CN101370804B - 作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的新的氨基苯基衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明包括具有组蛋白脱乙酰基酶抑制酶活性的新的式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、X和Y具有所定义的含义；它们制备、含有它们的组合物以及它们作为药物的用途。

Description

作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的新的氨基苯基衍生物
本发明涉及具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。还涉及它们的制备、含有它们的组合物以及它们在体外和体内抑制HDAC的用途和作为药物的用途，例如用作抑制例如癌症和牛皮癣的增殖病症的药物。
已知细胞核组蛋白是负责调节基因转录和其它DNA模制过程(例如复制、修复、重组和染色体分离)的组织的整合和动力成分。其用于转译后的修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化。
组蛋白脱乙酰基酶在此称为“HDAC”，是催化除去蛋白质赖氨酸残基上的乙酰基修饰的酶，包括核心核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4。HDAC与在此称为“HAT″的组蛋白转乙酰酶一起调节组蛋白乙酰化的水平。核小体组蛋白乙酰化的平衡在许多基因的转录中起重要作用。组蛋白的低乙酰化与凝聚染色质结构有关，导致基因转录的抑制，而乙酰化的组蛋白与更多开放的染色质结构和转录的活化有关。
已知十一种结构上相关的HDAC，并将其分为两类。I类HDAC由HADC 1、2、3、8和11组成，而II类HADC由HDAC 4、5、6、7、9和10组成。第三类HDAC在结构上与I类和Il类HDAC不相关。I/II类HDAC按照锌-依赖的机理起作用，而III类HDAC是NAD-依赖的。
除组蛋白之外，其它的蛋白质也是乙酰化的底物，特别是转录因子，例如p53、GATA-1和E2F；核受体，例如糖皮质激素受体、甲状腺受体、雌激素受体；和细胞-周期调节蛋白质，例如pRb。乙酰化的蛋白质已经与蛋白质稳定相联，如p53稳定、辅因子的补充和增强的DNA结合。p53是肿瘤抑制基因，可根据许多应力信号(例如DNA损伤)诱导细胞周期停滞或细胞程序死亡。对于p53诱导的细胞周期停滞，主要的靶标似乎是p21基因。除了被p53活化，已经通过p21与细胞周期蛋白/依赖细胞周期蛋白的激酶配合物的结合证明其导致细胞周期停滞在G1和G2相，在衰老期间向上调节，以及与增殖细胞核抗原相互作用。
HDAC抑制剂的研究指出其在细胞周期停滞、细胞分化、细胞程序死亡和转化的显型的反转中起重要作用。
例如，抑制剂Trichostatin A(TSA)导致细胞周期停滞在G1和G2相、恢复不同细胞系的转化的显型和诱导Friend白血病细胞的分化等。已经报道了TSA(和辛二酰基苯胺异羟肟酸SAHA)抑制细胞生长、诱导终末分化和阻止小鼠体内肿瘤的形成(Finnin et al.，Nature，401：188-193，1999)。
还报道了Trichostatin A用于纤维化的治疗，例如肝脏纤维化和肝硬化(Geerts et al.，欧洲专利申请EP 0 827 742，1998年3月11日公开)。
HDAC抑制剂的药效基团由与HDAC的含锌活性位点相互作用的金属结合区、连接区和与活性点边缘上的残基相互作用的表面识别区或封端区组成。
还报道过HDAC的抑制剂诱导p21基因表达。通过染色质重制，然后乙酰化在p21启动子区域中的组蛋白H3和H4，促进了借助这些抑制剂的p21基因转录激活。这种p21的活化以不依赖p53的方式发生，因此HDAC抑制剂在具有突变的p53基因的细胞中起作用，突变的p53基因是许多肿瘤的检验标记。
此外，HDAC抑制剂可以具有间接的活性，例如增加宿主的免疫应答和抑制肿瘤的血管生成，因此可以抑制原发肿瘤的生长和阻碍转移(Mai et al.，Medicinal Research Reviews，25：261-309，2005)。
鉴于如上所述，HDAC抑制剂在细胞增殖疾病或病症(包括具有突变p53基因的肿瘤)的治疗中可能具有巨大的潜能。2003年8月14日公开的专利申请EP 1472216公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的双环异羟肟酸盐(bicyclic hydroxamate)。
此外，在2003年9月18日公开的专利中请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378中公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌嗪基嘧啶基异羟肟酸类，而EP 1485365公开了R306465。
在2003年10月9日公开的专利申请EP 1492534公开了作为HDAC抑制剂的含有哌嗪连接基团的氨基甲酸化合物。
在2003年10月23日公开的专利申请EP1495002公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌嗪基苯基苯甲酰胺化合物。
2003年11月13日公开的专利申请EP1501508公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯酰胺类。
2004年1月29日公开的专利申请WO04/009536公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的衍生物，在芳基基团和异羟肟酸之间含有烷基连接基。
2004年2月12日公开的专利申请EP1525199公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的(杂)芳基烯基取代的双环异羟肟酸类。
2004年6月24日公开的专利申请EP1572626公开了作为药理学试剂的亚芳基羧酸(2-氨基-苯基)-酰胺衍生物。
2004年7月29日公开的专利申请EP1581484公开了具有抗炎和抗肿瘤活性的N-羟基-苯甲酰胺衍生物。
2004年7月29日公开的专利申请EP1585735公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代芳基异羟肟酸盐衍生物。
2004年8月19日公开的专利申请EP1592667公开了作为药理学试剂的单-酰化的O-苯乙胺衍生物。
2004年8月19日公开的专利申请EP1590340公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的二氨基次苯基衍生物。
2004年8月26日公开的专利申请EP1592665公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯甲酰胺衍生物。
2004年8月26日公开的专利申请WO04/072047公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吲哚类、苯并咪唑类和萘并咪唑类。
2004年9月30日公开的专利申请EP1608628公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的非芳香杂环系统连接的异羟肟酸盐。
2004年10月14日公开的专利申请EP1613622公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的肟衍生物。
2004年10月28日公开的专利申请EP1611088公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的异羟肟酸盐衍生物。
2005年3月31日公开的专利中请WO05/028447公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯并咪唑类。
2005年4月7日公开的专利申请wO05/030704和W005/030705公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯甲酰胺类。
2005年5月6日公开了专利申请WO05/040101公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的酰基脲连接的和磺酰脲连接的异羟肟酸类。
2005年5月6日公开的专利申请wO05/040161公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的联芳基连接的异羟肟酸类。
2005年8月18日公开的专利申请WO05/075469公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的噻唑基异羟肟酸类和噻二唑基异羟肟酸类。
2005年9月22日公开的专利申请WO05/086898公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的杂戊环异羟肟酸类。
2005年10月6日公开的专利申请WO05/092899公开了作为组蛋白脱乙酰基酶烯基苯酰胺类。
本发明的化合物在结构上、药理学活性和/或药理学效价方面与先有技术不同。
要解决的问题是提供具有高酶催化活性和细胞活性的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其具有提高的生物利用度和/或体内效价。
本发明的新化合物解决了上述问题。本发明的化合物显示了出色细胞活性。在细胞的内和体内水平，其均具有很高的p21基因活化能力。它们具有所希望的药物代谢动力学分布图和对P450酶的低亲合性，这降低了药物-药物相互作用的风险，并具有较宽的安全界限。本发明的化合物的有益特性是代谢稳定性、溶解度和/或p21诱导性能。更特别的是本发明的化合物在水溶液中具有提高的溶解度和/或在体内具有提高的p21启动子诱导性能。
本发明涉及式(I)化合物
Figure S2007800030170D00041
其N-氧化物形式、药学可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中
n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；
m是整数1或2；
X是N或CH；
Y是O、S或NR8；其中
R8是氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基甲基、苯基C1-6烷基、-C(＝O)-CHR9R10或-S(＝O)2-N(CH3)2；其中各R9和R10独立地是氢、氨基或氨基C1-6烷基；以及当Y是NR8，并且R2在吲哚基的7-位时，R2和R8可一起形成二价基团
-(CH2)2-    (a-1)，或
-(CH2)3-    (a-2)；
R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基羰基或者单-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基；
R2是氢、羟基、氨基、卤代、C1-6烷基、氰基、C2-6烯基、多卤代C1-6烷基、硝基、苯基、C1-6烷基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或者单-或二(C1-6烷基)氨基；
R3是羟基或氨基；
R4是氢、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任选被以下基团取代：卤代、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷基氧基、苯基C1-6烷基氧基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基、多卤代C1-6烷基氧基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羟基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、异噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；
R5、R6和R7各自独立地是氢、氨基、硝基、呋喃基、卤代、C1-6烷基、C1-6烷基氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R11。
术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂”用来表示能够与组蛋白脱乙酰基酶相互作用并抑制其活性，更具体地讲是抑制其酶活性的化合物。抑制组蛋白脱乙酰基酶酶活性意味着降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力。优选的，此抑制是特定的，即，所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂在一定浓度下降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力，所述的浓度低于该抑制剂产生其它不相关生物效应的浓度。
在上述定义和在下文中所用的卤代是一般指氟代、氯代、溴代和碘代；C1-2烷基是指直链饱和烃基团，其具有1或2个碳原子，例如甲基或乙基；C1-6烷基是指C1-2烷基和具有3-6个碳原子的直链或支链的饱和烃基，例如例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、己基、2-甲基戊基等；多卤代C1-6烷基表示含有三个相同或不同卤代取代基，例如三氟甲基；C2-6烯基表示含一个双键的直链和支链烃基并具有2到6个碳原子，例如例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C3-6炔基是指含一个三键的直链和支链烃基并具有3到6个碳原子，例如例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；C3-7环烷基包括具有3到7个碳的环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基等。
药学可接受的加成盐包括药学可接受的酸加成盐和药学可接受的碱加成盐。在上文提到的药学可接受的酸加成盐是指包括式(I)化合物能形成的治疗活性的无毒的酸加成盐形式。具有碱性的式(I)化合物可以通过将所述碱形式用合适的酸处理转化为它们的药学可接受的酸加成盐。合适的酸包括例如无机酸，如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸；或有机酸，例如乙酸、三氟醋酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。
具有酸性的式(I)化合物通过将所述酸形式用合适的有机或无机碱处理可转化为它们药学可接受的碱加成盐。合适的碱盐形式包括例如铵盐、碱金属盐和碱土碱金属盐(例如锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)、与有机碱形成的盐(例如苄星青霉素盐、N-甲基-D-葡萄糖胺盐、海巴胺盐(hydrabamine salts))以及与例如精氨酸、赖氨酸等氨基酸形成的盐。
术语“酸或碱加成盐”还包括式(I)化合物能形成的水合物和溶剂加成形式。这类形式的实例例如是水合物、醇化物等。
这里使用的术语“式(I)化合物的立体化学异构形式”定义为所有式(I)化合物可能具有的、由相同原子以相同键序组成但是具有不同的不可互换的三维结构的可能的化合物。除非另作说明或指示，化合物的化学命名包括所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构形式的混合物。
所述混合物可能含所述化合物基本分子结构的所有非对应异构体和/或对映异构体。式(I)化合物的所有立体化学异构形式的纯净形式或彼此混合形式均包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式包括那些式(I)化合物，其中一个或多个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物，特别是其中哌啶基、哌嗪基或哒嗪基的一个或多个氮被氧化的那些N-氧化物。
一些式(I)化合物可能还以其互变异构形式存在。尽管这类形式未在上式中明确指出，但是也包括在本发明范围内。
在下文中无论何时使用，术语“式(I)化合物”还包括药学可接受的加成盐和所有的立体异构形成。
这里使用的术语“组蛋白脱乙酰基酶”和“HDAC”用于表示从在组蛋白N-末端的赖氨酸残基的ε-氨基除去乙酰基的一系列酶的任何一种。除非上下文另有说明，术语“组蛋白”用于表示来自任何物种的任何组蛋白蛋白质，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白质或基因产品非限制性地包括HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。所述组蛋白脱乙酰基酶还可来自原生动物或真菌来源。
第一组感兴趣的化合物包括其中R4的不是氢的那些式(I)化合物。
第二组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：
a)n是0或1；
b)m是1或2；
c)X是N或CH；
d)Y是NR8，其中R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基或C3-6环烷基甲基；
e)R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基或C1-6烷基磺酰基；
f)R2是氢或卤代；
g)R3是氨基；
h)R4是氢或噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
第三组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：
a)n是0或1；
b)m是1或2；
c)X是N或CH；
d)Y是NR8，其中R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基或C3-6环烷基甲基；
e)R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
f)R2是氢或卤代；
g)R3是氨基；
h)R4是氢；和
i)R5、R6和R7各为氢。
第四组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：
a)n是0或1；
b)m是1或2；
c)X是N或CH；
d)Y是NR8，其中R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基或C3-6环烷基甲基；
e)R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
f)R2是氢或卤代；
g)R3是氨基；
h)R4是氢或噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
感兴趣的化合物的优选组包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：
a)n是1；
b)m是1或2；
c)X是N或CH；
d)Y是NR8，其中R8是C1-6烷基例如甲基或乙基；
e)R1是氢、羟基C1-6烷基或C1-6烷基磺酰基；
f)R2是氢或卤代例如氟代或氯代，尤其是在4-、5-或7-位；
g)R3是氨基；
h)R4是氢或噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
感兴趣的化合物的最优选组包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物：
a)n是1；
b)m是1；
c)X是N；
d)Y是NR8，其中R8是甲基；
e)R1是氢；
f)R2是氢或卤代例如氟代或氯代，尤其是在4-、5-或7-位；
g)R3是-NH2；
h)R4是氢或2-噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
特别优选的式(I)化合物是化合物No.2，即下式化合物：
式(I)化合物、其药学可接受的盐以及其N-氧化物和立体化学异构形式可以以常规方式制备。起始物质和一些中间体是已知的化合物，并且是商业可得的，或者可以根据本领域公知的常规反应操作或发专利申请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述制备。一些制备方法将在下文更详细描述。获得最终式(I)化合物的其它方法描述于实施例。
式(I)化合物可以通过将式(II)中间体(其中M表示氢或碱金属如钠或锂)与式(III)化合物在碱例如三乙胺和苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷并-磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)存在下反应来制备。所述反应是在适宜的溶剂例如四氢呋喃或二氯甲烷或其混合物中进行的。
或者，式(I)化合物可以通过在适宜的溶剂例如二氯甲烷中将式(II)化合物转化成酰基氯例如通过用磺酰氯(SOCl2)处理，然后将所得酰基氯化合物与式(III)化合物在碱例如吡啶存在下在适宜的溶剂例如二氯甲烷或THF中反应。
通过本领域已知的反应或官能团转化，式(I)化合物还可以相互转化，其取决于在该分子中的其它基团的敏感性，例如羧酸酯类水解成相应的羧酸或醇；酰胺类水解成相应的羧酸和胺类；腈类水解成相应的酰胺类；通过本领域已知的重氮化反应接着由氢置换所述的重氮基，苯基上的氨基可以被氢取代；醇类可以转化成酯类和醚类；伯胺类可以转化成仲胺类或叔胺类；双键可氢化成相应的单键；在适宜的钯催化剂存在下通过插入一氧化碳，苯基上的碘基团可以转化成酯基。
式(II)中间体可以通过将式(III)中间体与适宜的酸性溶液例如盐酸、或与适宜的碱金属碱例如氢氧化钠，在适宜的溶剂如乙醇中，通常在回流下反应来制备。
Figure S2007800030170D00111
式(III)中间体可以通过将式(IV)的羧酸乙酯与适宜的式(V)的醛(其中t是0或1)，在适宜的试剂例如硼氢化钠如四氢硼化钠存在下，在适宜的溶剂例如醇如甲醇中反应来制备。
Figure S2007800030170D00112
以类似的方式，式(III)中间体可以如上所述通过将式(IVa)中间体与式(Va)中间体反应来制备。
Figure S2007800030170D00113
式(III)中间体也可以通过将式(IV)中间体与式(VI)中间体(其中W是适宜的离去基团例如，例如卤代如氟、氯、溴或碘，或磺酰氧基团如甲基磺酰基氧基、4-甲基苯基磺酰基氧基等)反应来制备。该反应可在反应惰性溶剂中进行，该溶液例如，例如醇如甲醇、乙醇、2-甲氧基-乙醇、丙醇、丁醇等；醚如4，4-二噁烷、1，1′-氧基二丙烷等；酮如4-甲基-2-戊酮或N，N-二甲基甲酰胺，硝基苯，乙腈等。添加适宜的碱例如碱金属的或碱土金属的碳酸盐或碳酸氢盐，例如三乙胺或碳酸钠，可以用于清除在反应期间释放的酸。少量的适宜的金属碘化物如碘化钠或碘化钾可以被加入以促进该反应。搅拌可以增强反应的速度。该反应可以方便地在室温至反应混合物回流温度的温度范围内进行，如果需要，该反应可以在加压下进行。
以类似的方式，式(III)中间体可以如上所述通过将式(VII)中间体与式(VIII)中间体(其中W是适宜的离去基团)反应来制备。
Figure S2007800030170D00122
式(I)化合物和一些中间体可能在其结构中具有至少一个立体中心。该立体中心可以R或S构象存在。
在上述方法中制备的式(I)化合物通常是对映异构体的外消旋混合物，所述对映异构体可用本领域已知的拆分方法彼此分离。式(I)的外消旋化合物可通过与合适的手性酸反应转化为相应的非对映体盐形式。随后分离所述非对映体盐形式，例如通过选择结晶或分级结晶，然后用碱释出对映异构体。分离式(I)化合物对映异构体形式的另一种方法涉及用手性固定相的液相色谱。所述纯立体化学异构形式还可从合适原料的相应纯立体化学异构形式获得，条件是反应立体选择性地发生。如果需要特定的立体异构体，优选通过立体有择的制备方法合成所述化合物。这些方法使用对映异构纯的原料是有利的。
式(I)化合物、其药学可接受的酸加成盐和立体异构形式具有有价值的药理学特性，因为它们具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制效果。
本发明提供了一种通过给予有效量的本发明化合物抑制细胞(包括转化的细胞)异常生长的方法。细胞的异常生长指的是不受正常调节机制(例如接触抑制丧失)支配的细胞生长。这包括肿瘤生长的抑制，通过导致癌细胞生长停滞、终末分化和/或细胞程序死亡而直接抑制，以及抑制肿瘤的新血管形成而间接抑制。
本发明还提供一种通过给受试者给予有效量的本发明化合物抑制肿瘤生长的方法，该受试者例如是需要这类治疗的哺乳动物(特别是人)。特别是，本发明提供了一种通过给予有效量的本发明化合物抑制肿瘤生长的方法。可抑制的肿瘤的实例包括但不限于：肺癌(例如腺癌，并且包括非小细胞肺癌)、胰癌(例如，胰腺癌，例如外分泌胰腺的癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、前列腺癌(包括前期病变)、淋巴系统的造血肿瘤(例如，急性淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、甲状腺小囊癌、脊髓发育不良综合症(MDS)、间质源性肿瘤(例如，纤维内瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如，角化棘皮瘤)、乳房癌(例如，前期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
根据本发明的化合物可以用于其它的治疗目的，例如：
a)在用于治疗癌症的对肿瘤放射照射之前、期间或之后通过给予本发明化合物促进肿瘤对放射疗法的敏感性；
b)治疗关节病和骨病理学病症，如类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年关节炎、痛风、多发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮；
c)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖病症、动脉粥样硬化和再狭窄；
d)治疗炎症和与皮肤病症，如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、过敏性鼻炎、移植物抗宿主疾病(graft vs.host disease)、结膜炎、哮喘、ARDS、贝切特氏病、移植排斥反应、荨麻疹、过敏性皮炎、斑秃、硬皮病、皮疹、湿疹、皮肌炎、痤疮、糖尿病、全身性红斑狼疮、川崎病、多发性硬化、肺气肿、囊性纤维化和慢性支气管炎；
e)治疗子宫内膜异位、子宫平滑肌瘤、功能障碍性子宫出血和子宫内膜增生；
f)治疗眼的血管化，包括侵袭视网膜和脉络膜血管的血管病变；
g)治疗心脏功能紊乱；
h)抑制免疫抑制症状，如治疗HIV感染；
i)治疗肾功能紊乱；
j)抑制内分泌异常；
k)抑制葡萄糖异生作用的功能紊乱；
l)治疗神经病，如帕金森氏症，或治疗导致认知异常的神经病，例如阿尔茨海默氏病或与神经元疾病相关的聚谷氨酰胺病(polyglutamine)；
m)治疗精神错乱，例如精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、焦虑和精神异常；
n)抑制神经肌肉的病变，例如肌萎缩性侧索硬化；
o)治疗脊髓性肌萎缩；
p)治疗其它的受基因加强表达治疗作用的病症；
q)加强基因疗法；
r)抑制脂肪生成；
s)治疗寄生虫病，如疟疾。
因此，本发明公开了用作药物的式(I)化合物，以及这些式(I)化合物在制备治疗一种或多种上述病症的药物中的用途。
式(I)化合物、其药学可接受的酸加成盐和其立体异构形式具有有价值的诊断特性，因为它们可用于测定或确定生物样品中的HDAC，包括检测或测定在标记化合物和HDAC之间配合物的形成。
所述检测或确定方法可以使用用标记试剂标记的化合物，标记试剂例如是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括心125I、131I、3H和14C。酶通常通过合适底物的结合，接着催化可检测反应来检测酶。酶的实例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化酶。发光物质包括例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、水母发光蛋白和萤光素酶。
生物样品可以定义为身体组织或体液。体液的例子是脑脊液、血液、血浆、血清、尿，痰液、唾液等。
考虑到本发明化合物有用的药理学特性，其可配制到多种药物形式中用于给药。为了制备本发明的药物组合物，有效量特定的化合物以碱或酸加成盐的形式作为活性成分与药学可接受的载体完全混合，载体可以采用多种形式，取决于希望给药的制剂的形式。这些药物组合物理想地是适合的单元剂型，优选用于口服、直肠给药、经皮给药或肠道外注射。例如，在口服剂型组合物的制备中，可使用任何常用的药物介质，例如，例如在口服液体药剂例如悬浮液、糖浆剂、酏剂和溶液的情况下，使用水、二醇、油、醇等；在粉末、丸、胶囊和片的情况下使用固体载体如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
由于给药容易，片剂和胶囊是最有利的口服单位剂型，在这样的情况下，显然使用的是固体药物载体。对于肠道外给药的组合物，虽然可以包括其它成分，例如助溶成分，但是载体通常含有无菌水，至少占大部分。例如，可制备可注射的溶液，其中载体包括生理盐水、葡萄糖溶液或生理盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可制备可注射的悬浮液，在这样的情况下，可使用合适的液体载体、助悬剂等。在适用于经皮给药的组合物中，载体任选含有渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选与比例较小的任何性质的合适添加剂结合，添加剂对皮肤不产生显著的有害影响。所述添加剂可促进对皮肤的给药和/或有助于制备所需组合物。这些组合物可以多种方式给药，例如作为透过皮肤起作用的贴片、作为点滴剂(spot-on)或作为软膏。
以剂量单元形式配制上述药物组合物对于方便给药和用量的一致性是特别有益的。在说明书和权利要求中所用的单位剂型指的是物理上地不连续的、合适作为单位剂量的单位，每个单位含有预定量的活性成分，适于产生所需的治疗效果，并与需要的药物载体结合。这样的单位剂型的例子是片剂(包括划痕片剂或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包、扁囊剂(wafers)、可注射的溶液或悬浮液、茶匙剂、汤匙剂等，及其分隔开的多重剂量组合。
从在下文中提供的测试结果，本领域技术人员可以容易地确定有效量。通常，治疗有效量可以从0.005mg/kg体重到100mg/kg体重，特别是从0.005mg/kg体重到10mg/kg体重。在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔给药可能是适当的。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有含0.5-500mg、特别是10mg-500mg的活性成分。
作为本发明的另一个方面，提出了HDAC-抑制剂与另一抗癌剂组合，特别是用作药物，更准确地说是在癌症或相关疾病的治疗中。
对于上述病症的治疗，本发明的化合物可有利地与一种或多种其它药剂联合使用，更具体地讲是与其它的抗癌剂联合使用。抗癌剂的实例是：
-铂配位化合物，例如顺铂、卡铂或奥沙利铂；
-紫杉烷化合物，如紫杉醇(紫杉醇)或多西紫杉醇；
-拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物，例如伊立替康或托泊替康；
-拓扑异构酶II抑制剂，如抗肿瘤鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；
-抗肿瘤长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱或长春瑞滨；
-抗肿瘤核苷衍生物，例如5一氟尿嘧啶、吉西他滨或卡培他滨；
-烷基化剂，如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司汀；
-抗肿瘤蒽环素(anthracycline)衍生物，例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星或米托蒽醌；
-HER2抗体，例如曲妥单抗(曲妥单抗)；
-雌激素受体拮抗剂或选择性的雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟维司群(faslodex)或雷洛昔芬；
-芳香酶(芳香酶)抑制剂，如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑(letrazole)和伏氯唑；
-分化剂，如类视黄醇、维生素D和维甲酸代谢作用阻滞剂(RAMBA)，例如异维生素A酸(accutane)；
-DNA转甲基酶抑制剂，例如氮胞苷；
-激酶抑制剂，如flavoperidol、甲磺酸伊马替尼或吉非替尼(gefitinib)；
-法尼基转化酶(farnesyltransferase)抑制剂；
-其它的HDAC抑制剂；
-泛素-蛋白酶体途径抑制剂，例如万珂(Velcade)；或
-yondelis。
在此所用的术语“铂配位化合物”表示任何抑制肿瘤细胞生长的铂配位化合物，其提供离子形式的铂。
术语“紫杉烷化合物”表示具有紫杉烷环系的一类化合物，其与紫杉属(Taxus)某些树种的萃取物相关或由所述萃取物衍生。
术语“拓扑异构酶抑制剂”用于表示能够改变真核细胞内DNA拓扑结构的酶。它们对于重要的细胞功能和细胞增殖很关键。在真核细胞中有两种类型的拓扑异构酶，即I型和II型。拓扑异构酶I是大约100,000分子量的单体酶。所述酶与DNA结合并引入一个暂时性单链缺口，解开双螺旋(或使其解开)，然后经缺口再次封闭，之后从DNA链上分离。拓扑异构酶II具有类似的作用机理，包括引入DNA链的缺口或形成自由基。
术语“喜树碱化合物”用于表示与母体喜树碱化合物相关或由其衍生的化合物，母体喜树碱化合物是从中国树种Camptothecin acuminata和印度树种Nothapodytesfoetida获得的不溶于水的生物碱。
术语“鬼臼霉素化合物”用于表示与母体鬼臼霉素有关或由其衍生的化合物，鬼臼霉素萃取自曼德拉草植物(mandrake)。
术语“抗肿瘤长春花生物碱″用于表示与长春花植物(Vincarosea)的萃取物有关或由其衍生的化合物。
术语“烷基化剂”包括不同类的化学试剂，其具有共同的特性，即，其具有在生理条件下给生物学生命大分子(例如DNA)提供烷基的能力。对于大多数更重要的试剂，例如氮芥类和亚硝基脲类，在复杂的降解反应之后在体内生成活性的烷基化片断，其中一些降解反应是酶催化的。烷基化剂最重要的药理作用是干扰涉及细胞增殖基本进程，特别是DNA合成和细胞分裂。烷基化剂能够干扰迅速增殖的组织中DNA功能和完整性，这提供为其治疗应用和其许多的毒性提供了基础。
术语“抗肿瘤蒽环素衍生物”包括从真菌Strep.peuticus var.caesius获得的抗生素及其衍生物，其特征在于具有四环素环结构，通过糖苷键连接一个特殊的糖：氨基糖柔胺(daunosamine)。
已经指出在原发性乳房癌中人表皮生长因子受体2蛋白质(HER2)的扩增与某些患者的不良临床预后结果有关。曲妥单抗是一种高度纯化重组DNA-衍生的人化单克隆IgGl-κ抗体，其高亲合性和高特异性地与HER2受体的胞外域结合。
许多乳腺癌具有雌激素受体，雌激素可促进这些肿瘤的生长。术语“雌激素受体拮抗剂”和“选择性雌激素受体调节剂”用来表示与雌激素受体(ER)结合的雌二醇的竞争性抑制物。选择性的雌激素受体调节剂与ER结合时，导致受体的三维形状改变，调节其与雌激素效应元件(ERE)在DNA上的结合。
在绝经后妇女中，循环的雌激素的主要来源是肾上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睾丸激素)在周围组织中通过芳香酶酶转化为雌激素(雌甾酮和雌二醇)。通过芳香酶抑制或钝化导致雌激素损失对于一些患有激素依赖性乳腺癌的绝经后患者是有效的和选择性的治疗。
在此使用的术语“抗雌激素剂”不但包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括如上所述的芳香酶抑制剂。
术语“分化剂”包括可以多种方式抑制细胞增殖和诱导分化的化合物。已知在多种正常和恶性细胞类型的生长调节和分化中，维生素D和类视黄醇起了重要的作用。维甲酸代谢阻滞剂(RAMBA′s)通过抑制维甲酸的细胞色素P450-介导的分解代谢提高内源性维甲酸的水平。
DNA甲基化变化属于人类肿瘤形成中最常见的异常。在选择的基因的启动子中，高甲基化通常与所涉及基因的钝化有关。术语“DNA甲基转移酶抑制剂”用来表示通过DNA转甲基酶的药理学抑制和肿瘤抑制基因表达的再活化起作用的化合物。
术语“激酶抑制剂”包括激酶的有效抑制剂，起涉及细胞周期发展和细胞程序死亡(编程性细胞死亡)。
术语“法尼基转移酶抑制剂”用来表示被设计用于阻止Ras和其它细胞内蛋白质的法尼基化的化合物。它们已经显示出对恶性细胞增殖和存活有效。
术语“其它的HDAC抑制剂”包括但不限于：
-羧酸酯类，例如丁酸酯、肉桂酸、4-苯基丁酸酯或丙戊酸；
-异羟肟酸类，例如辛二酰基苯胺异羟肟酸(SAHA)、含哌嗪的SAHA类似物、联芳基异羟肟酸A-161906及其咔唑基醚-、四氢吡啶-和四氢萘酮-类似物、双环芳基-N-羟基羧酰胺类、pyroxamide、CG-1521、PXD-101、磺酰胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)、oxamflatin、scriptaid、与scriptaid相关的三环分子、间-羧基肉桂酸二异羟肟酸(CBHA)、CBHA样异羟肟酸类、trapoxin-异羟肟酸类似物、CRA-024781、R306465和苯甲酰基-和杂芳基-相关的异羟肟酸类、氨基辛二酸酯和丙二酰基二酰胺；
-环状四肽类，例如trapoxin、apidicin、缩酚酸肽(depsipeptide)、spiruchostatin-相关的化合物、RedFK-228、含巯基的环状四肽类(SCOPs)、含异羟肟酸的环状四肽类(CHAPs)、TAN-174s和azumamides；
-苯甲酰胺为，例如MS-275或CI-994，或
-depudecin。
术语“泛素-蛋白酶体通道抑制剂”用于表示抑制蛋白酶体内细胞蛋白质(包括细胞周期调节蛋白质)的靶向破坏的化合物。
为了治疗癌症，根据本发明的化合物可如上所述与放射联合给药于患者。放射的意思是指电离辐射，并且特别是伽马辐射，尤其是通过直线加速器或通过现在通用的放射性核素发射的射线。通过放射性核素对肿瘤辐照可以是外部的或内部的。
本发明还涉及抗癌剂和本发明的HDAC抑制剂的根据本发明的组合物。
本发明还涉及根据本发明的组合物，其用于医药治疗，例如抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还涉及根据本发明的组合物，其用于抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还涉及抑制人受试者内肿瘤细胞生长的方法，其包括给所述受试者给予有效量的本发明组合物。
本发明进一步提供了一种抑制细胞异常生长的方法，包括通过给予有效量本发明组合物转化细胞。
其它的药剂和HDAC抑制剂可以同时(例如，以分离的或单一的组合物)或以任一顺序相继给药。就后一种情况而言，两种化合物可在一定周期内以足够保证实现有益效果或协同效应的量和方式给药。应理解，优选的给药方法和顺序以及该组合物中各个成分的各自剂量和给药方案取决于所给予的特定的其它药剂和HDAC抑制剂、它们的给药途径、所治疗的特定肿瘤和被治疗的特定宿主。最恰当的给药方法和顺序以及剂量和给药方案可容易地由本领域技术人员用常规方法并考虑在此所列出的信息确定。
铂配位化合物有利地以每个疗程每平方米体表面积1-500mg(mg/m2)的剂量给药，例如50-400mg/m2，特别地，顺氯氨铂剂量为约75mg/m2，卡铂剂量为约300mg/m2。
紫杉烷化合物有利地以每个疗程每平方米体表面积50-400mg(mg/m2)的剂量给药，例如75-250mg/m2，特别地，紫杉醇剂量为约175-250mg/m2，多西紫杉醇剂量为约75-150mg/m2。
喜树碱化合物有利地以每个疗程每平方米体表面积0.1-400mg(mg/m2)的剂量给药，例如1-300mg/m2，特别地，伊立替康剂量为约100-350mg/m2，托泊替康剂量为约1-2mg/m2。
抗肿瘤鬼臼毒素衍生物有利地以每个疗程每平方米体表面积30-300mg(mg/m2)的剂量给药，例如50-250mg/m2，特别地，依托泊苷剂量为约35-100mg/m2，替尼泊苷剂量为约50-250mg/m2。
抗肿瘤长春花生物碱有利地以每个疗程每平方米体表面积2-30mg(mg/m2)的剂量给药，特别地，长春碱剂量为约3-12mg/m2，长春新碱剂量为约1-2mg/m2，长春瑞滨剂量为约10-30mg/m2。
抗肿瘤核苷衍生物有利地以每个疗程每平方米体表面积200-2500mg(mg/m2)的剂量给药，例如700-1500mg/m2，特别地，5-氟尿嘧啶剂量为200-500mg/m2，吉西他滨剂量为约800-1200mg/m2，卡培他滨剂量为约1000-2500mg/m2。
烷基化剂如氮芥或亚硝基脲有利地以每个疗程每平方米体表面积100-500mg(mg/m2)的剂量给药，例如120-200mg/m2，特别地，环磷酰胺剂量为约100-500mg/m2，苯丁酸氮芥剂量为约0.1-0.2mg/kg，卡莫司汀剂量为约150-200mg/m2，洛莫司汀剂量为约100-150mg/m2。
抗肿瘤蒽环素衍生物有利地以每个疗程每平方米体表面积10-75mg(mg/m2)的剂量给药，例如15-60mg/m2，特别地，多柔比星剂量为40-75mg/m2，柔红霉素剂量为约25-45mg/m2，伊达比星剂量为约10-15mg/m2。
曲妥单抗有利地以每个疗程每平方米体表面积1-5mg(mg/m2)的剂量给药，特别是2-4mg/m2。
根据特定的药剂和被治疗的症状，抗雌激素药剂有利地以每天约1-100mg的剂量给药。他莫昔芬有利地以5-50mg的剂量口服给药，优选10-20mg每天两次，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗效果。托瑞米芬有利地以约60mg的剂量一天一次经口给药，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗效果。阿那曲唑有利地以约1mg的剂量一天一次经口给药。屈洛昔芬有利地以约20-100mg的剂量一天一次经口给药。雷洛昔芬有利地以约60mg的剂量一天一次经口给药。依西美坦有利地以约25mg的剂量一天一次经口给药。
这些剂量可以每疗程例如一次、两次或多次给药，其可例如每隔7天、14天、21天或28天重复。
考虑到它们的有用的药理学特性，本发明组合物的成分，即所述的其它药剂和所述的HDAC抑制剂可以被配制成用于给药目的的各种药物形式。所述成分可分别地配制在单一的药物组合物中，或配制在含有这两种成分的整体药物组合物中。
本发明因此还涉及药物组合物，其含有所述的其它药剂和所述的HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明还涉及药物组合物形式的根据本发明的组合物，其含有抗癌剂和根据本发明的HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明进一步涉及根据本发明的组合物在生产抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
本发明进一步涉及一种产品，其含有作为第一活性成分的根据本发明的HDAC抑制剂和作为第二活性成分的抗癌剂，所述产品为组合的制剂，用于同时、单独或相继用于治疗罹患癌症的患者。
实验部分
在下文中，术语′K2CO3′表示碳酸钾，′CH2Cl2′表示二氯甲烷，′MgSO4′表示硫酸镁，′DIPE′表示二异丙醚，′THF′表示四氢呋喃，′EtOAc′表示乙酸乙酯，′DMF′表示N，N-二甲基甲酰胺，′DMSO′表示二甲亚砜，′Et3N′表示三乙胺，′NaBH4′表示四氢硼化钠(-1)，′NaBH3CN′表示氰基硼氢化钠，′PyBOP′表示苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷并-磷鎓六氟磷酸酯，′DIPEA′表示N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺，′NH4OH′表示氢氧化铵，′CH3OH′表示甲醇，′NH4HCO3′表示碳酸氢铵，′M.P.′表示熔点。
A.中间体的制备
实施例A1
a)制备中间体1
Figure S2007800030170D00221
在N2流下将2-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)乙基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(0.017mol)在DMF(17ml)中的溶液在室温下加至氢化钠(0.034mol)在DMF(11ml)中的混悬液中。将该混合物在室温下搅拌1小时。滴加1-碘代丙烷(0.034mol)。将该混合物在室温下搅拌2小时，倾入到H2O和NaCl中，再用EtOAc萃取。将有机层用H2O洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂，得到7.77g的中间体1。
b)制备中间体2
Figure S2007800030170D00222
将中间体1(0.021mol)和肼/H2O(0.106mol)在乙醇(100ml)中的混合物搅拌并回流2小时，然后冷却至室温，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂，得到5g(100％)的中间体2。
实施例A2
a)制备中间体3
Figure S2007800030170D00231
在N2流下将2-(甲基磺酰基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.094mol)在乙腈(40ml)中的溶液在10℃下加至4-哌啶甲醇(0.086mol)和K2CO3(0.172mol)在乙腈(200ml)中的混悬液中。将该混合物置于室温，然后搅拌4小时，倾入到H2O中，再用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(23g)从乙腈/乙醚中结晶。蒸发母层，再将获得的残余物通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 97/3/0.1；20-45μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到4.6g(20％)(M.P.：129℃)的中间体3。
b)制备中间体4
Figure S2007800030170D00232
在N2流下将DMSO(0.127mol)在-78℃下加至乙二酰氯(ethanedioyl dichloride，0.061mol)在CH2Cl2(110ml)中的溶液中。将该混合物搅拌15分钟。加入中间体3(0.051mol)在CH2Cl2(200ml)中的溶液。将该混合物在-78℃下搅拌1小时30分钟。滴加Et3N(0.26mol)。将该混合物在-78℃下搅拌15分钟，然后冷却至室温达2小时30分钟。加入H2O。将该混合物用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(14g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：环己烷/EtOAc 70/30；20-45μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到7.6g(57％)的中间体4。
c)制备中间体5
Figure S2007800030170D00241
在N2流下将NaBH3CN(0.034mol)和乙酸(0.023mol)加至中间体2(0.021mol)和中间体4(0.021mol)在CH3OH(500ml)中的溶液中。将该混合物搅拌72小时，倾入到10％K2CO3溶液中，再用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(10.4g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 97/3/0.1；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到5.5g(54％)的中间体5。
d)制备中间体6
将中间体5(0.001mol)和氢氧化钠(0.004mol)在乙醇(50ml)中的混合物搅拌并回流5小时，然后冷却至室温，蒸发至干燥。将残余物置于乙醚中。将沉淀物物滤出，干燥，得到0.407g(85％)(M.P.：＞260℃)的中间体6为钠盐(.Na)。
实施例A3
a)制备中间体7
Figure S2007800030170D00243
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0076mol)和1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.0114mol)在CH3OH(80ml)中的混合物搅拌并回流15小时，然后冷却至室温。分批加入NaBH4(0.012mol)。将该混合物在室温下搅拌过夜，倾入到H2O中，再用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(3.2g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 95/6/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到1.6g(53％)的中间体7。
b)制备中间体8
Figure S2007800030170D00251
将中间体7(0.0037mol)和氢氧化钠(0.0074mol)在乙醇(60ml)中的混合物在50℃下搅拌15小时，然后冷却至室温，再蒸发溶剂至干燥，得到1.5g(100％)的中间体8为钠盐(.Na)。
实施例A4
a)制备中间体9
在N2流下将氢化钠(0.0026mol，60％，在油中)分批加至5-氟-1H-吲哚-3-甲醛(0.0024mol)在DMF(8ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌30分钟。滴加1-碘代丙烷(0.0029mol)。将该混合物在室温下搅拌2小时，再倾入到冰水中。将沉淀物过滤，用H2O洗涤，干燥，得到0.44g(88％)的中间体9。
实施例A5
a)制备中间体10
Figure S2007800030170D00261
在N2流下将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0053mol)、中间体9(0.008mol)和MgSO4(1.5g)在CH3OH(100ml)中的混合物搅拌并回流过夜，然后冷却至5℃。加入NaBH4(0.0091mol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(3.4g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 97/3/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到1.3g(54％)的中间体10。
b)制备中间体11
Figure S2007800030170D00262
将中间体10(0.0029mol)和氢氧化钠(0.0057mol)在乙醇(50ml)中的混合物在60℃搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发溶剂，得到0.8g(54％)的中间体11为钠盐(.Na)。
实施例A6
a)制备中间体12
Figure S2007800030170D00263
在N2流下将4-哌啶甲醇(0.033mol)在CH2Cl2(80ml)中的溶液在室温下加至2-氯-5-嘧啶甲酸甲酯(0.066mol)和DIPEA(0.083mol)在CH2Cl2(100ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌3小时30分钟，倾入到冰水中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将残余物置于戊烷中。将沉淀物物滤出，干燥，得到7.88g(95％)的中间体12。
b)制备中间体13
在N2流下将DMSO(0.058mol)在-78℃下滴加至乙二酰氯(0.0278mol)在CH2Cl2(50ml)中的溶液中。将该混合物搅拌15分钟。滴加中间体12(0.023mol)在CH2Cl2(200ml)中的溶液。将该混合物在-78℃下搅拌1小时30分钟。滴加Et3N(0.118mol)。将该混合物在-78℃下搅拌1小时，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物从乙醚中结晶。将沉淀物物滤出，干燥，得到3.06g(54％)的中间体13。
c)制备中间体14
Figure S2007800030170D00272
在N2流下将NaBH3CN(0.019mol)在5℃下分批加至中间体13(0.0125mol)和1H-吲哚-3-乙胺(0.0125mol)在CH3OH(250ml)中的溶液中。加入乙酸(1ml)。将该混合物在室温下搅拌48小时。加入K2CO310％。将该混合物用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(5g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.3；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到3g(60％)的中间体14。
d)制备中间体15
Figure S2007800030170D00273
将中间体14(0.0064mol)和氢氧化钠(0.025mol)在乙醇(80ml)中的混合物在80℃下搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发。将残余物置于乙醚中。将沉淀物物滤出，干燥，得到2g(78％)的中间体15为钠盐(.Na)。
实施例A7
a)制备中间体16
Figure S2007800030170D00281
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0049mol)、1H-吲哚-3-乙醇甲磺酸盐(0.0054mol)和K2CO3(0.01mol)在乙腈(20ml)中的混合物搅拌并回流过夜，然后冷却，倾入到冰水中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(2.2g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.2；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.442g(22％)的中间体16。
b)制备中间体17
Figure S2007800030170D00282
甲磺酰氯(0.0018mol)在室温下滴加至中间体16(0.0012mol)和Et3N(0.0036mol)在CH2Cl2(15ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌过夜，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂，得到0.6g(100％)的中间体17。
c)制备中间体18
Figure S2007800030170D00291
将中间体17(0.012mol)和氢氧化钠(0.036mol)在乙醇(40ml)中的混合物在60℃下搅拌5小时，然后蒸发至干燥。将残余物置于乙醚中。将该混合物蒸发至干燥，得到0.6g(100％)的中间体18为钠盐(.Na)。
实施例A8
a)制备中间体19
Figure S2007800030170D00292
丙酰氯(0.0018mol)在0℃下加至中间体16(0.0012mol)在Et3N(0.5ml)和CH2Cl2(15ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌过夜，倾入到冰水中，再用CH2Cl2萃取。将有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂，得到0.56g(100％)的中间体19。将该产物直接用于下一反应步骤。
b)制备中间体20
Figure S2007800030170D00293
将中间体19(0.0012mol)和氢氧化钠(0.15g)在乙醇(50ml)中的混合物在60℃下搅拌6小时，然后冷却至室温，蒸发。将残余物置于乙醚中。将该混合物蒸发至干燥，得到0.55g(100％)的中间体20为钠盐(.Na)。将该产物直接用于下一反应步骤。
B、化合物的制备
实施例B1
制备化合物1
将Et3N(0.0037mol)在室温下加至中间体6(0.0008mol)、1，2-苯二胺一盐酸盐(0.0019mol)和PyBOP(0.0017mol)在THF(40ml)和CH2Cl2(40ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌2天，倾入到冰水中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(1.2g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH94/6/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂。将获得的残余物(0.078g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH98/2/0.2至90/10/1；3.5μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.049g(11％)(M.P.：80℃)的化合物1。
实施例B2
制备化合物2
Figure S2007800030170D00302
将Et3N(0.0108mol)在室温下加至中间体8(0.0025mol)和1，2-苯二胺一盐酸盐(0.0058mol)和PyBOP(0.005mol)在DMF/tamis(50ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，倾入到H2O中，过滤。将滤液用EtOAc萃取，然后用H2O洗涤3次，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(1.8g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 95/5/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂。将获得的残余物(0.262g，22％)从乙腈/DIPE中结晶。将沉淀物物滤出，干燥，得到0.106g(M.P.：142℃)的化合物2。
实施例B3
制备化合物3
将Et3N(0.0072mol)加至中间体11(0.0018mol)、1，2-苯二胺一盐酸盐(0.0045mol)和PyBOP(0.0036mol)在THF(20ml)和CH2Cl2(20ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌72小时，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层用H2O洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(3g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 93/7/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.13g(14％)(M.P.：85℃)，得到化合物3。
实施例B4
制备化合物4
将Et3N(0.01mol)在室温下加至中间体15(0.0025mol)、1，2-苯二胺一盐酸盐(0.0057mol)和PyBOP(0.005mol)在THF(15ml)和CH2Cl2(15ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(0.13g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH92/8/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂。将该级分(0.13g)通过反相色谱法经硅胶(洗脱液：CH3OH/NH4HCO360/40；5μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.07g(M.P.：95℃)的化合物4。
实施例B5
制备化合物5
Figure S2007800030170D00321
将Et3N(0.6ml)加至中间体18(0.001mol)、1，2-苯二胺一盐酸盐(0.0024mol)和PyBOP(0.002mol)在THF(5ml)和CH2Cl2(5ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌72小时，倾入到H2O中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(1.5g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 98/2/0.2；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.027g(5％)(M.P.：105℃)的化合物5。
实施例B6
制备化合物6
Figure S2007800030170D00322
将Et3N(0.0048mol)加至中间体20(0.0012mol)、1，2-苯二胺(0.0027mol)、PyBOP(0.0024mol)在CH2Cl2(5ml)和THF(5ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用CH2Cl2萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，再蒸发溶剂。将该残余物(1.5g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液：EtOAc/CH3OH/NH4OH 93/7/0.5；15-40μm)纯化。收集纯化的级分，再蒸发溶剂，得到0.16g(25％)的化合物6。
表F-1列出了根据以上实施例之一制备的化合物。
表F-1
Figure S2007800030170D00331
C、药理学实施例
对于抑制组蛋白脱乙酰基酶的体外试验(参见实施例C.1)测定了由式(I)化合物获得的HDAC酶活性的抑制作用。
式(I)化合物的细胞活性在A2780肿瘤细胞上用测定细胞毒性或存活率的比色试验确定(Mosmann Tim，Journal of Immunological Methods65：55-63，1983)(参见实施例C.2)。
化合物的溶解度测定的是化合物保持在溶液中的能力。在第一种方法中，测定化合物在稀释时保留在水溶液中的能力(见实施例C.3.a)。DMSO-储备溶液在不同的连续步骤中用单一的含水缓冲剂溶剂稀释。在此方法中，然后针对出现的沉淀物在BD Gentest溶解度扫描仪上扫描混合物。在第二种方法中，用化学发光氮气检测器可测定化合物在不同pH值的溶解度(参见实施例C.3.b)。
药物渗透性表示其从一种介质进入或通过另一种介质的能力。具体而言，是其穿过肠膜进入和/或从血流进入靶体的能力。渗透性(参见实施例C.4)可以通过形成滤过固定的人工膜磷脂双层测定。在滤过固定的人工膜试验中，用96孔微滴定板和96孔滤板形成“夹心”，从而每个组成的孔被分成双室，供体溶液在底部，受体溶液在上部，用涂敷了2％(wt/v)二油酰基磷脂酰基-胆碱的十二烷溶液的125μm微过滤片(孔径0.45μm微米)分隔，当该体系接触含水缓冲溶液时，滤片通道内部形成多层双分子层。化合物通过该人工膜的渗透性按cm/s计量。目的在于寻找在4.0和7.4两个不同的pH值通过平行人工膜的药物的渗透性。用UV-分光光度法在250和500nm之间的最佳波长检测化合物。
药物的代谢作用是指脂溶性的异生化合物或生物内生的化合物经酶催化转化成极性、水溶性的和可排泄的代谢产物。药物代谢的主要器官是肝脏。代谢产物往往比母体药物活性小或是非活性的。但是，一些代谢产物可能具有增强的活性或毒性作用。因此，药物代谢可包括“解毒”和“中毒”两种过程。确定生物处理药物和化学试剂能力的主要酶系之一代表性的是细胞色素P450单氧化酶，其为NADPH依赖的酶。化合物的代谢稳定性可以在体外借助于亚细胞的人类组织(见实施例C.5.a)确定。此时，化合物的代谢稳定性可以表示为这些化合物与微粒体培养15分钟后代谢的药物的百分比。化合物的定量通过LC-MS分析确定。
已经表明多种抗肿瘤剂活化p21蛋白质，包括DNA损伤剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。DNA损伤剂通过肿瘤抑制基因p53活化p21基因，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂经转录因子Sp1转录性地活化p21基因。因此，DNA损伤剂通过p53效应元件活化p21启动子，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂通过spl位点(位于相对于TATA box的-60bp至+40bp区域)活化p21启动子，导致p21蛋白质的表达提高。当细胞中的p21启动子由未含有p53效应元件的p211300bp启动子片段组成时，其相应地对DNA损伤剂没有响应。化合物诱导p21的能力可通过试验化合物诱导p21(其为细胞水平的HDAC抑制作用的结果)来评价。所述细胞可被含p211300bp启动子片段而不含p53效应元件的表达载体稳定转染，由其中与对照水平相比提高的报道基因表达确定化合物具有p21诱导能力。报道基因是荧光蛋白质，报道基因的表达以发射的荧光的量测定(参见实施例C.6.)。
特定的HDAC抑制剂不应抑制其它的酶，例如大量的CYP P450蛋白质。CYP P450(大肠杆菌表达的)蛋白质3A4、2D6en 2C9将其特定的底物转化为荧光分子。CYP3A4蛋白质将7-苄氧基-三氟甲基香豆素(BFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白质将3-[2-(N，N-二乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)转化为3-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-7-羟基-4-甲基香豆素盐酸盐，CYP2C9蛋白质将7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。化合物抑制所述的酶促反应将导致荧光信号的降低。
实施例C.1.：用荧光标记的底物抑制组蛋白脱乙酰基酶的体外试验：
使用Biomol(cat.No：AK-500-0001)的HDAC荧光活性试验/药物发现试剂盒。HDAC荧光活性试验基于Fluor de Lys(荧光基因组蛋白脱乙酰基酶赖氨酰((Fluorogenic HistonedeAcetylaseLysyl))底物和显影剂组合物。Fluor de Lys底物含有乙酰化赖氨酸侧链。底物的脱乙酰作用使所速底物具有感光性，从而在第二个步骤中，用Fluor de Lys显影剂处理生成荧光团。
HeLa细胞核萃取物(供应商：Biomol)以60μg/ml量与75μM的底物一起培养。将Fluor de Lys底物加入到缓冲剂中，所述缓冲剂含25mMTris、137mM NaCl、2.7mM KCl和1mM MgCl2·6H2O，pH值7.4。30分钟后，加入1体积显影剂。用355nm光激发荧光团，在荧光板检测器上检测发射光(450nm)。对于每个试验，对照(含HeLa细胞核萃取物和缓冲剂)、空白培养(含缓冲剂，但是不含HeLa细胞核萃取物)和样品(含溶于DMSO并进一步在缓冲剂中稀释的化合物和HeLa细胞核萃取物)平行进行。在第一种情况下，化合物在10-5M的浓度测试。当所述化合物在10-5M显示活性时，产生浓度-响应曲线，其中化合物在10-5M和10-9M之间的浓度测试。所有样品测试4次。在每个测试中，从对照和样品数值扣除空白值。对照样品表示底物100％脱乙酰化。对于每个样品，荧光表示为对照平均值的百分比。如果合适，IC50-值(将代谢产物的量降低至对照的50％所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算。在此，测试化合物的作用表示为pIC50(IC50-值的负对数值)(参见表F-2)。
实施例C.2：在A2780细胞上测定抗增殖活性
将测试的所有化合物溶于DMSO并进一步用培养液稀释。在细胞增殖试验中，最终的DMSO浓度从不超过0.1％(v/v)。对照样品含A2780细胞和DMSO，不含化合物；空白样品含DMSO，但是不含细胞。MTT以5mg/ml溶于PBS。制备由0.1M甘氨酸和0.1M NaCl组成的甘氨酸缓冲剂，用NaOH(1N)缓冲到pH 10.5(所有试剂来自于Merck)。
人A2780卵巢癌细胞(T.C.Hamilton博士[Fox Chase Cancer Centre，Pennsylvania，USA]热心捐赠)在补充了2mM L-谷氨酸盐、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640介质中培养。在37℃、湿润的5％CO2气氛中将细胞常规保持为单层培养物。细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液以1：40的分流比每周传代一次。所有介质和添加剂从LifeTechnologies获得。用Gen-Probe类茵质体组织培养试剂盒(供应商：BioMerieux)确定细胞无支原体污染。
将细胞接种到NUNCTM 96-孔培养皿(供应商：Life Technologies)中，使其附着在塑料板上过夜。接种密度为每孔1500个细胞，介质总体积为200μl。在细胞粘到所述的板以后，介质被改变，加入药物和/或溶剂得到最终体积200μl。然后培养四天，用200μl新鲜介质替代介质，用基于MTT的试验评价细胞密度和活力。向每个孔中加入25μl的MTT溶液，在37℃进一步培养所述细胞2小时。然后小心地吸出所述介质，加入25μl甘氨酸缓冲液，然后加入100μl的DMSO将蓝色MTI-甲脂(formazan)产物溶解。在微板振荡器上振动微量培养板10分钟，用Emax 96-孔分光光度计(供应商：Sopachem)在540nm测定吸光度。在一个试验中，每次试验条件的结果为3个平行测定孔的平均值。出于最初的筛选目的，化合物在单一固定的10-6M浓度测试。对于活性化合物，重复实验以建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养平行进行。从所有的对照和样本数值减去空白试验值。对于每个样本，细胞生长的平均值(以吸收度单位)表示为对照样细胞生长平均值的百分比。如果合适，IC50-值(将代谢产物的量降低至对照的50％所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算(Finney，DJ.，Probit Analyses，2nd Ed.Chapter 10，Graded Responses，Cambridge University Press，Cambridge 1962)。在此，测试化合物的作用表示为pIC50(IC50-值的负对数值)(参见表F-2)。
实施例C.3：溶解度
C.3.a.在含水介质中的动态溶解度
5000-9.8μM(1/2稀释)的DMSO-储备溶液是在96孔储备溶液板(每孔200μl)中在DMSO中制备的。每次稀释后将样品混合。然后将等份的此DMSO溶液(2μl)转移到2个另外的96孔缓冲溶液板中，该板每孔含有200μl缓冲溶液。每一缓冲溶液板既含有pH 7.4的含水缓冲溶液又含有pH 4.0的含水缓冲溶液。在最后稀释之后，将缓冲溶液板混合，并使样品在室温下稳1/2小时。对于每种化合物进行一式二份的稀释以免偶然误差。然后在BD Gentest溶解度扫描仪上对形成的沉淀物扫描。基于该混合物中不存在/存在沉淀物，通过插值计算动态溶解度。分级成3级。具有高溶解度的化合物得3分并具有高于或等于50μM的溶解度。具有中等溶解度的化合物得2分并具有高于20μM且低于50μM的溶解度。具有低溶解度的化合物得1分，对于这些化合物溶解度低于或等于10μM。
试验了三种化合物，并且在试验中各pH值下分值为1分。
C.3.b在pH2.3下的溶解度
在pH2.3下，化合物的溶解度还可以使用化学发光的氮气检测器测定(参见表F-2)。
实施例C.4：平行人工膜渗透性分析
将储备液样品(10μl的5mM储备液的等分样品在100％DMSo中)稀释于含有2ml的pH 4或pH 7.4的含水缓冲系统(PSR4系统溶液浓缩物(pION)的深孔板或预混合板中。在样品加入到所述参比板前，将150μ1的缓冲液加入到孔中，测定空白样的UV。此后，弃去所述缓冲液，该板用作参比板。所有测定在抗UV-板(供应商：Costar或Greiner)中进行。
在参比板的空白测定之后，将150μl的稀释样品加到该参比板，将稀释的样品200μl加入到供体板1。将受体滤板1(供应商：Millipore，型号：MAIP N45)用4μl人工膜形成溶液(1，2-二油酰基-sn-Glycer-3-磷酸胆碱在十二烷中，含0.1％2，6-二叔丁基-4-甲酚)涂敷，置于供体板1的上部形成“夹心”。将缓冲液(200μl)分配到上方的受体孔中。夹心用盖板覆盖，在室温下在暗处储藏18小时。
受体板2的空白测定是通过在孔中加入150μl的缓冲液然后进行UV测定进行的。在受体板2空白测定之后，弃去缓冲液，将150μl的受体溶液从受体滤板1转移到受体板2。然后除去受体滤板1形成夹心。在供体板2的空白测定之后(参见上文)，将150μl的供体溶液从供体板1转移到供体板2。扫描(使用SpectraMAX 190)供体板2、受体板2和参比板孔的紫外光谱。用PSR4p Command软件处理所有光谱以计算渗透性。所有化合物计算三次。在每次试验中使用卡马西平、灰黄霉素、阿昔洛韦、阿替洛尔、呋塞米和氯噻嗪作为标准。化合物分为3个等级的类别，即，具有低渗透率(平均效果＜0.5×10-6cm/s；分数1)、中渗透率(1×10-6cm/s＞平均效果≥0.5×10-6cm/s；分数2)或高渗透率(≥1×10-6cm/s；分数3)。
实施例C.5：代谢稳定性
根据Gorrod等人(Xenobiotica 5：453-462，1975)在机械均化组织之后通过离心分离制备亚细胞组织制剂。肝脏组织在冰冷的0.1MTris-HCl(pH 7.4)缓冲液中漂洗以洗涤过量的血液。然后吸干组织、称重和用手术剪粗粗地切碎。组织碎片用装配了Teflon杵的Potter-S(Braun，意大利)或者Sorvall Omni-混合匀浆器在3体积冰冷的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中均化7×10秒。在两种情况下，容器在所述均化步骤期间被保存在冰上/冰内。
在4℃下将组织匀浆用Sorvall离心机或Beckman超离心机以9000×g离心20分钟。得到的上层清液在-80℃储藏并标记为′S9′。
S9级分可以用Beckman超离心机以100.000×g进一步离心60分钟(4℃)。得到的上层清液被小心地吸出，等分并标记为′细胞溶质′。将所述颗粒(pellet)重新悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，每0.5g原始组织重量最终体积为1ml，标记为′微粒体′。
所有亚细胞部分被等分试样，立即在液氮中冰冻，在-80℃储藏直到使用。
对于要测试的样品，培养混合物含有PBS(0.1M)、化合物(5μM)、微粒体(1mg/ml)和NADPH-生成系统(0.8mM葡萄糖-6-磷酸、0.8mM氯化镁和0.8单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。对照样品含相同物质，但是所述微粒体被加热失活(在95摄氏度下10分钟)的微粒体替代。在对照样品中化合物的回收率的总是100％。
将混合物在37摄氏度预培养5分钟。反应在0时间点(t＝0)通过添加0.8mM NADP启动，样品培养15分钟(t＝15)。通过加入2体积的DMSO终止反应。然后样品以900×g离心10分钟，在分析前，上层清液在室温下储藏不超过24小时。所有培养被在duplo中进行。上层清液的分析用LC-MS分析仪进行。样品的洗脱在Xterra MS C18(50×4.6mm，5μm，Waters，US)上进行。使用Alliance 2790(供应商：Waters，US)HPLC系统。用缓冲液A(在H2O/乙腈(95/5)中25mM的乙酸铵(pH5.2))、溶剂B乙腈和溶剂C甲醇以2.4毫升/分钟的流速洗脱。使用的梯度是以线性方式在5分钟内有机相浓度从0％提高至50％B和50％C，在1分钟内提高到100％B，有机相浓度再保持稳定1.5分钟。样品的总注射体积是25μl。
使用配备了ESI源的Quattro(供应商：Micromass，Manchester，UK)三重四极质谱仪作为检测器。所述源和脱溶剂温度分别设定在120和350℃，用氮气作为雾化剂和干燥气体。以正扫描方式(单一离子反应)方式获取数据。锥体电压设定在10V，停留时间1秒。
代谢稳定性可以表示为在活性微粒体(E(活性的))存在下培养15分钟之后的化合物％代谢
Figure S2007800030170D00391
具有t＝0时E(活性的)的TIC百分代谢小于20％的化合物定义为高代谢稳定的，并给予3分。具有20-70％代谢的化合物定义为中等稳定的，并给予2分。显示百分代谢高于70％的化合物定义为低代谢稳定的，并给予1分。当进行代谢稳定性筛选时，总是包括三个参比化合物。维拉帕米作为具有低代谢稳定性(％代谢＝73％)的化合物被包括在内。西沙比利作为中等代谢稳定性(％代谢＝45％)的化合物被包括在内，丙醇作为中等至高代谢稳定性(25％代谢)的化合物被包括在内。这些参比化合物用来确认所述的代谢稳定性试验。试验了两个化合物，分别为3分和2分。
实施例C.6：p21诱导性能
在37℃下在5％CO2的湿润培养箱中，将A2780细胞(ATCC)在RPMI 1640介质中培养，所述RPMI 1640介质补充了10％FCS、2mM的L-谷氨酸盐和庆大霉素。所有细胞培养溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它材料由Nunc提供。
从增殖的A2780细胞提取基因组DNA，用作p21启动子的巢床PCR分离的模板。第一次扩增用低聚核苷酸对GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC，以基因组DNA为模板，在55℃韧化温度(annealing temperature)进行20个周期。得到的4.5kb片段包含相对于TATA盒的-4551至+88的片段，该片段用低聚核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88℃韧化温度再扩增20个周期，得到4.5kb片段，随后用低聚核苷酸对TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88℃韧化温度扩增20个周期，得到包含相对于TATA盒的-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苷酸(加下划线的序列)中的限制酶切位点XhoI和KpnI用于亚克隆。
从pGL3-basic去掉荧光素酶指针，在KpnI和XbaI限制酶切位点用ZsGreen指针(来自pZsGreenl-N1质粒)替代。通过将上述人p21启动子区域的1.3kb片段在XhoI和KpnI位点插入pGL3-basic-ZsGreenp构成GL3-basic-ZsGreen-1300。所有限制性内切酶由BoehringerManheim(德国)提供。将A2780细胞以2×105细胞的密度涂敷在6孔板中，培养24小时，通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Brussels，比利时)如制造商所述用2μg的pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2μg的pSV2neo介体转染。用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)选择所述转染的细胞10天，取单细胞悬浮液生长。3周后，得到单克隆。
扩增A2780选择的克隆，以每孔10000细胞接种在96孔板中。接种24小时后，用化合物再处理细胞24小时(影响邻近p21启动子区域的sp1位点)。随后，用4％PFA固定细胞30秒，用Hoechst染料染色。p21启动子活化导致ZsGreen产生，并因此发荧光，通过AscentFluoroskan(Thermo Labsystems，Brussels，比利时)检测。
对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养平行运行。从所有的对照和样本数值扣除空白试验值。对于每个样品，p21诱导值可以表示为对照样p21值的百分比。诱导百分比高于130％的定义为显著诱导。
实施例C.7：P450抑制性能
将所有被测试的化合物溶于DMSO(5mM)，在乙腈中进一步稀释到5×10-4M。在试验缓冲液中制备进一步的稀释物(0.1M NaK磷酸盐缓冲液pH 7.4)，最终的溶剂浓度不高于2％。
对CYP3A4蛋白质的分析包括每孔15pmol P450/mg蛋白质(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH发生系统(3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mM NADP和3.3mMMgCl2·6H2O，在分析缓冲液中)和化合物，总分析体积为100μl。在37℃预培养5分钟后，加入在分析缓冲液中150μM的荧光探针底物BFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和535nm发射波长处进行荧光测定。包括酮康唑(IC50-值：3×10-8M)作为该试验的参比化合物。对CYP2D6蛋白质的分析包括每孔6pmol P450/mg蛋白质(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH发生系统(0.41mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.0082mM NADP和0.41mM MgCl2·6H2O，在分析缓冲液中)和化合物，总分析体积100μl。在37℃预培养5分钟后，加入在分析缓冲液中的3μM的荧光探针底物AMMC启动酶促反应。在室温下培养45分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和460nm发射波长处进行荧光测定。包括奎尼丁(IC50-值＜5×10-8M)作为该试验的参比化合物。
对CYP2C9蛋白质的分析包括每孔15pmol P450/mg蛋白质(在0.01M NaK磷酸盐缓冲液+1.15％KCl中)、NADPH发生系统(3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mM NADP和3.3mMMgCl2·6H2O，在分析缓冲液中)和化合物，总分析体积100μl。在37℃预培养5分钟后，加入在分析缓冲液中200μM的荧光探针底物MFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和535nm发射波长处进行荧光测定。包括磺胺苯吡唑(IC50-值＝6.8×10-7M)作为该试验的参比化合物。
为了初步筛选的目的，化合物在单一固定的浓度的1×10-5M测试。对于活性化合物，重复试验建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白培养(不含酶或药物)平行运行。所有化合物一式四份分析。从所有的对照和样本数值减去空白试验值。对于每个样本，样品的P450活性平均值(以相对荧光度为单位)表示为对照样P450活性平均值的百分比。抑制百分比可以表示为100％减去样品P450活性平均值。如果合适，计算IC50-值(将P450活性降低到对照样的50％所需的药物的浓度)。
表F-2：列出了根据实施例C.1、C.2和C.3.b测试的化合物结果(空白表示相应化合物未得到值)。
表F-2
化合物No. 酶活性pIC50C.1 细胞活性pIC50C.2   溶解度C.3.b.pH＝2.3(mg/ml)
  1   ＜6   5.5
  2   4.8   7.0   3.7
  3   ＜6   5.8
  4   ＜6
  5   ＜6
D.组合物实施例：包膜衣的片剂
片芯的制备
100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸盐钠和10g聚乙烯基吡咯烷酮在约200ml水中的溶液湿润。将湿粉末混合物过筛，干燥，然后再次过筛。然后加入100g微晶纤维素和15g氢化植物油。全部混合均匀，压成片剂，得到10000片，每片含10mg的式(I)化合物。
包衣
向10g甲基纤维素在75ml变性乙醇中的溶液加入5g乙基纤维素在150ml二氯甲烷中的溶液。然后加入75ml的二氯甲烷和2.5ml 1，2，3-丙二醇。熔融10g的聚乙二醇，溶于75ml二氯甲烷。将后一溶液加入前者，然后加入2.5g十八酸镁、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml浓染料悬浮液，全部材料匀浆。用这样得到的混合物在包衣设备中将片芯包衣。

Claims (9)

1.式(I)化合物及其药学可接受的加成盐：
Figure FSB00000994033700011
其中
n是整数0、1或2，并且当n是0时，表示直接键；
m是整数1或2；
X是N或CH；
Y是O、S或NR8；其中
R8是氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基甲基、苯基C1-6烷基、-C(＝O)-CHR9R10或-S(＝O)2-N(CH3)2；其中
各R9和R10独立地是氢、氨基或氨基C1-6烷基；以及
当Y是NR8，并且R2在吲哚基的7-位时，R2和R8可一起形成二价基团
-(CH2)2-    (a-1)，或
-(CH2)3-    (a-2)；
R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基羰基或者单-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基；
R2是氢、羟基、氨基、卤代、C1-6烷基、氰基、C2-6烯基、多卤代C1-6烷基、硝基、苯基、C1-6烷基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或者单-或二(C1-6烷基)氨基；
R3是羟基或氨基；
R4是氢、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任选被以下基团取代：卤代、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷基氧基、苯基C1-6烷基氧基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基、多卤代C1-6烷基氧基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羟基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、异
Figure FSB00000994033700021
唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；
R5、R6和R7各自独立地是氢、氨基、硝基、呋喃基、卤代、C1-6烷基、C1-6烷基氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基或氨基羰基C1-6烷基。
2.根据权利要求1的化合物，其中：
a)n是0或1；
b)m是1或2；
c)X是N或CH；
d)Y是NR8，其中R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基或C3-6环烷基甲基；
e)R1是氢、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
f)R2是氢或卤代；
g)R3是氨基；
h)R4是氢或噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
3.根据权利要求1的化合物，其中：
a)n是1；
b)m是1；
c)X是N；
d)Y是NR8，其中R8是甲基；
e)R1是氢；
f)R2是氢或卤代；
g)R3是氨基；
h)R4是氢或2-噻吩基；和
i)R5、R6和R7各为氢。
4.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是化合物No.2，即下式所述化合物：
Figure FSB00000994033700031
5.一种药物组合物，包括药学可接受的载体和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1～4任一项所述的化合物。
6.制备权利要求5所述药物组合物的方法，其中所述的药学可接受的载体与权利要求1～4任一项所述的化合物被紧密地混合。
7.权利要求1～4任一项所述的化合物在制备治疗增殖疾病的药物中的用途。
8.抗癌剂和权利要求1～4任一项所述HDAC抑制剂的组合物。
9.制备根据权利要求1的化合物的方法，其特征在于，在碱存在下通过将其中的M表示氢或碱金属的式(II)中间体与式(III)化合物反应：
Figure FSB00000994033700032
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、X、Y、m和n如权利要求1中所定义。
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