ES2272461T3 - Proteinas proteina-quinasa relacionadas con el estres y metodos de utilizacion en las plantas. - Google Patents
Proteinas proteina-quinasa relacionadas con el estres y metodos de utilizacion en las plantas. Download PDFInfo
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Abstract
¿ Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Proteí- na¿Quinasa Relacionada con el Estrés (PKSRP), en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un poli- péptido como se define en SEQ ID NO: 27 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO: 27 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía en compara- ción con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.
Description
Proteínas proteína-quinasa
relacionadas con el estrés y métodos de utilización en las
plantas.
Esta solicitud reivindica el beneficio de
prioridad de la Solicitud Provisional U.S No. de Serie 60/196.001
presentada el 7 de abril de 2.000.
Esta invención se refiere en general a
secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están
asociadas con respuestas al estrés abiótico y la tolerancia al
estrés abiótico en las plantas. En particular, esta invención se
refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que
confieren tolerancia a la sequía a las plantas.
Los estados de estrés ambiental abiótico, tales
como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor y
estrés por frío, son factores limitantes importantes del crecimiento
y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y las
pérdidas de rendimiento de cosecha en cosechas importantes tales
como arroz, maíz dulce (cereal) y trigo causadas por estos estados
de estrés representan un factor económico y político importante y
contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países
subdesarrollados.
Las plantas se ven expuestas típicamente durante
su ciclo vital a condiciones de contenido de agua ambiental
reducido. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias
para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación.
No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía
son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el
crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha
son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cosecha
son muy sensibles a concentraciones más altas de sal en el suelo. La
exposición continua a sequía y contenido elevado de sal causan
alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos
grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente a la muerte
celular y por consiguiente a pérdidas de rendimiento.
El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es
una estrategia que tiene el potencial de resolver o mediar al menos
algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias
tradicionales de reproducción de las plantas para desarrollar nuevas
líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos
de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes
específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos
limitados de germoplasma para tolerancia al estrés e
incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas
remotamente emparentadas representan problemas importantes
encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los
procesos celulares que conducen a la tolerancia a la sequía, el frío
y la sal en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la sal son de
naturaleza compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación
celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza
multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo
ha hecho infructuosa en gran parte la reproducción orientada a la
tolerancia, sino que ha limitado también la posibilidad de modificar
por bioingeniería plantas tolerantes al estrés utilizando métodos
biotecnológicos.
Los estados de estrés por sequía, frío y sal
tienen un tema común importante para el crecimiento de las plantas,
que es la disponibilidad de agua. Las plantas se ven expuestas
durante todo su ciclo vital a condiciones de contenido de agua
reducido en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han
desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas
condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración
de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos
sobre el desarrollo de las plantas, el crecimiento y el rendimiento
de la mayoría de las plantas son profundos. Dado que un contenido
elevado de sal en algunos suelos da como resultado menos agua
disponible para consumo por las células, su efecto es similar a los
observados en condiciones de sequía. Adicionalmente, a temperaturas
de helada, las células vegetales pierden agua como resultado de la
formación de hielo que comienza en el apoplasto y sustrae agua del
simplasto. Por regla general, los mecanismos de respuesta molecular
de la planta a cada una de estas condiciones de estrés son comunes,
y las proteína-quinasas juegan un papel esencial en
estos mecanismos moleculares.
Las proteína-quinasas
representan una super-familia y los miembros de esta
familia catalizan la transferencia reversible de un grupo fosfato
del ATP a las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina
y tirosina en las proteínas diana. Las
proteína-quinasas son elementos primarios en los
procesos de señalización de las plantas y se ha comunicado que
desempeñan papeles cruciales en la percepción y transducción de
señales que permiten que una célula (y la planta) responda a
estímulos ambientales. En particular, las
proteína-quinasas receptoras (RPKs) representan un
grupo de proteína-quinasas que activan un sistema
complejo de caminos de señalización intracelulares en respuesta al
ambiente extracelular (Van der Gear et al., 1994 Annu. Rev.
Cell Biol. 10: 251-337). Las RPKs son proteínas
transmembranales de un solo paso que contienen una secuencia señal
amino-terminal, dominios extracelulares singulares
para cada receptor, y un dominio citoplásmico de quinasa. La
fijación de ligandos induce la homo- o
hetero-dimerización de las RPKs, y la proximidad
estrecha resultante de los dominios citoplásmicos da como resultado
la activación de las quinasas por transfosforilación. Aunque las
plantas tienen muchas proteínas similares a RPKs, no se ha
identificado ligando alguno para estas quinasas semejantes a
receptores (RLKs). La mayoría de las RLKs de las plantas que se han
identificado pertenecen a la familia de las serina/treonina
(Ser/Thr)-quinasas, y la mayor parte de ellas tienen
repeticiones extracelulares ricas en leucina (Becraft, PW. 1998,
Trends Plant Sci. 3: 384-388).
Otro tipo de proteína-quinasa es
la proteína-quinasa dependiente de Ca+ (CDPK). Este
tipo de quinasa tiene un dominio semejante a calmodulina en el
término COOH, que permite la respuesta a señales de Ca+ directamente
sin que esté presente calmodulina. Normalmente, las CDPKs son las
proteína-quinasas Ser/Thr más predominantes
encontradas en las plantas superiores. Aunque sus papeles
fisiológicos siguen sin estar claros, las mismas son inducidas por
frío, sequía y ácido abscísico (ABA) (Knight et al., 1991
Nature 352:524; Schroeder, JI y Thuleau, P., 1991 Plant Cell 3: 555;
Bush, D.S., 1995 Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 46: 95;
Urao, T. et al., 1994 Mol. Gen. Genet. 244: 331).
Otro tipo de mecanismo de señalización implica
miembros de la familia de las proteína-quinasas SNF1
serina/treonina conservadas. Estas quinasas juegan papeles
esenciales en la señalización de glucosa y estrés de los eucariotas.
Las quinasas semejantes a SNF1 de las plantas participan en el
control de enzimas metabólicas fundamentales, que incluyen HMGR,
nitrato-reductasa, sacarosa-sintasa,
y sacarosa-fosfato-sintasa (SPS).
Datos genéticos y bioquímicos indican que la regulación dependiente
del azúcar de las quinasas SMF1 implica varios otros componentes
sensoriales y de señalización en levaduras, plantas y animales.
Adicionalmente, miembros de la familia de las
Proteína-Quinasas Activadas por Mitógenos (MAPK) han
sido implicados en las acciones de numerosos estados de estrés
ambiental en animales, levaduras y plantas. Se ha demostrado que
tanto los niveles de actividad de las quinasas semejantes a MAPK y
de mRNA de los componentes de las cascadas de MAPK aumentan en
respuesta al estrés ambiental y a la transducción de señales
hormonales de las plantas. Las quinasas MAP son componentes de
cascadas secuenciales de quinasas, que son activadas por
fosforilación de residuos treonina y tirosina por quinasas
intermedias de tipo MAP-quinasa situadas aguas
arriba (MAPKKs). Las MAPKKs son activadas en sí mismas por
fosforilación de residuos serina y treonina por quinasas situadas
aguas arriba (MAPKKKs). Cierto número de genes de
MAP-quinasa han sido consignados en plantas
superiores.
Esta invención satisface en parte la necesidad
de identificar nuevas proteína-quinasas singulares
capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por
sobre-expresión. La presente invención proporciona
una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico
codificante de una Proteína de Tipo
Proteína-Quinasa Relacionada con el
Estrés (PKSRP), en donde la expresión de la secuencia de
ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una
tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la célula vegetal. A saber, en esta
memoria se describe la proteína-quinasa Ser/Thr
PK-6 de Physcomitrella patens.
La invención estipula en algunas realizaciones
que la PKSRP y el ácido nucleico codificante son los encontrados en
miembros del género Physcomitrella. En otra realización
preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una
Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés
ambiental es sequía.
La invención proporciona adicionalmente una
semilla producida por una planta transgénica transformada por un
ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la planta es mejora
genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental
en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La
invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una
planta transgénica que expresa una PKSRP, en donde la planta es
mejora genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés
ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta.
La invención proporciona adicionalmente un
producto agrícola producido por cualquiera de las plantas, partes de
plantas o semillas transgénicas descritas más adelante. La invención
proporciona adicionalmente una PKSRP aislada como se describe más
adelante. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico
codificante de PKSRP aislado, en donde el ácido nucleico codificante
de PKSRP codifica una PKSRP como se describe más adelante.
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido
nucleico codificante de PKSRP como se describe más adelante, en
donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como
resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula
hospedadora. La invención proporciona adicionalmente una célula
hospedadora que contiene el vector y una planta que contiene la
célula hospedadora.
La invención proporciona adicionalmente un
método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico
codificante de PKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la
planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés
ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un
vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de
PKSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta
transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. En
realizaciones preferidas, la PKSRP y el ácido nucleico codificante
de PKSRP son como se describe más adelante.
La presente invención proporciona también
métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que
comprenden, modificar la expresión de un ácido nucleico de PKSRP en
la planta, en donde la PKSRP es como se describe más adelante. La
invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que
la tolerancia al estrés se aumente o se reduzca. La tolerancia al
estrés por sequía se incrementa en una planta por la vía del
incremento de la expresión de un ácido nucleico de PKSRP.
Las Figuras 1(A-M)
muestran las secuencias parciales de cDNA de PK-6
(SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2),
PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID
NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2
(SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7),
MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID
NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5
(SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12) y
CPK-2 (SEQ ID NO: 13) de Physcomitrella
patens.
Las Figuras 2(A-M)
muestran las secuencias de longitud total de cDNA de
PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID
NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9
(SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18),
CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID
NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21),
MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID
NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24),
CPK-1 (SEQ ID NO: 25) y CPK-2 (SEQ
ID NO: 26) de Physcomitrella patens.
Las Figuras 3(A-M)
muestran las secuencias de aminoácidos deducidas de
PK-6 (SEQ ID NO: 27), PK-7 (SEQ ID
NO: 28), PK-8 (SEQ ID NO: 29), PK-9
(SEQ ID NO: 30), CK-1 (SEQ ID NO: 31),
CK-2 (SEQ ID NO: 32), CK-3 (SEQ ID
NO: 33), MPK-2 (SEQ ID NO: 34),
MPK-3 (SEQ ID NO: 35), MPK-4 (SEQ ID
NO: 36), MPK-5 (SEQ ID NO: 37),
CPK-1 (SEQ ID NO: 38 y CPK-2 (SEQ ID
NO: 39) de Physcomitrella patens.
La Figura 4 muestra un diagrama del vector de
expresión de plantas pBPSSC022 que contiene el
super-promotor que dirige la expresión de SEQ ID
NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26 ("Desired
Gene"). Los componentes son: gen NPTII de resistencia a la
kanamicina (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26:
8711-21, 1984), promotor AtAct2-i
(An YQ et al., Plant J. 10: 107-121, 1996),
terminador OCS3 (During K, Transgenic Res. 3:
138-140, 1994), terminador NOSpA (Jefferson et
al., EMBO J 6: 3901-7, 1987).
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpPK-6 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpPK-7 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpPK-7 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpPK-9 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpPK-9 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCK-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCK-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCK-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCK-3 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 14 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpMPK-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 15 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpMPK-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 16 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpMPK-3 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 17 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por helada con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpMPK-3 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 18 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpMPK-4 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 19 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCK-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 20 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCPK-1 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo
de estrés por sequía con plantas transgénicas que
sobre-expresan PpCPK-2 y líneas de
tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben
un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes
individuales.
La presente invención puede comprenderse más
fácilmente por referencia a la descripción detallada que sigue de
las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos
incluidos en esta memoria. Debe entenderse que la terminología
utilizada en esta memoria tiene por objeto únicamente la descripción
de realizaciones específicas y no pretende ser limitante. En
particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como
"Proteínas Proteína-Quinasa Relacionadas con el
Estrés" (PKSRPs) no limita en modo alguno la funcionalidad de
dichas secuencias.
La presente invención proporciona una célula de
planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de
PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la
célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada al
estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de
la célula de la planta. La invención proporciona adicionalmente
partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen
las células vegetales descritas en esta memoria. Se proporciona
también una semilla de planta producida por una planta transgénica
transformada por un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la
semilla contiene el ácido nucleico codificante de PKSRP, y en donde
la planta es mejora genética auténtica para tolerancia incrementada
al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla
producida por una planta transgénica que expresa una PKSRP, en donde
la semilla contiene la PKSRP, y en donde la planta es mejora
genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental
en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La
invención proporciona también un producto agrícola producido por
cualquiera de las plantas, partes de plantas y semillas de plantas
transgénicas descritas más adelante. Con relación a la invención,
PKSRP es la proteína-quinasa 6
(PK-6).
Como se utiliza en esta memoria, el término
"variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una
especie que comparten caracteres constantes que las separan de la
forma típica y de otras posibles variedades en dicha especie. Si
bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza
también por cierta variación entre individuos dentro de la variedad,
basada fundamentalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre
la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad se considera
"mejora genética auténtica" para un rasgo particular sí la
misma es genéticamente homocigótica para dicho rasgo en tal grado
que, cuando la variedad de mejora genética auténtica se
auto-poliniza, no se observa una cantidad importante
de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la
presente invención, el rasgo procede de la expresión transgénica de
una o más secuencias de DNA introducidas en una variedad de
planta.
La presente invención describe por primera vez
que la PKSRP de Physcomitrella patens es útil para aumentar
la tolerancia de una planta al estrés ambiental. De acuerdo con
ello, la presente invención proporciona la PKSRP
PK-6 aislada. En una realización preferida, la PKSRP
se selecciona de la proteína
Proteína-Quinasa-6
(PK-6) como se define en SEQ ID NO: 27. A
continuación se definen homólogos y ortólogos de las secuencias de
aminoácidos.
Las PKSRPs de la presente invención se producen
con preferencia por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una
molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a
clonación en un vector de expresión (como se describe más adelante),
se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como
se describe más adelante) y se expresa la PKSRP en la célula
hospedadora. La PKSRP puede aislarse luego de las células por un
esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de
purificación de proteínas. Alternativamente a la expresión
recombinante, un polipéptido o péptido PKSRP puede sintetizarse
químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos.
Además, la PKSRP nativa puede aislarse de las células (v.g.,
Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo
anti-PKSRP, que puede producirse por técnicas
estándar utilizando una PKSRP o fragmento de la misma.
La invención proporciona adicionalmente un ácido
nucleico codificante de PKSRP aislado. La presente invención incluye
ácidos nucleicos codificantes de PKSRP que codifican PKSRPs como se
describe en esta memoria. En realizaciones preferidas, el ácido
nucleico codificante de PKSRPs se selecciona de ácido nucleico de
Proteína Quinasa-6 (PK-6) como se
define en SEQ ID NO: 14. Homólogos y ortólogos de las secuencias de
nucleótidos se definen más adelante. En una realización preferida,
el ácido nucleico y la proteína se aíslan del género de plantas
Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido
nucleico y la proteína son de una planta Physcomitrella
patens (P. patens).
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"estrés ambiental" hace referencia a cualquier condición de
crecimiento sub-óptima e incluye, pero sin carácter limitante,
condiciones sub-óptimas asociadas con estados de estrés por
salinidad, sequía, temperatura, metales, productos químicos,
patógenos y oxidantes, o combinaciones de los mismos. La invención
estipula que el estrés ambiental es sequía y, en particular, puede
ser contenido de agua bajo. Debe entenderse también que tal como se
utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones,
"un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del
contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a
"una célula" puede significar que puede utilizarse al menos una
célula.
Tal como se utilizan también en esta memoria,
debe entenderse que los términos "ácido nucleico" y "molécula
de ácido nucleico" incluyen moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA
genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA
generados utilizando análogos de nucleótidos. Este término abarca
también secuencias no traducidas localizadas en ambos extremos 3' y
5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000
nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región
codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la
secuencia aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del
gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o
bicatenaria, pero con preferencia es DNA bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es
una que está separada sustancialmente de otras moléculas de ácido
nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido
nucleico. Con preferencia, un ácido nucleico "aislado" está
exento de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente el
ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5'
y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se
deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la
molécula de ácido nucleico de PKSRP aislada puede contener menos de
aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1kb, 0,5 kb o 0,1 kb de
secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de
ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que se deriva
el ácido nucleico (v.g., una célula de Physcomitrella
patens). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada",
tal como una molécula de cDNA, puede estar exenta de algo del
material celular restante con el que está asociada naturalmente, o
medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o
precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza
químicamente.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención, v.g. una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14, o una porción de la
misma, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología
molecular y la información de secuencias proporcionada en esta
memoria. Por ejemplo, un cDNA de PKSRP de P. patens puede
aislarse a partir de una genoteca de P. patens utilizando la
totalidad o una porción de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. Además, una molécula de ácido
nucleico que abarca la totalidad o una porción de una de las
secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13
puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando
iniciadores oligonucleotídicos diseñados sobre la base de esta
secuencia. Por ejemplo, puede aislarse mRNA a partir de células
vegetales (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato
de guanidinio de Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18:
5294-5299) y puede prepararse cDNA utilizando
transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa de MLV Moloney,
disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de
AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
Pueden diseñarse iniciadores de oligonucleótidos sintéticos para
amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa basándose
en una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. Una molécula de ácido
nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o,
alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores
oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de
amplificación por PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada
puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis
de secuencias de DNA. Adicionalmente, pueden prepararse
oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de
PKSRP por técnicas estándar de síntesis, v.g., utilizando un
sintetizador automático de DNA.
Una molécula de ácido nucleico aislada de la
invención comprende las secuencias de nucleótidos que se muestran en
SEQ ID NO: 14. Este cDNA comprende una secuencia que codifica la
PKSRP (es decir, la "región codificante", indicada en la Tabla
1), así como una secuencia 5' sin traducir y una secuencia 3' sin
traducir. Debe entenderse que SEQ ID NO: 14, comprende a la vez una
región codificante y regiones 5' y 3' sin traducir.
Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden comprender solamente la región codificante de la
secuencia SEQ ID NO: 14, o pueden contener fragmentos genómicos
enteros aislados de DNA genómico. Una región codificante de esta
secuencia se indica como "posición ORF". La presente invención
incluye también ácidos nucleicos codificantes de PKSRP que codifican
la PKSRP PK-6 (SEQ ID NO: 27).
Además, la molécula de ácido nucleico puede
comprender solamente una porción de la región codificante de la
secuencia SEQ ID NO: 14, por ejemplo, un fragmento que puede
utilizarse como sonda o iniciador o un fragmento que codifica una
porción biológicamente activa de una PKSRP. Las secuencias de
nucleótidos determinadas por la clonación de los genes PKSRP de
P. patens permiten la generación de sondas e iniciadores
diseñados para uso en identificación y/o clonación de homólogos de
PKSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de
PKSRP de otros musgos y especies afines.
Las porciones de proteínas codificadas por las
moléculas de ácido nucleico de PKSRP son con preferencia porciones
biológicamente activas de una de las PKSRPs descritas en esta
memoria. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "porción
biológicamente activa de" una PKSRP tiene por objeto incluir una
porción, v.g., un dominio/motivo, de una PKSRP que participa en la
respuesta de tolerancia al estrés por sequía en una planta, tiene
una actividad como se indica en la Tabla 1, o participa en la
transcripción de una proteína implicada en una respuesta de
tolerancia al estrés por sequía en una planta. Para determinar si
una PKSRP, o una porción biológicamente activa de la misma, puede
participar en la transcripción de una proteína implicada en una
respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o si la represión
de una PKSRP da como resultado una tolerancia incrementada al estrés
en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta
que comprende la PKSRP. Métodos de análisis de este tipo son bien
conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el
Ejemplo 7. De modo más específico, fragmentos de ácido nucleico que
codifican porciones biológicamente activas de una PKSRP pueden
prepararse por aislamiento de una porción de la secuencia SEQ ID NO:
27, que expresa la porción codificada de la PKSRP o el péptido
(v.g., por expresión recombinante in vitro) e investigación
de la actividad de la región codificada de la PKSRP o el
péptido.
Se contemplan porciones biológicamente activas
de una PKSRP, e incluyen péptidos que comprenden secuencias de
aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una PKSRP,
v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, o la secuencia
de aminoácidos de una proteína homóloga a una PKSRP, que incluyen
menos aminoácidos que una PKSRP de longitud total o la proteína de
longitud total que es homóloga a una PKSRP, y exhiben al menos una
actividad de una PKSRP. Típicamente, porciones biológicamente
activas (v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, una longitud de 5,
10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos)
comprenden un dominio o motivo que tiene al menos una actividad de
PKSRP. Además, otras porciones biológicamente activas en las cuales
están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden prepararse
por técnicas recombinarse y investigarse respecto a una o más de las
actividades descritas en esta memoria. Con preferencia, las
porciones biológicamente activas de una PKSRP incluyen uno o más
dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen
actividad biológica.
La invención proporciona también proteínas PKSRP
quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una
"proteína quimérica" o "proteína de fusión" PKSRP
comprende un polipéptido de PKSRP enlazado operativamente a un
polipéptido distinto de PKSRP. Un polipéptido de PKSRP hace
referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que corresponde a una PKSRP, mientras que un polipéptido distinto de
PKSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente
homóloga a la PKSRP, v.g., una proteína que es diferente de la
PKSRP y se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente.
Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado
operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido PKSRP
y el polipéptido distinto de PKSRP están fusionados uno a otro de
tal manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta
atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido distinto de PKSRP
puede fusionarse al término N o al término C del polipéptido PKSRP.
Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una
proteína de fusión GST-PKSRP en donde las secuencias
de PKSRP están fusionadas al término C de las secuencias de GST.
Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de PKSRPs
recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una
PKSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N.
En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de
mamífero), la expresión y/o secreción de una PKSRP puede
incrementarse por el uso de una secuencia señal heteróloga.
Con preferencia, una proteína PKSRP quimérica o
de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA
recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las
secuencias polipeptídicas diferentes se ligan uno a otro en marco de
acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos
con extremos romos o con extremos cohesivos para la ligación,
digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos
apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado,
tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y
ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede
sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores
automáticos de DNA. Alternativamente, la amplificación por PCR de
fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando iniciadores de
anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos
fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse y
re-amplificarse subsiguientemente para generar una
secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in
Molecular Biology, compiladores Ausubel et al., John Wiley
& Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos
vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un
polipéptido de GST). Un ácido nucleico codificante de PKSRP puede
clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal manera que el
resto de fusión está enlazado en marco a la PKSRP.
Además de proteínas de fusión de la PKSRP
descrita en esta memoria, se contemplan homólogos y análogos de
PKSRPs existentes naturalmente y ácidos nucleicos codificantes de
PKSRP en una planta. Los "homólogos" se definen en esta memoria
como dos ácidos nucleicos o proteínas que tienen secuencias
similares, u "homólogas", de nucleótidos o aminoácidos,
respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas,
ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de PKSRPs como se
definen más adelante. El término "homólogo" abarca
adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la
secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 14 (y
porciones de la misma) debido a la degeneración del código genético
y codifican por tanto la misma PKSRP que la codificada por la
secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 14. Como se
utiliza en esta memoria, una PKSRP "existente naturalmente"
hace referencia a una secuencia de aminoácidos de PKSRP que existe
en la naturaleza. Con preferencia, una PKSRP existente naturalmente
comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27.
Un agonista de la PKSRP puede retener
sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades
biológicas de las PKSRP. Un antagonista de la PKSRP puede inhibir
una o más de las actividades de la forma existente naturalmente de
la PKSRP. Por ejemplo, el antagonista de PKSRP puede fijarse
competitivamente a un miembro de aguas abajo o aguas arriba de la
cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye
la PKSRP, o fijarse a una PKSRP que media el transporte de
compuestos a través de tales membranas, previniendo de este modo que
tenga lugar translocación.
Moléculas de ácido nucleico correspondientes a
variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un
cDNA de PKSRP pueden aislarse sobre la base de su identidad con los
ácidos nucleicos de PKSRP de Physcomitrella patens descritos
en esta memoria utilizando cDNAs de PKSRP, o una porción de los
mismos como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de
hibridación en condiciones de hibridación severas. En una
realización alternativa, pueden identificarse homólogos de PKSRP por
investigación de genotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes
de truncación, de la PKSRP en cuanto a actividad agonista o
antagonista de PKSRP. En una realización, se genera una genoteca
diversificada de variantes de PKSRP por mutagénesis combinatoria al
nivel del ácido nucleico y se codifica por una genoteca
diversificada de genes. Una genoteca diversificada de variantes de
PKSRP puede producirse mediante, por ejemplo, ligación enzimática de
una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de
tal modo que puede expresarse una serie degenerada de secuencias
potenciales de PKSRP como polipéptidos individuales, o
alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores
(v.g., para presentación de fago) que contienen la serie de
secuencias de PKSRP en ellas. Existen una diversidad de métodos que
pueden utilizarse para producir genotecas de homólogos potenciales
de PKSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada.
La síntesis química de una secuencia de genes degenerada puede
realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético
se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso de una
serie degenerada de genes permite la provisión, en una sola mezcla,
de la totalidad de las secuencias que codifican la serie deseada de
secuencias potenciales de PKSRP. Métodos para sintetizar
oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g.,
Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984
Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science
198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acids Res. 11: 477).
Adicionalmente, pueden utilizarse genotecas de
fragmentos de las regiones codificantes de PKSRP para generar una
población diversificada de fragmentos de PKSRP para investigación y
selección subsiguiente de homólogos de una PKSRP. En una
realización, puede generarse una genoteca de fragmentos de secuencia
codificante por tratamiento de un fragmento de PCR bicatenario de
una secuencia codificante de PKSRP con una nucleasa en condiciones
en las cuales se produce la mella sólo aproximadamente una vez por
molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización
del DNA para formar DNA bicatenario, lo que puede incluir pares
sentido/antisentido de productos mellados diferentes, eliminación de
porciones monocatenarias a partir de los dúplex reformados por
tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la genoteca de fragmentos
resultante en un vector de expresión. Por este método, puede
derivarse una genoteca de expresión que codifica fragmentos
N-terminales, C-terminales e
internos de diversos tamaños de la PKSRP.
Se conocen en la técnica varios métodos para
investigar productos génicos de genotecas combinatorias producidas
por mutaciones puntuales o truncación, y para investigar genotecas
de cDNA respecto a productos génicos que tengan una propiedad
seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para investigación
rápida de las genotecas de genes generadas por la mutagénesis
combinatoria de homólogos de PKSRP. Los métodos utilizados más
ampliamente, que son susceptibles de análisis de alta capacidad,
para investigación de grandes genotecas de genes, incluyen
típicamente clonación de la genoteca de genes en vectores de
expresión replicables, transformación de células apropiadas con la
genoteca de vectores resultante, y expresión de los genes
combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una
actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el
gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recurrente de
conjunto (REM), una nueva técnica que aumenta la frecuencia de
mutantes funcionales en las genotecas, puede utilizarse en
combinación con los ensayos de investigación para identificar
homólogos de PKSRP (Arkin y Yourvan, 1992 PNAS 89:
7811-7815; Delgrave et al., 1993 Protein
Engineering 6(3): 327-331). En otra
realización, pueden aprovecharse ensayos basados en células para
analizar una genoteca diversificada de PKSRP, utilizando métodos
bien conocidos en la técnica. Se proporciona adicionalmente un
método de identificación de una nueva PKSRP, que comprende (a)
generar una respuesta de anticuerpos específica para una PKSRP, o un
fragmento de la misma, como se describe en esta memoria; (b)
investigar material PKSRP supuesto con el anticuerpo, en donde la
fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia
de una PKSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado
en comparación con PKSRP conocida, para determinar su
novedad.
novedad.
Para determinar el porcentaje de homología de
dos secuencias de aminoácidos (v.g., la secuencia SEQ ID NO: 27 y
una forma mutante de la misma), se alinean las secuencias para
propósitos óptimos de comparación (v.g., pueden introducirse lagunas
en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación
óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Se comparan
luego Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos o
posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en
una secuencia (v.g., la secuencia SEQ ID NO: 27) está ocupada por el
mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la
otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia seleccionada
del polipéptido de SEQ ID NO: 27), entonces las moléculas son
homólogas en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta
memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es
equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El
mismo tipo de comparación puede hacerse entre dos secuencias de
ácido nucleico.
El porcentaje de homología entre las dos
secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas
por las secuencias (es decir, % de homología = números de posiciones
idénticas/números de posiciones totales x 100). Con preferencia, las
secuencias de aminoácidos incluidas en la presente invención son al
menos 70%, y con preferencia al menos aproximadamente
70-80%, 80-90%,
90-95%, y de modo más preferible al menos
aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a la secuencia
entera de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 27. En otra
realización adicional, al menos 70%, con preferencia al menos
aproximadamente 70-80%, 80-90%,
90-95%, y de modo más preferible al menos
aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a una secuencia
de aminoácidos entera codificada por la secuencia de ácido nucleico
que se muestra en SEQ ID NO: 14.
En otra realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de
nucleótidos que es al menos aproximadamente 80-90%,
o 90-95%, y con preferencia al menos aproximadamente
95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de nucleótidos
que se muestra en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 o SEQ
ID NO: 26. La longitud de comparación de las secuencias para ácidos
nucleicos es la longitud total de la región codificante.
Es asimismo preferible que la molécula de ácido
nucleico homóloga de la invención codifique una proteína o porción
de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es
suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
27, de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la
misma o similar función que la secuencia de aminoácidos con la que
se compara. Funciones de las secuencias de aminoácidos de PKSRP
incluyen la capacidad de participar en una respuesta de tolerancia
al estrés en una planta, o más particularmente, para participar en
la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de
tolerancia al estrés en una planta Physcomitrella patens.
Ejemplos de tales actividades se describen en la Tabla 1.
Además de los métodos arriba descritos, una
determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede
realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido
y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul
(1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Un
algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST
de Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:
403-410).
Las búsquedas de ácidos nucleicos BLAST pueden
realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de
palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a
las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la invención.
Adicionalmente, las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse
con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para
obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las PKSRPs de la
presente invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas
para propósitos de comparación, puede utilizare Gapped BLAST como se
describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y
Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los
programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no
limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Millar
(CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN
(versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de
alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN
para comparación de secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una
tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de
laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4 a fin de obtener
secuencias de aminoácidos homólogas a las PKSRPs de la presente
invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas para fines
de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en el
Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y
Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los
programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no
limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la
comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Millar
(CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN
(versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de
alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN
para comparación de secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una
tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de
laguna de 12 y una penalidad por laguna
de 4.
de 4.
Por último, puede determinarse también la
homología entre secuencias de ácido nucleico utilizando métodos de
hibridación conocidos por los expertos en la técnica. De acuerdo con
ello, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia
de nucleótidos que se hibrida, v.g. se hibrida en condiciones
severas, a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:
14, o una porción de la misma. De modo más particular, una molécula
de ácido nucleico aislada tiene al menos 15 nucleótidos de longitud
y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico
que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14. En otras
realizaciones, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250 o
más nucleótidos de longitud.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir
condiciones para hibridación y lavado en las cuales las secuencias
de nucleótidos que tienen al menos una homología de 60% entre sí se
mantienen típicamente hibridadas una a otra. Con preferencia, las
condiciones son tales que las secuencias que son al menos
aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente
70%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o
más homólogas una a otra se mantienen típicamente hibridadas entre
sí. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la
técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular
Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons,
N.Y. (1989). Un ejemplo no limitante preferido de condiciones
severas de hibridación son hibridación en 6X cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por uno
o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Con
preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida
en condiciones severas a la secuencia SEQ ID NO: 14 corresponde a
una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Como se
utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente
naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA o DNA que
tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza
(v.g., codifica una proteína natural). En una realización, el ácido
nucleico codifica una PKSRP de Physcomitrella patens
existente naturalmente.
Utilizando los métodos arriba descritos, y otros
conocidos por los expertos en la técnica, una persona con
experiencia ordinaria en la técnica puede aislar homólogos de la
PKSRP que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en
SEQ ID NO: 27. Un subgrupo de estos homólogos son variantes
alélicas. Como se utiliza en esta memoria, el término "variante
alélica" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que
contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de
aminoácidos de una PKSRP y que existen dentro de una población
natural (v.g., una especie o variedad de planta). Tales variaciones
alélicas naturales pueden dar típicamente como resultado una
varianza de 1-5% en un ácido nucleico de PKSRP. Las
variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la
secuencia de ácido nucleico de interés en cierto número de plantas
diferentes, lo que puede realizarse fácilmente utilizando sondas de
hibridación para identificar el mismo locus genético de PKSRP en
dichas plantas. Cualquiera y la totalidad de dichas variaciones de
ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos
resultantes en una PKSRP que son el resultado de la variación
alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una
PKSRP, deben considerarse dentro del alcance de la invención.
Se contemplan además moléculas de ácido nucleico
que codifican PKSRPs de la misma u otra especie tales como análogos,
ortólogos y parálogos de PKSRP. Como se utiliza en esta memoria, el
término "análogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que
tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por
separado en organismos no afines. Como se utiliza en esta memoria,
el término "ortólogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos
de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen
ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos
codifican proteínas que tienen la misma o similares funciones. Como
se utiliza también en esta memoria, el término "parálogos"
hace referencia a dos ácidos nucleicos que están relacionados por
duplicación en un mismo genoma. Los parálogos tienen usualmente
funciones diferentes, pero estas funciones pueden ser afines
(Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278 (5338):
631-637). Análogos, ortólogos y parálogos de una
PKSRP existente naturalmente pueden diferir de la PKSRP existente
naturalmente por modificaciones posteriores a la traducción, por
diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas cosas.
Modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización
química de polipéptidos in vivo e in vitro, v.g.
acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y tales
modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento
de los polipéptidos o después del tratamiento con enzimas
modificantes aisladas. En particular, los ortólogos de la invención
exhibirán generalmente al menos 80-85%, más con
preferencia 90%, y muy con preferencia 95%, 96%, 97%, 98% o incluso
99% de identidad u homología con la totalidad o una parte de una
secuencia de aminoácidos de PKSRP existente naturalmente y exhibirán
una función similar a una PKSRP. Los ortólogos son también con
preferencia capaces de participar en la respuesta al estrés en las
plantas. En una realización, los ortólogos de PKSRP mantienen la
capacidad para participar en el metabolismo de los compuestos
necesarios para la construcción de membranas celulares en
Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a
través de estas membranas.
Además de las variantes existentes naturalmente
de una secuencia de PKSRP que pueden existir en la población, el
experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden
introducirse cambios por mutación en la secuencia de nucleótidos SEQ
ID NO: 14, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de
aminoácidos de la PKSRP codificada, sin alterar la capacidad
funcional de la PKSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de
nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos
de aminoácidos "no esenciales" en la secuencia SEQ ID NO: 14.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede
estar alterado respecto de la secuencia de tipo salvaje de una de
las PKSRPs sin alterar la actividad de dicha PKSRP, mientras que un
residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad
de la PKSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo (v.g.,
aquéllos que no están conservados o están sólo
semi-conservados en el dominio que tiene actividad
de PKSRP) pueden ser esenciales o no para la actividad y por
consiguiente son probablemente susceptibles de alteración sin que se
altere la actividad de la PKSRP.
De acuerdo con ello, otro aspecto de la
invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican
PKSRPs que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no
son esenciales para la actividad de la PKSRP. Tales PKSRPs difieren
en secuencias de aminoácidos de la secuencia contenida en SEQ ID NO:
27, pero retienen al menos una de las actividades de PKSRP descritas
en esta memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de
aminoácidos que es al menos homóloga aproximadamente en un 70% a la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. Con preferencia, la proteína
codificada por la molécula de ácido nucleico tiene una homología de
al menos aproximadamente 70-80%,
80-90%, 90-95% con la secuencia SEQ
ID NO: 27, y de modo más preferible una homología de al menos
aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% homóloga a la secuencia SEQ ID
NO: 27. Los homólogos de PKSRP preferidos de la presente invención
son con preferencia capaces de participar en la respuesta de
tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participar
en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de
tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens,
o tienen una o más actividades indicadas en la Tabla 1.
Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un homólogo de PKSRP a la secuencia de proteína de SEQ ID
NO: 27 puede crearse por introducción de una o más sustituciones,
adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO: 14, de tal modo que se introduzcan una o más
sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína
codificada. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia SEQ ID
NO: 14 por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y
mutagénesis mediada por PCR. Con preferencia, se hacen sustituciones
conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no
esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de
aminoácidos" es una en la que el residuo de aminoácidos está
reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena
lateral similar.
Se han definido en la técnica familias de
residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares.
Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas
(v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g.,
ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin
carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (v.g., alanita,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,
triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (v.g.,
treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g.,
tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de
aminoácido no esencial predicho en una PKSRP se reemplaza con
preferencia con otro residuo de aminoácido de la misma familia de
cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden
introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o
parte de una secuencia codificante de PKSRP, por ejemplo por
mutagénesis de saturación, y los mutantes que resultan pueden
investigarse respecto a una actividad de PKSRP descrita en esta
memoria para identificar mutantes que retienen actividad de PKSRP.
Después de la mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO: 14, la proteína
codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la
proteína puede determinarse por análisis de la tolerancia al estrés
de una planta que expresa la proteína como se describe en el Ejemplo
7.
Además de las moléculas de ácido nucleico que
codifican la PKSRP arriba descrita, otro aspecto se refiere a
moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto a
las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una
secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico
"sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la
cadena codificante de una molécula de cDNA bicatenario o
complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un
ácido nucleico antisentido puede estar unido por enlaces hidrógeno a
un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser
complementario a una cadena codificante de PKSRP entera, o sólo a
una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido
nucleico antisentido es antisentido para una "región
codificante" de la cadena codificante de una secuencia de
nucleótidos que codifica una PKSRP. El término "región
codificante" hace referencia a la región de la secuencia de
nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de
aminoácidos (v.g., la región codificante entera de ,,,,, comprende
los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la molécula de ácido
nucleico antisentido es antisentido para una "región no
codificante" de la cadena codificante de una secuencia de
nucleótidos que codifica una PKSRP. El término "región no
codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la
región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, a
las que se hace referencia también como regiones 5' y 3' no
traducidas).
En una realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de
ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos
que se muestra en SEQ ID NO: 14. Una molécula de ácido nucleico que
es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en
SEQ ID NO: 14 es una que es suficientemente complementaria a la
secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 14, de tal
modo que puede hibridarse a la secuencia de nucleótidos que se
muestra en SEQ ID NO: 14, formando con ello un dúplex estable.
Dadas las secuencias de las cadenas codificantes
que codifican las PKSRPs descritas en esta memoria (v.g., la
secuencia expuesta en SEQ ID NO: 14, los ácidos nucleicos
antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las reglas de
apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido
nucleico antisentido puede ser complementaria para la región
codificante entera de mRNA de PKSRP, pero más con preferencia es un
oligonucleótido que es antisentido sólo para una porción de la
región codificante o no codificante de mRNA de PKSRP. Por ejemplo,
el oligonucleótido antisentido puede ser complementario para la
región que rodea el sitio de comienzo de la traducción de mRNA de
PKSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una
longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50
nucleótidos.
Un ácido nucleico antisentido puede construirse
utilizando reacciones de síntesis química y ligación enzimática que
emplean procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
ácido nucleico antisentido (v.g., un oligonucleótido antisentido)
puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes
naturalmente o nucleótidos modificados de diversos modos diseñados
para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para
aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos
nucleicos antisentido y sentido, v.g., pueden utilizarse derivados
fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de
nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido
nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroximetil)-uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetil-aminometiluracilo,
dihidrouracilo,
beta-D-galactosil-queosina,
inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metil-guanina,
1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina,
2-metil-adenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metil-citosina,
N6-adenina, 7-metilguanina,
5-metilamino-metiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxi-uracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wybutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo,
uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido
uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo,
(acp3)w, y 2,6-diaminopurina.
Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse
biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un
ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es
decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado será
de orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés,
descrito adicionalmente en la subsección siguiente).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido se
administran típicamente a una célula o se generan in situ de
tal modo que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA y/o DNA
genómico celular codificante de una PKSRP para inhibir con ello la
expresión de la proteína. v.g., por inhibición de la transcripción
y/o la traducción. La hibridación puede realizarse por
complementariedad convencional de nucleótidos a fin de formar un
dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido
nucleico antisentido que se fija a los dúplex de DNA, por
interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice.
La molécula antisentido puede modificarse de tal manera que se fije
específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una
superficie celular seleccionada, v.g., por enlace de la molécula de
ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se fija
a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de
ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a las células
utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para alcanzar
concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas
antisentido, se prefieren constructos vectores en los cuales la
molécula de ácido nucleico antisentido está puesta esencialmente
bajo el control de un promotor fuerte procariota, viral, o eucariota
(con inclusión de promotores vegetales).
En otra realización adicional, la molécula de
ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico
\alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico
\alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios
específicos con RNA complementario en los cuales, contrariamente a
las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas una a
otra (Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:
6625-6641). La molécula de ácido nucleico
antisentido puede comprender también un
2'-o-metil-ribonucleótido
(Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res.
15:6131-6148) o un análogo quimérico
RNA-DNA (Inoue et al., 1987 FEBS Lett, 215:
327-330).
En otra realización adicional, un ácido nucleico
antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son
moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son
capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un
mRNA, para el cual tienen una región complementaria. Así, las
ribozimas (v.g., las ribozimas de cabeza de martillo descritas en
Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591)
pueden utilizarse para escindir catalíticamente transcritos de mRNA
de PKSRP a fin de inhibir con ello la traducción de mRNA de PKSRP.
Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico
codificante de PKSRP puede diseñarse sobre la base de la secuencia
de nucleótidos de un cDNA de PKSRP, como se describe en esta memoria
(es decir, SEQ ID NO: 14), o sobre la base de una secuencia
heteróloga que puede aislarse de acuerdo con métodos expuestos en
esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA
IVS L-19 de Tetrahymena, en el cual la
secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la
secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de PKSRP.
Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech
et al., Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede
utilizarse mRNA de PKSRP para seleccionar un RNA catalítico que
tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de una
agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak,
J.W., 1993, Science 261: 1411-1418.
Alternativamente, la expresión de genes de PKSRP
puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de nucleótidos
complementarias a la región reguladora de una secuencia de
nucleótidos de KPSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de PKSRP)
para formar estructuras de triple hélice que impiden la
transcripción de un gen de PKSRP en células diana. Véase
generalmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des.
6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992
Ann N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J., 1992;
Bioassays 14(12):807-15.
Además de los ácidos nucleicos y proteínas PKSRP
arriba descritos, la presente invención abarca estos ácidos
nucleicos y proteínas fijados a un resto. Estos restos incluyen,
pero sin carácter limitante, restos de detección, restos de
hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de
reacción, restos de fijación, etcétera. Un grupo típico de ácidos
nucleicos que tienen restos unidos son sondas e iniciadores. Las
sondas y los iniciadores comprenden típicamente un oligonucleótido
sustancialmente aislado. El oligonucleótido comprende típicamente
una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones
severas a al menos aproximadamente 12, con preferencia
aproximadamente 25, de modo más preferible aproximadamente 40, 50 ó
75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia
expuesta en SEQ ID NO: 14, una secuencia antisentido de la secuencia
expuesta en SEQ ID NO: 14, o mutantes de la misma existentes
naturalmente. Iniciadores basados en la secuencia de nucleótidos de
SEQ ID NO: 14 pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar
homólogos de PKSRP. Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos
PKSRP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias
genómicas que codifican la misma proteína o proteínas homólogas. En
realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo
marcador unido a ella, v.g. el grupo marcador puede ser un
radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor
enzimático. Tales sondas pueden utilizarse como parte de un kit de
ensayo de marcadores genómicos para identificar células que expresan
una PKSRP, por ejemplo midiendo un nivel de un ácido nucleico
codificante de PKSRP, en una muestra de células, v.g., por detección
de niveles de mRNA de PKSRP o determinación de si un gen de PKSRP
genómico se ha mutado o ha sido delecionado.
En particular, un método útil para averiguar el
nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA
disponible para traducción al producto génico) consiste en realizar
una transferencia Northern (para referencia, véase, por ejemplo,
Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley; Nueva York). Esta información demuestra al menos parcialmente
el modo de transcripción del gen transformado. El RNA celular total
puede prepararse a partir de células, tejidos u órganos por varios
métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el
descrito en Bormann, E.R. et al., 1992 Mol. Microbiol.
6:317-326. Para investigar la presencia o cantidad
relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden
emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western.
Estos métodos son bien conocidos por una persona con experiencia
ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al.,
1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley; Nueva York).
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido
nucleico de PKSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión
del vector en una célula hospedadora da como resultado una
tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. Como se utiliza
en esta memoria, el término "vector" hace referencia a una
molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico
al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que
hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario en donde
pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es
un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de DNA
adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de
replicación autónoma en una célula hospedadora en donde se han
introducido (v.g. vectores bacterianos que tienen un origen de
replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros
vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) se integran en
el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la
célula hospedadora, y por consiguiente se replican junto con el
genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de
dirigir la expresión de genes a los que se han enlazado
operativamente. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria
como "vectores de expresión". En general, los vectores de
expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante se encuentran
a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria
descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse
intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector
utilizada más comúnmente. No obstante, la invención tiene por objeto
incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como
vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación,
adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan
funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma
adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula
hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión
recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras,
seleccionadas sobre la base de las célula hospedadoras a utilizar
para la expresión, lo que está enlazado operativamente a la
secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión
recombinante, debe entenderse que "enlazado operativamente"
significa que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a
la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la
expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de
transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora
cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). El término
"secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores,
intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g.,
señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se
describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o
véase: Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo 7,
89-108, CRC Press, Boca Raton, Florida, con
inclusión de las referencias citadas en dicho lugar. Secuencias
reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva
de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células
hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de
nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras o en ciertas
condiciones. Será apreciado por los expertos en la técnica que el
diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como
la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de
expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la
invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir
con ello proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos
de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en
esta memoria (v.g., PKSRPs, forman mutantes de PKSRPs, proteínas de
fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención pueden diseñarse para expresión de PKSRPs en células
procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse genes de
PKSRP en células bacterianas tales como C. glutamicum,
células de insecto (utilizando vectores de expresión de
baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase
Romanos, M.A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast:
a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel C.A.M.J.J.
et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous
fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet, & L.L.
Lasure, compiladores, p. 396-428; Academic Press: S.
Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt. P.J., 1991, Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi, en:
Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al.,
compiladores, p. 1-28, Cambridge University Press:
Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999 Marine
Biotechnology 1(3): 239-251), ciliados de los
tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria,
Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya,
Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y
Stylonychia, especialmente del género Stylonychia
lemnae, con vectores siguiendo un método de transformación como
el descrito en WO 98/01572 y células de plantas multicelulares
(véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of
Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell
Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and
Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter 6/7, S.
71-119 (1993); F.F. White, B.Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu,
128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu.
Rev. Plant Physiol. Molec. Biol. 42:205-225 y las
referencias citadas en dichos lugares) o células de mamífero.
Células hospedadoras adecuadas se describen más detalladamente en
Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press: San Diego, Ca (1990). Alternativamente, el
vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse
in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del
promotor T7 y polimerasa T7.
La expresión de proteínas en procariotas se
lleva a cabo en la mayoría de los casos con vectores que contienen
promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de
proteínas de fusión o distintas de las proteínas de fusión. Los
vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una
proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la
proteína recombinante, pero también al término C o se fusionan en
regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión sirven
típicamente para tres propósitos: 1) aumentar la expresión de una
proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de una proteína
recombinante; y 3) facilitar la purificación de una proteína
recombinante por actuar como un ligando en la purificación por
afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se
introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de
fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la
proteína recombinante del resto de fusión subsiguientemente a la
purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus
secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina
y enteroquinasa.
Vectores de expresión de fusión típicos incluyen
pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988 Gene
67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y
pRIT5 (Pharmacia Piscataway, NJ) que fusionan
glutatión-S-transferasa (GST), la
proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a
la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia
codificante de la PKSRP se clona a un vector de expresión pGEX para
crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende,
desde el término N al término C, GST-sitio de
escisión de trombina-proteína X. La proteína de
fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando
resina glutatión-agarosa. La PKSRP recombinante no
fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de
fusión con trombina.
Ejemplos de vectores de expresión de E.
coli que no son de fusión inducibles y adecuados incluyen pTrc
(Amann et al., 1988 Gene 69:301-315) y pET
11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, (1990)
60-89). La expresión de genes diana a partir del
vector pTrc está basada en la transcripción de
RNA-polimerasa del hospedador por un promotor de
fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana a
partir del vector pET-11d está basada en la
transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac
mediada por una RNA-polimerasa viral
co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es
suministrada por las células hospedadoras BL21(DE3) o HMS174
(DE3) a partir de un profago \lambda residente que aloja un gen de
T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV5.
Una estrategia para maximizar la expresión de
proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una
bacteria hospedadora con una capacidad deteriorada para escindir
proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra
estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico a
insertar en un vector de expresión de tal modo que los codones
individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente
en la bacteria seleccionada para expresión, tales como C.
glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res.
20:2111-2118). Dicha alteración en las secuencias de
ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas
estándar de síntesis de DNA.
En otra realización, el vector de expresión de
PKSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores
para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1
(Baldari, et al., 1977 Embo J. 6:229-234,
pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:939-943),
pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123),
y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos
para la construcción de vectores apropiados para uso en otros
hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados
en: van den Hondel C.A.M.J.J. & Punt. P.J. (1991): Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi, in:
Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al.,
compiladores., p. 1-28, Cambridge University Press:
Cambridge.
Alternativamente, las PKSRPs de la invención
pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de
expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para
la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (v.g.
células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al., 1983 Mol.
Cell. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y
Summers, 1989 Virology 170: 31-39).
En otra realización adicional, un ácido nucleico
de PKSRP de la invención se expresa en células de mamífero
utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores
de expresión de mamífero incluyen pPCDM8 (Seed, B., 1987 Nature
329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J.
6:187-195). Cuando se utilizan en células de
mamífero, las funciones de control del vector de expresión son
desempeñadas a menudo por elementos reguladores virales. Por
ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma,
Adenovirus 2, citomegalovirus y el Virus 40 de los Simios. Para
otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas
como eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook J.,
Fritsch E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
En otra realización, el vector de expresión
recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido
nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se
utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar
el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos se
conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores
específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina
(específico del hígado; Pinkert et al., 1987 Genes Dev.
1:268-287), promotores específicos linfoides (Calame
y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en
particular promotores de receptores de las células T (Winoto y
Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733 e inmunoglobulinas
(Banerji et al., 1983 Cell 33:729-740; Queen
and Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), promotores
específicos de neuronas (v.g., el productor de neurofilamentos;
Byrne and Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477),
promotores específicos de páncreas (Edlund et al., 1985
Science 930:912-916), y promotores específicos de
glándulas mamarias (v.g. promotor de lactosuero; patente U.S. No.
4873316 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264166).
Están comprendidos también promotores regulados evolutivamente, por
ejemplo, los promotores hox murinos (Kessell and Gruss, 1990 Science
249:374-379) y el promotor fetoproteína (Campes y
Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).
En otra realización, las PKSRPs de la invención
pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como
algas) (véase Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1
(3):239-251 y las referencias citadas en dicho
lugar) y células vegetales procedentes de plantas superiores (v.g.,
las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de
vectores de expresión en plantas incluyen los detallados en: Becker,
D., Kemper E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary
vectors with selectable markers located proximal to the left border,
Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984
Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl.
Acid. Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer
in Higher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and
Utilization, compiladores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993; p.
15-38.
Una casete de expresión en plantas contiene con
preferencia secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión
génica en células vegetales y enlazadas operativamente de tal modo
que cada secuencia puede desempeñar su función, por ejemplo,
terminación de la transcripción por señales de poliadenilación.
Señales de poliadenilación preferidas son las procedentes de
t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tales como
el gen 3 conocido como octopina-sintasa del plásmido
Ti pTiACH5 (Gieleu et al., 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes
funcionales del mismo, pero también son adecuados otros terminadores
funcionalmente activos en plantas.
Dado que la expresión de genes vegetales no se
limita en muchos casos a niveles de transcripción, una casete de
expresión en plantas contiene con preferencia otras secuencias
enlazadas operativamente como mejoradores de la traducción tales
como la secuencia superimpulsora ("overdrive") que contiene la
secuencia conductora 5' no traducida del virus del mosaico del
tabaco que mejora la relación de proteína por RNA (Gallie et
al., 1987 Nucl. Acids Research
15:8693-8711).
La expresión de genes de plantas tiene que estar
enlazada operativamente a un promotor apropiado que confiere la
expresión génica de una manera oportuna, específica de la célula o
del tejido. Se prefieren promotores que impulsan expresión
constitutiva (Benfey et al., 1989 EMBO J.
8:2195-2202) como los derivados de virus de plantas
tales como el CAMV 35S (Franck et al., 1980 Cell
21:285-294), el CaMV 19S (véase también la patente
U.S. No. 5352605 y la solicitud PCT No. WO 8402913) o promotores de
plantas tales como los de la subunidad pequeña de Rubisco descrita
en la patente U.S. No. 4962028.
Otras secuencias preferidas para uso en casetes
de expresión de genes vegetales son secuencias de direccionamiento
necesarias para dirigir el producto génico en su compartimiento
celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev.
Plant Sci. 15 (4):285-423 y las referencias citadas
en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de
plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el
espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático,
cuerpos de aceite, peroxisomas y otros compartimientos de las
células vegetales.
La expresión de genes vegetales puede ser
facilitada también por la vía de un promotor inducible (para
revisión véase Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
48:89-108). Promotores químicamente inducibles son
especialmente adecuados si se quiere que la expresión génica ocurra
de una manera específica del tiempo. Ejemplos de tales promotores
son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO
95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et
al., 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor
inducible por etanol (solicitud PCT No. WO 93/21334).
Asimismo, promotores adecuados que responden a
condiciones de estrés bióticas o abióticas son aquéllos tales como
el promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et
al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el
promotor hsp80 del tomate inducible por calor (patente U.S. No.
5187267,), el promotor de \alpha-amilasa de la
patata inducible por frío (solicitud PCT No. WO 96/12814) o el
promotor pinII inducible por lesiones (patente europea No. 375091).
Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y sal,
tal como el promotor RD29A, véase
Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993) Mol. Gen.
Genet. 236:331-340).
Se prefieren especialmente aquellos promotores
que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos,
tales como células de guarda y las células de los pelos radiculares.
Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza
(patente U.S. No. 5608152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein
et al., 1991 Mol. Gen. Genet. 225
(3):459-67), el promotor oleosina de
Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor
faseolina de Phaseolus vulgaris (patente U.S. No. 5504200),
el promotor Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980) o el
promotor B4 de legumina (LEB4; Baeumlein et al., 1992 Plant
Journal, 2 (2):233-9) así como promotores que
confieren expresión específica de semillas en plantas
monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etcétera.
Promotores adecuados dignos de mención son el promotor del gen lpt2
o lpt1 de la cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT
No. WO 95/23230) o los descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890
(promotores del gen hordeína de la cebada, el gen glutelina del
arroz, el gen orizina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen
gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeína del
maíz, el gel glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo y el
gen secalina del centeno).
Son también especialmente adecuados promotores
que confieren expresión génica específica de plástidos, dado que los
plástidos son el compartimiento en el que tiene lugar la biosíntesis
de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de
RNA-polimerasa viral descrito en la solicitud PCT
No. WO 95/16783 y la solicitud PCT No. WO 97/06250, y el promotor
clpP de Arabidopsis descrito en la solicitud PCT No. WO
99/46394.
La invención proporciona adicionalmente un
vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA
de PKSRP de la invención clonada en el vector de expresión en
orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está enlazada
operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite
la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una
molécula de RNA que es antisentido para un mRNA de PKSRP. Pueden
seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una
molécula de ácido nucleico clonada en orientación antisentido que
dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en
una diversidad de tipos de células. Por ejemplo, pueden
seleccionarse promotores y/o intensificadores virales, o secuencias
reguladoras que dirigen la expresión constitutiva directa de RNA
antisentido, específica de tejido o específica del tipo de célula.
El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de
un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en donde los
ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una
región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región
reguladora puede estar determinada por el tipo de célula en el que
se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la
expresión génica utilizando los genes antisentido véase Weintraub,
H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic
analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.
1(1) 1986 y Mol et al., 1990 FEBS Letters
268:427-430.
Otro aspecto de la invención se refiere a
células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de
expresión recombinante de la invención. Los términos "célula
hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan
en esta memoria de modo intercambiable. Debe entenderse que dichos
términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata,
sino que se aplican también a la progenie o progenie potencial de
dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en
las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias
ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la
célula originaria, pero se incluye todavía dentro del alcance del
término como se utiliza en esta memoria.
Una célula hospedadora puede ser cualquier
célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una PKSRP puede
expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum,
células de insecto, células fúngicas, o células de mamífero (tales
como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas,
ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como
C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son
conocidas por los expertos en la técnica.
El DNA vector puede introducirse en células
procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de
transformación o transfección. Tal como se utiliza en esta memoria,
los términos "transformación", "transfección",
"conjugación" y "transducción" tienen por objeto hacer
referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica
para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula
hospedadora, con inclusión de co-precipitación con
fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural,
transferencia mediada por productos químicos y electroporación.
Métodos adecuados para transformación o transfección de células
hospedadoras que incluyen células vegetales pueden encontrarse en
Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de
laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44,
Agrobacterium protocols, compiladores: Gartland y Davey,
Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés
biótico y abiótico es un rasgo general que se desea sea heredado en
una gran diversidad de plantas tales como maíz, trigo, centeno,
avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza
y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas
tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies de Vicia,
guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de
Sálix, árboles (palma de aceite, cocotero), hierbas perennes y
cosechas forrajeras, estas plantas de cosecha son también plantas
diana preferidas para una ingeniería genética como una realización
adicional de la presente invención.
En particular, la invención proporciona un
método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico
codificante de PKSRP en donde la PKSRP es PK-6 y en
donde la expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da
como resultado una tolerancia incrementada al estrés por sequía en
comparación con una variedad de tipo salvaje en la planta que
comprende: (a) transformar una célula de la planta con un vector de
expresión que comprende un ácido nucleico de PKSRP, y (b) generar a
partir de la célula de la planta una planta transgénica con una
tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una
variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona
también un método de incrementar la expresión de un gen de interés
en una célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo
salvaje de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se
transcribe en respuesta a una PKSRP, que comprende: (a) transformar
la célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un
ácido nucleico codificante de PKSRP, y (b) expresar la PKSRP en la
célula hospedadora, aumentado con ello la expresión del gen
transcrito en respuesta a la PKSRP, en comparación con una variedad
de tipo salvaje de la célula hospedadora.
Para dicha transformación de plantas, pueden
utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer,
1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de
los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en
orientación sentido o antisentido en el T-DNA. En
posición 5' respecto al cDNA, un promotor de planta activa la
transcripción del cDNA. Una secuencia de poliadenilación está
localizada en posición 3-prima respecto al cDNA. La
expresión específica de tejidos puede conseguirse utilizando un
promotor específico de tejido. Por ejemplo, la expresión específica
de semilla puede conseguirse por clonación del promotor napin o LeB4
o USP en posición 5' respecto al cDNA. Asimismo, puede utilizarse
cualquier otro elemento promotor específico de semilla. Para
expresión constitutiva en la planta entera, puede utilizarse el
promotor CaMV 35S. La proteína expresada puede ser direccionada a un
compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para
plástidos, la mitocondria o el retículo endoplasmático (Kermode,
1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15):285-423). El
péptido señal se clona en posición 5' en marco al cDNA para archivar
la localización subcelular de la proteína de fusión. Adicionalmente,
promotores que son sensibles a estados de estrés abiótica tales como
el promotor RD29S de Arabidopsis, pueden utilizarse con las
secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria. Un experto
en la técnica reconocerá que el promotor utilizado debería estar
enlazado operativamente al ácido nucleico de tal modo que el
promotor cause la transcripción del ácido nucleico, lo que da como
resultado la síntesis de un mRNA que codifica un polipéptido.
Alternativamente, el RNA puede ser un RNA antisentido para uso a
fines de influir en la expresión subsiguiente del mismo u otro gen o
genes.
Métodos alternativos de transfección incluyen la
transferencia directa de DNA a flores en desarrollo por
electroporación o transferencia de genes mediada por
Agrobacterium. La transfección de plantas mediada por
Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa
GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986 Mol. Gen. Genet.
204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de
Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse
por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere
et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788;
Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology
Manual, 2ª edición, - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in
Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN
0-7923-2731-4;
Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. - 360 S.,
ISBN 0-8493-5164-2).
Por ejemplo, la colza puede transformarse por la vía de
transformación de los cotiledones o del hipocótilo (Moloney et
al., 1989 Plant Cell Report 8:238-242; De Block
et al., 1989 Plant Physiol. 91:694-701). El
uso de antibióticos para la selección de Agrobacterium y de
plantas depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium
utilizados para la transformación. La selección de la colza se
realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador de plantas
seleccionable. La transferencia de genes mediada por
Agrobacterium al lino puede realizarse utilizando, por
ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994
Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la
transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo
una técnica descrita en la patente europea No. 0424047, la patente
U.S. No. 5.322.783, la Patente Europea No. 0397687, la patente U.S.
No. 5.376.543 o la patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del
maíz puede realizarse por bombardeo de partículas, absorción de DNA
mediada por polietilenglicol o por la vía de la técnica de fibras de
carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot "The
Maize Handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993), ISBN
3-540-97826-7). Un
ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la
patente U.S. No. 5.990.387 y un ejemplo específico de transformación
de trigo puede encontrarse en la solicitud PCT No. WO 93/07256.
Para la transfección estable de células de
mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la
técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de
células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de
identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce
generalmente en las células hospedadoras un gen que codifica un
marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) junto con
el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen
aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418,
higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia
frente a un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Moléculas de
ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden
introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que
codifica una PKSRP o pueden introducirse en un vector separado. Las
células transfectadas de manera estable con la molécula de ácido
nucleico introducida pueden identificarse mediante, por ejemplo,
selección de fármacos (v.g., las células que han incorporado el gen
marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células
mueren).
Para crear un microorganismo recombinante
homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de
un gen de PKSRP en donde se ha introducido una deleción, adición o
sustitución para alterar con ello, v.g., interrumpir funcionalmente,
el gen PKSRP. Con preferencia, el gen PKSRP es un gen KPSRP de
Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una
planta afín o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o
insecto. En una realización preferida, el vector se diseña de tal
modo que, después de la recombinación homóloga, el gen PKSRP
endógeno queda interrumpido funcionalmente (es decir ya no codifica
una proteína funcional; a lo que se hace referencia también como un
vector fuera de combate ("knock-out")).
Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal manera que,
después de recombinación homóloga, el gen PKSRP endógeno queda
mutado o alterado de cualquier otro modo pero codifica todavía una
proteína funcional (v.g., la región reguladora situada aguas arriba
puede alterarse, alterando con ello la expresión de la PKSRP
endógena). Para crear una mutación puntual por recombinación
homóloga, pueden utilizarse híbridos DNA-RNA en una
técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Straus
et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5):
1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American
Scientist. 87(3): 240-247). Los
procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella
patens son también bien conocidos en la técnica y se contemplan
para uso en esta invención.
En cuanto al vector de recombinación homóloga,
la porción alterada del gen PKSRP está flanqueada en sus extremos 5'
y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen PKSRP para
permitir que ocurra recombinación homóloga entre el gen PKSRP
exógeno transportado por el vector y un gen PKSRP endógeno, en un
microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de PKSRP
flanqueante adicional tiene una longitud suficiente para
recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se
incluyen en el vector varios centenares de pares de bases hasta
kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase
v.g., Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987 Cell 51: 503 para una
descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et
al., 1998 PNAS, 95(8): 4368-4373 para
recombinación basada en cDNA en Physcomitrella patens). El
vector se introduce en un microorganismo o una célula de planta
(v.g., por la vía de DNA mediado por polietilenglicol), y se
seleccionan células en las cuales el gen PKSRP introducido se ha
recombinado homólogamente con el gen PKSRP endógeno utilizando
métodos conocidos en la técnica.
En otra realización, pueden producirse
microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados
que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo,
la inclusión de un gen de PKSRP en un vector que lo pone bajo
control del operón lac permite la expresión del gen de PKSRP
únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien
conocidos en la técnica.
Una célula hospedadora de la invención, tal como
una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede
utilizarse para producir (es decir, expresar) una PKSRP. De acuerdo
con ello, la invención proporciona adicionalmente métodos para
producir PKSRPs utilizando las células hospedadoras de la invención.
En una realización, el método comprende cultivar la célula
hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector
de expresión recombinante que codifica una PKSRP, o en cuyo genoma
se ha introducido un gen que codifica una PKSRP de tipo salvaje o
alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la PKSRP. En
otra realización, el método comprende adicionalmente aislar PKSRPs
del medio o la célula hospedadora.
Otro aspecto de la invención se refiere a PKSRPs
aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas. Una
proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente
activa de la misma está exenta de algo del material celular cuando
se produce por técnicas de DNA recombinante, o precursores químicos
u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La
expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye
preparaciones de PKSRP en las cuales la proteína está separada de
una parte de los componentes celulares de las células en las cuales
se produce la misma natural o recombinantemente. En una realización,
la expresión "sustancialmente exenta de material celular"
incluye preparaciones de una PKSRP que tiene menos de
aproximadamente 30% (referido a peso seco) de material distinto de
PKSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como una
"proteína contaminante"), de modo más preferible menos de
aproximadamente 20% de material distinto de PKSRP, de modo todavía
más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de
PKSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de
material distinto de PKSRP.
Cuando la PKSRP o la porción biológicamente
activa de la misma se produce recombinantemente, la misma está de
modo preferible sustancialmente exenta también de medio de cultivo,
es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente
20%, de modo más preferible menos de aproximadamente 10%, y de modo
muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la
preparación de proteína. La expresión "sustancialmente exenta de
precursores químicos u otros productos químicos" incluye
preparaciones de PKSRP en las cuales la proteína está separada de
precursores químicos u otros productos químicos que están implicados
en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión
"sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos
químicos" incluye preparaciones de una PKSRP que tienen menos de
aproximadamente 30% (referido a peso seco) de precursores químicos o
productos químicos distintos de PKSRP, de modo más preferible menos
de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos
distintos de PKSRP, de modo todavía más preferible menos de
aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos
distintos de PKSRP, y de modo muy preferible menos de
aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos
distintos de PKSRP. En realizaciones preferidas, las proteínas
aisladas, o porciones biológicamente activas de las mismas, carecen
de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la
PKSRP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión
recombinante de, por ejemplo, una PKSRP de Physcomitrella
patens en plantas distintas de Physcomitrella patens o
microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u
hongos.
Las moléculas de ácido nucleico, proteínas,
homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores,
y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse
en uno o más de los métodos siguientes: identificación de
Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas
de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación
y localización de secuencias de interés de Physcomitrella
patens; estudios de evolución; determinación de regiones de
PKSRP requeridas para función; modulación de la actividad de una
PKSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares;
modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y
modulación de la resistencia al estrés.
El musgo Physcomitrella patens presenta
un miembro de los musgos. El mismo es afín a otros musgos tales como
Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de
luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella
comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y el
nivel de polipéptidos, lo que permite el uso de investigación
heteróloga de moléculas de DNA con sondas procedentes de otros
musgos u organismos, haciendo posible con ello la derivación de una
secuencia de consenso adecuada para la investigación heteróloga o la
anotación funcional y predicción de funciones génicas en terceras
especies. La posibilidad de identificar tales funciones puede tener
por tanto gran importancia, v.g., la predicción de la especificidad
de sustrato de las enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido
nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeado de
genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.
Las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la
invención tienen una diversidad de usos. De modo muy importante, las
secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la presente invención
pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo con ello
tolerancia a la sequía. La presente invención proporciona por
consiguiente una planta transgénica transformada por un ácido
nucleico de PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido
nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada
a la sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la
planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una
dicotiledónea. La invención estipula adicionalmente que la planta
transgénica puede seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena,
trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza,
canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas,
patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante,
alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite,
cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras, por ejemplo.
En particular, la presente invención describe el
uso de la expresión de PK-6, de Physcomitrella
patens para transformar por bioingeniería plantas tolerantes a
la sequía. Esta estrategia se ha demostrado en esta memoria para
Arabidopsis thaliana, colza/canola, soja, maíz y trigo, pero
su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con
ello, la invención proporciona una planta transgénica que contiene
la PKSRP PK-6 (SEQ ID NO: 27), en donde el estrés
ambiental es sequía.
La presente invención proporciona también
métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que
comprenden modificar la expresión de una PKSRP en la planta. La
invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que
la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce. En particular, la
presente invención proporciona métodos de producción de una planta
transgénica que tiene una tolerancia incrementada al estrés por
sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta
que comprenden aumentar la expresión de una PKSRP en una
planta.
planta.
Los métodos de aumento de la expresión de PKSRPs
pueden utilizarse en casos en que la planta es transgénica o no
transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta
puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los
ácidos nucleicos codificantes de PKSRP descritos anteriormente, o
bien puede transformarse la planta con un promotor que dirige la
expresión de PKSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención
estipula que dicho promotor puede ser específico de un tejido.
Adicionalmente, dicho promotor puede estar regulado evolutivamente.
De modo alternativo, las plantas no transgénicas pueden tener
expresión de PKSRP nativa modificada por inducción de un promotor
nativo.
La expresión PK-6 (SEQ ID NO:
14) en plantas diana puede realizarse por, pero sin carácter
limitante, uno de los ejemplos siguientes: (a) promotor
constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor
inducido por productos químicos, y (d)
sobre-expresión de un promotor modificado por
bioingeniería con, por ejemplo, factores de transcripción derivados
de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275: 657). El último
caso implica la identificación de los homólogos de
PK-6 (SEQ ID NO: 27) en la planta diana así como de
su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que
contienen dedos de cinc se modifican por bioingeniería para
interaccionar específicamente con el homólogo de
PK-6 (SEQ ID NO: 27), activándose la transcripción
del gen correspondiente.
Además de introducir las secuencias de ácido
nucleico de PKSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden
utilizarse también para identificar un organismo como
Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo.
Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia
de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una
población mixta de microorganismos. Se proporcionan las secuencias
de ácido nucleico de cierto número de genes de Physcomitrella
patens. Por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de
una población singular o mixta de microorganismos en condiciones
severas con una sonda que abarque una región de un gen de
Physcomitrella patens que es exclusivo de este organismo,
puede averiguarse si está presente dicho organismo.
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico
y de proteína de la invención pueden servir como marcadores para
regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el
mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de las
proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para
identificar la región del genoma a la cual se fija una proteína
particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens,
podría digerirse el genoma de Physcomitrella patens, e
incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA.
Aquellos fragmentos que fijan la proteína pueden sondarse
adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención,
con preferencia con marcadores fácilmente detectables. La fijación
de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del
genoma permite la localización del fragmento al mapa genómico de
Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces
con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la
secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Además,
las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser
suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines, con
lo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como
marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos
afines.
Las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la
invención son también útiles para estudios evolutivos y
estructurales de proteína. Los procesos metabólicos y de transporte
en los cuales participan las moléculas de la invención son
utilizados por una gran diversidad de células procariotas y
eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican
enzimas similares de otros organismos, puede estimarse la afinidad
evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este
tipo permite una estimación de cuáles son las regiones de la
secuencia que se conservan y cuáles no lo son, lo que puede ayudar
a la determinación de aquellas regiones de la proteína que son
esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de
determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y
puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la
proteína en términos de mutagénesis sin perder su función.
La manipulación de las moléculas de ácido
nucleico de PKSRP de la invención puede dar como resultado la
producción de PKSRPs que tienen diferencias funcionales de la PKSRP
de tipo salvaje. Estas proteínas pueden ser mejoradas en eficiencia
o actividad, pueden estar presentes en la célula en mayores números
que lo que es usual, o pueden verse reducidas en eficiencia o
actividad.
Existen varios mecanismos por los cuales la
alteración de una PKSRP de la invención puede afectar directamente a
la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de
plantas que expresan PKSRPs, el transporte incrementado puede
conducir a un reparto mejorado de sal y/o soluto en los tejidos y
órganos de la planta. Por aumento del número o la actividad de las
moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas desde la
célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la
sal.
El efecto de la modificación genética en las
plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la
tolerancia al estrés puede evaluarse por cultivo del microorganismo
modificado o la planta en condiciones inadecuadas y analizar luego
las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta.
Tales métodos de análisis son bien conocidos por un experto en la
técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas,
síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de
evapotranspiración, rendimiento de la planta en general y/o de la
cosecha, floración, reproducción, producción de semillas,
crecimiento de raíces, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis,
etc. (Aplicaciones de HPLC en Bioquímica en: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al.,
1993 Biotechnology, vol. 3, capítulo III: Recuperación y
purificación de productos, páginas 469-714, VCH:
Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988 Bioseparations:
downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons;
Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovey processes for
biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry,
J.D., 1988 Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, páginas
1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989)
Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes
Publications).
Por ejemplo, vectores de expresión en levadura
que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o
fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en
Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las
células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a
fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y
temperatura. Análogamente, vectores de expresión de plantas que
comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o
fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una
célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza,
maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos
estándar. Las células transgénicas resultantes y/o las plantas
derivadas de ellas pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o
alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y
temperatura.
La modificación por bioingeniería de uno o más
genes de PKSRP de la invención puede dar también como resultado
PKSRPs que tengan actividades alteradas que afectan indirectamente a
la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas,
plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como C.
glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del
metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de
productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno
reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos
procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito
nitra las cadenas laterales de la tirosina, desactivando con ello
algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves,
J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):
226-235). Si bien estos productos son excretados
típicamente, las células pueden alterarse genéticamente para
transportar más productos que lo que es típico para una célula de
tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más PKSRPs
de la invención que están involucradas en la exportación de
moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser
posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.
Adicionalmente, las secuencias descritas en esta
memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar
mutaciones de puesta fuera de combate
("knock-out") en los genomas de diversos
organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de
levadura, y células vegetales (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15:
39-48). Las células puestas fuera de combate
resultantes pueden investigarse luego en cuanto a su aptitud o
capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta
a diversas condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o
el genotipo de la mutación. Para otros métodos de desactivación de
genes véase la Patente U.S. No. 6.004.804
"Non-Chimeric Mutational Vectors", y Puttaraju
et al., 1999, "Spliceosome-mediated RNA
trans-splicing" as a tool for gene therapy, Nature
Biotechnology 17: 246-252.
Las estrategias de mutagénesis mencionadas
anteriormente para PKSRPs que dan como resultado una resistencia
incrementada al estrés no deben entenderse como limitantes;
variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para un
experto en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando
los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido
nucleico y proteína de la invención pueden utilizarse para generar
algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como
C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y
proteínas PKSRP mutadas tales que se mejora la tolerancia al
estrés.
Pueden proporcionarse también anticuerpos que se
fijan específicamente a una PKSRP, o una porción de la misma, tal
como es codificada por un ácido nucleico descrito en esta memoria.
Pueden producirse anticuerpos por muchos métodos bien conocidos
(véase, v.g. Harlow and Lane, "Antibodies; A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, Nueva York, (1988)). Resumidamente, un antígeno purificado
puede inyectarse en un animal en una cantidad y en intervalos
suficientes para provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos
pueden purificarse directamente, o pueden obtenerse células de bazo
del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea de
células inmortales e investigarse en cuanto a secreción de
anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para investigar
genotecas de clones de ácidos nucleicos para las células que
secretan el antígeno. Aquellos clones que dan resultado positivo
pueden secuenciarse luego. (Véase, por ejemplo, Kelly et al.,
1992, Bio/Technology 10: 163-167; Bebbington et
al., 1992, Bio/Technology 10: 169-175).
Las expresiones "se fija selectivamente" y
"se fija específicamente" con el polipéptido hacen referencia a
una reacción de fijación que es determinante de la presencia de la
proteína en una población heterogénea de proteínas y otras entidades
biológicas. Así, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los
anticuerpos especificados fijados a una proteína particular no se
fijan en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la
muestra. La fijación selectiva de un anticuerpo en tales condiciones
puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad
para una proteína particular. Pueden utilizarse una diversidad de
formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se fijan
selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan
rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar
anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase
Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold
Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción
de formatos y condiciones de inmunoensayo que podrían utilizarse
para determinar fijación selectiva.
En algunos casos, es deseable preparar
anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una
descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales
puede encontrarse en Stites et al., compiladores, "Basic
and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos,
Calif., 4ª Edición) y las referencias citadas en dicho lugar, y en
Harlow and Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Publications, Nueva York, 1988).
A lo largo de esta solicitud se hace referencia
a diversas publicaciones. La invención se ilustra adicionalmente por
los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse en modo alguno
como imposición de limitaciones en cuanto al alcance de la
misma.
Para este estudio, se utilizaron plantas de la
especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. procedentes de
la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad
de Hamburgo. Las mismas proceden de la cepa 16/14 recogida por
H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra),
que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J.
Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas
se efectuó por medio de esporas y por regeneración de los
gametofitos. El protonema se desarrolló a partir de la espora
haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en
cloroplastos, sobre el cual se formaron yemas al cabo de
aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que
llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, se
obtuvo el esporofito diploide con una seta corta y la cápsula de
esporas, en la cual maduraron las meiosporas.
El cultivo se efectuó en una cámara climatizada
a una temperatura del aire de 25ºC y una intensidad de luz de 55
micromoles^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente; Philips TL
65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se
modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con
Reski y Abel (1985; Planta 165: 354-358) o se
cultivó en medio Knop sólido utilizando agar oxoide al 1% (Unipath,
Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para aislamiento
de RNA y DNA se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los
protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a medio de
cultivo fresco.
Los detalles para el aislamiento del DNA total
se refieren al tratamiento de 1 gramo de peso fresco de material de
planta. Los materiales utilizados incluyen los tampones siguientes:
tampón CTAB: 2% (p/v) de bromuro de
N-cetil-N,N,N-trimetilamonio
(CTAB); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4M; EDTA 20 mM; tampón de
N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de
N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA
20 mM.
El material de planta se trituró bajo nitrógeno
líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a vasos
Eppendorf de 2 ml. El material de planta congelado se cubrió luego
con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón
CTAB, 100 \mul de tampón de N-laurilsarcosina, 20
\mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de
solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante 1
hora con agitación continua mediante sacudidas. El homogeneizado
obtenido se distribuyó en dos vasos Eppendorf (de 2 ml) y se extrajo
dos veces por agitación mediante sacudidas con el mismo volumen de
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases,
se efectuó una centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente
durante 15 minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC
durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado con hielo. El DNA
precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se
resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al.,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN
0-87969-309-6). Para
purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración final
1,2M) y se precipitó de nuevo a -70º durante 30 minutos utilizando
dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de
lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió
subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración
final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC y se
efectuó subsiguientemente la digestión con RNAsa a 37ºC durante 1
hora. El almacenamiento del DNA tuvo lugar a 4ºC.
Para la investigación de los materiales
transcritos, se aislaron tanto RNA total como RNA
poli(A)^{+}. El RNA total se obtuvo a partir de
protonemas de tipo salvaje de 9 días siguiendo el método GTC (Reski
et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244:
352-359). El RNA poli(A)^{+} se
aisló utilizando DynaBeads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las
instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de
determinar la concentración del RNA o del RNA
poli(A)^{+}, el RNA se precipitó por adición de 1/10
volúmenes de acetato de sodio 3M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol,
y se guardó a -70ºC.
Para construcción de la genoteca de cDNA, se
realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa
inversa del Virus de la Leucemia Murina (Roche, Mannheim, Alemania)
e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la
segunda cadena por incubación con DNA-polimerasa I,
enzima Klenow y digestión con RNAsaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1
hora), y 22ºC (1 hora). La reacción se paró por incubación a 65ºC
(10 minutos) y se transfirió subsiguientemente a hielo. Las
moléculas de DNA bicatenario se hicieron romas con
DNA-polimerasa T4 (Roche, Mannheim) a 37ºC (30
minutos). Los nucleótidos se separaron por extracción con
fenol/cloroformo y columnas rotativas Sephadex G50. Se ligaron
adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del
cDNA por medio de DNA-ligasa T4 (Roche, 12ºC, una
noche) y se fosforilaron por incubación con
polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos).
Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de
fusión bajo. Las moléculas de DNA mayores que 300 pares de bases se
eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en
columnas Elutip-D (Schleicher and Schuell, Dassel,
Alemania) y se ligaron a ramas vectoras, después de lo cual se
empaquetaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda
ZAP-Express utilizando el Kit Gigapack Gold
(Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) utilizando material y
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se utilizaron genotecas de cDNA como se describe
en el Ejemplo 3 para secuenciación del DNA de acuerdo con métodos
estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas
utilizando el kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt,
Alemania). La secuenciación aleatoria se llevó a cabo
subsiguientemente a la recuperación preparativa de plásmido a partir
de genotecas de cDNA por escisión másica in vivo,
retransformación, y extensión subsiguiente de DH10B sobre placas de
agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Amsterdam,
Países Bajos). Se preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de
E. coli desarrollados durante una noche, que crecían en medio
de Caldo Luria que contenía ampicilina (véase Sambrook et
al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN
0-87969-309-6) en un
robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con
los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de
secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes:
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' | SEQ ID NO: 40 | |
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3' | SEQ ID NO: 41 | |
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' | SEQ ID NO: 42 |
Las secuencias se procesaron y anotaron
utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX
proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich,
Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos
bioinformáticos importantes para caracterización funcional y
estructural de secuencias de proteínas. Para referencia se remite al
sitio de la web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos
más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA:
Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con
estimaciones de significación estadística; Pearson W.R. (1990)
Comparación de secuencias rápida y sensible con FASTP y FASTA.
Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: Very sensitive
sequence database searches with estimates of statistical
significance. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., y
Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular
Biology 215:403-10; PREDATOR:
High-accuracy secondary structure prediction from
single and múltiple sequences. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75%
accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins,
27:329-335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment.
Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W:
Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment
through sequence weighting, positions-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:
4673-4680; TMAP: Transmembrane region prediction
from multiply aligned sequiences. Persson, B. and Argos, P. (1994)
Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple
sequence alignments J. Mol. Biol. 237:182-192
ALOM2: Transmembrane regio prediction from single sequence Klein,
P., Kanehisa, M., and DeLisi, C. Prediction Biochim. Biophys. Acta
787:221-226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakari;
PROSEARCH: Detection of PROSITE protein sequence pattens. Kolakowski
L.F Jr., Leunissen J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: fast
searching of protein sequiences with regular expression pattens
related to protein structure and function. Biotechniques 13,
919-921; BLIMPS: Similarity searches against a
database of ungapped blocks. J.C. Wallace and Henikoff S., (1992);
PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and
block queries and databases, CAMBIOS 8:249-254.
Escrito por Bill Alford.
Los cDNAs parciales de Physcomitrella
patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se
identificaron en el programa de secuenciación EST de
Physcomitrella patens utilizando el programa
EST-MAX por análisis BLAST. Los Números de
Identificación de Secuencia correspondientes a estas ESTs son como
sigue: PK-6 (SEQ ID NO: 1), PK-7
(SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3),
PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID
NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3
(SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8),
MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID
NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11),
CPK-1 (SEQ ID NO: 12) y CPK-2 (SEQ
ID NO: 13).
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Para aislar los clones codificantes de
PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID
NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9
(SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18),
CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID
NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21),
MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID
NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24),
CPK-1 (SEQ ID NO: 25) y CPK-2 (SEQ
ID NO: 26) a partir de Physcomitrella patens, se crearon
genotecas de cDNA con el kit de Amplificación de cDNA SMART RACE
(Clontech Laboratories) siguiendo instrucciones del fabricante. Se
utilizó como molde RNA total aislado como se describe en el Ejemplo
3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento del RNA como
sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio
complementado con NaCl 1-M; Estrés por Frío: 4ºC
durante los mismos tiempos que en el caso de la sal; Estrés por
Sequía: los cultivos se incubaron sobre papel de filtro seco durante
los mismos tiempos que en el caso de la sal.
Se utilizaron las secuencias EST
PK-6 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID
NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9
(SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5),
CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID
NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3
(SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10),
MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID
NO: 12) y CPK-2 (SEQ ID NO: 13) identificadas por la
búsqueda en bases de datos como se describe en el Ejemplo 4, para
diseñar oligos para RACE (véase Tabla 15). Las secuencias extendidas
para estos genes se obtuvieron por realización de Amplificación
Rápida de la reacción en cadena de la polimerasa en los Extremos de
cDNA (RACE PCR) utilizando el kit Advantage 2 (Clontech
Laboratories) y el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech
Laboratories) utilizando un Termociclador Biometra T3 siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas a partir de
las reacciones RACE, correspondían a regiones codificantes de
longitud total de CC-2 y CC-3 y se
utilizaron para diseñar oligos para clonación de longitud total de
los genes respectivos (véase la amplificación de longitud total más
adelante).
Clones de longitud total correspondientes a
PK-6 (SEQ ID NO: 14), PK-7 (SEQ ID
NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9
(SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18),
CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID
NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21),
MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID
NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24),
CPK-1 (SEQ ID NO: 25) y CPK-2 (SEQ
ID NO: 26) se obtuvieron por realización de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos de genes (véase
Tabla 15) y la EST original como molde. Las condiciones para la
reacción fueron condiciones estándar con
DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó de
acuerdo con condiciones estándar y con protocolos del fabricante
(Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., Termociclador Biometra T3). Los parámetros para la
reacción fueron: 5 minutos a 94ºC seguidos por cinco ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Esto fue
seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1,5
minutos a 72ºC.
Los fragmentos amplificados se extrajeron de gel
de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se
ligaron en el vector TOPO pCR2.1 (Invitrogen) siguiendo
instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se
transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones
estándar (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y). Las células transformadas se seleccionaron
sobre agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido)
y 0,8 mg de IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactosido)
y se desarrollaron durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las
colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido
que contenía 100 \mug/ml de amplicilina y se dejaron crecer
durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el
Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo instrucciones del
fabricante. Los análisis de clones subsiguientes y el mapeado de
restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de
biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y).
El constructo plasmídico pACGH101 se digirió con
PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo
por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). Esto dio
como resultado un fragmento de vector con el promotor de
Arabidopsis Actin 2 con un intrón interno y el terminador
OCS3. Los iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII se
diseñaron como sigue:
El gen NPTII de 0,9 kilobases se amplificó por
PCR a partir de DNA del plásmido 2301 de pCambia [94ºC 60s, {94ºC
60s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) 60 s, 72ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10
min en máquina de Gradiente Biometra T], y se purificó por medio del
kit de Extracción de PCR Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El DNA de la PCR se subclonó luego en
el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante (constructo
NPT-Topo). Estas ligaciones se transformaron en
células Top10 (Invitrogen) y se dejaron crecer sobre placas LB con
50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante una noche a 37ºC. Se
utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50
\mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una
noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el estuche
Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció en ambas direcciones
5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis subsiguiente de
los datos de secuencia utilizando el soporte lógico VectorNTI reveló
la ausencia de errores de PCR presentes en la secuencia del gen
NPTII.
El constructo NPT-Topo se
digirió luego con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. El fragmento de 0,9 kilobases se
purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de
extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). El fragmento de inserción
Pst/Fse de NPT-Topo y el fragmento vector Pst/Fse de
pACGH101 se ligaron luego utilizando DNA-ligasa T4
(Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. La ligación se
transformó luego en células Top10 (Invitrogen) en condiciones
estándar, creando el constructo pBPSsc019. Se seleccionaron las
colonias sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y
se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Estas colonias se
utilizaron luego para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de
sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC.
El DNA plasmídico se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin
Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El constructo pBPSSC019 se digirió con KpnI y
BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
fragmento se purificó por medio de gel de agarosa y se extrajo luego
mediante el kit de extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo
con sus instrucciones, dando como resultado una casete
Act-NPT de 3 kilobases, que incluía el promotor
Actin 2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el
terminador OCS3.
El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI
(Roche) y se rellenó para hacer romos los extremos con enzima Klenow
y dNTPs (Roche) 0,1 mM de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Esto produjo un fragmento vector de 10,1 kilobases menos
la casete de Gentamicina, que se recircularizó por autoligación con
DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformó en células
Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar. Las células
transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50
\mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una
noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de
LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se
dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se
extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo
las instrucciones del fabricante. El plásmido recircularizado se
digirió luego nuevamente con KpnI (Roche) y se extrajo del gel de
agarosa por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
La inserción Act-NPT cortada con
Kpn y el vector recircularizado pBPSJH001 cortado con Kpn se ligaron
luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) y
se transformaron en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. El constructo resultante,
pBPSsc022, contenía ahora el Promotor Super, el gen GUS, el
terminador NOS, y la casete Act-NPT. Las células
transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50
\mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una
noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de
LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se
dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se
extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Después de la confirmación del
éxito de la ligación por medio de productos de digestión con
restricción el DNA plasmídico pBPSsc022 se propigó ulteriormente y
se recuperó utilizando el Kit Plasmid Midiprep (Qiagen) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos que contenían las diferentes
proteína-quinasas de Physcomitrella patens se
subclonaron a partir de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por
doble digestión con enzimas de restricción (véase la Tabla 16) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de la
subsecuencia se escindió del gel de agarosa con un Kit de Extracción
de gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante y se ligó en los vectores binarios pGMSG, se escindió con
XmaI y Ec1136II y se desfosforiló antes de la ligación. El pGMSG
recombinante resultante contenía el factor de transcripción
correspondiente en la orientación de sentido bajo el
super-promotor constitutivo.
A continuación se indican los nombres de los
diversos constructos de los factores de transcripción de
Physcomitrella patens utilizados para transformación de
plantas
Los vectores recombinantes se transformaron en
Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con
condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).
Se cultivaron y transformaron Arabidopsis
thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar
(Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris, 316: 1194-1199;
Bent et al. 1994, Science 265:
1856-1860).
Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo con
protocolos estándar (Xiong et al., 1999, Plant Molecular
Biology Reporter 17: 159-170). Las semillas se
extendieron sobre medios 1/2 Murashige y Skoog (MS)
(Sigma-Aldrich) de pH 5,7 con KOH, agar al 0,6% y se
complementaron con 1% de sacarosa, 0,5 g/l de ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES)
(Sigma-Aldrich), 50 \mug/ml de kanamicina
(Sigma-Aldrich), 500 \mug/ml de carbenicilina
(Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil
(Sigma-Aldrich). Las semillas se vernalizaron en las
placas durante cuatro días a 4ºC. Las semillas se dejaron germinar
en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y con
una intensidad luminosa de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo
fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo diurno de 16 horas de luz y
8 horas de oscuridad. Las plantas de semillero transformadas se
seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a medio 1/2 MS
de pH 5,7 con placas de agar al 0,6% en KOH complementadas con 0,6%
de agar, 1% de sacarosa, 0,5 g/l de MES
(Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil
(Sigma-Aldrich) y se dejó que se recuperaran durante
cinco-siete días.
Las plantas de semillero T1 se transfirieron a
papel de filtro seco estéril en una cápsula Petri y se dejaron
desecar durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en un Armario de
Cultivo Percieval MLR-350H, micromoles^{-lm2} (luz
blanca, tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se redujo luego la RH
a 60% y se desecaron ulteriormente las plantas de semillero durante
8 horas. Se retiraron luego las plantas de semillero y se pusieron
sobre placas de agar 0,6% MS 1/2 complementadas con 2 \mug/ml de
benomil (Sigma-Aldrich) y 0,5 g/l de MES
(Sigma-Aldrich), y se investigaron después de 5
días.
En condiciones de estrés por sequía, las plantas
PpPK-6 que sobreexpresaban Arabidopsis
thaliana exhibían una tasa de supervivencia de 95% (20
supervivientes de 21 plantas estresadas) a la investigación de
estrés; PpPK-8, 40% (2 supervivientes de 5 plantas
estresadas), PpPK-9, 78% (38 supervivientes de 49
plantas estresadas), PpCK-1, 50% (5 supervivientes
de 10 plantas estresadas), PpCK-2, 52% (16
supervivientes de 31 plantas estresadas), PpCK-3,
60% (3 supervivientes de 5 plantas estresadas),
PpMPK-2, 100% (52 supervivientes de 52 plantas
estresadas), PpMPK-3, 98% (44 supervivientes de 45
plantas estresadas), PpMPK-4, 92% (11 supervivientes
de 12 plantas estresadas), PpMPK-5, 100% (9
supervivientes de 9 plantas estresadas), PpCPK-1,
60% (12 supervivientes de 20 plantas estresadas),
PpCPK-2, 89% (17 supervivientes de 19 plantas
estresadas), mientras que el control sin transformar presentaba
solamente una tasa de supervivencia de 11% (1 superviviente de 9
plantas estresadas). Es de notar que los análisis de estas líneas
transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los
resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante
homocigótico fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron plantas de semillero a cápsulas
Petri que contenían 1/2 MS agar al 0,6% complementado con 2% de
sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de
semillero se incubaron a 4ºC durante 1 hora y se cubrieron luego con
hielo en virutas. Se pusieron luego las plantas de semillero en una
Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron
durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC, con disminución de la
temperatura a -1ºC por hora. Las plantas de semillero se incubaron
luego a -5,0ºC durante 24 horas y se dejaron descongelar luego a
5ºC durante 12 horas. El agua se separó por vertido y las plantas de
semillero se evaluaron al cabo de 5 días.
En condiciones de estrés por helada, las plantas
PPK-7 que sobreexpresaban Arabidopsis
thaliana presentaban una tasa de supervivencia de 73% (8
supervivientes de 11 plantas estresadas) a la investigación de
estrés; PpPK-9, 100% (45 supervivientes de 45
plantas estresadas), PpCK-1, 100% (14 supervivientes
de 14 plantas estresadas), PpMPK-2, 68% (36
supervivientes de 53 plantas estresadas), PpMPK-3,
92% (24 supervivientes de 26 plantas estresadas),
PpCPK-2, 64% (7 supervivientes de 11 plantas
estresadas), mientras que el control sin transformar exhibía
solamente una tasa de supervivencia de 2% (1 supervivientes de 48
plantas estresadas). Es de notar que los análisis de estas líneas
transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los
resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante
homocigótico fuerte.
Se transfirieron plantas de semillero a papel de
filtro impregnado en ½ MS y se pusieron sobre ½ MS con agar al 0,6%
complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior a la
investigación de la tolerancia a la sal. Para la investigación de la
tolerancia a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero
se llevó a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 50
mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro con
las plantas de semillero se llevó a pilas de papel de filtro
estéril, impregnadas con NaCl 200 mM, en una cápsula Petri. Al cabo
de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó
a tiras de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 600 mM en
una cápsula Petri. Al cabo de 10 horas, las plantas de semillero se
llevaron a cápsulas Petri que contenían ½ MS con agar al 0,6%
complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero
se investigaron después de 5 días.
Las plantas transgénicas se investigan respecto
a su tolerancia mejorada a la sal, demostrando que la expresión de
los transgenes confiere tolerancia a la sal.
Una hoja de una planta de Arabidopsis de
tipo salvaje y de una planta transgénica de Arabidopsis se
homogeneizaron en 250 \mul de tampón de bromuro de
hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4
M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM, pH 8,0) y 1 \mul de
\beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a
60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250
\mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron
enérgicamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos
a 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada muestra y se
añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se incubaron a la
temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante
10 minutos a 18.000 x g. Cada pelet se lavó con 70% de
etanol, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se utilizaron
4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR de 20 \mul
utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche
Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
El plásmido del vector binario con cada gen
clonado en el mismo se utilizó como control positivo, y como control
negativo se utilizó el DNA genómico C24 de tipo salvaje en las
reacciones PCR. Se analizaron 10 \mul de la reacción PCR en gel de
0,8% agarosa-bromuro de etidio.
PpPk-6: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,8 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
\newpage
PpPK-7: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
Los iniciadores se utilizaron en la primera
tanda de reacciones con el programa siguiente: 30 ciclos de 1 minuto
a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a
72ºC. Se generó un fragmento de 1,1 kb a partir del control positivo
y las plantas transgénicas T1.
PpPK-8: Los iniciadores
utilizados en las reacciones fueron:
El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,6 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpPK-9: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,4 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpCK-1: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,7 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpCK-2: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,9 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpCK-3: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,2 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpMPK-2: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,7 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpMPK-3: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,2 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpMPK-4: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,7 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpMPK-5: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,4 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpCPK-1: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,3 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
PpCPK-2: Los iniciadores
utilizados en las reacciones son:
El programa PCR era como sigue: 30 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10
minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,2 kb a partir del
control positivo y las plantas transgénicas.
Los transgenes se amplificaron con éxito a
partir de las líneas transgénicas T1, pero no del tipo salvaje C24.
Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al
menos una copia de los transgenes. No había indicación alguna de la
existencia de genes idénticos o muy similares en el control de
Arabidopsis thaliana sin 564transformar que pudo amplificarse
por este método.
La expresión de los transgenes se detectó
utilizando RT-PCR. El RNA total se aisló a partir de
plantas tratadas respecto a estrés utilizando un procedimiento
adaptado de (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362). Se
recogieron muestras de hojas (50-100 mg) y se
molieron hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido. El tejido
molido se resuspendió en 500 \mul de una mezcla 1:1 mantenida a
80ºC de fenol a tampón de extracción (LiCl 100 mM, Tris 100 mM de pH
8, EDTA 10 mM, 1% SDS), seguido por agitación enérgica breve para
mezclar. Después de la adición de 250 \mul de cloroformo, cada
muestra se agitó brevemente de modo enérgico. Se centrifugaron luego
las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. La fase acuosa superior
se llevó a un tubo Eppendorf nuevo. El RNA se precipitó por adición
de una décima parte de volumen de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes
de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se
dejaron en hielo durante 30 minutos. El RNA se redujo a un pelet por
centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el
sobrenadante y los pelets se secaron brevemente al aire. Los pelets
de la muestra de RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada
con DEPC. Para separar el DNA contaminante de las muestras, se trató
cada una con DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del RNA
total utilizando el kit de síntesis de cDNA de la primera cadena
(Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del
fabricante.
La amplificación por PCR de un fragmento de gen
específico del cDNA sintetizado se realizó utilizando
DNA-polimerasa Taq (Roche) e iniciadores
específicos del gen (véase Tabla 15 para los iniciadores) en la
reacción siguiente: 1X tampón PCR, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 \muM de
cada iniciador, 0,2 \muM de dNTPs, 1 unidad de polimerasa, 5
\mul de cDNA de la reacción de síntesis. La amplificación se
realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1
minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto,
35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, siempre.
Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1%, se
tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV
utilizando el sistema de documentación de gel
Quantity-One (Bio-Rad).
La expresión de los transgenes se detectó en la
línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes
se expresan en las líneas transgénicas y sugerían fuertemente que su
producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en
la línea transgénica. Por otra parte, no pudo detectarse por este
método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy
similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del
Ejemplo 7. Esto respalda sólidamente la afirmación de los inventores
de que la tolerancia al estrés observada es debida al transgén
introducido.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se realizó en las condiciones
siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC,
30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC,
5 minutos; mantenimiento, 4ºC, siempre. Los productos PCR se
corrieron sobre un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de
etidio y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de
documentación de gel Quantity-one
(Bio-Rad).
La expresión de los transgenes se detectó en la
línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes
se expresan en las líneas transgénicas y sugieren fuertemente que su
producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en
las líneas transgénicas. De acuerdo con la afirmación anterior, no
pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos
idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los
datos del Ejemplo 7.
Se utilizaron los constructos pBPSJyw022,
pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012, pBPSYyw
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar soja como se describe a continuación.
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar soja como se describe a continuación.
Se esterilizaron superficialmente semillas de
soja con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente
con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de
Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos con
agitación continua mediante sacudidas. A continuación, las semillas
se lavaron cuatro veces con agua destilada y se dejaron sobre papel
de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura
ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las
semillas, y se separaron los cotiledones del eje del embrión. Se
examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región
meristemática no estaba deteriorada. Los ejes del embrión escindidos
se recogieron en una cápsula Petri estéril
semi-abierta y se secaron al aire hasta un contenido
de humedad menor que 20% (peso fresco) en una cápsula Petri sellada
hasta su utilización posterior.
Se preparó un cultivo de Agrobacterium
tumefaciens a partir de una sola colonia en medio sólido LB más
antibióticos apropiados (v.g. 100 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/l
de kanamicina) seguido por crecimiento de la colonia simple en medio
LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. A
continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un pelet a 7000
rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se resuspendió en
medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con acetosiringona
100 \muM. Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio de
pre-inducción durante 2 horas a la temperatura
ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las
semillas cigóticas de soja a aproximadamente 15% de contenido de
humedad se embebieron durante 2 horas a la temperatura ambiente con
el cultivo de la suspensión de Agrobacterium
pre-inducida. Los embriones se separaron del cultivo
de imbibición y se transfirieron a cápsulas Petri que contenían
medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se incubaron
durante 2 días, en la oscuridad a la temperatura ambiente.
Alternativamente, los embriones se pusieron sobre papel de filtro
estéril húmedo (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se
incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después
de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o
líquido complementado con 500 mg/l de carbenicilina o 300 mg/ml de
cefotaximo para destruir las agrobacterias. El medio líquido se
utilizó para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se
incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol
m^{-2}s^{-1} y fotoperiodo de 12 horas. Una vez que las plantas
de semillero produjeron raíces, se transfirieron las mismas a suelo
Metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se eliminó
por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se
mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante una semana para
favorecer el proceso de aclimatación. Las plantas se transfirieron
luego a una sala de crecimiento donde se incubaron a 25ºC, bajo 150
\mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad luminosa y fotoperiodo de 12
horas durante aproximadamente 80 días.
Las plantas transgénicas se investigaron luego
respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de
acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7,
demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia
al estrés.
Se utilizaron los constructos pBPSJyw022,
pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012, pBPSYyw
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar colza/canola como se describe a continuación.
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar colza/canola como se describe a continuación.
El método de transformación de plantas descrito
en esta memoria es aplicable también a Brassica y otras
cosechas. Las semillas de canola se esterilizan superficialmente con
etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con
agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de
Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos, a
la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A
continuación, se lavan las semillas cuatro veces con agua destilada
y se ponen sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri
a la temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación, se
retiran las cubiertas de las semillas y se secan al aire las
semillas durante una noche en una cápsula Petri estéril
semi-abierta. Durante este periodo, las semillas
pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se guardan
luego las semillas a la temperatura ambiente en una cápsula Petri
sellada hasta su uso ulterior. Los constructos de DNA y la
imbibición de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10.
Las muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizan
por PCR para confirmar la presencia de T-DNA. Estos
resultados se confirman por hibridación Southern en donde el DNA se
somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se
transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente (Roche
Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Muestras PCR DIG
(Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina
por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante.
Las plantas transgénicas se investigan luego
respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método
de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la
expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.
Se utilizaron los constructos pBPSJyw022,
pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012, pBPSYyw
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar maíz como se describe a continuación.
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar maíz como se describe a continuación.
La transformación de maíz (Zea mays L.)
se realiza por el método descrito por Ishida et al. 1996.
Nature Biotch. 14745-50. Los embriones inmaduros se
co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que
lleva vectores "super-binarios", y las plantas
transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento
proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5%
y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego respecto a su
tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con
el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que
la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.
Se utilizaron los constructos pBPSJyw022,
pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012, pBPSYyw
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar trigo como se describe a continuación.
034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar trigo como se describe a continuación.
La transformación del trigo se realiza por el
método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotch.
14745-50. Los embriones inmaduros se
co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que
lleva vectores "super-binarios", y se recuperan
plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento
proporciona una eficiencia de transformación entre 2,5% y 20%. Las
plantas transgénicas se investigan luego respecto a su tolerancia
mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación
descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los
transgenes confiere tolerancia a la sequía.
Pueden utilizarse secuencias de genes para
identificar genes homólogos o heterólogos a partir de cDNA o
genotecas genómicas. Los genes homólogos (v.g., clones de cDNA de
longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico
utilizando por ejemplo genotecas de cDNA. Dependiendo de la
abundancia del gen de interés, 100.000 hasta 1.000.000 de
bacteriófagos recombinantes se extienden en placas y se transfieren
a membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, se
inmoviliza el DNA en la membrana mediante, v.g., reticulación por
UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta severidad.
En solución acuosa, la hibridación y el lavado se llevan a cabo a
una concentración iónica de NaCl 1M y una temperatura de 68ºC. Las
sondas de hibridación se generan mediante, v.g., marcación por
transcripción radiactiva de la mella (^{32}P) (High Prime, Roche,
Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por
autorradiografía.
Los genes parcialmente homólogos o heterólogos
que son afines pero no idénticos pueden identificarse de manera
análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de
hibridación y lavado a baja severidad. Para la hibridación acuosa,
la concentración iónica se mantiene normalmente a NaCl 1M mientras
que la temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42ºC.
El aislamiento de secuencias génicas con
homologías (o identidad/similitud de secuencias) únicamente en un
dominio diferenciado de (por ejemplo 10-20
aminoácidos) puede llevarse a cabo utilizando sondas
oligonucleotídicas sintéticas radiomarcadas. Los oligonucleótidos
radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo
5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con
polinucleótidoquinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se
reasocian y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros
bicatenarios se someten luego a radiomarcación mediante, por
ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se realiza
normalmente en condiciones de severidad baja utilizando
concentraciones altas de oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de hibridación de oligonucleótidos:
- 6 x SSC
- Fosfato de sodio 0,01M
- EDTA 1 mM (pH 8)
- 0,5% de SDS
- 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
- 0,1% de leche desnatada desecada.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la hibridación, la temperatura se reduce
gradualmente a 5-10ºC por debajo del valor Tm
estimado de los oligonucleótidos o hasta la temperatura ambiente
seguido por pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza
con severidad baja tal como tres pasos de lavado utilizando 4 x SSC.
Detalles ulteriores han sido descritos por Sambrook, J. et
al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994)
"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &
Sons.
Pueden utilizarse clones de
c-DNA para producir proteína recombinante por
ejemplo en E. coli (v.g. sistema pQE QIAexpress de Qiagen).
Las proteínas recombinantes se purifican luego normalmente por
afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA
(Qiagen). Las proteínas recombinantes se utilizan luego para
producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas
estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican
por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada
con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu et
al., 1994 BioTechniques 17: 257-262. El
anticuerpo puede utilizarse luego para investigar genotecas de
expresión de cDNA a fin de identificar genes homólogos o heterólogos
por una vestigación inmunológica (Sambrook, J. et al. (1989),
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
La mutagénesis in vivo de microorganismos
puede realizarse por paso de DNA plasmídico (u otro vector) a través
de E. coli u otros microorganismos (v.g., Bacillus
spp., o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae)
que están deteriorados en sus capacidades para mantener la
integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas
tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de DNA
(v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp, W.D.
(1996) DNA Repair Mechanisms, en: Escherichia coli and
Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington).
Tales cepas son bien conocidas por los expertos en la técnica. El
uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. and
Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La
transferencia de moléculas de DNA mutadas a plantas se realiza con
preferencia después de selección y ensayo en microorganismos. Se
generan plantas transgénicas de acuerdo con diversos ejemplos
comprendidos en la sección de ejemplos de este documento.
La determinación de las actividades y parámetros
cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los
experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima
alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica de la
enzima de tipo salvaje, lo que está perfectamente dentro de la
capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de enzimas
en general, así como detalles específicos concernientes a la
estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos
para la determinación de muchas actividades enzimáticas pueden
encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes:
Dixon, M., and Webb, E.C.,
(1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht,
(1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New
York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms.
Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens,
L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:
Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3^{rd}
ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H.,
(1994) Enzymkinetik, 2^{nd} ed. VCH: Weinheim (ISBN
3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., GraBl, M., eds
(1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^{rd}
ed., vol I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol.
A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.
La actividad de las proteínas que se fijan a DNA
puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como los
ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también
ensayos de retardación en gel). El efecto de tales proteínas sobre
la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de
genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et
al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las
referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de ensayo de genes
informadores son bien conocidos y están bien establecidos para
aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando
enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína
fluorescente verde, y varias otras.
La determinación de la actividad de las
proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con
técnicas tales como las descritas en Gennis R.B. Pores, Channels and
Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp.
85-137, 199-234 y
270-322, Springer: Heidelberg (1989).
La recuperación del producto deseado a partir de
material de plantas (es decir, Physcomitrella patens o
Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de
C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con
las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el
sobrenadante de los cultivos arriba descritos puede realizarse por
diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto
deseado no es secretado por las células, puede recogerse del cultivo
por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse
por técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o tratamiento por
ultrasonidos. Los órganos de las plantas pueden separarse
mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la
homogeneización, se separan por centrifugación los residuos
celulares, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas
solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto
deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas,
entonces las células se separan del cultivo por centrifugación a
baja velocidad, y la fracción sobrenadante se retiene para
purificación ulterior.
La fracción sobrenadante de cualquier método de
purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en
donde la molécula deseada es retenida sobre una resina
cromatográfica mientras que muchas de las impurezas contenidas en la
muestra no lo son, o donde las impurezas son retenidas por la resina
mientras que la muestra no lo es. Dichos pasos de cromatografía
pueden repetirse en caso necesario, utilizando las mismas o
diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría
perfectamente versado en la selección de resinas cromatográficas
apropiadas y en su aplicación más eficaz para la purificación de una
molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por
filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la
cual se maximiza la estabilidad del producto.
Existe una extensa serie de métodos de
purificación conocidos en la técnica y el método precedente de
purificación no debe interpretarse como limitante. Dichas técnicas
de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. &
Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals,
McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la
identidad y pureza de los compuestos aislados pueden investigarse
por métodos estándar en la técnica. Éstos incluyen cromatografía
líquida de alta eficiencia (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos
de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático,
o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis han sido revisados
en:
Patek et al., 1994 Appl. Environ.
Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al.,
1996 Biotekhnologiya 11:27-32; And Schmidt
et al., 1998 Bioprocess Engineer.
19:67-70 Ulmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90,
p. 521-540, p. 540-547, p.
559-566, 575-581 and p.
581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An
Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons;
Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry
in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol
17.
<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS
PROTEÍNA-QUINASA RELACIONADAS CON EL ESTRÉS Y
MÉTODOS DE UTILIZACIÓN EN LAS PLANTAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 16313-0036
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/11435
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-04-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/196,001
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222>()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, a, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 651
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phyecomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (608)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2,86cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (619)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a,t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)
<223 > a, t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (612)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 953
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
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<220>
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (610)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c, g, otra o desconocida
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (923)
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<223> a, t, e, g, otra o desconocida
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1143)
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<223> a, t, c, g, otra o desconocida
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1385)
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<223> a, t, c, g, otra o desconocida
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<213> Physcomitrella patens
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<213> Physcomitrella patens
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<212> DNA
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<213> Physcomitrella patens
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<213> Physcomitrella patens
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<212> PRT
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<213> Physcomitrella patens
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<213> Physcomitrella patens
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<212> PRT
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<213> Physcomitrella patens
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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Artificial: Iniciador
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
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<223> Descripción de la Secuencia
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\hfill30
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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<223> Descripción de la Secuencia
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcaggcta ctttgcgtgg agcac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtgctggc taacaccagg ccaga
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgggca acgagaagca ttcgagatgg c
\hfill31
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgttaacga gcatcacgat actcggtgat ttc
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggcatct ctcccgatgt tctta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaactga aggcgtgtca tgatc
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgagggct cgttcaccgt gacct
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaggtaac agtagtcagg ctgctc
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcgaccct tccacgcatc agcat
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctccaggaa gcctgcgccg agaag
\hfill25
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<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacattgtc cgtgatcagc aatcga
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcctctgg aacaaccaga cgctg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcaccgcga ggtacaagcc accac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagctctgg agctctgtac cacct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggccacgt cgagaatctg agcaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaagtgctc gcaagcaatg ccgaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgggcg gtcgagtcgt attaggtgtt gtttc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagctccggt aggtccgacc tcttcaattg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcaactgt caatagcaga cctgga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagtccca acgaacgtgt ctcgct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagatga cgactgctat tgcga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgatgact ccaatgctcc atacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagcatcg aggtcagtat ccggtgt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgtggcc ttcagaggcg catcctc
\hfill27
Claims (29)
1. Una célula de planta transgénica transformada
por un ácido nucleico codificante de una Proteína
Proteína-Quinasa Relacionada con el Estrés (PKSRP),
en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un
polipéptido como se define en SEQ ID NO: 27 y un polipéptido que
tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido de
SEQ ID NO: 27 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido
nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia
incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la
planta.
2. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde la PKSRP se define en SEQ ID NO: 27.
3. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se
define en SEQ ID NO: 14.
4. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP
tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con
la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 14 en toda su región
codificante.
5. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde la planta es una monocotiledónea.
6. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde la planta es una dicotiledónea.
7. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo
constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz,
cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento,
girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena,
tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té,
especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierba perenne y
cosechas forrajeras.
8. Una planta transgénica que comprende una
célula vegetal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
9. Una semilla producida por una planta
transgénica que comprende una célula vegetal de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la
semilla es mejora genética auténtica para una tolerancia
incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de
tipo salvaje de la célula de la planta.
10. Uso de una planta transgénica de acuerdo con
la reivindicación 8 o una semilla de acuerdo con la reivindicación 9
para la fabricación de un producto agrícola.
11. Una Proteína
Proteína-Quinasa aislada Relacionada con el Estrés
(PKSRP) en donde la PKSRP se selecciona del grupo constituido por
Proteína-Quinasa-6
(PK-6) como se define en SEQ ID NO: 27 y un
polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el
polipéptido de SEQ ID NO: 27 en toda su longitud, y en donde la
expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una
tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía en
comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.
12. La PKSRP aislada de la reivindicación 11, en
donde la PKSRP se define en SEQ ID NO: 27.
13. Un ácido nucleico codificante de una
Proteína Proteína-Quinasa Relacionada con el Estrés
(PKSRP) aislado, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se
selecciona del grupo constituido por PK-6 como se
define en SEQ ID NO: 14 y una secuencia que tiene al menos
80-90% de identidad de secuencia con la secuencia
del polinucleótido de SEQ ID NO: 14 en toda su región
codificante.
14. El ácido nucleico codificante de PKSRP
aislado de la reivindicación 13, en donde el ácido nucleico
codificante de PKSRP se define en SEQ ID NO: 14.
15. Un vector de expresión recombinante aislado
que comprende un ácido nucleico de las reivindicaciones 13 ó 14, en
donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da
como resultado una tolerancia incrementada de la célula hospedadora
al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje
de la célula hospedadora.
16. Un método de producción de una planta
transgénica que contiene un ácido nucleico codificante de una
Proteína Proteína-Quinasa Relacionada con el Estrés
(PKSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da
como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés
por sequía en comparación con una variedad del tipo salvaje de la
planta, que comprende,
- a.
- transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y
- d.
- generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,
en donde la PKSRP se selecciona del
grupo constituido por
Proteína-Quinasa-6
(PK-6) como se define en SEQ ID NO: 27 y un
polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el
polipéptido de SEQ ID NO: 27 en toda su
longitud.
17. El método de la reivindicación 16, en donde
la PKSRP se define en SEQ ID NO: 27.
18. El método de la reivindicación 16, en donde
el ácido nucleico codificante de PKSRP se define en SEQ ID NO:
14.
19. El método de la reivindicación 16, en donde
el ácido nucleico codificante de PKSRP tiene al menos
80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de
polinucleótidos de SEQ ID NO: 14 en toda su región codificante.
20. Un método para modificar la tolerancia al
estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una
Proteína Proteína-Quinasa Relacionada con el Estrés
(PKSRP) en la planta, en donde la PKSRP se selecciona del grupo
constituido por Proteína-Quinasa-6
(PK-6) como se define en SEQ ID NO: 27 y de un
polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el
polipéptido de SEQ ID NO: 27 en toda su longitud, y en donde la
modificación de la expresión del ácido nucleico de PKSRP en la
planta da como resultado una tolerancia modificada en la planta al
estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de
la planta.
21. El método de la reivindicación 20, en donde
la PKSRP se define en SEQ ID NO: 27.
22. El método de la reivindicación 20, en donde
el ácido nucleico codificante de PKSRP se define en SEQ ID NO:
14.
23. El método de la reivindicación 20, en donde
el ácido nucleico codificante de PKSRP tiene al menos
80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de
polinucleótidos de SEQ ID NO: 14 en toda su región codificante.
24. El método de la reivindicación 20, en donde
la tolerancia al estrés se reduce.
25. El método de la reivindicación 20, en donde
la planta no es transgénica.
26. El método de la reivindicación 20, en donde
la planta es transgénica.
27. El método de la reivindicación 26, en donde
la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de
la PKSRP.
28. El método de la reivindicación 27, en donde
el promotor es específico de tejido.
29. El método de la reivindicación 27, en donde
el promotor está regulado evolutivamente.
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