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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft allgemein Nukleinsäuresequenzen, die Proteine
kodieren, welche mit abiotischen Stressantworten und abiotischer
Stresstoleranz in Pflanzen im Zusammenhang stehen. Die Erfindung betrifft
insbesondere Nukleinsäuresequenzen,
die Proteine kodieren, welche Pflanzen Toleranz gegenüber Trockenheit
und/oder Kälte
verleihen.
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Hintergrund
des Fachgebiets
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Abiotischer
Umweltstress, wie beispielsweise Trockenheitsstress, Salzgehaltstress,
Hitzestress und Kältestress,
sind Hauptfaktoren, welche Pflanzenwachstum und Produktivität begrenzen.
Ernteausfälle
und Ertragsverluste der Ernte der wichtigsten Getreidesorten, wie
beispielsweise Reis, Mais und Weizen, die durch solche Arten von
Stress verursacht werden, stellen einen bedeutenden ökonomischen
und politischen Faktor dar und tragen zur Nahrungsmittelknappheit
in vielen unterentwickelten Ländern
bei.
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Pflanzen
sind während
ihres Lebenszyklus typischerweise Bedingungen eines verminderten
Umgebungswassergehalts ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien
entwickelt, um sich selbst gegen diese Austrocknungsbedingungen
zu schützen.
Wenn Dauer und Schwere der Trockenheitsbedingungen jedoch zu extrem
sind, so sind die Auswirkungen auf die Pflanzenentwicklung, Wachstum
und Ausbeute der meisten Erntepflanzen gravierend. Außerdem sind
die meisten Erntepflanzen sehr empfindlich gegenüber höheren Salzkonzentrationen im
Boden. Eine andauernde Aussetzung gegen Trockenheit und hohen Salzgehalt
verursacht bedeutende Veränderungen
des Pflanzenmetabolismus. Diese bedeutenden Veränderungen des Metabolismus
führen
letztendlich zum Zelltod und folglich zu Ertragsverlusten.
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Die
Entwicklung von stresstoleranten Pflanzen ist eine Strategie, die
das Potenzial besitzt, wenigstens einige dieser Probleme zu lösen oder
zu mildem. Traditionelle Pflanzenzuchtstrategien für die Entwicklung neuer
Pflanzenlinien, die Resistenz (Toleranz) gegenüber diesen Arten von Stress
aufweisen, sind jedoch relativ langsam und es sind spezielle resistente
Linien für
die Kreuzung mit der gewünschten
Linie erforderlich. Die begrenzten Ressourcen an Protoplasma für Stresstoleranz
und die Inkompatibilität
der Kreuzung von entfernt verwandten Pflanzenspezies stellen signifikante
Probleme dar, die bei der herkömmlichen
Züchtung
auftreten. Außerdem
sind die zellulären
Vorgänge,
die zu Trockenheits-, Kälte-
und Salztoleranz im Modell, in trockenheits- und/oder salztoleranten
Pflanzen führen,
komplex und schließen
multiple Mechanismen der zellulären
Anpassung und zahlreiche Metabolismuswege ein. Aufgrund dieses mehrteiligen
Charakters der Stresstoleranz ist nicht nur das Züchten der
Toleranz weitgehend erfolglos gewesen, Sonden auch die Möglichkeit, stresstolerante
Pflanzen unter Verwendung von biotechnologischen Verfahren gentechnisch
zu erzeugen, begrenzt.
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Erforderlich
ist daher die Identifizierung von Genen und Proteinen, die in diesen
Mehrkomponenten-Prozessen, die zu Stresstoleranz führen, beteiligt
sind. Die Bestimmung der Funktion von Genen, die in stresstoleranten
Pflanzen exprimiert werden, wird nicht nur unser Verständnis der
pflanzlichen Anpassung und Toleranz gegenüber Umweltstress verbessern,
sondern auch wichtige Informationen für den Entwurf neuer Strategien
zur Verbesserung von Nutzpflanzen bereitstellen.
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Eine
Gruppe von Proteinen, die mit Stressantworten in Pflanzen und Tieren
im Zusammenhang zu stehen scheinen, sind Proteine, die mit Zellteilung
und dem Zellzyklus in Beziehung stehen. Anzeichen für diese Verwandtschaft
liegen in der Tatsache, dass unterschiedliche Arten von Umweltstress
bezüglich
Wassergehalt des Erdbodens, Auflicht und variierender Blatttemperatur
jeweils zu einer Veränderung
der Zellteilungsrate führen.
Beispielsweise erfolgt in Sonnenblumenblättern in Verbindung mit Stress
und Alterung eine Verlängerung
des Zellzyklus. Zellen in den Sonnenblumenblättern tendieren dazu, auf der
G1-Phase des Zellzyklus anzuhalten, wobei keine Veränderung
der Dauer der S-G2-M-Phasen des Zellzyklus erfolgt. Ähnliche
Beobachtungen wurden bei anderen Pflanzenspezies gemacht, die Umweltstress,
wie beispielsweise Saccharosemangel, (Van't Hof 1973 Bookhaven Symp. 25: 152),
oxidativem Stress (Reichheld et al. 1999 Plant J. 17: 647) und Wassermangel
(Schuppler et al. 1998 Plant Physiol. 117: 667) ausgesetzt wurden.
Diese Beobachtungen und Ergebnisse lassen vermuten, dass es einen
wichtigen „Kontrollpunkt" in der Regulierung
des Zellzyklus bei dem G1-S-Übergang
gibt, während
andere Studien einen anderen „Kontrollpunkt" bei dem G2-M-Übergang
mit einem Halt der Zellen in der G2-Phase nahelegen. Es wurde außerdem festgestellt,
dass die Temperatur die Dauer aller Zellzyklusphasen in einem ähnlichen
Maß beeinflusst,
ohne bevorzugtes Anhalten in irgendeiner bestimmten Phase des Zellzyklus
(Tardieu und Granier, 2000 Plant Mol. Biol. 43: 555). Obwohl sich
diese zuvor genannten Antworten auf Umweltstress unterscheiden,
zeigen alle diese Ergebnisse die Zusammenschaltung des Stressantwortsystems
dieser Pflanzen und der Zellteilungsproteine darin.
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Im
Fachbereich werden verschiedene Proteine beschrieben, die mit Zellteilung
und dem Zellzyklus im Zusammenhang stehen. Ein solches Protein oder
Proteinkomplex ist der Cyclin-CDK-Komplex, der die Progression der
Zellzyklusphasen kontrolliert. Cyclinabhängige Proteinkinasen (CDKs)
benötigen
Cyclinbindung für
die Aktivität
und ihre Mitwirkung an den Kontrollpunken des eukaryotischen Zellzyklus
ist heute weithin anerkannt. Die weitreichende Bedeutung von CDKs
wurde vor fast zehn Jahren anhand unabhängiger genetischer Ansätze in Hefe
und biochemischer Untersuchungen mitotischer Kontrollen in befruchteten
Eiern von Meeressäugern
erkannt.
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Eine
bekannte Komponente eines CDK-Komplexes ist ein Cdc2-Protein namens
P34cdc2, das an beiden Kontrollpunkten (G1-S
und G2-M) benötigt
wird. Verschiedene andere Cdc2-Homologe sind aus Menschen und aus
Pflanzenspezies einschließlich
Hefe isoliert worden. Eine solches Hefe-Homologon ist Cdc48, welches
in der Spindel-Polkörperchen-Trennung
in Saccharomyces cerevisiae eine Rolle spielt. Eine anderes Cdc2-Homologon
ist in Arabidopsis beschrieben worden (Feiler et al. 1995 EMBO J
14: 5626), welches in den proliferierenden Zellen der vegetativen
Triebe, Wurzeln, Blütenstände und
Blüten
und in rasch wachsenden Zellen stark exprimiert ist. Das Arabidopsis
Cdc48-Gen ist in den sich entwickelnden Mikrosporen und Samenanlagen aufreguliert
und in den meisten differenzierten Zelltypen herunterreguliert.
Außerdem
ist dieses Gen im Kern und während
der Cytokinese zu Fragmoplasten lokalisiert worden.
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Eine
weitere Gruppe von Proteinen, die an Zellteilung und dem Zellzyklus
beteiligt sind, sind pRB-Proteine. Es gibt zunehmende Anzeichen
dafür,
dass pRB-ähnliche
Proteine in Pflanzen unter den nuklearen Zielen von Pflanzen-CDKs
sein könnten.
In Säugern
spielt das pRB eine zentrale Rolle in der Regulierung des G1-zu-S-Übergangs.
Durch Phosphorylierung von Säuger-pRB
mittels Cyclin D- und Cyclin E-abhängigen Kinasen wird das pRB
inaktiviert und dabei die S-Phase unterdrückt und die DNA-Replikation
gefördert.
Bedeutenderweise ist das pRB-bindende Motiv LXCXE (worin X eine
beliebige Aminosäure
bedeutet) in allen bekannten pflanzlichen D-Cyclinen vorzufinden.
In Pflanzen wurden LXCXE-abhängige
Wechselwirkungen zwischen D-Cyclinen
von Arabidopsis und Mais-pRB-Proteinen in vitro und in einem Hefe
Zwei-Hybrid-Assay nachgewiesen.
Die Rolle von pRBs in der pflanzlichen Zellteilung im Zusammenhang
mit Signalkaskaden wird weiter durch die Tatsache gestützt, dass
verschiedene pRBs und insbesondere das Mais-pRB mehrfache putative
CDK-Phosphorylierungsstellen
aufweisen und in vitro durch G1- und S-spezifische Säuger-CDKs effizient phosphoryliert
werden. Es ist auch bekannt, dass Mais-pRB-Proteine Veränderungen
durchlaufen bei der Phosphorylierung während des Übergangs zur Endoreduplikation
in dem Endosperm. Die Phosphorylierung durch pflanzliche CDKs ist
jedoch noch nachzuweisen.
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Obwohl
also verschiedene pflanzliche Zellzyklusproteine aufgeklärt wurden,
müssen
die Signaltransduktionskaskaden des pflanzlichen Zellzyklus im Fachbereich
noch im Detail beschrieben werden. Im Stand der Technik wird auch
die Beziehung zwischen pflanzlichen Zellzyklusproteinen und der
Antwort einer Pflanze auf Umweltstress, so dass eine stresstolerante
Pflanze erzeugt werden kann, nicht beschrieben. Dementsprechend
besteht ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die in stresstoleranten
Pflanzen exprimiert werden, welche die Fähigkeit besitzen, ihrer Wirtspflanze
und anderen Pflanzenspezies Stressresistenz zu verleihen. Neu erzeugte
stresstolerante Pflanzen werden zahlreiche Vorteile aufweisen, wie
z.B. eine Ausweitung des Bereichs, in dem Nutzpflanzen angebaut
werden können,
indem beispielsweise der Wasserbedarf einer Pflanzenspezies verringert
wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese
Erfindung erfüllt
zum Teil das Erfordernis, neue einzigartige Zellzyklusproteine zu
identifizieren, die dazu in der Lage sind, bei Überexpression Pflanzen Toleranz
gegenüber
Trockenheits- und/oder Froststress zu verleihen. Die vorliegende
Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer
für ein stressbezogenes
Zellzyklusprotein (CCSRP) kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, welche
ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus CC-1, wie in SEQ ID NO: 7 definiert,
und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu SEQ
ID NO: 7 über
seine Gesamtlänge,
wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle
zu erhöhter
Toleranz gegenüber
Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle
führt.
Hierin beschrieben sind die Zellzyklusproteine 1) Zellzyklus-1 (CC-1); 2) Zellzyklus-2
(CC-2) und 3) Zellzyklus-3 (CC-3), jeweils aus Physcomitrella patens.
CC-2 und CC-3 sind nicht Gegenstand der Erfindung.
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Die
Erfindung sieht in einigen Ausführungsformen
vor, dass das CCSRP und die kodierende Nukleinsäure in Mitgliedern der Gattung
Physcomitrella vorkommen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind
die Nukleinsäuren
und Proteine jeweils aus einer Physcomitrella patens. Die Erfindung
sieht vor, dass der Umweltstress Trockenheit oder kalte Temperatur
ist.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen
Pflanze produziert ist, die mit einer ein CCSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert
ist, wobei die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress
im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Die Erfindung
stellt ferner ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen Pflanze,
die ein CCSRP exprimiert, erzeugt ist, wobei die Pflanze reinrassig
ist für
erhöhte
Toleranz gegenüber
Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze.
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Die
Erfindung stellt ferner ein landwirtschaftliches Produkt bereit,
welches durch eine beliebige der nachstehend beschriebenen transgenen
Pflanzen, Pflanzenteile oder des Saatgut erzeugt ist. Die Erfindung stellt
ferner ein isoliertes CCSRP bereit, wie nachstehend beschrieben.
Die Erfindung stellt ferner eine isolierte CCSRP kodierende Nukleinsäure bereit,
wobei die CCSRP kodierende Nukleinsäure für ein CCSRP wie es nachstehend
beschrieben ist, kodiert.
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Die
Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor
bereit, umfassend eine CCSRP kodierende Nukleinsäure, wie nachstehend beschrieben,
wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz
gegenüber
Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle
führt.
Die Erfindung stellt ferner eine Wirtszelle, welche den Vektor enthält und eine
Pflanze, welche die Wirtszelle enthält, bereit.
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Die
Erfindung stellt ein ferner ein Verfahren zur Herstellung einer
transgenen Pflanze mit einer CCSRP kodierenden Nukleinsäure bereit,
worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer
im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze erhöhten Toleranz
gegenüber
Umweltstress führt,
umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor,
umfassend eine CCSRP kodierende Nukleinsäure, und (b) Erzeugen einer
transgenen Pflanze mit erhöhter
Toleranz gegenüber
Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze
aus der Pflanzenzelle. Das CCSRP und die CCSRP kodierende Nukleinsäure sind
nachstehend beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifizierung der
Trockenheits- und/oder
Froststresstoleranz einer Pflanze bereit, welche das Modifizieren
der Expression eines CCSRP in der Pflanze umfassen, worin das CCSRP
wie nachstehend beschrieben ist. Die Erfindung sieht vor, dass dieses
Verfahren derart durchgeführt
werden kann, dass die Trockenheits- und/oder Froststresstoleranz
erhöht
wird. Vorzugsweise wird die Trockenheits- und/oder Froststresstoleranz
in einer Pflanze durch Steigerung der Expression eines CCSRP erhöht.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 (A–C)
zeigen die partiellen cDNA-Sequenzen von CC-1 (SEQ ID NO: 1), CC-2
(SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ ID NO: 3) aus Physcomitrella patens.
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2 (A–C)
zeigen die Volllängen-cDNA-Sequenzen
von CC-1 (SEQ ID NO: 4), CC- 2
(SEQ ID NO: 5) und CC-3 (SEQ ID NO: 6) aus Physcomitrella patens.
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3 (A–H)
zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
von CC-1 (SEQ ID NO: 7), CC-2 (SEQ ID NO: 8) und CC-3 (SEQ ID NO:
9) aus Physcomitrella patens.
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4 zeigt
ein Diagramm des pflanzlichen Expressionsvektors ppBPSsc022, welcher
den Superpromotor enthält,
der die Expression von SEQ ID NO: 4, 5 und 6 steuert („Gewünschtes
Gen"). Die Komponenten sind:
NPTII Kanamycin-Resistenz-Gen, ATAct2-i Promoter, OCS3 Terminator,
NOSpA Terminator (Jefferson et al., 1987 EMBO J 6: 3901–7).
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5 zeigt
die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen,
welche PpCC-1 überexprimieren
und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen
toleranten Phänotyp.
Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
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6 zeigt
die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit transgenen Pflanzen,
welche PpCC-1 überexprimieren
und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen
toleranten Phänotyp.
Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
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7 zeigt
die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen,
welche PpCC-2 überexprimieren
und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen
toleranten Phänotyp.
Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
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8 zeigt
die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen,
welche PpCC-3 überexprimieren
und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen
toleranten Phänotyp.
Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist durch die folgende ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
und die enthaltenen Beispiele leichter verständlich Selbstverständlich dient
die hierin verwendete Terminologie nur der Beschreibung spezieller
Ausführungsformen
und soll nicht einschränkend
verstanden werden. Insbesondere schränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen
als „stressbezogene
Zellzyklusproteine" (CCSRPs)
die Funktionalität
dieser Sequenzen in keiner Weise ein. Gemäß der Erfindung ist CCSRP ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus CC-1, wie es in SEQ ID NO: 7 definiert
ist, und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu SEQ
ID NO: 7 über
seine gesamte Länge.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit,
welche mit einer CCSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, worin
die Expression der Nukleinsäuresequenz
in der Pflanzenzelle zu erhöhter
Toleranz gegenüber
Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle führt. Die Erfindung
stellt ferner transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen bereit,
welche die hierin beschriebenen Pflanzenzellen enthalten. Ebenfalls
bereitgestellt wird ein pflanzliches Saatgut, welches von einer
transgenen Pflanze produziert ist, die mit einer CCSRP kodierenden
Nukleinsäure
transformiert ist, worin das Saatgut die CCSRP kodierende Nukleinsäure enthält und worin
die Pflanze reinrassig ist für
erhöhte
Toleranz gegenüber Umweltstress,
im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Ferner stellt
die Erfindung ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen Pflanze
produziert ist, die ein CCSRP exprimiert, wobei das Saatgut das
CCSRP enthält
und worin die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress,
im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Die Erfindung
stellt außerdem
ein landwirtschaftliches Produkt bereit, das durch beliebige der
nachstehend beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und
Pflanzensaatgut hergestellt ist.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Varietät" auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb
einer Spezies, die gemeinsame konstante Merkmale aufweisen, welche
sie von der typischen Form und von anderen möglichen Varietäten innerhalb
dieser Spezies unterscheiden. Während
eine Varietät
wenigstens ein unterscheidendes Merkmal aufweist, zeichnet sie sich
auch durch eine gewisse Variation zwischen Individuen innerhalb
der Varietät
aus, vorrangig auf Grundlage der Mendelschen Segregation von Merkmalen
unter den Abkömmlingen
nachfolgender Generationen. Eine Varietät wird als „reinrassig" für ein bestimmtes
Merkmal angesehen, wenn sie für
dieses Merkmal genetisch homozygot ist, in einem solchen Ausmaß, dass
dann, wenn die reinrassige Varietät selbst-befruchtet wird, kein
signifikantes Ausmaß unabhängiger Segregation
des Merkmals unter den Abkömmlingen
beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung ist das Merkmal auf
die transgene Expression einer oder mehrerer der in eine Pflanzenvarietät eingebrachen
DNA-Sequenzen zurückzuführen.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt erstmals das Physcomitrella patens
CCSRP. CC-1 ist
geeignet zur Steigerung der Toleranz einer Pflanze gegenüber Umweltstress.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung isolierte CCSRPs
bereit, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Zellzyklus-1 (CC-1) Protein,
wie es in SEQ ID NO: 7 definiert ist, und Homologen und Orthologen
davon. Homologe und Orthologe der Aminosäuresequenzen sind nachstehend
definiert.
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Die
erfindungsgemäßen CCSRPs
werden vorzugsweise über
rekombinante DNA-Techniken
hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, welches das Protein kodiert,
in einen Expressionsvektor kloniert (wie nachstehend beschrieben),
der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingebracht (wie nachstehend
beschrieben) und das CCSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das
CCSRP kann dann aus den Zellen über
ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von Standardtechniken
der Proteinreinigung isoliert werden. Alternativ zu der rekombinanten
Expression kann ein CCSRP Polypeptid oder Peptid chemisch synthetisiert
werden, unter Verwendung von Standardtechniken der Peptidsynthese.
Außerdem
kann natives CCSRP aus Zellen isoliert werden (z.B. Physcomitrella
patens), beispielsweise unter Verwendung eines anti-CCSRP Antikörpers, der
durch Standardtechniken unter Verwendung eines CCSRPs oder eines
Fragments davon hergestellt werden kann.
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Die
Erfindung stellt ferner eine isolierte CCSRP kodierende Nukleinsäure bereit.
Die CCSRP kodierende Nukleinsäure
ist ausgewählt
aus einer Zellzyklus-1 (CC-1) Nukleinsäure, wie in SEQ ID NO: 4 definiert.
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Homologe
und Orthologe der Nukleotidsequenzen sind nachstehend definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Nukleinsäure
und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert.
In einer anderen bevorzugten Pflanzengattung stammen Nukleinsäure und
Protein jeweils aus einer Physcomitrella patens (P. patens)-Pflanze.
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Wie
hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Umweltstress" beliebige suboptimale
Wachstumsbedingungen und beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf
suboptimale Bedingungen bezüglich
Salzgehalt, Trockenheit, Temperatur, Metall, Chemikalien, pathogene
und oxidative Stressarten oder Kombinationen davon. Bei dem beanspruchten
Gegenstand der Erfindung handelt es sich bei Umweltstress um geringen
Wassergehalt oder niedrige Temperatur. Es ist außerdem selbstverständlich,
dass, wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, „ein" oder „eine" ein oder mehrere
bedeuten kann, abhängig
von dem Zusammenhang, in dem es verwendet wird. Wenn beispielsweise
auf „eine
Zelle" Bezug genommen
wird, so kann das bedeuten, dass wenigstens eine Zelle verwendet
werden kann.
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Wie
ebenfalls hierin verwendet, sollen die Bezeichnungen „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B.
cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) und unter Verwendung von
Nukleotid-Analoga erzeugte Analoga der DNA oder RNA bedeuten. Diese
Bezeichnung umfasst auch eine untranslatierte Sequenz, die sich
sowohl an dem 3' als
auch dem 5'-Ende
der kodierenden Region des Gens befindet: wenigstens etwa 1000 Nukleotide
der Sequenz stromaufwärts
von dem 5'-Ende
der kodierenden Region und wenigstens etwa 200 Nukleotide der Sequenz
stromabwärts
der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein, vorzugsweise ist es doppelsträngige DNA.
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Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein
Nukleinsäuremolekül, das im
Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen
Quelle der Nukleinsäure
vorhanden sind, abgetrennt ist. Bevorzugt ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei
von einigen der Sequenzen, welche die Nukleinsäure natürlicherweise flankieren (d.h.
Sequenzen, die sich an den 5'-
und 3'-Enden der
Nukleinsäure
befinden) in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet
ist. Beispielsweise kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte
CCSRP Nukleinsäuremolekül weniger
als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen
enthalten, die natürlicherweise
das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA
der Zelle, aus der die Nukleinsäure
abgeleitet ist (z.B. eine Physcomitrella patens Zelle), flankieren.
Außerdem
kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise
ein cDNA-Molekül,
frei sein von einigem anderen zellulären Material, mit dem es natürlicherweise
verbunden ist, oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken
hergestellt wird, oder chemische Vorläufer oder andere Chemikalien,
wenn es chemisch synthetisiert ist.
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Ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z.B.
ein Nukleinsäuremolekül mit einer
Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 oder ein Teil davon, kann unter
Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und den hierin
bereitgestellten Sequenzinformationen isoliert werden. Zum Beispiel
kann eine P. patens CCSRP-cDNA
aus einer P. patens Bibliothek unter Verwendung der gesamten oder
eines Teils der Sequenz aus SEQ ID NO: 1 isoliert werden. Außerdem kann
ein Nukleinsäuremolekül, das die
vollständige
oder einen Teil der Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst, durch die
Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern
isoliert werden, die auf Grundlage dieser Sequenz entworfen wurden.
Beispielsweise kann mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z.B.
durch das Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin
et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299) und cDNA kann unter
Verwendung reverser Transkriptase hergestellt werden (z.B. Moloney
MLV reverse Transkriptase, erhältlich
von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von
Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotidprimer
zur Polymerasekettenreaktion-Amplifizierung
können
auf Basis der Nukleinsäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, erstellt werden. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann unter
Verwendung von cDNA oder wahlweise von genomischer DNA als eine
Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern nach Standard-PCR-Amplifikationstechniken
amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in
einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert
werden. Ferner können
Oligonukleotide entsprechend einer CCSRP-Nukleotidsequenz durch
Standard-Synthesetechniken
hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines automatisierten
DNA-Synthesizers.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül die Nukleinsäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist. Diese cDNAs umfassen sowohl Sequenzen, welche
die CCSRPs kodieren (d.h. die "kodierende
Region", in Tabelle
1 gezeigt) als auch 5'-untranslatierte Sequenzen
und 3'-untranslatierte
Sequenzen. Es ist selbstverständlich,
dass SEQ ID NO: 4 sowohl kodierende Regionen als auch 5'- und 3'-untranslatierte
Regionen umfasst. Wahlweise können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle nur die
kodierende Region der Sequenz aus SEQ ID NO: 4 oder vollständige genomische
Fragmente, welche aus genomischer DNA isoliert sind, umfassen. Eine
kodierende Region für
diese Sequenzen wird als "ORF-Position" bezeichnet. Bevorzugt
ist eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure, welche das CCSRP CC-1
(SEQ ID NO: 7) kodiert.
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Darüber hinaus
kann das Nukleinsäuremolekül nur einen
Teil der kodierenden Region einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 umfassen, beispielsweise ein Fragment,
das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment,
welches einen biologisch aktiven Abschnitt eines CCSRP kodiert.
Die Nukleinsäuresequenzen,
die durch die Klonierung der CCSRP-Gene aus P. patens bestimmt wurden,
erlauben die Erstellung von Sonden und Primern, die zur Verwendung
bei der Identifizierung und/oder Klonierung von CCSRP-Homologen
in anderen Zelltypen und Organismen konzipiert sind, sowie CCSRP-Homologe
aus anderen Moosen und verwandten Spezies.
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Abschnitte
von Proteinen, die durch die CCSRP-Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, sind vorzugsweise
biologisch aktive Abschnitte eines der hierin beschriebenen CCSRPs.
Wie hierin verwendet, soll die Formulierung "biologisch aktiver Abschnitt" eines CCSRPs einen
Abschnitt zu umfassen, z.B. eine Domäne/ein Motiv eines CCSRPs,
der an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze beteiligt ist,
der eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist, oder der an der
Transkription eines Proteins beteiligt ist, das in eine Stresstoleranzantwort
einer Pflanze involviert ist. Um zu bestimmen, ob ein CCSRP oder
ein biologisch aktiver Abschnitt davon an der Transkription eines
Proteins beteiligt sein kann, das in eine Stresstoleranzantwort
in einer Pflanze involviert ist, kann eine Stressanalyse einer Pflanze,
die das CCSRP umfasst, durchgeführt
werden. Solche Analyseverfahren, wie sie in Beispiel 7 ausführlich beschrieben
sind, sind dem Fachmann gut bekannt. Spezieller können Nukleinsäurefragmente,
die biologisch aktive Abschnitte eines CCSRP kodieren durch Isolierung eines
Abschnitts der Sequenz aus SEQ ID NO: 7, Exprimieren des kodierten
Abschnitts des CCSRP oder des Peptids (z.B. durch rekombinante Expression
in vitro) und Bestimmung der Aktivität des kodierten Abschnitts des
CCSRPs oder Peptids, hergestellt werden.
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Biologisch
aktive Abschnitte eines CCSRPs sind inbegriffen und schließen Peptide
umfassend Aminosäuresequenzen,
die von der Aminosäuresequenz
eines CCSRPs, z.B. einer Aminosäuresequenz
aus SEQ ID NO: 7 oder von der Aminosäuresequenz eines Proteins,
welches homolog zu CCSRP ist und welches weniger Aminosäuren umfasst
als ein Volllängen-CCSRP
oder das Volllängen-Protein,
welches homolog zu einem CCSRP ist, abgeleitet sind, und wenigstens
eine Aktivität
eines CCSRPs aufweisen, ein. Typischerweise umfassen biologisch
aktive Abschnitte (z.B. Peptide, welche beispielsweise 5, 10, 15,
20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang
sind) eine Domäne
oder ein Motiv mit wenigstens einer Aktivität eines CCSRPs. Darüber hinaus
können
andere biologisch aktive Abschnitte, in welchen andere Regionen
des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt
werden und für
eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten evaluiert
werden. Vorzugsweise schließen
die biologisch aktiven Abschnitte eines CCSRPs eine oder mehrere
ausgewählte
Domänen/Motive
oder Abschnitte davon mit biologischer Aktivität ein.
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CCSRP
chimäre
Proteine oder Fusionsproteine können
bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet, umfasst ein CCSRP "chimäres Protein" oder "Fusionsprotein" ein CCSRP-Polypeptid,
welches operativ mit einem nicht-CCSRP-Polypeptid verknüpft ist.
Ein CCSRP-Polypeptid betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
entsprechend einem CCSRP, wohingegen ein nicht-CCSRP-Polypeptid
ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
betrifft, entsprechend einem Protein, welches im Wesentlichen nicht
homolog zu dem CCSRP-Protein ist, z.B. einem Protein, welches sich
von dem CCSRP unterscheidet und welches aus dem gleichen oder einem
unterschiedlichen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des Fusionsproteins
soll die Formulierung "operativ
verknüpft" ausdrücken, dass
das CCSRP-Polypeptid und das nicht-CCSRP-Polypeptid aneinander fusioniert
sind, so dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion, welche
der verwendeten Sequenz zugeschrieben wird, erfüllen. Das nicht-CCSRP-Polypeptid
kann an den N-Terminus oder C-Terminus des CCSRP-Polypeptids fusioniert
sein. Beispielsweise ist in einer Ausführungsform das Fusionsprotein
ein GST-CCSRP-Fusionsprotein, in welchem die CCSRP-Sequenzen an
den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die
Reinigung von rekombinanten CCSRPs erleichtern. In einer anderen
Ausführungsform
ist das Fusionsprotein ein CCSRP mit einer heterologen Signalsequenz
an seinem N-Terminus. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säugerwirtszellen)
kann die Expression und/oder Sekretion eines CCSRP durch die Verwendung
einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
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Ein
CCSRP chimäres
Protein oder Fusionsprotein wird vorzugsweise unter Verwendung von
rekombinanten DNA-Standardtechniken hergestellt. Beispielsweise
können
DNA-Fragmente, welche für
die unterschiedlichen Polypeptidsequenzen kodieren, im Leserahmen
entsprechend konventionellen Techniken ligiert werden, beispielsweise
unter Verwendung von glatten oder überhängenden Enden zur Ligation,
Restriktionsenzymverdau, um die entsprechenden Enden bereitzustellen,
Auffüllen
der kohäsiven
Enden soweit erforderlich, alkalische Phosphotase-Behandlung, um
unerwünschtes
Binden zu vermeiden und enzymatische Ligation. In einer anderen
Ausführungsform
kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken einschließlich automatisierter
DNA-Synthesizer synthetisiert werden. Wahlweise kann die PCR-Amplifizierung von
Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern, welche zu komplementären Überhängen zwischen
zwei konsekutiven Genfragmenten führen und welche anschließend annealed
und reamplifiziert werden können,
um eine chimäre
Gensequenz zu erzeugen, durchgeführt
werden (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology,
Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons:
1992). Darüber
hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich,
die bereits einen Fusionsrest kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid).
Eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure
kann so in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, dass
der Fusionsrest im Leseraster mit dem CCSRP verknüpft ist.
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Zusätzlich zu
Fragmenten und Fusionsproteinen der hierin beschriebenen CCSPPs
können
auch Homologe und Analoge von natürlich auftretenden CCSRPs und
CCSRP-kodierenden
Nukleinsäuren
in einer Pflanze bereitgestellt werden. „Homologe" sind hierin definiert als zwei Nukleinsäuren oder
Proteine, die ähnliche
oder „homologe" Nukleotid- bzw.
Aminosäuresequenzen
aufweisen. Homologe schließen
allelische Varianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten
der nachstehend definierten CCSRPs ein. Der Begriff „Homologon" umfasst ferner Nukleinsäuremoleküle, die
sich von einer der in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO:
6 (und Teilen davon) gezeigten Nukleinsäure aufgrund der Degenerierung
des genetischen Codes unterscheiden, und somit das selbe CCSRP kodieren,
das von den in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 gezeigten
Nukleinsäuren
kodiert wird. Wie hierin verwendet, betrifft ein „natürlich auftretendes" CCSRP eine CCSRP-Aminosäuresequenz,
die in der Natur vorkommt. Vorzugsweise umfasst ein natürlich auftretendes
CCSRP eine Aminosäuresequenz,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und
SEQ ID NO: 9.
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Ein
CCSRP-Agonist kann im Wesentlichen die gleiche biologische CCSRP-Aktivität oder eine
Teilmenge der biologischen CCSRP-Aktivitäten behalten. Ein CCSRP-Antagonist kann eine
oder mehrere Aktivitäten
der natürlich
auftretenden Form des CCSRPs hemmen. Beispielsweise kann der CCSRP-Antagonist
ein Stromabwärts- oder Stromaufwärtselement
der metabolischen Kaskade der Zellmembrankomponenten, die CCSRP
umfasst, kompetitiv binden, oder an ein CCSRP, welches den Transport
von Verbindungen über
solche Membranen hinweg vermittelt binden, und somit ein Stattfinden
der Translokation verhindern.
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Nukleinsäuremoleküle, die
zu natürlichen
allelischen Varianten und Analogen, Orthologen und Paralogen einer
CCSRP-cDNA korrespondieren können
auf Grundlage ihrer Identität
zu den hierin beschriebenen Physcomitrella patens CCSRP-Nukleinsäuren unter
Verwendung von CCSRP-cDNAs oder eines Teils davon, als Hybridisierungssonde,
gemäß Hybridisierungs-Standardtechniken
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hergestellt werden.
In einer alternativen Ausführungsform
können
CCSRP-Homologe durch Durchmustern kombinatorischer Bibliotheken
von CCSRP-Mutanten, z.B. Trunkation-Mutanten, nach CCSRP-Agonist-
oder -Antagonistaktivität
identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine reichhaltige
Bibliothek von CCSRP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese
auf der Stufe von Nukleinsäuren
erzeugt und wird durch eine reichhaltige Genbibliothek kodiert.
Eine reichhaltige Bibliothek von CCSRP-Varianten, kann beispielsweise
durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide
in Gensequenzen hergestellt werden, so dass ein degenerierter Satz
möglicher
CCSRP-Sequenzen
als einzelne Polypeptide exprimierbar ist, oder alternativ ein Satz
großer
Fusionsproteine (z.B. zum Phagen-Display), der den Satz CCSRP-Sequenzen
enthält,
hergestellt wird. Es gibt eine breite Auswahl an Verfahren, welche
verwendet werden können,
um Bibliotheken potenzieller CCSRP-Homologer aus einer degenerierten
Oligonukleotidsequenz herzustellen. Die chemische Synthese einer
degenerierten Gensequenz kann in einem automatisierten DNA-Synthesizer
durchgeführt
werden, und das synthetische Gen wird anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor
kloniert. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen erlaubt
die Bereitstellung aller der Sequenzen, die für den gewünschten Satz möglicher
CCSRP-Sequenzen
kodieren, in einer Mischung. Verfahren zur Synthese degenerierter
Oligonukleotide sind im Fachbereich bekannt (siehe z.B. Narang,
S. A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem.
53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., 1983
Nucleic Acid Res. 11: 477).
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Zusätzlich können Bibliotheken
von Fragmenten der CCSRP-kodierenden Regionen verwendet werden,
um eine variierte Population von CCSRP-Fragmenten zum Durchmustern
und anschließende
Auswahl von CCSRP-Homologen zu erzeugen. In einer Ausführungsform
kann eine Bibliothek kodierender Sequenzfragmente durch Behandlung
eines doppelsträngigen
PCR-Fragments einer CCSRP-kodierenden Sequenz mit einer Nuklease
unter Bedingungen, bei denen ein Schnitt nur etwa einmal pro Molekül auftritt,
Denaturierung der doppelsträngigen
DNA, Renaturierung der DNA, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, welche
sense-/antisense-Paare aus verschiedenen geschnittenen Produkten
einschließen
kann, Entfernen der einzelsträngigen
Abschnitte von den wieder gebildeten Duplexen durch Behandlung mit
S1-Nuklease und Ligieren der sich ergebenden Fragmentbibliothek
in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann
eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die N-terminale, C-terminale
und interne CCSRP-Fragmente mit verschiedenen Größen kodiert.
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Zum
Durchmustern von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken,
welche durch Punktmutationen oder Trunkation hergestellt wurden,
und zum Durchmustern von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten mit
einer ausgewählten
Eigenschaft, sind im Fachbereich einige Techniken bekannt. Solche
Techniken können
zum schnellen Durchmustern von Genbibliotheken, die durch kombinatorische
Mutagenese von CCSRP-Homologen erzeugt wurden, angepasst werden.
Die am häufigsten
verwendeten Techniken, die einer Hochdurchsatz-Analyse zum Durchmustern
großer
Genbibliotheken zugänglich
sind, schließen
typischerweise die Klonierung der Genbibliothek in replizierbare
Expressionsvektoren, die Transformierung geeigneter Zellen mit der
sich ergebenden Vektorbibliothek und die Expression der kombinatorischen
Gene unter Bedingungen ein, unter welchen die Detektion einer gewünschten
Aktivität
die Isolierung des Vektors ermöglicht,
der das Gen kodiert, dessen Produkt detektiert wurde. Rekursive
Ensemble-Mutagenese (recursive ensemble mutagenesis; REM), eine
neue Technik, welche die Häufigkeit
funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit
den Durchmusterungsassays verwendet werden, um CCSRP-Homologe zu
identifizieren (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811–7815; Delgrave
et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327–331). In einer anderen Ausführungsform
können
Assays auf Zellbasis verwendet werden, um eine vielfältige CCSRP-Bibliothek
unter Verwendung von im Fachbereich gut bekannten Verfahren zu analysieren.
Ein Verfahren zur Identifizierung eines neuen CCSRPs kann bereitgestellt
werden, umfassend (a) Erzeugen einer spezifischen Antikörperantwort
auf ein CCSRP oder ein Fragment davon, wie oben beschrieben; (b)
Durchmustern von mutmaßlichem
CCSRP-Material mit dem Antikörper,
worin das spezifische Binden des Antikörpers an das Material die Gegenwart
eines potentiellen neuen CCSRPs anzeigt und; (c) Analysieren des
gebundenen Materials im Vergleich zu bekanntem CCSRP, um dessen
Neuheit zu bestimmen.
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Um
die prozentuale Homologie zweier Aminosäuresequenzen zu bestimmen (z.B.
der Sequenz aus SEQ ID NO: 7 und einer Mutantenform davon), werden
die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken aligned (z.B. können Lücken in
die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingeführt werden, für ein optimales
Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure). Die
Aminosäurereste
an korrespondierenden Aminosäurepositionen
oder Nukleotidpositionen werden anschließend verglichen. Wenn eine Position
in einer Sequenz (z.B. in der Sequenz aus SEQ ID NO: 7) durch denselben
Aminosäurerest
besetzt ist wie die korrespondierende Position in der anderen Sequenz
(z.B. einer Mutantenform der Sequenz des Polypeptids von SEQ ID
NO: 7), so sind die Moleküle
an dieser Position homolog (d.h. wie hierin verwendet entspricht
Aminosäure-
oder Nukleinsäure-"Homologie" Aminosäure- oder
Nukleinsäure-"Identität"). Derselbe Vergleich
kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen
angestellt werden.
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Die
prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion
der Anzahl an identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam
haben (d.h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtzahl
an Positionen × 100).
Die in der vorliegenden Erfindung enthaltenen Aminosäuresequenzen
sind wenigstens 80–90%,
90–95%,
und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder
mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
7 gezeigt ist. In einer anderen Ausführungsform zu wenigstens 80–90%, 90–95% und
am meisten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog
zu einer gesamten Aminosäuresequenz,
die von einer in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleinsäuresequenz kodiert ist.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die wenigstens 80–90%
oder 90–95%
und noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
oder mehr homolog zu einer in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz
ist. Die Länge
des Sequenzvergleichs für
Nukleinsäuren
ist die gesamte kodierende Region der Nukleinsäure.
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Es
ist außerdem
bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon
kodiert, der eine Aminosäuresequenz
enthält,
die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7
ist, sodass das Protein oder der Abschnitt davon dieselbe oder eine ähnliche
Funktion behält,
wie die Aminosäuresequenz,
mit der sie verglichen wird. Funktionen der CCSRP-Aminosäuresequenzen beinhalten
die Fähigkeit,
sich an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze zu beteiligen,
oder insbesondere, an der Transkription eines Proteins teilzunehmen,
das an einer Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens-Pflanze beteiligt
ist. Beispiele für
solche Aktivitäten
sind in Tabelle 1 beschrieben.
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Verfahren kann eine Bestimmung der prozentualen
Homologie zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen
Algorithmus durchgeführt
werden. Ein bevorzugtes nicht-beschränkendes
Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich
von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin
und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877).
Ein solcher Algorithmus fließt in
die in NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990 J.
Mol. Biol. 215: 403–410)
ein.
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Um
Nukleinsäuresequenzen,
die homolog zu erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremolekülen sind,
zu erhalten, können
BLAST-Nukleinsäure-Suchen
mit dem NBLAST-Programm durchgeführt
werden, Score = 100, Wortlänge
= 12. Um Aminosäuresequenzen,
die homolog zu erfindungsgemäßen CCSRPs
sind, zu erhalten, können
außerdem
BLAST-Protein-Suchen mit dem XBLAST-Programm durchgeführt werden, Score
= 50, Wortlänge
= 3. Um Alignments mit Lücken
(gapped Alignments) für
Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST, wie in Altschul
et al. (1997 Nucleic Acid Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden.
Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die
Fehlerparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST)
verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nicht limitierendes Beispiel
eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen
verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS
1989). Ein solcher Algorithmus fließt in das ALIGN-Programm (Version
2.0) ein, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Software-Pakets ist. Wenn
das ALIGN-Programm für
den Vergleich von Aminosäuresequenzen
verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtungstabelle (weight residue
table), eine Strafe für
Lückenlängen (gap
length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von
4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen CCSRPs sind. Um für Vergleichszwecke
Alignments mit Lücken
(gapped Alignments) zu erhalten, kann Gapped BLAST, wie in Altschul
et al. (1997 Nucleic Acid Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet
werden. Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet werden,
können
die Fehlerparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST)
verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nicht limitierendes Beispiel
eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen
verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS
1989). Ein solcher Algorithmus fließt in das ALIGN-Programm (Version 2.0)
ein, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Software-Pakets ist.
Wenn das ALIGN-Programm
für den Vergleich
von Aminosäuresequenzen
verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtungstabelle (weight residue table),
eine Strafe für
Lückenlängen (gap
length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von
4 verwendet werden.
-
Schließlich kann
Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen
auch unter Verwendung von Hybridisierungs-Standardtechniken, die
dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Entsprechend umfasst
ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die, z.B. unter stringenten Bedingungen, an die in SEQ ID NO: 4
gezeigte Nukleotidsequenz oder einen Abschnitt davon hybridisiert.
Insbesondere weist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Länge von wenigstens 15 Nukleotiden
auf, und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 umfasst. In anderen Ausführungsformen
weist die Nukleinsäure
eine Länge
von wenigstens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden auf.
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Wie
hierin verwendet, soll die Formulierung "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für die Hybridisierung
und Wasch-Schritte beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen mit
wenigstens 60% Homologie zueinander typischerweise aneinander hybridisiert
bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass Sequenzen typischerweise
mit wenigstens etwa 65%, stärker
bevorzugt mit wenigstens etwa 70% und nochmals stärker bevorzugt,
mit wenigstens etwa 75% oder mehr Homologie aneinander hybridisiert
bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt
und können
Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)
entnommen werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel von stringenten
Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6× Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45°C,
gefolgt von einem oder mehreren Wasch-Schritten in 0,2 × SSC, 0,1%
SDS bei 50–65°C. Vorzugsweise
entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an
eine Sequenz aus SEQ ID NO: 4 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden
Nukleinsäuremolekül. Wie hierin
verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA-
oder DNA-Molekül
mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (die z.B.
ein natürliches
Protein kodiert). In einer Ausführungsform
kodiert die Nukleinsäure
ein natürlich
vorkommendes Physcomitrella patens-CCSRP.
-
Unter
Verwendung der oben beschriebenen Verfahren und anderer Verfahren,
die dem Fachmann bekannt sind, kann ein Fachmann Homologe der CCSRPs,
die die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, isolieren.
Eine Untergruppe dieser Homologen sind allelische Varianten. Wie
hierin verwendet betrifft der Begriff „allelische Variante" eine Nukleotidsequenz,
die Polymorphismen enthält,
die zu Veränderungen
der Aminosäuresequenzen
eines CCSRPs führen,
und die in einer natürlichen
Population (z.B. einer Pflanzenspezies oder Varietät) vorkommen.
Solche natürlichen
allelischen Variationen können
typischerweise zu 1–5%
Varianz in einer CCSRP-Nukleinsäure führen. Allelische
Varianten können
identifiziert werden, indem die Nukleinsäuresequenz von Interesse in
mehreren unterschiedlichen Pflanzen sequenziert wird, was leicht durch
Verwendung von Hybridisierungssonden erfolgen kann, um dieselbe
CCSRP-Genstelle in diesen Pflanzen zu identifizieren.
-
Außerdem können Nukleinsäuremoleküle in Betracht
gezogen werden, die CCSRPs derselben oder anderer Spezies kodieren,
wie beispielsweise CCSRP Analoge, Orthologe und Paraloge. Wie hierin
verwendet betrifft der Begriff „Analoge" zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche
Funktion aufweisen, die sich aber separat in nicht verwandten Organismen
entwickelt haben. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Orthologe" zwei Nukleinsäuren von
unterschiedlichen Spezies, die sich aber aus einem gemeinsamen Stammgen
durch Speziation entwickelt haben. Normalerweise kodieren Orthologe
Proteine, welche dieselben oder ähnliche
Funktionen besitzen. Wie ebenfalls hierin verwendet betrifft der
Begriff „Paraloge" zwei Nukleinsäuren, die
durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge
weisen üblicherweise
unterschiedliche Funktionen auf, diese Funktionen können aber
verwandt sein (Tatusov, R. L. et al. 1997 Schience 278 (5338): 631–637). Analoge,
Orthologe und Paraloge eines natürlich
auftretenden CCSRPs können
sich von dem natürlich
auftretenden CCSRP durch post-translationale Modifikationen, durch
Aminosäuresequenzunterschiede
oder durch beides unterscheiden. Post-translationale Modifikationen
beinhalten chemische Derivatisierung von Polypeptiden in vivo und
in vitro, z.B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder
Glycosylierung, und solche Modifikationen können während der Polypeptidsynthese
oder Verarbeitung oder nach der Behandlung mit isolierten modifizierenden
Enzymen auftreten. Orthologe werden insbesondere wenigstens 80–85%, weiter
bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar
99% Identität oder
Homologie mit der ganzen oder einem Teil der natürlich auftretenden CCSRP-Aminosäuresequenz
aufweisen und sie werden eine ähnliche
Funktion wie ein CCSRP zeigen. Orthologe sind außerdem vorzugsweise in der
Lage, an der Stressantwort in Pflanzen teilzunehmen. In einer Ausführungsform
behalten die CCSRP-Orthologe die Fähigkeit, sich an dem Metabolismus
von Verbindungen, die für
die Erzeugung von Zellmembranen in Physcomitrella patens notwendig
sind, oder an dem Transport von Molekülen über diese Membranen zu beteiligen.
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Zusätzlich zu
natürlich
vorkommenden Varianten einer CCSRP-Sequenz, die in der Population
auftreten können,
wird der Fachmann ferner erkennen, dass Veränderungen durch Mutation in
eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO: 6 eingefügt
werden können,
die zu Veränderungen in
der Aminosäuresequenz
des kodierten CCSRPs führen
ohne die funktionelle Fähigkeit
des CCSRPs zu verändern.
Beispielsweise können
Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht-essentiellen" Aminosäureresten
führen,
in einer Sequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO:
6 erfolgen. Ein „nicht-essentieller" Aminosäurerest
ist ein Rest, der von der Wildtyp-Sequenz eines der CCSRPs verändert werden
kann, ohne die Aktivität
des CCSRPs zu verändern,
wohingegen ein „essentieller" Aminosäurerest
für die
CCSRP-Aktivität
benötigt
wird. Andere Aminosäurereste
(z.B. solche, die in der Domäne
mit CCSRP-Aktivität
nicht konserviert sind oder nur teilweise konserviert sind) können jedoch
für die
Aktivität
nicht essentiell sein und daher eher verändert werden, ohne die CCSRP-Aktivität zu verändern.
-
Entsprechend
betrifft eine andere Ausführungsform
Nukleinsäuremoleküle, die
CCSRPs kodieren, welche Veränderungen
in Aminosäureresten
enthalten, die für
die CCSRP-Aktivität
nicht essentiell sind. Solche CCSRPs unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz
von einer Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 enthalten ist, behalten jedoch
wenigstens eine der hierin beschriebenen CCSRP-Aktivitäten. In
einer Ausführungsform umfasst
das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die ein Protein kodiert, worin das Protein eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche wenigstens zu etwa 80% homolog zu einer Aminosäuresequenz aus
SEQ ID NO: 7 ist, noch weiter bevorzugt zu wenigstens 80–90%, 90–95% homolog
zu der Sequenz aus SEQ ID NO: 7 ist, und am meisten bevorzugt zu
wenigstens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu der Sequenz aus
SEQ ID NO: 7 ist. Die bevorzugten CCSRP-Homologe der vorliegenden Erfindung
sind vorzugsweise in der Lage, an der Stresstoleranzantwort in einer
Pflanze teilzunehmen, oder insbesondere an der Transkription eines
Proteins teilzunehmen, das in eine Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella
patens Pflanze involviert ist, oder eine oder mehrere der in Tabelle
1 dargelegten Aktivitäten
aufweist.
-
Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches
ein CCSRP-Homologon zu einer Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 7 kodiert,
kann durch Einführen
einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen
in eine Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO: 4 erzeugt werden, so dass
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden.
Mutationen können
in die Sequenz aus SEQ ID NO: 4 durch Standardtechniken wie z.B.
sitedirected Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt werden.
Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder
mehreren vorausgesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten
durchgeführt.
Eine "konservative
Aminosäuresubstitution" ist eine Substitution,
bei welcher der Aminosäurerest
durch einen Aminosäurerest,
der eine ähnliche
Seitenkette aufweist, ersetzt wird.
-
Familien
von Aminosäureresten
mit ähnlichen
Seitenketten sind im Fachgebiet definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit
basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten
(z.B. Asparaginsäure,
Glutaminsäure),
ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin,
Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z.B.
Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin,
Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin,
Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin,
Tryptophan, Histidin) ein. Daher wird ein vorausgesagter nicht-essentieller
Aminosäurerest
in einem CCSRP vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest
aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Wahlweise können in
einer anderen Ausführungsform
Mutationen zufällig über die
gesamte oder einen Teil einer CCSRP-kodierenden Sequenz, beispielsweise
durch Saturations-Mutagenese, eingefügt werden und die sich daraus
ergebenden Mutanten können
nach einer hierin beschriebenen CCSRP-Aktivität durchmustert werden, um so
Mutanten zu identifizieren, die CCSRP-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese
der Sequenz aus SEQ ID NO: 4 kann das kodierte Protein rekombinant
exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann durch Analyse
der Stresstoleranz einer Pflanze bestimmt werden, wobei das Protein
wie in Beispiel 7 beschrieben exprimiert wird.
-
Zusätzlich zu
den CCSRP-kodierenden Nukleinsäuremolekülen, die
oben beschrieben wurden, betrifft eine andere Ausführungsform
isolierte Nukleinsäuremoleküle, die
antisense dazu sind. Eine "antisense"-Nukleinsäure umfasst
eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer ein Protein kodierenden "sense"-Nukleinsäure ist,
z.B. komplementär
zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder
komplementär
zu einer mRNA-Sequenz. Entsprechend kann eine antisense-Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindungen
an eine sense-Nukleinsäure
binden. Die antisense-Nukleinsäure
kann komplementär
zu einem vollständigen
CCSRP-kodierenden
Strang sein oder nur zu einem Abschnitt davon. In einer Ausführungsform ist
ein antisense-Nukleinsäuremolekül antisense
zu einer "kodierenden
Region" des kodierenden
Strangs einer Nukleotidsequenz, welche ein CCSRP kodiert. Die Formulierung "kodierende Region" betrifft die Region der
Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste
translatiert werden (z.B. die vollständige kodierende Region von
,,, umfasst Nukleotide 1 bis ...). In einer anderen Ausführungsform
ist das antisense-Nukleinsäuremolekül antisense
zu einer "nicht
kodierenden Region" des
kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, welche ein CCSRP kodiert.
Die Formulierung "nicht
kodierende Region" betrifft
5'- und 3'-Sequenzen, welche
die kodierende Region flankieren und die nicht in Aminosäuren translatiert
werden (d.h. auch als 5'-
und 3'-untranslatierte
Regionen bezeichnet werden).
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das ein
Komplement einer der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenzen
oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der
in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz ist, ist ausreichend
komplementär
zu der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz, sodass es an
die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Nukleotidsequenz hybridisieren und
dabei eine stabile Duplex bilden kann.
-
Wenn
die hierin offenbarten Sequenzen des kodierenden Strangs, welche
für die
CCSRPs kodieren gegeben sind (z.B. die in SEQ ID NO: 4 dargestellte
Sequenz), können
antisense-Nukleinsäuren
gemäß den Basenpaarungsregeln
von Watson und Crick konzipiert werden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der
vollständigen
kodierenden Region der CCSRP-mRNA sein, aber stärker bevorzugt ist ein Oligonukleotid,
welches nur zu einem Abschnitt der kodierenden oder nicht kodierenden
Region der CCSRP-mRNA antisense ist. Beispielsweise kann das antisense-Oligonukleotid
komplementär
zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle der CCSRP-mRNA
umgibt. Ein antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise eine Länge von
etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden aufweisen.
-
Eine
antisense-Nukleinsäure
kann unter Verwendung chemischer Synthese oder enzymatischer Ligationsreaktionen
unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren konstruiert
werden. Beispielsweise kann eine antisense-Nukleinsäure (z.B.
ein antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender
Nukleotide oder verschieden modifizierter Nukleotide, welche konzipiert
sind, um die biologische Stabilität der Moleküle zu steigern oder um die
physikalische Stabilität
der Duplex, die sich zwischen antisense- und sense-Nukleinsäuren bildet,
zu steigern, synthetisiert werden, z.B. können Phosphorothioat-Derivate
und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele
für modifizierte
Nukleotide, die verwendet werden können, um die antisense-Nukleinsäuren zu
erzeugen, beinhalten 5-Fluorurazil, 5-Bromurazil, 5-Chlorurazil, 5-Jodurazil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-urazil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin,
5-Carboxymethylaminomethylurazil,
Dihydrourazil, beta-D-Galaktosylqueosine, Inosin, N6-Isopentenyladenin,
1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin,
3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethylurazil,
5-Methoxyaminomethyl-2-thiourazil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethylurazil, 5-Methoxyurazil,
2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin,
Urazil-5-oxyessigsäure
(v), Wybutoxosin, Pseudourazil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiourazil,
2-Thiourazil, 4-Thiourazil, 5-Methylurazil, Urazil-5-oxyessigsäuremethylester,
Urazil-5-oxyessigsäure
(v), 5-Methyl-2-Thiourazil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)urazil,
(acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Wahlweise kann die antisense-Nukleinsäure biologisch
unter Verwendung eines Expressionsvektors, in welchen eine Nukleinsäure in antisense-Orientierung
subkloniert wurde (d.h. RNA, welche von der insertierten Nukleinsäure transkribiert
wird, befindet sich in antisense-Orientierung
zu einer Zielnukleinsäure
von Interesse, was im nachfolgenden Unterabschnitt weiter unten
beschrieben ist) hergestellt werden.
-
Die
antisense-Nukleinsäuremoleküle werden
typischerweise derart einer Zelle verabreicht oder in situ hergestellt,
dass sie an zelluläre
mRNA und/oder genomische CCSRP kodierende DNA hybridisieren oder
binden, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z.B. durch
Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung
kann durch übliche
Nukleotidkomplementarität
unter Ausbildung einer stabilen Duplex erfolgen oder beispielsweise
für den
Fall eines antisense-Nukleinsäuremoleküls, welches
an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der
großen
Furche der Doppelhelix. Das antisense-Molekül kann modifiziert werden,
so dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen, welche
auf einer ausgewählten
Zelloberfläche
exprimiert werden, bindet, z.B. durch Verknüpfung des antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem
Peptid oder einem Antikörper,
welche an einen Zelloberflächenrezeptor
oder ein Antigen binden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung
der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen abgegeben werden. Um
ausreichende intrazelluläre
Konzentrationen an antisense-Molekülen zu erhalten, sind Vektorkonstrukte
bevorzugt, in welchen das antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken
prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich pflanzlichen)
Promotors angeordnet ist.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
ist das antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres
Nukleinsäuremolekül bildet
mit komplementärer
RNA spezifische doppelsträngige
Hybride, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge jeweils
parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids.
Res. 15: 6625–6641).
Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch
ein 2'-o-Methylribonukleotid
(Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon
(Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
-
In
noch einer anderen Ausführungsform
ist die antisense-Nukleinsäure
ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche
in der Lage sind, eine einzelsträngige
Nukleinsäure,
wie beispielsweise eine mRNA, gegenüber welcher sie eine komplementäre Region
aufweisen, zu spalten. Daher können
Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme, beschrieben in Haselhoff und
Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591)
verwendet werden, um CCSRP-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten,
um so die Translation von CCSRP-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit
Spezifität
für eine
CCSRP-kodierende Nukleinsäure kann
auf Basis der Nukleotidsequenz einer hierin offenbarten CCSRP-cDNA
(d.h. SEQ ID NO: 4) oder auf Basis einer heterologen Sequenz, die
gemäß den hierin
gelehrten Verfahren zu isolieren ist, konzipiert werden. Beispielsweise
kann ein Derivat von Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden,
in welchem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der
zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer CCSRP-kodierenden mRNA ist.
Siehe z.B. Cech et al. U.S.-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al.,
U.S.-Patent Nr.
5,116,742. Wahlweise kann CCSRP-mRNA verwendet werden, um eine katalytische
RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren.
Siehe z.B. Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418.
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Alternativ
kann die CCSRP-Genexpression durch Zielstrukturnukleotidsequenzen,
die zu der regulatorischen Region einer CCSRP-Nukleotidsequenz komplementär sind (z.B.
ein CCSRP-Promotor und/oder Enhancer) gehemmt werden, um tripel-helikale
Strukturen zu bilden, welche die Transkription eines CCSRP-Gens
in Zielzellen verhindern. Siehe allgemein Helene, C., 1991 Anticancer
Drug Des. 6(6): 569–84;
Helene, C. et al., 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27–36; und
Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807–15.
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen CCSRP-Nukleinsäuren und -Proteinen können diese
Nukleinsäuren
und Proteine auch an einen Rest angebunden sein. Diese Reste umfassen,
sind aber nicht beschränkt auf
Detektionsreste, Hybridisierungsreste, Reinigungsreste, Abgabereste,
Reaktionsreste, Bindereste und dergleichen. Eine typische Gruppe
von Nukleinsäuren,
die an einen Rest gebunden sind, sind Sonden und Primer. Sonden
und Primer umfassen typischerweise ein im Wesentlichen isoliertes
Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise einen
Abschnitt einer Nukleotidsequenz, der unter stringenten Bedingungen
an wenigstens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50
oder 75 konsekutive Nukleotide eines Sense-Stranges der in SEQ ID
NO: 4 gezeigten Sequenz, einer antisense-Sequenz der in SEQ ID NO: 4 gezeigten
Sequenz, oder natürlich
vorkommender Mutanten davon, hybridisiert. Primer, die auf Nukleotidsequenzen
aus SEQ ID NO: 4 basieren, können
in PCR-Reaktionen verwendet werden, um CCSRP-Homologe zu klonieren.
Sonden, die auf CCSRP-Nukleotidsequenzen basieren, können verwendet
werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen, welche dasselbe
oder homologe Proteine kodieren, zu detektieren. In bevorzugten
Ausführungsformen
umfasst die Sonde ferner eine daran angefügte Markierungsgruppe, z.B.
kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende
Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Co-Faktor sein. Solche Sonden
können
als ein Teil eines genomischen Testmarkerkits zur Identifizierung
von CCSRP exprimierenden Zellen verwendet werden, wie beispielsweise
durch Messung der Menge einer CCSRP-kodierenden Nukleinsäure in einer
Zellprobe, z.B. durch Detektieren der CCSRP-mRNA-Menge oder durch
Bestimmung, ob ein genomisches CCSRP-Gen mutiert oder deletiert
wurde.
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Ein
besonders nützliches
Verfahren um die Transkriptionsmenge des Gens (ein Indikator für die Menge
an mRNA, die zur Translation zu dem Genprodukt zur Verfügung steht)
festzustellen, besteht darin, einen Northern Blot durchzuführen (für Referenz
siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley: New York). Diese Information zeigt wenigstens teilweise den
Transkriptionsgrad für
das transformierte Gen. Gesamtzelluläre RNA kann aus Zellen, Geweben
oder Organen durch mehrere Verfahren hergestellt werden, die im
Fachbereich alle gut bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben
in Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317-326. Um das
Vorliegen oder die relative Menge von Protein, welches von dieser mRNA
translatiert wird, zu bestimmen, können Standardtechniken wie
zum Beispiel ein Western Blot verwendet werden. Diese Techniken
sind einem Fachmann vertraut. (siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
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Die
Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor
bereit, der eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben,
umfasst, worin die Expression des Vektors in einer Wirtszelle verglichen
mit einer Wildtyp-Varietät
der Wirtszelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress
führt.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere
Nukleinsäure,
mit der es verknüpft
wurde, zu transportieren. Eine Art von Vektoren ist ein „Plasmid", welches eine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Schleife
bezeichnet, in die zusätzliche
DNA-Segmente ligiert werden können.
Eine andere Art eines Vektors ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche
DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte
Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in
die sie eingebracht werden, in der Lage (z.B. bakterielle Vektoren
mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren).
Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugervektoren) werden nach Einführung in
die Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und werden
so zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren
in der Lage, die Expression von Genen, mit welchen sie operativ
verknüpft
sind, zu lenken. Solche Vektoren werden hierin als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen
liegen Expressionsvektoren zur Verwendung bei rekombinanten DNA-Techniken
oft in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung
können "Plasmid" und "Vektor" untereinander austauschbar
verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines
Vektors darstellt. Jedoch soll die Erfindung auch andere Formen
von Expressionsvektoren, wie z.B. virale Vektoren (z.B. replikationsdefekte
Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) einschließen, welche
den gleichen Funktionen dienen.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die zur
Expression der Nukleinsäure
in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten
Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen einschließen, ausgewählt auf
Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, welche operativ
mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll "operativ verknüpft" bedeuten, dass die
Nukleotidsequenz von Interesse mit der/den regulatorischen Sequenz(en)
in einer Weise verknüpft
ist/sind, welche die Expression der Nukleotidsequenz erlaubt (z.B.
in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer
Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingefügt ist).
Die Formulierung "regulatorische
Sequenz" soll Promotoren,
Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale)
einschließen.
Solche regulatorischen Sequenzen werden beispielsweise in Goeddel,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA (1990) beschrieben oder siehe: Gruber und Crosby,
in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick
und Thompson, Kapitel 7, 89–108,
CRC Press, Boca Raton, Florida, einschließlich der Referenzen darin. Regulatorische
Sequenzen schließen
diejenigen ein, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz
in vielen Typen von Wirtszellen lenken und diejenigen, welche die
Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder
unter bestimmten Bedingungen lenken. Ein Fachmann erkennt, dass
die Konzeption des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der
Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der Expressionsmenge des
gewünschten
Proteins etc. abhängig
sein kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
können
in Wirtszellen eingeführt
werden, um so Proteine oder Peptide einschließlich Fusionsproteine oder
Peptide, herzustellen, die durch Nukleinsäuren wie sie hierin beschrieben
sind kodiert werden (z.B. CCSRPs, Mutantenformen von CCSRPs, Fusionsproteine
etc.).
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren können
zur Expression von CCSRPs in prokaryotischen oder eukaryotischen
Zellen konzipiert sein. Beispielsweise können CCSRP-Gene in bakteriellen
Zellen wie beispielsweise C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung
von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe oder anderen Pilzzellen
(siehe Romanos, M. A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast:
a review, Yeast 8: 423–488;
van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologous gene expression in
filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure,
Hrsg., S. 396–428: Academic
Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J.,
1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous
fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et
al., Hrsg., S. 1–28,
Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al.,
1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251), Ziliaten der Typen:
Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium,
Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus,
Euplotes, Engelmaniella, und Stylonychia, insbesondere der Gattung
Stylonychia lemnae mit Vektoren folgend einem Transformationsverfahren
wie in der PCT-Anmeldung WO 98/01572 beschrieben und multizellulären Pflanzenzellen
(siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf
and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586); Plant Molecular Biology
and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.
71–119
(1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in:
Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung
und R. Wu, 128–43,
Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Molec. Biol. 42: 205–225
und die darin zitierten Referenzen) oder Säugerzellen exprimiert werden.
Geeignete Wirtszellen werden ferner in Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990)
diskutiert. Wahlweise kann der rekombinante Expressionsvektor in
vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. unter Verwendung
von T7-Promotor regulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase.
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Die
Expression von Proteinen in Prokaryoten wird oft mit Vektoren, die
konstitutive oder induzierbare Promotoren, welche entweder die Expression
von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen
lenken, durchgeführt. Fusionsvektoren
addieren eine Anzahl von Aminosäuren
an ein darin kodiertes Protein, normalerweise an den Aminoterminus
des rekombinanten Proteins, aber auch an den C-Terminus oder fusioniert
innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Solche Fusionsvektoren
erfüllen
typischerweise drei Funktionen: 1) die Expression eines rekombinanten
Proteins zu steigern; 2) die Löslichkeit
eines rekombinanten Proteins zu steigern; und 3) die Reinigung eines
rekombinanten Proteins zu unterstützen, indem sie als Ligand
bei einer Affinitätsreinigung
fungieren. In Fusionsexpressionsvektoren wird häufig eine proteolytische Schnittstelle
an der Verbindung zwischen dem Fusionsrest und dem rekombinanten
Protein eingefügt,
um im Anschluß an
die Reinigung des Fusionsproteins die Trennung des rekombinanten
Proteins vom Fusionsrest zu ermöglichen.
Solche Enzyme und ihre zugehörigen
Erkennungssequenzen schließen
Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
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Typische
Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech
Inc; Smith, D. B. und Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL
(New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,
NJ) ein, welche Glutathion S-Transferase (GST), Maltose-E bindendes
Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren.
In einer Ausführungsform
wird die kodierende Sequenz von CCSRP in einen pGEX-Expressionsvektor
kloniert, um einen Vektor zu erzeugen, der ein Fusionsprotein kodiert,
umfassend, vom N-Terminus zum C-Terminus: GST-Thrombin-Schnittstelle-X-Protein.
Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung
von Glutathion-Agaroseharz aufgereinigt werden. Nicht mit GST fusioniertes
rekombinantes CCSRP kann durch Abspalten des Fusionsproteins mit
Thrombin wiedergewonnen werden.
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Beispiele
für geeignete
induzierbare nicht-fusionierende E. coli Expressionsvektoren schließen pTrc (Amann
et al., 1988 Gene 69: 301–315)
und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)
60–89)
ein. Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor stützt sich auf die Transkription
eines Hybrid-trp-lac-Fusionspromotors durch die RNA-Polymerase des
Wirts. Die Zielgenexpression vom pET 11d-Vektor stützt sich
auf die Transkription eines T7 gn10-lac Fusionspromotors, wobei
die Transkription durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerase
(T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die
Wirtsstämme
BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem ansässigem λ-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen
unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5-Promotors trägt, zur
Verfügung
gestellt.
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Eine
Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins
ist es, das Protein in Wirtsbakterien in welchen die Fähigkeit
zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins abgeschwächt ist,
zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)
119–128).
Eine andere Strategie ist es, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor
zu insertierenden Nukleinsäure
so zu verändern,
dass die einzelnen Codons für
jede Aminosäure
diejenigen sind, welche in dem Bakterium, das für die Expression ausgewählt wird,
vorzugsweise verwendet werden, wie z.B. C. glutamicum (Wada et al.,
1992 Nucleic Acid Res. 20: 2111–2118). Solche
Veränderungen
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
können
durch DNA-Standardsynthesetechniken
ausgeführt
werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist der CCSRP-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren
zur Expression in Hefe S. cerevisiae schließen pYepSec1 (Baldari et al.,
1987 Embo J. 6: 229–234),
pMFa (Kurjan und Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al.,
1987 Gene 54: 113–123)
und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Vektoren
und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung
in anderen Pilzen, wie z.B. Fadenpilzen, geeignet sind, schließen die ein,
die ausführlich
beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems
and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular
Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge
University Press: Cambridge.
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Wahlweise
können
die erfindungsgemäßen CCSRPs
in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren
exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren,
welche zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen
(z.B. Sf 9 Zellen) erhältlich
sind, schließen
die pAc-Serien (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und
die pVL-Serien (Lucklow und Summers, 1989 Virology 170: 31–39) ein.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
wird eine erfindungsgemäße CCSRP
Nukleinsäure
in Säugerzellen
unter Verwendung eines Säuger-Expressionvektors
exprimiert. Beispiele für
Säuger-Expressionvektors schließen pCDM8
(Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987
EMBO J. 6: 187–195) ein.
Wenn sie in Säugerzellen
verwendet werden, werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors
häufig
durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Beispielsweise
sind häufig
verwendete Promotoren abgeleitet von Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalovirus
und Simianvirus 40. Für
weitere geeignete Expressionssysteme, sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische
Zellen, siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F.,
und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. zweite
Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
-
In
einer anderen Ausführungsform
ist der rekombinante Säuger-Expressionsvektor
in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten
Zelltyp zu lenken (z.B. werden gewebespezifische regulatorische
Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische
regulatorische Elemente sind im Fachbereich bekannt. Nicht-beschränkende Beispiele
von geeigneten gewebespezifischen Promotoren schließen den
Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1:
268–277),
lymphspezifische Promotoren (Calame und Eaton, 1988 Adv. Immunol.
43: 235–275),
insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989
EMBO J. 8: 729–733)
und Immunglobuline (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740; Queen
und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), neuronspezifische Promotoren
(z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle, 1989 PNAS 86:
5473–5477),
Pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230:
912–916)
und Brustdrüsen-spezifische
Promotoren (z.B. Milk Whey Promotor; US Patent Nr. 4,873,316 und
Offenlegungsschrift der europäischen
Patentanmeldung Nr. 264,166) ein. Entwicklungsspezifisch regulierte
Promotoren werden ebenfalls umfasst, beispielsweise die murinen
Hox-Promotoren (Kessel und Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und
der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:
537–546).
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In
einer anderen Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen CCSRPs
in einzelligen Pflanzenzellen (wie beispielsweise Algen) (siehe
Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und
Referenzen darin) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. den Spermatophyten,
wie beispielsweise Kulturpflanzen) exprimiert werden. Beispiele
für Pflanzenexpressionsvektoren
schließen
diejenigen ein, die ausführlich
beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson,
R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located
proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und
Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation,
Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721;
Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants,
Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic
Press, 1993, S. 15–38.
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Eine
Pflanzenexpressionskassette enthält
vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die zum Lenken der Genexpression
in Pflanzenzellen fähig
sind und die derart operativ verknüpft sind, dass jede Sequenz
ihre Funktion erfüllen
kann, wie beispielsweise die Termination der Transkription durch
Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind
diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie
beispielsweise das Gen 3, bekannt als Oktopinsynthase des Ti-Plasmids
pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) oder funktionelle Äquivalente
davon, aber sämtliche
anderen in Pflanzen funktionell aktive Terminatoren sind ebenfalls
geeignet.
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Da
die Genexpression in Pflanzen sehr oft nicht auf transkriptionelle
Level beschränkt
ist, enthält
eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere operativ verknüpfte Sequenzen
wie zum Beispiel translationale Enhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die
5'-untranslatierte
Leadersequenz des Tabakmosaikvirus enthält und die das Verhältnis Protein
pro RNA verbessert (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15:
8693–8711).
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Die
Genexpression in Pflanzen muss operativ mit einem geeigneten Promotor
verknüpft
sein, welcher eine Genexpression in einer zeit-, zell- oder gewebespezifischen
Weise überträgt. Bevorzugt
sind Promotoren, welche die konstitutive Expression lenken (Benfey
et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202)
wie diejenigen, die von Pflanzenviren wie beispielsweise dem 35S
CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), dem 19S CaMV (siehe
auch US Patent Nr. 5,352,605 und WO 8402913) oder Pflanzenpromotoren
wie denen aus der kleinen Rubisco-Untereinheit, die in US Patent
Nr. 4,962,028 beschrieben ist, abgeleitet sind.
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Andere
bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten
sind Zielsequenzen, welche nötig
sind, um das Genprodukt in sein zugehöriges Zellkompartiment zu lenken
(für eine Übersicht
hierzu siehe Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423 und
die darin zitierten Referenzen) wie beispielsweise die Vakuole,
den Nukleus, alle Typen von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten,
Chromoplasten, den extrazellulären
Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Reticulum, Ölkörperchen,
Peroxisome und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
-
Genexpression
in Pflanzen kann auch durch einen induzierbaren Promotor ermöglicht werden
(für eine Übersicht
hierzu siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
48: 89–108).
Wenn die Genexpression in einer zeitspezifischen Weise erfolgen
soll, sind insbesondere chemisch induzierbare Promotoren geeignet.
Beispiele für
solche Promotoren sind ein Salizylsäure-induzierbarer Promotor
(PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443), ein Tetrazyklin-induzierbarer Promotor
(Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer
Promotor (PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334).
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Ebenfalls
geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen
antworten, sind solche wie beispielsweise der Pathogen-induzierbare
PRP1-Gen Promotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der
Hitze-induzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (US Patent Nr. 5,187,267),
der Kälte-induzierbare
Alpha-amylase Promotor
aus Kartoffel (PCT-Anmeldung WO 96/12814) oder der Wunden-induzierbare pinII-Promotor
(Europäisches
Patent
EP 375091 ). Für andere
Beispiele von Trockenheits-, Kälte-
und Salz-induzierbaren Promotoren, wie beispielsweise dem RD29A-Promotor,
siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331– 340).
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Insbesondere
sind solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in spezifischen
Geweben und Organen übertragen,
wie beispielsweise Schließzellen
und Haarwurzelzellen. Geeignete Promotoren schließen sowohl
den Napin-Genpromotor aus Raps (US Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor
aus Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3): 459–67), den
Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (PCT-Anmeldung WO 98/45461), den Phaseolinpromotor
aus Phaseolus vulgaris (US Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor
aus Brassica (PCT-Anmeldung WO 91/13980) oder den Legumin B4-Promotor
(LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2): 233–9) als
auch Promotoren, die eine Saatgut-spezifische Expression in monokotylen
Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. verleihen,
ein. Besonders zu erwähnende
Promotoren sind der lpt2 oder der lpt1-Genpromotor aus Gerste (PCT-Anmeldung
Nr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldung Nr. WO 95/23230), oder die in
PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem
Hordein-Gen aus Gerste, dem Glutelin-Gen aus Reis, dem Oryzin-Gen
aus Reis, dem Prolamin-Gen aus Reis, dem Gliadin-Gen aus Weizen,
dem Glutelin-Gen aus Weizen, dem Zein-Gen aus Mais, dem Glutelin-Gen
aus Hafer, dem Kasirin-Gen aus Sorghum und Secalin-Gen aus Roggen).
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Speziell
geeignet sind auch Promotoren, die Plastid-spezifische Genexpression übertragen,
da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Lipidbiosynthese
erfolgt. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerasepromotor,
der in PCT-Anmeldung
Nr. WO 95/16783 und PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250 beschrieben ist,
und der in PCT-Anmeldung Nr. WO 99/46394 beschriebene clpP-Promotor
aus Arabidopsis.
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Eine
weitere Ausführungsform
ist ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes CCSRP
DNA-Molekül
umfasst, welches in antisense-Orientierung in den Expressionsvektor
einkloniert wurde. Das heißt,
dass das DNA-Molekül
in einer solchen Art operativ mit einer regulatorischen Sequenz
verknüpft ist,
dass eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines
RNA-Moleküls,
welches antisense zu einer CCSRP-mRNA vorliegt, möglich ist.
Regulatorische Sequenzen, die operativ mit einem in Antisense-Orientierung
klonierten Nukleinsäuremolekül verknüpft sind,
können
gewählt
werden, wobei die regulatorischen Sequenzen die kontinuierliche Expression
des antisense-RNA-Moleküls
in einer Vielfalt von Zelltypen lenken. Beispielsweise können virale
Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen gewählt werden, die
eine konstitutive, gewebespezifische oder Zelltypspezifische Expression
der antisense-RNA lenken. Der Antisense-Expressionsvektor kann in
Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus
vorliegen, worin Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer
hocheffizienten regulatorischen Region erzeugt werden, wobei die
Aktivität
dieser durch den Zelltyp in welchen der Vektor eingeführt wird,
bestimmt wird. Für
eine Diskussion zur Regulation der Genexpression unter Verwendung
von Antisense-Genen siehe Weintraub, H., et al., Antisense RNA as
a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Band
1(1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein
erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor
eingeführt
wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante
Wirtszelle" werden
hierin untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich,
dass die Begriffe nicht nur den besonderen Gegenstand Zelle betreffen,
sondern auch die Nachkommenschaft oder die mögliche Nachkommenschaft einer solchen
Zelle betreffen. Da in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifizierungen
entweder aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann
eine derartige Nachkommenschaft in der Tat nicht identisch zur Elternzelle
sein, sie ist aber immer noch vom Geltungsbereich des Begriffs,
wie er hierin verwendet wird, eingeschlossen.
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Eine
Wirtszelle kann jede beliebige prokaryotische oder eukaryotische
Zelle sein. Beispielsweise kann ein CCSRP in bakteriellen Zellen
wie beispielsweise C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder
Säugerzellen
(wie beispielsweise Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO)
oder COS-Zellen), Algen, Ziliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen
Mikroorganismen wie C. glutamicum exprimiert werden. Weitere geeignete
Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
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Vektor-DNA
kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels herkömmlicher
Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden.
Wie hierin verwendet, sollen die Ausdrücke „Transformation", „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" eine Vielfalt von
fachbekannten Techniken zur Einführung fremder Nukleinsäure (z.B.
DNA) in eine Wirtszelle betreffen, einschließlich Calziumphosphat- oder Calziumchlorid-Copräzipitation,
DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz,
chemisch vermittelter Transfer und Elektroporation. Geeignete Verfahren
zur Transformierung oder Transfektion von Wirtszellen einschließlich Pflanzenzellen
können
Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Zweite
Ausgabe, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie
beispielsweise Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium
protocols, Hrsg. Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey,
entnommen werden. Da biotische oder abiotische Stresstoleranz ein
allgemeines Merkmal ist, welches wunschgemäß einer weiten Bandbreite von
Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste,
Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer,
Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattengewächsen wie Kartoffel, Tabak,
Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Buschgewächsen (Kaffee,
Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäumen
(Ölpalme,
Kokosnuss), perennierendem Gras und Futterplanzen verliehen wird, sind
diese Nutzpflanzen auch bevorzugte Zielpflanzen zur Genmanipulation
als weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die
Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer
transgenen Pflanze mit einer CCSRP-kodierenden Nukleinsäure bereit,
worin die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer
gesteigerten Toleranz gegenüber
Umweltstress im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze
führt,
umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor
umfassend eine CCSRP-Nukleinsäure
und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer gesteigerten
Toleranz gegenüber
Umweltstress im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze
aus einer Pflanzenzelle. Es kann auch ein Verfahren zur Steigerung
der Expression eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle im Vergleich
zu einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle
bereitgestellt werden, worin das Gen von Interesse in Antwort auf
ein CCSRP transkribiert wird, umfassend (a) Transformieren der Wirtszelle
mit einem Expressionsvektor, umfassend eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure und
(b) Expression des CCSRPs innerhalb der Wirtszelle, wobei so die
Expression des in Antwort auf das CCSRP transkribierten Gens im
Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle gesteigert
wird.
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Für eine solche
Pflanzentransformation können
binäre
Vektoren, wie beispielsweise pBinAR verwendet werden (Höfgen und
Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Die Konstruktion der
binären
Vektoren kann durch Ligation der cDNA in sense- oder antisense-Orientierung
in die T-DNA durchgeführt
werden. Ein Pflanzenpromotor am 5'-Ende der cDNA aktiviert die Transkription
der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich am 3'-Ende der cDNA. Gewebespezifische
Expression kann durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors
erreicht werden. Beispielsweise kann eine keimspezifische Expression
durch Klonierung des Napin- oder des LeB4- oder des USP-Promotors am 5'-Ende der cDNA erreicht
werden. Ferner kann jedes andere keimspezifische Promotorelement
verwendet werden. Für
eine konstitutive Expression innerhalb der gesamten Pflanze kann
der CaMV 35S-Promotor verwendet werden. Unter Verwendung eines Signalpeptids,
beispielsweise für
Plastiden, Mitochondrien oder das endoplasmatische Reticulum, kann
das exprimierte Protein auf ein zelluläres Kompartiment ausgerichtet
werden (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci., 1996 4(15): 285–423). Um
eine subzelluläre
Lokalisierung des Fusionsproteins zu erreichen, wird das Signalpeptid im
Leseraster am 5'-Ende
der cDNA kloniert. Zusätzlich
können
Promotoren, die responsiv sind für
abiotischen Stress, wie beispielsweise der Arabidopsis Promotor
RD29A, mit den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden.
Ein Fachmann wird erkennen, dass der verwendete Promotor mit der
Nukleinsäure operativ
verknüpft
sein sollte, sodass der Promotor die Transkription der Nukleinsäure hervorruft,
was zu der Synthese einer mRNA führt,
die ein Polypeptid kodiert. Alternativ kann die RNA eine antisense-RNA
sein, für die
Verwendung für
die Beeinflussung der anschließenden
Expression desselben oder eines anderen Gens oder derselben oder
anderer Gene.
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Verschiedene
Verfahren zur Transfektion beinhalten die direkte Übertragung
von DNA in entwickelnde Blüten über Elektroporation
oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer. Agrobacterium-vermittelte
Pflanzentransformation kann beispielsweise unter Verwendung des
GV3101(pMP90) (Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder
des LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens-Stamms durchgeführt werden.
Die Transformation kann durch Standard-Transformations- und Regenerierungstechniken
durchgeführt
werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin,
Stanton B. und Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual,
2. Ausg. – Dordrecht:
Kluwer Academic Publ., 1995. – in
Sect., Rinbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick,
Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology
and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps durch Kotyledon- oder Hypokotyl-Transformation
transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8:
238–242;
De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Die Verwendung von Antibiotika
zur Agrobacterium- und Pflanzenselektion ist vom zur Transformation
verwendeten binären
Vektor und dem Agrobacterium-Stamm abhängig. Die Selektion von Raps
wird üblicherweise
unter Verwendung von Kanamyzin als wählbarem Pflanzenmarker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter
Gentransfer zu Flachs kann beispielsweise unter Verwendung einer
Technik, welche durch Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285, beschrieben
wurde, durchgeführt
werden. Zusätzlich
kann eine Transformation von Sojabohne beispielsweise unter Verwendung
einer in dem Europäischen
Patent
EP 0 424 047 ,
US-Patent Nr. 5,322,783, in dem Europäischen Patent
EP 0 397 687 , US-Patent Nr. 5,376,543
oder US-Patent Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Eine Transformation von Mais kann unter Verwendung von Partikelbeschuss,
Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder durch die Siliziumcarbidfaser-Technik
erzielt werden (siehe beispielsweise Freeling und Walbot „The maize
handbook" Springer
Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel
zur Transformation von Mais findet sich in
US 5,990,387 und ein spezifisches
Beispiel zur Transformation von Weizen findet sich in der PCT-Anmeldung
WO 93/07256.
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Von
der stabilen Transfektion von Säugerzellen
ist bekannt, dass, abhängig
vom verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik
nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren
kann. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird
normalerweise ein Gen, welches einen selektierbaren Marker (z.B.
Resistenz gegenüber
Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die
Wirtszelle eingeführt.
Bevorzugte selektierbare Marker schließen diejenigen ein, welche
eine Resistenz gegenüber
Wirkstoffen, wie beispielsweise G418, Hygromyzin und Methotrexat,
verleihen oder in Pflanzen eine Resistenz gegenüber einem Herbizid, wie beispielsweise
Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren
Marker kodieren, können
auf dem gleichen Vektor, der ein CCSRP kodiert, in eine Wirtszelle
eingeführt
werden oder sie können
auf einem getrennten Vektor eingeführt werden. Mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül stabil
transfizierte Zellen können
beispielsweise durch Wirkstoffselektion identifiziert werden (z.B.
Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, überleben,
während
die anderen Zellen absterben).
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Um
einen homologen rekombinanten Mikroorganismus zu erzeugen, wird
ein Vektor hergestellt, der wenigstens einen Teil eines CCSRP-Gens
enthält,
in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde,
um so das CCSRP-Gen zu verändern,
z.B. funktionell zu stören.
Vorzugsweise ist das CCSRP-Gen ein Physcomitrella patens CCSRP-Gen,
aber es kann ein Homologon aus einer verwandten Pflanze oder sogar
aus einer Säuger-,
Hefe- oder Insektenquelle sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Vektor so gestaltet, dass nach homologer Rekombination das
endogene CCSRP-Gen funktionell gestört ist (d.h. nicht länger ein
funktionelles Protein kodiert; auch als Knock-out-Vektor bezeichnet).
Wahlweise kann der Vektor so gestaltet sein, dass das endogene CCSRP-Gen
nach homologer Rekombination mutiert ist oder auf eine andere Weise
verändert
ist, aber noch immer ein funktionelles Protein kodiert (z.B. kann
die stromaufwärts
regulatorische Region verändert
sein, um so die Expression des endogenen CCSRP zu verändern).
Zur Erzeugung einer Punktmutation durch homologe Rekombination können DNA-RNA-Hybride in einer
Technik, welche als Chimeraplastie (chimeraplasty) bekannt ist,
verwendet werden (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research
27(5): 1323–1330
und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247). Homologe
Rekombinationsverfahren in Physcomitrella patens sind im Fachbereich
ebenfalls bekannt und zur Verwendung hierin vorgesehen.
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Im
homologen Rekombinationsvektor ist der veränderte Abschnitt des CCSRP-Gens
an seinen 5'- und 3'-Enden durch ein
zusätzliches
Nukleinsäuremolekül des CCSRP-Gens
flankiert, um eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen
CCSRP-Gen, welches vom Vektor getragen wird, und einem endogenen CCSRP-Gen
in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu ermöglichen.
Das zusätzliche
flankierende CCSRP-Nukleinsäuremolekül ist von
ausreichender Länge
für eine
erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Typischerweise
werden einige hundert Basenpaare bis hin zu Kilobasen flankierender DNA
(sowohl an den 5'-
als auch den 3'-Enden)
in den Vektor eingeschlossen (siehe z.B. Thomas, K. R. und Capecchi,
M. R., 1987 Cell 51: 503 für
eine Beschreibung homologer rekombinanter Vektoren oder Strepp et al.,
1998 PNAS, 95 (8): 4368–4373
zur Rekombination in Physcomitrella patens auf Basis von cDNA).
Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle
eingeführt
(z.B. über
Polyethylenglykol-vermittelte DNA) und die Zellen, in welchen das
eingeführte
CCSRP-Gen mit dem endogenen CCSRP-Gen homolog rekombiniert wurde,
werden unter Verwendung von Techniken, welche im Fachbereich bekannt
sind, selektiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
können
rekombinante Mikroorganismen, welche ausgewählte Systeme, die eine regulierte
Expression des eingeführten
Gens erlauben, enthalten, hergestellt werden. Beispielsweise erlaubt
die Inklusion eines CCSRP-Gens auf einem Vektor, welches unter Kontrolle
des Lac-Operons steht, die Expression des CCSRP-Gens ausschließlich in
der Gegenwart von IPTG. Solche regulatorischen Systeme sind im Fachbereich
gut bekannt.
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Eine
erfindungsgemäße Wirtszelle,
wie beispielsweise eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle
in Kultur, kann verwendet werden, um ein CCSRP herzustellen (d.h.
zu exprimieren). In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszellen
(in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, welcher ein CCSRP
kodiert, eingeführt
wurde oder in deren Genom ein Gen, welches einen Wildtyp oder ein
verändertes
CCSRP kodiert, eingeführt
wurde) in einem geeigneten Medium, bis CCSRP hergestellt wird. In
einer anderen Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner die Isolierung von CCSRPs aus dem Medium
oder der Wirtszelle.
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Eine
andere Ausführungsform
betrifft isolierte CCSRPs und biologisch aktive Abschnitte davon.
Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein oder ein
biologisch aktiver Abschnitt davon ist frei von einem Teil zellulären Materials,
falls es durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde oder
frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, falls es
chemisch synthetisiert wurde. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von
zellulärem
Material" umfasst
CCSRP-Präparationen
in welchen das Protein von irgendeiner der zellulären Komponenten
der Zelle, in welchen es natürlich
vorkommt oder rekombinant hergestellt wurde, abgetrennt wurde. In
einer Ausführungsform
umfasst die Formulierung „im
Wesentlichen frei von zellulärem
Material" CCSRP-Präparationen
mit weniger als etwa 30% (in Bezug auf Trockengewicht) nicht-CCSRP (hierin
auch als ein „kontaminierendes
Protein" bezeichnet),
stärker
bevorzugt weniger als etwa 20% nicht-CCSRP Material, stärker bevorzugt
weniger als etwa 10% nicht-CCSRP
Material und am stärksten
bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-CCSRP Material.
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Wenn
das CCSRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon rekombinant
hergestellt wurde, ist es auch bevorzugt frei von Kulturmedium,
d.h. Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt
weniger als etwa 10% und am stärksten
bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation dar.
Die Formulierung „im
Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst CCSRP-Präparationen,
in welchen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien,
die an der Synthese des Proteins beteiligt sind, abgetrennt wurde.
In einer Ausführungsform
umfasst die Formulierung „im
Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" CCSRP-Präparationen
mit weniger als etwa 30% (im Bezug auf Trockengewicht) von chemischen
Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien,
stärker
bevorzugt weniger als etwa 20% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien,
nochmals stärker
bevorzugt weniger als etwa 10% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien
und am stärksten
bevorzugt weniger als etwa 5% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien.
In bevorzugten Ausführungsformen
weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Teile davon keine
verunreinigenden Proteine aus dem selben Organismus, aus welchem
das CCSRP abgeleitet ist, auf. Typischerweise werden solche Proteine
durch rekombinante Expression beispielsweise eines Physcomitrella
patens CCSRP in anderen Pflanzen als Physcomitrella patens oder
Mikroorganismen, wie beispielsweise C. glutamicum, Ziliaten, Algen
oder Pilzen, hergestellt.
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Die
hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine,
Proteinhomologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen
können
in einer oder mehreren der folgenden Methoden verwendet werden:
Identifizierung von Physcomitrella patens und verwandten Organismen;
Kartierung des Genoms von mit Physcomitrella patens verwandten Organismen;
Identifizierung und Lokalisierung von Physcomitrella patens-Sequenzen, welche
von Interesse sind; evolutive Studien; Bestimmung von CCSRP-Regionen, welche
für die
Funktion benötigt
werden; Modulation einer CCSRP-Aktivität; Modulation des Metabolismus
einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulation des Transmembrantransports
einer oder mehrerer Verbindungen; und Modulation der Stresswiderstandfähigkeit.
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Das
Moos Physcomitrella patens repräsentiert
ein Mitglied der Moose. Es ist zu anderen Moosen, wie beispielsweise
Ceratodon purpureus verwandt, welches bei Abwesenheit von Licht
wachstumsfähig
ist. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella teilen einen hohen Grad
an Homologie im Bezug auf die DNA-Sequenz und die Polypeptidebene,
was die Anwendung einer heterologen Durchmusterung von DNA-Molekülen mit
Sonden, welche von anderen Moosen oder Organismen abstammen, ermöglicht und
so die Ableitung einer Konsensus-Sequenz ermöglicht, welche zum heterologen
Durchmustern oder funktionellen Annotieren oder Vorhersagen von
Genfunktionen in einer dritten Spezies geeignet ist. Die Fähigkeit
zur Identifizierung solcher Funktionen kann daher signifikante Bedeutung
haben, z.B. die Vorhersage der Substratspezifität von Enzymen. Ferner können diese
Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte
beim Kartieren von Moosgenomen oder Genomen verwandter Organismen
dienen.
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Die
erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremoleküle weisen
eine Vielfalt an Verwendungen auf. Am wichtigsten ist es, dass die
erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen
verwendet werden können,
um Pflanzen zu transformieren und so Toleranz gegenüber Stress
wie beispielsweise Trockenheit, hohem Salzgehalt und Kälte zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb eine transgene Pflanze,
welche durch eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure transformiert ist, bereit,
worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu
einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich
mit einer Wildtyp-Varietät
der Pflanze führt.
Die transgene Pflanze kann monokotyl oder dikotyl sein. Die Erfindung ermöglicht ferner,
dass die transgene Pflanze beispielsweise ausgewählt werden kann aus Mais, Weizen,
Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle,
Raps, Canola, Manjok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel,
Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee,
Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme,
Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere die Verwendung der
Expression von CC-1 aus Physcomitrella patens um Trockenheits-tolerante
und/oder kältetolerante Pflanzen
zu erstellen. Die Strategie wurde hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola,
Sojabohnen, Mais und Weizen gezeigt, aber ihre Anwendung ist nicht
auf diese Pflanzen beschränkt.
Entsprechend stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die
ein CCSRP ausgewählt
aus CC-1 (SEQ ID NO: 7) enthält,
wobei der Umweltstress Trockenheit oder verringerte Temperatur ist.
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Die
Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifizierung der Stresstoleranz
einer Pflanze bereit, umfassend Modifizieren der Expression von
CC-1 in der Pflanze. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren
so durchgeführt
werden kann, dass die Stresstoleranz gesteigert wird.
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Die
Verfahren zur Erhöhung
der Expression von CCSRPs können
verwendet werden, wenn die Pflanze entweder transgen oder nicht
transgen ist. In Fällen,
in welchen die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem
Vektor, welcher eine beliebige der oben beschriebenen CCSRP-kodierenden
Nukleinsäuren
enthält, transformiert
werden, oder die Pflanze kann beispielsweise mit einem Promotor,
der die Expression von nativem CCSRP in der Pflanze lenkt, transformiert
werden. Die Erfindung stellt ferner bereit, dass ein derartiger Promotor
gewebespezifisch sein kann. Ferner kann ein solcher Promotor entwicklungsabhängig reguliert
sein. Alternativ kann bei nicht-transgene
Pflanze eine native CCSRP-Expression durch Induktion eines nativen
Promotors modifiziert sein.
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Die
Expression von CC-1 (SEQ ID NO: 7) in Zielpflanzen kann durch eines
der folgenden Beispiele erreicht werden, ist aber nicht darauf beschränkt: (a)
konstitutiver Promotor, (b) Stress-induzierbarer Promotor, (c) chemisch-induzierter
Promotor und (d) konstruierte Promotorüberexpression mit beispielsweise
Zinkfinger-abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo,
1997 Science 275: 657). Der letztere Fall schließt sowohl die Identifizierung
von CC-1-(SEQ ID NO: 7) Homologen in der Zielpflanze als auch von
seinem Promotor ein. Zinkfinger-enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren
werden konstruiert, um spezifisch mit dem CC-1-(SEQ ID NO: 7) Homologon
zu wechselwirken und die Transkription des entsprechenden Gens wird
aktiviert.
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Zusätzlich zur
Einführung
der CCSRP-Nukleinsäuresequenzen
in transgene Pflanzen, können
diese Sequenzen auch verwendet werden, um einen Organismus als Physcomitrella
patens oder einen nahen Verwandten davon zu identifizieren. Sie
können
auch verwendet werden, um das Vorliegen von Physcomitrella patens
oder einem Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen
zu identifizieren. Die Nukleinsäuresequenzen
einer Anzahl von Physcomitrella patens-Genen werden bereitgestellt; durch Untersuchen
der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer eindeutigen
oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten
Bedingungen mit einer Sonde, welche einen auf diesen Organismus
beschränkten
Bereich eines Physcomitrella patens-Gens umfasst, kann man feststellen,
ob dieser Organismus vorliegt.
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Ferner
können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und
Proteinmoleküle
als Marker für
spezifische Regionen des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim
Kartieren des Genoms nützlich,
sondern auch bei funktionellen Studien von Physcomitrella patens-Proteinen. Um den
Abschnitt des Genoms zu identifizieren, an welchen ein bestimmtes
Physcomitrella patens-DNA-bindendes Protein bindet, könnte beispielsweise
das Physcomitrella patens-Genom verdaut und die Fragmente mit dem
DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen Fragmente, welche
Protein binden, könnten
zusätzlich
mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen untersucht
werden, vorzugsweise mit einfach zu detektierenden Labels. Das Binden
eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das
Genomfragment ermöglicht
die Lokalisierung des Fragments in der Genomkarte von Physcomitrella
patens und wenn das Verfahren mehrfach mit verschiedenen Enzymen
durchgeführt
wurde, ermöglicht
es die schnelle Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an welche das Protein
bindet. Ferner können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle so ausreichend
homolog zu Sequenzen verwandter Spezies sein, dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker
zur Konstruktion einer Genomkarte in verwandten Moosen dienen können.
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Die
erfindungsgemäßen CCSRP
CC-1 Nukleinsäuremoleküle sind
auch für
evolutive und Proteinstruktur-Untersuchungen nützlich. Die metabolischen Prozesse
und Transportprozesse, an welchen die erfindungsgemäßen Moleküle partizipieren,
werden von einer breiten Vielfalt prokaryotischer und eukaryotischer
Zellen benutzt. Durch den Vergleich der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen,
die ähnliche
Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann die evolutive Beziehung
der Organismen beurteilt werden. In ähnlicher Weise erlaubt ein
derartiger Vergleich eine Bewertung, welche Sequenzregionen konserviert
sind und welche nicht, wobei dies bei der Bestimmung solcher Proteinregionen
hilfreich sein kann, die für
das Funktionieren des Enzyms essentiell sind. Diese Art der Bestimmung
ist von Bedeutung für
Studien zur Proteinkonstruktion und kann einen Hinweis darauf geben,
was das Protein im Hinblick auf Mutagenese ohne Verlust seiner Aktivität tolerieren
kann.
-
Die
Manipulation von erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremolekülen kann
zur Erzeugung von CCSRPs mit funktionellen Unterschieden zu Wildtyp-CCSRPs
führen.
Die Proteine können
in ihrer Effizienz oder Aktivität
verbessert sein, können
in größerer Anzahl
als gewöhnlich
in der Zelle vorliegen oder können
in ihrer Effizienz oder Aktivität
vermindert sein.
-
Es
gibt eine Vielzahl von Mechanismen, durch welche die Veränderung
eines erfindungsgemäßen CCSRPs
eine Stressantwort und/oder Stresstoleranz direkt beeinflussen kann.
Für den
Fall, dass Pflanzen CCSRPs exprimieren, kann ein gesteigerter Transport
zu einer verbesserten Salzverteilung und/oder Verteilung gelöster Stoffe
innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Sowohl durch eine Steigerung
der Zahl als auch der Aktivität
der Transportermoleküle,
welche ionische Moleküle
aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Salztoleranz
der Zelle zu beeinflussen.
-
Der
Einfluss einer genetischen Modifizierung in Pflanzen, C. glutamicum,
Pilzen, Algen oder Ziliaten auf Stresstoleranz kann durch Aufzucht
des modifizierten Mikroorganismus oder der modifizierten Pflanze
unter Bedingungen, die schlechter als geeignete Bedingungen sind,
und anschließende
Analyse der Wachstumscharakteristika und/oder des Metabolismus der
Pflanze bewertet werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann
gut bekannt und schließen
Trockengewicht, Nassgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese,
Evapotranspirationsgeschwindigkeiten, allgemeiner Pflanzen- und/oder
Ernteertrag, Blüte,
Reproduktion, Samenbeladung, Wurzelwachstum, Atmungsraten, Photosyntheseraten
etc. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biologym, Band 17; Rehm et al., 1993
Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification,
Seiten 469–714, VHC:
Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream
processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F.
und Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials,
John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical
separations, in: Ulmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seiten
1–27,
VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques
in biotechnology, Noyes Publications).
-
Beispielsweise
können
Hefeexpressionsvektoren konstruiert werden, die die hierin offenbarten
Nukleinsäuren
oder Fragmente davon umfassen, und unter Verwendung von Standardprotokollen
in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden. Die resultierenden
transgenen Zellen können
dann auf ein Ausbleiben oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheit,
Salz und Temperaturstress untersucht werden. In gleicher Weise können Pflanzenexpressionsvektoren
konstruiert werden, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder
Fragmente davon umfassen, und in eine geeignete Pflanzenzelle, wie
z.B. Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula
etc. unter Verwendung von Standardprotokollen transformiert werden.
Die sich daraus ergebenden transgenen Zellen und/oder daraus abgeleiteten
Pflanzen können
dann auf ein Ausbleiben oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheit,
Salz und Temperaturstress untersucht werden.
-
Die
Konstruktion von einem oder mehreren erfindungsgemäßen CCSRP-Genen
kann auch zu CCSRPs mit veränderten
Aktivitäten
führen,
welche indirekt auf die Stressantwort und/oder Stresstoleranz von
Algen, Pflanzen, Ziliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen
wie C. glutamicum einwirken. Beispielsweise führen die normalen biochemischen
Prozesse des Metabolismus zur Erzeugung einer Vielzahl von Produkten
(z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies),
die aktiv in den selben metabolischen Prozessen wechselwirken können (beispielsweise
ist Peroxynitrit dafür
bekannt, Tyrosinseitenketten zu nitrieren, wobei solche Enzyme mit
Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden) (Groves, J. T., 1999
Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226–235). Während diese Produkte typischerweise
ausgeschieden werden, können
Zellen genetisch verändert
werden, um mehr Produkte als für
eine Wildtypzelle typisch, zu transportieren. Durch Optimierung
der Aktivität
eines oder mehrerer erfindungsgemäßer CCSRPs, die in den Export
spezifischer Moleküle
involviert sind, wie beispielsweise Salzmoleküle, kann es möglich sein,
die Stresstoleranz der Zelle zu verbessern.
-
Zusätzlich können die
hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon verwendet werden,
um Knock-Out-Mutationen in Genomen verschiedenartiger Organismen
zu erzeugen, wie beispielsweise Bakterien, Säugerzellen, Hefezellen und
Pflanzenzellen (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48). Die
sich ergebenden Knock-Out-Zellen können dann nach ihrer Fähigkeit
oder ihrer Kapazität
verschiedene Stressbedingungen zu tolerieren, nach ihrer Antwort
auf verschiedene Stressbedingungen und den Effekt auf den Phänotyp oder
Genotyp der Mutation bewertet werden. Für andere Verfahren zur Gen-Inaktivierung
siehe US-Patent Nr. 6,004,804 "Non-Chimeric
Mutational Vectors" und
Puttaraju et al., 1999 Spliceosomemediated RNA trans-splicing as
a tool for gene therapy Nature Biotechnology 17: 246–252.
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Die
oben genannten Mutagenesestrategien für CCSRPs zum Erlangen einer
gesteigerten Stressresistenz, sind nicht beschränkend zu verstehen; Veränderungen
dieser Strategien sind für
den Fachmann leicht erkennbar. Unter Verwendung solcher Strategien
und unter Berücksichtigung
der hierin offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und
Proteinmoleküle
verwendet werden, um Algen, Ziliaten, Pflanzen, Pilze oder andere
Mikroorganismen wie C. glutamicum zu erzeugen, welche mutierte CCSRP-Nukleinsäuren und
Proteinmoleküle
exprimieren, so dass die Stresstoleranz verbessert ist.
-
Antikörper können bereitgestellt
werden, welche spezifisch an ein CCSRP oder einen Abschnitt davon, wie
es/er durch eine hierin offenbarte Nukleinsäure kodiert wird, binden. Antikörper können durch
viele bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Harlow und
Lane, "Antibodies;
A Laboratory Manual" Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)):
Gereinigtes Antigen kann in ein Tier in einer Menge und in Abständen, die
ausreichend sind, eine Immunantwort auszulösen, injiziert werden. Die
Antikörper
können
entweder direkt gereinigt werden oder es können Milzzellen des Tiers erhalten
werden. Die Zellen können dann
mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und nach einer Antikörpersekretion
durchmustert werden. Die Antikörper
können
verwendet werden, um Nukleinsäure-Klonbibliotheken
nach Zellen, welche das Antigen absondern, zu durchmustern. Solche
positiven Klone können
anschließend
sequenziert werden (siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology
10: 163–167;
Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
-
Die
Formulierungen "bindet
selektiv" und "bindet spezifisch" mit dem Polypeptid
beziehen sich auf eine Binde-Reaktion, welche die Gegenwart des
Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen oder anderen
biologischen Stoffen anzeigt. Das heißt, unter ausgewiesenen Immunoassay-Bedingungen
bindet der spezifizierte Antikörper,
der an ein bestimmtes Protein gebunden ist, in keiner signifikanten
Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Ein selektives
Binden an einen Antikörper
unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der für seine
Spezifität
gegenüber
einem bestimmten Protein ausgewählt
ist. Eine Vielfalt von Immunoassayausführungen kann verwendet werden,
um Antikörper
auszuwählen,
die selektiv mit einem bestimmten Protein binden. Beispielsweise
werden Festphasen-ELISA-Immunoassays
routinemäßig verwendet,
um Antikörper
auszuwählen,
welche selektiv immunoreaktiv mit einem Protein sind. Siehe Harlow
und Lane, "Antibodies,
A Laboratory Manual" Cold
Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immunoassayausführungen
und Bedingungen, die verwendet werden können, um ein selektives Binden
zu bestimmen.
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In
einigen Fällen
ist es wünschenswert,
monoklonale Antikörper
aus verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken
zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper kann Stites et al., Herausgeber, "Basic and Clinical
Immunology", (Lange
Medical Publications, Los Altos, Kalif., Vierte Ausgabe) und darin
zitierten Referenzen und Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications,
New York, (1988) entnommen werden.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass die vorhergehenden Ausführungen bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung betreffen. Die Erfindung wird durch die
folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche im Bezug auf
den Umfang der Erfindung in keiner Weise als Beschränkungen
zu verstehen sind.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1
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Aufzucht von Physcomitrella
patens-Kulturen
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Für diese
Studie wurden Pflanzen der Spezies Physcomitrella patens (Hedw.)
B.S.G. aus der Sammlung der Abteilung für genetische Studien der Universität Hamburg
verwendet. Sie stammen vom Stamm 16/14 ab, welcher von H.L.K. Whitehouse
in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) eingesammelt wurde und der
von Engel aus einer Spore subkultiviert wurde (1968, Am. J. Bot.
55, 438–446).
Die Proliferation der Pflanzen wurde mittels Sporen und mittels
Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema entwickelte
sich aus der haploiden Spore als ein Chloroplasten-reiches Chloronema
und ein Chloroplasten-armes Caulonema, worauf sich nach etwa 12
Tagen Knospen bildeten. Diese wuchsen unter Bildung von Gametangienträgern, welche
Antheridien und Archegonien hervorbrachten. Nach der Befruchtung
ergab sich die diploide Sporophyte mit einer kurzen Seta und der
Sporenkapsel, in welcher die Meiosporen reiften.
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Die
Kultivierung wurde in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur
von 25°C
und einer Lichtintensität
von 55 Mikromol–lm2 (weißes Licht;
Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre)
und einem Licht-/Dunkelwechsel von 16/8 Stunden durchgeführt. Das
Moss wurde entweder in Flüssigkultur
unter Verwendung von Knop-Medium gemäß Reski und Abel (1985, Planta
165: 354–358)
modifiziert oder unter Verwendung von 0,1% Oxoidagar (Unipath, Basingstoke,
England) auf festem Knop-Medium kultiviert. Die für RNA- und
DNA-Isolierung verwendeten Protonema wurden in belüfteten Flüssigkulturen
kultiviert. Die Protonema wurden alle 9 Tage verkleinert und in
frisches Kulturmedium überführt.
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Beispiel 2
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Isolierung von Gesamt-DNA
aus Pflanzen
-
Die
Einzelheiten zur Isolierung von Gesamt-DNA beziehen sich auf die
Aufarbeitung von einem Gramm Frischgewicht an Pflanzenmaterial.
Die verwendeten Materialien schließen die folgenden Puffer ein: CTAB-Puffer:
2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid
(CTAB); 100 mM Tris HCl pH 8,0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; N-Laurylsarcosin-Puffer:
10% (w/v) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris HCl pH 8,0; 20 mM EDTA.
-
Das
Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem
Stickstoff in einem Mörser
zerrieben, um ein feines Puder zu ergeben und in 2 ml Eppendorf-Gefäße übertragen.
Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde anschließend mit einer Schicht von
1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 μl N-Laurylsarcosin-Puffer, 20 μl β-Mercaptoethanol
und 10 μl
Proteinase-K-Lösung,
10 mg/ml) bedeckt und für
eine Stunde bei 60°C
unter ständigem Schütteln inkubiert.
Das erhaltene Homogenat wurde auf zwei Eppendorf-Gefäße (2 ml)
aufgeteilt und zweimal durch Schütteln
mit demselben Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.
Zur Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g und
Raumtemperatur für
15 Minuten durchgeführt.
Die DNA wurde anschließend
bei –70°C für 30 Minuten
unter Verwendung von eisgekühltem
Isopropanol präzipitiert.
Die präzipitierte
DNA wurde bei 4°C
und 10 000 g für
30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook
et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration)
behandelt und wiederum bei –70°C für 30 Minuten unter
Verwendung des doppelten Volumens von absolutem Ethanol präzipitiert.
Nach einem Wasch-Schritt mit 70%-igem Ethanol, wurde die DNA getrocknet
und anschließend
in 50 μl
H2O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration)
aufgenommen. Die DNA wurde über
Nacht bei 4°C
gelöst
und anschließend
wurde der RNAse-Verdau bei 37°C
für eine
Stunde durchgeführt.
Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4°C.
-
Beispiel 3
-
Isolierung von Gesamt-RNA
und Poly-(A)+ RNA und Erstellen einer cDNA-Bibliothek
aus Physcomitrella patens
-
Zur
Untersuchung von Transkripten wurde sowohl Gesamt-RNA als auch Poly-(A)+ RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde aus
9 Tage alten Wildtyp-Protonerneta unter Befolgung des GTC-Verfahrens
(Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359) erhalten. Die Poly-(A)+-RNA wurde unter Verwendung von Dyna BeadsR (Dynal, Oslo, Norwegen) unter Befolgung
der Instruktionen des Herstellerhandbuchs isoliert. Nach Bestimmung
der RNA- oder der Poly-(A)+ RNA-Konzentration
wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH
4,6 und 2 Volumina Ethanol präzipitiert
und bei –70°C gelagert.
-
Zur
cDNA-Bibliothek-Konstruktion wurde die Erststrangsynthese unter
Verwendung von reverser Transkriptase aus murinem Leukämievirus
(Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese
durch Inkubation mit DNA-Polymerase
I, Klenow-Enzym und RNAseH-Verdau bei 12°C (2 Stunden), 16°C (1 Stunde)
und 22°C
(1 Stunde) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 Minuten)
gestoppt und anschließend
auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden
durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 Minuten) mit glatten Enden
versehen. Nukleotide wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion und
Sephadex G50-Spin-Säulen
entfernt. EcoRI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden
durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht)
an die cDNA-Enden ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase
(Roche, 37°C,
30 Minuten) phosphoryliert. Das Gemisch wurde auf einem niedrig
schmelzenden Agarosegel einer Auftrennung unterzogen. DNA-Moleküle, die
größer als
300 Basenpaare waren, wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert
und auf Elutip-D-Säulen
(Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und an
die Enden eines Vektors ligiert und unter Verwendung des Gigapack
Gold Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) in Lambda-ZAPII-Phagen
oder Lambda-ZAP-Expressphagen verpackt, wobei Material des Herstellers
verwendet und die Herstellervorschriften befolgt wurden.
-
Beispiel 4
-
Sequenzierung und Funktionsannotierung
von Physcomitrella patens ESTs
-
cDNA-Bibliotheken
wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden zur DNA-Sequenzierung gemäß Standardverfahren
und insbesondere durch das Kettenabbruchverfahren unter Verwendung
des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
-
Im
Anschluss an eine präperative
Plasmidgewinnung aus cDNA-Bibliotheken durch in vivo-Massenexzision,
Retransformation und anschließendes
Ausplatieren von DH10B auf Agarplatten wurde Random-Sequenzierung
durchgeführt
(Material und Protokolleinzelheiten von Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Plasmid-DNA
wurde aus über
Nacht aufgezogenen E. coli-Kulturen, welche in Luria-Broth-Medium
mit Ampizillin aufgezogen wurden (siehe Sambrook et al., 1989 Cold
Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) mit einem Qiagen
DNA-Präparationsrobotor
(Qiagen, Hilden) gemäß dem Herstellerhandbuch hergestellt.
Es wurden Sequenzierungsprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen
verwendet:
-
-
Die
Sequenzen wurden unter Verwendung des Softwarepakets EST-MAX, welches
kommerziell von Bio-Max (München,
Deutschland) angeboten wird, verarbeitet und annotiert. Das Programm
berücksichtigt
so gut wie alle bioinformatischen Verfahren, die für eine funktionale
und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen wichtig
sind. Zur Referenz dient die Webseite unter pedant.mips.biochem.mpg.de.
Die wichtigsten Algorithmen, die durch EST-MAX berücksichtigt
werden, sind: FASTA: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der
statistischen Signifikanz; Pearson W. R. (1990) Rapid and sensitive
sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183:
63–98;
BLAST: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der
statistischen Signifikanz. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers
E. W., und Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal
of Molecular Biology 215: 403–10;
PREDATOR: Sekundärstrukturvorhersage
von einzelnen und mehreren Sequenzen mit hoher Genauigkeit. Frishman,
D. und Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure
prediction. Proteins, 27: 329–335;
CLUSTALW: Alignment mehrerer Sequenzen. Thompson, J. D., Higgins,
D. G. und Gibson, T. J. (1994); CLUSTAL W: improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,
positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic
Acids Research, 22: 4673–4680;
TMAP: Vorhersage der transmembranen Region von mehrfach alignten
Sequenzen. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane
segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J.
Mol. Biol. 237: 182–192; ALOM2:
Transmembranregionvorhersage von einzelnen Sequenzen. Klein, P.,
Kanehisa, M., und DeLisi, C. Prediction of protein function from
sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim.
Biophys. Acta 787: 221–226
(1984). Version 2 von Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Erkennung von PROSITE-Proteinsequenzmustern.
Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch:
fast searching of protein sequences with regular expression patterns
related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919–921; BLIMPS: Ähnlichkeitssuchen
gegen eine Datenbank von lückenlosen
(ungapped) Blöcken.
J. C. Wallace und Henikoff S., (1992); PATMAT: Ein Such- und Extraktionsprogramm
für Sequenzen-,
Muster- und Blockanfragen und Datenbanken, CABIOS 8: 249–254. Geschrieben
von Bill Alford.
-
Beispiel 5
-
Identifizierung von Physcomitrella
patens ORF entsprechend CC-1, CC-2 und CC-3 CC-2 und CC-3 sind Vergleichsversuche
-
Die
unten in Tabelle 1 gezeigten partiellen cDNAs (ESTs) aus Physcomitrella
patens wurden mit dem Physcomitrella patens-EST-Sequenzierungsprogramm
unter Verwendung des Programms EST-MAX durch BLAST-Analyse identifiziert.
Die Sequenzidentifizierungsnummern entsprechend diesen ESTs sind
wie folgt: CC-1 (SEQ ID NO: 1), CC-2 (SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ
ID NO: 3). Tabelle
1
-
Tabelle
2 Grad
der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit
von PpCC-1 und anderen homologen Proteinen (ein GCG-Gap-Programm
wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score
matrix: blosum62)
-
Tabelle
3 Grad
der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit
von PpCC-2 und anderen homologen Proteinen; ein GCG-Gap-Programm
wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score
matrix: blosum62 (Vergleichsbeispiel)
-
-
Tabelle
4 Grad
der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit
von PpCC-3 und anderen homologen Proteinen; ein GCG-Gap-Programm
wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score
matrix: blosum62 (Vergleichsbeispiel)
-
Beispiel 6
-
Klonierung der Volllängen Physcomitrella
patens-cDNA, welche für
CC-1, CC-2 und CC-3 kodiert (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Um
die Klone zu isolieren, die für
Pp CC-1 (SEQ ID NO: 4), Pp CC-2 (SEQ ID NO: 5) und Pp CC-3 (SEQ
ID NO: 6) aus Physcomitrella patens codieren, wurden mit SMART RACE
cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories) nach Anweisung des
Herstellers cDNA-Bibliotheken erzeugt. Gesamt-RNA, die wie in Beispiel
3 beschrieben isoliert wurde, wurde als Matrize verwendet. Die Kulturen
wurden vor Isolierung der RNA wie folgt behandelt: Salzstress: 2,
6, 12, 24, 48 Stunden mit 1-M NaCl-ergänztem Medium; Kältestress:
4°C für die gleichen
Zeitspannen wie bei Salz; Trockenheitsstress: Kulturen wurden auf
trockenem Filterpapier inkubiert, für die gleichen Zeitspannen
wie bei Salz.
-
5' RACE Protokoll
-
Die
bei der in Beispiel 4 beschriebenen Datenbanksuche identifizierten
EST-Sequenzen CC-2
(SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ ID NO: 3) wurden verwendet, um Oligos
für RACE
zu erstellen (siehe Tabelle 5). Die verlängerten Sequenzen für diese
Gene wurden erhalten, indem RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends
Polymerasekettenreation) durchgeführt wurde, unter Verwendung
des Advantage 2 PCR Kits (Clontech Laboratories) unter Verwendung
eines Biometra T3 Thermocyklers, entsprechend Herstelleranweisungen.
Die bei den RACE Reaktionen erhaltenen Sequenzen entsprachen den
vollen Längen
der codierenden Regionen von CC-2 und CC-3 und wurden verwendet,
um Oligos für
eine Volllängen-Klonierung
der entsprechenden Gene zu entwerten (siehe unten Volllängen-Amplifizierung)
-
Volllängen-Amplifizierung
-
Volllängen-Klone
entsprechend CC-1 (SEQ ID NO: 4), CC-2 (SEQ ID NO: 5) und CC-3 (SEQ
ID NO: 6) wurden erhalten, indem Polymerasekettenreaktionen (PCR)
mit genspezifischen Primern (siehe Tabelle 5) und dem ursprünglichen
EST als Matrize durchgeführt
wurden. Die Reaktionsbedingungen waren Standardbedingungen mit PWO
DNA Polymerase (Roche). PCR wurde gemäß Standardbedingungen und entsprechend
den Herstelleranweisungen durchgeführt (Sambrook et al., 1989
Molecular Coloning, A. Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., Biometra T3 Thermocykler). Die
Reaktionsparameter waren: 5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen von
einer Minute bei 94°C,
1 Minute bei 50°C
und 1,5 Minuten bei 72°C.
Anschließend
erfolgten 25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 65°C und 1,5
Minuten bei 72°C.
-
Die
amplifizierten Fragmente wurden von Agarosegel extrahiert mit einem
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) und in den TOPO pCR 2.1 Vektor
(Invitrogen) ligiert, gemäß Herstelleranweisungen.
Rekombinante Vektoren wurden unter Verwendung von Standardbedingungen
in Top10 Zellen (Invitrogen) transformiert (Sambrook et al. 1989
Molecular Coloning, A. Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Transformierte
Zellen wurden auf LB-Agar, der 100 μg/ml Carbenizillin, 0,8 mg X-gal
(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid)
und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-galaktosid)
enthielt, selektiert und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Weiße
Kolonien wurden ausgewählt
und verwendet, um 3 ml flüssiges
LB, welches 100 μg/ml
Ampizillin enthielt, anzuimpfen, und über Nacht bei 37°C aufgezogen.
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits
(Qiagen) unter Befolgung der Herstellerangaben extrahiert. Analysen
der nachfolgenden Klone und Restriktionskartierung wurden nach molekularbiologischen
Standardtechniken (Sambrook et al. 1989 Molecular Coloning, A Laboratory
Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring
Harbor, NY) durchgeführt.
-
Tabelle
5 für die Klonierung
von Volllängen-Klonen
verwendetes Schema und Primer
-
-
Beispiel 7
-
Konstruktion stresstoleranter
Arabidopsis-Pflanzen durch Überexpression
der Gene CC-1, CC-2 und CC-3 (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Binäre Vektorkonstruktion: Kanamycin
-
Das
Plasmid-Konstrukt pACGH101 wurde mit PstI (Roche) und FseI (NEB)
gemäß Herstellerangaben verdaut.
Das Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und mit dem Qiaex
II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Dies ergab ein Vektorfragment
mit dem Arabidopsis Actin2 Promotor mit internem Intron und dem
OCS3 Terminator. Primer für
die PCR Amplifizierung des NPTII-Gens waren wie folgt aufgebaut:
-
-
-
Das
0,9 kb NPTII-Gen wurde durch PCR amplifiziert aus pCambia 2301 Plasmid-DNA
[94°C 60
sek, {94°C
60 sek, 61°C
(–0,1°C pro Zyklus)
60 sek, 72°C
2 min} × 25
Zyklen, 72°C
10 min an Biometra T-Gradient Maschine] und mittels des Qiaquick
PCR Extraction Kits (Qiagen) gemäß Herstelleranweisungen
aufgereinigt. Die PCR-DNA wurde dann in den pCR-BluntII TOPO Vektor
(Invitrogen) subkloniert, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers
(NPT-TOPO Konstrukt). Diese Ligate wurden in Top10 Zellen (Invitrogen)
transformiert und auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat über Nacht
bei 37°C
aufgezogen. Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml LB-Medium mit
50 μg/ml
Kanamycinsulfat zu beimpfen und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin
Miniprep Kits (Qiagen) gewonnen und sowohl in 5' als auch in 3' Richtung unter Verwendung von Standardbedingungen
sequenziert. Anschließende Analyse
der Sequenzdaten unter Verwendung von VectorNTI Software ergab,
dass in der NPTII-Gensequenz keine PCR-Fehler vorlagen.
-
Das
NPT-Topo Konstrukt wurde dann mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß Herstellerangaben
verdaut. Das 0,9 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt
und mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Das
Pst/Fse-Einschubfragment
von NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektorfragment von pACGH101 wurden
dann zusammen ligiert, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Roche),
unter Befolgung der Herstellerangaben. Das Ligat wurde dann unter
Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert,
wobei ein pBPSsc019-Konstrukt erzeugt wurde. Kolonien wurden auf
LB-Platten mit 50 μg/ml
Kanamycinsulfat selektiert und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Diese Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat
zu beimpfen und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin
Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers
gewonnen.
-
Das
pBPSSC019 Konstrukt wurde mit KpnI und BsaI (Roche) gemäß Herstelleranweisungen
verdaut. Das Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und dann
anweisungsgemäß mit dem
Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert, was zu einer 3
kb Act-NPT-Kassette führte,
die den Arabidopsis Actin2 Promotor mit internem Intron, das NPTII-Gen
und den OCS3 Terminator enthielt.
-
Der
Vektor pBPSJH001 wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut und mit
Klenow-Enzym und
0.1 mM dNTPs (Roche) gemäß Herstellerangaben
zu glatten Enden aufgefüllt.
Dadurch wurde ein 10,1 kb-Vektorfragment abzüglich der Gentamycin-Kassette erzeugt,
welches durch selbst-Ligieren mit T4-DNA-Ligase (Roche) rezirkuliert
wurde, und unter Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen)
transformiert wurde. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, welches
50 μg/ml
Kanamycinsulfat enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen.
Die Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml flüssiges LB, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat
enthielt, zu beimpfen, und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin
Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers
gewonnen. Das rezirkulierte Plasmid wurde dann mit KpnI (Roche)
verdaut und von einem Agarosegel mit dem Qiaex II DNA Extraction
Kit (Qiagen) extrahiert, entsprechend der Anweisungen des Herstellers.
-
Der
Act-NPT Kpn-cut Einschub und der Kpn-cut pBPSJH001 rezirkulierte
Vektor wurden dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche) aneinander
ligiert, und entsprechend der Anweisungen des Herstellers in Top10-Zellen
(Invitrogen) transformiert. Das sich ergebende Konstrukt, pBPS022,
enthielt nun den Superpromotor, das GUS-Gen, den NOS-Terminator
und die Act-NPT-Kassette. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar,
welches 50 μg/ml
Kanamycinsulfat enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen.
Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml flüssiges LB, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat
enthielt, zu beimpfen, und über
Nacht bei 37°C
aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin
Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers
gewonnen. Nach Bestätigung
der erfolgreichen Ligierung durch Restriktionsverdau wurde pBPSsc022
Plasmid-DNA weiter vermehrt und unter Verwendung des Plasmid Midiprep
Kits (Qiagen) entsprechend der Anweisungen des Herstellers gewonnen.
-
Subklonierung von CC-1,
CC-2 und CC-3 in den binären
Vektor
-
Die
Fragmente, welche die verschiedenen Physcomitrella patens-Transkriptionsfaktoren
enthalten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1 TOPO Vektoren durch
zweifachen Verdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 6) gemäß Herstellerangaben
subkloniert. Das Untersequenz-Fragment wurde aus einem Agarosegel
mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen) gemäß Herstellerangaben
ausgeschnitten und in die binären
Vektoren pGMSG, welche vor der Ligation mit XmaI und Ecl136II geschnitten
und dephosphoriliert worden waren, ligiert. Der sich ergebende rekombinante
pGSMG enthielt die entsprechenden Transkriptionsfaktoren in sense-Orientierung
unter dem konstitutiven Superpromotor. Tabelle
6 Aufgelistet
sind die Namen der verschiedenen Konstrukte der Physcomitrella patens
Transkriptionsfaktoren, die für
die Pflanzentransformation verwendet wurden
-
Agrobakterium-Transformation
-
Die
rekombinanten Vektoren wurden nach Standardbedingungen in Agrobacterium
tumefaciens C58C1 und PMP90 transformiert (Hoefgen und Willmitzer,
1990).
-
Pflanzentransformation
-
Arabidopsis
thaliana Ökotyp
C24 wurden aufgezogen und gemäß Standardbedingungen
transformiert (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194–1199; Bent
et al. 1994, Science 265: 1856–1860).
-
Durchmustern transformierter
Pflanzen
-
T1-Samen
wurde nach Standardprotokollen sterilisiert (Xiong et al. 1999,
Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170). Die Samen wurden auf ½ MS 0,6%
Agar, der mit 1% Saccharose, 50 μg/ml
Kanamycin (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml
Benomyl (Sigma-Aldrich) supplementiert war, ausplattiert. Die Samen
auf den Platten wurden für
vier Tage bei 4°C
vernalisiert. Die Samen wurden in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur
von 22°C
und einer Lichtintensität
von 40 Mikromol–lm2 (weißes Licht;
Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre)
und einem Tageslängenzyklus
mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gekeimt. Transformierte Keimlinge
wurden nach 14 Tagen selektiert und auf ½ MS 0,6% Agarplatten, die
mit 1% Saccharose supplementiert waren, übertragen und man ließ sie sich
für fünf bis sieben
Tage erholen.
-
Durchmustern nach Trockenheitstoleranz
-
Die
T1-Keimlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in einer
Petrischale übertragen
und man ließ sie
für zwei
Stunden bei 80% LF (relative Luftfeuchtigkeit) in einem Sanyo Wachstumsschrank
MLR-350H, Mikromol–lm2 (weißes Licht;
Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre)
austrocknen. Die LF wurde dann auf 60% abgesenkt und die Keimlinge
wurden für
weitere acht Stunden ausgetrocknet. Die Keimlinge wurden dann entfernt
und auf ½ MS
0,6% Agarplatten platziert, die mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert
waren, und nach fünf Tagen
ausgewertet.
-
Bei
Trockenheitsstress-Bedingungen zeigten die PpCC-1 überexprimierenden
Arabidopsis thaliana Pflanzen eine Überlebensrate von 67% (6 Überlebende
von 9 gestressten Pflanzen), PpCC-2: 75% (6 Überlebende von 8 gestressten
Pflanzen) und PpCC-3: 92% (11 Überlebende
von 12 gestressten Pflanzen), wohingegen die Kontrollen nur eine Überlebensrate
von 11% (1 Überlebender
von 9 gestressten Pflanzen) zeigten (siehe Tabelle 7). Es ist beachtenswert,
dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden,
daher werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter, starker
Expressor gefunden wird. Tabelle
7 Zusammenfassung
des Trockenheitsstress-Tests
-
Durchmustern nach Frosttoleranz
-
Die
Keimlinge wurden auf Petrischalen übertragen, die ½ MS 0,6%
Agar enthielten, der mit 2% Saccharose und mit 2 μg/ml Benomyl
supplementiert war. Nach vier Tagen wurden die Keimlinge für eine Stunde bei
4°C inkubiert
und dann mit geschabtem Eis bedeckt. Die Keimlinge wurden dann in
einer Environmental Specialist ES2000 Klimakammer plaziert und für 3,5 Stunden
beginnend bei –1,0°C, inkubiert,
wobei jede Stunde um –1°C abgesenkt
wurde. Die Keimlinge wurden dann für 24 Stunden bei –5°C inkubiert
und dann ließ man
sie bei 5°C
für 12
Stunden auftauen. Das Wasser wurde abgegossen und die Keimlinge
wurden nach 5 Tagen ausgewertet.
-
Bei
Froststress-Bedingungen zeigten die PpCC-1 überexprimierenden Arabidopsis
thaliana Pflanzen eine Überlebensrate
von 89% (8 Überlebende
von 9 gestressten Pflanzen), wohingegen die untransformierten Kontrollen
nur eine Überlebensrate
von 2% (1 Überlebender
von 48 gestressten Pflanzen) zeigten (siehe Tabelle 8). Es ist beachtenswert,
dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden,
daher werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter, starker
Expressor gefunden wird.
-
Tabelle
8 Zusammenfassung
des Froststress-Tests
-
Durchmustern nach Salztoleranz
(Vergleichsbeispiel)
-
Die
Keimlinge wurden auf Filterpapier, welches mit ½ MS getränkt war, übertragen und die Nacht vor der
Durchführung
der Durchmusterung auf Salztoleranz auf ½ MS 0,6% Agar platziert,
der mit 2 μg/ml
Benomyl supplementiert war. Zur Durchmusterung auf Salztoleranz
wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel aus mit 50
mM NaCl getränktem,
sterilem Filterpapier in einer Petrischale übertragen. Nach zwei Stunden wurde
das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier,
welches mit 200 mM NaCl getränkt
war, in einer Petrischale übertragen.
Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel
von sterilem Filterpapier, welches in 600 mM NaCl getränkt war,
in einer Petrischale übertragen.
Nach 10 Stunden wurden die Keimlinge auf Petrischalen übertragen,
die ½ MS
0,6% Agar enthielten, der mit 2 μg/ml Benomyl
supplementiert war. Die Keimlinge wurden nach fünf Tagen ausgewertet.
-
Die
transgenen Pflanzen werden auf ihre verbesserte Salztoleranz hin
durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Salztoleranz
verleiht.
-
Beispiel 8
-
Detektion von CC-1, CC-2
und CC-3 Transgenen in den transgenen Arabidopsis-Linien (CC-2 und
CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Ein
Blatt eines Wildtyps und einer transgenen Arabidopsis-Pflanze wurden
in 250 μl
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Puffer (2% CTAB, 1,4 M NaCl,
8 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8,0) und 1 μl β-Mercaptoethanol homogenisiert.
Die Proben wurden für
30 Minuten bei 60–65°C inkubiert
und anschließend wurden
zu jeder Probe 250 μl
Chloroform hinzugegeben. Die Proben wurden drei Minuten verwirbelt
und fünf Minuten
bei 18.000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde von jeder Probe abgenommen und 150 μl Isopropanol wurden zugegeben.
Die Proben wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 10
Minuten bei 18.000 × g
zentrifugiert. Jedes Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet
und in 20 μl
TE resuspendiert. 4 μl
der obigen Suspension wurden in einer 20 μl PCR-Reaktion unter Verwendung
von Taq-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) gemäß Herstellerangaben
eingesetzt. Die in den Reaktionen verwendeten Primer waren:
-
-
Das
PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute
bei 62°C
und 4 Minuten bei 72°C,
gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen wurde ein 1,6
kb Fragment erzeugt.
-
-
Die
Primer wurden in der ersten Runde der Reaktionen in dem folgenden
Programm verwendet: 30 Zyklen für
1 Minute bei 94°C,
1 Minute bei 62°C
und 4 Minuten bei 72°C,
gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Aus der Positivkontrolle und den T1-transgenen Pflanzen wurde ein
3 kb Fragment erzeugt.
-
-
Das
PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute
bei 62°C
und 4 Minuten bei 72°C,
gefolgt von 10 Minuten bei 72°C.
Aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen wurde ein 2,3
kb Fragment erzeugt.
-
Die
Transgenen wurden erfolgreich aus den T1-transgenen Linien amplifiziert,
aber nicht aus dem Wildtyp C24. Dieses Ergebnis zeigt, dass die
T1-transgenen Pflanzen wenigstens eine Kopie der Transgene enthalten.
Es gab keine Anzeichen für
die Existenz von identischen oder sehr ähnlichen Genen in der untransformierten
Arabidopsis thaliana Kontrolle, die durch dieses Verfahren amplifiziert
werden könnten.
-
Beispiel 9
-
Detektion der CC-1, CC-2
und CC-3 transgenen mRNA in transgenen Arabidopsis-Linien (CC-2 und
CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Die
transgene Expression wurde unter Verwendung von RT-PCR detektiert.
Gesamt-RNA wurde
aus stressbehandelten Pflanzen unter Verwendung eines Verfahrens
basierend auf (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362) isoliert. Blattproben
(50–100
mg) wurden gesammelt und in flüssigem
Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen. Das zermahlene Gewebe
wurde in 500 μl
einer 80°C,
1:1 Mischung von Phenol zu Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM
Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS) suspendiert, gefolgt von kurzem Verwirbeln,
um zu mischen. Nach der Zugabe von 250 μl Chloroform wurde jede Probe
kurz verwirbelt. Die Proben wurden anschließend 5 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert.
Die obere wässrige
Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Gefäß abgetrennt. Die RNA wurde
durch Zugabe eines 1/10-Volumens 3 M Natriumacetat und 2 Volumina 95%
Ethanol präzipitiert.
Die Proben wurden durch Invertieren gemischt und für 30 Minuten
auf Eis platziert. Die RNA wurde durch Zentrifugation bei 12,000 × g für 10 Minuten
pelletiert. Der Überstand
wurde entfernt und die Pellets kurz luftgetrocknet. Die RNA-Probenpellets
wurden in 10 μl
DEPC behandeltem Wasser resuspendiert. Um kontaminierende DNA aus
den Proben zu entfernen, wurde jede Probe mit RNase-freier DNase
(Roche) gemäß Herstellerempfehlungen
behandelt. cDNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des Erststrang-cDNA-Synthesekits
(Boehringer Mannheim) synthetisiert, wobei die Herstellerempfehlungen
befolgt wurden.
-
Die
PCR-Amplifikation eines genspezifischen Fragments aus der synthetisierten
cDNA wurde unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Roche) und genspezifischen
Primern (Primer siehe unten) in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 × PCR Puffer,
1,5 mM MgCl2, 0,2 μl jedes Primers, 0,2 μM dNTPs,
ein Unit Polymerase, 5 μl
cDNA aus der Synthesereaktion. Die Amplifikation wurde unter den
folgenden Bedingungen durchgeführt:
Denaturierung, 95°C,
1 Minute, Annealing, 62°C,
30 Sekunden; Verlängerung,
72°C, 1
Minute, 35 Zyklen; Verlängerung,
72°C, 5
Minuten; Halten, 4°C,
andauernd. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel
aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht unter
Verwendung des Quantity-One Geldokumentationssystems (Bio-Rad) sichtbar
gemacht.
-
Die
Expression der Transgene wurde in der T1-transgenen Linie detektiert.
Dieses Ergebniss zeigt, dass die Transgene in den transgenen Linien
exprimiert werden und deutet stark darauf hin, dass ihr Genprodukt
die Stresstoleranz der Pflanzen in der transgenen Linie verbesserte.
Andererseits konnte durch dieses Verfahren keine Expression identischer
oder sehr ähnlicher
endogener Gene detektiert werden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung
mit den Daten aus Beispiel 7. Dadurch wird unsere Aussage, dass
die verbesserte Stresstoleranz auf das eingefügte Transgen zurückzuführen ist,
bedeutend gestützt.
-
Die
folgende Primerkombination wurde in den oben beschriebenen Reaktionen
verwendet:
-
-
-
-
-
Die
Amplifizierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung,
95°C, 1
Minute; Annealing, 62°C,
30 Sekunden; Verlängerung,
72°C, 1
Minute, 35 Zyklen; Verlängerung,
72°C, 5
Minuten; Halt, 4°C,
andauernd. Die PCR-Produkte
wurden auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid
angefärbt
und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One Geldokumentationssystems (Bio-Rad)
sichtbar gemacht.
-
Die
Expression von Transgenen wurde in der T1-transgenen Linie detektiert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transgene in den transgenen Linien
exprimiert werden und sie deuten stark darauf hin, dass ihr Genprodukt
die Stresstoleranz der Pflanzen in den transgenen Linien verbesserte.
In Übereinstimmung
mit der vorhergehenden Aussage konnte durch dieses Verfahren keine
Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene detektiert
werden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den Daten
aus Beispiel 7.
-
Beispiel 10
-
Konstruktion stresstoleranzer
Sojabohnenpflanzen durch Überexpression
der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Die
Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet,
um Sojabohnen wie unten beschrieben zu transformieren.
-
Sojabohnensamen
wurden mit 70% Ethanol für
vier Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt
von 20 Minuten 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert
war, unter kontinuierlichem Schütteln
oberflächensterilisiert.
Anschließend
wurden die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und auf
einem angefeuchteten, sterilen Filterpapier in einer Petrischale
bei Raumtemperatur für
6 bis 39 Stunden platziert. Die Samenschalen wurden abgezogen, und
die Keimblätter
wurden von jeder Embryoachse abgelöst. Die Embryoachse wurde untersucht,
um sicherzustellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt war.
Die ausgeschnittenen Embryoachsen wurden in einer halboffenen, sterilen Petrischale
gesammelt und bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20%
(Frischgewicht) in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren
Verwendung luftgetrocknet.
-
Eine
Agrobacterium tumefaciens-Kultur wurde aus einer einzelnen Kolonie
in festem LB-Medium plus geeignete Antibiotika (z.B. 100 mg/l Streptomycin,
50 mg/l Kanamycin) gefolgt von der Aufzucht der einzelnen Kolonie
in flüssigem
LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm, hergestellt.
Anschließend wurde
die Bakterienkultur bei 7000 upm für 7 Minuten bei Raumtemperatur
pelletiert und in MS (Murashige und Skoog, 1962)-Medium resuspendiert,
welches mit 100 μM
Acetosyringon supplementiert war. Vor der Verwendung wurden die
Bakterienkulturen in diesem Prä-Induktionsmedium
für zwei
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Achsen der Sojabohnen-zygotischen
Keimlingembryonen mit etwa 15% Feuchtigkeitsgehalt wurden für zwei Stunden
bei Raumtemperatur mit der präinduzierten
Agrobacterium-Suspensionskultur imbibiert. Die Embryonen wurden
aus der Imbibitionskultur entfernt und auf Petrischalen übertragen,
die festes MS-Medium enthielten, welches mit 2% Saccharose supplementiert
war, und für
zwei Tage in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ
wurden die Embryonen auf angefeuchtetem (flüssiges MS-Medium), sterilem
Filterpapier in einer Petrischale platziert und unter den gleichen
Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Nach dieser Zeitspanne
wurden die Embryonen entweder auf festes oder flüssiges MS-Medium übertragen, welches mit 500
mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Kefotaxim supplementiert war, um
die Agrobakterien abzutöten.
Das flüssige
Medium wurde verwendet, um das sterile Filterpapier anzufeuchten.
Die Embryonen wurden für
vier Wochen bei 25°C
unter 150 μmolm–2sec–1 und
einer 12-Stunden-Photoperiode inkubiert. Nachdem die Keimlinge Wurzeln
gebildet hatten, wurden sie auf sterilen Metromixboden übertragen.
Vor dem Übertrag
der Pflanzen auf den Boden wurde das Medium von den in vitro-Pflanzen
abgewaschen. Um den Akklimatisierungsprozess zu begünstigen,
wurden die Pflanzen für
eine Woche unter einer Plastikbedeckung gehalten. Anschließend wurden
die Pflanzen in eine Wachstumskammer überführt, wo sie bei 25°C unter 150 μmolm–2sec–1 Lichtintensität und einer
12-Stunden-Photoperiode
für etwa
80 Tage inkubiert wurden.
-
Die
transgenen Pflanzen wurden dann auf ihre verbesserte Trockenheits-,
Salz- und/oder Kältetoleranz
gemäß dem Durchmusterungsverfahren,
welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei es sich
zeigte, dass transgene Expression Stresstoleranz verleiht.
-
Beispiel 11
-
Konstruktion stresstoleranter
Raps-/Canolapflanzen durch Überexpression
der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Die
Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet,
um Raps-/Canolapflanzen wie unten beschrieben zu transformieren.
-
Das
hierin beschriebene Verfahren zur Pflanzentransformation ist auch
auf Brassica und andere Kulturpflanzen anwendbar. Canolasamen werden
oberflächensterilisiert
mit 70% Ethanol für
vier Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt
von 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert
war, für
20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln. Anschließend werden
die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und für 18 Stunden auf einem angefeuchteten,
sterilen Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur platziert.
Anschließend
werden die Samenschalen entfernt und die Samen werden über Nacht
in einer halboffenen, sterilen Petrischale luftgetrocknet. Während dieser
Zeitspanne verlieren die Samen etwa 85% ihres Wassergehalts. Die
Samen werden anschließend
bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren
Verwendung gelagert. Die DNA-Konstrukte
und die Embryoimbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben
der primären
transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorliegen
von T-DNA zu bestätigen.
Die Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung, in welcher
DNA auf einem 1% Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt und
auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) übertragen
wird, bestätigt.
Der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet,
um durch PCR eine Digoxigenin-markierte Probe herzustellen, und
wird wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
-
Die
transgenen Pflanzen werden anschließend auf ihre verbesserte Stresstoleranz
gemäß dem Durchmusterungsverfahren,
welches im Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei gezeigt
wird, dass transgene Expression Trockenheitstoleranz verleiht.
-
Beispiel 12
-
Konstruktion stresstoleranter
Maispflanzen durch Überexpression
der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Die
Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet,
um Mais wie unten beschrieben zu transformieren.
-
Die
Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit dem Verfahren, welches
von Ishida et al., 1996, Nature Biotech 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife
Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre" Vektoren tragen,
co-kultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogense gewonnen.
Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5%
und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte
Toleranz gegenüber
Trockenheit, Salz und/oder Kälte
gemäß dem in
Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren durchmustert,
wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Stresstoleranz verleiht.
-
Beispiel 13
-
Konstruktion stresstoleranter
Weizenpflanzen durch Überexpression
der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
-
Die
Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet,
um Weizen wie unten beschrieben zu transformieren.
-
Die
Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren, welches von Ishida
et al., 1996, Nature Biotech 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife
Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre" Vektoren tragen,
co-kultiviert und
transgene Pflanzen werden durch Organogense gewonnen. Dieses Verfahren
stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit.
Die transgenen Pflanzen werden dann gemäß dem Durchmusterungsverfahren,
welches in Beispiel 7 beschrieben ist, auf ihre verbesserte Stresstoleranz
durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Trockenheitstoleranz
verleiht.
-
Beispiel 14
-
Identifizierung homologer
und heterologer Gene
-
Gensequenzen
können
verwendet werden, um homologe oder heterologe Gene aus cDNA oder
genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Homologe Gene (z.B.
Volllängen-cDNA-Klone)
können
durch Nukleinsäurehybridisierung
unter Verwendung von beispielsweise cDNA-Bibliotheken isoliert werden.
Abhängig
von der Abundanz des Gens von Interesse werden 100.000 bis zu 1.000.000
rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen.
Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert,
z.B. durch UV-Crosslinking. Die Hybridisierung wird bei Bedingungen
von hoher Stringenz durchgeführt.
Die Hybridisierung in wässriger
Lösung
und Waschen wird bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer
Temperatur von 68°C
durchgeführt.
Die Hybridisierungssonden werden beispielsweise durch radioaktive (32P) Nick-Transkriptionsmarkierung erzeugt
(High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland). Die Signale werden durch
Autoradiographie detektiert.
-
Partiell
homologe oder heterologe Gene, die zueinander in Bezug stehen, aber
nicht identisch sind, können
in einer zu dem oben beschriebenen Verfahren analogen Weise unter
Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen von niedriger
Stringenz identifiziert werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird
die Ionenstärke
normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur allmählich von
68 auf 42°C
abgesenkt wird.
-
Die
Isolierung von Gensequenzen mit Homologien (oder Sequenzidentität/-ähnlichkeit)
in nur einer bestimmten Domäne
(beispielsweise 10–20
Aminosäuren)
kann durch Verwendung synthetischer radiomarkierter Oligonukleotidsonden
durchgeführt
werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorilierung
am 5'-Ende von zwei
komplementären
Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide
werde annealed und ligiert, um Concatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Concatemere
werden anschließend
radiomarkiert, beispielsweise durch Nick-Transkription. Die Hybridisierung wird
normalerweise unter Bedingungen von niedriger Stringenz unter Verwendung
hoher Oligonukleotidkonzentrationen durchgeführt.
-
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
-
- 6 × SSC
- 0,01 M Natriumphosphat
- 1 mM EDTA (pH 8)
- 0,5% SDS
- 100 μg/ml
denaturierte Lachssperma-DNA
- 0,1% fettfreie Trockenmilch
-
Während der
Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die
geschätzte
Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raumtemperatur abgesenkt, gefolgt
von Wasch-Schritten und Autoradiographie. Waschen wird mit niedriger
Stringenz durchgeführt,
beispielsweise drei Wasch-Schritte unter Verwendung von 4 × SSC. Weitere
Einzelheiten werden von Sambrook, J. et al., (1989), „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons,
beschrieben.
-
Beispiel 15
-
Identifizierung homologer
Gene durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
-
c-DNA-Klone
können
verwendet werden, um rekombinante Proteine herzustellen, beispielsweise
in E. coli (z.B. Qiagen QIAexpress pQE system). Die rekombinanten
Proteine werden anschließend
normalerweise über
Ni-NTA-Affinitätschromatographie
(Qiagen) affinitätsgereinigt.
Die rekombinante Proteine werden anschließend verwendet, um spezifische
Antikörper
herzustellen, beispielsweise unter Verwendung von Standardtechniken
zur Kaninchenimmunisierung. Die Antikörper werden unter Verwendung
einer Ni-NTA-Säule, die
mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, affinitätsgereinigt,
wie es von Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262, beschrieben ist. Der
Antikörper
kann anschließend
verwendet werden, um Expressions-cDNA-Bibliotheken zu durchmustern, um so
homologe oder heterologe Gene durch immunologisches Durchmustern
zu identifizieren (Sambrook, J. et al., (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons).
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Beispiel 16
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In vivo-Mutagenese
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Eine
in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch eine Passage von
Plasmid-(oder anderer Vektor)-DNA
durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder
Hefen wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae), welche in ihren
Fähigkeiten,
die Integrität
ihrer genetischen Informationen aufrecht zu erhalten, beeinträchtigt sind,
durchgeführt
werden. Typische Mutator-Stämme
tragen Mutationen in den Genen für
das DNA-Reparatursystem (z.B. mutHLS, mutD, mutT, etc.; zur Referenz
siehe Rupp, W. D. (996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli
und Salmonella, S. 2277–2294,
ASM: Washington). Solche Stämme
sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist
beispielsweise in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies
7: 32–34
erläutert.
Der Transfer mutierter DNA-Moleküle
in Pflanzen wird vorzugsweise nach Selektion und Austesten in Mikroorganismen
durchgeführt.
Transgene Pflanzen werden gemäß den verschiedenen
Beispielen innerhalb der Erläuterung
dieser Druckschrift erzeugt.
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Beispiel 17
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In vitro-Analyse der Funktion
von Physcomitrella-Genen in transgenen Organismen
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Die
Bestimmung von Aktivitäten
und der kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachbereich etabliert.
Versuche zur Bestimmung der Aktivität eines beliebigen gegebenen
veränderten
Enzyms müssen
auf die spezifische Aktivität
des Wildtyp-Enzyms
zugeschnitten sein, was vollständig
im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns
liegt. Überblicke über Enzyme
im Allgemeinen, sowie spezielle Einzelheiten, welche Struktur, Kinetiken,
Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele für die Bestimmung
vieler Enzymaktivitäten betreffen,
sind beispielsweise in den folgenden Referenzen zu finden: Dixon,
M. und Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985)
Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979)
Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.
C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ.
Press: Oxford; Boyer, P. D.. Hrsg. (1983) The Enyzmes, Dritte Ausgabe, Academic
Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, Zweite Ausgabe,
VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J.,
Graßl,
M., Hrsg. (1983–1986)
Methods of Enzymatic Analysis, Dritte Ausgabe, Band I–XII, Verlag
Chemie: Weinheim; und Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987)
Band A9, Enzymes. VCH: Weinheim, S. 352–363.
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Die
Aktivität
von Proteinen, welche an DNA binden, kann durch einige gängige Verfahren,
beispielsweise DNA-Band-Shiftassays (auch als Gelretardationsassays
bezeichnet) gemessen werden. Die Wirkung solcher Proteine auf die
Expression anderer Moleküle
kann unter Verwendung von Reportergenassays gemessen werden (beispielsweise
wie in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und den darin zitierten
Referenzen beschrieben). Reportergen-Testsysteme sind gut bekannt
und sowohl für
Anwendungen in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen
unter Verwendung von Enzymen, wie beispielsweise β-Galaktosidase,
grünfluoreszierendem
Protein und einigen anderen, gängig.
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Die
Bestimmung der Aktivität
von membrangebundenen Transportproteinen kann gemäß den Techniken
durchgeführt
werden, wie sie beispielsweise in Gennis, R. B. Pores, Channels
and Transporters in Biomembranes, Molecular Structure and Function,
S. 85–137,
199–234
und 270–322,
Springer: Heidelberg (1989) beschrieben sind.
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Beispiel 18
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Reinigung des gewünschten
Produkts aus transformierten Organismen
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Die
Gewinnung des gewünschten
Produkts aus Pflanzenmaterial (d.h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis
thaliana), Pilzen, Algen, Ziliaten, C. glutamicum-Zellen oder anderen
mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuren transformierten bakteriellen
Zellen, oder aus dem Überstand
der oben beschriebenen Kulturen, kann durch verschiedene Verfahren,
die im Fachbereich bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn das gewünschte Produkt
nicht von den Zellen sekretiert wird, kann es aus der Kultur durch
Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet werden, die
Zellen können
durch Standardtechniken, wie beispielsweise mechanische Kräfte oder
Sonifizierung, lysiert werden. Pflanzenorgane können von anderem Gewebe oder
Organen mechanisch abgetrennt werden. Nach der Homogenisierung werden
Zelltrümmer
durch Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion, welche die
löslichen
Proteine enthält,
wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung zurückbehalten.
Wenn das Produkt von den gewünschten
Zellen sekretiert wird, können
die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit
entfernt werden und die Überstandsfraktion
wird zur weiteren Reinigung zurückbehalten.
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Die Überstandsfraktion
aus beiden Reinigungsverfahren wird einem Chromatographieschritt
an einem geeigneten Harz unterzogen, wobei das gewünschte Molekül entweder
auf dem Chromatographieharz zurückgehalten
wird, während
viele der Verunreinigungen in der Probe nicht zurückgehalten
werden, oder wobei die Verunreinigungen durch das Harz zurückgehalten
werden, während
die Probe nicht zurückgehalten
wird. Falls notwendig können
solche Chromatographieschritte unter Verwendung derselben oder verschiedener
Chromatographieharze wiederholt werden. Der Fachmann ist in der
Wahl geeigneter Chromatographieharze und ihrer möglichst effektiven Anwendung
für ein
bestimmtes, aufzureinigendes Molekül erfahren. Das gereinigte
Produkt kann durch Filtration oder Ultra-Filtration konzentriert
und bei einer Temperatur, bei der die Stabilität des Produkts am größten ist,
gelagert werden.
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Es
gibt eine lange Reihe von Reinigungsverfahren, die im Fachbereich
bekannt sind und das vorangehende Reinigungsverfahren ist nicht
einschränkend
gedacht. Solche Reinigungstechniken werden beispielsweise in Bailey,
J. E. & Ollis,
D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)
beschrieben. Zusätzlich
kann die Identität
und Reinheit der isolierten Verbindungen durch Standardtechniken
aus dem Fachbereich festgestellt werden. Diese schließen Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC),
spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschicht-Chromatographie,
NIRS, enzymatischen Assay oder mikrobiologische Verfahren ein. Solche
Analyseverfahren werden besprochen in: Patek et al., 1994 Appl.
Environ. Microbiol. 60: 133–140;
Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32; und Schmidt, et al., 1998
Bioprocess Engineer. 19: 67–70.
Ulmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, (1996) Band A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S.
521–540,
S. 540–547,
S. 559–566,
S. 575–581
und S. 581–587;
Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry
and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al., Applications
of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, Band 17.
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