KR100577142B1

KR100577142B1 - 스트레스 저항성 전사인자 유전자, 단백질 및 이에 의해형질전환된 스트레스 저항성 식물체

Info

Publication number: KR100577142B1
Application number: KR1020030028792A
Authority: KR
Inventors: 최도일; 이소영; 정영희; 이상협; 박정미
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2003-05-07
Publication date: 2006-05-08
Also published as: WO2004099415A1; AU2003264962A1; KR20040096006A

Abstract

본 발명은 식물병원체 및 환경스트레스에 의해 발현이 유도되는 EREBP/AP2-type 고추의 전사인자인 CaPF1에 관한 것이다.

본 발명은 CaPF1 전사인자를 암호화 하는 DNA 또는 상기 DNA를 내재하고 있어 식물체에 스트레스 저항성을 부여할 수 있는 식물체 형질전환용 발현벡터, 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물체 세포, 상기 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물체 개체 및 상기 스트레스 저항성 식물체 개체가 생산한 농산물을 제공한다. 또한 본 발명은, 상기 DNA를 식물체에 도입하여 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의하여 각종 생물적 또는 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 가지는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있게 된다.

전사인자, 스트레스, 저항성, 식물, EREBP/AP2

Description

스트레스 저항성 전사인자 유전자, 단백질 및 이에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물체{A New Stress-Resistance Transcription Factor Gene, its Protein and A Transfected Plant by the Gene}

도 1a는 병원성 세균을 접종한 고추 조직에서 질병 저항성에 따른 CaPF1의 발현을 보여주는 RNA gel 블럿 분석결과 사진.

도 1b는 고추에서 CaPF1의 조직특이적 발현을 보여주는 RNA gel blot 사진.

도 2는 DraI, EcoRI, HindIII, 또는 XbaI으로 처리된 고추 총 DNA에 대해 CaPF1 cDNA를 탐침으로 한 게놈 DNA gel 블럿 분석결과 사진.

도 3은 생물적 스트레스에 의한 CaPF1의 발현을 보여주는 RNA gel 블럿 분석결과 사진.

도 4는 식물호르몬 처리 또는 환경 스트레스 처리에 의한 CaPF1의 발현을 보여주는 RNA gel 블럿 분석결과 사진.

도 5는 CaPF1과 식물의 스트레스 저항성 관련 프로모터 서열인 GCC box 또는 CRT/DRE box와의 특이적 상호작용을 보여주는 사진.

도 6a, 6b는 애기장대에서 CaPF1의 과발현에 의한 방어-관련 유전자들의 항시발현을 보여주는 블럿결과 사진.

도 7a, 7b, 7c는 CaPF1이 과발현된 담배에서 방어-관련 유전자들이 항시 발현되고, 식물 병원성 세균에 대한 저항성이 증가된 사실을 보여주는 블럿결과 사진, 개체사진 및 도표.

도 8a, 8b는 CaPF1이 과발현된 애기장대에서 저온 스트레스 및 식물 병원성 세균에 대한 저항성이 증가된 현상을 보여주는 사진 및 도표.

본 발명은 식물병원체 및 환경스트레스에 의해 발현이 유도되는 EREBP/AP2-type 고추의 전사인자인 CaPF1( C apsicum a nnuum Pathogen and Freezing tolerance related gene 1; 고추 병 및 저온 내성 관련 유전자 1)에 관한 것이다.

식물은 생활사 동안 다양한 환경 스트레스를 받게 되고, 이는 올바른 생육에 좋지 않은 영향을 준다. 식물은 변화하는 환경에 대응하기 위해 적극적인 저항성 반응을 유도하는데, 그중 가장 흥미로운 것은 다양한 방어-관련 유전자들의 발현을 유도하는 것이다.

특별히 전사인자들의 발현 변화는 스트레스 상황에 있는 식물에 많은 영향을 주게된다. 애기장대에는 DNA와 상호작용할 수 있는 Domain을 가지는 다양한 종류의 전사인자들이 있다. 이들 중에는 EREBP/AP2, bZIP, Myp, WRKY 그리고 Zinc finger 도메인을 갖는 단백질들이 포함되는데, 이들이 어떤 스트레스 상황에서 발 현이 유도되는가에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다(Rushton et al., 1998; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000). 예를들어 토마토의 에칠렌 반응 인자(ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR)인 Pti4가 과발현된 토마토는 식물의 곰팡이 병원체인 Erysiphe orontii와, 식물의 세균 병원체인 Pseudomonas syringae pv. tomato에 대한 저항성이 증가되었다. Pti4는 프로모터에 GCC box를 갖는 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 가지고 있는 것으로 추정되고 있다(Gu et al., 2002; Wu et al., 2002). 또 다른 예로, 애기장대의 EREBP/AP2 type 전사인자인 CBP1/DREBP1과 DERBP1A를 과발현시킨 애기장대가 건조, 고농도의 염, 저온과 같은 환경 스트레스에 내성을 보인다는 연구결과가 보고되었다(Jaglo-Ottosen et al., 1998). 이들 두 전사인자는 저온 반응에 관여하는 프로모터 서열인 CRT/DRE box와 상호작용하고, target 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다(Kasuga et al., 1999).

담배의 에칠렌 반응 인자 중 하나인 Tsi1은 프로모터 서열인 GCC box와 CRT/DRE box 모두와 상호작용하며, Tsi1 유전자가 과발현된 담배가 병원성 세균 및 고농도의 염에 내성을 나타낸다고 보고되었다. 그러나 Tsi1 유전자가 과발현된 담배에서는 병에 대한 방어-관련 유전자들만 항시 발현되었을 뿐 내염성에 관련된 유전자의 항시 발현은 확인되지 않았다(Park et al., 2001).

식물 호르몬과 같은 조절물질들은 서로 다른 신호전달체계에 관여한다. 살리실산, 에칠렌 그리고 자스몬산은 병원체 침입 후 병 저항성 신호전달 과정 중 이차 신호전달자로 활동하면서 많은 방어-관련 유전자들의 발현을 유도한다(Yang et al. 1997). 건조와 고농도의 염은 다량의 abscisic acid 생성을 유도하며, 외부에 서 처리한 abscisic acid는 건조와 저온 스트레스에 반응하는 여러 유전자들의 발현을 조절한다. 이러한 현상은 생물적 스트레스와 비생물적 스트레스에 관여하는 유전자들의 발현 유형이 서로 다르며, 이는 서로 다른 전사인자와 식물 호르몬의 서로 다른 조절의 결과이다.

최근 연구결과, 생물적 스트레스와 비생물적 스트레스에 관여하는 신호전달 체계가 서로 공유되고 있다는 사실이 제시되고 있다. 첫 번째 증거는, 식물과 병원성 곰팡이 간의 비친화적 상호작용시 유도 발현되는 유전자 집단이 물리적인 상처에 의해 유도 발현되는 유전자 집단과 유사하다는 사실이다(Durrant et al., 2000). 두 번째 증거는, 유전자 칩 분석을 통해 곰팡이 병원균 접종 또는 건조 및 저온 스트레스 처리 후 발현이 유도되는 유전자의 무리가 매우 유사하다는 것이다(Schenk et al., 2000; Seki et al., 2001). 세 번째 증거는, 402개의 애기장대 전사인자로 이루어진 유전자 칩 분석 결과 서로 다른 스트레스 처리로 유도발현되는 유전자의 무리가 명확히 겹친다는 보고이다(Chen et al., 2002). 그러나 서로 다른 스트레스에 대응하는 식물의 저항성 기작이 상호 겹친다는 많은 연구에도 불구하고, 이에 관련된 분자생불학적 기작은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 식물의 생물적, 비생물적 스트레스 방어기작에 관련된 혹은 둘의 상호작용에 관련된 연구는 식물의 방어기작을 이해하는데 있어서 꼭 필요하다.

본 발명은, 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 새로운 전사인자 유전자 및 그 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 새로운 전사인자 유전자로 형질전환된 스트레스 저항성 식물체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은, 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 새로운 전사인자 유전자로 식물체를 형질전환시켜 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 고추 cDNA 라이브러리 (http://plant.pdrc.re.kr 참조)에서 추정적(putative) EREBP/AP2 type 전사인자 단백질을 암호화하는 신규의 유전자 CaPF1( C apsicum a nnuum Pathogen and Freezing tolerance related protein 1)을 분리하고 그 특성을 밝힌 사실에 기초한다.

본 발명은, EREBP/AP2 도메인을 가지는 식물체 스트레스 저항성 유도 전사인자인 CaPF1을 암호화하는 DNA 또는 상기 DNA와 혼성화할 수 있는 DNA에 관한 것이다.

이때 상기 DNA는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 CaPF1 유전자 DNA일 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 DNA는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA일 수 있다.

본 발명에서 상기 스트레스는 바이러스성, 세균성, 진균성 병원균과 같은 생물적(biotic) 스트레스나, 창상, 추위, 화학물질 등과 같은 비생물적(abiotic) 스 트레스를 모두 포함하는 개념이다.

또한 본 발명은 상기 각종의 DNA에 의해 암호화되는 식물체 스트레스 저항성 유도 전사인자 단백질에 관한 것이다. 예를들면 이들 전사인자 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.

또한 본 발명은 상기 DNA를 내재하고 있어 식물체에 스트레스 저항성을 부여할 수 있는 식물체 형질전환용 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 식물체 세포 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물체 개체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 스트레스 저항성 식물체 개체가 생산한 농산물(예를 들면, 과일, 채소, 종자, 목재 등)에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 각종의 DNA를 식물체에 도입하여 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 방법과, 상기 각종의 병원균-반응성 전사인자 단백질의 발현을 변화시켜 식물체의 병저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 기술적 사상 및 본 발명의 기초가 되는 발견들에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에 의하면, CaPF1 유전자의 전사체는 숙주-비양립성(host-incompatible) 및 비숙주-비양립성(nonhost-incompatible) 병원균에 감염된 조직들에서뿐만 아니라, 에테폰(ethephon) 또는 자스몬산(jasmonic acid; JA)으로 처리된 잎에서도 유도되는 것으로 밝혀졌다.

CaPF1의 과발현은 세균성 병원균에 대한 저항성을 나타내며, PR― 또는 환경 스트레스 방어관련―유전자들의 발현을 항시적으로 유도한다. 따라서 CaPF1로 형질전환된 식물체는 세균성 병원균 감염이나 저온 스트레스에 대하여 강한 저항성을 나타내었다.

EREBP/AP2 유형인 CaPF1 전사인자가 병원균의 감염, 에테폰 처리 또는 저온 처리에 의해 우선적으로 유도되므로, CaPF1 유전자가 생물적 혹은 비생물적 스트레스 방어 반응의 신호 전달 경로에 공히 관계된다는 사실을 추측케 한다.

이하 CaPF1의 각종 특성과 관련하여 상세히 설명한다.

CaPF1은 고추에서 과민감 반응시 발현이 유도된다

과만감 반응 특이적 발현 유형을 보이는 유전자를 선별하기 위해 콩 불마름병 세균이 접종된 고추의 mRNA를 이용해 differential display 수행중 CaPF1이 선별되었다.

RNA 젤 블럿의 분석을 이용해 비숙주 비양립성(고추와 콩 불마름병균 상호작용), 또는 숙주 비양립성(고추와 고추 세균성 점무늬병균 상호작용) 상황에서 공통적으로 CaPF1의 발현이 유도되는 것으로 보아 CaPF1 유전자는 고추에서 세균에 의해 유도되는 과민감반응 유도부위에 특이적으로 유도발현 되는 사실을 알 수 있다.

담배 및 애기장대에서 CaPF1의 과발현은 방어관련 유전자의 활성화를 유도한다

스트레스 방어작용에서 CaPF1의 기능을 분석하기 위해 CaPF1이 과발현되는 애기장대와 담배를 제조하였다. 두 서로 다른 종의 식물에서 공통적으로 방어관련 유전자가 활성화되었다. 생물적 스트레스 관련 방어유전자로 PR2, PDF1.2 그리고 GST1(애기장대, 담배) 유전자가 항시 발현되었고, 저온 트레스 관련 방어유전자로 COR47, COR6.6, 그리고, COR78(애기장대)이 항시 발현되었다.

담배 및 애기장대에서 CaPF1의 과발현은 세균성 병원균에 대한 저항성을 유도한다

본 발명에서는, 담배 및 애기장대에서 CaPF1 유전자의 발현을 통해 방어기작에서 CaPF1의 기능을 밝혔다.

CaPF1이 과발현된 애기장대의 경우 토마토의 세균병인 DC3000에 대한 저항성이 증가되었으며, CaPF1이 과발현된 담배의 경우 담배 세균성 불마름병균에 대한 저항성이 증가되었다. 이러한 현상은 CaPF1의 과발현에 의해 유도된 PR- 또는 방어-관련 유전자의 증가된 발현에 의한 것으로 추정되며, CaPF1 유전자가 세균에 대한 저항성 발생 경로에서의 커뮤니케이션에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.

애기장대에서 CaPF1의 과발현은 저온 스트레스에 대한 저항성을 유도한다

저온 내성 여부를 실험하기 위해 CaPF1이 형질전환된, 혹은 형질전환되지 않은 애기장대를 25℃에서 3주 키운 뒤 -5℃에서 24h 방치한 한 다음, 동사한 개체 수 측정했다. 형질전환되지 않은 애기장대는 90% 이상 동사했으며, CaPF1이 형질전환된 애기장대는 70%이상이 살아남았다.

이러한 사실로부터 CaPF1이 과발현된 애기장대의 경우 저온에 대한 내성이 증가됨을 알 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시적인 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.

실시예 1 : CaPF1 유전자의 분리 분석

식물의 스트레스 저항반응에서의 조절기작을 이해하기 위하여 고추 식물체로부터 CaPF1 유전자를 분리하고 그 특성을 분석하였다.

27±2℃, 16시간 명―8시간 암 조건에서 재배된 발아 8주령의 고추 식물체(Capsicum annunm cv. Bugang)를 모델시스템으로 이용하였다.

(1) 8주된 고추에 콩 불마름병균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra ; Xag 8ra) 배양 혼탁액(1X108cfu/ml)과, 대조구로 1 mM MgCl2를 접종(syringe-infiltration)하고 소정의 시간마다 각 개체로부터 mRNA를 분리하여 세균병에 의해 유도되는 cDNA 라이브러리를 제작하였다. mRNA differential display에서 선별한 CaPF1 DNA조각을 탐침으로 이용해 full sequence를 갖는 클론을 분리했다.

통상의 방법에 따라 상기 CaPF1 유전자 cDNA의 서열을 분석하였다(서열번호 1). 분석결과, CaPF1 유전자는 1.4kb의 핵산서열로 이루어져 있으며, 계산상 분자량이 41 KD인, 369개 아미노산 잔기로 이루어진 추정 아미노산 서열(서열 2)을 암호화하는 하나의 ORF(open reading frame)를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.

추정 아미노산 서열을 기초로 한 단백질 구조분석결과, CaPF1 단백질은 57개의 아미노산 서열로 이루어진 EREBP/AP2 DNA 결합 도메인과 핵으로 이동신호를 하는 짧은 염기성 잔기(basic residue) 및 산성 잔기들이 모여있는 도메인으로 구성되어 있었다. EREBP/AP2 도메인을 갖는 유전자 집단 중 아미노산 서열에서 가장 상동성을 보이는 것은 카드뮴에 의해 발현이 유도되는 것으로 알려진 애기장대의 AS30 유전자이다.

(2) 전술한 (1)의 방법에 따라 소정 시간마다 CaPF1의 발현을 확인할 수 있도록 통상의 방법에 따라 RNA gel 블럿을 수행하였다(도 1A). 분석결과 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 병원균이 접종된 경우, 시간이 경과함에 따라 CaPF1 유전자와 저항성 관련 유전자인 PR-4의 발현이 증폭되는 현상을 확인할 수 있었다.

(3) 여러 조직에서 CaPF1 전사체의 전사 특이성을 조사하였다.

접종 18시간 경과 후, RNA 겔 블럿 분석을 위하여 종래 방법(Choi et al., 1996)에 따라, 감염된 고추 식물체의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 과실 조직 등 8개의 조직에서 총 RNA를 분리하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA 20㎍을 포름알데하이드가 함유된 아가로스 겔 전기영동 방법(Sambrook et al., 2001)으로 분획하고, 나일론 멤브레인(Amersham, USA)으로 옮겼다. 분리된 RNA들을 블럿팅하였고, 블럿을 ³²P-표지된 전체 CaPF1 cDNA와 혼성화시켰다(도 1B).

도에서 볼 수 있는 바와 같이, CaPF1 유전자에 대응하는 전사체는 꽃, 줄기, 발아한 종자에서 많이 발견하게 되었으나, 외부 스트레스 처리가 없는 잎 조직에서는 거의 발견되지 않았다. 보통 EREBP/AP2 유형의 전사인자들은 뿌리에서 발현량이 많은 것으로 알려져 있는데, CaPF1의 경우 뿌리에서의 발현 량이 매우 적었다.

이상의 사실로부터 CaPF1 유전자는 조직 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.

(3) 게놈 DNA gel blot 분석으로 고추 게놈 내에서 CaPF1의 카피수를 조사했다.

알려진 방법(Lee et al., 2002)에 따라, 고추 잎에서 게놈 DNA를 분리하였다. 20㎍ 게놈 DNA를 EcoRI, HindIII, XbaI 및 DraI로 충분히 처리하였다. 처리된 게놈 DNA를 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분리한 다음, 변성시키고 나일론 멤브레인(Amersham, USA) 상으로 블럿시켰다. ³²P-dCTP로 표지된 CaPF1의 전체 cDNA 및 3'말단 부위의 유전자 특이적 서열 부분을 탐침자로 이용하여, 종래 방법(Church and Gilbert 1984)에 따라 서던 브롯팅을 수행하였다(도 2). 도에서 D, E, H 및 X는 각각 DraI, EcoRI, HindIII 및 XbaI로 처리된 실험구를 의미한다.

도에서 볼 수 있듯이, 전체 cDNA를 이용한 분석에서는 5개의 밴드가, 3'말단 부위의 유전자 특이적 서열을 이용한 분석에서는 하나의 밴드가 관찰되었다. 위 분석결과로 미루어 보아 고추 게놈에는 EREBP/AP2 유형의 유전자가 여러 개 존재하고, CaPF1 유전자는 하나만 존재한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2 : 생물적 스트레스에 의한 CaPF1 유전자의 발현 분석

전기 실시예 1에서, 콩에 불마름병을 유발하면서 고추에는 비기주저항성을 유발하여 과민감 반응을 일으키는 콩의 불마름병균(X. axonopodis 8ra)을 접종했을 때, 고추에서 CaPF1 유전자의 발현이 유도됨을 확인하였다. 이러한 과민감반응 특이적 발현을 재확인하기 위해, (1X10⁸cfu/ml)농도로 고추의 세균성 점무늬병균 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria race 3(Xcv race3)을 로 민감성 고추 품종인 ECW (bs2/bs2) 및 저항성 품종인 ECW-20R (BS2/BS2)의 잎에 접종하여 과민감반응을 유도하였다. 상기 병원균은 avrBS2 유전자를 발현한다. 접종 후 다양한 시간대 별로 총 RNA를 추출하고 노던 블럿을 통해 CaPF1 유전자의 발현을 분석하였다(도 3).

도에서도 볼 수 있듯이, 민감성 품종의 식물체(cv. ECW)에서는 36시간 경과 후 아무런 가시적 반응이 나타나지 않았지만, 저항성 고추 품종(cv. ECW-20R)에서는 24시간 이내에 CaPF1 유전자와 PR-4 유전자가 다량 전사되고, 과민감반응도 유도되었다.

실시예 3 : 다양한 비생물적 스트레스에 의한 CaPF1 유전자의 발현 분석

식물체가 비생물적(abiotic) 스트레스를 받을 때 CaPF1의 발현이 유도되는지를 확인하였다(도 4).

(1) 에칠렌, 살리실산, 자스몬산 등은 식물의 방어기작에관련된 신호전달체계에서 중요한 역할을 하는 호르몬으로 많은 연구가 되어있다. 위 호르몬들을 고추 잎에 분무한 후 CaPF1 유전자의 유도 발현 여부를 조사하였다. CaPF1 유전자는 에칠렌과 자스몬산에의 처리 30분만에 발현이 유도되었으나 SA에 의해서는 발현이 유도되지 않았다(도 4에서 A 참조).

(2) 고추에 대표적인 환경스트레스인 건조(0.4 M 만니톨 처리), 저온(4℃), 고농도의 염(0.4 M) 처리를 수행하여 CaPF1 유전자의 유도 발현 여부를 조사하였다. 처리한 모든 스트레스에 발현이 유도되었으나, 특별히 저온 스트레스 처리에 빠르고 강하게 유도 발현되었다(도 4에서 B 참조).

실시예 4 : CaPF1 전사인자와 프로모터 서열 GCC box 또는 CRT/DRE box와의 특이적인 상호작용 여부 분석

EREBP/AP2 유형의 전사인자들이 특이적으로 상호 작용하는 프로모터 서열은 이미 보고된 바 있다. 전사인자인 CaPF1 단백질도 방어관련 유전자의 프로모터 서열인 GCC box 또는 CRT/DRE box와 특이적인 상호작용을 하는지 여부를 확인하였다.

이미 알려진 단백질 생산방법에 따라, CaPF1 유전자 말토스 결합 단백질(MBP) 유전자와 융합(MBP:CaPF1)시킨 뒤 대장균 내에서 발현시키고, 이를 순수 분리하여 gel retardation assay에 사용하였다. GCC box의 염기서열과 CRT/DRE box의 염기서열은 인공 합성하여 사용하였다(도 5).

실험 결과, 도 5에서도 볼 수 있는 바와 같이, CaPF1 단백질은 GCC box, CRT/DRE box와 공통적으로 상호작용 함을 알 수 있다. 종래 EREBP/AP2 유형의 단백질이 GCC box 또는 CRT/DRE box 둘 중 하나의 서열과 특이적인 상호작용을 하는 것에 비하여, 이러한 특성은 CaPF1 고유의 성질인 것으로 파악된다.

실시예 5 : 애기장대와 담배에 CaPF1 과발현 효과 1 - 방어관련유전자와 저온반응 유전자들의 항시발현

CaPF1의 과발현과 방어관련유전자(PR gene) 및 저온반응 유전자(COR gene)와의 관련성을 분석하였다.

35S 프로모터를 갖는 pMBP1 벡터에 CaPF1 cDNA를 클로닝 하여 애기장대에 과발현시킨 후, 형질전환 제2 세대의 식물로부터 RNA를 분리하여 RNA gel blot 분석에 사용하였다. 이때 PR2, PDF1.2, 등 프로모터에 GCC box를 갖는 PR gene들과, COR47, COR6.6, COR78 등 프로모터에 CRT/DRE box를 갖는 COR gene들을 탐침으로 이용하였다.

이러한 유전자 탐침들은 모두 외부 스트레스 처리 없이도 형질 전환된 애기장대에서 항시 발현되며, 고추와 같은 가지과 식물인 담배 형질전환체의 경우에도 외부스트레스 없이도 방어관련유전자(PR2, 3, 4, 5 gene)들이 항시 발현되며, 애기장대에서도 동일한 결과를 나타내었다(도 6A, 6B). 도에서 control은 빈 벡터만 형질전환시킨 negative control이고, line3, 8 및 22는 CaPF1을 형질전환시킨 제2 세대(따라서 CaPF1이 과발현된 애기장대)들 중 병과 저온 스트레스에 대한 내성이 상대적으로 우수한 개체를 의미한다.

위와 같은 결과는 전기 실시에 4에서 밝힌 특정 프로모터 서열(GCC box, CRT/DRE box)과 CaPF1단백질과의 상호작용이 생체 내(in vivo)에서도 동일하게 일어남을 확인하는 것이다.

실시예 6 : 애기장대와 담배에 CaPF1 과발현 효과 2 - 식물 병원성 세균 감염 및 저온 처리에 내성 증가

여러 가지 방어관련유전자가 항시 발현되는 CaPF1 과발현 형질전환체들(애기장대, 담배)이 보통의 식물과 비교해서 스트레스 내성이 증가 되었는지 여부를 분석하였다

(1) 담배의 병원성 세균에 대한 저항성 증가

담배 식물체에 세균성 점무늬병원균을 접종하고 그 결과를 분석하였다(도 7A, 7B, 7C). 도에서 c는 대조구(비형질전환체)를, 나머지 숫자는 형질전환된 클론의 종류를 의미한다.

도에서 볼 수 있듯이, 비형질전환체(대조구; c)에 비해 본 발명에 의한 CaPF1 유전자로 형질전환된 식물체의 경우 CaPF1 및 저항성 관련 유전자들의 전사가 크게 증가하였으며(도 7A), 육안관찰에 의하더라도 병증이 거의 나타나지 않았다(도 7B). 접종시간 경과에 따라서도 대조구에 비해 형질전환 식물체의 잎에서 병원균체 수가 매우 적게 나타났다(도 7C). 예를들면, 담배 식물체의 경우 비형질 전환체에 비해 조직내 살아있는 병원균 수가 100배 이상 감소되었다.

이러한 사실은 CaPF1 전사인자의 과발현으로 담배 식물체가 세균병에 내성을 가지게 됨을 의미하는 것이다.

(2) 애기장대의 저온 스트레스 및 병원성 세균에 대한 저항성 증가

CaPF1이 과발현된 애기장대를 24시간동안 -5℃에서 방치한뒤 살아남는 개체수를 측정한 결과 비형질전환체는 90%이상이 동사했고, 형질전환체는 70%이상의 개체가 살아남았다(도 8A). 도에서 Col-0는 대조구(비형질전환체)를 의미한다.

또한 병원균 스트레스로서, 애기장대 식물체에 토마토의 병원성 세균인 DC3000을 접종하고 그 결과를 분석하였다(도 8B).

도에서 볼 수 있듯이, 비형질전환체(대조구; c)에 비해 본 발명에 의한 CaPF1 유전자로 형질전환된 식물체의 경우 육안관찰에 의하더라도 병증이 거의 나타나지 않았으며, 접종시간 경과에 따라서도 대조구에 비해 형질전환 식물체의 잎에서 병원균체 수가 매우 적게 나타났다. 예를들면, 형질전환된 애기장대의 경우 비형질전환체에 비해 조직내 살아있는 병원균 수가 10-100배 감소되었다.

이러한 사실은 CaPF1 전사인자의 과발현으로 애기장대 식물체가 세균병에 내성을 가지게 됨을 의미하는 것이다.

본 발명에 의하여 각종 식물병원 세균 및 저온 스트레스에 대한 저항성을 모두 가질 수 있는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있게 된다.

본 발명에서 이용되는 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 새로운 전사인자 유전자 및 그 단백질은 역사적으로 오랫동안 이용되어 왔던 작물인 고추에서 유래된 것이므로, 이를 이용하여 보다 안전한 형질전환 식물체 및 농산물을 얻을 수 있게 된다.

또한 본 발명에 의해 식물체에서 외부 스트레스에 대한 저항 메카니즘이 규명되었기 때문에, 이후 관련 분야의 연구 및 기술개발에 기초를 제공할 수 있게 된다.

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Claims

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는, 식물 스트레스 저항성 유도 전사인자 CaPF1 유전자.
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제 1 항에 있어서,

상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는 CaPF1 유전자.
제 1 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 스트레스는 바이러스성, 세균성, 진균성 병원균이거나, 비생물적 스트레스인 것을 특징으로 하는 CaPF1 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물체 스트레스 저항성 유도 전사인자 CaPF1 단백질.
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제 1 항 또는 제 5 항에 의한 CaPF1 유전자를 내재하고 있는 식물체 스트레스 저항성 부여를 위한 형질전환용 발현벡터.
제 10 항에 의한 형질전환용 발현벡터가 도입된 식물체 세포.
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제 1 항 또는 제 5 항에 의한 CaPF1 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 스트레스 저항성을 부여하는 방법.
제 7 항에 의한 식물체 스트레스 저항성 유도 전사인자 CaPF1 단백질의 발현을 변화시켜 식물체의 스트레스 저항성을 조절하는 방법.