ES2277922T3 - Proteinas fijadoras de gtp relacionadas con el estres, y metodos de utilizacion en plantas. - Google Patents
Proteinas fijadoras de gtp relacionadas con el estres, y metodos de utilizacion en plantas. Download PDFInfo
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Abstract
Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de Proteína Fijadora de GTP Relacionada con el Estrés (GBSRP), en la cual la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO:11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO:11 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.
Description
Proteínas fijadoras de GTP relacionadas con el
estrés, y métodos de utilización en plantas.
Esta invención se refiere en general a
secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están
asociadas con respuestas al estrés abiótico y la tolerancia al
estrés abiótico en las plantas. En particular, esta invención se
refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que
confieren a las plantas tolerancia a la sequía y/o la hela-
da.
da.
Los estados de estrés abiótico ambiental, tales
como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor, y
estrés por frío, son factores fundamentales limitantes del
crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de
cosechas y pérdidas de rendimiento de cosecha de cosechas
importantes tales como arroz, maíz (grano) y trigo causadas por
estos estados de estrés constituyen un factor económico y político
importante y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países
sub-desarrollados.
Las plantas se ven expuestas típicamente durante
su ciclo vital a condiciones de contenido reducido de agua en el
medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado
estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de
desecación. No obstante, si la severidad y duración de las
condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el
desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las
plantas de cosecha son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las
plantas de cosecha son muy sensibles a concentraciones elevadas de
sal en el suelo. La exposición continua a sequía y contenido elevado
de sal causa alteraciones importantes en el metabolismo de las
plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente
a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de
rendimiento.
El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es
una estrategia que tiene potencial para resolver o mediar al menos
alguno de estos problemas. Sin embargo, las estrategias de
tradicionales de reproducción de plantas para desarrollar nuevas
líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos
de estrés son relativamente lentas y requieren líneas específicas
resistentes para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos
limitados de germoplasma para tolerancia al estrés y la
incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas
remotamente afines representan problemas importantes encontrados en
la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos
celulares que conducen a tolerancia a la sequía, el frío y la sal en
plantas modelo, tolerantes a la sequía y/o la sal son de naturaleza
compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y
numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza
multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo
ha hecho en gran parte infructuosa la reproducción para tolerancia,
sino que ha limitado también la posibilidad de elaborar por
ingeniería genética plantas con tolerancia al estrés utilizando
métodos biotecnológicos.
Así pues, es necesaria la identificación de los
genes y proteínas implicados en estos procesos
multi-componente que conducen a la tolerancia al
estrés. La elucidación de la función de los genes expresados en las
plantas tolerantes al estrés no sólo hará avanzar la comprensión
actual de la adaptación de las plantas y la tolerancia a los
estados de estrés ambiental, sino que puede proporcionar también
información importante para el diseño de nuevas estrategias para
mejora de las cosechas.
Existen al menos cuatro caminos diferentes de
transducción de señales que conducen a tolerancia al estrés en la
planta modelo Arabidopsis thaliana. Estos caminos se
encuentran bajo el control de distintos factores de transcripción,
proteína-quinasas,
proteína-fosfatasas y otros componentes de los
caminos de transducción de señales (Shinozaki et al. 2000
Curr. Op. Pl. Biol. 3: 217-23). Estas proteínas son
dianas primarias para modificación por ingeniería genética de la
tolerancia al estrés, dado que las mismas podrían funcionar como
cambios maestros; las alteraciones en un solo gen podrían conducir a
la activación de una cadena entera de transducción de señales
conducente a la tolerancia al estrés.
La percepción del estrés osmótico en las
bacterias así como en las plantas es realizada por un sistema de
dos componentes que comprende una proteína perceptora y una proteína
efectora (Wurgler-Murphy SM y Saito S. 1997. Trends
in Biochem. Sci. 22: 172-6 y Shinozaki et al.
2000. Curr. Op. Pl. Biol. 3: 217-23). Caminos de
transducción de señales dependientes de
proteína-quinasas activadas por mitógenos están
estrechamente implicados en estos procesos. Otro componente
importante de estas cadenas de transducción de señales son las
proteínas fijadoras de GTP (proteínas G). Hablando en términos
generales, existen al menos tres clases de proteínas G: a)
proteínas heterotrímeras (subunidades alfa, beta y gamma), b)
proteínas monómeras (pequeñas), y c) Dianinas. Las proteínas
fijadoras de GTP reciben este nombre debido a que cada una debe
fijar GTP para ser activa. Las funciones de las proteínas fijadoras
de GTP son variadas, en el sentido de que se extienden desde la
transmisión directa de una señal externa (por estar asociadas con
un receptor fijado a la membrana), pasando por la participación en
el tráfico de vesículas, hasta la importación de proteínas en
compartimientos sub-celulares.
La participación de proteínas G trímeras en la
tolerancia al estrés no ha sido demostrada directamente hasta
ahora. Sin embargo, dado que las mismas están asociadas con
receptores fijados a la membrana, pueden estar implicadas en la
transmisión de la señal de estrés detectada que conduce a la
tolerancia al estrés. La fijación del ligando a un receptor podría
causar supuestamente la activación de la sub-unidad
alfa y cambiar con ello la concentración de un segundo mensajero de
peso molecular bajo. Los cambios en la concentración de segundos
mensajeros, como CAMP en los sistemas animales, activan finalmente
otros componentes del camino de transducción de señales, y segundos
mensajeros tales como derivados de inositol han sido implicados en
la tolerancia al estrés en las plantas (Ishitani et al. 1996
PI Journal 9: 537-48).
Las proteínas G monómeras/pequeñas están
involucradas también en muchos procesos celulares diferentes y han
sido implicadas en el tráfico/transporte de vesículas, el ciclo
celular y la importación de proteínas a orgánulos. Varios grupos de
investigadores han identificado proteínas G pequeñas, homólogas a la
familia Rab de proteínas G pequeñas, que son inducidas por
tratamientos de desecación en las plantas (Bolte et al. 2000
Plant Mol. Biol. 42: 923-36; O'Mahony y Oliver 1999
Plant Mol. Biol. 39: 809-21). Estos investigadores
especulan que las proteínas G pequeñas podrían estar involucradas
en la preservación de la integridad de la membrana o la
re-estructuración después del alivio del estrés. Sin
embargo, dichos investigadores no han producido plantas
transgénicas con tolerancia incrementada al estrés por
sobre-expresión de estas proteínas G pequeñas.
Otra clase de proteínas G es la de las proteínas
G de peso molecular alto. Las Dinaminas son un miembro
representativo de esta clase. Han sido identificados varios
homólogos de proteínas G de peso molecular alto en cierto número de
sistemas eucariotas, que incluyen levadura, humanos, ratas y ratones
y en sistemas vegetales que incluyen Arabidopsis thaliana,
Nicotiana tabacum y Glycine max. Aunque la secuencia y
las funciones propuestas de los diferentes homólogos son diversas,
todos ellos parecen funcionar en el tráfico de proteínas, ayudando
probablemente a la formación de vesículas. La Dinamina mejor
caracterizada hasta la fecha ha sido aislada de la rata y se ha
demostrado que se fija a los microtúbulos y participa en la
endocitosis al tiempo que es regulada por fosforilación (Robinson
et al. 1993 Nature 365: 163-166.).
Adicionalmente, se ha encontrado que la Dinamina vegetal aislada de
Glycine max está localizada en toda la anchura de la placa
celular recién formada durante la citoquinesis, lo que sugiere un
papel para la proteína en la deposición del material de la placa
celular por vesículas exocíticas (Gu & Verma 1996. EMBO J. 15:
695-704). Se ha demostrado que la proteína, ADL1,
aislada de Arabidopsis, se localiza en las membranas
tilacoides en el fraccionamiento sub-organular de
los cloroplastos de las hojas. Plantas transgénicas que
sobre-expresan una forma mutante de este gen exhiben
un número reducido de cloroplastos y los cloroplastos existentes
tenían un número reducido de tilacoides y proteínas de membrana
tilacoidea. Estos datos sugieren un papel para ADL1 en el
transporte de proteína necesario para la biogénesis de las membranas
tilacoides (Park et al. 1998 EMBO J. 17:
859-867). Otro homólogo de este tipo, DNM1,
encontrado en Saccharomyces cerevisiae participa también en
la endocitosis, actuando en un nuevo paso antes de la fusión con el
endosoma final (Gammie et al. 1995. J. Cell Biol. 130:
553-566). Sin embargo,
a pesar de estas investigaciones no ha sido demostrada la participación de las Dinaminas en la tolerancia al estrés.
a pesar de estas investigaciones no ha sido demostrada la participación de las Dinaminas en la tolerancia al estrés.
Existe necesidad por tanto, de identificar los
genes expresados en las plantas tolerantes al estrés que tengan la
capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta hospedadora
y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés de
nueva generación tendrán muchas ventajas, tales como el aumento de
la extensión en que pueden cultivarse las plantas de cosecha, por
ejemplo por disminución de los requerimientos de agua en una
especie vegetal.
Esta invención satisface en parte la necesidad
de identificar proteínas nuevas y singulares fijadoras de GTP
capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por
sobre-expresión. La presente invención proporciona
una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico
codificante de una Proteína Fijadora de GTP
Relacionada con el Estrés (GBSRP), en donde la GBSRP
se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se
define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene una identidad de
secuencia de al menos 95% con un polipéptido de SEQ ID NO: 11 en
toda su longitud, y en donde la expresión de la secuencia de ácido
nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia
incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o el
estrés por helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de
la célula de la planta. Concretamente, en esta memoria se describen
proteínas-G: 1) Proteína-1
Fijadora de GTP (GBP-1) de
Physcomitrella patens.
La invención estipula en algunas realizaciones
que la GBSRP y el ácido nucleico codificante son los encontrados
en miembros del género Physcomitrella. En otra realización
preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una
Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés
ambiental puede ser estrés por sequía y estrés por temperatura, o
combinaciones de los mismos. En particular, el estrés ambiental es
sequía o temperatura baja.
La invención proporciona adicionalmente una
semilla producida por una planta transgénica transformada por un
ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en
donde la semilla es progenie auténtica para tolerancia incrementada
al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla
producida por una planta transgénica que expresa una GBSRP como se
ha descrito arriba en donde la semilla es progenie auténtica para
tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la planta.
La invención proporciona adicionalmente el uso
de cualquiera de las plantas o semillas transgénicas arriba
descritas para la fabricación de un producto agrícola. La invención
proporciona adicionalmente una GBSRP aislada como se ha descrito
arriba. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico
codificante de GBSRP aislado, en donde el ácido nucleico
codificante de GBSRP codifica una GBSRP como se ha descrito
arriba.
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido
nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde
la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como
resultado la tolerancia incrementada de la célula hospedadora al
estrés por sequía y/o el estrés por helada, en comparación con la
variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.
La invención proporciona adicionalmente un
método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico
codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en el cual la
expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado la
tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por
sequía y/o el estrés por helada en comparación con la variedad de
tipo salvaje de la planta, que comprende: (a) transformar una célula
de planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico
codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, y (b) generar a
partir de la célula de la planta una planta transgénica con una
tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o el estrés por
helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de la
planta.
La presente invención proporciona también
métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta
que comprenden modificar la expresión de una GBSRP en la planta, en
donde la GBSRP es como se ha descrito arriba. La invención estipula
que este método puede realizarse de tal manera que la tolerancia al
estrés se aumenta o se reduce. Preferiblemente, la tolerancia al
estrés se aumenta en una planta por aumento de la expresión de una
GBSRP.
Las Figuras 1 (A-E) muestran las
secuencias parciales de cDNA de GBP-1 (SEQ ID NO:
1), GBP-2 (SEQ ID NO: 2), GBP-3
(SEQ ID NO: 3), GBP-4 (SEQ ID NO: 4) y
GBP-5 (SEQ ID NO: 5) de Physcomitrella
patens.
Las Figuras 2 (A-E) muestran las
secuencias de cDNA de longitud total de GBP-1 (SEQ
ID NO: 6), GBP-2 (SEQ ID NO: 7),
GBP-3 (SEQ ID NO: 8), GBP-4 (SEQ ID
NO: 9) y GBP-5 (SEQ ID NO: 10 de Physcomitrella
patens.
Las Figuras 3 (A-E) muestran las
secuencias de aminoácidos deducidas de GBP-1 (SEQ ID
NO: 11), GBP-2 (SEQ ID NO: 12),
GBP-3 (SEQ ID NO: 13), GBP-4 (SEQ ID
NO: 14) y GBP-5 (SEQ ID NO: 15) de Physcomitrella
patens.
La Figura 4 muestra un diagrama del vector de
expresión de plantas pBPSSC022 que contiene el
super-promotor que dirige la expresión de SEQ ID
NOs: 6, 7, 8, 9, y 10 ("Gen Deseado"). Los componentes son: gen
de resistencia a la kanamicina NPTII (Hajdukiewicz et al.
1994 Pl. Mol Biol. 25: 989-98), promotor
AtAct2-i (An et al. 1996 Plant J. 10:
107-21), terminador OCS3 (Weigel et al. 2000
Pl. Physiol. 122: 1003-13).
La Figura 5 muestra los resultados de una prueba
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 6 muestra los resultados de una prueba
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 7 muestra los resultados de una prueba
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-3 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 8 muestra los resultados de una prueba
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-4 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 9 muestra los resultados de una prueba
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 10 muestra los resultados de una
prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 11 muestra los resultados de una
prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-3 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 12 muestra los resultados de una
prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-4 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 13 muestra los resultados de una
prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpGBP-5 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La presente invención puede entenderse más
fácilmente por referencia a la descripción detallada siguiente de
las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos
incluidos en esta memoria. Debe entenderse que la terminología
utilizada en esta memoria tiene por objeto únicamente describir
realizaciones específicas y no debe interpretarse como limitante.
En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como
proteína "Proteínas Relacionadas con el
Estrés Fijadoras de GTP" (GBSRPs), no limita
en modo alguno la funcionalidad de dichas secuencias.
La presente invención proporciona una célula de
planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante
de GBSRP, en donde la GBSRP se selecciona de un grupo constituido
por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido
que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con un polipéptido
de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en donde la expresión de la
secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como
resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al
estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con la
variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. La invención
proporciona adicionalmente una planta transgénica que comprende una
célula de planta como se ha descrito arriba. Se proporciona también
una semilla de planta producida por una planta transgénica que
comprende una célula de la planta como se ha descrito arriba, en
donde la semilla es progenie auténtica para tolerancia incrementada
al estrés ambiental en comparación con la variedad de tipo salvaje
de la planta. La invención proporciona también el uso de una planta
o semilla transgénica como se ha descrito arriba para la fabricación
de un producto agrícola.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una
especie que comparten caracteres constantes que los separan de la
forma típica y de otras variedades posibles dentro de dicha
especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se
caracteriza también por cierta variación entre los individuos
dentro de la variedad, basada fundamentalmente en la segregación
mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas.
Una variedad se considera "progenie auténtica" para un rasgo
particular si la misma es homocigótica genéticamente para dicho
rasgo en tal grado que, cuando la variedad de progenie auténtica se
auto-poliniza, no se observa un grado significativo
de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la
presente invención, el rasgo procede de la expresión transgénica de
una o más secuencias de DNA introducidas en una variedad de la
planta.
La presente invención describe por primera vez
que la GBSRP de Physcomitrella patens,
GBP-1, es útil para aumentar la tolerancia de una
planta al estrés por sequía y/o el estrés por helada. La proteína
predicha codificada por PpGBP-1 es similar a una
clase particular de la proteína G pequeña de levadura, la proteína
Sar-1 (Davies C. 1994. Plant Mol. Biol. 24:
525-31). Sar-1 está involucrada en
el transporte de vesículas de levadura en el retículo
endoplasmático. La sobre-expresión de esta clase de
proteínas puede aumentar la tolerancia al estrés por preservación
de la integridad de la membrana durante el intervalo de estrés y
aceleración de la reconstrucción de la membrana después de la
cesación del estrés.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona GBSRPs aisladas seleccionadas del grupo constituido por
GBP-1. En particular, la GBSRP se selecciona de una
Proteína-1 fijadora de GTP (GBP-1)
como se define en SEQ ID NO: 11 y secuencias que tienen al menos
95% de identidad con ella en toda su longitud, y homólogos y
ortólogos de la misma. Homólogos y ortólogos de las secuencias de
aminoácidos se definen más adelante.
Las GBSRPs de la presente invención se producen
preferiblemente por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una
molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a
clonación en un vector de expresión (como se ha descrito arriba),
se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como
se ha descrito arriba y se expresa la GBSRP en la célula
hospedadora. La GBSRP puede aislarse luego de las células por un
esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de
purificación de proteínas. Como alternativa a la expresión
recombinante, un polipéptido o péptido GBSRP puede sintetizarse
químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos.
Además, la GBSRP nativa puede aislarse de células (v.g.,
Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo
anti-GBSRP, que puede producirse por técnicas
estándar utilizando una GBSRP o fragmento de la misma.
La invención proporciona adicionalmente un ácido
nucleico codificante de GBSRP aislado como se ha descrito
arriba.
En particular, el ácido nucleico codificante de
GBSRP se selecciona de un ácido nucleico de la
Proteína-1 Fijadora de GTP (GBP-1)
como se define en SEQ ID NO: 6 y una secuencia que tiene al menos
80% de identidad con ella en toda la región codificante.
Homólogos y ortólogos de las secuencias de
nucleótidos se definen más adelante. En una realización preferida,
el ácido nucleico y la proteína se aíslan del género de plantas
Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido
nucleico y la proteína son de una planta Physcomitrella
patens (P. patens).
Como se utiliza en esta memoria, el término
"estrés ambiental" se refiere a cualquier condición de
crecimiento sub-óptima e incluye condiciones sub-óptimas asociadas
con estrés por sequía y temperatura, o combinaciones de los mismos.
En particular, el estrés ambiental es sequía o temperatura, o
combinaciones de las mismas, y en particular, puede ser contenido
bajo de agua o temperatura baja. Debe entenderse también que, tal
como se utiliza en la memoria descriptiva y en las
reivindicaciones, "un" o "uno(a)" puede significar
uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por
ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que
puede utilizarse al menos una célula.
Como se utilizan también en esta memoria, debe
entenderse que los términos "ácido nucleico" y "molécula de
ácido nucleico" incluyen moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA
genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA
generados utilizando análogos de nucleótidos. Este término abarca
también secuencia no traducida localizada en ambos extremos 3' y 5'
de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000
nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región
codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia
aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del gen. La
molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria,
pero preferiblemente es DNA bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es
una que está separada sustancialmente de otras moléculas de ácido
nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido
nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está
exento de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente el
ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5'
y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se
deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones,
la molécula de ácido nucleico de GBSRP aislada puede contener menos
de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de
las secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la
molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la
que se deriva el ácido nucleico (v.g., una célula de
Physcomitrella patens). Además, una molécula de ácido
nucleico "aislada", tal como una molécula cDNA, puede estar
exenta de algo del material celular restante con el que está
asociada la misma naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce
por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros
productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención, v.g. una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, puede aislarse utilizando
técnicas estándar de biología molecular y la información de
secuencias proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, un cDNA de
GBSRP de P. patens puede aislarse a partir de una genoteca
de P. patens utilizando la totalidad o una porción de una de
las secuencias de SEQ ID NO: 1. Además, una molécula de ácido
nucleico que abarca la totalidad o una porción de una de las
secuencias de SEQ ID NO: 1 puede aislarse por la reacción en cadena
de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos
diseñados basándose en esta secuencia. Por ejemplo, puede aislarse
mRNA de células de plantas (v.g., por el procedimiento de
extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al.
1979 Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse
cDNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa
de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o
transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America Inc.,
St. Petersburg, FL). Iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para
amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa pueden
diseñarse basándose en las secuencias de nucleótidos que se muestran
en SEQ ID NO: 1. Una molécula de ácido nucleico de la invención
puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA
genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de
acuerdo con las técnicas estándar de amplificación PCR. La molécula
de ácido nucleico así amplificada puede clonarse en un vector
apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA.
Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes
a una secuencia de nucleótidos de GBSRP por técnicas de síntesis
estándar, v.g., utilizando un sintetizador automático de DNA.
En una realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de
nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 6.
Estos cDNAs comprenden secuencias que codifican
las GBSRPs (es decir, la "región codificante", indicada en la
Tabla 1), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no
traducidas. Debe entenderse que SEQ ID NO: 6 comprenden a la vez
regiones codificantes y regiones 5' y 3' no traducidas.
Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden comprender solamente la región codificante de la
secuencia en SEQ ID NO: 6 o pueden contener fragmentos genómicos
enteros aislados de DNA genómico. Una región codificante de estas
secuencias se indica como una "posición ORF".
Además, la molécula de ácido nucleico puede
comprender solamente una porción de la región codificante de la
secuencia en SEQ ID NO: 6, por ejemplo, un fragmento que puede
utilizarse como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica
una porción biológicamente activa de una GBSRP. Las secuencias de
nucleótidos determinadas por la clonación de los genes GBSRP de
P. patens permiten la generación de sondas e iniciadores
diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos
de GBSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos
de GBSRP de otros musgos y especies afines.
Porciones de proteínas codificadas por las
moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la invención son
preferiblemente porciones biológicamente activas de una de las
GBSRPs descritas en esta memoria. Como se utiliza en esta memoria,
debe entenderse que la expresión "porción biológicamente activa
de" una GBSRP incluye una porción, v.g., un dominio/motivo, de
una GBSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en
una planta, tiene una actividad como se indica en la Tabla 1, o
participa en la transcripción de una proteína involucrada en una
respuesta de tolerancia al estrés en una planta. Para determinar si
una GBSRP, o una porción biológicamente activa de la misma, puede
participar en la transcripción de una proteína involucrada en una
respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o si la represión
de una GBSRP da como resultado una tolerancia incrementada al estrés
en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta
que comprende la GBSRP. Tales métodos de análisis son bien
conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el
Ejemplo 7. De modo más específico, fragmentos de ácido nucleico que
codifican porciones biológicamente activas es de una GBSRP pueden
prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias
en SEQ ID NO: 11, que expresa la porción codificada de la GBSRP o
el péptido (v.g., por expresión recombinante in vitro) y
evaluación de la actividad de la porción codificada de la GBSRP o
el
péptido.
péptido.
Se contemplan porciones biológicamente activas
de una GBSRP e incluyen péptidos que comprenden secuencias de
aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una GBSRP,
v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o la secuencia
de aminoácidos de una proteína homóloga a una GBSRP, que incluyen
menos aminoácidos que una GBSRP de longitud total o la proteína de
longitud total que es homóloga a una GBSRP, y exhiben al menos una
actividad de una GBSRP. Por regla general, las porciones
biológicamente activas (v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, 5,
10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de
longitud) comprenden un dominio o motivo que tiene al menos una
actividad de una GBSRP. Además, otras porciones biológicamente
activas en las cuales están delecionadas otras regiones de la
proteína, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse
respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria.
Con preferencia, las porciones biológicamente activas de una GBSRP
incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los
mismos que tienen actividad biológica.
La invención abarca también proteínas GBSRP
quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una
"proteína quimérica" o "proteína de fusión" GBSRP
comprende un polipéptido de GBSRP enlazado operativamente a un
polipéptido que no es de GBSRP. Un polipéptido de GBSRP hace
referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que corresponde a una GBSRP como se ha descrito arriba, en tanto que
un polipéptido que no es de GBSRP hace referencia a un polipéptido
que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una
proteína que no es sustancialmente homóloga a la GBSRP, v.g., una
proteína que es diferente de la GBSRP y se deriva del mismo
organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteína de
fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto
indicar que el polipéptido de GBSRP y el polipéptido que no es de
GBSRP están fusionados uno a otro de tal manera que ambas
secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia
utilizada. El polipéptido que no es de GBSRP puede fusionarse al
término N o el término C del polipéptido de GBSRP. Por ejemplo, en
una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión
GST-GBSRP en la cual las secuencias de GBSRP están
fusionadas al término C de las secuencias de GST. Tales proteínas de
fusión pueden facilitar la purificación de GSBRPs recombinantes. En
otra realización, la proteína de fusión es una GBSRP que contiene
una secuencia de señal heteróloga en su término N. En ciertas
células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero), la
expresión y/o secreción de una GBSRP puede incrementarse por el uso
de una secuencia señal heteróloga.
Preferiblemente, una proteína GBSRP quimérica o
de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA
recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las
diferentes secuencias de polipéptidos se ligan unos a otros en
marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando
términos de extremos romos o extremos cohesivos para ligación,
digestión con enzimas de restricción para proporcionar los términos
apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado,
tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable
y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede
sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen
sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, puede llevarse
a cabo la amplificación de fragmentos de genes por PCR utilizando
iniciadores de anclaje que dan lugar a colgantes complementarios
entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden reasociarse y
re-amplificarse subsiguientemente para generar una
secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in
Molecular Biology, compiladores Ausubel et al. John Wiley
& Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos
vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un
polipéptido GST). Un ácido nucleico codificante de GBSRP puede
clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que el
resto de fusión está enlazado en marco a la GBSRP.
Además de fragmentos y proteínas de fusión de
las GBSRPs descritas en esta memoria, se contemplan homólogos y
análogos de GBSRPs y ácidos nucleicos codificantes de GBSRP
existentes naturalmente en una planta como se ha descrito arriba.
Los "homólogos" se definen en esta memoria como dos ácidos
nucleicos o proteínas que tienen secuencias de nucleótidos o
aminoácidos similares u "homólogas", respectivamente. Los
homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos,
agonistas y antagonistas de las GBSRPs como se define más adelante.
El término "homólogo" abarca adicionalmente moléculas de ácido
nucleico que difieren de las secuencias de nucleótidos que se
muestran en SEQ ID NO: 6 (y porciones de las mismas) debido a la
degeneración del código genético y codifican por tanto la misma
GBSRP que la codificada por las secuencias de nucleótidos que se
muestran en SEQ ID NO: 6.
Como se utiliza en esta memoria, una GBSRP
"existente naturalmente" hace referencia a una secuencia de
aminoácidos de GBSRP que existe en la naturaleza. Particularmente,
una GBSRP existente naturalmente comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:
11.
Un agonista de la GBSRP puede retener
sustancialmente las mismas actividades biológicas de la GBSRP, o un
subconjunto de ellas. Un antagonista de la GBSRP puede inhibir una
o más de las actividades de la forma existente naturalmente de la
GBSRP. Por ejemplo, el antagonista de GBSRP puede fijarse
competitivamente a un miembro situado aguas abajo o aguas arriba de
la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que
incluye la GBSRP, o fijarse a una GBSRP que media el transporte de
compuestos a través de tales membranas, impidiendo con ello que
tenga lugar translocación.
Moléculas de ácido nucleico correspondientes a
variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de
un cDNA de GBSRP pueden aislarse basándose en su identidad con los
ácidos nucleicos de GBSRP de Physcomitrella patens descritos
en esta memoria utilizando cDNAs de GBSRP, o una porción de los
mismos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar
de hibridación en condiciones de hibridación severas. En una
realización alternativa, los homólogos de la GBSRP pueden
identificarse por escrutinio de genotecas combinatorias de
mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la GBSRP respecto a
actividad agonista o antagonista de GBSRP. En una realización, se
genera una genoteca diversificada de variantes de GBSRP por
mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico y se codifica
por una genoteca de genes diversificada. Una genoteca diversificada
de variantes de GBSRP puede producirse mediante, por ejemplo,
ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en
secuencias de genes de tal modo que pueda expresarse un conjunto
degenerado de secuencias potenciales de GBSRP como polipéptidos
individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de
fusión mayores (v.g., para presentación de fago) que contienen la
serie de secuencias de GBSRP en ellas. Existen una diversidad de
métodos que pueden utilizarse para producir genotecas de homólogos
potenciales de GBSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos
degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada
puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen
sintético se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso
de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una
mezcla, de todas las secuencias codificantes de la serie deseada de
secuencias potenciales de GBSRP. Métodos para la síntesis de
oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g.,
Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. 1984
Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. 1984 Science
198: 1056; Ike et al. 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).
Adicionalmente, pueden utilizarse genotecas de
fragmentos de las regiones codificantes de GSBRP para generar una
población diversificada de fragmentos de GBSRP para escrutinio y
selección subsiguiente de homólogos de una GBSRP. En una
realización, puede generarse una genoteca de fragmentos de secuencia
codificantes por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una
secuencia codificante de GBSRP con una nucleasa en condiciones en
las cuales se produce mellado sólo aproximadamente una vez por
molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización
del DNA para formar DNA bicatenario, que puede incluir pares
sentido/antisentido de productos mellados diferentes, eliminación
de porciones monocatenarias de los dúplex reformados por tratamiento
con nucleasa S1, y ligación de la genoteca de fragmentos resultante
en un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una
genoteca de expresión que codifica fragmentos
N-terminales, C-terminales e
internos de diversos tamaños de la GBSRP.
Se conocen en la técnica varios métodos para
escrutar productos génicos de genotecas combinatorias producidas
por mutaciones puntuales o truncación, y para el escrutinio de
genotecas de cDNA para productos génicos que tengan una propiedad
seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para escrutinio rápido
de las genotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria
de homólogos de GBSRP. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que
son susceptibles de análisis de alta capacidad, para escrutinio de
grandes genotecas de genes incluyen típicamente clonación de la
genoteca de genes en vectores de expresión replicables,
transformación de células apropiadas con la genoteca de vectores
resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en
las cuales la detección de una actividad deseada facilita el
aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se
detectó. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una nueva
técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las
genotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de
escrutinio para identificar homólogos de GBSRP (Arkin y Youvan,
1992 PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. 1993
Protein Engineering 6 (3): 327-331). En otra
realización, pueden aprovecharse ensayos basados en células para
analizar una genoteca de GBSRP diversificada, utilizando métodos
bien conocidos en la técnica. Se proporciona un método de
identificación de una nueva GBSRP, que comprende (a) generar una
respuesta específica de anticuerpos para una GBSRP, o un fragmento
de la misma, como se describe en esta memoria; (b) escrutar material
supuesto de GBSRP con el anticuerpo, en donde la fijación
específica del anticuerpo al material indica la presencia de una
GBSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado en
comparación con GBSRP conocidas, para determinar su novedad.
A fin de determinar el porcentaje de homología
de dos secuencias de aminoácidos (v.g., la secuencia de SEQ ID NO:
11 y una forma mutante de la misma), se alinean las secuencias para
propósitos de comparación óptima (v.g., pueden introducirse lagunas
en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación
óptima con la otra proteína o ácido nucleico). Se comparan luego
los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos
correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (v.g., la
secuencia de SEQ ID NO: 11) está ocupada por el mismo residuo de
aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia
(v.g., una forma mutante de la secuencia seleccionada del
polipéptido de SEQ ID NO: 11) entonces las moléculas son homólogas
en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria,
"homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a
"identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El mismo tipo de
comparación puede hacerse entre dos secuencias de ácido
nucleico.
El porcentaje de homología entre las dos
secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas
por las secuencias (es decir, % homología = números de posiciones
idénticas/números totales de posiciones x 100). Las secuencias de
aminoácidos incluidas en la presente invención son homólogas al
menos en un 95%, y preferiblemente al menos en 96%, 97%, 98%, 99% o
más a una secuencia completa de aminoácidos representada en SEQ ID
NO: 11. En otra realización adicional, al menos 95%, y
preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homólogas a una
secuencia entera de aminoácidos codificada por una secuencia de
ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 6.
En otras realizaciones, la longitud preferible
de comparación de secuencias para proteínas es al menos 15 residuos
de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 residuos de
aminoácidos, y muy preferiblemente al menos 35 residuos de
aminoácidos.
En otra realización, una molécula de ácido
nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de
nucleótidos que es al menos 95%, y preferiblemente al menos 96%,
97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos
representada en SEQ ID NO: 6, o una porción de la misma. La longitud
preferible de la comparación de secuencias para ácidos nucleicos de
la invención es la longitud total de la región codificante.
Asimismo, es preferible que la molécula de ácido
nucleico homóloga codifique una proteína o porción de la misma que
incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga
a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, tal que la
proteína o porción de la misma mantenga la misma función o una
función similar que la secuencia de aminoácidos con la que se
compara. Las funciones de las secuencias de aminoácidos de GBSRP de
la presente invención incluyen la capacidad para participar en una
respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más
particularmente, para participar en la transcripción de una proteína
implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de
Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se
describen en la Tabla 1.
Además de los métodos arriba descritos, puede
realizarse una determinación del porcentaje de homología entre dos
secuencias utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido
y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul
(1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Un
algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y
XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-410).
Las búsqueda de los ácidos nucleicos BLAST puede
realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de
palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a
las moléculas de ácido nucleico GBSRP de la invención.
Adicionalmente, pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con
el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para
obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las GBSRPs de la
presente invención. Para obtener alineaciones con lagunas para
propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se
describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST
Y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los
programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no
limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS
1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN
(versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de
alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN
para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una
tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de
laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4 a fin de obtener
secuencias de aminoácidos homólogas a las GBSRPs de la presente
invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de
comparación, puede utilizarse GAPPED BLAST como se describe en
Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y
Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los
programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no
limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS
1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN
(versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de
alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN
para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una
tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de
laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.
Finalmente, la homología entre secuencias de
amino-ácidos puede determinarse también utilizando métodos de
hibridación conocidos por los expertos en la técnica. De acuerdo con
ello, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una
secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en
condiciones severas, a una de las secuencias de nucleótidos que se
muestran en SEQ ID No.: 6 o una porción de la misma. Más
particularmente, una molécula de ácido nucleico aislada tiene al
menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones
severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.
En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene
una longitud de al menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión
"se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir
condiciones para hibridación y lavado en las cuales las secuencias
de nucleótidos que son al menos homólogas en un 60% una a otra se
mantienen típicamente hibridadas una a otra. Preferiblemente, las
condiciones son tales que secuencias de al menos aproximadamente
65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo
todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas
una a otra, se mantienen por lo general hibridadas mutuamente.
Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la
técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular
Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons,
N.Y. (1989). Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de
hibridación severas es la hibridación en 6X cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por uno
o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC.
Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada que se
hibrida en condiciones severas a una secuencia de SEQ ID NO: 6
corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente.
Tal como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico
"existente naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA
o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la
naturaleza (v.g., que codifica una proteína natural). En una
realización, el ácido nucleico codifica una GBSRP de
Physcomitrella patens existente naturalmente.
Utilizando los métodos arriba descritos, y otros
conocidos por los expertos en la técnica, una persona con
experiencia ordinaria en la técnica puede aislar homólogos de las
GBSRPs que comprenden secuencias de aminoácidos que se muestran en
SEQ ID NO: 11.
Un subconjunto de estos homólogos está
constituido por variantes alélicas. Tal como se utiliza en esta
memoria, la expresión "variante alélica" hace referencia a una
secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a
cambios en las secuencias de aminoácidos de una GBSRP y que existen
en una población natural (v.g., una especie o variedad de planta).
Tales variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado
típicamente una varianza de 1-5% en un ácido
nucleico de GBSRP. Las variantes alélicas pueden identificarse por
secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en
cierto número de plantas diferentes, lo cual puede realizarse
fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el
mismo locus genético de GBSRP en dichas plantas. Cualquiera y la
totalidad de dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o
variaciones de aminoácidos resultantes en una GBSRP que son el
resultado de la variación alélica natural y que no alteran la
actividad funcional de una GBSRP, debe entenderse que están
comprendidas dentro del alcance de la invención.
Se contemplan adicionalmente moléculas de ácido
nucleico que codifican GBSRPs de la misma u otra especie tales como
análogos, ortólogos y parálogos de GBSRP,. Tal como se utiliza en
esta memoria, el término "análogos" hace referencia a dos
ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han
evolucionado por separado en organismos no afines. Tal como se
utiliza en esta memoria, el término "ortólogos" hace referencia
a dos ácidos nucleicos de especies diferentes, pero que han
evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación.
Normalmente, los ortólogos codifican proteínas que tienen la misma o
similares funciones. Como se utiliza también en esta memoria, el
término "parálogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que
están relacionados por duplicación en un mismo genoma. Los parálogos
tienen usualmente funciones diferentes, pero estas funciones pueden
ser afines (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278 (5338):
631-637). Análogos, ortólogos y parálogos de una
GBSRP existente naturalmente pueden diferir de la GBSRP existente
naturalmente por modificaciones posteriores a la traducción, por
diferencias en la secuencia de amino-ácidos o por ambas cosas.
Modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización
química in vivo e in Vitro de polipéptidos, v.g.,
acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y dichas
modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el
procesamiento de polipéptidos o después del tratamiento con enzimas
modificantes aisladas. En particular, los ortólogos exhibirán por
lo general al menos 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad u
homología con la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos
de GBSRP existente naturalmente, y exhibirán una función similar a
una GBSRP. Los ortólogos son también preferiblemente capaces de
participar en la respuesta al estrés en las plantas. En una
realización, los ortólogos de GBSRP mantienen la capacidad para
participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la
construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens,
o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.
Además de variantes existentes naturalmente de
una secuencia de GBSRP que pueden existir en la población, el
profesional experto apreciará adicionalmente que pueden introducirse
cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:
6, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de
la GBSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la
GBSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que
conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos
"no esenciales" en una secuencia de SEQ ID NO: 6.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es
un residuo que puede alterarse con respecto a la secuencia de tipo
salvaje de una de las GBSRPs sin alterar la actividad de dicha
GBSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se
requiere para la actividad de la GBSRP. Otros residuos de
aminoácidos, sin embargo, (v.g., aquéllos que no están conservados
o están sólo semi-conservados en el dominio que
tiene actividad de GSBRP) pueden no ser esenciales para la
actividad y por consiguiente es probable que sean susceptibles de
alteración sin alterar la actividad de la GBSRP.
De acuerdo con ello, otro aspecto se refiere a
moléculas de ácido nucleico que codifican GBSRPs que contienen
cambios en residuos de aminoácidos que no son esencialmente para la
actividad de la GBSRP. Tales GBSRPs difieren en secuencia de
aminoácidos de una secuencia contenida en SEQ ID NO: 11, pero
retienen al menos una de las actividades de GBSRP descritas en esta
memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en
donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene
al menos 95% de homología con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 111.
Preferiblemente, la proteína codificada por la
molécula de ácido nucleico tiene una homología de al menos 96%,
97%, 98%, o 99% respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 11.
Los homólogos de GBSRP preferidos son
preferiblemente capaces de participar en una respuesta de tolerancia
al estrés en una planta, o más particularmente, participar en la
transcripción de una proteína implicada en una respuesta de
tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens,
o tienen una o más actividades expuestas en la Tabla 1.
Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un homólogo de GBSRP para una secuencia proteínica de SEQ
ID NO: 11 puede crearse por introducción de una o más sustituciones,
adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia nucleotídica
de SEQ ID NO: 6 tal que se introducen una o más sustituciones,
adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada.
Pueden introducirse mutaciones en la secuencia de SEQ ID NO: 6 por
técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis
mediada por PCR. Preferiblemente, se efectúan sustituciones
conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no
esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de
aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido se
reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral
similar.
Familias de residuos de aminoácidos que tienen
cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas
familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g.,
lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido
aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares desprovistas
de carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,
triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (v.g.,
treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g.,
tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de
aminoácido no esencial predicho en una GBSRP se reemplaza
preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia
de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden
introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de
una secuencia codificante de GBSRP, por ejemplo por mutagénesis de
saturación, y los mutantes resultantes pueden escrutarse respecto a
una actividad de GBSRP descrita en esta memoria a fin de identificar
mutantes que retienen la actividad de GBSRP. Después de la
mutagénesis de las secuencias de SEQ ID NO: 6, la proteína
codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la
proteína puede determinarse por análisis de la tolerancia al estrés
de una planta que expresa la proteína que se describe en el Ejemplo
7.
Además de las moléculas de ácido nucleico que
codifican las GBSRPs descritas anteriormente, otro aspecto se
refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido
respecto a aquéllas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende
una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido
nucleico "sentido" que codifica una proteína, v.g.,
complementaria a la cadena codificante de una molécula de cDNA
bicatenaria o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo
con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por
hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido
puede ser complementario a una cadena codificante entera de GBSRP;
o sólo a una porción de la misma. En una realización, una molécula
de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una
"región codificante" de la cadena codificante de la cadena
codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una GBSRP.
La expresión "región codificante" hace referencia a la región
de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen
en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de
,,,,, comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la
molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una
"región no codificante" de la cadena codificante de una
secuencia de nucleótidos que codifica una GBSRP. La expresión
"región no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que
flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos
(es decir, a las que se hace referencia también como regiones 5' y
3' no traducidas).
En una realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada comprende una molécula de ácido nucleico que
es un complemento de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ
ID NO: 6, o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico
que es complementaria a una de las secuencias de nucleótidos que se
muestran en SEQ ID NO: 6 es una que es suficientemente
complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID
NO: 6 tal que la misma puede hibridarse a la secuencia de
nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6, formando con ello un
dúplex estable.
Dadas las secuencias de la cadena codificante
que codifican las GBSRPs descritas en esta memoria (v.g., la
secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6) pueden diseñarse ácidos
nucleicos antisentido de la invención de acuerdo con las reglas de
apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido
nucleico antisentido puede ser complementaria a la región
codificante entera de mRNA de GBSRP, pero más preferiblemente es un
oligonucleótido que es antisentido respecto a solamente una porción
de la región codificante o no codificante de RNA de GBSRP. Por
ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a
la región que circunda el sitio de comienzo de la traducción de
mRNA de GBSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por
ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 ó 50 nucleótidos.
Un ácido nucleico antisentido puede construirse
utilizando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática
que emplean procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
ácido nucleico antisentido (v.g. un oligonucleótido antisentido)
puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes
naturalmente o nucleótidos modificados diversamente, diseñados para
aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar
la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos
antisentido y de sentido, v.g., pueden utilizarse derivados
fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de
nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido
nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wybutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxi-propil)-uracilo,
(acp3)w, y 2,6-diaminopurina.
Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse
biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido
nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (es
decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado
tendrá una orientación antisentido respecto a un ácido nucleico
diana de interés, descrito ulteriormente en la subsección que
sigue).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido se
administran típicamente a una célula o se generan in situ de
tal manera que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA celular
y/o DNA genómico que codifica una GBSRP para inhibir con ello la
expresión de la proteína, v.g., por inhibición de la transcripción
y/o la traducción. La hibridación puede realizarse por
complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex
estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido
nucleico antisentido que se fija a dúplex de DNA, por interacciones
específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula
antisentido puede modificarse de tal manera que la misma se fije
específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una
superficie seleccionada de la célula, v.g., por enlace de la
molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo
que se fija a un receptor o antígeno de la superficie celular. La
molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también
a células utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para
alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las
moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los
cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está dispuesta
bajo el control de un promotor procariota, viral, o eucariota (con
inclusión de plantas)
fuerte.
fuerte.
En otra realización adicional, la molécula de
ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico
alfa-anomérica. Una molécula de ácido nucleico
alfa-anomérica forma híbridos bicatenarios
específicos con RNA complementario en los cuales, contrariamente a
las unidades \beta usuales, las cadenas avanzar paralelas una a
otra (Gaultier et al. 1987 Nucleic Acids. Res. 15:
6625-6641). La molécula de ácido nucleico
antisentido puede comprender también un
2'-o-metilribonucleótido (Inoue
et al. 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148)
o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et
al. 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).
En otra realización adicional, un ácido nucleico
antisentido es una ribozima. Las ribozimas son moléculas
catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de
escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, para el
cual tienen las mismas una región complementaria. Así, pueden
utilizarse ribozimas (v.g., las ribozimas de cabeza de martillo
descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988 Nature 334:
585-591) para escindir catalíticamente transcritos
de mRNA de GBSRP a fin de inhibir con ello la traducción de mRNA de
GBSRP. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico
codificante de GBSRP puede diseñarse basándose en la secuencia de
nucleótidos de un cDNA de GBSRP, como se describe en esta memoria
(es decir, SEQ ID NO: 6) o sobre la base de una secuencia
heteróloga a aislar de acuerdo con los métodos propuestos en esta
invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA de
IVS de Tetrahymena L-19 en el cual la
secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la
secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de
GBSRP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y
Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente,
puede utilizarse mRNA de GBSRP para seleccionar un RNA catalítico
que tenga una actividad específica de ribonucleasa a partir de una
agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak,
J.W., 1993 Science 261: 1411-1418.
Alternativamente, la expresión de los genes de
GBSRP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de
nucleótidos complementarias a la región reguladora de una secuencia
nucleotídica de GBSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de
GBSRP) para formar estructura de triple hélice que impiden la
transcripción de un gen de GBSRP en las células diana. Véase en
líneas generales, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):
569-84; Helene C. et al. 1992 Ann. N.Y.
Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher, L.J., 1992 Bioassays
14(12): 807-15.
Además de los ácidos nucleicos de GBSRP y
proteínas arriba descritos, la presente invención abarca estos
ácidos nucleicos y proteínas unidos a un resto. Estos restos
incluyen, pero sin carácter limitante, restos de detección, restos
de hibridación, restos de purificación, restos de suministro,
restos de reacción, restos de fijación, y análogos. Un grupo típico
de ácidos nucleicos unidos a un resto incluye sondas e iniciadores.
Las sondas y los iniciadores comprenden típicamente una región de
secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas a al
menos 12, con preferencia aproximadamente 25, con más preferencia
aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena
sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6, una secuencia
anti-sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:
6, o mutantes de la misma existentes naturalmente. Iniciadores
basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 pueden
utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de GBSRP. Las
sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de GBSRP pueden
utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que
codifican la misma proteína o proteínas homólogas. En realizaciones
preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador
unido a ella; el grupo marcador puede ser v.g. un radioisótopo, un
compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor
enzimático. Dichas sondas pueden utilizarse como una parte de un kit
de ensayo de marcadores genómicos para identificar células que
expresan una GBSRP, por ejemplo por medida de un nivel de un ácido
nucleico codificante de GBSRP, en una muestra de células, v.g.,
detección de niveles de mRNA de GBSRP o determinación de si un gen
de GBSRP genómico ha sido mutado o delecionado.
En particular, un método útil para averiguar el
nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA
disponible para la traducción del producto génico) consiste en
realizar una transferencia Northern (para referencia véase, por
ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley: Nueva York). Esta información demuestra al menos
parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Puede
prepararse RNA celular total a partir de células, tejidos u órganos
por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales
como el descrito en Bormann, E.R. et al. 1992 Mol. Microbiol.
6: 317-326. Para evaluar la presencia o la cantidad
relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden
emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western.
Estos métodos son bien conocidos por una persona con experiencia
ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al.
1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva
York).
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido
nucleico de GBSRP, como se ha descrito arriba, en donde la expresión
del vector en una célula hospedadora da como resultado la
tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por
sequía y/o el estrés por helada en comparación con una variedad de
tipo salvaje de la célula hospedadora. Como se utiliza en esta
memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de
ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se
ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", término que
hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario al cual
pueden estar ligados segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de
vector es un vector viral, en el cual segmentos adicionales de DNA
pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de
replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se han
introducido (v.g., vectores bacterianos que tienen un origen de
replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros
vectores (v.g., vectores no episómicos de mamífero) se integran en
el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la
célula hospedadora, y con ello se replican junto con el genoma del
hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la
expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. En
esta memoria se hace referencia a vectores de este tipo como
"vectores de expresión". En general, los vectores de expresión
de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a
menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria
descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse
intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector más
corrientemente utilizada. Sin embargo, la invención tiene por objeto
incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores
virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y
virus adeno-asociados), que desempeñan funciones
equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma
adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula
hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión
recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras,
seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar
para la expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia
de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión
recombinante, la expresión "enlazado operativamente" tiene por
objeto significar que la secuencia de nucleótidos de interés está
enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que
permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (v.g., en un
sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula
hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora).
La expresión "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir
promotores, intensificadores y otros elementos de control de la
expresión (v.g., señales de poliadenilación). Secuencias reguladoras
de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990) o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo
7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, con
inclusión de las referencias que aparecen en dicho lugar.
Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión
constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de
células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la
secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospedadoras
o en ciertas condiciones. Será apreciado por los expertos en la
técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de
factores tales como la elección de la célula hospedadora a
transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los
vectores de expresión de la invención pueden introducirse en
células hospedadoras para producir con ello proteínas o péptidos,
con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por
ácidos nucleicos como se describe en esta memoria (v.g., GBSRPs,
formas mutantes de GBSRPs, proteínas de fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención pueden diseñarse para expresión de GBSRPs en células
procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes GBSRP pueden
expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum,
células de insecto (utilizando vectores de expresión de
baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase
Romanos, M.A. et al. 1992, Foreign gene expression in yeast:
a review, Yeast 8: 423-488; van den Hondel,
C.A.M.J.J. et al. 1991 Heterologous gene expression in
filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W.
Bennet & L.L. Lasure, compiladores, p. 396-428:
Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt,
P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for
filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi,
Peberdy, J.F. et al. compiladores, p. 1-28,
Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et
al. 1999 Marine Biotechnology 1(3):
239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia,
Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium,
Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus,
Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del
género Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un método
de transformación como el descrito en WO 98/01572 y células de
plantas multicelulares (véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988
High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon
explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular
Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter
6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, B.Jenes et
al. Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu,
128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu.
Rev. Plant Physiol. Molec. Biol. 42:205-225 y las
referencias citadas en dichos lugares) o células de mamífero.
Células hospedadoras adecuadas se exponen adicionalmente en
Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, el
vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse
in vitro, utilizando por ejemplo secuencias reguladoras del
promotor T7 y la polimerasa T7.
La expresión de proteínas en procariotas se
realiza en muchos casos con vectores que contienen promotores
constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas
sean de fusión o no lo sean. Los vectores de fusión añaden cierto
número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente
al término amino de la proteína recombinante, pero también al
término C, o se fusionan dentro de regiones adecuadas en las
proteínas. Tales vectores de fusión desempeñan típicamente tres
finalidades: 1) aumentar la expresión de una proteína recombinante;
2) aumentar la solubilidad de una proteína recombinante; y 3) ayudar
a la purificación de una proteína recombinante por actuar como un
ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores
de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión
proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína
recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante
del resto de fusión subsiguientemente a la purificación de la
proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de
reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y
enteroquinasa.
Vectores de expresión de fusión típicos incluyen
pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988 Gene
67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)
y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan
glutation-S-transferasa (GST),
proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a
la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia
codificante de la GBSRP se somete a clonación en un vector de
expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de
fusión que comprende, desde el término N al término C
GST-sitio de escisión de
trombina-proteína X. La proteína de fusión puede
purificarse por cromatografía de afinidad utilizando resina
glutatión-agarosa. La GBSRP recombinante no
fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de
fusión con trombina.
Ejemplos de vectores de expresión de E.
coli inducibles y adecuados que no son de fusión incluyen pTrc
(Amann et al. 1988 Gene 69:301-315) y pET
11b (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)
60-89). La expresión de genes diana por el vector
pTrc está basada en la transcripción por la
RNA-polimerasa del hospedador a partir de un
promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de
genes diana por el vector pET 11d está basada en la transcripción a
partir de un promotor de fusión gn10-lac T7 mediado
por una RNA-polimerasa viral
co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es
suministrada por cepas hospedadoras BL21(DE3) o
HMS174(DE3) a partir de un profago \lambda residente que
aloja un gen T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor
lacUV 5.
Una estrategia para maximizar la expresión de
proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una
bacteria hospedadora que tiene una capacidad deteriorada para
escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S.,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, California (1990)
119-128). Otra estrategia consiste en alterar la
secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión
de tal manera que los codones individuales para cada aminoácido sean
los utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para
expresión, tal como C. glutamicum (Wada et al. 1992
Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración
de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse por
técnicas estándar de síntesis de DNA.
En otra realización, el vector de expresión de
GBSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores
para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1
(Baldari, et al. 1987 Embo J. 6:229-234),
pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:933-943),
pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123),
y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos
para la construcción de vectores apropiados para uso en otros
hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados
en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi",
en: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy, et
al. compiladores, p. 1-28 Cambridge University
Press: Cambridge.
Alternativamente, las GBSRPs de la invención
pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de
expresión de baculovirus. Vectores de expresión de baculovirus
disponibles para expresión de proteínas en células de insecto
cultivadas (v.g., células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et
al. 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la
serie pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology
170:31-39).
En otra realización adicional, un ácido nucleico
de GBSRP de la invención se expresa en células de mamífero
utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores
de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B, 1987 Nature
329-840) y pMT2PC (Kaufman et al. 1987 EMBO
J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de
mamífero, las funciones de control del vector están proporcionadas a
menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores
utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2,
Citomegalovirus y el Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de
expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas,
véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. Fritsch, E.F. y
Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989.
En otra realización, el vector de expresión
recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido
nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se
utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar
el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos se
conocen la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores
específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina
(específico de hígado; Pinkert et al. 1987 Genes Dev.
1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame
y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en
particular promotores de receptores de las células T (Winoto y
Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733) e
inmunoglobulinas (Banerji et al. 1983 Cell
33:729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell
33:741-748), promotores específicos de neuronas
(v.g., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989
PNAS 86:5473-5477), promotores específicos
de páncreas (Edlund et al. 1985 Science
230:912-916), y promotores específicos de glándula
mamaria (v.g., el promotor de lactosuero; patente U.S. No. 4.873.316
y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264.166).
Están comprendidos también promotores regulados por desarrollo, por
ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990 Science,
249:374-379) y el promotor de fetoproteína (Campes y
Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).
En otra realización, las GBSRPs de la invención
pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como
algas) (véase Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1
(3):239-251 y las referencias citadas en dicho
lugar) y células de plantas procedentes de plantas superiores (v.g.,
las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de
vectores de expresión de plantas incluyen los detallados en; Becker,
D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary
vectors with selectable markers located proximal to the left
border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan,
M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant
transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721;
Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants,
vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores: Kung y R. Wu,
Academic Press, 1993; p. 15-38.
Una casete de expresión de plantas contiene
preferiblemente secuencias reguladoras capaces de impulsar la
expresión génica en células de plantas y enlazadas operativamente de
tal manera que cada secuencia puede desempeñar su función, por
ejemplo, la terminación de la transcripción por señales de
poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son las
originarias de t-DNA de Agrobacterium
tumefaciens tales como el gen 3 conocidos como
octopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen
et al. 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de los
mismos, pero también son adecuados cualesquiera otros terminadores
funcionalmente activos en plantas.
Dado que la expresión de genes de plantas no
está limitada en muchos casos a niveles de transcripción, una
casete de expresión de plantas contiene preferiblemente otras
secuencias enlazadas operativamente tales como intensificadores de
la traducción, tales como la secuencia superestimulante que contiene
la secuencia conductora no traducida 5' del virus del mosaico del
tabaco, que mejora la relación de proteína por RNA (Gallie et
al. 1987 Nucl. Acids Research
15:8693-8711).
La expresión de genes de plantas debe enlazarse
operativamente a un promotor apropiado que confiere la expresión de
los genes de una manera oportuna, específica de la célula o del
tejido. Se prefieren promotores que impulsan expresión constitutiva
(Benfey et al. 1989 EMBO J. 8:2195-2202) como
los derivados de virus de plantas tales como el CAMV 35S (Franck
et al. 1980 Cell 21:285-294), el CaMV 19S
(véase también la patente U.S. No. 5352605 y la solicitud PCT No.
WO 8402913) o promotores de plantas como los de la subunidad pequeña
Rubisco descrita en la patente U.S. No. 4.962.018.
Otras secuencias preferidas para uso en casetes
de expresión de genes de plantas son secuencias de direccionamiento
necesarias para dirigir el producto génico a su compartimiento
celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev.
Plant Sci. 15(4):285-423 y las referencias
citadas en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los
tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos,
cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo
endoplasmático, los cuerpos de aceite, peroxisomas y otros
compartimientos de las células de las plantas.
La expresión de genes de plantas puede ser
facilitada también por un promotor inducible (véase Gatz, 1997
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Biol. 48:89-108).
Promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si
se desea que ocurra la expresión génica de una manera específica en
el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible
por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor
inducible por tetraciclina (Gatz et al. 1992 Plant J.
2:397-404) y un promotor inducible por etanol
(Solicitud PCT No. WO 93/21334).
Asimismo, promotores adecuados que responden a
condiciones de estrés biótico o abiótico son aquéllos tales como el
promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et al.
1993 Plant Mol. Biol. 22:371-366), el promotor
hsp80 del tomate inducible por calor (Patente U.S. No. 5187267), el
promotor alfa-amilasa de la patata inducible por
frío (Solicitud PCT No. WO 96/12814) o el promotor pinII inducible
por lesiones (Patente Europea No. 375091). Para otros ejemplos de
promotores inducibles por sequía, frío y sal, tales como el promotor
RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei et al.
(1993 Mol. Gen. Genet. 236:331-340).
Se prefieren especialmente aquellos promotores
que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos,
tales como células de guarda y las células de los pelos radicales.
Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza
(Patente U.S. No. 5.608.152), el promotor USP de Vicia Faba
(Baeumlein et al. 1991 Mol. Gen Genet.
225(3):459-67), el promotor oleosina de
Arabidopsis (Solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor
faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5504200),
el promotor Bce4 de Brassica (Solicitud PCT No. WO 91/13980)
o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al. 1992
Plant Journal, 2(2):233-9) así como
promotores que confieren expresión específica de semillas en plantas
monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz,
etc. Promotores adecuados que deben indicarse son el promotor del
gen 1pt2 o 1pt1 de la cebada (Solicitud PCT No. WO 95/15389 y la
Solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la Solicitud PCT
No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de la cebada, el gen
glutelina del arroz, el gen oricina del arroz, el gen prolamina del
arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen
zeína del maíz, el gen glutelina de la avena, el gen kasirina del
sorgo y el gen secalina del centeno).
Son también especialmente adecuados promotores
que confieren expresión de genes específicos de plástidos, dado que
los plástidos son el compartimiento en el que tiene lugar la
biosíntesis de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de
RNA-polimerasa viral descrito en la Solicitud PCT
No. WO 95/16783 y la Solicitud PCT No. WO 97/06250 y el promotor
clpP de Arabidopsis descrito en la Solicitud PCT No. WO
99/43394.
Puede proporcionarse un vector de expresión
recombinante que comprende una molécula de DNA de GBSRP de la
invención clonado en el vector de expresión en una orientación
antisentido. Es decir, la molécula de DNA se enlaza operativamente
a una secuencia reguladora de una manera que permita la expresión
(por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA
que es antisentido para un mRNA de GBSRP. Pueden seleccionarse
secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de
ácido nucleico clonada en la orientación antisentido que dirigen la
expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una
diversidad de tipos de células. Por ejemplo, pueden seleccionarse
promotores y/o intensificadores virales, o secuencias reguladoras
que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o
específica del tipo de células de RNA antisentido. El vector de
expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido,
fagémido recombinante o virus atenuado en el cual los ácidos
nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región
reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora
puede estar determinada por el tipo de célula en el que se
introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la
expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub, H.
et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic
analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol
et al. 1990 FEBS Letters 268:427-
430).
430).
Otro aspecto de la invención se refiere a
células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de
expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula
hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se
utilizan intercambiablemente en esta memoria. Debe entenderse que
dichas expresiones se refieren no sólo a la célula objeto
particular sino que se aplican también a la progenie o progenie
potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas
modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o a
influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser
idéntica a la célula originaria, pero se incluyen todavía dentro
del alcance de la expresión tal como se utiliza en esta memoria.
Una célula hospedadora puede ser cualquier
célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una GBSRP puede
expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum,
células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales
como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas,
ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como
C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son
conocidas por los expertos en la técnica.
Puede introducirse DNA vector en células
procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de
transformación o transfección. Tal como se utilizan en esta
memoria, los términos "transformación", "transfección",
"conjugación" y "transducción" tienen por objeto hacer
referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica
para la introducción de ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una
célula hospedadora, con inclusión de
co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
lipofección, competencia natural, transferencia mediada por
productos químicos y electroporación. Métodos adecuados para
transformación o transfección de células hospedadoras, con
inclusión de células de plantas pueden encontrarse en Sambrook,
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales
como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44,
Agrobacterium protocols, compiladores: Gartland y Davey,
Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés
biótico o abiótico es un rasgo general que se desea conferir por
herencia a una diversidad de plantas tales como maíz, trigo,
centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete,
algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes,
plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena y tomate,
especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café,
cacao, té), especies de Sálix, árboles (palma de aceite, cocotero),
céspedes perennes y cosechas forrajeras, estas plantas de cosecha
son también plantas diana preferidas para la ingeniería genética
como una realización adicional de la presente invención.
En particular, la invención proporciona un
método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico
codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde la
expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da como
resultado una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o
helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta, que comprende: (a) transformar una célula de planta con un
vector de expresión que comprende un ácido nucleico de GBSRP como
se ha descrito arriba, y (b) generar a partir de la célula de la
planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al
estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la planta. La invención abarca también
un método de aumentar la expresión de un gen de interés en una
célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se transcribe
en respuesta a una GBSRP, que comprende: (a) transformar la célula
hospedadora con un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, y (b)
expresar la GBSRP en la célula hospedadora, incrementando con ello
la expresión del gen transcrito en respuesta a la GBSRP, en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula
hospedadora.
Para dicha transformación de plantas, pueden
utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer,
1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de
los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en
orientación de sentido o antisentido en el T-DNA. En
la posición 5-prima respecto al cDNA un promotor de
planta activa la transcripción del cDNA. Una secuencia de
poliadenilación está localizada en posición 3-prima
respecto al cDNA. La expresión específica de tejido puede lograrse
utilizando un promotor específico de tejido. Por ejemplo, la
expresión específica de semilla puede conseguirse por clonación del
promotor napin o LeB4 o USP en posición 5-prima
respecto al cDNA. Asimismo, puede utilizarse cualquier otro elemento
promotor específico de semilla. Para expresión constitutiva en la
planta entera, puede utilizarse el promotor 35S de CaMV. La
proteína expresada puede estar direccionada a un compartimiento
celular utilizando péptido señal, por ejemplo para plástidos,
mitocondria o retículo endoplasmático (Kermode, 1996 (Crit. Rev.
Plant Sci. 4(15):285-423). El péptido señal
se somete a clonación en posición 5-prima en marco
respecto al cDNA para conseguir la localización subcelular de la
proteína de fusión. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores que
son sensibles a estados de estrés abiótico, tales como el promotor
RD29A de Arabidopsis, con las secuencias de ácido nucleico
descritas en esta memoria. Un experto en la técnica reconocerá que
el promotor utilizado debería estar enlazado operativamente al
ácido nucleico de tal modo que el promotor cause la transcripción
del ácido nucleico, que da como resultado la síntesis de un mRNA
que codifica un polipéptido. Alternativamente, el RNA puede ser un
RNA antisentido para uso en producir la expresión subsiguiente del
mismo u otro gen o genes.
Métodos alternativos de transfección incluyen la
transferencia directa de DNA en flores en desarrollo por
electroporación o transferencia génica mediada por
Agrobacterium. La transformación de plantas mediadas por
Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa
GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1996 Mol. Gen. Genet.
204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de
Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse
por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere
et al. 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788;
Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology
Manual, 2ª Edición - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in
Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11- P ISBN
0-7923-2731-4;
Glick, Bernard R.; Thompson John E., Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. - 360 S.,
ISBN 0-8493-5164-2).
Por ejemplo, la colza puede transformarse por transformación del
cotiledón o el hipocótilo (Moloney et al. 1989 Plant Cell
Report 8:238-242; De Block et al. 1989 Plant
Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para
la selección de Agrobacterium y plantas depende del vector
binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la
transformación. La selección de colza se realiza normalmente
utilizando kanamicina como marcador de plantas seleccionable. La
transferencia de genes mediada por Agrobacterium al lino
puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por
Mlynarova et al. 1994 Plant Cell Report
13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la
soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en
la Patente Europea No. 0424 047, la Patente U.S. No. 5.322.783, la
Patente Europea No. 0397 687, la Patente U.S. No. 5.376.543 o la
Patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del maíz puede
realizarse por bombardeo con partículas, absorción del DNA mediada
por polietilen-glicol o por la técnica de las fibras
de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot
"The maize handbook", Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN
3-540-97826-7). Un
ejemplo específico de transformación del maíz se encuentra en la
Patente U.S. No. 5.990.387 y un ejemplo específico de
transformación del trigo puede encontrarse en la Solicitud PCT No.
WO 93/07256.
Para la transfección estable de células de
mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la
técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de
células puede integrar el DNA extraño en su genoma. A fin de
identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce
generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g.,
resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el
gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen
aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418,
higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia
hacia un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Las moléculas
de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden
introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el
que codifica una GBSRP o pueden introducirse en un vector separado.
Las células transfectadas de manera estable con la molécula de ácido
nucleico introducida pueden identificarse, por ejemplo, mediante
selección de fármacos (v.g., las células que han incorporado el gen
marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células
morirán).
Para crear un microorganismo recombinante
homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de
un gen de GBSRP en el cual se ha introducido una deleción, adición o
sustitución para alterar con ello, v.g., desorganizar
funcionalmente, el gen de GBSRP. Preferiblemente, el gen de GBSRP es
un gen GBSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un
homólogo de una planta afín o incluso de una fuente de mamífero,
levadura, o insecto. En una realización preferida, el vector está
diseñado de tal manera que, por recombinación homóloga, el gen de
GBSRP endógeno se rompe funcionalmente (es decir, ya no codifica una
proteína funcional; a esto se hace referencia también como un
vector puesto fuera de combate ("knock-out")).
Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal manera que,
después de la recombinación homóloga, el gen GBSRP endógeno resulta
mutado o alterado de cualquier otro modo pero codifica todavía una
proteína funcional (v.g., la región reguladora de aguas arriba
puede estar alterada alterando con ello la expresión de la GBSRP
endógena). Para crear una mutación puntual por recombinación
homóloga, pueden utilizarse híbridos DNA-RNA en una
técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss
et al. 1999 Nucleic Acids Research 27(5):
1323-1330 y Kmiec, 1999 Gene therapy american
Scientist 87(3):240-247). Los procedimientos
de recombinación homóloga en Physcomitrella patens son
también bien conocidos en la técnica y se contemplan para uso en
esta invención.
Por lo que respecta al vector de recombinación
homóloga, la porción alterada del gen GBSRP está flanqueada en los
extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del
gen GBSRP que permite que ocurra la recombinación homóloga entre el
gen GBSRP exógeno transportado por el vector y un gen de GBSRP
endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido
nucleico de GBSRP flanqueante adicional tiene una longitud
suficiente para la recombinación homóloga exitosa con el gen
endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varios centenares
de pares de bases hasta kilobases de DNA flanqueante (en ambos
extremos 5' y 3') (véase, v.g., Thomas, K. R., y Capecchi, M.R.,
1987 Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación
homóloga o Strepp et al. 1998 PNAS,
95(8):4368-4373 para recombinación basada en
cDNA en Physcomitrella patens). El vector se introduce en un
microorganismo o célula de planta (v.g., por DNA mediado por
polietilen-glicol), y las células en las cuales el
gen de GBSRP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen
GBSRP endógeno se seleccionan utilizando métodos conocidos en la
técnica.
En otra realización, puede producirse
microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados
que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por
ejemplo, la inclusión de un gen de GBSRP en un vector poniéndolo
bajo control del operón lac permite la expresión del gen GBSRP
únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son
bien conocidos en la técnica.
Una célula hospedadora de la invención, tal como
una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede
utilizarse para producir (es decir, expresar) una GBSRP. De acuerdo
con ello, la invención proporciona adicionalmente métodos para
producir GBSRPs utilizando las células hospedadoras de la invención.
En una realización, el método comprende cultivar la célula
hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector
de expresión recombinante que codifica una GBSRP, o en cuyo genoma
se ha introducido un gen que codifica una GBSRP de tipo salvaje o
alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la GBSRP. En
otra realización, el método comprende adicionalmente aislar GBSRPs
del medio o la célula hospedadora.
Otro aspecto de la invención se refiere a GBSRPs
aisladas como se ha descrito arriba y porciones biológicamente
activas de las mismas. Una proteína "aislada" o
"purificada" o porción biológicamente activa de la misma está
exenta de algo del material celular cuando se produce por técnicas
de DNA recombinante, o precursores químicos u otros productos
químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión
"sustancialmente exenta de material celular" incluye
preparaciones de GBSRP en las cuales la proteína está separada de
algunos de los componentes celulares de las células en las que se
produce la misma natural o recombinantemente. En una realización, la
expresión "sustancialmente exenta de material celular"
incluye preparaciones de una GBSRP que tienen menos de
aproximadamente 30% (expresado en peso seco) de material distinto de
GBSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como
"proteína contaminante"), de modo más preferible menos de
aproximadamente 20% de material distinto de GBSRP, de modo todavía
más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de
GBSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de
material distinto de GBSRP.
Cuando la GBSRP o la porción biológicamente
activa de la misma se produce recombinantemente, la misma está
también de modo preferible sustancialmente exenta de medio de
cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de
aproximadamente 20%, de modo más preferible menos de aproximadamente
10%, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% del
volumen de la preparación de proteína. La expresión
"sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos
químicos" incluye preparaciones de GBSRP en las cuales la
proteína está separada de precursores químicos u otros productos
químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una
realización, la expresión "sustancialmente exenta de precursores
químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de
una GBSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (expresado en peso
seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de
GBSRP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de
precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP, de
modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de
precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP, y de
modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores
químicos o productos químicos distintos de GBSRP. En realizaciones
preferidas, proteínas aisladas, o porciones biológicamente activas
de las mismas, carecen de proteínas contaminantes del mismo
organismo del que se deriva la GBSRP. Típicamente, tales proteínas
se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una GBSRP
de Physcomitrella patens en plantas distintas de
Physcomitrella patens o microorganismos tales como C.
glutamicum, ciliados, algas u hongos.
Las moléculas de ácido nucleico, proteínas,
homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores,
y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse
en uno o más de los métodos siguientes: identificación de
Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas
de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación
y localización de secuencias de interés de Physcomitrella
patens; estudios de evolución; determinación de regiones de
GBSRP requeridas para función; modulación de una actividad de GBSRP;
modulación del metabolismo de una o más funciones celulares;
modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y
modulación de la resistencia al estrés.
El musgo Physcomitrella patens representa
un miembro de los musgos. El mismo es afín a otros musgos tales
como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia
de luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella
comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y el
nivel de polipéptidos permitiendo el uso de escrutinio heterólogo
de moléculas de DNA con sondas procedentes de otros musgos u
organismos, permitiendo así la derivación de una secuencia de
consenso adecuada para escrutinio heterólogo o anotación funcional y
predicción de funciones de genes en terceras especies. La
posibilidad de identificar tales funciones puede tener por tanto
importancia significativa, v.g. la predicción de especificidad de
sustrato de enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido
nucleico
puede servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.
puede servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.
Las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la
invención tienen una diversidad de usos. Es muy importante que el
ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la presente
invención pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo
con ello tolerancia a estados de estrés tales como sequía y frío. La
presente invención proporciona por tanto una planta transgénica
transformada por un ácido nucleico de GBSRP como se ha descrito
arriba, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en
la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés
por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de
tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una
monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención estipula
adicionalmente que la planta transgénica puede seleccionarse de
maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja,
cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol,
tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate,
especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de
Sálix, palma de aceite, cocotero, céspedes perennes y cosechas
forrajeras, por ejemplo.
En particular, la presente invención describe la
utilización de la expresión de GBP-1 de
Physcomitrella patens para producir por ingeniería genética
plantas tolerantes a la sequía y/o tolerantes al frío. Esta
estrategia ha sido demostrada en esta memoria para Arabidopsis
thaliana, colza/canola, habas de soja, maíz y trigo, pero su
aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello,
la invención proporciona una planta transgénica que contiene una
GBSRP seleccionada de GBP-1 (SEQ ID NO: 11), en
donde el estrés ambiental es sequía o temperatura incrementada.
La presente invención proporciona también
métodos de modificación de la tolerancia al estrés, es decir
tolerancia a la sequía y/o al frío de una planta, que comprende
modificar la expresión de una GBSRP como se describe arriba en la
planta.
La invención estipula que este método puede
realizarse de tal manera que la tolerancia al estrés se aumenta o
se reduce. En particular, la presente invención proporciona métodos
de producción de una planta transgénica que tiene una tolerancia
incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de
tipo salvaje de la planta que comprende aumentar la expresión de
una GBSRP en una planta.
Pueden utilizarse métodos de aumento de la
expresión de GBSRPs en los cuales la planta es transgénica o no
transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta
puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los
ácidos nucleicos codificantes de GBSRP arriba descritos, o la planta
puede transformarse con un promotor que dirige la expresión de
GBSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención estipula que
dicho promotor puede ser específico de tejido. Adicionalmente, un
promotor de este tipo puede estar regulado por desarrollo. En una
alternativa, plantas no transgénicas pueden tener expresión de GBSRP
nativa modificada por inducción de un promotor nativo.
La expresión de GBP-1 (SEQ ID
NO: 6) en plantas diana puede realizarse por uno de los ejemplos
siguientes, aunque sin carácter limitante,: (a) promotor
constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor
inducido por productos químicos, y (d)
sobre-expresión de un promotor modificado por
ingeniería genética con, por ejemplo, factores de transcripción
derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275:657).
El último caso implica la identificación de los homólogos de
GBP-1 (SEQ ID NO: 11) en la planta diana así como
de su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que
contienen dedos de cinc se modifican por ingeniería genética para
interaccionar específicamente con la GBP-1 (SEQ ID
NO: 11) homóloga y se activa la transcripción del gen
correspon-
diente.
diente.
Además de introducir las secuencias de ácido
nucleico de GBSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden
utilizarse también para identificar un organismo como
Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo.
Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia
de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una
población mixta de microorganismos. La invención proporciona las
secuencias de ácido nucleico de varios genes de Physcomitrella
patens; por sonda del DNA genómico extraído de un cultivo de una
población singular o mixta de microorganismos en condiciones
severas con una sonda que abarca una región de un gen de
Physcomitrella patens que es exclusivo de este organismo,
puede determinarse si está presente este organismo.
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico
y proteína de la invención pueden servir como marcadores para
regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el
mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de
proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para
identificar la región del genoma a la que se fija una proteína
particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens, el
genoma de Physcomitrella patens podía digerirse, e incubarse
los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos
fragmentos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con
las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente
con marcadores fácilmente detectables. La fijación de una molécula
de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la
localización del fragmento al mapa genómico de Physcomitrella
patens, y, cuando se realiza múltiples veces con enzimas
diferentes, facilita una determinación rápida de la secuencia de
ácido nucleico a la que se fija la proteína. Adicionalmente, las
moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser
suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines de tal
modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como
marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos
afines.
Las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la
invención son también útiles para estudios evolutivos y
estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos y de
transporte en los cuales participan las moléculas de la invención
son utilizados por una diversidad de células procariotas y
eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican
enzimas similares de otros organismos, puede evaluarse la afinidad
evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este
tipo permite una evaluación de cuáles son las regiones de la
secuencia que se conservan y cuáles no, lo que puede ayudar a
determinar aquellas regiones de la proteína que son esenciales para
el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es
valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede
proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en
términos de mutagénesis sin pérdida de función.
La manipulación de las moléculas de ácido
nucleico de GBSRP de la invención puede dar como resultado la
producción de GBSRPs que tengan diferencias funcionales de las
GBSRPs de tipo salvaje. Estas proteínas pueden mejorarse en
eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en
la célula de lo que es usual, y pueden tener eficiencia o actividad
reducidas.
Existen varios mecanismos por los cuales la
alteración de una GBSRP de la invención puede afectar directamente
a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de
plantas que expresan GBSRPs, el transporte incrementado puede
conducir a un reparto mejorado de sal y/o solutos en el tejido y los
órganos de las plantas. Por aumento del número o la actividad de
las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la
célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la
sal.
El efecto de la modificación genética en
plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la
tolerancia al estrés puede evaluarse dejando crecer el
microorganismo o la planta modificado(a) en condiciones
inferiores a las adecuadas y analizando posteriormente las
características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Dichos
métodos de análisis son bien conocidos por un experto en la técnica,
e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis
de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración,
rendimiento de la planta en general y/o la cosecha, floración,
reproducción, producción de semillas, crecimiento de raíces, tasas
de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de HPLC en
Bioquímica en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, vol. 17; Rehm et al. 1993 Biotechnology, vol. 3,
capítulo III: Recuperación y purificación de productos, páginas
469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al.
1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John
Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovery
processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz,
J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical Separations, en: Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, páginas
1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989)
Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes
Publications).
Por ejemplo, vectores de expresión de levadura
que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o
fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en
Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las
células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a
fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y
temperatura. Análogamente, vectores de expresión de plantas que
comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o
fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una
célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza,
maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando
protocolos estándar. Las células transgénicas y/o plantas
resultantes derivadas de ello pueden ensayarse luego en cuanto a
fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y
temperatura.
La modificación por ingeniería genética de uno o
más genes de GBSRP de la invención puede dar también como resultado
GBSRPs que tienen actividades alteradas que afectan indirectamente a
la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas,
plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos tales como C.
glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del
metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de
productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies oxigenadas
reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos
procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito
nitra las cadenas laterales de la tirosina, desactivando con ello
algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves,
J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol.
3(2):226-235). Si bien estos productos son
excretados típicamente, las células pueden alterarse genéticamente
para transportar más productos de lo que es típico para una célula
de tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más
GBSRPs de la invención que están involucradas en la exportación de
moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser
posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.
Adicionalmente, las secuencias descritas en esta
memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar
mutaciones del tipo "knockout" (es decir mutaciones que
desactivan un gen determinado) en los genomas de diversos
organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de
levadura, y células de plantas (Girke, T., 1998 The Plant Journal
15:39-48). Las células "knockout" resultantes
pueden evaluarse luego respecto a su aptitud o capacidad para
tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas
condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o el
genotipo de la mutación. Para otros métodos de desactivación de
genes véase la Patente U.S. No. 6.004.804
"Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju
et al. 1999 Spliceosome-mediated RNA
trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature
Biotechnology 17:246-252.
Las estrategias de mutagénesis mencionadas
anteriormente para GBSRPs que dan como resultado resistencia
incrementada al estrés no deben considerarse limitantes;
variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para un
experto en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando
los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido
nucleico y proteínas de la invención pueden utilizarse para generar
algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como
C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y
proteínas GBSRP mutadas tales que la tolerancia al estrés se
mejora.
Las GBSRPs descritas en esta memoria pueden
utilizarse también para generar anticuerpos que se fijan
específicamente a una GBSRP, o una porción de la misma, tal como es
codificada por un ácido nucleico descrito en esta memoria. Los
anticuerpos pueden producirse por muchos métodos bien conocidos
(véase, v.g Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory
Manual" Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva
York, (1988)). Resumidamente, puede inyectarse antígeno purificado
en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para
provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden
purificarse directamente, o pueden obtenerse células del bazo a
partir del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea
de células inmortales y escrutarse respecto a la secreción de
anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para escrutar
genotecas de clones de ácido nucleico en cuanto a células
secretoras del antígeno. Los clones positivos pueden secuenciarse
posteriormente. (Véase, por ejemplo, Kelly et al. 1992
Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al.
1992 Bio/Technology 10:169-175).
Las expresiones "se fija selectivamente" y
"se fija específicamente" con el polipéptido hacen referencia a
una reacción de fijación que es determinante de la presencia de la
proteína en una población heterogénea de proteínas y otros
compuestos biológicos. Así, en condiciones de inmunoensayo
diseñadas, los anticuerpos específicos fijados a una proteína
particular no se fijan en una cantidad significativa a otras
proteínas presentes en la muestra. La fijación selectiva de un
anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se
seleccione por su especificidad para una proteína particular. Pueden
utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para
seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente a una proteína
particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos
ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos que son
selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow
and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Publications, Nueva York, (1988)), para una descripción de
formatos y condiciones de inmunoensayo que podrían utilizarse para
determinar fijación
selectiva.
selectiva.
En algunos casos, es deseable preparar
anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una
descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos
monoclonales puede encontrarse en Stites et al. compiladores,
"Basic and Clinical Immunology" (Lange Medical Publications,
Los Altos, Calif., 4ª edición) y las referencias citadas en dicho
lugar, y en Harlow and Lane, ("Antibodies; A Laboratory
Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York,
(1988)).
A lo largo de esta solicitud se han citado
diversas publicaciones.
Debe entenderse también que lo que antecede hace
referencia a realizaciones preferidas de la presente invención. La
invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen, que
no deben interpretarse en modo alguno como imposición de
limitaciones en cuanto al alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este estudio se utilizaron plantas de la
especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección
de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo.
Dichas plantas proceden de la cepa 16/14 recogida por H.L.K.
Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue
subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot.
55, 438-446). La proliferación de las plantas se
llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de
los gametofitos. El protonema se desarrolló a partir de la espora
haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en
cloroplastos, sobre el cual se formaron yemas al cabo de
aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que
llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, se
obtuvo el esporofito diploide con una pequeña seta y la cápsula de
esporas, en la cual maduraron las
meiosporas.
meiosporas.
El cultivo se llevó a cabo en una cámara
climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y con una intensidad
de luz de 55 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente
Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El
musgo se modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de
acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165:
354-358) o se cultivó en medio sólido de Knop
utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra).
Los protonemas utilizados para el aislamiento de RNA y DNA se
cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se
trituraron cada nueve días y se transfirieron a medio de cultivo
fresco.
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles para el aislamiento de DNA total se
refieren al tratamiento de un gramo de peso fresco de material de
la planta. Los materiales utilizados incluyen los tampones
siguientes: tampón CTAB: 2% (p/v) de bromuro de
N-cetil-N,N,N-trimetilamonio
(CTAB); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; tampón de
N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de
N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA
20 mM.
El material de planta se trituró bajo nitrógeno
liquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a
matraces Eppendorf de 2 ml. El material de planta congelado se
cubrió luego con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml
de tampón CTAB, 100 \mul de tampón de
N-laurilsarcosina, 20 \mul de
\beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de
proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante una hora con
agitación continua mediante sacudidas. El homogeneizado obtenido se
distribuyó en dos matraces Eppendorf (de 2 ml) y se extrajo dos
veces mediante sacudidas con el mismo volumen de cloroformo/alcohol
isoamílico (24:1). Para la separación de fases, se llevó a cabo una
centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente durante 15
minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC durante 30
minutos utilizando isopropanol enfriado en hielo. El DNA
precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se
resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al.
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN
0-87969-309-6). Para
purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración
final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a -70ºC durante 30 minutos
utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un
paso de lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió
subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración
final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC y la
digestión con RNAsa se llevó a cabo subsiguientemente a 37ºC durante
una hora. El almacenamiento del DNA tuvo lugar
a 4ºC.
a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la investigación de los transcritos, se
aislaron tanto RNA total como RNA poli(A)^{+}. El
RNA total se obtuvo de protonemas de tipo salvaje de 9 días
siguiendo el método GTC (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet.,
244:352-359). El RNA poli(A)^{+} se
aisló utilizando Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las
instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de la
determinación de la concentración del RNA o del RNA
poli(A)^{+}, se precipitó el RNA por adición de
1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M de pH 4,6 y 2 volúmenes de
etanol y se guardó a
-70ºC.
-70ºC.
Para la construcción de la genoteca de cDNA, se
realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa
inversa del Virus de la Leucemia de los Murinos (Roche, Mannheim,
Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la
síntesis de la segunda cadena por incubación con
DNA-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con
RNAsaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). La reacción
se paró por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió
subsiguientemente a hielo. Las moléculas de DNA bicatenario se
hicieron romas con DNA-polimerasa T4 (Roche,
Mannheim) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se separaron por
extracción con fenol/cloroformo y columnas centrífugas Sephadex
G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a
los extremos del cDNA con DNA-ligasa T4 (Roche,
12ºC, durante una noche) y se fosforilaron por incubación con
polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos).
Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de
fusión bajo. Las moléculas DNA mayores que 300 pares de bases se
eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en
columnas Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel,
Alemania), se ligaron a ramas vectoras y se empaquetaron en fagos
lamda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el
kit Gigapack Gold (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) utilizando
material y siguiendo las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron genotecas de cDNA como se describe
en el Ejemplo 3 para secuenciación de DNA de acuerdo con métodos
estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas
utilizando el equipo ABI PRISM Big Bye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt,
Alemania). Se realizó una secuenciación aleatoria subsiguientemente
a la recuperación preparativa del plásmido a partir de genotecas de
cDNA por escisión en masa in vivo, retransformación, y
extensión subsiguiente de DH10B en placas de agar (detalles de
material y protocolo de Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). Se
preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de E. coli
desarrollados durante una noche que crecían en medio Caldo Luria que
contenía ampicilina (véase Sambrook et al. 1989, Cold Spring
Harbor Laboratory Press: ISBN
0-87969-309-6) en un
robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden), de acuerdo
con los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de
secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias se procesaron y anotaron
utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX
proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich,
Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos
bioinformáticos importantes para la caracterización funcional y
estructural de secuencias de proteínas. Para referencia, puede
consultarse el sitio de la web pedant.mips.biochem.mpg.de.
Los algoritmos más importantes incorporados en
EST-MAX son: FASTA: Búsquedas de bases de datos de
secuencias muy sensibles con estimaciones de significación
estadística; Pearson W.R. (1990) Comparación de secuencias rápida y
sensible con FASTP y FASTA. Methods Enzymol.
183:63-98; BLAST: Búsquedas de bases de datos de
secuencias muy sensibles con estimaciones de significación
estadística. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., and
Lipman D.J. Herramienta de búsqueda de alineación local básica.
Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR:
Predicción de la estructura secundaria de alta exactitud de
secuencias simples y múltiples. Frishman, D. and Argos, P. (1997)
75% de exactitud en la predicción de la estructura secundaria de
proteínas. Proteins, 27:329-335; CLUSTALW:
Alineación de secuencias múltiples. Thompson, J.D., Higgins, D.G.
and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Mejora de la sensibilidad de la
alineación de secuencias progresivas múltiples por ponderación de
secuencia, penalidades por laguna específicas de las posiciones y
elección de la matriz de peso. Nucleic Acids Research, 22:
4673-4680; TMAP: Predicción de la región
transmembranal a partir de secuencias múltiplemente alineadas.
Persson, B. and Argos, P. (1994) Predicción de segmentos
transmembranales en proteínas utilizando alineaciones de secuencias
múltiples. J. Mol. Biol. 237:182-192; ALOM2:
Predicción de la región transmembranal de secuencias simples.
Klein, P., Kanehisa, M.,and DeLisi, C. Predicción de la función de
proteínas a partir de las propiedades de las secuencias: Un
análisis discriminado de una base de datos. Biochim. Biophys. Acta
787:221-226 (1984). Versión 2 por Dr.
K-Nakai; PROSEARCH: Detección de patrones de
secuencia de proteínas PROSITE. Kolakowski L.F. Jr, Leunissen
J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: búsqueda rápida de secuencias
de proteínas con patrones de expresión regular relacionados con la
estructura y función de las proteínas. Biotechniques 13,
919-921; BLIMPS: Búsquedas de semejanza contra una
base de datos de bloques sin lagunas. J.C. Wallace and Henikoff S.,
(1992); PATMAT: Un programa de búsqueda y extracción para consultas
y bases de datos de secuencia, patrón y bloque, CABIOS
8:249-254. Escrito por Bill Alford.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cDNAs parciales de Physcomitrella
patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se
identificaron en el programa de secuenciación de Physcomitrella
patens EST utilizando el programa EST-MAX por
análisis BLAST. Los Números de Identificación de Secuencia
correspondientes a estos ESTs son como sigue: GBP-1
(SEQ ID NO: 1) (abarcada por la presente invención),
GBP-2 (SEQ ID NO: 2) (no abarcada por la presente
invención), GBP-3 (SEQ ID NO: 3) (no abarcada por
la presente invención), GBP-4 (SEQ ID NO: 4) (no
abarcada por la presente invención) y GBP-5 (SEQ ID
NO: 55) (no abarcada por la presente invención).
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar PpGBP-2 de longitud
total (SEQ ID NO: 7) se realizó una PCR como se describe más
adelante bajo Amplificación de Longitud Total utilizando los ESTs
originales descritos en el Ejemplo 5 como molde dado que los mismos
eran de longitud total (véase la Tabla 3 para los iniciadores). Para
aislar los clones codificantes de PpGBP-1 (SEQ ID
NO: 6), PpGBP-3 (SEQ ID NO: 8),
PpGBP-4 (SEQ ID NO: 9) y PpGBP-5
(SEQ ID NO: 10) de Physcomitrella patens, se crearon
genotecas de cDNA con el kit SMART RACE cDNA Amplification (Clontech
Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
utilizó como molde RNA total aislado como se describe en el Ejemplo
3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento del RNA como
sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 h con medio complementado
con NaCl 1-M; Estrés por Frío: 4ºC durante los
mismos tiempos que para la sal; Estrés por Sequía: los cultivos se
incubaron sobre papel de filtro seco durante los mismos tiempos
anteriores. El RNA se retiró luego y se utilizó para
aislamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las secuencias EST
PpGBP-1 (SEQ ID NO: 1), PpGBP-3 (SEQ
ID NO: 3), PpGBP-4 (SEQ ID NO: 4),
PpGBP-5 (SEQ ID NO: 5) identificadas por la
búsqueda de bases de datos como se describe en el Ejemplo 5, para
diseñar oligos para RACE (véase la Tabla 3). Las secuencias
extendidas para estos genes se obtuvieron por realización de la
reacción en cadena de la polimerasa Rapid Amplification of cDNA Ends
(RACE PCR) utilizando el kit Adbantage2 PCR (Clontech Laboratories)
y el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories)
empleando un termociclador Biometra T3 siguiendo las instrucciones
del fabricante.
Las secuencias obtenidas por las reacciones RACE
contenían el extremo 5' de las regiones codificantes de longitud
total para PpGBP-1, PpGBP-3,
PpGBP-4 y PpGBP-5 y se utilizaron
para diseñar oligos para clonación de longitud total de los genes
respectivos (véase a continuación bajo "Amplificación de Longitud
total").
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron clones de longitud total
correspondientes a PpGBP-2 (SEQ ID NO: 7) realizando
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores
específicos de genes (véase la Tabla 3) y el EST original como
molde. Las condiciones para la reacción eran condiciones estándar
con DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó
de acuerdo con condiciones estándar y con los protocolos del
fabricante (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A
Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Cold Spring Harbor, NY, termociclador Biometra T3). Los parámetros
para la reacción eran: cinco minutos a 94ºC seguidos por cinco
ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC.
Esto fue seguido por 25 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a
65ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Los clones de longitud total para
PpGBP-1 (SEQ ID NO: 6), PpGBP-3 (SEQ
ID NO: 8), PpGBP-4 (SEQ ID NO: 9),
PpGBP-5 (SEQ ID NO: 10) se aislaron por repetición
del método RACE pero utilizando los iniciadores específicos de
genes que se dan en la Tabla 3.
Los fragmentos amplificados se extrajeron luego
del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick
(Qiagen) y se ligaron en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores
recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen)
utilizando condiciones estándar (Sambrook et al. 1989.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Las células
transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml
de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido)
y 0,8 mg de IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactosido)
que se había dejado crecer durante una noche a 37ºC. Se
seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3
ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se
dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA
plasmídico utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los análisis de los
clones subsiguientes y el mapeado de restricción se llevaron a cabo
de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook
et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª
Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor,
NY).
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el constructo plasmídico pACGH101 con
PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo
por medio del Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). Esto dio
como resultado un fragmento vector con el promotor Actina 2 de
Arabidopsis con intrón interno y el terminador OCS3. Los
iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII se
designaron como sigue:
El gen NPTII de 0,9 kilobases se amplificó por
PCR a partir de DNA del plásmido pCambia 2301 [94ºC 60 s, {94ºC 60
s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) 60 s, 62ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10
min en máquina de Gradiente T Biometra], y se purificó por medio
del Kit de Extracción PCR Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El DNA de la PCR se subclonó luego en
el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) siguiendo
las instrucciones del fabricante (constructo
NPT-Topo). Estas ligaciones se transformaron en
células Top10 (Invitrogen) y se dejaron crecer sobre placas LB con
50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante una noche a 37ºC. Se
utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50
\mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una
noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el kit
Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció en ambas direcciones
5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis subsiguiente de
los datos de secuencia utilizando el soporte lógico VectorNTI
reveló la ausencia de errores de la PCR en la secuencia del gen
NPTII.
El constructo NPT-Topo se
digirió luego con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. El fragmento de 0,9 kilobases se
purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del Kit de
Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). El fragmento de inserción
Pst/Fse de NPT-Topo y el fragmento vector Pst/Fse
de pACGH101 se ligaron luego uno a otro utilizando
DNA-ligasa T4 (Roche) siguiendo las instrucciones
del fabricante. La ligación se transformó luego en células Top10
(Invitrogen) en condiciones estándar, creando el constructo
pBPSsc019. Se seleccionaron colonias sobre placas LB con 50
\mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una
noche a 37ºC. Se utilizaron luego estas colonias para inocular 2 ml
de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron
crecer durante una noche a 37ºC. Se recuperó el DNA plasmídico
utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
El constructo pBPSSC019 se digirió con KpnI y
BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo luego por medio
del Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con sus
instrucciones, dando como resultado una casete
Act-NPT de 3 kilobases, que incluía el promotor
Actin2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el
terminador OCS3.
El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI
(Roche) y se rellenó en los extremos romos con enzima Klenow y
dNTPs 0,1 mM (Roche) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Esto produjo un fragmento vector de 10,1 kilobases
menos la casete de Gentamicina, que se recircularizó por
autoligación con DNA-ligasa T4 (Roche), y se
transformó en células Top10 (Invitrogen) empleando condiciones
estándar. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que
contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer
durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego colonias para
inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de
kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo
el DNA plasmídico utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido
recircularizado se digirió luego con KpnI (Roche) y se extrajo del
gel de agarosa empleando el Kit de Extracción de DNA Qiaex II
(Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
La inserción Act-NPT cortada con
Kpn y el vector pBPSJH001 recircularizado cortado con Kpn se ligaron
luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) y
se transformaron en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. El constructo resultante,
pBPSsc022, contenía ahora el Super Promotor, el gen CUS, el
terminador NOS, y la casete Act-NPT. Las células
transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 50 \mug/ml
de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a
37ºC. Se utilizaron luego colonias para inocular 2 ml de LB líquido
que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron
crecer a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el kit
QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Después de confirmación del éxito de la ligación por
digestiones de restricción, se propagó ulteriormente el DNA del
plásmido pBPSsc022 y se recuperó utilizando el kit Plasmid Midiprep
(Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos que contenían los diferentes
factores de transcripción de Physcomitrella patens se
subclonaron a partir de los vectores PCR2.1 TOPO por doble
digestión con enzimas de rescisión (véase la Tabla 4) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. El fragmento de la
subsecuencia se escindió del gel de agarosa con un Kit de
Extracción de Gel QIAquick (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante, y se ligó a los vectores binarios pBPSsc022, se
escindió con las enzimas apropiadas (véase Tabla 4) y se
desfosforiló antes de la ligación. El pBPSsc022 recombinante
resultante contenía el ácido nucleico de la proteína fijadora de
GTP correspondiente en la orientación de sentido bajo el
super-promotor constitutivo.
\vskip1.000000\baselineskip
* = no abarcada por la presente invención |
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores recombinantes se transformaron en
Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con
condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).
Se cultivaron y transformaron Arabidopsis
thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar
(Bechtold 1993, Acad. Sci. París. 316:1194-1199;
Bent et al. 1994, Science 265:1856-1860).
Se utilizaron semillas T1 de acuerdo con
protocolos estándar (Xiong et al. 1999, Plant Molecular
Biology Reporter 17:159-170). Se extendieron las
semillas sobre medio ½ Murashige y Skoog (MS)
(Sigma-Aldrich) de pH 5,7 con KOH, 0,6% de agar y
se complementaron con 1% de sacarosa, 0,5 g/l de ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES)
(Sigma-Aldrich), 50 \mug/ml de kanamicina
(Sigma-Aldrich), 500 \mug/ml de carbenicilina
(Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil
(Sigma-Aldrich). Las semillas en las placas se
vernalizaron durante 4 días a 4ºC. Las semillas se dejaron germinar
en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y con
intensidad luminosa de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca); tubo
fluorescente Philips TL 65W/25) con 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad como ciclo de longitud diurna. Las plantas de semillero
transformadas se seleccionaron al cabo de 14 días y se
transfirieron a medio ½ MS de pH 5,7 con placas de agar KOH al 0,6%
complementadas con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, 0,5 g/l de MES
(Sigma-Aldrich), y 2 \mug/ml de benomil
(Sigma-Aldrich) y se dejaron recuperar durante
5-7 días.
Se transfirieron plantas de semillero T1 a papel
de filtro estéril seco en una cápsula Petri y se dejaron desecar
durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en un equipo Percival
Growth CU3615, micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente
Philips TL 65W/25). Se redujo luego la RH a 60% y se desecaron
ulteriormente las plantas de semillero durante 8 horas. Las plantas
de semillero se retiraron luego y se pusieron sobre placas de agar
½ MS 0,6% complementadas con 2 \mug/ml de benomil
(Sigma-Aldrich) y 0,5 g/l de MES
(Sigma-Aldrich) y se evaluaron después de 5
días.
En condiciones de estrés por sequía, las plantas
de Arabidopsis thaliana que sobreexpresaban
PpGBP-1 exhibían una tasa de supervivencia de 45%
(9 supervivientes de 20 plantas estresadas) al escrutinio de estrés;
PpGBP-2, 84% (76 supervivientes de 90 plantas
estresadas); PpGBP-3, 44% (4 supervivientes de 9
plantas estresadas); PpGBP-4, 82% (97
supervivientes de 116 plantas estresadas); en tanto que el control
no transformado tenía una tasa de supervivencia de 28% (16
supervivientes de 57 plantas estresadas) (véase Tabla 5). Es digno
de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se
realizaron con plantas T1, y por consiguiente los resultados serán
mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
* = no abarcado por la presente invención |
\vskip1.000000\baselineskip
Se transportaron plantas de semillero a cápsulas
Petri que contenían 1/2 MS 0,6% agar complementado con 2% de
sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de
semillero se incubaron a 4ºC durante una hora y se cubrieron luego
con hielo machacado. Las plantas de semillero se pusieron luego en
una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron
durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC y descendiendo -1ºC/hora. Las
plantas de semillero se incubaron luego a -5,0ºC durante 24 horas y
se dejaron descongelar luego a 5ºC durante 12 horas. El agua se
retiró por vertido y las plantas de semillero se registraron al cabo
de 5 días.
En condiciones de estrés por helada, las plantas
de Arabidopsis thaliana que sobreexpresaban
PpGBP-1 exhibían una tasa de supervivencia de 60%
(15 supervivientes de 25 plantas estresadas) al escrutinio de
estrés; PpGBP-2, 75% (44 supervivientes de 59
plantas estresadas); PpGBP-3, 80% (8 supervivientes
de 10 plantas estresadas); PpGBP-4 87% (34
supervivientes de 39 plantas estresadas); PpGBP-5
75% (6 supervivientes de 8 plantas estresadas); mientras que el
control no transformado exhibía una tasa de supervivencia de 28% (16
supervivientes de 57 plantas estresadas) (véase la Tabla 6). Es
digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se
realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán
mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico
fuerte.
fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
* = no abarcado por la presente invención |
Se transfirieron plantas de semillero a papel de
filtro impregnado en 1/2 MS y se pusieron sobre agar al 0,6% 1/2 MS
complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior al
escrutinio de tolerancia a la sal. Para el escrutinio de tolerancia
a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero se
desplazó a pilas de papel de filtro estéril, impregnado en NaCl 50
mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro
con las plantas de semillero se movió a pilas de papel de filtro
estéril, impregnado con NaCl 200 mM, en una cápsula Petri. Después
de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se movió
a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 600 mM, en
una cápsula Petri. Después de 10 horas, las plantas de semillero se
movieron a cápsulas Petri que contenían 0,6% de agar 1/2 MS
complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero
se evaluaron después de 5 días.
Las plantas transgénicas se escrutan respecto a
su tolerancia mejorada a la sal, demostrando que la expresión del
transgén confiere tolerancia a la sal.
Una hoja de una planta de tipo salvaje y una
planta transgénica de Arabidopsis se homogeneizó en 250
\mul de tampón de bromuro de
hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4
M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM de pH 8,0) y 1 \mul de
\beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a
60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250
\mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron
enérgicamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5
minutos durante 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada
muestra y se añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se
incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos, y se
centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g. Cada pelet se lavó
con etanol a 70%, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se
utilizaron 4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR
de 20 \mul utilizando DNA-polimerasa Taq
(Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El plásmido del vector binario con cada gen clonado en
el mismo se utilizó como control positivo, y como control negativo
se utilizó DNA genómico C24 de tipo salvaje en las reacciones PCR.
La reacción PCR de 10 \mul se analizó en gel de agarosa/bromuro de
etidio al 0,8%. El programa PCR utilizado fue como sigue: 30 ciclos
de un minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 70ºC, seguido
por 10 minutos a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El iniciador 5' era como sigue:
- 5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3' (SEQ ID NO: 35). Los iniciadores específicos del gen y el tamaño de las bandas amplificadas (Tamaño del Producto Génico) se indican a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
PpGBP-1:
- Iniciador: RC587: GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG
- Producto génico: 700 pb (SEQ ID NO: 36).
\vskip1.000000\baselineskip
PpGBP-2: (no abarcado por la
presente invención)
- Iniciador: RC404: GCGAGCTCGAGGCACTAATCAGAGAACGCCGTA
- Producto Génico: 1000 pb (SEQ ID N0:37)
\vskip1.000000\baselineskip
PpGBP-3: (no abarcado por la
presente invención)
- Iniciador: RC498: GCGAGCTCGACCCTGGCATTTCCCATCGCAGCAA
- Producto Génico: 700 pb (SEO ID N0:38)
\vskip1.000000\baselineskip
PpGBP-4: (no abarcado por la
presente invención)
- Iniciador: RC569: GCGAGCTCCTGGGAGTTGAGGGCTTGGATGTAA
- Producto Génico: 2100 pb (SEQ ID N0:39)
\vskip1.000000\baselineskip
PpGBP-5: (no abarcado por la
presente invención)
- Iniciador RC647:GCGAGCTCGCAACTGGCGTACTTATTAACACTA
- Producto Génico: 900 pb (SEQ ID N0:40)
\vskip1.000000\baselineskip
Los transgenes se amplificaron con éxito a
partir de las líneas transgénicas T1, pero no del tipo salvaje C24.
Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al
menos una copia de los transgenes. No había indicación alguna de
existencia de genes idénticos o muy similares en el control de
Arabidopsis thaliana sin transformar que pudo amplificarse
por este método.
La expresión del transgén se detectó utilizando
RT-PCR. Se aisló el RNA total a partir de plantas
tratadas por estrés utilizando un procedimiento adaptado (de
Verwoerd et al. 1989 NAR 17:2362). Se recogieron muestras de
hojas (50-100 mg) y se trituraron a un polvo fino en
nitrógeno líquido. Se resuspendió el tejido triturado en 500 \mul
de una mezcla 1:1 a 80ºC de fenol a tampón de extracción (LiCl 100
mM, Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM, SDS al 1%), seguido por
agitación enérgica breve para mezclar. Después de la adición de 250
\mul de cloroformo, se agitó brevemente cada muestra con
intensidad. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a
12.000 x g. La fase acuosa superior se llevó a un tubo Eppendorf
nuevo. Se precipitó el RNA por adición de una décima parte de su
volumen de acetato de sodio 3 M y dos volúmenes de etanol de 95%. Se
mezclaron las muestras por inversión y se dejaron en hielo durante
30 minutos. El RNA se redujo a un sedimento por centrifugación a
12.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y los
pelets se secaron brevemente al aire. Los pelets de las muestras de
RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada con DEPC. Para
eliminar el DNA contaminante de las muestras, se trató cada una con
DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del RNA total utilizando el
estuche de síntesis de cDNA de la primera Cadena (Boehringer
Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
La amplificación por PCR de un fragmento
específico de gen del cDNA sintetizado se realizó utilizando DNA
polimerasa Taq (Roche) y los iniciadores específicos del gen
en la reacción siguiente: tampón PCR 1X, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2
\muM de cada iniciador, 0,2 \muM dNTPs, 1 unidad de polimerasa,
y 5 \mul de cDNA de la reacción de síntesis. La amplificación se
realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1
minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto,
35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todos
los casos. Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al
1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV
utilizando el sistema de documentación de gel
Quantity-One (Bio-Rad). La expresión
de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos
resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas
transgénicas y sugerían fuertemente que su producto génico mejoraba
la tolerancia de la planta al estrés en las líneas transgénicas. De
acuerdo con la exposición anterior, no pudo detectarse por este
método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy
similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del
Ejemplo 7.
* = no abarcado por la presente invención |
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los constructos pBPSLVM162,
pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar
soja como se describe a continuación.
Se esterilizaron en superficie semillas de soja
con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con
agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de
Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Twin durante 20 minutos con
agitación continua mediante sacudidas. Después de ello, se lavaron
las semillas 4 veces con agua destilada y se pusieron sobre papel
de filtro estéril humedecido en una cápsula Petri a la temperatura
ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las
semillas, y se desprendieron los cotiledones del eje del embrión.
El eje del embrión se examinó para asegurarse de que no se había
deteriorado la región meristemática. Los ejes cortados del embrión
se recogieron en una cápsula Petri estéril
semi-abierta y se secaron al aire hasta un
contenido de humedad menor que 20% (peso fresco) en una cápsula
Petri sellada hasta su uso ulterior.
Se preparó un cultivo de Agrobacterium
tumefaciens a partir de una sola colonia en medio LB sólido más
los antibióticos apropiados (v.g. 100 mg/l de estreptomicina, 50
mg/l de kanamicina) seguido por crecimiento de la colonia simple en
medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. A
continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un sedimento a
7000 rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se
resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con
acetosiringona 100 \muM. Los cultivos bacterianos se incubaron en
este medio de pre-inducción durante 2 horas a la
temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los
embriones de las semillas cigóticas de soja a aproximadamente 15% de
contenido de humedad se embebieron durante 2 horas a la temperatura
ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium
pre-inducido. Los embriones se retiraron del
cultivo de imbibición y se transfirieron a cápsulas Petri que
contenían medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se
incubaron durante 2 días en la oscuridad, a la temperatura
ambiente. Alternativamente, los embriones se pusieron sobre papel de
filtro estéril húmedo (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se
incubaron en las mismas condiciones arriba descritas. Después de
este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o
líquido complementado con 50 mg/l de carbenicilina o 300 mg/l de
cefotaximo para destruir las agrobacterias. Se utilizó el medio
líquido para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se
incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol^{-2}s^{-1}
y fotoperiodo de 12 horas. Una vez que las plantas de semillero
produjeron raíces, se transfirieron a suelo Metromix estéril. El
medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de
transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo
una cubierta de plástico durante 1 semana para favorecer el proceso
de aclimatación. Se transfirieron luego las plantas a una sala de
crecimiento en la cual se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol
m^{-2}s^{-1} de intensidad luminosa y fotoperiodo de 12 horas
durante aproximadamente 80 días.
Las plantas transgénicas se escrutaron luego en
cuanto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío, de
acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo 7,
demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia
al estrés.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los constructos pBPSLVM162,
pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar
colza/canola como se describe a continuación.
El método de transformación de plantas descrito
en esta memoria es también aplicable a Brassica y otras cosechas.
Semillas de canola se esterilizan superficialmente con etanol al 70%
durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua
mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado
con 0,05% (v/v) de Twin durante 20 minutos, a la temperatura
ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A continuación,
se lavan 4 veces las semillas con agua destilada y se dejan sobre
papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la
temperatura ambiente durante 18 horas. Se separan luego las
cubiertas de las semillas y las semillas se secan al aire durante
una noche en una cápsula Petri estéril semiabierta. Durante este
periodo, las semillas pierden aproximadamente un 85% de su
contenido de agua. Las semillas se guardan a la temperatura ambiente
en una cápsula Petri herméticamente cerrada hasta su uso ulterior.
Los constructos de DNA y la imbibición de los embriones son como se
describe en el Ejemplo 10. Se analizan muestras de las plantas
transgénicas primarias (T0) por PCR para confirmar la presencia de
T-DNA. Estos resultados se confirman por hibridación
Southern en la cual el DNA se somete a electroforesis en un gel de
agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nailon cargada
positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de
Sonda PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada
con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
Las plantas transgénicas se escrutan luego
respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método
de escrutinio descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la
expresión del transgén confiere tolerancia a la sequía.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los constructos pBPSLVM162,
pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar
maíz como se describe a continuación.
La transformación de maíz (Zea Mays L.) se
realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996 Nature
Biotech. 14645-50. Los embriones inmaduros se
co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que
llevan vectores "super-binarios", y las
plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este
procedimiento proporciona una eficiencia de transformación
comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se escrutan
luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el
frío de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo
7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al
estrés.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los constructos pBPSLVM162,
pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar
trigo como se describe a continuación.
La transformación del trigo se realiza con el
método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotech.
14745-50. Se co-cultivan embriones
inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores
"super-binarios", y se recuperan plantas
transgénicas por organogénesis. Este procedimiento proporciona una
eficiencia de transformación entre 2,5% y 20%. Las plantas
transgénicas se escrutan luego respecto a su tolerancia mejorada al
estrés de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el
Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere
tolerancia a la sequía.
Pueden utilizarse secuencias génicas para
identificar genes homólogos o heterólogos a partir de cDNA o
genotecas genómicas. Los genes homólogos (v.g. clones de cDNA de
longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico
utilizando por ejemplo genotecas de cDNA. Dependiendo de la
abundancia del gen de interés, se extienden en placas 100.000 hasta
1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a
membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, se
inmoviliza el DNA en la membrana mediante, v.g., reticulación por
UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de severidad alta.
En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan con una
fuerza iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68ºC. Se generan
sondas de hibridación mediante v.g. marcación radiactiva (^{32}P)
por transcripción de la mella (High Prime, Roche, Mannheim,
Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.
Los genes parcialmente homólogos o heterólogos
que son afines pero no idénticos pueden identificarse de una manera
análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de
hibridación y lavado de baja severidad. Para la hibridación acuosa,
la fuerza iónica se mantiene normalmente a NaCl 1 M mientras que la
temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42ºC.
El aislamiento de las secuencias génicas con
homologías (o identidad/semejanza de secuencia) solamente en un
dominio diferenciado de (por ejemplo 10-20
aminoácidos) puede llevarse a cabo por utilización de sondas de
oligonucleótidos sintéticos radio-marcadas. Los
oligonucleótidos radio-marcados se preparan por
fosforilación del extremo 5-prima de dos
oligonucleótidos complementarios con
polinucleótido-quinasa T4. Los oligonucleótidos
complementarios se reasocian y se ligan para formar concatémeros.
Los concatémeros bicatenarios se someten luego a radiomarcación
mediante, por ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se
lleva a cabo normalmente en condiciones de severidad baja
utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos.
Solución de hibridación de oligonucleótidos:
- 6 x SSC
- fosfato de sodio 0,01 M
- EDTA 1 mM (pH 8)
- 0,5% SDS
- 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
- 0,1% de leche desnatada seca
Durante la hibridación, la temperatura se reduce
gradualmente hasta 5ºC por debajo del valor Tm estimado de los
oligonucleótidos o hasta la temperatura ambiente seguido por pasos
de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con severidad
baja tal como tres pasos de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles
adicionales han sido descritos por Sambrook, J. et al.
(1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994)
"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &
Sons.
Pueden utilizarse clones de cDNA para producir
proteínas recombinantes, por ejemplo en E. coli (v.g. sistema
QIAexpress pQE de Qiagen). Las proteínas recombinantes se purifican
luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad
Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se
utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo
utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los
anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna
Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha
sido descrito por Gu et al. 1994 BioTechniques
17:257-262. El anticuerpo puede utilizarse luego
para escrutar genotecas de expresión de cDNA a fin de identificar
genes homólogos o heterólogos por escrutinio inmunológico (Sambrook,
J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M.
et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons.
La mutagénesis in vivo de microorganismos
puede realizarse mediante pasadas de DNA plasmídico (u otro vector)
a través de E. coli u otros microorganismos (v.g.
Bacillus spp o levaduras tales como Saccharomyces
cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para
mantener la integridad de su información genética. Las cepas
mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de
reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia,
véase Rupp W.D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia
coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM:
Washington). Tales cepas son bien conocidas por los expertos en la
técnica. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en
Greener, A. y Callahan, M. (1994) Strategies
7:32-34. La transferencia de moléculas de DNA
mutadas en plantas se realiza preferiblemente después de selección y
ensayo en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de
acuerdo con diversos ejemplos dentro de la sección de ejemplos de
este docu-
mento.
mento.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de las actividades y los
parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la
técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier
enzima alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica
de la enzima de tipo salvaje, lo cual está perfectamente dentro de
la capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de
enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a
estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos
para la determinación de muchas actividades de enzimas pueden
encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M.,
and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, (1985)
Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979)
Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C.,
Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:
Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press:
Nueva York; Bisswanger, H, (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH:
Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., GraBl,
M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis,
3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9,
Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.
La actividad de las proteínas que se fijan a DNA
puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como
ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también
ensayos de retardación en gel). El efecto de dichas proteínas sobre
la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de
genes informadores (tales como el descrito Kolmar, H. et al.
(1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las
referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de ensayo de
genes informadores son bien conocidos y están bien establecidos para
aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando
enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína
fluorescente verde, y varias
otras.
otras.
La determinación de la actividad de las
proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con
técnicas tales como las descritas en Gennis, R.B. Pores, Channels
and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and
Function, pp. 85-137, 199-234 y
270-322, Springer, Heidelberg (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
La recuperación del producto deseado a partir de
material de plantas (a saber, Physcomitrella patens o
Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de
C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con
las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el
sobrenadante de los cultivos arriba descritos puede realizarse por
diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto
deseado no es secretado por las células, puede recogerse a partir
del cultivo por centrifugación a baja velocidad, después de lo cual
pueden lisarse las células por técnicas estándar, tales como fuerza
mecánica o sonificación. Los órganos de las plantas pueden
separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la
homogeneización, los residuos celulares se separan por
centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las
proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del
compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células
deseadas, entonces se separan las células del cultivo por
centrifugación a baja velocidad, y se retiene la fracción
sobrenadante para purificación ulterior.
La fracción sobrenadante de cualquier método de
purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en
la cual la molécula deseada o es retenida sobre una resina
cromatográfica en tanto que muchas de las impurezas de la muestra
no se retienen, o, por el contrario, las impurezas son retenidas por
la resina mientras que la muestra no lo es. Tales pasos de
cromatografía pueden repetirse en caso necesario, utilizando la
misma o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la
técnica estaría plenamente versado en la selección de resinas
cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para una
molécula particular a purificar. El producto purificado puede
concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una
temperatura a la que se maximiza la estabilidad del
producto.
producto.
Existe una amplia serie de métodos de
purificación conocidas en la técnica y el método de purificación que
antecede no tiene por objeto ser limitante. Dichas técnicas de
purificación se describen, por ejemplo, en Bailei J.E. & Ollis,
D.F. Biochemical Engineering Fundamentals,
McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la
identidad y pureza de los compuestos aislados puede evaluarse por
métodos estándar de la técnica. Éstos incluyen cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos
de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático,
o microbiológicamente. Tales métodos de análisis se revisan en:
Patek et al. 1994 Appl. Environ. Microbiol.
60:133-140; Malakhova et al., 1996
Biotekhnologiya 11:27-32; y Schmidt et
al., 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70.
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27,
VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540,
p. 540-547, p. 559-566,
575-581 and p. 581-587; Michal, G.
(1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular
Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987)
Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.
<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS FIJADORAS DE GTP
RELACIONADAS CON EL ESTRÉS, Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN EN PLANTAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 16313-0040
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/11291
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-04-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/196,001
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 805
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 749
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 815
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (782)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 490
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
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<213> Secuencia Artificial
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<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctcct gggagttgag ggcttggatg taa
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctcgc aactggcgta cttattaaca cta
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgggtc cgtagatacc aaggctggt
\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgggcc tctcttgctc atccccaatg gctg
\hfill34
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<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctcga ggcactaatc agagaacgcc gta
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgggca ggagattgga gaatcagtct gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctcga ccctggcatt tcccatcgca gcaa
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcacacagg agtacgcaga gtttc
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctctctgc gtcttgctgc tatcatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<400> 49
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\hfill33
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<210> 50
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctcgc aactggcgta cttattaaca cta
\hfill33
Claims (40)
1. Una célula de planta transgénica
transformada por un ácido nucleico codificante de Proteína Fijadora
de GTP Relacionada con el Estrés (GBSRP), en la cual la GBSRP se
selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se
define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de
identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda
su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula
de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la
célula de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la
planta.
2. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la GBSRP es como se define en SEQ ID
NO: 11.
3. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual el ácido nucleico codificante de GBSRP
es como se define en SEQ ID NO: 6.
4. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual el ácido nucleico codificante de GBSRP
tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con
la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6. en toda su región
codificante.
5. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la planta es una monocotiledónea.
6. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la planta es una dicotiledónea.
7. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la planta se selecciona del grupo
constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz,
cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca,
pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco,
berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café,
cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierbas
perennes y cosechas forrajeras.
8. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la expresión del ácido nucleico en la
célula de la planta da como resultado una eficiencia incrementada
del uso de agua por la planta en comparación con una variedad de
tipo salvaje de la célula de la planta.
9. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en la cual la expresión del ácido nucleico en la
célula de la planta da como resultado un peso seco incrementado de
la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
célula de la planta.
10. Una planta transgénica que comprende una
célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-9.
11. Una semilla producida por una planta
transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la cual
la semilla es progenie auténtica para una tolerancia incrementada
al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la célula de la planta.
12. Uso de una planta transgénica de acuerdo
con la reivindicación 10 o una semilla de acuerdo con la
reivindicación 11 para la fabricación de un producto agrícola.
13. Una Proteína Relacionada con el Estrés
Fijadora de GTP (GBSRP) aislada, en la cual la GBSRP se selecciona
del grupo constituido por Proteína-1 Relacionada con
el Estrés Fijadora de GTP (GBP-1) como se define en
SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad
de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su
longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en una planta
da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al
estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la planta.
14. La GBSRP aislada de la reivindicación 13,
en la cual la GBSRP es GBP-1 como se define en SEQ
ID NO: 11.
15. Un ácido nucleico codificante de Proteína
Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP) aislado, en el
cual la GBSRP se selecciona del grupo constituido por
GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11 y una
secuencia de polipéptidos que tiene al menos 95% de identidad de
secuencia con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 11 en toda
su longitud.
16. El ácido nucleico codificante de GBSRP
aislado de la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico
codificante de GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 6.
17. El ácido nucleico codificante de GBSRP
aislado de la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico
codificante de GBSRP tiene al menos 80-90% de
identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID
NO: 6 en toda su región codificante.
18. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 15, en donde la expresión del ácido nucleico en una
planta da como resultado una eficiencia incrementada de uso del
agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la planta.
19. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 15, en donde la expresión del ácido nucleico en una
célula de la planta da como resultado un peso seco incrementado de
la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta.
20. Un vector de expresión recombinante que
comprende un ácido nucleico de las reivindicaciones 15, 16, 17, 18
ó 19, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula
hospedadora da como resultado la tolerancia incrementada de la
célula hospedadora al estrés por sequía y/o estrés por helada en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula
hospedadora.
21. El vector de expresión recombinante de la
reivindicación 20, en el cual la expresión del ácido nucleico en
una planta da como resultado una eficiencia incrementada de uso del
agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la planta.
22. El vector de expresión recombinante de la
reivindicación 20, en el cual la expresión del ácido nucleico en
una planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta
en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.
23. Un método de producción de una planta
transgénica que contiene un ácido nucleico codificante de una
Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP), en el
cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado
una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía y/o
estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la planta, que comprende
- a.
- transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y
- b.
- generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,
en donde la GBSRP se selecciona de
un grupo constituido por GBP-1 como se define en SEQ
ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de
secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su
longitud.
24. El método de la reivindicación 23, en el
cual la GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 11.
25. El método de la reivindicación 23, en el
cual el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en
SEQ ID NO: 6.
26. El método de la reivindicación 23, en el
cual el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos
80-90% de identidad de secuencia con la secuencia
de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6 en toda su región
codificante.
27. El método de la reivindicación 23, en el
cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado
una eficiencia incrementada del uso de agua por la planta en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.
28. El método de la reivindicación 23, en el
cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado
un peso seco incrementado de la planta en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la planta.
29. Un método de modificación de la tolerancia
al estrés de una planta, que comprende modificar la expresión de
una Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP) en la
planta, en el cual la GBSRP se selecciona de un grupo constituido
por GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11 y un
polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el
polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en el cual la
modificación de la expresión de la GBSRP en la planta da como
resultado una tolerancia modificada al estrés por sequía y/o estrés
por helada de la planta en comparación con una variedad de tipo
salvaje de la planta.
30. El método de la reivindicación 29, en el
cual la GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 11.
31. El método de la reivindicación 29, en el
cual el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en
SEQ ID NO: 6.
32. El método de la reivindicación 29, en el
cual el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos
8-90% de identidad de secuencia con la secuencia de
polinucleótidos de SEQ ID NO: 6 en toda su región codificante.
33. El método de la reivindicación 29, en el
cual la tolerancia al estrés se incrementa.
34. El método de la reivindicación 29, en el
cual la planta no es transgénica.
35. El método de la reivindicación 29, en el
cual la planta es transgénica.
36. El método de la reivindicación 35, en el
cual la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión
de la GBSRP.
37. El método de la reivindicación 36, en el
cual el promotor es específico de tejido.
38. El método de la reivindicación 36, en el
cual el promotor está regulado por desarrollo.
39. El método de la reivindicación 29, en el
cual el aumento de la expresión del polipéptido en la planta da
como resultado una eficiencia incrementada de uso del agua por la
planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta.
40. El método de la reivindicación 29, en el
cual el aumento de la expresión del polipéptido en la planta da
como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación
con una variedad de tipo salvaje de la planta.
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