g) em MeOH (80 mL) foi agitada a 60°C de um dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. Adicionou-se tetra-hidroborato de sódio (0,0041 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, vertida para água e extraida com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,lg) foi cristalizado de acetonitrilo. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,9g (86%) de intermediário 46, ponto de fusão: 150 °C. c) Preparação do intermediário 47 9'

Uma mistura de intermediário 46 (0,002 mol) e hidróxido de sódio (0,008 mol) em EtOH (60 mL) foi agitada a 60°C de um dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e evaporada. O resíduo foi retomado em éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,6g (67%) de intermediário 47. d) Preparação do intermediário 48

54

Adicionou-se EDC (0,0019 mol) e HOBt (0,0019 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 47 (0,0013 mol) e trietilamina (0,0039 mol) em DCM/THF (50/50) (100 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada 0-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0026 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (lg) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0,2 a 92/8/0,2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,101g (15%) de intermediário 48.

Exemplo A6 a) Preparação do intermediário 49 o

Uma solução de ácido 2-cloro-5-pirimidinacarboxílico, éster metilico (0,033 mol) em DCM (80 mL) foi adicionada à temperatura ambiente a uma solução de 4-piperidinametanol (0,066 mol) e IV-etildiisopropilamina (0,083 mol) em DCM (100 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas e 30 minutos, vertida para água gelada e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo foi retomado em pentano. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 7,88g (95%) de intermediário 49. 55 b) Preparação do intermediário 50 55 o

Adicionou-se DMSO (0,058 mol) gota a gota a -78°C a uma solução de dicloreto de etanodioilo (0,0278 mol) em DCM (50 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 15 minutos. Foi adicionada uma solução de intermediário 49 (0,023 mol) em DCM (200 mL) gota a gota. A mistura foi agitada a -78°C durante 1 hora e 30 minutos. Foi adicionada trietilamina (0,118 mol) gota a gota. A mistura foi agitada a -78°C durante 1 hora, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi cristalizado de éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 3,06g (54%) de intermediário 50. c) Preparação do intermediário 51 o

Adicionou-se o intermediário 50 (0,0122 mol) a 5°C a uma

solução de l-metil-lfí-indole-3-etanamina (0,0122 mol) em MeOH (270 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada alguns minutos. Foram adicionados cianoboro-hidreto de sódio (0,0183 mol) e ácido acético (0,0183 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para carbonato de potássio a 10% e extraida com DCM. A 56 camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. 0 resíduo (4,9g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo l,2g (24%) de intermediário 51. d) Preparação do intermediário 52

Uma mistura de intermediário 51 (0,0009 mol) e hidróxido de sódio (0,0039 mol) em EtOH (60 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 15 horas, em seguida evaporada até à secura, produzindo o intermediário 52. Este intermediário foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. e) Preparação do intermediário 53

Adicionou-se HOBt (0,0019 mol) em seguida EDC (0,0019 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 52 (0,0009 mol) e O- (tetra-hidro-2#-piran-2-il) -hidroxilamina (0,0019 mol) em DCM/THF (130 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca 57 (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. 0 resíduo (0,93g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,155g (33%) de intermediário 53.

Exemplo A7 a) Preparação do intermediário 54

Uma mistura de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,0038 mol), 1-etil-lfí-indole-3-carboxaldeido (0, 0049 mol) e Pd/C 10% (0,5g) em MeOH (20 mL) contendo 1 mL de um solução de tiopeno a 10% em EtOH, foi hidrogenada à temperatura ambiente durante 24 horas sob uma pressão de 3 bar, em seguida filtrada sobre celite. O solvente foi evaporado até à secura. O resíduo (1,8 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,2 a 93/7/0,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,7g (44%) de intermediário 54. b) Preparação do intermediário 55

58

Adicionou-se hidreto de sódio a 60% (0,009 mol) a 0°C a uma solução de intermediário 54 (0,0045 mol) em THF (50 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Foi adicionada, gota a gota, uma solução de iodo-etano (0,0062 mol) em THF (10 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro, vertida para água e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,6g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 9515/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,16g (8%) de intermediário 55. c) Preparação do intermediário 56

Uma mistura de intermediário 55 (0,0003 mol) e hidróxido de sódio (0,03g) em EtOH (15 mL) foi agitada a 80°C durante 6 horas, em seguida evaporada até à secura, produzindo 0,16g (100%) de intermediário 56. d) Preparação do intermediário 57

59

Adicionou-se EDC (0,0005 mol) e HOBt (0,0005 mol) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 56 (0,0003 mol) em DCM (20 mL) e THF (20 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 15 minutos. Foi adicionada 0-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0007 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (0,3g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0. 35) . As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,03g (16%) de intermediário 57.

Exemplo A8 a) Preparação do intermediário 58

Adicionou-se hidreto de sódio (0,011 mol) a 5°C a uma solução de intermediário 13 (0,0037 mol) em THF (30 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 30 minutos. Foi adicionada, gota a gota, uma solução de iodometano (0,0081 mol) em THF (10 mL). A mistura foi agitada a 10°C durante 2 horas, em seguida trazida até à temperatura ambiente durante 1 hora e 30 minutos, vertida para água gelada e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (l,7g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (15-40ym) (eluente: DCM/MeOHNH3OH 98/2/0,1). Foram 60 recolhidas duas frações e o solvente foi evaporado, produzindo 0,265g de intermediário 58 e 0,57g (17%) de intermediário 10. b) Preparação do intermediário 59

Uma mistura de intermediário 58 (0,0006 mol) e hidróxido de sódio (0,0012 mol) em EtOH (30 mL) foi agitada a 80°C de um dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e o solvente foi evaporado, produzindo 0,26g (100%) de intermediário 59. c) Preparação do intermediário 60

Adicionou-se EDC (0,0009 mol) e HOBt (0,0009 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 59 (0,0006 mol) em THF (30 mL) e DCM (30 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0012 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCh) ; filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo 61 (0,6g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0,05 e 94/6/0,3). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,lg (33%) de intermediário 60.

Exemplo A9 a) Preparação do intermediário 61

Adicionou-se DMSO (0,127 mol) a -78°C a uma solução de dicloreto de etanodioilo (0,061 mol) em DCM (110 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 15 minutos. Foi adicionada uma solução de intermediário 8 (0,051 mol) em DCM (200 mL) . A mistura foi agitada a -78°C durante 1 hora e 30 minutos. Foi adicionada trietilamina (0,26 mol) gota a gota. A mistura foi agitada a -78°C durante 15 minutos, em seguida trazida até à temperatura ambiente durante 2 horas e 30 minutos. Foi adicionada água. A mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (14g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (20-45ym) (eluente: ciclo-hexano/AcOEt 70/30). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 7,6g (57%) de intermediário 61. b) Preparação do intermediário 62 62

Adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (0,049 mol) e ácido acético (0,034 mL) à temperatura ambiente a uma solução de 5-cloro-l-metil-lfí-Indole-3-etanamina (0,031 mol) e intermediário 61 (0,034 mol) em MeOH (700 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, vertida para carbonato de potássio 10% e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (14,8g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (20-45ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 4,52g (32%) de intermediário 62. c) Preparação do intermediário 63

Adicionou-se cloreto de metanossulfonilo (0,0049 mol) a 5°C a uma solução de intermediário 62 (0,004 mol) e trietilamina (0,008 mol) em DCM (150 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e 0 solvente foi evaporado. 0 resíduo (2 ,39g) foi retomado em 63

Dl PE. 0 precipitado foi filtrado e seco, produzindo l,78g (84%) de intermediário 63, ponto de fusão 162°C. d) Preparação do intermediário 64

Uma mistura de intermediário 63 (0,0032 mol) e hidróxido de sódio (0,0128 mol) em EtOH (150 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 5 horas, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e retomada em éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo l,57g (99%) de intermediário 64, ponto de fusão > 260°C. e) Preparação do intermediário 65

Adicionou-se EDC (0,0064 mol) e HOBt (0,0064 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 64 (0,0032 mol) em THF (160 mL) e DCM (160 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0064 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo 64 (2,7 7 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/N4OH 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. O residuo (0,385g) foi cristalizado de CH3CN/éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,084g de intermediário 65, ponto de fusão 179°C.

Exemplo A 10 a) Preparação do intermediário 66

Uma solução de ácido 2-(metilsulfonil)-5- pirimidinacarboxílico, éster etílico (0,094 mol) em acetonitrilo (240 mL) foi adicionada à temperatura ambiente a uma solução de ácido 4-piperidinil-carbâmico, éster de 1,1-dimetiletilo (0,078 mol) e carbonato de potássio (0,156 mol) em acetonitrilo (120 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro, vertida para água gelada e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi cristalizado de éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 14,4g (53%) de intermediário 66, ponto de fusão 160°C. b) Preparação do intermediário 67

nh2

Y o 65

Adicionou-se TFA (20 mL) a à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 66 (0,0225 mol) em DCM (110 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 horas, vertida para água e basificada com carbonato de potássio. A mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 5,5g (98%) de intermediário 67.

Exemplo All a) Preparação do intermediário 68 r

o·

Adicionou-se hidreto de sódio a 60% em óleo (0,0069 mol) a 0°C a uma solução de ácido 2-metil-lH-indole-3-acético, éster etílico (0,0046 mol) em THF (10 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Foi adicionado iodo-etano (0,006 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas e vertida para AcOEt e NaCl saturado. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado até à secura. O resíduo (l,lg) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: ciclo-hexano/AcOEt 80/20) . As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,73g (65%) de intermediário 68. b) Preparação do intermediário 69 66 r

Uma solução de hidreto de diisobutil-alumínio em tolueno (0,0045 mol) foi adicionada gota a gota a -78°C a uma solução de intermediário 68 (0,003 mol) em DCM (15 mL) e 1,2-dimetoxietano (15 mL) (peneiros moleculares: 3 angstrom) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada a -78°C durante 3 horas, em seguida desativada com HC1 3N e extraida com DCM. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado até à secura, produzindo 0,7g (>100%) de intermediário 69. c) Preparação do intermediário 70 r

Adicionou-se etóxido de titânio (IV) (0,0023 mol) a uma mistura de intermediário 67 (0,0021 mol) e intermediário 69 (0,0021 mol) em 1,2-dicloro-etano (25 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi adicionado tris(acetato-α-Ο)hidro-borato(1-), sódio (0,0023 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, em seguida desativada com NaHCCb e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCU), filtrada e o solvente foi evaporado até à secura. O resíduo (l,2g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (5ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,1). 67

As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,2g (21%) de intermediário 70. d) Preparação do intermediário 71

Uma mistura de intermediário 70 (0,0004 mol) e hidróxido de sódio (0,0009 mol) em EtOH (30 mL) foi agitada a 60°C de um dia para o outro, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e evaporada, produzindo 0,2g (100%) de intermediário 71. e) Preparação do intermediário 72

Adicionou-se EDC (0,0007 mol) e HOBt (0,1 g) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 71 (0,0004 mol) e trietilamina (0,0009 mol) em DCM/THF (40 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0009 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 72 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCh), filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (0,4g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5ym)(eluente: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0,1 a 90/10/1). 68

As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,087g (37%) de intermediário 72.

Exemplo AI2 a) Preparação do intermediário 73

0 intermediário 50 (0,0046 mol) foi adicionada a 5°C a uma solução de 6-metoxi-l-metil-lH-Indole-3-etanamina (0,0046 mol) em MeOH (100 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 30 minutos. Foram adicionados cianoboro-hidreto de sódio (0,0068 mol) em seguida ácido acético (0,0046 mol) em porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para carbonato de potássio 10% e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCh) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (4g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40pm)) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. Uma parte (0,7g) do residuo (2,2g) foi cristalizada de acetonitrilo. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,43g (61 %) de intermediário 73, ponto de fusão 122°C. b) Preparação do intermediário 74 69

Uma mistura de intermediário 73 (0,0015 mol) e hidróxido de sódio (0,006 mol) em EtOH (90 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 8 horas, em seguida evaporada até à secura, produzindo intermediário 74. c) Preparação do intermediário 75

Adicionou-se HOBt (0,003 mol) em seguida EDC (0,003 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 74 (0,0015 mol) e O-(tetra-hidro-2fí-piran-2-il)-hidroxilamina (0,003 mol) em THF/DCM (200 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para água e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,lg) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (10pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,24g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (10ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,5). As frações puras 70 foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,17g (21 %) de intermediário 75.

Exemplo AI3 a) Preparação do intermediário 76

H

Uma mistura de 6-metoxi-lií-indole-3-etanamina (0,053 mol) e 1,3-isobenzofurandiona (0,058 mol) em tolueno (130 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 48 horas, em seguida filtrada. O filtrado foi evaporado, produzindo 5,4g (32%) de intermediário 76. b) Preparação do intermediário 77

Uma solução de intermediário 76 (0,017 mol) em DMF (19 mL) foi adicionada gota a gota à temperatura ambiente a uma suspensão de hidreto de sódio (0,034 mol) em DMF (11 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e 30 minutos. Foi adicionado 1-iodopropano (0,034 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e 15 minutos. Foi adicionado NaCl saturado. A mistura foi extraida com AcOEt. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 4,9g de 71 intermediário 77. Este produto foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. c) Preparação do intermediário 78

Uma mistura de intermediário 77 (0,068 mol) e hidrazina, mono-hidrato (0, 068 mol) em EtOH (60 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 1 hora, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCg) , filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 3,53g de intermediário 78. Este produto foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. d) Preparação do intermediário 79

o

Adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (0,024 mol) e ácido acético (0,0167 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 61 (0,0167 mol) e intermediário 78 (0,015 mol) em MeOH (380 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 30 minutos, vertida para carbonato de potássio 10% e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (8,8 4 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40ym) 72 (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 2,85g (40%) de intermediário 79. e) Preparação do intermediário 80

Uma mistura de intermediário 79 (0,0028 mol), iodo-etano (0,0056 mol) e trietilamina (0,0085 mol) em DMF (60 mL) foi agitada a 50°C durante 7 horas, vertida para água gelada e extraida com AcOEt. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (l,8g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5pm) (eluente: DCM/MeOH 100/0 a 95/5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo l,lg (78%) de intermediário 80. f) Preparação do intermediário 81

.Na

Uma mistura de intermediário 80 (0,0022 mol) e hidróxido de sódio (0,0088 mol) em EtOH (100 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 6 horas, em seguida agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e evaporada até à secura. O residuo foi retomado em éter dietilico. O precipitado foi 73 filtrado e seco, produzindo 0,965g (88%) de intermediário 81, ponto de fusão > 260°C. g) Preparação do intermediário 82

Adicionou-se EDC (0,0038 mol) e HOBt (0,0038 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 81 (0,0019 mol) em THF (100 mL) e DCM (100 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2H-piran-2-il)- hidroxilamina (0,0038 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, vertida para água e extraida com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCg) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,2g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (5ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0,05 a 93/7/0,35). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,114g de intermediário 82.

Exemplo A14 a) Preparação do intermediário 83 o

x .Na 74

Uma mistura de intermediário 62 (0,0034 mol) e hidróxido de sódio (0,0134 mol) em EtOH (150 mL) foi agitada a 80°C durante 3 horas, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e evaporada até à secura. O residuo foi retomado em éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo l,18g (78%) de intermediário 83, ponto de fusão > 260°C. b) Preparação do intermediário 84

Adicionou-se EDC (0,0052 mol) e HOBt (0,0052 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 83 (0,0026 mol) em THF (120 mL) e DCM (120 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi adicionada O- (tetra-hidro-2fí-piran-2-il) -

hidroxilamina (0,0052 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 6 dias, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O residuo (2 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (15-40pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. O residuo (0,75g, 55%) foi purificado por cromatografia em coluna sobre kromasil (10ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,5). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,625g de intermediário 84. Este produto foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. 75

Exemplo A15

Preparação do intermediário 85

ΓΤ 4-Piperidinametanamina (0,65 mol) e carbonato de potássio (96 g) foram agitados em acetonitrilo (1000 mL) e em seguida foi adicionada uma solução de ácido 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinacarboxilico, éster etilico (0,37 mol) em acetonitrilo (500 mL) gota a gota à temperatura ambiente ao longo de 1 hora. A mistura reacional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente e o solvente foi evaporado. O resíduo foi agitado em água e a mistura foi extraída com DCM (2 x 500 mL) . A camada orgânica foi separada, lavada com água, seca (MgSCg) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (eluente 1: AcOEt/Hexano 1/1; eluente 2: MeOH + pequena quantidade de NH4OH) . As frações do produto foram recolhidas, agitadas com suspensão espessa de carbonato de potássio e a mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo 31 g (32 %) de intermediário 85.

Exemplo AI6 a) Preparação do intermediário 86 76

•Cl

Adicionou-se hidreto de sódio (0,0095 mol) a 5°C a uma solução de 5-cloro-lfí-indole-3-carboxaldeído (0,0056 mol) em THF (52 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada a 0°C durante 1 hora. Foi adicionado 1-iodo-propano (0,0067 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 dias, vertida para água e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado, produzindo l,5g de intermediário 86. Este produto foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. b) Preparação do intermediário 87

Adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (0,0068 mol) e ácido acético (0,0046 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 85 (0,0042 mol) e intermediário 86 (0,0051 mol) em MeOH (120 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada e submetida a refluxo durante 2 dias, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente, vertida para carbonato de potássio 10% e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (2,42g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,2). As frações puras foram 77 recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo l,2g (60%) de intermediário 87. c) Preparação do intermediário 88

Uma mistura de intermediário 87 (0,0025 mol) e hidróxido de sódio (0,01 mol) em EtOH (120 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 4 horas, em seguida evaporada até à secura. O resíduo foi retomado em éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,845g (72%) de intermediário 88, ponto de fusão > 260°C. d) Preparação do intermediário 89

Adicionou-se EDC (0,0036 mol) e HOBt (0,0036 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 88 (0,0018 mol) em THF (90 mL) e DCM (90 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada durante 30 minutos. Foi adicionada 0-(tetra-hidro-2fí-piran-2-il) -hidroxilamina (0,0036 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias, vertida para água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgS04) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (l,3g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0,5). As frações puras foram 78 recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,54g (56%) de intermediário 89.

Exemplo A17 a) Preparação do intermediário 90

Adicionou-se cloreto de metanossulfonilo (0,004 mol) a 10°C a uma solução de 1,2-dimetil-lfí-indole-3-etanol (0,0026 mol) e trietilamina (0,008 mol) em DCM (10 mL) sob fluxo de N2. A mistura foi agitada a 10°C durante 4 horas. O solvente foi evaporado até à secura, produzindo o intermediário 90. Este produto foi utilizado diretamente no passo reacional seguinte. b) Preparação do intermediário 91

Uma mistura de intermediário 85 (0,0054 mol), intermediário 90 (0,0075 mol) e carbonato de potássio (0,021 mol) em acetonitrilo (150 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante 2 dias, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente, vertida para água gelada e extraída com AcOEt. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCg) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (1,8 8 g) foi purificado 79 por cromatografia em coluna sobre sílica gel (15-40ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,15g (7%) de intermediário 91. c) Preparação do intermediário 92

Uma mistura de intermediário 91 (0,0003 mol) em hidróxido de sódio (0,0014 mol) e EtOH (20 mL) foi agitada e submetida a refluxo durante um dia, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e evaporada até à secura. O resíduo foi retomado em éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,12g (82%) de intermediário 92, ponto de fusão > 260°C. d) Preparação do intermediário 93

Adicionou-se EDC (0,0005 mol) e HOBt (0,0005 mol) à temperatura ambiente a uma solução de intermediário 92 (0,0002 mol) em THF (15 mL) e DCM (15 mL) . A mistura foi agitada durante 15 minutos. Foi adicionada O-(tetra-hidro-2fí-piran-2-il)-hidroxilamina (0,0005 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 dias, vertida para 80 água gelada e extraída com DCM. A camada orgânica foi separada, seca (MgSCg) , filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,14 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (10ym) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,3). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,035g (25%) de intermediário 93. O Quadro F-l lista os intermediários que foram preparados de acordo com um dos Exemplos acima.

Quadro F-l (intermediários)

ν°γλ^Ν 1 O (^cr^xo ΗΟ-γΛ^Ν 1 o Interm. 1/ Ex. [Al] Interm. 2; Ex. [Al]; p.f. >2 60 °C n H rVCTs^çO 0 Cl ί Interm. 3; Ex. [Al]; p.f. 7 0 °C Interm. 7; Ex. [A2] r-r^O rYJ O rr-^O I O Interm. 10; Ex. [A3] .Na; Interm. 11; Ex. [A3]; p.f. >2 60 °C αγΟ 1 O rYJ ^0yVN o Interm.12; Ex. [A3]; p.f. 154 °C Interm. 13; Ex. [A4]; p.f. 238 °C 81 Η Ο ^ rr^àO «j0r° V ο ^ Interm. 14; Εχ. [Α4] .Na; Interm. 15; Εχ. [Α4] αγτ V ο ' fiC η η rNr0 S k0A0^NY^N O .Na; Interm. 16; Εχ. [Α4] Interm. 17; Εχ. [A4] rr^JO Ci η rY^ ο /ΝγΝ^ \/0γ^Ν Ο Interm. 18; Εχ. [Α1]; p.f. 109°C Interm. 19; Ex. [Al] ffi Ο \ / Q ζχ W ο 1 H fN^ Ci h rY^ ΥΑο'ΝγΛ^Ν 0 .Na; Interm. 20; Εχ. [Α1] Interm. 21; Ex. [Al]; p.f. 7 0 ° C γΥΌ rYJ ν°γ^Ν ο γΫΟ xYU ΗΟΥ^\^Ν Ο Interm. 22; Εχ. [Α1]; p.f. 159°C .Na; Interm. 23; Ex. [Al] 82 ^jjo ο ryO^YQ Υ/°γΛ^Ν ο Interm. 24; Εχ. [Α1]; p.f.100°C Interm. 25; Εχ. [Α1]; p.f. 120 °C ί Γ) χΎΝ^ ΗΟν^Α^Ν ο rrr\ η η η χν° SY YVY1^" ο Interm. 26; Εχ. [Α1] Interm. 27; Εχ. [Α1]; p.f. 8 4 ° C χΝγ° Vk ν°γ^νΝ \ ο Ι^^Υ^ΝΗ /Ύ° ηοΥγν^ν s \ / ο Interm. 28; Εχ. [Α1]; p.f. 83°C .Na; Interm. 29; Εχ. [Α1] OvVY ο 25 W b Ο > Interm. 30; Εχ. [Α1] Interm. 31; Εχ. [Α1]; p.f. 85 °C πο-^Λ^χ ο Υ'ί rvCrH^b ο .Na; Interm. 32; Εχ. [Α1] Interm. 33; Εχ. [Α1] η Ο η „ fr^^Ò ^ο^ο"Νγ^Ν ο .Na; Interm. 34; Εχ. [Α1] Interm. 35; Εχ. [Α1] ΓΥ^Υχ υ Υυχα O^cu, to. Interm. 36; Εχ. [Α2] Interm. 37; Εχ. [Α2] 83 OTs [I ji ( r\ h rNW ^Λο'Νγνχ O Interm. 38; Ex. [A2]; p.f. 17 3 ° C Interm. 39; Ex. [A2] O NH ínYn^H^^\ ν°γνΝ o Interm. 40; Ex. [A2]; p.f. 110°C Interm. 41; Ex. [A3]; p.f. 2 4 0 ° C NH ΗΟγΑ^Ν O NH η h O .Na; Interm. 42; Ex. [A3] Interm. 43; Ex. [A3]; p.f. 88 °C '==/ o Interm. 44; Ex. [Al] 0» N+--0 f T \ /<)'γΛ^χ Ο α N+-0 -N f Y \ HOyVN O Interm. 46; Ex. [Α5]; p.f. 150 °C .Na; Interm. 47; Ex. [A5] ο. V-o Y η rNrN Νχ koAo-NY^N ο 0 TY . Interm. 48; Ex. [A5] Interm.. 51; Ex. [A6] 84

Ο Υα» 0 Ο σ .Na; Interm.52; Εχ. [Α6] Interm. 53; Εχ. [Α6] Ο Ο ΚΟ^Υ^Ν ^-¾ Interm. 55; Εχ. [Α7] .Na; Interm. 56; Εχ. [Α7] Ο U Η U/S Ν Οι r Ο ΐΑΝ ^ιΑν^| ! 6Λ.»^ο 1 Interm. 57; Εχ. [Α7] Interm. 58; Εχ. [Α8] Ο hct\í^n 1 Ο Η 1 1 .Na; Interm.59; Εχ. [Α8] Interm. 60; Εχ. [Α8] Ο ^•Ν \ Ο hcAy^n ^•Ν \ Interm.63; Εχ.[Α9]; p.f. 162 °C .Na; Interm.64; Εχ. [Α9]; p.f. >2 60 °C 85 rV^^Spx | a ^•N \ Interm. 65 ; Ex. [A9]; p.f. 17 9°C Interm. 70; Ex. [All] O HO lf^N .Na; Interm. 71; Ex. [All] Interm. 72; Ex. [All] 4"° P 1 0 HO^Y^N T /° Interm. 73; Ex. [AI2]; p.f. 122 °C .Na; Interm.74; Ex. [A12] σΛ> _ χχ^-Νν/ν,,α /° N Interm. 75; Ex. [AI2] Interm.80; Ex. [A13] 0 1 HO |T^N i .Na; Interm. 81; Ex. [AI3]; p.f. >2 60 °C Interm. 82; Ex. [A13] 86 Ο ΧλϊΧ^<5 ^Ν \ O HO^V^N χΛϊχ \ Interm. 62; Εχ. [Α9] .Na; Interm.83; Ex. [A14]; p.f. >2 60 °C ^'Ο'ίχ,Λ ^•Ν \ ,-rCr‘XCf' Interm. 84; Εχ. [Α14] Interm. 87; Ex. [Al6] ΗΟγΛ^Ν α.xyCrn-pr ^(Λ<ρχγ^χ J .Na; Interm. 88; Εχ. [AI6]; p.f. >2 60 °C Interm. 89; Ex.[A16] zw b O > V-N rV*^ ΗΟνΛ^Ν o Interm.91; Εχ. [A17] .Na; Interm. 92; Ex. [Al7]; p.f. >2 60 °C V-N η = rY° H ^ο^ο"Νγ^Ν O O H Interm. 93; Ex. [AI7] Interm. 94; Ex. [Al] hvCTn^ ^cy~^ O H O H .Na; Interm. 95; Ex. [Al] Interm. 96; Ex. [Al] 87

88 o^° ryv rYJ H0^N O rO~o/ rfY p? . rv° O .Na; Interm. 107; Ex. [Al]; p.f. >2 60 °C Interm. 108; Ex. [Al]; p.f. 80 °C ZK b O ffi Interm. 109; Ex. [Al]; p.f. °C .Na; Interm. 110; Ex. [Al]; p.f. 2 60 °C η h rv1^^ O Γγ0^\Ο O Interm. 111; Ex. [Al] Interm. 112; Ex. [Al] n „ ^τ£ΤΟ^τ o n h yTW ί(Λ(ρ"γ^χ 1 O Interm. 113; Ex. [Al] Interm. 114; Ex. [A2] n h fVC^B^çO O ^ .n. J H IL JL J CXa/J ' o Interm. 115; Ex. [A2] Interm. 116; Ex. [A2] · CijJX? F cr»·Vi ^ W Interm. 117; Ex. [A2] Interm. 118; Ex. [A2] 89 Ο η γνΟΡrvO-a ‘ " ι3 Η λΧΓrVfj ° ^"NvA. ' ^ o \ Interm. 119; Ex. [A2] Interm. 120; Ex. [A2] c~^i h ryr> ° 'rXV\ " C. >—^ •' y O h ΓΥλ_ °Λτ ννΓ U3 ° ΐ Interm. 121; Ex. [A2] Interm. 122; Ex. [A2] q h 1 '''Nv\ " L /—^ • " r3 "o O Interm. 123; Ex. [A2] Interm. 124; Ex. [A2] Λ .N. /===/ ^°\ ΟχγΟ ^ O α 1Αχχγ^χ ‘n-, O ^ Interm. 125; Ex. [A2] Interm. 126; Ex. [A2] Cl g SAo-Ny^N O Χ>χΤ o Interm. 127; Ex. [A2] Interm. 128 ; Ex. [A2] n rNYCCYXO' CXa^XJ O || jfY Cl » rv° O Interm. 129; Ex. [A2] Interm. 130; Ex. [A2] n H rVcrs^uo o Q. » Λ'-'νΑ'ν 0'ΝχνΓ Αχ ° (Λ Interm. 131; Ex. [A2] Interm. 132; Ex. [A2] 90

a,=YocrrVr Ο n „ ^«Λο^γνχ o Interm. 133; Ex. [A2] Interm. 134; Ex. [A2] h fT C/ ^o^o'NY^N o O h YvCA AyCí trS O f X==^ Interm. 135; Ex. [A2] Interm. 136; Ex. [A2] 0 u ' AcuYto rY^Vx 1 u ^CuYCC Interm. 137; Ex. [A2] Interm. 138; Ex. [A2] O 0^K(O^ ^ 0 Interm. 139; Ex. [A2] Interm. 140; Ex. [A2] οΑχ. •A> . ^ NH O^cr^3 ^ o Interm. 141; Ex. [A2] Interm. 142; Ex. [A2] O N\ O HO^V^N YlCY ^•N \ Interm. 143; Ex. [A7] .Na; Interm. 144; Ex. [A7] ; p.f. >2 60 °C 91

O χ°Αγ^Ν σ Interm. 145; Ex. [A7] Interm. 146; Ex. [A7] O HO^Y^N tf tfAju r ΊΪ .Na; Interm. 147; Ex. [A7]; p.f. >2 60 °C Interm. 148; Ex. [A7] O O ho^Y^n Interm. 149; Ex. [A7] .Na; Interm. 150; Ex. [A7] rVOXgO ^°γΧ^Ν 1 O Interm. 151; Ex. [A7] Interm. 152; Ex. [A7] fYOCTgO ηοΎ^^ν 1 o n , mtf o O .Na; Interm. 153; Ex. [A7] Interm. 154; Ex. [A7] O ^nACCC n\ O HO^Y^N I,AoxA N\ Interm. 155; Ex. [A9] .Na; Interm. 156; Ex. [A9]; p.f. >2 60 °C 92 ct^qv^ \ O Ν,-V*. 1 N N > ^ Interm. 157; Ex. [A9] Interm. 158; Ex. [A9] O HO lf^N O <τΛχ~, v. .Na; Interm. 159; Ex. [A9] Interm.160 ; Ex. [A9] O --° lP*N \A^NN/\A Q /° O HO lf^N Ν/\^ΝΝ/\<Α /° Interm. 161; Ex. [A9] .Na; Interm. 162; Ex. [A9]; p.f. >2 60 °C Cf^Cl /° ^QJXO Χ^ΟγΑ^Ν 1 o Interm. 163; Ex. [A9] Interm. 164; Ex. [A9] ✓Y0XXO ΗΟγΛ^Ν 1 ο r„ H voxxo O .Na; Interm. 165; Ex. [A9] Interm. 166; Ex. [A9] 93 O ηοΛτΓχ í' Q /° Interm. 167; Εχ. [Α12] .Na; Interm. 168; Ex. [AI2]; p.f. >2 60 °C O N CU^ç5 N \ Interm. 169; Εχ. [Α12]; ρ.f. 80 °C Interm. 170; Ex. [A13] 0 HO^Sr^N _ \ ^-*N \ .Na; Interm. 171; Ex. [AI3] Interm. 172; Ex. [A13] rrr-^ /γθ vVvN o ? £Ύ<0 hoyVn o Interm. 173; Εχ. [A13]; p.f. 173°C .Na; Interm. 174; Ex. [A13]; p.f. >260°C rJ CXvOf° " O NH rXiT^O rV^ \/0nA^n O Interm. 175; Εχ. [A13] Interm. 176; Ex. [A17] 94

B. Preparação dos compostos finais

Exemplo BI

Preparação do composto la

.C2HF3O2

Adicionou-se TFA (2 mL) a uma mistura de intermediário 3 (0, 0006 mol) em MeOH (40 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 horas. O solvente foi evaporado. O resíduo foi cristalizado de AcOEt/éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,31 g (86%) de composto la, ponto de fusão 130°C. síntese alternativa para o composto 1

Preparação do composto lb

. 2HC1

Adicionou-se hidroxilamina (50% em água, 7,5 mL) e em seguida NaOH IN (15 mL) a 10°C a uma mistura de 95 intermediário 1 (0,0098 mol) em MeOH (10 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura foi acidificada até pH5-6 adicionando uma solução de HC1 IN. O precipitado foi filtrado, lavado com éter dietilico e seco. O residuo (4,5g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel LiChroprep® NH2 (25-40pm) (eluente: DCM/Me0H/H20 90/10/1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 3,lg (80%). O sal de HC1 foi preparado numa fração (0,5g) em EtOH e o precipitado foi filtrado, lavada com éter dietilico e seco produzindo 0,43g de composto lb, ponto de fusão 220°C.

Exemplo B2

Preparação do composto 2 HO—f o

H C2HF3O2

Adicionou-se TFA (0,5 mL) a uma mistura de intermediário 7 (0, 0001 mol) em MeOH (10 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado. O residuo foi cristalizado de acetonitrilo/éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,036g (50%) de composto 2, ponto de fusão 205°C.

Exemplo B3

Preparação do composto 3 96 96 Η .Ν. .Ν, ΗΟ'

Ο .C2HF3O2

Adicionou-se TFA (5 mL) à temperatura ambiente a uma mistura de intermediário 12 (0,0014 mol) em MeOH (100 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O residuo foi cristalizado de AcOEt/éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,545g (74%) de composto 3, ponto de fusão 121°C.

Exemplo B4

Preparação do composto 4

H

o .C2HF302

Adicionou-se TFA (0,5 mL) a uma mistura de intermediário 17 (0,0009 mol) em MeOH (80 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi evaporado. O residuo foi cristalizado de éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,19g (32%) de composto 4, ponto de fusão 103°C.

Exemplo B5

Preparação do composto 18 97

97 HO' Η N

Ο .C2HF3O2

Uma mistura de intermediário 48 (0,0002 mol) em TFA (0,75 mL) e MeOH (15 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado. O resíduo foi cristalizado de éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,071g (59%) de composto 18.

Exemplo B6

Preparação do composto 19 o

N— .C2HF3O2

Uma mistura de intermediário 53 (0,0003 mol) em TFA (1 mL) e MeOH (20 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O resíduo foi cristalizado de MeOH/CH3CN/éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,133g (80%) de composto 19, ponto de fusão 174°C.

Exemplo B7

Preparação do composto 20 98 ο

Uma mistura de intermediário 57 (0,00005 mol) em TFA (0,25 mL) e MeOH (10 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado. O resíduo (0,04g) foi cristalizado de CH3CN/éter dietílico. O precipitado foi filtrado e seco. O resíduo (0,04g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel LiChroprep® NH2 (25-40ym) (eluente: DCM/Me0H/H20 80/20/2). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado, produzindo 0,02g (80%) de composto 20, ponto de fusão 90°C.

Exemplo B8

Preparação do composto 21

Uma mistura de intermediário 60 (0,0001 mol) em TFA (0,5 mL) e MeOH (10 mL) foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi evaporado. O resíduo (0,15g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel LiChroprep® NH2 (25-40pm) (eluente: DCM/Me0H/H20 80/20/2). As frações puras foram recolhidas e o solvente 99 foi evaporado, produzindo 0,064g (78%) de composto 21, ponto de fusão 83°C.

Exemplo B9

Preparação do composto 22

N \

Uma mistura de intermediário 65 (0,002 mol) em TFA (6 mL) e MeOH (120 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O residuo foi cristalizado de CH3CN/MeOH/éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,9g (87%) de composto 22, ponto de fusão 183°C.

Exemplo B10

Preparação do composto 23

O

Uma mistura de intermediário 72 (0, 0001 mol) em TFA (0,5 mL) e MeOH (10 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas. O solvente foi evaporado. O residuo foi cristalizado de éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,059g (59%) de composto 23, ponto de fusão 182°C. 100

Exemplo Bll

Preparação do composto 24

Uma mistura de intermediário 75 (0,0003 mol) em TFA (1 mL) e MeOH (20 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O residuo foi cristalizado de MeOH/CH3CN/éter dietilico. O precipitado foi filtrado e seco, produzindo 0,147g (78%) de composto 24, ponto de fusão 160°C.

Exemplo B12

Preparação do composto 25

Uma mistura de intermediário 82 (0,0009 mol) em TFA (2,5 mL) e MeOH (56 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O residuo foi purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel (25-40pm) (eluente: DCM/Me0H/H20 90/10/1). As frações puras foram recolhidas e o solvente foi evaporado. O residuo foi cristalizado de DIPE. O precipitado foi 101 filtrado e seco, produzindo 0,286g (53%) de composto 25, ponto de fusão 80°C.

Exemplo B 13

Preparação do composto 26 o

\ .C2HF3O2

Uma mistura de intermediário 84 (0,0012 mol) em TFA (3 mL) e MeOH (60 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi evaporado até à secura. O residuo foi cristalizado de DCM/MeOH. O precipitado foi filtrado, lavado com éter dietilico e seco, produzindo 0,322g (50%) de composto 26, ponto de fusão 188°C.

Exemplo B14

Preparação do composto 27

Uma mistura de intermediário 89 (0,001 mol) em TFA (2,5 mL) e MeOH (50 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, em seguida evaporada até à secura. O residuo foi cristalizado de MeOH/CH3CN/éter dietilico. O precipitado foi filtrado, lavado com água e seco, produzindo 0,33g (55%) de composto 27, ponto de fusão 171°C. 102

Exemplo B 15

Preparação do composto 28

° .C2HF3O2

Uma mistura de intermediário 93 (0,00007 mol) em TFA (0,2 mL) e MeOH (4 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias, em seguida evaporada até à secura, produzindo 0,041 g (100%) de composto 28, ponto de fusão 80 °C. O Quadro F-2 lista os compostos gue foram preparados de acordo com um dos Exemplos acima. As seguintes abreviaturas foram utilizadas nos guadros: .C2HF3O2 significa o sal de trifluoroacetato, p.f. significa ponto de fusão.

Quadro F-2 (compostos finais)

HO [1 O HO O C2HF3O2; Co. n° la; Ex. [B1 ] ; p.f. 163 °C .HC1; Co. n° lb; Ex. [B1] ; p.f. 220 °C HO—NH y=N i-S, Η”λ-»Γ>Α O ^—N N-< HN—\ .Cl tu H H h rY^ HO 0 C2HF3O2; Co. n° 2; Ex. [B2 ] ; p.f. 205°C Co. n° 3; Ex. [B3]; p.f. 121 0 C 103

ο . fW S HO Yp O rrr^Q h rNYNv^ xN>s>555s/N ho Yp 0 .C2HF302; Co. n° 4; Ex. [ B 4 ] ; p.f. 103°C . C2HF302;CO. n° 5; Ex. [B1 ] ; p.f. 120 °C h rV^ HO O . íVnJ HO >p O .C2HF3O2; Co. n° 6; Ex. [B1 ] ; p.f. 132 0 C C2HF3O2; Co. n° 7; Ex. [B1 ] ; p.f. 136°C . jVYYp HO O h rY° S-Va Λ s-/ \ HO \ / O C2HF302;CO. n° 8; Ex. [B1 ] ; p.f. 110°C C2HF302; Co. n° 9; Ex. [B1 ] ; p.f. 217 °C J H °-A η η T \=/ Ho >r 0 HO O C2HF3O2; Co. n° 10; Ex. [B1 ] ; p.f. 192 0 C C2HF3O2; Co. n° 11; Ex. [B1 ] ; p.f. 186°C 0 '^\XaAX 0 H°v N N '^ΧΧλΛΧ C2HF302 . H20; Co. n° 12; Ex. [B2] ; p.f. 192 0 C C2HF3O2; Co. n° 13; Ex. [B2 ] ; p.f. 202 °C hjV-^ÇÇ3 .S.N HO O vcr.^cr·' HO Yp O C2HF302; Co. n° 14; Ex. [B2 ] ; p.f. 14 5 0 C C2HF3O2; Co. n° 15; Ex. [B2 ] ; p.f. > 2 60 °C 104

ι jfVχ Η rV° W ΗΟ Ο H—ΝΉ „ χΥ^^Η ΗΟ' Ο 2 C2HF302 .1/2 Η20; Co. η° 16; Εχ. [Β2]; ρ.f. 180 °C .C4H10O . C 2 Η F 3 02; Co. η° 17; Εχ. [Β3]; p.f. 138 °C Q> Ν+-° r-rr^y „ fY^ Ν\ ΗΟ Ο Ο ηον JL Ν Τι ^ Ν » 0 .C2HF302 (1 : 1); Co. η° 18; Εχ. [ Β5 ] .C2HF302 (1 : 1); Co. η° 19; Εχ. [Β6]; p.f. 17 4 ° C 0 ιΛνΛ^ν 4 ΙλΛ Ν η r °χχ^ Ο “'ν'Υν I Co. η° 20; Εχ. [Β7]; p.f. 90 °C Co. η° 21; Εχ. [Β8]; p.f. 83 °C Ο “ΝΑ^ν ^--Ν \ Ο ΗΟ^ JL Ν Τι Co. η° 22; Εχ. [Β9]; p.f. 183°C .C2HF302 (1:1); Co. n° 23; Ex. [BI 0]; p.f. 182 °C Ο HCX Ν 1ι ν'— Τ /° “'Λ'· Γ .C2HF302 (1 : 1); Co. η° 24; Εχ. [ Β11]; p.f. 160 °C .C2HF302 (1:1); Co. n° 25; Ex. [B12]; p.f. 80 °C 105 Ο η<\Α«-^ν Η ΐΛο__Λ \ ηο-ΝΥΛ^Ν J .C2HF302 (1 : 1); Co. η° 2 6; Εχ. [Β13] ; ρ.f. 188 °C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 27; Ex. [Bl4] ; p.f. 1710 C ν Ν/ Η jfV*^ ΗΟ ΟΤ Ο .C2HF3O2 (1:1); Co. η° 28; Εχ. [Β15]; ρ.f. 80 °C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 2 9; Ex. [Bl] ; p.f. 17 3 0 C Ο H0^nVn 1 F " JLl N Y | H (| II 1 r' rV^rtr^) ^xp PE ,^χ HO O .C2HF3O2 (1:1); Co. n°30 ; Ex. [Bl]; p.f. 197 °C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 31; Ex. [Bl]; p.f. 160 °C rí>ci ryY „ rV^ HO O rO~F CfY H jrv° ^x. ^>x Ho 0 .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 32; Ex. [Bl]; p.f. 186°C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 33; Ex. [Bl]; p.f. 196°C /n^n·H H | T ) Ηο-ΝγΛ^Ν / O /^~NH H í T „(rxY^N 0 Co. n° 34; Ex. [Bl]; p.f. 2 8 7 0 C Co. n° 35; Ex. [Bl] 106

.jy HO γ ο 1 1 HO γ O .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 36; Ex. [B2] ; p.f. >300 °C .C2HF302 (1:1); Co. n° 37; Ex. [B2]; p.f. 189°C HO ηρ ^ O 0 HO^ X^ F .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 38; Ex. [B2] ; p.f. 188 °C .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 39; Ex. [B2]; p.f. 239°C Vi ^ W Jt 1 }—Cl N ± ΊΓ ^ H ÍJ—^ »oX„ ^ .C2HF302 (1 : 1); Co. n°40; Ex. [B2]; p.f. 183°C .C2HF302 (1:1); Co. n° 41; Ex. [B2]; p.f. 148 °C H /^NV'n-^> hjT\ / ro"n\JL » a y~* o \ y .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 42; Ex. [B2]; p.f. 134 °C .C2HF302 (1:1); Co. n° 43; Ex. [B2]; p.f. 143°C = rW \ ° N ^ ΐ h rvT^ II,rNNj. /r N-^ y~y o " ^ .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 44; Ex. [B2] ; p.f. 124 °C .C2HF302 (1:1); Co. n° 45; Ex. [B2] ; p.f. 116 ° C O N^J H ΐ=/ "Vo7 H f T \ ) >\A/X HO γ v O .C2HF302 (1 : 1); Co. n° 4 6; Ex. [B2]; p.f. 183°C .C2HF302 (1:1); Co. n° 47; Ex. [B2]; p.f. 161°C 107

.ycrax) “'"A"* V Ο κ ho-nY^n 0 C2HF3O2 (1:1) ;Co. η° 48; Εχ. [Β2] ; p.f. 181 0 C Co. n° 49; Εχ. [B2]; p.f. 10 4 0 C Ηθ'Νγ^Ν Ο .jyCr-yp· HO ηρ O Co. η° 50; Εχ. [Β2]; p.f. 114 0 C C2HF3O2 (1:1);Co. n° 51; Ex. [B2] ; p.f. 14 0 0 C Γ η || || η rNW ΗΟ-Νγ^Ν S Ο 0 C2HF3O2 (1:1); Co. η° 52; Εχ. [Β2] ; p.f. 114 0 C C2HF3O2 (1:1); Co. n° 53; Ex. [B2] ; p.f. 17 8 0 C Ο ho-nY^n 1 0 C2HF3O2 (1:1); Co. η° 54; Εχ. [Β2]; p.f. 159°C C2HF3O2 (1:1); Co. n° 55; Ex. [ B 2] ; p.f. 144°C ΗΟ Ο „ HO 0 Co. η° 56; Εχ. [Β2] ; p.f. 14 5 0 C Co. n° 57; Ex. [B2]; p.f. 100°C ΗΟ"Νν^^Ν Ο ϊ O ho'n'V'n , Ιαλ ,Υ-^ο N N > |f ΥΥΛ 1 H > C2HF302 (1 : 1); Co. η° 58; Εχ. [Β2] ; p.f. 130 °C Co. n° 59; Ex. [B2]; p.f. 122 °C 108

N N > |f Ti ^ I^JL^h || |^|^ Η í T ) Ηο-ΝγΛ^Ν 7 o Co. n° 60; Ex. [B2]; p.f. 105°C Co. n° 61; Ex. [B2]; p.f. 117 0 C Η,ν^ ηο-ΝΥΛ^Ν k ο 1 0 HOv JL^-sss. H 1 J N N^| C2HF3O2 (1:1); Co. n° 62; Ex. [B2] ; p.f. 162 0 C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 63; Ex. [B2]; p.f. 110°C . * . J /NII h r VN^ H ^ Ho >r 0 O n^íAg^N H 1 F N \ C2HF3O2 (1:1); Co. n° 64; Ex. [B2]; p.f. 135°C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 65; Ex. [ B 7] ; p.f. 111°C 0 %v» H ^ n n η r <? O "ίΑ^ν " Ia^ ^ ]ΝΓ^]ΝΓ> Co. n° 66; Ex. [B7]; p.f. 8 8 °C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 67; Ex. [B7]; p.f. 119°C HO' O O vV> ” XnAcccyt5 ^-N \ Co. n° 68; Ex. [B7]; p.f. 210 °C Co. n° 69; Ex. [B9]; p.f. 110°C 109

0 Ν Ν > ^ Ο “'νΛ^ν " U^vx Ν Ν | ^ /° Co. η° 70; Εχ. [Β9]; p.f. 8 0 °C Co. η° 71; Εχ. [Β9] ; p.f. 114 0 C η rVCQCçO ΗΟ Ο Ο Η<Χ JL^Ss. ” ua r \As/nn/V«A Q /° Co. η° 72; Εχ. [Β9]; p.f. 219 ° C Co. n° 73; Εχ. [B11]; p.f. 98 °C Ο -CVnJ-Y^N ^-Ν \ rJ „ rV^ HO O Co. η° 74; Εχ. [Β12]; p.f. 149°C .C2HF3O2 (1:1); Co. n° 75; Ex. [B12]; p.f. 184 °C \---- ι^ΓίΤ^Χ) „ ίΥ*^ ΗΟ >Τ ^ 0 η /τνΓ^8^Λ /N\/VN Ho >r v 0 .C2HF3O2 (1:1); Co. η° 7 6; Εχ. [Β15]; p.f. 164 °C .C2HF3O2 (1:1,4); Co. n° 77; Εχ. [B5]; p.f. 190 °C I π rV^H ' nv ΗΟ ηΤ ^ Ο „jy HO O .C2HF3O2 (1:1,3); Co. η°78; Εχ. [Β2] ; p.f. 114 0 C .C2HF3O2 (1:1,27); Co. n°79; Ex. [Bl]; p.f. 189°C 110

C. Exemplo farmacológico: O ensaio in vitro para a inibição da histona-desacetilase (ver exemplo C.l) mede a inibição da atividade enzimática da HDAC obtida com os compostos de fórmula (I). A atividade celular dos compostos de fórmula (I) foi determinada em células tumorais A2780 utilizando um ensaio colorimétrico para a toxicidade ou sobrevivência celular (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983)(ver exemplo C.2). A solubilidade de um composto mede a aptidão de um composto para permanecer em solução. Num primeiro método é medida a aptidão de um composto para permanecer em solução aquosa após diluição (ver exemplo C.3.a). Soluções-mãe em DMSO são diluídas com um solvente de tampão aquoso simples em 3 passos consecutivos. Para cada diluição é medida a turvação com um nefelómetro. Num segundo método a solubilidade de um composto a diferentes pH pode ser medida com a utilização de um Detetor Quimioluminescente de Azoto (ver exemplo C.3.b). A permeabilidade de um fármaco exprime a sua aptidão para se mover de um meio para ou através de outro. Especificamente, a sua aptidão para se mover através da membrana intestinal para a corrente sanguínea e/ou da corrente sanguínea para o alvo. A permeabilidade (ver 111 exemplo C.4) pode ser medida através da formação de um membrana artificial de bicamada de fosfolipido imobilizada num filtro. No ensaio de membrana artificial imobilizada num filtro é formado uma "sanduíche" com uma placa microtítulo de 96 poços e uma placa de filtração de 96 poços, de tal forma que cada poço compósito é dividido em duas câmaras com uma solução doadora no fundo e uma solução recetora no cimo, separadas por um disco de filtração de 125 ym (poros de 0,45 ym) , revestido com solução de dioleoilfosfatidil-colina a 2%(p/v) em dodecano, em condições que se formam bicamadas multilamelares dentro dos canais do filtro quando o sistema contacta com um solução tampão aquosa. A permeabilidade dos compostos através desta membrana artificial é medida em cm/s. O objetivo é pesquisar a permeação dos fármacos através de uma membrana artificial paralela a 2 pH diferentes: 4,0 e 7,4. A deteção do composto é feita com espetrometria de UV a um comprimento de onda ótimo entre 250 e 500 nm.

Metabolismo de fármacos significa que um composto xenobiótico ou endobiótico lipossolúvel é enzimaticamente transformado em (um) metabolito(s) polar(es), solúvel/solúveis em água e excretáveis. O órgão principal para o metabolismo de fármacos é o fígado. Os produtos metabólicos são frequentemente menos ativos do que o fármaco parental ou inativo. No entanto, alguns metabolitos podem ter uma atividade ou efeitos tóxicos melhorados. Assim, o metabolismo de fármacos pode incluir processos de "destoxificação" e "toxificação". Um dos sistemas enzimáticos principais que determinam a capacidade do organismo para lidar com fármacos e substâncias químicas é representado pelas monooxigenases do citocromo P450, as quais são enzimas dependentes de NADPH. A estabilidade metabólica de compostos pode ser determinada in vitro com a 112 utilização de tecido subcelular humano (ver exemplo C.5.a.)· Aqui a estabilidade metabólica de compostos é exprimida como % de fármaco metabolizado após 15 minutos de incubação destes compostos com microssomas. A quantificação dos compostos foi determinada através de análise por LC-MS. A estabilidade metabólica de compostos também pode ser determinada calculando a semivida de compostos em células de hepatócitos de ratazana (ver exemplo C.5.b.).

Foi demonstrado que uma grande variedade de agentes antitumorais ativam a proteína p21, incluindo os agentes de deterioração de ADN e os inibidores de histona-desacetilase. Os agentes de deterioração de ADN ativam o gene p21 através do supressor de tumores p53, enquanto os inibidores de histona-desacetilase ativam transcricionalmente o gene p21 através do fator de transcrição Spl. Assim, os agentes de deterioração de ADN ativam o promotor de p21 através do elemento sensível a p53, enquanto os inibidores de histona-desacetilase ativam o promotor de p21 através de sítios spl (localizados na região do pb -60 a pb +40 relativamente à caixa TATA) levando ambos a uma maior expressão da proteína p21. Quando o promotor de p21 nas células consiste de um fragmento promotor de p21 de 1300 pb que não compreende os elementos sensíveis a p53, ele é em conformidade não sensível a agentes de deterioração de ADN. A capacidade de compostos para induzir o p21 pode ser avaliada de várias maneiras.

Um primeiro método consiste em tratar células tumorais com o composto de interesse e após lise das células detetar a indução de p21 com o ensaio de imunoabsorção enzimática de p21 (ELISA WAF1 de Oncogene). O ensaio de p21 é um 113 imunoensaio enzimático em "sanduíche" que utiliza anticorpos monoclonais de rato e policlonais de coelho. Um anticorpo policlonal de coelho, específico para a proteína p21 humana, foi imobilizado na superfície dos poços de plástico proporcionados no kit. Qualquer p21 presente na amostra a ser ensaiada ligar-se-á ao anticorpo de captura. 0 anticorpo monoclonal detetor biotinilado também reconhece a proteína p21 humana, e ligar-se-á a qualquer p21, que tenha sido retida pelo anticorpo de captura. Por sua vez, o anticorpo detetor está ligado por estreptavidina conjugada com peroxídase de rábano silvestre. A peroxídase de rábano silvestre catalisa a conversão do substrato cromogénico tetra-metilbenzidina de uma solução incolor para uma solução azul (ou amarela após a adição de reagente de paragem), cuja intensidade é proporcional à quantidade de proteína p21 ligada à placa. 0 produto corado da reação é quantificado utilizando um espetrofotómetro. A quantificação é conseguida através da construção de uma curva padrão utilizando concentrações conhecidas de p21 (proporcionada liofilizada). Este ensaio pode medir a indução de p21 em consequência de danos no dano ou em consequência da inibição da histona-desacetilase (ver exemplo C.6.a.).

Outro método testa a capacidade dos compostos para induzir a p21 em consequência da inibição da HDAC ao nível celular. As células podem ser transfetadas de modo estável com um vetor de expressão contendo um fragmento promotor de p21 de 1300pb que não compreende os elementos sensíveis a p53 e em que um aumento da expressão do gene repórter, em comparação com os níveis de controlo, identifica o composto como possuindo capacidade de indução de p21. 0 gene repórter é uma proteína fluorescente e a expressão do gene repórter é 114 medida como a quantidade de luz fluorescente emitida (ver exemplo C.6.b.). 0 último método é um método in vivo em que são utilizados ratos para rastrear a atividade farmacolóqica de um composto. As células tumorais transformadas de modo estável descritas acima podem ser administradas a ratos numa quantidade suficiente para levar à formação de um tumor. Depois de as células tumorais terem tempo suficiente para formar um tumor, pode administrar-se um composto potencialmente ativo aos animais e o efeito do referido composto nas células tumorais é avaliado medindo a expressão do gene repórter. A incubação com compostos farmacêuticos ativos resultará num aumento da expressão do gene repórter por comparação com os niveis de controlo (ver exemplo C.6.c.)

Os inibidores específicos de HDAC não deveriam inibir outras enzimas como as proteínas abundantes de CYP P450. As proteínas de CYP P450 (expressadas em E.coli) 3A4, 2D6 e 2C9 convertem os seus substratos específicos numa molécula fluorescente. A proteína CYP3A4 converte a 7-benziloxi-trifluorometilcumarina (BFC) em 7-hidroxi- tritluorometilcumarina. A proteína CYP2D6 converte a 3 — [2 — (N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC) em cloridrato de 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina e a proteína CYP2C9 converte a 7-Metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) em 7-hidroxi- trifluorometilcumarina. Os compostos que inibem a reação enzimática originarão uma diminuição do sinal fluorescente (ver exemplo C.7).

Exemplo C.I.: Ensaio In Vitro para Inibição de histona-desacetilase: 115

Exemplo C.l.a.: Ensaio In vitro com substrato marcado com [3H] :

Extratos nucleares de HeLa (fornecedor: Biomol) foram incubadas a 60 pg/mL com 75 μΜ de substrato. Como um substrato para medir a atividade da HDAC foi utilizado um péptido sintético, isto é, os aminoácidos 14-21 da histona H4. O substrato está biotinilado na extremidade NH2 com um grupo espaçador de ácido 6-amino-hexanóico e está protegido na extremidade COOH-terminal por um grupo amida e especificamente [ 3H]acetilado na lisina 16. O substrato, biotina-(6-amino-hexanóico)Gly-Ala- ( [3H] -acetil-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2) , foi adicionado num tampão contendo Hepes 25 mM, sacarose 1 M, 0,1 mg/mL de BSA e 0,01 % de Triton X-100 a pH 7,4. Após 30 min a reação de desacetilação foi terminada pela adição de HC1 e ácido acético. (concentração final 0,035 mM e 3,8 mM respetivamente). Depois de parar a reação, o 3H-acetato livre foi extraido com acetato de etilo. Após mistura e centrifugação, a radioatividade numa aliquota da fase superior (orgânico) foi contada num contador β.

Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (contendo extrato nuclear de HeLa e DMSO sem composto), uma incubação em branco (contendo DMSO mas sem extrato nuclear de HeLa ou composto) e amostras (contendo composto dissolvido em DMSO e extrato nuclear de HeLa). Numa primeira instância, os compostos foram testados a uma concentração de 10“5M. Quando os compostos exibiram atividade a 10_5M foi feita uma curva concentração-resposta em que os compostos foram testados a concentrações entre 10“5M e 10_12M. Em cada teste o valor do branco foi subtraído dos valores do controlo e da amostra. A amostra 116 de controlo representou 100% de desacetilação do substrato. Para cada amostra a radioatividade foi exprimida como uma percentagem do valor médio dos controlos. Quando apropriado os valores de IC50 (concentração de fármaco, necessária para reduzir a quantidade de metabolitos até 50% do controlo) foram calculados utilizando análise de probit para dados classificados. Aqui os efeitos dos compostos de ensaio são exprimidos como pIC5o (o valor do log negativo do valor de IC5o) (ver Quadro F-3) .

Exemplo C.l.b.: Ensaio In Vitro com substrato marcado com Fluorescência:

Foi utilizado o Kit de Ensaio de Atividade Fluorescente de HDAC/Descoberta de Fármaco de Biomol (N° cat.: AK-500-0001). O Ensaio de Atividade Fluorescente de HDAC baseia-se no substrato Fluor de Lys (Fluorogenic Histone deAcetylase Lysyl) e combinação reveladora. O substrato Fluor de Lys, compreende uma cadeia lateral de lisina acetilada. A desacetilação do substrato sensibiliza o substrato de modo que, no segundo passo, o tratamento com o revelador de Fluor de Lys produz um fluoróforo.

Os extratos nucleares de HeLa (fornecedor: Biomol) foram incubados a 60 pg/mL com 75 μΜ de substrato. Foi adicionado o substrato Fluor de Lys num tampão contendo Tris 25 mM, NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM e MgCl2.6H20 1 mM a pH 7,4. Após 30 min, foi adicionada 1 volume do revelador. O fluoróforo foi excitado com luz a 355 nm e a luz emitida (450 nm) foi detetada num leitor fluorimétrico de placas.

Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (contendo extrato nuclear de HeLa e tampão), uma incubação em branco (contendo tampão mas sem extrato nuclear de HeLa) 117 e amostras (contendo composto dissolvido em DMSO e ainda diluidos em tampão e extrato nuclear de HeLa) . Numa primeira instância, os compostos foram testados a uma concentração de 1CT5M. Quando os compostos exibiram atividade a 10‘5M foi feita uma curva concentração-resposta em que os compostos foram testados a concentrações entre 10~5M e 1CT9M. Todas as amostras foram testadas 4 vezes. Em cada teste o valor do branco foi subtraído dos valores do controlo e da amostra. A amostra de controlo representou 100% de desacetilação de substrato. Para cada amostra a fluorescência foi exprimida como uma percentagem do valor médio dos controlos. Quando apropriado os valores de IC5o (concentração do fármaco, necessária para reduzir a quantidade de metabolitos a 50% do controlo) foram calculados utilizando análise de probit para dados classificados. Aqui os efeitos dos compostos de ensaio são exprimidos como pICso (o valor do log negativo do valor de IC5o) (ver Quadro F-3) .

Exemplo C.2: Determinação da atividade antiproliferativa em células A2780

Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO e foram feitas diluições adicionais em meio de cultura. As concentrações finais de DMSO nunca excederam 0,1 % (v/v) nos ensaios de proliferação celular. Os controlos continham células A2780 e DMSO sem composto e os brancos continham DMSO mas sem células. O MTT foi dissolvido a 5 mg/mL em PBS. Foi preparado um tampão de glicina constituído por glicina 0,1 M e NaCl 0,1 M tamponado a pH 10,5 com NaOH (1 N) (todo os reagentes foram da Merck).

As células de carcinoma ovariano A2780 humano (um oferta generosa de Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Câncer Centre, 118

Pennsilvania, EUA]) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina 2 mM, 50 pg/mL de gentamicina e 10 % soro fetal de vitelo. As células foram rotineiramente mantidas como culturas monocamada a 37°C num atmosfera humidificada de 5% CO2 · As células foram subcultivadas uma vez por semana utilizando uma solução de tripsina/EDTA a uma razão de divisão de 1:40. Todos os meios e suplementos foram obtidos de Life Technologies. As células estavam isentas de contaminação com micoplasma como determinado utilizando o kit Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture (fornecedor: BioMérieux).

As células foram aplicadas em placas de cultura NUNC™ de 96 poços (fornecedor: Life Technologies) e deixadas aderir ao plástico de um dia para o outro. As densidades utilizadas para aplicação foram de 1500 células por poço num volume total de 200 pL de meio. Após adesão das células às placas, o meio foi mudado e foram adicionados fármacos e/ou solventes num volume final de 200 pL. Após quatro dias de incubação, o meio foi substituido por 200 pL de meio fresco e a densidade e viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio com base em MTT. A cada poço foram adicionados 25 pL de solução de MTT e as células foram ainda incubadas durante 2 horas a 37°C. O meio foi então cuidadosamente aspirado e o produto azul de MTT-formazano foi solubilizado por adição de 25 pL de tampão de glicina seguidos de 100 pL de DMSO. As placas microteste foram agitadas durante 10 min num agitador de microplacas e a absorvância a 540 nm foi medida utilizando um espetrofotómetro Emax de 96 poços (fornecedor: Sopachem). Numa experiência, os resultados para cada condição experimental são a média de 3 poços repetidos. Para efeitos de seleção inicial, os compostos foram testados a uma concentração fixa simples de 10~6 M. Para compostos ativos, as experiências foram repetidas para 119 definir curvas concentração-resposta completas. Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (sem fármaco) e uma incubação em branco (sem células nem fármacos). 0 valor do branco foi subtraído de todos os valores do controlo e amostra. Para cada amostra, o valor médio do crescimento celular (em unidades de absorvância) foi exprimido como uma percentagem do valor médio do crescimento celular do controlo. Quando apropriado, os valores de IC5o (concentração do fármaco, necessária para reduzir o crescimento celular a 50% do controlo) foram calculados utilizando análise de probit para dados classificados (Finney, D.J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962) . Aqui os efeitos dos compostos de ensaio são exprimidos como pICso (o valor do log negativo do valor de IC50) (ver Quadro F-3) .

Exemplo C.3: Solubilidade/Estabilidade C.3.1. Solubilidade em meio aquoso

No primeiro passo de diluição, 10 pL de uma solução-mãe concentrada do composto ativo, solubilizado em DMSO (5mM), foram adicionados a 100 pL de tampão de fosfato citrato pH 7,4 e misturados. No segundo passo de diluição, uma alíquota (20 pL) do primeiro passo de diluição foi ainda transferida para 100 pL de tampão de fosfato citrato pH 7,4 e misturada. Finalmente, no terceiro passo de diluição, uma amostra (20 pL) do segundo passo de diluição foi ainda diluída em 100 pL de tampão de fosfato citrato pH 7,4 e misturada. Todas as diluições foram realizadas em placas de 96 poços. Imediatamente após o último passo de diluição, mediu-se a turvação dos três passos de diluição consecutivos com um nefelómetro. A diluição foi efetuada em 120 triplicado para cada composto para excluir erros ocasionais. Com base nas medições de turvação é realizada uma classificação em 3 classes. Os compostos com alta solubilidade obtiveram uma classificação de 3 e para estes compostos a primeira diluição é transparente. Os compostos com solubilidade média obtiveram uma classificação de 2. Para estes compostos a primeira diluição não é transparente e a segunda diluição é transparente. Os compostos com baixa solubilidade obtiveram uma classificação de 1 e para estes compostos tanto a primeira como a segunda diluição não são transparentes (ver Quadro F-3). C.3.b. solubilidade/estabilidade a pH diferentes A solubilidade de um composto, a pH diferentes, também pode ser medida com a utilização de um Detetor

Quimioluminescente de Azoto, (ver Quadro F-3).

Exemplo C.4: Análise de permeabilidade em membrana artificial paralela

As amostras concentradas (alíquotas de 10 pL de um solução-mãe de 5 mM em DMSO a 100 %) foram diluídas numa placa de poços profundos ou de Pré-mistura contendo 2 mL de um sistema tampão aquoso pH 4 ou pH 7,4 (PSR4 System Solution Concentrate (pION)).

Antes das amostras terem sido adicionados à placa de referência, adicionou-se 150 pL de tampão aos poços e realizou-se uma medição de UV em branco. Depois disso o tampão foi rejeitado e a placa foi utilizada como placa de referência. Todas as medições foram feitas em placas resistentes a UV (fornecedor: Costar ou Greiner). 121

Após medição do branco da placa de referência, adicionou-se 150 pL das amostras diluídas à placa de referência e adicionou-se 200 pL das amostras diluídas à placa doadora 1. Uma placa de filtro recetora 1 (fornecedor: Millipore, tipo: MAIP N45) foi revestida com 4 pL da solução formadora de membrana artificial (1,2-Dioleoil-sn-Glycer-3-Fosfocolina em Dodecano contendo 0,1 % de 2,6-Di-terc-butil-4-metilfenol e colocada por cima da placa doadora 1 para formar uma "sanduíche". Foi transferido tampão (200 pL) para os poços recetores no cimo. A sanduíche foi coberta com uma tampa e conservada durante 18h à temperatura ambiente no escuro.

Foi realizada uma medição em branco da placa recetora 2 através da adição de 150 pL de tampão ao poços, seguidos de uma medição por UV. Após a medição do branco da placa recetora 2 o tampão foi rejeitado e foram transferidos 150 pL de solução recetora a partir da placa de filtro recetora 1 para a placa recetora 2. Em seguida a placa de filtro recetora 1 foi retirada da sanduíche. Após a medição em branco da placa recetora 2 (ver acima) , 150 pL da solução doadora foram transferidos da placa recetora 1 para a placa recetora 2. Foram traçados os espetros de UV da placa doadora 2, placa recetora 2 e da placa de referência (com um SpectraMAX 190). Todos os espetros foram processados para calcular a permeabilidade com o Software PSR4p Command. Todos os compostos foram medidos em triplicado. Carbamazepina, griseofulvina, acicloguanisina, atenolol, furosemida e clorotiazida foram utilizados como padrões em cada experiência. Os compostos foram classificados em 3 categorias como tendo uma permeabilidade baixa (efeito médio < 0,5 χ 10”6 cm/s; classificação 1), uma permeabilidade média (1 χ 10”6 cm/s > efeito médio ^ 122 0,5 x 10 6 cm/s; classificação 2) ou uma permeabilidade alta (> 1 x 10”6 cm/s; classificação 3).

Exemplo C.5; Estabilidade metabólica

Exemplo C.5.a.

As preparações de tecido sub-celular foram feitas de acordo com Gorrod et ai. (Xenobiotica 5: 453-462, 1975) por separação centrífuga após homogeneização mecânica do tecido. O tecido de fígado foi lavado em tampão de Tris-HCl 0,1 M gelado (pH 7,4) para lavar o excesso de sangue. O tecido foi então seco por transferência, pesado e cortado grosseiramente utilizando tesouras cirúrgicas. Os pedaços de tecido foram homogeneizados em 3 volumes de tampão de fosfato 0,1 M gelado (pH 7,4) utilizando um Potter-S (Braun, Itália) munido de uma mão de almofariz em Teflon ou um homogeneizador Sorvall Omni-Mix, durante 7 x 10 s. Em ambos os casos, o vaso foi mantido em/sobre gelo durante o processo de homogeneização.

Os homogenatos de tecido foram centrifugados a 9000 x g durante 20 minutos a 4 °C utilizando uma centrífuga Sorvall ou ultracentrífuga Beckman. O sobrenadante resultante foi conservado a -80 °C e é designado 'S9'. A fração S9 pode ser ainda centrifugada a 100 000 x g durante 60 minutos (4°C) utilizando uma ultracentrífuga Beckman. O sobrenadante resultante foi cuidadosamente aspirado, divido em alíquotas e designado 'citosol'. O sedimento foi ressuspenso em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) num volume final de 1 mL por 0,5 g de peso de tecido original e designado 'microssomas'. 123

Todas as frações sub-celulares foram divididas em aliquotas, imediatamente congeladas em azoto liquido e conservadas a -80 °C até à utilização.

Para as amostras a serem testadas, a mistura de incubação continha PBS (0,1M), composto (5 μΜ) , microssomas (lmg/ mL) e um sistema gerador de NADPH (glucose-6-fosfato 0,8 mM, cloreto de magnésio 0,8 mM e 0,8 Unidades de glucose-6-fosfato-desidrogenase) . As amostras de controlo continham o mesmo material mas os microssomas foram substituídos por microssomas termicamente inativados (10 min a 95 graus Celsius). A recuperação dos compostos nas amostras de controlo foi sempre de 100%.

As misturas foram pré-incubadas durante 5 min a 37 graus Celsius. A reação foi iniciada no tempo (t = 0) por adição de NADP 0,8 mM e as amostras foram incubadas durante 15 min (t = 15) . A reação foi terminada pela adição de 2 volumes de DMSO. Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 10 min a 900 x g e os sobrenadantes foram conservados à temperatura ambiente durante não mais do que 24 h antes da análise. Todas as incubações foram realizadas em duplicado. A análise dos sobrenadantes foi realizada através de análise por LC-MS. A eluição das amostras foi realizada numa Xterra MS C18 (50 x 4,6 mm, 5 ym, Waters, US). Foi utilizado um sistema de HPLC Alliance 2790 (Fornecedor: Waters, US) . A eluição foi com tampão A (acetato de amónio 25 mM (pH 5,2) em H20/acetonitrilo (95/5)), sendo o solvente B acetonitrilo e o solvente C metanol a um caudal de 2,4 ml/min. O gradiente utilizado consistiu em aumentar a concentração de fase orgânica de 0 % até 50%Be50%C em 5 min até 100 % B em 1 min de uma maneira linear e concentração de fase orgânica foi mantida 124 estacionária durante mais 1,5 min. 0 volume total de injeção das amostras foi de 25 yL.

Como detetor foi utilizado um espetrómetro de massa de triplo quadrupolo Quattro (fornecedor: Micromass, Manchester, UK) munido com uma fonte de ESI. A fonte e a temperatura de dessolvatação foram fixadas a 120 e 350°C, respetivamente e foi utilizado azoto como gás nebulizador e de secagem. Os dados foram adquiridos no modo de varrimento positivo (reação de ião simples) . A tensão do cone foi ajustada a 10 V e o tempo de residência foi de 1 s. A estabilidade metabólica foi exprimida como % de metabolismo do composto após 15 min de incubação na presença de microssomas ativos (E(act))

/ fOBSFB^UmsAYtâàí ClSOá*lCsef$ai = iS

| \ HS áe I(ac$& t = P

Os compostos que tinham uma percentagem de metabolismo inferior a 20 % foram definidos como extremamente estáveis ao metabolismo. Os compostos que tinham um metabolismo entre 20 e 70 % foram definidos como intermediamente estáveis e os compostos que exibiram uma percentagem de metabolismo superior a 70 foram definidos como possuindo baixa estabilidade ao metabolismo. Foram sempre incluídos três compostos de referência sempre que era realizado um rastreio de estabilidade metabólica. O verapamil foi incluído como um composto com baixa estabilidade metabólica (% metabolismo = 73 %) . A cisaprida foi incluída como um composto com estabilidade metabólica média (% metabolismo 45 %) e o propanol foi incluído como um composto com estabilidade metabólica intermédia a alta (25 % de metabolismo). Estes compostos de referência foram 125 utilizados para validar o ensaio de estabilidade metabólica. C.5.b: estabilidade metabólica com cultura de células de hepatócitos de ratazana.

Hepatócitos de ratazana foram isolados a partir de ratazanas Sprague Dowley machos. Os compostos foram dissolvidos numa solução-mãe a 5 mM em DMSO a 100% e incubados a uma concentração final de 5 μΜ durante 0, 15, 30, 60 e 120 min com culturas de células de hepatócitos de ratazana (0,5 milhões de células viáveis/ 0,5 mL) utilizando placas de 24 poços.

As amostras foram preparadas para LC-MS por adição de dois volumes de DMSO. As amostras foram exaustivamente agitadas e subsequentemente centrifugadas a 900g durante 10 min (temperatura ambiente). Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Do sobrenadante resultante foram analisados 50 pL por LC-MS.

Para LC-MS, a eluição das amostras foi realizada numa coluna Hypersil BDS C18 (50 x 4,6 mm, 5 pm, Thermohypersil, UK) . O sistema de HPLC compreendia um sistema de injeção Surveyor (Surveyor Inc., San Jose, US) munido de um amostrador automático Surveyor. A eluição foi com tampão A (acetato de amónio 10 mM (pH 6, 9) em H20/Acetonitrilo (95:5)) e solvente B (acetonitrilo) a um caudal de 1,2 ml/min. O gradiente utilizado foi de 0,5 min de solvente A como condição inicial seguida de aumento da concentração de fase orgânica de 0 % B até 95% B ao longo de 2 min de uma maneira linear. Esta fase foi mantida estacionária durante mais 2 min e novamente reduzida até 0% B em 0,5 min. 126

126 o LO A O 0 O 0 e 0,1 mL 0 volume total de injeção das amostras foi de temperatura do forno de colunas foi mantida a caudal de LC foi dividido para deteção por MS deixados entrar para a fonte.

Para deteção foi utilizado um espetrómetro de massa de triplo quadrupolo TSQ Quantum (Thermofinnigan, LaJolla, EUA) munido com uma fonte ESI. A tensão da fonte foi fixada a 3800 volt, a temperatura do capilar a 300 °C. O espetrómetro de massa foi operado no modo de iões positivos ião em SIM ajustado à massa de M+H com uma largura de varrimento de 1 Da para efeitos de quantificação. O controlo do instrumento, aquisição de dados e processamento foram realizados utilizando o software Xcalibur (ThermoFinnigan, San Jose, CA, E.U.A.). A estabilidade metabólica dos compostos em hepatócitos de ratazana foi exprimida como semividas in vitro. O composto R306465 (WO03/76422) foi utilizado (semivida in vitro: 8 min) como referência. Foram testados os composto 1 e composto 5 e tinham uma in vitro semivida de 81 min. e 60 min., respetivamente.

Exemplo C.6: capacidade de indução de p21

Exemplo C.6.a: ensaio de imunoabsorção enzimática de p21 O seguinte protocolo foi aplicado para determinar o nível de expressão da proteína p21 em células de carcinoma ovariano A2780 humano. As células A2780 (20000 células /180 pL) foram aplicadas em placas de 96 micropoços em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina 2 mM, 50 pg/mL de gentamicina e 10 % de soro fetal de vitelo. 24 horas antes da lise das células, adicionou-se os compostos a 127 concentrações finais de 10~5, 10~6, 10~7 e 10~8 M. Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO e foram feitas diluições adicionais em meio de cultura. 24 horas após a adição do composto, os sobrenadantes foram retirados das células. As células foram lavadas com 200 pL de PBS gelado. Os poços foram aspirados e foram adicionados 30 pL de tampão de lise (Tris.HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, 1 % de Nonidet p40 e 10 % de glicerol) . As placas foram incubadas de um dia para o outro a -70 °C. O número apropriado de poços microtitulo foram retirados da bolsa de folha de metal e colocados num suporte de poço vazio. Foi preparada uma solução de trabalho (lx) do Tampão de Lavagem (concentrado de lavagem de placa 20x: 100 mL de solução 20 vezes concentrada de PBS e tensioativo. Contém 2 % de cloroacetamida) . O padrão de p21 WAF liofilizado foi reconstituído com H2O destilada e adicionalmente diluído com diluente de amostra (fornecido no kit)

As amostras foram preparadas diluindo-as a 1:4 em diluente de amostra. As amostras (100 pL) e os padrões de p21 WAF1 (100 pL) foram pipetados para poços apropriados e incubados à temperatura ambiente durante 2 horas. O poços foram lavados 3 vezes com tampão de lavagem lx e em seguida foram pipetados 100 pL de reagente anticorpo detetor (uma solução de anticorpo monoclonal p21 WAF1 biotinilado) para cada poço. Os poços foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora e em seguida lavados três vezes com tampão de lavagem 1 x. O conjugado 400x (conjugado de peroxídase estreptavidina: solução concentrada 400 vezes) foi diluído e foram adicionados 100 pL da solução lx aos poços. Os poços foram incubados à temperatura ambiente durante 30 min e em seguida lavados 3 vezes com tampão de lavagem lx e 1 vez com H20 destilada. Foi adicionada solução de substrato 128 (substrato cromogénico) (100 yL) aos poços e os poços foram incubados durante 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Foi adicionada solução de paragem a cada poço pela mesma ordem que a solução de substrato anteriormente adicionada. A absorvância em cada poço foi medida utilizando um leitor de placas espetrofotométrico a comprimentos de onda duplos de 450/595 nm.

Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (sem fármaco) e uma incubação em branco (sem células nem fármacos). O valor do branco foi subtraído de todos os valores de controlo e amostra. Para cada amostra, o valor de indução de p21WAFl (em unidades de absorvância) foi exprimido como a percentagem do valor de p21WAFl presente no controlo. Uma percentagem de indução superior a 130 % foi definida como indução significativa. Foram testados nove compostos e todos mostraram indução significativa a 10"6M.

Exemplo C.6.b.: método celular Células A2780 (ATCC) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, L-glutamina 2 mM e gentamicina a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% CO2. Todas as soluções de cultura de células são fornecidas por Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . Os outros materiais são fornecidos por Nunc.

O ADN genómico foi extraído de células A2780 em proliferação e utilizado como cadeia molde para isolamento do promotor de p21 por PCR com iniciadores internos. A primeira amplificação foi realizada durante 20 ciclos a uma temperatura de emparelhamento de 55°C utilizando o par oligonucleotídico GAGGGCGCGGTGCTTGG e TGCCGCCGCTCTCTCACC 129 com o ADN genómico como cadeia molde. O fragmento de 4,5 kb resultante contendo o fragmento -4551 a +88 relativamente à caixa TATA foi re-amplifiçado com os oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG e ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos com emparelhamento a 88°C resultando num fragmento de 4,5 kb e subsequentemente com o par oligonucleotidico TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC e ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos com emparelhamento a 88°C resultando num fragmento de 1,3 kb contendo o fragmento -1300 a +88 relativamente à caixa TATA. Os sitios de restrição Xhol e Kpnl presentes nos oligonucleótidos (sequência sublinhada) foram utilizados para subclonagem. O repórter luciferase foi retirado do pGL3-básico e substituído pelo repórter ZsGreen (do plasmídeo pZsGreenl-Nl) nos sítios de restrição Kpnl e Xbal. O pGL3-básico-ZsGreen-1300 foi construído via inserção do fragmento de 1,3 kb supramencionado da região promotora de p21 humano no pGL3-básico-ZsGreen nos sítios Xhol e Kpnl. Todas as enzimas de restrição são fornecidas por Boehringer Manheim (Alemanha). As células A2780 foram aplicadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 2xl05 células, incubadas durante 24 horas e transfetadas com 2 ug de pGL3-básico-ZsGreen-1300 e 0,2 ug de vetor pSV2neo utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Brussels, Bélgica) como descrito pelo fabricante. As células transfetadas foram selecionadas durante 10 dias com G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) e foram cultivadas suspensões de células únicas. Após três semanas foram obtidos clones únicos.

Os clones de A2780 selecionados foram expandidos e aplicados a 10000 células por poço em placas de 96 poços. 24 horas após aplicação, as células foram tratadas durante 130 mais 24 horas com compostos (que afetam os sítios spl na região promotora proximal de p21). Subsequentemente, as células foram fixadas com PFA a 4% durante 30' e sujeitas a revelação de contraste com corante Hoechst. A ativação do promotor de p21 que leva à produção de ZsGreen e, desse modo, a fluorescência, foi seguida por Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussels, Bélgica).

Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (sem fármaco) e uma incubação em branco (sem células nem fármacos). O valor do branco foi subtraído de todos os valores de controlo e amostra. Para cada amostra, o valor de indução de p21 foi exprimido como a percentagem do valor de p21 presente no controlo. Uma percentagem de indução superior a 130 % foi definida como indução significativa.

Foram testados setenta e um compostos e todos exibiram indução significativa a 10_6M.

Exemplo Ç.6.C.: método in vivo

Um clone selecionado foi injetado por via subcutânea (107 células/200 pL) no flanco de ratos glabros e 12 dias depois foi obtido um tumor mensurável com paquímetro. A partir do dia 12, os animais foram administrados diariamente, por via oral ou intravenosa, durante 6 dias com solvente e 20-40 mpk de composto (4-10 animais cada). Os tumores foram avaliados por fluorescência pelo Sistema de Imagiologia de Corpo Inteiro Automatizado desenvolvido nas nossas instalações (Estereomicroscópio fluorescente tipo Olympus® SZX12 munido de um filtro GFP e acoplado a uma câmara de CCD tipo JAI® CV-M90 controlada por um pacote de software com base no Software IMAQ Vision de National Instruments®) . Como referência foi utilizado o composto R306465 131 (WO03/76422). Os compostos foram classificados como inativos (sem fluorescência mensurável) , mais fracos, idênticos ou melhores do que o R306465. 0 composto 1 foi testado e foi melhor do que o R306465.

Exemplo C.7: capacidade de inibição do P450

Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO (5 mM) e foi feita uma diluição adicional até 5 IO”4 M em acetonitrilo. Foram feitas outras diluições em tampão de ensaio (tampão de fosfato de NaK 0,1 M pH 7,4) e a concentração final de solvente nunca foi superior a 2 %. O ensaio para a proteína CYP3A4 compreende por poço 15 pmol de P450/mg proteína (em tampão de fosfato de NaK 0,01 M + 1,15% de KC1), um sistema gerador de NADPH (Glucose-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/mL de Glucose-6-f osfato desidrogenase, NADP 1,3 mM e MgCl2.6H20 3,3 mM em tampão de ensaio) e o composto num volume total de ensaio de 100 yL. Após uma pré-incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada pela adição de 150 μΜ do substrato de sonda fluorescente BFC em tampão de ensaio. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente a reação foi terminada após adição de 2 volumes de acetonitrilo. As determinações fluorescentes foram realizadas a um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. Nesta experiência foi incluído cetoconazole (valor de IC5o = 3 x 10”8M) como composto de referência. O ensaio para a proteína CYP2D6 compreende por poço 6 pmol de P450/mg proteína (em tampão de fosfato de NaK 0,01 M + 1,15% de KC1), um sistema gerador de NADPH (Glucose-6-fosfato 0,41 mM, 0,4 U/mL de Glucose-6-f osfato desidrogenase, NADP 0,0082 mM e MgCl2.6H20 0,41 mM em 132 tampão de ensaio) e composto num volume total de ensaio de 100 pL. Após uma pré-incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada pela adição de 3 μΜ do substrato de sonda fluorescente AMMC em tampão de ensaio. Após uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente a reação foi terminada após adição de 2 volumes de acetonitrilo. As determinações fluorescentes foram realizadas a um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Nesta experiência foi incluída quinidina (valor de IC5o < 5 x 10~8 M) como composto de referência. O ensaio para a proteína CYP2C9 compreende por poço 15 pmol de P450/mg proteína (em tampão de fosfato de NaK 0,01M + 1,15% de KC1), um sistema gerador de NADPH (Glucose-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/mL de Glucose-6-f osfato desidrogenase, NADP 1,3 mM e MgCl2.6H20 3,3 mM em tampão de ensaio) e composto num volume total de ensaio de 100 pL. Após uma pré-incubação de 5 min a 37 °C a reação enzimática foi iniciada pela adição de 200 pM do substrato de sonda fluorescente MFC em tampão de ensaio. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente a reação foi terminada após adição de 2 volumes de acetonitrilo. As determinações fluorescentes foram realizadas a um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. Nesta experiência foi incluído sulfafenazole (valor de IC5o = 6,8 X 10“7 M) como composto de referência.

Para efeitos de seleção inicial, os compostos foram testados a uma única concentração fixa de 1 x 10“5 M. Para compostos ativos, as experiências foram repetidas para estabelecer as curvas concentração-resposta completas. Para cada experiência foram corridos em paralelo controlos (sem fármaco) e uma incubação em branco (sem enzima nem 133 fármacos). Todos os compostos foram ensaiados em quadruplicado. 0 valor do branco foi subtraído de todos os valores de controlo e amostra. Para cada amostra, o valor médio de atividade de P450 da amostra (em unidades de fluorescência relativa) foi exprimido como uma percentagem do valor médio de atividade de P450 do controlo. A percentagem de inibição foi exprimida como 100% menos o valor médio de atividade de P450 da amostra. Quando apropriado, calculou-se os valores de IC5o (concentração de fármaco, necessária para reduzir a atividade de P450 a 50% do controlo).

Quadro F-3: lista os resultados dos compostos que foram testados de acordo com os exemplos C.l.a., C.l.b, C.2, C.3.a. e C.3.b. Número do composto Atividade enzimática pIC50 C.l a. Atividade enzimática pIC50 C.l.b Atividade celular pIC50 C.2 Solubilidade C.3.a. Solubilidade C.3.b. pH = 2,3 (ng/ mL) 5 8, 6 6, 5 2,0 la 8, 8 9,2 8,2 3 1,4 6 8,2 6,3 7 8,5 6,1 3 8,5 6,7 4 8,7 7,0 3 17 7,8 6, 8 8 8, 3 7,1 2,4 9 8, 3 7,1 10 81 7,5 3 3,7 16 8, 6 7,1 3 11 8,2 7,5 3 2,8 2 8,4 7,5 3 15 8, 5 7,5 14 8,4 7,4 1,7 13 6, 0 7,5 3 12 8,2 7,1 3 35 8,2 6,7 68 > 9,0 7,2 2,5 134 Número do composto Atividade enzimática pIC50 C.l a. Atividade enzimática pIC50 C.l.b Atividade celular pIC50 C.2 Solubilidade C.3.a. Solubilidade C.3.b. pH = 2,3 (mg/ mL) 63 >9,0 7, 5 67 8,3 75 1,9 76 7,8 6, 7 72 7,9 6, 8 80 7,8 7, 1 34 8,4 7, 5 33 10, 0 7, 5 1,6 32 8, 0 8, 4 1,5 21 8,5 7, 6 1,9 49 8,7 7, 5 3,3 53 10, 0 8, 0 20 9,5 8, 1 2,7 64 8,9 7, 8 62 9,5 8, 0 28 8,1 7, 1 61 8,9 7, 6 60 8,7 6, 9 3,1 59 9, 0 7, 7 58 10, 0 5, 8 19 8, 0 7 1 24 7,6 6, 5 1,6 57 10,2 7, 6 2,8 56 9,2 7, 6 55 10, 1 7, 8 2,0 54 10,2 7, 9 52 10,3 8, 1 51 9,8 8, 0 50 8, 6 7, 6 2,4 48 >9,0 8, 2 66 >9,0 7, 4 1,7 73 7,9 7, 1 47 8, 8 8, 0 4,0 74 8,2 7, 1 46 9, 0 8, 0 31 8,2 7, 4 135 Número do oanposto Atividade enzimática pIC50 C.l a. Atividade enzimática pIC50 C.l.b Atividade celular pIC50 C.2 Solubilidade C.3.a. Solubilidade C.3.b. pH = 2,3 (mg/ mL) 75 7,3 7,1 27 > 9,0 8, 0 45 9,0 6,7 1,7 44 8,2 7,4 1,8 43 8,5 7,8 2,1 29 7,9 6, 9 42 8,3 7,5 71 7,5 6, 5 70 8,5 6, 8 69 7,6 6,7 25 7,6 7,0 41 8,4 5, 8 40 8,5 7,5 23 8,4 7,5 22 9,1 7,2 26 >9,0 7,5 65 > 9,0 7,5 1,6 39 90 7,5 2,0 30 9,0 7,5 2,1 38 > 9,0 7,5 37 8, 6 7,5 36 8,7 8, 6 2,5 79 8,4 8,1 2,7 18 8,3 8, 0 81 8,9 7,5 D. Exemplo de composição: Comprimidos revestidos com película

Preparação do núcleo de comprimidos

Uma mistura de 100 g de um composto de fórmula (I), 570 g de lactose e 200 g de amido é bem misturada e depois disso humidificada com uma solução de 5 g de dodecilsulfato de sódio e 10 g de polivinil-pirrolidona em cerca de 200 mL de 136 água. A mistura em pó húmida é peneirada, seca e novamente peneirada. Em seguida é adicionado 100 g de celulose microcristalina e 15 g de óleo vegetal hidrogenado. A totalidade é bem misturada e prensada em comprimidos, dando 10 000 comprimidos, compreendendo cada 10 mg de um composto de fórmula (I).

Revestimento A uma solução de 10 g de metilcelulose em 75 mL de etanol desnaturado é adicionada uma solução de 5 g de etilcelulose em 150 mL de diclorometano. Em seguida são adicionados 75 mL de diclorometano e 2,5 mL de 1,2,3-propanotriol. 10 g de polietileno glicol é fundido e dissolvido em 75 mL de diclorometano. A última solução é adicionada à anterior e em seguida são adicionados 2,5 g de octadecanoato de magnésio, 5 g de polivinil-pirrolidona e 30 mL de suspensão corante concentrada e toda a mistura é homogeneizada. Os núcleos de comprimidos são revestidos com a mistura assim obtida num aparelho de revestimento.

Lisboa, 17 de Abril de 2012

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (I),

as formas N-óxido, os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereoquimicamente isoméricas deste, em que cada n é um número inteiro com valor 0, 1 ou 2 e quando n é 0 então é pretendida uma ligação direta; cada m é um número inteiro com valor 1 ou 2; cada X é independentemente N ou CH; cada Y é independentemente O, S ou NR4; em que cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi- 6alquiloCi_6, cicloalquiloC3-6, cicloalquilC3-6inetilo, fenilalquiloCi-e, -C (=0) -CHR5R6 ou -S (=0) 2-N (CH3) 2/ em que cada R5 e R6 é independentemente hidrogénio, amino, alquiloCi-6 ou aminoalquiloCi-6; e quando Y é NR4 e R2 está na posição 7 do indolilo então R2 e R4 podem formar, em conjunto, o radical bivalente -(CH2)2- (a-1) , ou - (CH2) 3- (a-2); R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi-6Sulf onilo, alquilCi-6carbonilo ou mono- ou di (alquilCi-6) aminossulfonilo; 2 R2 é hidrogénio, hidroxilo, amino, halo, alquiloCi-6, ciano, alceniloC2-6í poli-haloalquiloCi-6, nitro, fenilo, alquilCi-6carbonilo, hidroxicarbonilo, alquilCi-6carbonilamino, alquiloxiloCi_6, ou mono- ou di (alquilCi-6) amino; R3 é hidrogénio, alquiloCi-6 ou alquiloxiloCi-6; e quando R2 e R3 estão em átomos de carbono adjacentes, eles podem formar o radical bivalente -O-CH2-O-.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 em que cada n é um número inteiro com valor 0 ou 1; cada R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi-6alquiloCi-6, cicloalquiloC3-6 ou f enilalquiloCi-6/ R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi-6, alquilCi_6carbonilo ou alquilCi-6Sulf onilo; e R2 é hidrogénio, halo, alquiloCi-6, ciano, nitro, poli-haloalquiloCi-6 ou alquiloxiloCi-6.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 e 2 em que cada n é um número inteiro com valor 1; cada m é um número inteiro com valor 1; cada X é independentemente N; cada Y é independentemente NR1; cada R1 é alquiloCi-6; R1 é hidrogénio; R2 é hidrogénio ou halo; e R3 é hidrogénio. 1 Composto de acordo com a reivindicação 1, 2 e 3 em que o referido composto é o composto n° la, composto n° 30, composto n° 39 e composto n° 50. 3 HO ^ O O %V» I F “ ,Li N N C2HF3O2; Composto la C2HF3O2 (1:1); composto 30 1 F H ^cr^oí "Ο'ϊ^ o C2HF3O2 (1:1); composto 39 composto 50

5. Composição farmacêutica compreendendo veiculos farmaceuticamente aceitáveis e como um ingrediente ativo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4.

6. Processo de preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 em que os veículos farmaceuticamente aceitáveis e um composto de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4 são intimamente misturados.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 para ser utilizado como um medicamento.

8. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças proliferativas.

9. Associação de um agente anticancerígeno e um inibidor de HDAC de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4. 4

10. Processo de preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a) fazer reagir um intermediário de fórmula (II), em que Q é tetra-hidropiraniloxiaminocarbonilo, aqui referido como um intermediário de fórmula (Il-a), com um ácido apropriado, tal como por exemplo, ácido trifluoroacético, produzindo um ácido hidroxâmico de fórmula (I).

b) fazer reagir um intermediário de fórmula (II), em que Q é alquiloxiCi-2carbonilo, aqui referido como intermediários de fórmula (II-c), com hidroxilamina, na presença de uma base e num solvente apropriado com a produção de um ácido hidroxâmico de fórmula (I)

0) 5

11. Composto de fórmula (II),

as formas iV-óxido, os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereoquimicamente isoméricas deste, em que cada n é um número inteiro com valor 0, 1 ou 2 e quando n é 0 então é pretendida uma ligação direta; cada m é um número inteiro com valor 1 ou 2; cada X é independentemente N ou CH; cada Y é independentemente O, S ou NR4; em que cada R4 é hidrogénio, alquiloCi-6, alquiloxiCi- 6alquiloCi_6, cicloalquiloC3_6, cicloalquilC3-6metilo, fenilalquiloCi-e, -C (=0) -CHR5R6 ou -S (=0) 2-N (CH3) 2/ em que cada R5 e R6 é independentemente hidrogénio, amino, alquiloCi-6 ou aminoalquiloCi-6; e quando Y é NR4 e R2 está na posição 7 do indolilo então R2 e R4 podem formar, em conjunto, o radical bivalente - (CH2) 2- (a-1), ou - (CH2) 3- (a - 2) ; R1 é hidrogénio, alquiloCi-6, hidroxialquiloCi_s, alquilCi-6Sulf onilo, alquilCi-6carbonilo ou mono- ou di (alquilCi-6) aminossulfonilo; R2 é hidrogénio, hidroxilo, amino, halo, alquiloCi-6, ciano, alceniloC2-6, poli-haloalquiloCi_6, nitro, fenilo, alquilCi_6Carbonilo, hidroxicarbonilo, 6 alquilCi-6carbonilamino, alquiloxiloCi-6, ou mono- ou di (alquilCi-6) amino; R3 é hidrogénio, alquiloCi-G ou alquiloxiloCi-6; quando R2 e R3 estão em átomos de carbono adjacentes, eles podem formar o radical bivalente -O-CH2-O-; e Q é alquiloxiCi-2carbonilo, hidroxicarbonilo ou tetra-hidropiraniloxiaminocarbonilo.

12. Processo para preparar um composto de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a) fazer reagir um composto de fórmula (II), em que Q é hidroxicarbonilo, aqui referido como compostos de fórmula (Il-b), com um intermediário de fórmula (III) na presença de reagentes apropriados tais como Ν' -(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-l,3- propanodiamina, monocloridrato (EDC) e 1-hidroxi-lR-benzotriazole (HOBT) com a formação de um composto de fórmula (Il-a),

(H-b)

b) fazer reagir um intermediário de fórmula (VI) com o carboxaldeido de fórmula (V) apropriado, em que t é um número inteiro com valor 0 ou 1, e quando t é 0 então é pretendida uma ligação direta, na presença 7 de um reagente apropriado, com a formação de um composto de fórmula (Il-a),

c) fazer reagir um composto de fórmula (II), em que Q é metil- ou etiloxicarbonilo (alquiloCi-2) , aqui referido como compostos de fórmula (II-c), com uma solução ácida ou solução básica apropriada, com a formação de um composto de fórmula (Il-b),

d) fazer reagir o éster etilico de ácido carboxilico de fórmula (IV) com o carboxaldeido de fórmula (V) apropriado, na presença de um reagente apropriado, com a formação de um composto de fórmula (II-c),

e) fazer reagir um intermediário de fórmula (XIV) com o intermediário de fórmula (XV) apropriado, na presença de um reagente apropriado, num solvente adequado, com a formação de um composto de fórmula (II-c),

f) fazer reagir um intermediário de fórmula (X) com um intermediário de fórmula (XI) em que W é um grupo de saida apropriado tal como, por exemplo, halo, por exemplo flúor, cloro, bromo ou iodo, ou um radical sulfoniloxilo tal como metilsulfoniloxilo, com a formação de um composto de fórmula (II-c), ou 9

g) fazer reagir um intermediário de fórmula (XII) com um intermediário de fórmula (XIII), em que W é um grupo de saida apropriado como descrito acima, com a formação de um composto de fórmula (II-c).

Lisboa, 17 de Abril de 2012