ES2322132T3 - Metodo de estabilizacion de fosfatasa alcalina. - Google Patents
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Abstract
Un método de estabilización de fosfatasa alcalina derivada de hígado humano en una preparación liofilizada, que comprende liofilizar la fosfatasa alcalina derivada de hígado humano en presencia de un sacárido seleccionado entre el grupo que consiste en galactosa, lactosa y fructosa, en combinación con albúmina o dextrano.
Description
Método de estabilización de fosfatasa
alcalina.
La presente invención se refiere a una
preparación liofilizada que contiene fosfatasa alcalina para usar
en exámenes clínicos. Específicamente, la presente invención se
refiere a un método de estabilización de fosfatasa alcalina
derivada de hígado humano, en una preparación liofilizada. Más
específicamente, la presente invención se refiere a una preparación
liofilizada que no muestra aumento de actividad después de
reconstituir con agua y que puede ser almacenada durante un período
de tiempo prolongado, y a un método para estabilizar la misma.
La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima que se
sabe que existe en plantas, animales, microorganismos o semejantes.
Por ejemplo, sus orígenes animales varían ampliamente y son tales
como los intestinos delgados de bovinos, cerdos, conejos y perros,
y los riñones de bovinos y cerdos, placentas humanas, y sus orígenes
de microorganismos incluyen enzimas que derivan de E. coli.
Todas ellas se encuentran disponibles en el mercado. Estas enzimas
son iguales en lo que respecta a la función pero se diferencian unas
de otras en propiedades tales como la especificidad, la estabilidad
térmica y la reactividad.
En una diagnosis clínica, se mide la actividad
enzimática de un suero humano, lo que refleja una diversidad de
estados mórbidos. Los orígenes de una enzima contenida en el suero
varían ampliamente y son tales como el hígado, los riñones, los
huesos, el intestino delgado y la placenta.
En general, la actividad enzimática está
representada por un valor numérico relativo que cambia según
condiciones tales como el pH y la temperatura medida. Por
consiguiente, aun cuando se use la misma muestra, el valor de la
actividad difiere según el reactivo usado. Factores tales como el
deterioro del reactivo y el deterioro de la propia muestra, ejercen
una gran influencia sobre el valor de la actividad. Por tanto, con
objeto de medir con exactitud la actividad enzimática, debe
emplearse un material de referencia que sea estable, sin
variaciones, cada vez que se efectúa una medida para comparar los
resultados de su medida con los resultados medidos de la muestra, o
debe usarse un método estándar de medida.
En el campo de los exámenes clínicos, los
productos de que se dispone en el comercio bajo el nombre común de
suero testigo, calibrador o material de referencia, son distribuidos
como materiales de referencia para la medida de la actividad
enzimática conforme a su aplicación. De ellos, los sueros testigo
son usados para el control de calidad interno, es decir, el control
diario en una determinada instalación de medida, y los calibradores
y los materiales de referencia se utilizan no solo para el control
de calidad, si no también como sustancia testigo entre
instalaciones, al tiempo que se tiene en cuenta la exactitud del
valor de las medidas.
Sin embargo, la actividad enzimática de la ALP
en el suero humano cambia con facilidad y el tanto por ciento de
cambio de la actividad de la sangre recientemente obtenida al cabo
de 96 horas es -4% a 10%, según las condiciones de almacenamiento.
Se ha indicado que cuando un suero reunido congelado se disolvía y
mantenía a temperatura ambiente, la actividad se elevaba 6,4%
(Clin. Chem., vol. 18(4), 1972). Es sabido que la estabilidad
térmica difiere según el tipo de una isozima (Akio Genba,
Isoenzyme, Igaku-Shoin Ltd., páginas
10-16, 1978).
A todo esto, la liofilización es útil y se usa
comúnmente para el almacenamiento durante largo tiempo de una
sustancia térmicamente inestable y que se desnaturaliza fácilmente
cuando se mantiene en forma de solución acuosa, tal como una
proteína. Las enzimas se liofilizan con frecuencia para mantener sus
actividades durante largo tiempo. Pero existe un gran número de
enzimas que se desnaturalizan y se desactivan con facilidad durante
el transcurso de la liofilización, dependiendo de su tipo y de su
pureza. Por consiguiente, se añaden a la sustancia objetivo una
proteína tal como albúmina y un sacárido tal como sacarosa o
trehalosa, como estabilizante, con objeto de eliminar este
problema. Por ejemplo, el documento JP-A
56-148201 describe estabilizantes para enzimas que
incluyen sacarosa y albúmina de suero bovino o humano. No obstante,
no existe estabilizante alguno que tenga efecto sobre todos los
tipos de proteínas, ni están ahora en camino estudios sobre un
estabilizante eficaz para cada proteína.
Para control de calidad y otros fines, se han
emitido diversos informes sobre la liofilización de ALP. Por
ejemplo, en cuanto al efecto de adición a la ALP de un sacárido que
afecta a la liofilización, se han comparado la trehalosa, el
manitol y la lactosa (J. Pharm Pharmacol., 45 (10), páginas
86-93, 1993). Según este informe, la trehalosa
posee un efecto mayor de estabilización que la lactosa, y la lactosa
posee un efecto mayor de estabilización que el manitol La enzima
utilizada es solamente una enzima escasamente purificada, derivada
de la membrana mucosa del intestino delgado de ganado bovino y no se
ha estudiado una enzima derivada de un ser humano. Se ha descrito
en la referencia J. Pharm. Pharmacol., 45 (10), páginas
900-906, 1993, que cuando se lleva a cabo la
liofilización usando una enzima purificada derivada de la membrana
mucosa del intestino delgado bovino y albúmina de suero humano
glicatada como aditivo, se produce un efecto negativo. Dado que la
albúmina sacarificada se obtiene combinando un sacárido reducido con
albúmina, no se prefiere usar esta combinación como aditivo. Se ha
indicado que cuando se usa 15% de trehalosa como el único aditivo,
la actividad de la ALP se pierde en el proceso de liofilización y
que solamente se obtiene una actividad residual de 40%,
aproximadamente, después de secar como Ejemplo Comparativo.
Según se ha descrito anteriormente, el material
de referencia debe ser estable durante un periodo de garantía,
generalmente 1 año o más, y mostrar un cierto comportamiento cuando
esté en uso. Hasta ahora, se ha apuntado que cuando se reconstituye
un suero testigo liofilizado de que se dispone en el comercio, la
ALP muestra un aumento gradual de su actividad (Clin. Chem. Vol.
18(4), páginas 366-377, 1972).
No puede decirse que se prefiera esto cuando se
usa después de reconstituir. Para establecer una comparación entre
sustancias utilizadas como control de calidad obtenidas congelando
suero humano y liofilizando suero humano, se ha indicado, en el
caso de ALP y creatina quinasa (CK), que los productos congelados
son superiores como sueros testigo (Clin. Biochem., 29 (2),
páginas. 183-185, 1996). Estos sueros testigo se
preparan en su mayor parte añadiendo a un suero una enzima derivada
de un animal, como adición a ALP intrínseca derivada de un ser
humano (Clin. Chem., 35(3), página 510, 1989).
Aun cuando han debido ser utilizadas enzimas
derivadas de un ser humano, en la actualidad se ha empleado con
frecuencia una diversidad de enzimas derivadas de animales, que se
diferencian unas de otras en sus propiedades, tomando en
consideración características éticas, de infección y de facilidad de
adquisición. (Clin. Chem., 33 (11), páginas
1971-1977, 1987).
En estos últimos años ha sido fácil extraer
enzimas desde células animales establecidas y células recombinantes
obtenidas usando ingeniería genética sin usar materiales biológicos,
y se encuentran disponibles en la actualidad productos comerciales
que incluyen una enzima derivada de seres humanos. Por ejemplo, un
suero testigo que contiene muchas enzimas liofilizadas y que
incluye ALP obtenida partiendo de una línea celular amniótica
humana, muestra aumento de actividad después de reconstituir
(Analysis of Bio Specimens,14 (2), páginas 81-89,
1991: Clinical examination/equipment/reagent, 15(4), páginas
615-623, 1992).
El desarrollo de sustancias de control de
calidad que incluyen ALP derivada de seres humanos, está siendo
acelerado desde ahora en adelante. Sin embargo, no se ha informado
todavía de un producto liofilizado que incluya ALP derivada de
seres humanos, que no muestre aumento de actividad después de
reconstituir con agua, y que sea estable durante largo tiempo de
almacenamiento.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una preparación liofilizada que incluye ALP derivada de
hígado humano, que no pone de manifiesto aumento de actividad
después de reconstituir con agua y que es estable durante largo
tiempo, y un método de estabilización de ALP de hígado humano en la
preparación.
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Los inventores de la presente invención han
llevado a cabo estudios intensos para resolver el problema anterior
y han encontrado que puede obtenerse, inesperadamente, una
composición que pone de manifiesto pequeñas variaciones de
actividad antes y después de liofilizar y que es estable durante
largo tiempo, mediante la adición de un sacárido seleccionado entre
el grupo que consiste en galactosa, lactosa y fructosa, y albúmina o
dextrano, en el momento de la liofilización de ALP derivada de
hígado humano. La presente invención ha sido conseguida basándose
en este descubrimiento. Es decir, según la presente invención, se
proporciona una preparación de estabilización de ALP de hígado
humano, que puede ser preservada durante largo tiempo, es altamente
estable en el uso práctico y no muestra variaciones tales como
aumento de actividad cuando se usa, es decir, se reconstituye,
mediante liofilización de ALP de hígado humano en presencia de un
sacárido seleccionado entre el grupo que consiste en galactosa,
lactosa y fructosa, y albúmina o dextrano.
La presente invención será descrita en detalle
más adelante en esta memoria. El sacárido que puede ser usado en la
preparación liofilizada de la presente invención, está seleccionado,
preferiblemente, entre el grupo que consiste en galactosa, lactosa
y fructosa, y la concentración del sacárido es, preferiblemente, 0,5
a 20% (p/v), más preferiblemente 1 a 10% (p/v). Estos sacáridos
pueden ser utilizados solos o en forma de mezcla de dos o tres.
La albúmina puede ser albúmina de mamífero tal
como albúmina de suero humano o albúmina de suero bovino (BSA), o
albúmina de aves tal como albúmina de suero de pollo, y la
concentración de la albúmina es, preferiblemente, 0,3 a 7% (p/v),
más preferiblemente, 1 a 5% (p/v). Además, puede usarse también la
que se obtiene cultivando una célula recombinante con un gen que
codifica los aminoácidos de cada albúmina y que ha sido purificada.
La albúmina se utiliza como excipiente. Otras proteínas y otros
polisacáridos tales como dextrano, que muestran el mismo efecto que
la albúmina, pueden ser usados apropiadamente solos o en
combinación. La cantidad de dextrano es, preferiblemente, 0,3 a 7%
(p/v), más preferiblemente, 1 a 5% (p/V), cuando se usa.
La fosfatasa alcalina que puede ser usada en la
presente invención es una enzima derivada de hígado humano. El
hígado, los riñones, los huesos, el intestino delgado, y la
placenta, se conocen como los orígenes de ALP derivada de seres
humanos y puede obtenerse la enzima partiendo de estos materiales
biológicos. La enzima que deriva de la placenta está disponible en
el mercado aun cuando no se prefiere la obtención de la enzima a
partir de esos materiales biológicos al tomar en consideración
características éticas y de infección. La enzima puede ser obtenida
a partir de productos cultivados de líneas celulares tales como
líneas de células HeLa y líneas celulares amnióticas. Además, son
conocidos genes que codifican la proteína de ALP derivada de seres
humanos, por progresos recientes llevados a cabo por tecnología de
ingeniería genética, y la enzima puede ser obtenida a partir de
células transformadas que incluyen esos genes. Por ejemplo., se
obtiene ALP de tipo hepático a partir de una célula animal
transformada, purificada y comercializada por Asahi Kasei Co., Ltd.
(catálogo de enzimas de diagnóstico de Asahi Kasei Co., Ltd.).
Aquí, el gen de la ALP del tipo de hígado humano
es idéntico al denominado gen de ALP inespecífico de órganos
humanos. Asimismo, en este caso, como célula transformada pueden
usarse no solo células humanas sino también células animales
distintas de células humanas tales como células CHO derivadas del
hámster Chino y células microbianas tales como E. coli,
levaduras y hongos. También puede usarse un gen transformado para
codificar un derivado de ALP obtenido por deleción o sustitución
parcial de la secuencia de aminoácidos de ALP y adición de otros
restos de aminoácidos u otras secuencias de aminoácidos. Las enzimas
producidas, excepto las que se encuentran disponibles en el
comercio, pueden ser usadas para este fin una vez que sus purezas
hayan sido mejoradas hasta un nivel práctico, combinando métodos de
purificación de conocimiento general, tales como cromatografía en
columna.
La cantidad de ALP a añadir en la preparación
liofilizada de la presente invención, no está limitada
especialmente, pero es, preferiblemente, de 9 a 6500 U/L, más
preferiblemente, de 45 a 1300 U/L.
El pH de la solución acuosa antes de liofilizar
está alrededor del neutro, específicamente, en el entorno de 6,5 a
8,5. Dado que el pH de la solución en la que es reconstituido el
producto liofilizado está, deseablemente, dentro del mismo
intervalo, puede usarse un tampón adecuado, por ejemplo, un tampón
de Good tal como PIPES, HEPES o BES, un tampón fosfato, o un tampón
Tris, en una concentración de 5 a 200 mM, específicamente 10 a 100
mM. Diversos aditivos pueden ser empleados para mejorar la forma de
una preparación liofilizada, tales como dextrano o sulfato de
dextrano, y puede usarse adecuadamente un
azúcar-alcohol tal como el manitol.
Dado que es sabido que la ALP tiene cinc en su
molécula, se añade, por ejemplo, cloruro de cinc, o puede añadirse
adecuadamente cloruro de magnesio conocido como agente de
activación.. Puede añadirse adecuadamente un aminoácido que se sepa
que posee el efecto de estabilización de enzimas, tal como la
valina.
La presente invención será descrita basada en
Ejemplos.
Ejemplo
1
(1) No se añadió BSA, (2) se añadió BSA al 1%
(p/v), y (3) se añadió BSA al 3% (p/v), a una solución tampón 20 mM
de POPSO-NaOH (pH 7,5) que contenía lactosa al 5%,
cloruro magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400 U/L de
ALP derivada de hígado humano (Número T-73,
producida por Asahi Kasei Co., Ltd.), y 2 ml de cada una de las
soluciones obtenidas fueron inyectados en un vial y liofilizados. En
las condiciones respectivas anteriores, se llevó a cabo un ensayo
de aceleración de temperatura sobre cada uno de los productos
liofilizados, a 37ºC, que luego se reconstituyó con 2 ml de agua
destilada cada semana durante hasta 4 semanas, en el momento de
realizar la medida, para medir la actividad de ALP. En la Tabla 1 se
muestran los cambios de la actividad residual de cada una de las
muestras. Se observó estabilización significativa en los sistemas a
los que se había añadido BSA en comparación con los sistemas sin
BSA.
Ejemplo
2
3% de sacarosa, 3% de galactosa y 3% de lactosa
fueron añadidos, cada uno, a una solución tampón 20 mM de
BES-NaOH (pH 7,5) que contenía BSA al 3%, cloruro de
cinc 0,1 mM, valina 30 mM y 400 U/L de ALP derivada de hígado
humano, y 3 ml de cada una de las soluciones obtenidas fueron
inyectados en dos viales y liofilizados. Se añadió a cada uno de
los productos liofilizados 3 ml de agua destilada, para
reconstituir, con objeto de medir la actividad de ALP El vial
restante se colocó en un incubador a 37ºC y se dejó estar durante
una semana. Después de esto, se midió la actividad de ALP del mismo
modo. Como indica la Tabla 2, los productos a los que se había
añadido galactosa y lactosa, de la presente invención, mostraban,
significativamente, una mayor actividad residual que la del sistema
al que se había añadido sacarosa.
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Ejemplo
3
5% (p/v) de galactosa, 5% (p/v) de fructosa y 5%
(p/v) de lactosa, fueron añadidos, cada uno, a una solución tampón
40 mM de PIPES-NaOH que contenía BSA al 3%, cloruro
magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400 U/L de ALP
derivada de hígado humano (Número T-73, producida
por Asahi Kasei Co., Ltd.), y 2 ml de cada una de los soluciones
obtenidas fueron inyectados en un vial y liofilizados. En cuanto a
las condiciones de liofilización, después de evacuación a una
temperatura de congelación de -50ºC, la desecación primaria se
llevó a cabo a -10ºC durante 12 horas, la desecación secundaria se
llevó a cabo a 20ºC durante 24 horas, y se efectuó el taponamiento
de los viales en vacío. Se añadió a cada uno de los productos
liofilizados 2 ml de agua destilada con objeto de medir la
actividad de ALP de cada sacárido añadido. Los viales restantes se
colocaron en un incubador a 37ºC y se disolvieron en 2 ml de agua
destilada, uno por semana, para medir la actividad de ALP durante
hasta 3 semanas. La actividad residual se muestra en la Tabla 3
cuando la actividad enzimática correcta después de liofilizar es
del 100%. La actividad residual de ALP cuando se añadieron, cada
una, galactosa, fructosa y lactosa, fue significativamente alta en
comparación con la obtenida cuando no se había añadido
sacárido.
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Ejemplo
4
(1) No se añadió sacárido, (2) se añadió 1%
(p/v) de galactosa, y (3) se añadió 3% (p/v) de galactosa, (4) se
añadió 5% (p/v) de galactosa, y (5) se añadió 3% (p/v) de manosa, a
una solución tampón 40 mM de BES-NaOH que contenía
BSA al 3%, cloruro magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400
U/L de ALP derivada de hígado humano (Número T-73,
producida por Asahi Kasei Co., Ltd.), y 2 ml de cada una de las
soluciones obtenidas fueron inyectados en viales y liofilizados.
Bajo las respectivas condiciones anteriores, se llevó a cabo un
ensayo de aceleración de temperatura sobre cada uno de los productos
liofilizados, a 37ºC, que después se disolvieron en 2 ml de agua
destilada cada semana durante hasta 4 semanas, en el momento de
realizar la medida, para determinar la actividad de ALP. Los
cambios de la actividad residual de cada muestra se indican en la
Tabla 4. Como puede confirmarse desde la tabla, aun cuando la
adición de galactosa proporcionaba efecto, el producto al que se
había añadido manosa mostraba una caída brusca de actividad al cabo
de 3 semanas.
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Ejemplo
5
5% (p/v) de galactosa ó 5% (p/v) de
3-lactosa se añadió a una solución tampón 40 mM de
BES-NaOH que contenía BSA al 1%, dextrano 60K al
3%, cloruro magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400 U/L de
ALP derivada de hígado humano (Número T-73,
producida por Asahi Kasei Co., Ltd.), y 2 ml de cada una de las
soluciones obtenidas fueron inyectados en viales y liofilizados.
Después de que los productos liofilizados habían disueltos y se
habían medido sus actividad iniciales, cada cuatro viales fueron
colocados en incubadores a 25ºC, 37ºC y 45ºC para llevar a cabo un
ensayo de degradación acelerado. Los resultados se indican en la
Tabla 5.. Después, basándose en los resultados obtenidos, se
calculó el período de tiempo de cada muestra que transcurría hasta
que su actividad residual llegaba a ser del 98% cuando se mantenía a
4ºC y -10ºC usando la expresión de Arrhenius (J. Biol. Stand. 12,
páginas 195-224, 1984) y se indica en la Tabla 6.
Los resultados de los cálculos muestran que la solución de
galactosa y la solución de lactosa podrían ser estables durante 1 ó
más años cuando eran mantenidas a 4ºC y durante 15 años,
aproximadamente, cuando se mantenían a -10ºC.
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Ejemplo
6
5% (p/v) de galactosa ó 5% (p/v) de lactosa, o
trehalosa, como Ejemplo Comparativo, se añadió a una solución
tampón 40 mM de BES-NaOH que contenía BSA al 3%,
cloruro magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400 U/L de
ALP derivada de hígado humano (Número T-73,
producida por Asahi Kasei Co. Ltd.), y 2 ml de la solución
resultante se inyectaron en un vial y se liofilizó. Los cambios de
actividad se examinaron durante 6 meses de almacenamiento en frío
(5ºC). Los resultados de los mismos se indican en la Tabla 7. La
preparación liofilizada a la que se había añadido trehalosa había
disminuido su actividad en 4 meses 8,6%, mientras que la preparación
de la presente invención no ponía de manifiesto disminución de
actividad.
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Ejemplo
7
5% (p/v) de galactosa, 5% (p/v) de lactosa y 5%
(p/v) de fructosa, se añadieron, cada uno, a una solución tampón 40
mM de BES-NaOH que contenía BSA al 3%, cloruro
magnésico 0,5 mM, cloruro de cinc 10 \muM y 400 U/L de ALP
derivada de hígado humano (Número T-73, producida
por Asahi Kasei Co., Ltd.), y 2 ml de cada una de las soluciones
obtenidas fueron inyectados en viales y liofilizados. El producto
liofilizado se disolvió en 2 ml de agua destilada y después se dejó
en reposo a 25ºC. Los cambios de actividad de ALP de la solución
que tenía disuelto el producto se muestran en la Tabla 8 como la
actividad residual. En todos los sacáridos, no hubo aumento de
actividad, y continuó una condición estable durante 48 horas.
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Ejemplo
8
3% de dextrano (peso molecular
60000-9000: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ó
3% de BSA, se añadió a una solución tampón 20 mM de
POPSO-NaOH (pH 7,5) que contenía 5% de galactosa,
cloruro de cinc 0,01mM, cloruro magnésico 0,5 mM y 400 U/L de ALP
derivada de hígado humano, y 2 ml de cada uno de los productos
obtenidos fueron inyectados en viales y liofilizados en las mismas
condiciones de liofilización que las del Ejemplo 3. Bajo las
respectivas condiciones anteriores, se llevó a cabo un ensayo de
carga sobre cada uno de los productos liofilizados, a 37ºC, que
luego se disolvieron en 2 ml de agua destilada cada semana durante
hasta 4 semanas en el momento de realizar la medida de la actividad
de ALP. Los cambios de la actividad residual de cada muestra se
indican en la Tabla 9. Asimismo, en el caso del dextrano, pudo
confirmarse un efecto de estabilización aun cuando ligeramente
inferior al del BSA. Nótese que se usó como testigo el producto al
que no se había añadido ni dextrano ni BSA, con el resultado de que
el producto no pudo ser liofilizado suficientemente.
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Según la presente invención, se proporciona,
como una preparación liofilizada que contiene fosfatasa alcalina
para usar, específicamente, en exámenes clínicos, una preparación
liofilizada en la que es estable fosfatasa alcalina derivada de
hígado humano, que no manifiesta aumento de actividad después de
reconstituir con agua y que puede ser almacenada durante largo
tiempo.
Claims (3)
1. Un método de estabilización de fosfatasa
alcalina derivada de hígado humano en una preparación liofilizada,
que comprende liofilizar la fosfatasa alcalina derivada de hígado
humano en presencia de un sacárido seleccionado entre el grupo que
consiste en galactosa, lactosa y fructosa, en combinación con
albúmina o dextrano.
2. El método de estabilización según la
reivindicación 1, en el que la fosfatasa alcalina derivada de hígado
humano se obtiene a partir de una línea celular humana que
comprende una célula recombinante transformada con un gen que
codifica fosfatasa alcalina de hígado humano.
3. El método de estabilización según la
reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que se usa albúmina
en combinación con el sacárido.
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| JP2001200612 | 2001-07-02 |
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