ES2275505T3 - Metodos para inducir la muerte de celulas cancerosas y la regresion de tumores. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de FPT en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un paciente por administración de: (1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente: (+)-enantiómero y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

Description

Métodos para inducir la muerte de células cancerosas y la regresión de tumores.

Campo de la invención

Esta invención proporciona el uso de un inhibidor de farnesil-proteína-transferasa (FPT) o un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras para tratar sujetos afectados de cáncer, incluyendo tumores y enfermedad metastásica, administrando un inhibidor de FTP y un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras. En particular, esta invención proporciona el uso de un inhibidor de farnesil-proteína-transferasa (FPT) o un inhibidor adicional de la vía de señalización de Ras en la fabricación de una composición farmacéutica para uso en métodos de tratar cáncer que comprende el uso combinado de: (1) un inhibidor de farnesil-proteína-transferasa (FPT) o (2) un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas (en particular, muerte celular apoptótica), permitiendo de este modo regímenes de tratamiento a bajas dosis.

Antecedentes de la invención

La Figura 1 de la presente memoria muestra una descripción lineal simplificada de una vía de transducción de señales que conduce a la proliferación celular. Esta vía se define en la presente memoria como la "vía de señalización Ras", debido a que Ras es un transmisor central en esta vía que recibe señales de elementos situados aguas arriba (por ejemplo, receptores de factores de crecimiento) y las transmite a los elementos situados aguas abajo.

Las vías de señalización iniciadas por los receptores de factores de crecimiento que conducen a la proliferación celular y en algunos casos a la transformación maligna, están siendo aclaradas. Muchos receptores de factores de crecimiento, tal como los del factor de crecimiento epidérmico (abreviadamente en lo sucesivo EGF por la expresión inglesa epidermal growth factor) y los del factor de crecimiento derivado de plaquetas (abreviadamente en lo sucesivo PDGF por platelet-derived growth factor), así como también las moléculas relacionadas con el receptor del EGF (por ejemplo, Her-2/Neu/ErbB2), poseen una actividad intrínseca de tirosina-quinasa que es activada por la dimerización del receptor inducida por ligandos (Heldin, 1995). Esto da como resultado la autofosforilación del receptor en los residuos de tirosina y la unión de proteínas que contienen los dominios de Src-homología 2 (SH2).

Dos de dichas proteínas SH2 son las Grb2 y SHC, que activan indirectamente a la pequeña proteína Ras de unión a GTPasa asociada a la membrana plasmática.

En otro ejemplo preferido de terapia de combinación en el tratamiento de cánceres (por ejemplo, cáncer de páncreas, de pulmón o de vejiga) el inhibidor adicional de FTP es SCH 66336, como se ha identificado previamente, administrado por vía oral en una cantidad de 70 mg/día, en dos dosis divididas, en un régimen de dosificación continuo; y el inhibidor de la vía de señalización Ras es U0126 (o uno de sus análogos) administrado en una cantidad de 350 mg/día, en dos dosis divididas, en un régimen de dosificación continuo.

En el uso de acuerdo con esta invención, se ha de administrar un inhibidor de FTP simultáneamente o secuencialmente con un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras. Por tanto, no es necesario que, por ejemplo, el inhibidor adicional de la vía de señalización Ras y el inhibidor de la FTP deban administrarse simultáneamente o esencialmente de modo simultáneo. La ventaja de una administración simultánea o esencialmente simultánea está dentro del conocimiento del médico clínico experto.

También, en general el inhibidor de FTP y el inhibidor adicional de la vía de señalización Ras no tiene que ser administrados en la misma composición farmacéutica, y deben, debido a diferentes características físicas y químicas, tener que administrarse por diferentes vías, Por ejemplo, el inhibidor de FTP puede administrarse por vía oral para generar y mantener sus buenos niveles en sangre. Mientras que el inhibidor adicional de la vía de señalización Ras puede ser administrado por vía intravenosa. La determinación del modo de administración y la idoneidad de la administración, cuando sea posible, en la misma composición farmacéutica, está dentro del conocimiento del médico clínico experto. La administración inicial puede realizarse de acuerdo con protocolos establecidos conocidos en la técnica, y luego, basándose en los efectos observados, pueden ser modificados por el médico clínico experto la dosificación, los modos de administración, y los tiempos de administración.

La elección particular del inhibidor de FTP y el inhibidor adicional de la vía de señalización Ras dependerá del diagnóstico de los médicos que atienden el caso y su juicio sobre el estado del paciente y el protocolo de tratamiento adecuado que activa la pequeña proteína Ras de unión a GTP asociada a la membrana plasmática. La activación de Ras ocurre también en respuesta a la unión del ligando a siete receptores acoplados a la proteína G del dominio transmembranal (por ejemplo Gutkind, 1998). La activación de Ras y otras vías de señalización reguladas por el receptor del factor de crecimiento conduce finalmente a cambios en el citoesqueleto y la expresión de genes que son necesarios para la proliferación, diferenciación, y transformación celular (revisado por Campbell et al., 1998).

Los tres genes ras humanos (Ha-Ras, N-Ras, y Ki-Ras) codifican 4 proteínas (debido al empalme alternativo del mRAN de Ki-Ras). En circunstancias normales, las proteínas Ras tienen un ciclo entre un estado activo (unido a G7-P) y un estado inactivo (unido a GDP). La activación de Ras ocurre mediante el intercambio del GDP unido por GTP, el cual es facilitado por una familia de factores de intercambio de nucleótidos de guanina. La activación de Ras ocurre mediante hidrólisis del GTP unido por GDP. Esta reacción es facilitada por las proteínas activadoras de GTPasa (las GAP) (Trahey and McCormick, 1987). En muchos cánceres humanos, las proteínas Ras se convierten en oncogénicamente activadas debido a mutaciones que destruyen su activación por GTPasa, y que por lo tanto des-regulan la señalización de Ras (revisado por Campbell et al., 1998).

Existen múltiples candidatos de efectores de Ras que pueden servir situados aguas arriba de Ras en la transducción de señales y en la transformación oncogénica, incluyendo miembros de la familia Rho de pequeñas GTPasas, fosfatidilinositol-3- quinasa (PI3K) y la proteína serina/treonina-quinasa c-Raf-1 (revisada por Campbell et al., 1998). La señalización mediada por Raf es la vía efectora de Ras mejor caracterizada. La Ras activada recluta Raf a la membrana en la cual ocurre la activación. La Ras activada es el componente inicial de una cascada de quinasa, la cascada de proteína-quinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) (revisada por Lowy and Willumsen, 1993; Campbell et al., 1998). La Raf fosforila y activa las proteínas-quinasas MEK1 y MEK2 (MAPK/ERK quinasa) las cuales a su vez fosforilan y activan las quinasas extracelulares reguladas por señales ERK1 y ERK2 (conocidas también como MAPK1 y MAPK2). A diferencia de sus dianas aguas arriba en la vía, ERK 12, las proteínas MEK1,2 son enzimas altamente específicas cuyos únicos sustratos conocidos son las proteínas ERK1,2. Mediante activación, ERK1 y ERK2 fosforilan (y por lo tanto regulan) una variedad de proteínas dianas que incluyen los factores de transcripción nuclear que conducen a la respuesta celular final. Esta vía lineal de la señalización Ras está esquematizada en el diagrama de la Figura 1.

La importancia de estas vías de señalización en el desarrollo anormal de células cancerosas se indica por el descubrimiento de que el receptor del factor de crecimiento y los componentes de la vía Ras están frecuentemente mutados y/o están sobreexpresados en el cáncer. Por ejemplo la Ras está mutacionalmente activada en aproximadamente 30% de los cánceres humanos incluyendo un elevado porcentaje de los principales cánceres epiteliales, tales como cánceres de pulmón, de colón y de páncreas. Adicionalmente la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento ocurre en una variedad de cánceres (por ejemplo la sobreexpresión del receptor de Her-2/Neu ocurre en aproximadamente 30% del cáncer de mama humano). Estas observaciones han conducido a la búsqueda y desarrollo de agentes diseñados para bloquear los componentes individuales de cualquier vía de transducción de señales. Aunque dichos agentes se consideran nuevos y potenciales agentes terapéuticos para cáncer, muchos de los inhibidores de la transducción de señales se considera que actúan en una forma citostática en vez de modo citotóxico, bloqueando el progreso de las células a través del ciclo celular. Esto los distingue de los tradicionales fármacos quimioterapéuticos para cáncer porque son menos tóxicos pero también porque poseen menor actividad antitumoral
notable.

El documento WO 97/45412 describe el uso de un inhibidor de MEK y un inhibidor de farnesil-proteína-transferasa (FTP) en el tratamiento del cáncer. El texto no describe ningún beneficio inesperado de la administración de dos fármacos en combinación. En el documento WO 92/11034 se describen agentes potenciadores, tales como compuestos de benzocicloheptaridina condensados en el anillo, que mejoran la eficacia de los agentes antineoplásticos. En el documento WO 97/23478 se demuestra que nuevos compuestos de amidas tricíclicos que son capaces de inhibir la farnesil-proteína-transferasa son útiles en el tratamiento de las enfermedades de proliferación. Los nuevos compuestos incluyen SCH 66336, lo cual ha sido demostrado adicionalmente por Liu M. et al., (1998) Cancer Research, vol. 58, no. 21 pp. 4947-4956 que tienen actividad anti-tumoral en modelos de xeno-injerto tumoral humano y ratones transgénicos Wap-ras. Alessi. D. R. et al., J. Biol. Chem., vol. 270, nº 46, pp. 27489-27494, demostraron la actividad del compuesto PD 0980059 como un inhibidor específico de la activación de la proteína-quinasa activada por mitógeno in vitro e in vivo.

Por lo tanto sigue existiendo el desafío de hallar métodos nuevos y mejorados para tratar el cáncer. Por ejemplo, para tratar las células de cáncer tumorígenas, sería sumamente deseable disponer de nuevos métodos que logren una drástica y selectiva inducción de la muerte de células cancerosas y que al mismo tiempo minimicen los potenciales efectos secundarios tóxicos contra las células normales no transformadas. La presente invención crea dichos métodos de tratamiento.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de un inhibidor de la farnesil-proteína-transferasa (FPT) en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un paciente por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

1

y (2) un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

La presente invención proporciona además el uso de un inhibidor de la vía de señalización Ras en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un paciente por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

1

y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

Las composiciones de la presente invención consiguen una inducción inesperadamente notable de la muerte de células cancerosas (en particular muerte celular apoptótica). Los efectos son sinérgicos y muy selectivos contra las células transformadas (particularmente células cancerosas tumorígenas), lo cual permite el uso de pequeñas dosis para minimizar los potenciales efectos tóxicos secundarios contra las células normales no transformadas. Además, las composiciones de la presente invención demostraron de forma sorprendente que tienen un efecto sostenido de larga duración en el bloqueo de la señalización de las células, lo cual minimiza nuevamente los potenciales efectos tóxicos secundarios contra células normales no transformadas. Ninguno de estos efectos, dejado solo en su magnitud, podría haber sido pronosticado antes de la presente invención. Además, aprovechando la sorprendente sinergia y los efectos sostenidos de larga duración de esta invención, se proporcionan composiciones especiales con dosis bajas de manera que se puede lograr en forma eficaz la muerte de las células cancerosas y al mismo tiempo se mantiene un bajo riesgo de potenciales efectos tóxicos secundarios para las células normales no transformadas. Las composiciones de la presente invención son particularmente útiles para el tratamiento de varios cánceres tumorígenos especialmente cánceres epiteliales (por ejemplo cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colo-rectal y cáncer de vesícula), y melanoma.

Breve descripción de los dibujos

El compuesto inhibidor de FPT definido en las Figuras 1 a 7 (denominado algunas veces "SCH 66336") es el siguiente:

Figura 1: Transducción de señal Ras: Una representación esquemática de los componentes de la vía de transducción de señales Ras/MAPK. Esta vía lineal del receptor del factor de crecimiento para la activación de ERK fue la primera vía mediada por Ras que fue aclarada. También se indican las etapas dianas de varios inhibidores incluyendo el inhibidor de FPT SCH 66336 y los inhibidores de MEK PD098059 y U0126.

Figura 2: La respuesta apoptótica dependiente de la dosis para el tratamiento con PD098059 es mejorada mediante la adición de SCH 66336. Se trataron células Rat2 transformadas con H-ras-CVLS con las concentraciones indicadas de PD098059 (A385-023-MOOS; Alexis Corporation), solas o en combinación con SCH 66336. Las células se cosecharon mediante tratamiento con tripsina/EDTA y se fijaron en acetona/metanol (50%:50%) a -20ºC durante 30 minutos, se lavaron concienzudamente con PBS y se marcaron durante treinta minutos a temperatura ambiente con PBS que contenía 75 \mug/ml de yoduro de propidio (PI; Calbiochem; La Jolla, CA) y 500 \mug/ml de RNasa (Sigma; St. Louis, MO). Se midió la apoptosis mediante tinción con yoduro de propidio de DNA cromosómico) con análisis FACS de la población de células (FACS-Calibur, Becton-Dickinson; Mountain View, CA). La concentración de PD098059 varió desde 0,25 a 20 \muM en presencia de (\ding{115}) o ausencia de (\blacksquare) de 100 nM SCH 66336.

Figura 3: La respuesta apoptótica dependiente de la dosis para el tratamiento con SCH 66336 es mejorada mediante la adición de PD098059. Las células Rat2 transformadas con H-Ras-CVLS se trataron durante 36 horas con las concentraciones indicadas de SCH 66336, solas o en combinación con PD098059. El análisis se llevó a cabo tal como se describió en la descripción para la Figura 2. La concentración de SCH 66336 se varió desde 0,0125 a 0,75 \muM en presencia de (\ding{115}) o ausencia de (\blacksquare) de PD098059 2,5 \muM.

Figura 4: Efecto de SCH 66336 y U0126 sobre la apoptosis medida por FACS: Las células Rat2 transformadas con H-Ras se trataron durante 24 horas con 0 a 10 \muM U0126 (nº V1121; Promega Corporation; Madison, W1) en presencia o en ausencia de 0,5 \muM de SCH 66336. El análisis se llevó a cabo tal como se describió en la leyenda para la Figura 2. 1 = células no tratadas; 2 = SCH 66336; 3 = U0126 1 \muM; 4 = U0126 + SCH 66336 1 \muM; 5 = 00126 + SCH 66336 5 \muM; 6 = U0126 + SCH 66336 5 \muM; 7 = U0126 10 \muM; 8 = U0126 + SCH 66336 10 \muM.

Figura 5: Efecto de SCH 66336 y PD098059 sobre la apoptosis medida por activación de caspasa: Las células Rat2 y Rat2 parentales transformadas con H-Ras se trataron durante 24 horas con PD098059 20 \muM, SCH 66336 0,5 \muM, o una combinación de los dos fármacos. Las células fueron lisadas en un tampón detergente recomendado por Clontech (Ensayo Apo-Alert CPP32/Caspasa-3) y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC para sedimentar los residuos celulares. La concentración de proteína del sobrenadante resultante se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce; Rockford, IL) con 175 \mug de cada lisado ensayado para la actividad de Caspasa-3 usando un sustrato peptídico fluorogénico (AC-DEVD-AMC; Clontech, Palo Alto, CA) mediante fluorometría (lector de placa CytoFluor; Perseptive Biosystems; Framingham, MA). 1 = células H-Ras no tratadas; 2 = células H-Ras + SCH 66336; 3 = H-Ras + PD 098059; 4 = H-Ras + SCH 66336 + PD 098059; 5 = células Rat2 no tratadas; 6 = células Rat2 + SCH 66336; 7 = células Rat2 + PD098059; 8 = células Rat2 + SCH 66336 + PD 098059.

Figura 6: Efecto de SCH 66336 y PD 098059 sobre la fosforilación de ERK1 y ERK2: Las células Rat2 transformadas con H-Ras se trataron con PD09058 20 \muM o SCAH 66336 durante 0 a 36 horas. Las células fueron lisadas en un tampón detergente y se centrifugaron a 14.000 durante 15 minutos a 4ºC para sedimentar los residuos celulares. La concentración de proteína del sobrenadante resultante se determinó mediante el análisis de proteína BCA (Pierce; Rockford, IL). Las proteínas celulares (20 \mug) se separaron mediante electrofóresis en gel de Tris-glicina de poliacrilamida al 8-16% (Novel San Diego, CA). Luego las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF para el análisis de transferencia Western. Se detectaron ERK1 y ERK2 fosforilados usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para las proteínas p42/44 MAPK fosforiladas (phosphoThr202fTyr204 específico; nº 9101; New England Biolabs, Inc.; Beverly MA). Los ERK1 y ERK2 totales se detectaron usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para las proteínas p421 44 MAPK (nº 9102; New England Biolabs, Inc.,Beverly, MA). Ambos anticuerpos se reconocieron con anticuerpo HRP-anti-ratón de cabra (peroxidasa de rábano silvestre; Chemicon; Temecula, CA) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Sustrate; Pierce; Rockford, IL).

Figura 7: Vías de transducción de señales intracelulares: La Figura 1 representa en un diagrama una vía lineal que conduce desde los receptores del factor de crecimiento a través de Ras a la activación de la cascada MAPK. Resulta claro que las vías de señalización son considerablemente más complejas con múltiples ramificaciones e interconexiones. Algunas de estas complejidades se ilustran en la presente memoria en la Figura 7.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos métodos de tratamiento de cáncer combinando (1) un inhibidor de farnersil-proteína-transferasa (FPT), y (2) un inhibidor adicional de señalización de la vía Ras

(1) Un "inhibidor de farnersil-proteína-transferasa" o "inhibidor de FTP" o inhibidor de farnesil-transferasa ("FTI") se define en la presente memoria como un compuesto que: (i) inhibe potentemente FPT (pero preferiblemente no la geranilgeranil-proteína-transferasa 1, in vitro); (ii) bloquea el cambio fenotípico inducido por una forma de H-ras transformante que es un aceptor de farnesilo (pero preferiblemente no mediante una forma de H-ras transformante manipulada por ingeniería genética para ser un aceptor de geranilgeranilo); (iii) bloquea la farnesilación intracelular de ras; y (iv) bloquea el desarrollo anormal de las células.

(2) Un "inhibidor de la vía de señalización Ras" se define en la presente memoria como un agente que bloquea la actividad de cualquier proteína en la vía de transducción de señales que se muestra en la Figura 1. Un inhibidor de la vía de señalización Ras particularmente preferido es un "inhibidor de MEK", que se define en la presente memoria como un agente que bloquea la actividad de la enzima in vitro de una proteína MEK (MAPK/ERK-quinasa) (inhibiendo preferiblemente MEK1 y MEK2), y por lo tanto bloquea la activación de una proteína MAPK según se pone de manifiesto por un bloqueo en la fosforilación de la proteína MAPK. Esto puede detectarse mediante análisis de transferencia Western para MAPK fosforilada, tal como ha sido descrito por ejemplo en Dudley et al., Proc Natl Acad Sci. 92:7686-7689 (1995), y Favata et al., J. Biol Chem. 273:18623-32 (1998).

1. Inhibidores FPT

Como agentes solos o en combinación con quimioterapia (véase por ejemplo Liu et al., 1998), los inhibidores de FPT representan una enfoque líder para bloquear la función de las oncoproteínas Ras. La FPT cataliza la adición de un resto lipídico de isoprenilo a un residuo de cisteína que está presente cerca del extremo carboxi de la proteína Ras. Esta es la primera etapa de una vía de procesamiento post-traduccional que es esencial tanto para la asociación a la membrana Ras como para la transformación oncogénica inducida por Ras. Se ha informado sobre una variedad de inhibidores de FPT, incluyendo una variedad de inhibidores peptídicos miméticos, así como también otros inhibidores de pequeñas moléculas más notablemente los inhibidores de FPT tricíclicos ejemplificados por SCH 66336. Los inhibidores de FPT interfieren con el proceso post-traduccional de las proteínas Ras en las células y demuestran actividad antitumoral en una amplia variedad de modelos de cáncer in vitro e in vivo. (Bishop et al., 1995; Liu et al., 1998). La actividad antitumoral de SCH 66336 incluye la inhibición del desarrollo independiente de la unión de una variedad de líneas celulares de tumores humanos in vitro y su desarrollo como xeno-injerto en ratones inmunocomprometidos (Liu et al., 1998). Las líneas de células tumorales humanas difieren significativamente en su sensibilidad para los efectos de crecimiento de los inhibidores de FPT. La sensibilidad o resistencia no está correlacionada con el estado mutacional de Ras.

En varios modelos de tumores de ratón transgénico (por ejemplo MMTV-HRas, WAP-H-Ras, TGF\alpha y TGF\alpha/neu) han sido inducidas significativas regresiones tumorales mediante el tratamiento con los inhibidores de FPT. Estas regresiones están asociadas con un aumento de la apoptosis (Liu et al 1998; Barrington et al., 1998; Norgaard et al., 1999). Los inhibidores de FPT pueden inducir también apoptosis de células transformadas en cultivos. Se ha informado que el efecto apoptótico in vitro requiere desarrollo en poco suero o en un medio de crecimiento forzado de suspensión (Hung and Chaung, 1998; Lebowitz et al., 1997; Suzuki et al., 1998).

También se ha demostrado que el tratamiento con el inhibidor de FPT reduce la actividad de la vía MAPK en las células Rat1 transformadas con Ha-Ras (por ejemplo James et al., 1994). Esta disminución de la actividad de MAPK está correlacionada con una disminución del crecimiento celular. Los inhibidores de FPT no reducen la actividad de MAPK en células Rat1 no transformadas.

2. Agentes que tienen como diana MEK

La vía MAPK también ha sido examinada como una diana, y se han descrito el desarrollo de terapéutica anti-cáncer y los efectos de los inhibidores específicos de esta vía sobre líneas de células tumorales (Dudley et al., 1995; Favata et al., 1998). El inhibidor de MEK mejor caracterizado es PD098059, una pequeña molécula que inhibe la actividad de MEK1 y MEK2 a través de la unión directa de una manera que es no competitiva con respecto a cualquier sustrato (proteína ATP o ERK). Esto da como resultado una disminución de la fosforilación de MEK1 y MEK2 y una disminución de la activación de los sustratos MEK, ERK1 y ERK2. El tratamiento con PD098059 bloquea la proliferación mediada por el factor de crecimiento y un crecimiento independiente de la unión de las células transformadas Ras (Alessi et al, 1995, J. Biol. Chem. 270:27489-27494).

Recientemente, se informó de un nuevo inhibidor de MEK, el U0126, el cual se une a MEK con superior afinidad que el PD098059. Para una información más detallada sobre los inhibidores de MEK, y los métodos para preparar los inhibidores de MEK puede hacerse referencia por ejemplo a las publicaciones de patentes internacionales WO 99/01421 (14 de Enero de 1999) y WO 99/01426 (14 de Enero de 1999).

3. Agentes que tienen como objetivo los receptores del factor de crecimiento

Se adoptaron dos enfoques principales para bloquear las vías de señalización del receptor del factor de crecimiento: (i) anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor; (ii) inhibidores de la actividad del receptor de la tirosina-quinasa; y (iii) ácidos nucleicos antisentido para bloquear la expresión de proteínas. Los anticuerpos monoclonales anti-receptores incluyen los que tienen como diana el receptor erbB2 (por ejemplo HERCEPTIN® trastuzumab de Genentech) y los que tienen como diana el receptor EGF. El anticuerpo receptor anti-EGF mejor caracterizado es el anticuerpo quimérico C225 (Goldstein et al. (1995), Clin. Cancer Res. 1:1311-1318). Tanto HERCEPTIN® como C225 han demostrado ser eficaces en modelos de tumores pre-clínicos en los cuales estaban expresados sus receptores afines.

También se ha informado de inhibidores constituidos por pequeñas moléculas de actividad de tirosina-quinasa con por lo menos dos de estos compuestos ya en pruebas clínicas humanas: El inhibidor del receptor del PDGF de Sugen, el SU101, que está en la fase III de las pruebas clínicas para glioma y en las pruebas de primera fase para otras indicaciones de cáncer, y el inhibidor del receptor EGF de Pfizer, el CP-358,774, que está en pruebas de primera fase (Moyer et al. (1997), Cancer Res. 57:4838-4848).

4. Otros antagonistas de señalización

Además de las realizaciones descritas antes, otros elementos de la vía de señalización Ras y otras vías de transducción de señales, han sido dianas para el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Las proteínas SH2 (SCH y Grb2), que unen a los receptores del factor de crecimiento para la activación Ras, han sido diana de agentes peptidomiméticos que bloquean la unión de los dominios SH2 a las secuencias de proteínas que contienen fosfotirosina.

La proteína-quinasa Raf, que une Ras a la activación de MEK1,2 ha sido también la diana de inhibidores de quinasa de pequeñas moléculas y de enfoques antisentido. Este último enfoque (ISIS-5132) está en la fase II de pruebas clínicas (Monja et al., 1996).

Otras dianas relevantes de señalización intracelular incluyen la fosfolípido-quinasa PI3K (fosfatidilinositol-3 quinasa) y_{} la proteína-quinasa C.

En realizaciones preferidas, los métodos de la presente invención pueden usarse para tratar células cancerosas tumorígenas, que tienen un efecto significativo sobre la muerte celular (por ejemplo, por apoptosis) en el caso de células cancerosas (es decir, que tienen un efecto significativo sobre la muerte celular más allá de la simple interrupción del crecimiento), mientras que al mismo tiempo, pueden administrarse los agentes activos en dosis relativamente bajas (y/o en forma menos frecuente) para minimizar los potenciales efectos tóxicos secundarios contra las células normales no transformadas. Además, la presente invención proporciona nuevos métodos para tratar cáncer mediante la creación de un efecto más prolongado y más sostenido sobre la señalización de las células bloqueantes, mientras que, al mismo tiempo se minimiza el riesgo de los potenciales efectos secundarios contra las células normales.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas (por ejemplo apoptosis) en un paciente con cáncer, que comprende administrar simultáneamente o secuencialmente cantidades eficaces de: (1) un inhibidor de FPT y (2) un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras (es decir, en cantidades que son suficientes para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas, medido por ejemplo mediante el ensayo de fluorescencia con yoduro de propidio descrito en Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs 6:522-32. De manera similar, en la presente memoria se proporcionan métodos para matar células cancerosas en un paciente con cáncer (medido mediante el ensayo de Dengler et al., 1995) que comprende administrar cantidades eficaces de: (1) un inhibidor de FPT y (2) un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras.

Además en realizaciones preferidas, los métodos de la presente invención incluyen métodos para tratar tumores y para producir una regresión del volumen del tumor [(por ejemplo, medido por escaneo por tomografía asistida por ordenador (abreviadamente en lo sucesivo CAT, por la expresión inglesa Computer-Aided Tomography]] en un paciente que necesita dicho tratamiento (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano), mediante la administración, en forma simultánea o secuencial: (1) de un inhibidor de FPT y (2) un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras en cantidades suficientes para lograrlo. Ejemplos de tumores que pueden tratarse incluyen, pero sin limitación: cánceres epiteliales, por ejemplo cáncer de próstata, cáncer de pulmón (por ejemplo adenocarcinoma de pulmón), cánceres de páncreas (carcinoma pancreático tal como por ejemplo carcinoma pancreático exocrino), cánceres de mama, cáncer de colon (por ejemplo carcinomas colo-rectales, tales como por ejemplo adenocarcinoma de colon y adenoma de colon), cáncer de ovario, carcinoma de vesícula y cánceres de hígado. Otros cánceres que pueden tratarse incluyen melanomas, leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielógena aguda), sarcomas, cáncer folicular de tiroides, y síndrome mielodisplático.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de FPT y un inhibidor adicional de la vía de señalización Ras para el tratamiento de cáncer (incluyendo la inducción de muerte de células cancerosas y regresión del tumor), y la preparación de dichas composiciones, se proporciona también mediante la presente invención.

Tal como se usan en la presente memoria las expresiones siguientes tienen los siguientes significados a menos que se indique lo contrario:

"Inhibidor de receptores de factores de crecimiento": un agente que bloquea las propiedades de transducción de señales de receptores de factores de crecimiento. Estos pueden actuar como inhibidores directos de la actividad de tirosina-quinasa del receptor o mediante la inhibición de la activación estimulada por ligandos de la actividad de quinasa del receptor, tal como ha sido descrito en Levitski and Gazit, 1995 (Science. 267:1782-1788).

"Inhibidor de tirosina-quinasa": un agente que bloquea la actividad de fosforilación de tirosina mediante competición con ATP o a través de una interacción alostérica con la enzima, tal como ha sido descrito en Levitski and Gazit, 1995.

"Inhibidor de proteína-quinasa": un agente que bloquea la actividad de fosforilación de residuos de serina, treonina o tirosina, tal como ha sido descrito en Levitzki and Gazit, 1995.

"Inhibidor del receptor p185 erbB2/HER2/neu" o "inhibidor del receptor de erbB2": un agente que bloquea las propiedades de transducción de señales del receptor de erbB2, inhibiendo la actividad de tirosina-quinasa del receptor o bloqueando la estimulación por ligandos de la actividad de quinasa del receptor, tal como ha sido descrito en Levitzki and Gazit, 1995.

"Inhibidor de tirosina-quinasa del receptor del PDGF": un agente que bloquea las propiedades de transducción de señales del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ya sea inhibiendo la actividad de tirosina-quinasa del receptor o bien bloqueando la estimulación por el PDGF de la actividad de quinasa del receptor, tal como ha sido descrito en Kovalenko, M., et al. (1994). Cancer Res. 54:6106-6114.

"Inhibidor de tirosina-quinasa del receptor de EGF": un agente que bloquea las propiedades de traducción de señales del receptor del factor de crecimiento bloqueando la estimulación por el EGF de la actividad de quinasa del receptor, tal como ha sido descrito en Fry et al., (1994). Science. 9:1093-1095.

"Un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de un receptor del factor de crecimiento": dicho anticuerpo bloquea la actividad biológica del receptor del factor de crecimiento inhibiendo la unión del ligando y/o evitando la activación estimulada por ligando de la tirosina-quinasa receptora, tal como ha sido descrito en Mendelsohn, J. (1992) J. Natl Cancer Inst Monogr 13:125-131.

"Un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor de ''p185 erbB2/HER2/neu" o "un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor de erbB2": dicho anticuerpo bloquea la actividad biológica del receptor de HER2, tal como se muestra mediante la inhibición de la unión del ligando y/o evitando la activación estimulada por ligandos de la quinasa receptora del factor de crecimiento, tal como ha sido descrito en Pegram et al., 1998; Véase también Carter et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci: 89:4285-4289.

"Un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor EGF": mostrado por un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de EGF, y la actividad de quinasa estimulada por el EGF, tal como ha sido descrito por Mendelsohn, J. (1992) J. Natl Cancer Inst Monogr 13:125-131.

"Una molécula antisentido dirigida contra un receptor del factor de crecimiento u otro componente en la vía de señal Ras": un oligonucleótido modificado que interfiere con la traducción de RNA mensajero (y por lo tanto con la expresión de proteínas) de cualquier componente de proteínas en la vía, tal como ha sido descrito en Wang et al., 1998 o Resnicoff, 1998. Para una estudio general de la tecnología antisentido, véase por ejemplo Antisense DNA and ARN, (Cold Spring Harbor Laboratory, D. Melton, ed., 1998).

"Concurrentemente" (1) simultáneamente a lo largo del tiempo o (2) en diferentes momentos durante el curso de un programa de tratamiento común; y

"Secuencialmente" (1) administración de un componente del método ((a) del inhibidor FPT o (b) un inhibidor adicional de la vía Ras) seguido de la administración del otro componente; después de la administración de un componente, el segundo componente puede administrarse sustancialmente de forma inmediata después del primer componente, o el segundo componente puede administrarse después de un período de tiempo eficaz a continuación del primer componente; el período de tiempo eficaz es la cantidad de tiempo para la realización del beneficio máximo desde la administración del primer componente.

"Aguas abajo" se define en la presente memoria como una actividad de proteína (dentro de la vía de señalización Ras) que es regulada por Ras ya sea directamente a través de la unión proteína:proteína o indirectamente por una proteína efectora regulada por Ras. Por lo tanto, con referencia a la Figura 1, un "elemento aguas abajo de Ras" puede ser por ejemplo Mek1,2 o Erk1,2.

"Aguas arriba" se define en la presente memoria como una actividad de proteína (dentro de la vía de señalización Ras) que regularía la actividad de Ras, ya sea directamente a través de la unión proteína:proteína o bien indirectamente regulando otra proteína que se une directamente y que regula la actividad Ras. Por lo tanto, un "elemento aguas arriba de Ras" puede ser por ejemplo un receptor de erbB2, un receptor de PDGF, un receptor de IGF o un receptor de EGF.

"Muerte celular" o "Muerte de células", tal como se describe aquí, es la muerte inducida ya sea bajo condiciones fisiológicas o mediante una lesión aguda que da como resultado el desensamblamiento de los orgánulos celulares y las proteínas y la abolición de los procesos metabólicos tal como fue revisado por Raff. M. (1998) Nature, 396:119-122. La muerte celular puede medirse por ejemplo, mediante el ensayo de citometría de flujo con yoduro de propidio descrito en Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs, 6:522-32.

"Apoptosis" tal como se describe en la presente memoria es una forma de muerte celular (muerte celular programada) que exhibe cambios morfológicos estereotípicos revisado por Raff, M. (1998) Nature, 396:119-122. La apoptosis puede medirse por ejemplo mediante el ensayo de citometría de flujo con yoduro de propidio descrito por Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs, 6:522-32, o mediante la desoxinucleotidil-transferasa terminal in situ y el ensayo de traslado de muesca (análisis TUNEL) descrito en Gorczyca, (1993) Cancer Res. 53:1945-51.

"Sinérgico" o "nivel sinérgico" se define en la presente memoria como un efecto logrado por la combinación de dos componentes que es superior a la suma de los efectos de cualquiera de los dos componentes por separado (manteniendo constante la cantidad del componente). Por lo tanto, por ejemplo, la frase "cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas" se refiere a las cantidades de dos componentes que logran un nivel de muerte de células cancerosas (por ejemplo muerte de células por apoptosis medido por el ensayo de citometría de flujo con yoduro de propidio descrito por Dengler et al., (1995) Anticancer Drugs, 6:522-32, o mediante desoxinucleotidil-transferasa terminal in situ y ensayo de traslado de muesca (Análisis TUNEL) descrito por Gorczyca, (1993) Cancer Res. 53:1945-51), que es superior a la suma de los efectos de cualquiera de los dos componentes solos.

"Efecto sostenido" se define en la presente memoria como una respuesta apoptótica/mejorada para un tratamiento de combinación con un FPT1 y un inhibidor MEK1,2 en comparación con el tratamiento de uno solo por separado. Las consecuencias de un "efecto sostenido" pueden ser monitorizadas midiendo la actividad MAPK o bien la muerte de las células o apoptosis tal como se describió previamente. El curso de tiempo eficaz para la inhibición de la vía MAPK con las fármacos individuales depende de la dosis. Sin embargo los presentes experimentos muestran que los inhibidores de MEK1,2 inhiben óptimamente la vía MAPK en o antes en un tratamiento de 6 horas, mientras que SCH 66336 demuestra una inhibición óptima de la vía MAPK 12-18 horas después del tratamiento. El efecto inhibidor de MAPK de SCH 66336 ha demostrado que dura tanto como 72 horas después del tratamiento. Por lo tanto la combinación de las dos fármacos puede dar como resultado una inhibición "sostenida" de la vía MAPK durante un largo período de tiempo preferiblemente por un periodo a partir o justo antes de seis horas después del tratamiento y prosiguiendo preferiblemente a través de hasta 36 horas, más preferiblemente 72 horas después del tratamiento (véase por ejemplo la Figura 6).

La frase "muerte de células cancerosas" se refiere a la inducción de la muerte de células cancerosas en células tumorales de cáncer transformadas.

Uso de quimioterapia y/o terapia de radiación como agentes adicionales en los tratamientos de la presente invención

Los agentes quimioterapéuticos y/o de radiación pueden añadirse opcionalmente a los regímenes de tratamiento de la presente invención (además de la combinación de (1) un inhibidor de farnersil-proteína-transferasa FPT, y (2) un inhibidor de señalización adicional de la vía Ras). Para ser usado en quimioterapia y/o terapia de radiación en combinación con únicamente un inhibidor de FPT puede hacerse referencia a Liu, M., et al. Cancer Res. 58:4947-4956 (1998) y a la solicitud de Patente de EE.UU. 98/217.335, que se incorporan en la presente memoria como referencia.

Las clases de compuestos que pueden usarse como agente quimioterapéutico incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, productos naturales y sus derivados, hormonas y esteroides (incluyendo análogos de síntesis y sintéticos). Ejemplos de compuestos dentro de estas clases son los que se dan a continuación.

Agentes alquilantes (incluyendo mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos); mostaza de uracilo, Clorometina, Ciclofofamida (Cytoxan®), Ifosfamida, Melfalan, Clorambucil, Pipobroman, Trietilen-melamina, Trietilentiofosforamina, Busulfan, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina, y Temozolomida.

Antimetabolitos (incluyendo antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina-desaminasa); Metotrexato, 5-Fluoruracilo, Floxuridina, Citarabina, 6-Mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de Fludarabina, Pentostatina, y Gemcitabina.

Productos naturales y sus derivados (incluyendo alcaloides de vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfoquinas y epipodofilotoxinas): Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Bleomicina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, paclitaxel (paclitaxel es comercialmente obtenible como Taxol®, Mitramicina, Desoxico-formicina, Mitomicina-C, L-Asparaginasa, Interferones (especialmente IFN-\alpha), Etoposido y Teniposido.

Hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos); 17\alpha-Etinilestradiol, Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, Propionato de Dromostanolona, Testolactona, Acetato de Megestrol, Tamoxifeno, Metilprednisolona, Metiltestosterona, Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Acetato de medroxiprogesterona, Leoprolida, Flutamida, Toremifeno, y Zoladex.

Sintéticos (incluyendo complejos inorgánicos tales como complejos de coordinación de platino): Cisplatino, Carboplatino, Hidroxiurea, Amsacrina, Procarbazina, Mitotano, Mitoxantrona, Levamisol, y Hexametilmelamina.

Los métodos para una administración segura y eficaz de la mayor parte de estos agentes quimioterapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Además su administración ha sido descrita en la bibliografía convencional. Por ejemplo, la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos ha sido descrita en "Physicians' Desk Reference" (PDR), por ejemplo 1996 edición (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA); cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia.

Ejemplos

Los ejemplos proporcionados a continuación describen el efecto de la combinación de un inhibidor de FPT (SCH 66336) con un inhibidor de MEK (cualquiera de PD098059 o U0126) para la muerte celular programada (apoptosis) en las células Rat2 transformadas con H-Ras. De manera similar a las líneas de células tumorales, estas células exhiben un fenotipo totalmente transformado que incluye la capacidad de desarrollarse independientemente de la fijación en agar blando y como xeno-injertos en ratones atímicos (ratones a los que se suprimido el sistema inmune).

El compuesto inhibidor de FPT usado en los ejemplos siguientes (SCH 66336, Schering-Plough Research Institute) tiene la siguiente fórmula:

3

"PD 0980509", es un inhibidor de MEK particular que tiene la siguiente estructura química.

4

"PD 098059" se describe en forma más detallada en Dudley et al., 1995. La referencia de Dudley et al., menciona que el sólido liofilizado debe reconstituirse en DMSO para las concentraciones de reactivo usadas en los experimentos que se describen en la presente memoria.

"U0126", otro ejemplo de un inhibidor de MEK tiene la siguiente estructura química:

5

U0126 se describe en forma más detallada en Favata et al., 1998. La referencia de Favata et al., menciona también que el sólido liofilizado debe reconstituirse en DMSO para las concentraciones usadas en los experimentos que se describen aquí.

Materiales y métodos Líneas de células y tratamientos

En todos los casos las secuencias Ras contenían una mutación activadora por Gly^{12} a Val. H-ras (G12V;CVLL) representa una mutación Ser^{189} a Leu que genera una forma geranil-geranilada de la proteína H-ras. Los DNAc que representan estas proteínas H-ras fueron subclonados en el plásmido pMV7 para la generación de líneas de células estables Rat2 que expresan Ras mediante retroversión retroviral y selección con el gen de neomicina (Kirschmeier et al., 1988). Las líneas de células estables presentadas en la presente memoria representan clones individuales de células seleccionadas por neomicina que expresan Ras. Las H-ras (G12V)/Rat2, H-ras (G12V;CVLL)/Rat2, y las células parentales Rat2 fueron propagadas en DMEM que contenían 10% de suero de ternero fetal, penicilina, estreptomicina, aminoácidos no esenciales, L-glutamina y para los transformantes Ras, 200 \mug/ml Geneticina (Gibco/BRL; Gaithersburg, MD). Todas las células ras transformadas demostraron un fenotipo totalmente transformado que incluye el desarrollo independiente de la fijación y capacidades tumorígenas.

PD098059 (A385-023-M005; Alexis Corporation^{-}, San Diego, CA) y U0126 (nº V1121; Promega Corporation; Madison, WI) y fueron usados de acuerdo con Dudley et al. (1995) y Favata et al., (1998).

Valoración por FACS

La valoración por clasificación de células activadas por fluorescencia (abreviadamente en lo sucesivo FACS por la expresión inglesa Fluorescence-activated Cell Sorting) se llevó a cabo usando protocolos convencionales. Las células fueron cosechadas mediante tratamiento con tripsina/EDTA, la tripsina se neutralizó con DMEM que contenía 10% de FCS y las células fueron sedimentadas a razón de 500 x g durante 5 minutos. Las células se lavaron con PBS, se sedimentaron, se resuspendieron en 0,5 ml de PBS, y se fijaron con 10 ml de acetona:metanol (1:1) enfriado con hielo durante 30 minutos a -20ºC. Para marcar el DNA cromosómico con yoduro de propidio (PI), se lavaron dos veces las células fijadas con PBS, antes de resuspenderlas a razón de 1 x 10^{6} células/ml en PBS, 75 \mug/ml de Pl (Calbiochem; La Jolla, CA), 500 \mug/ml de RNasa (Sigma; St. Louis, MO), para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se filtraron a través de una tapa filtradora de 35 \mum (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) y se conservaron a 4ºC antes de la valoración por FACS en un aparato FACS Calibur (Becton Dickinson; Mountain View, CA). La cuantificación se llevó a cabo usando un aparato CellQuest (Becton Dickinson., Mountain View, CA).

Ensayo de actividad de caspasa

Las células Rat2 transformadas y Rat2 parentales de H-ras se trataron con PD098059 20 mM, SCH 66336 0,5 \muM o una combinación de las dos fármacos durante 36 horas a 37ºC. Las células se cosecharon con tripsina/EDTA, se sedimentaron a 500 x g durante 5 minutos, se lavaron con PBS, y fueron nuevamente sedimentadas. Las células fueron resuspendidas/lisadas en un tampón de lisis (ApoAlert CPP32/Caspase-3 Assay Kit; Clontech Laboratories; Palo Alto CA) que contenía inhibidores de proteasa "Complete" (Boehringer Mannheim; Alemania), incubados durante 10 minutos en hielo y se centrifugaron durante 3 minutos a 12000 rpm a 4ºC tal como se recomienda en el Protocolo Clontech. La concentración de proteína de los lisados de células se determinó usando el ensayo de proteína BCA (Pierce; Rockford, IL) y aproximadamente 30 \mug de cada lisado se ensayó para la actividad de Caspasa-3 por fluorometría (lector de placa (CytoFluor; Perspective Biosystems; Framingham, MA) usando un sustrato peptídico fluorogénico (Ac-DEVD-AFC; Clontech; Palo Alto, CA).

Análisis de transferencia Western del estatus de fosforilación de ERK1.2

Se lisaron las células en un tampón detergente (proporcionado con el ApoAlert CPP32/Caspase-3 Assay Kit; Clontech; Palo Alto CA) y se centrifugaron a 14000 rpm durante 15 minutos a 4ºC para sedimentar los residuos celulares. La concentración de proteína del sobrenadante resultante se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce; Rockford, IL). Se separaron las proteínas celulares (20 \mug) en 8-16% de geles de Tris-Glicina-poliacrilamida (Novex; San Diego, CA) y se transfirieron a membranas de PVDE para el análisis por transferencia Western. Las proteínas fosforiladas ERK1 y ERK2 fueron detectadas usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para la forma fosforilada de las proteínas p42144 MAPK (phosfho-Thr202/Tyr204 specific; New England Biolabs, Inc., Beverly MA). Las proteínas totales ERK1 y ERK2 se detectaron usando un anticuerpo policlonal de conejo específico para las proteínas p42144 MAPk (New England Biolabs, Inc, Beverly, MA). Un anticuerpo secundario anticonejo-HRP de cabra (Chemicon; Temecula, CA) permitió la visualización mediante quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Sustrate; Pierce, Rockford, IL).

Resultados 1. Efectos sobre la apoptosis: Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

Las respuestas apoptóticas celulares pueden monitorizarse en una variedad de formas que incluyen análisis de la fragmentación de DNA cromosómico, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células teñidas por yoduro de propidio, y medición de la activación por caspasa. Para evaluar la respuesta apoptótica al tratamiento con cualquier fármaco se coloreó el DNA cromosómico de las células tratadas con yoduro de propidio y se analizaron las células individuales mediante FACS. Las poblaciones típicas de cultivo de células exhiben un gran pico de células en la fase G1/G0 del ciclo celular con un pico más pequeño que representa las células de fase G2/M. Entre estos dos picos están células en la fase S del ciclo celular. Las células que exhiben marcado de DNA que están antes del pico G1/G0 representan células con DNA fragmentado que comprende menos de la cantidad diploide del DNA cromosómico y por lo tanto están sometidas a muerte celular (Dengler, et al., 1995). Esta medición proporciona una relativa cuantificación de la apoptosis que es comparable con otros ensayos de apoptosis que incluyen dUTP mediado por TdT, marcado en el extremo con muesca (Análisis TUNEL); Gorczyca et al., (1993) Cancer Res. 53: 1945-51. En los experimentos siguientes, se determinó el porcentaje de población total de células en el pico subG0/G1 como medición del porcentaje de apoptosis.

El tratamiento de las células Rat2 transformadas con H-Ras con PD098059 solo durante 36 horas dio como resultado un aumento de porcentaje de células apoptóticas que dependen de la dosis (Figura 2). A una concentración de PD098059 20 \muM, el 50% de las células eran apoptóticas. Cuando se repitió la respuesta a la dosis de PD098059 en presencia de SCH 66336 100 nM se observó un resultado muy diferente. En presencia de SCH 66336 100 nM solo, 30% de las células eran apoptóticas. Cuando se trató con la combinación, más del 60% de las células fueron llevadas hasta la apoptosis usando tan poco como PD098059 2,5 \muM. La concentración de PD098059 requerida para lograr una apoptosis del 50% fue 20 \muM cuando este compuesto se usó solo, pero fue de \leq1 \muM cuando se usó en combinación con un inhibidor de FPT. Esto indica que SCH 66336 sensibiliza las células en forma significativa para los efectos pro-apoptóticos de PD098059.

También se llevó a cabo un experimento inverso. El tratamiento con SCH 66336 solo durante 36 horas indujo una respuesta apoptótica dependiente de la dosis (Fig. 3). Usando SCH 66336 0,75 \muM, 70% las células fueron apoptóticas. Cuando se usó solo, la concentración de SCH 66336 requerida para inducir 50% de la apoptosis fue entre 0,25 y 0,5 \muM. La curva de respuesta a la dosis para SCH 66336 exhibió un desplazamiento hacia la izquierda en presencia de PD098059 2,5 \muM lo cual significó una respuesta apoptótica mejorada. Cuando estaba presente PD098059 la concentración de SCH 66336 requerida para inducir 50% de apoptosis fue 50 nM.

Se llevó a cabo un conjunto similar de experimentos con un inhibidor de MEK estructuralmente distinto U0126 (Fig. 4). De manera similar a PD098059, el U0126 es un inhibidor muy selectivo de las proteínas MEK 1,2 es un inhibidor muy selectivo de las proteínas MEK1,2 que exhibe una potente inhibición de su actividad de quinasa (Farata et al., 1890). El tratamiento con U0126 solo dio como resultado una inducción dependiente de la dosis de la apoptosis en células Rat2 transformadas con H-Ras con 17% de células apoptóticas observadas usando una concentración de 10 \muM. Cuando se repitió este experimento en presencia de SCTI 66336 0,5 \muM (una concentración que indujo 14% de apoptosis por sí misma) se observó una respuesta más que aditiva con la combinación. La combinación de U0126 10 \muM y SCH 66336 0,5 \muM dio como resultado más de 50% de las células convertidas en apoptóticas.

Estos datos demuestran un aumento significativo de la potencia proapoptótica en las células Rat2 transformadas con H-Ras de los inhibidores de MEK y los inhibidores SCH 66336 cuando se ensayaron en combinación. En contraste con estos resultados, las células Rat2 parentales no transformadas o las células Rat2 transformadas con Ki-Ras activados fueron insensibles a la apoptosis inducida por cualquiera de los fármacos solos o mediante la combinación de SCH 66336 y PD098059 (los datos no se muestran). La falta de efecto en las células Rat2 transformadas con Ki-Ras puede explicarse en parte por recientes observaciones en el sentido de que algunas isoformas Ras (Ki-Ras y N-Ras) son alternativamente preniladas mediante la geranil-geranil transferasa 1 tanto in vitro como en células tratadas con inhibidores de FPT (Zhang et al., 1997; Whyte et al., 1997).

2. Efectos sobre la apoptosis: Activación por caspasa

Las caspasas son una familia evolucionadamente conservada de enzimas que degradan y desensamblan proteolíticamente la célula en respuesta a las señales proapoptóticas (revisadas por Thomberry and Lazebnik, 1998). Para evaluar la apoptosis usando este punto final bioquímico distinto, se midió la actividad de caspasa en lisados de células preparados a partir de células Rat2 transformadas con H-Ras usando un ensayo fluorométrico para la actividad de caspasa 3 (ApoAlert CPP32/Caspase-3 Assay, Clontech). El tratamiento de células H-Ras transformadas durante 24 horas con SCH 66336 0,5 \muM o PD098059 20 \muM solo aumentó la actividad de caspasa por encima del nivel de base de las células no tratadas (Figura 5). Estos resultados son consistentes con los efectos proapoptóticos de cualquiera de los fármacos observados durante el análisis FACS (Figura 2 a las 36 horas). Cuando las células Rat2 transformadas con H-Ras se trataron con la combinación de ambos fármacos, se observó una respuesta más que aditiva de la caspasa 3, lo cual confirmó nuevamente los resultados del FACS.

Se observó muy poca o ninguna activación por caspasa en las células Rat2 parentales cuando se trataron con un agente único o con una combinación de ambos fármacos (Fig. 5).

3. Efectos sobre la fosforilación de MAPK

Se investigó la capacidad del inhibidor de FPT SCH 66336 y del inhibidor de MEK PD098059 para bloquear la activación de MEK en células Rat2 transformadas con H-Ras midiendo el estado de fosforilación de sus sustratos ERK1 y ERK2 (44 y 42 Kd, respectivamente). El tratamiento de células con PD098059 20 \muM disminuyó la fosforilación de ambas proteínas (Fig. 6). La inhibición máxima se observó en el primer punto de tiempo examinado (6 horas) y la fosforilación permaneció suprimida a través de las 36 horas. El tratamiento de las células con SCH 66336 0,5 \muM disminuyó la fosforilación de ambas proteínas en una sola vez (Fig. 6) y de manera que dependía de la dosis (no se muestran los datos), con SCH 66336 0,5 \muM que exhibió una inhibición máxima entre las 24-36 horas de tratamiento. En ambos casos la inhibición de la fosforilación fue más intensa para la proteína ERK1 de 44 kDa. Aunque su estado de fosforilación disminuyó, la cantidad total de esas proteínas no fue afectada por el tratamiento con el fármaco (Fig. 6, paneles inferiores).

Discusión

Los inhibidores de FPT tales como los inhibidores SCH 66336 y los de MEK tales como PD098059 o U0126 tienen como diana distintas etapas en una vía común de transducción de señales. Sorprendentemente, cuando ambos agentes se combinan, tienen más que un efecto aditivo sobre la apoptosis en las células Rat2 transformadas con H-Ras medido mediante análisis FACS o por población subG0/G1 o por activación de caspasa. Sin deseo expreso de basarnos en una teoría en particular, existen dos potenciales explicaciones para esta observación. La primera, es posible si esta combinación da como resultado una inhibición más completa o de duración más prolongada (sostenida) de la vía lineal señalada en la Figura 1. Alternativamente, la eficacia de la combinación puede atribuirse al hecho de que las vías de señalización intracelular son considerablemente más complejas y están más interconectadas que la vía representada en la Figura 1. Un esquema de conexiones más completo se muestra en la Figura 7. Tal como se mencionó previamente, es claro que estas vías se ramifican en varias etapas a lo largo de la vía. Los receptores del factor de crecimiento activan varias vías de señalización a través de interacciones que son mediadas por SH2. De manera similar los efectores Ras múltiples han sido identificados utilizando híbridos de dos levaduras y otras realizaciones bioquímicas. La eficacia combinada de un inhibidor de FPT y un inhibidor de MEK puede ser la razón de sus efectos sobre distintas ramificaciones de estas vías. Por ejemplo, además de bloquear la activación intermediada por H-Ras de MEK, los inhibidores de FPT bloquean otras vías efectoras de Ras (por ejemplo las vías PI3K y Rho). De manera similar existe evidencia de la activación independiente Ras de la vía MEK/MAPK (Duckworth and Cantley, 1997; Morrison and Cutier, 1997). Aunque los componentes moleculares de esta vía independiente Ras siguen sin estar totalmente delineados, esto sugiere que un inhibidor de FPT solo no puede bloquear todas las vías que conducen a la activación MEK/MAPK. Por lo tanto, la combinación de estas dos clases de inhibidores puede dar como resultado un bloqueo más completo.

Independientemente del mecanismo, los datos ex vivo con la combinación de SCH 66336 y PD098059 demuestran una sorprendente potenciación de la actividad inductora de apoptosis. Además, este tipo de eficacia mejorada en forma combinada es extensible para incluir otros agentes cuyo objetivo son las vías de transducción de señales, (por ejemplo agentes que bloquean los receptores del factor de crecimiento). Tal como se manifestó anteriormente dichos efectos pueden ser el resultado de: (i) una inhibición más completa de la vía de señalización Ras del factor de crecimiento que la que se logra con el tratamiento con un solo agente, o (ii) la inhibición simultánea de múltiples vías de señalización. Por ejemplo muchos tumores pueden ser activados por la acción de factores múltiples de crecimiento, que actúan cada uno de ellos de modo autocrino o paracrino para dirigir la proliferación a través de sus receptores afines. El bloqueo de una de estas vías receptoras usando anticuerpos o inhibidores de tirosina quinasa puede ejercer un efecto antitumoral bloqueando la vía de señalización, pero sin embargo otras vías impulsadas por el receptor no pueden ser afectadas. La adición de un inhibidor de FPT puede cerrar la señalización de estas otras vías lo cual dará como resultado una inhibición más completa de la transducción de señales y por lo tanto exhibirá un efecto antitumoral sinérgico. Además, debido a que los receptores del factor de crecimiento se sabe que inician cascadas de señalización múltiple (por ejemplo Ras/MEK, fosfolipasa C\gamma y _{} P13K), puede suceder que la inhibición de la vía Ras con un inhibidor de FPT o un inhibidor de MEK no tenga ningún efecto sobre la capacidad de señalización de estas otras vías. Por lo tanto, la adición de un anticuerpo receptor del factor de crecimiento o un inhibidor de tirosina-quinasa a una célula tumoral tratada con un inhibidor de FPT puede dar como resultado una inhibición más completa de la señalización y tener un efecto antitumoral sinérgico mediante la interrupción de las vías que no son afectadas por el inhibidor de FTP.

También puede observarse tipos similares de sinergia combinando los inhibidores de FPT con agentes cuyas dianas son otras etapas en estas vías de señalización (por ejemplo los inhibidores Raf, los inhibidores SH2, los inhibidores PI3K).

Composiciones farmacéuticas

Los vehículos farmacéuticamente aceptables inertes usados para preparar composiciones farmacéuticas sobre los inhibidores de FPT y los inhibidores de las vías de señalización Ras descritos en la presente memoria pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones sólidas incluyen polvos, comprimidos, gránulos dispersables, cápsulas, sellos y supositorios.

Para preparar supositorios, se funde primero una cera de bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao y el ingrediente activo se dispersa homogéneamente en la misma mediante agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de un tamaño apropiado y se deja enfriar y por consiguiente solidificar.

Las preparaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Pueden mencionarse como ejemplo, agua o soluciones de agua y propilenglicol para inyección parenteral. Las preparaciones líquidas pueden incluir también soluciones para administración intranasal.

Las preparaciones en aerosol que son apropiadas para inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma pulverulenta que pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un gas inerte comprimido.

Así mismo se incluyen las preparaciones sólidas que están destinadas a la conversión poco tiempo antes de su uso en preparaciones líquidas para administración por vía oral o parenteral. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones.

Los inhibidores de FPT y los inhibidores de la vía Ras adicionales descritos en la presente memoria pueden ser administrados también por vía transdérmica. Las composiciones transdérmicas pueden tener las formas de cremas, lociones, aerosoles y/o emulsiones y pueden incluirse en un parche transdérmico de tipo de matriz o depósito tal como los que se usan convencionalmente en la técnica para tales propósitos.

Preferiblemente los compuestos se administran por vía oral.

Preferiblemente, la preparación farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria. En dicha forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen las cantidades apropiadas del componente activo, por ejemplo una cantidad eficaz para lograr el propósito deseado.

La cantidad de compuesto activo en una dosis de preparación unitaria puede variar o puede ajustarse a desde aproximadamente 0,5 mg a 1000 mg, preferiblemente desde aproximadamente 1 mg a 300 mg, y más preferiblemente 5 mg a 200 mg, de acuerdo con la aplicación particular.

La dosis real empleada puede variar dependiendo de los requisitos del paciente y de la gravedad de la enfermedad que se está tratando. La determinación de la dosis adecuada para una situación particular está dentro de la experiencia del experto en la técnica. En general el tratamiento se inicia con dosis más pequeñas inferiores a la dosis óptima del compuesto. A continuación se incrementa la dosis en pequeñas cantidades hasta alcanzar el efecto óptimo bajo las circunstancias determinadas. Por razones de conveniencia la dosis diaria total puede dividirse y puede administrarse en porciones durante el día si se desea.

La cantidad y frecuencia de administración de los inhibidores de FPT y de los inhibidores adicionales de la vía Ras estarán reguladas de acuerdo con la opinión del clínico de cabecera (médico) considerando factores tales como la edad, el estado y el tamaño del paciente. así como también la gravedad de la enfermedad que se está tratando. En general, la dosis para un inhibidor de FPT (cuando se usa como único agente), puede tener concebiblemente un límite superior de 2000 mg/día, preferiblemente un intervalo de 50 a 400 mg/día en casos en los que el inhibidor de FPT es una benzocicloheptapiridina tricíclica de anillo fusionado, sin embargo, en la terapia de combinación de la presente invención, un régimen de dosificación bajo preferido de los inhibidores de FTP es por ejemplo, la administración por vía oral de una cantidad en el intervalo de 1,4 a 400 mg/día más preferiblemente 1,4 a 350 mg/día, aún más preferiblemente 3,5 a 70 mg/día preferiblemente con un programa de dosificación de dos veces al día (B.I.D.). Un intervalo de dosis particularmente baja puede ser de 1,4 a 70 mg/día.

Los inhibidores adicionales de la vía Ras pueden administrarse de acuerdo con los protocolos terapéuticos que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo., Pegram, M.D. et al., (1998). J. Clin Oncol. 16:2659-2671. Resultará evidente para los expertos en la técnica que la administración del inhibidor adicional de la vía Ras puede variar dependiendo de la enfermedad que se está tratando y de los efectos conocidos del inhibidor adicional de la vía ras sobre esta enfermedad. Así mismo de acuerdo con el conocimiento del médico clínico, los protocolos terapéuticos (por ejemplo las cantidades de dosificación y los tiempos de administración), pueden variarse en vista de los efectos observados de los agentes terapéuticos administrados (es decir, el inhibidor adicional de la vía ras) en el paciente, y en vista de las respuestas observadas de la enfermedad para los agentes terapéuticos administrados. En general, las dosis para un inhibidor adicional de las vías de señalización Ras (cuando se usa como agente único) puede estar, por ejemplo en el intervalo de 5 a 2000 mg/día. Sin embargo en la terapia de combinación de la presente invención, un régimen de bajas dosis preferido de un inhibidor adicional de una vía de señalización ras (por ejemplo un inhibidor de MEK), es la administración de un cantidad en el intervalo de 1 a 350 mg/día más preferiblemente 3,5 a 70 mg/día, preferiblemente con un programa de dosificación de dos veces al día (B.I.D). Un intervalo de dosis particularmente bajo puede ser de 1 a 70 mg/día.

Por lo tanto, en un ejemplo preferido de terapia de combinación para el tratamiento de cáncer (por ejemplo, cáncer de páncreas, de pulmón o de vesícula), el inhibidor de FPT puede ser SCH 666336, tal como se identificó previamente, administrado por vía oral en una cantidad de 70 mg/día en dos dosis divididas, en un régimen de dosificación continua; y el inhibidor adicional de la vía de señalización Ras puede ser PD098059 (o un análogo del mismo) administrado en una cantidad de 350 mg/día en_{} dos dosis dividas en un régimen de dosificación continua.

El inhibidor de FPT y el inhibidor adicional de la vía Ras pueden ser administrados concurrentemente (por ejemplo simultáneamente, esencialmente simultáneamente o dentro del mismo protocolo de tratamiento), o secuencialmente dependiendo de la naturaleza de la enfermedad proliferante, del estado del paciente y de la elección real del inhibidor adicional de la vía Ras que debe administrarse conjuntamente (es decir dentro de un protocolo de tratamiento único) con el inhibidor de FPT.

Si el inhibidor de FPT y el inhibidor adicional de la vía Ras no se administran simultáneamente o esencialmente de modo simultáneo, entonces el orden inicial de administración del inhibidor de FPT y del inhibidor adicional de la vía Ras pueden no ser importantes. Por lo tanto, el inhibidor de FPT puede administrarse primero seguido de administración del inhibidor adicional de la vía Ras; o el inhibidor adicional de la vía Ras puede administrarse primero seguido de la administración del inhibidor de FPT. Esta administración alternativa puede repetirse durante un protocolo de tratamiento único. La determinación del orden de administración y de la cantidad de repeticiones de cada agente terapéutico durante un protocolo de tratamiento está dentro de la experiencia del experto en la técnica después de evaluar la enfermedad que se está tratando y el estado del paciente. Por ejemplo, el inhibidor adicional de la vía Ras puede administrarse primero y luego puede continuarse el tratamiento con la administración del inhibidor FPT seguido, cuando se considera ventajoso, de la administración del inhibidor de la vía Ras adicional, etc, hasta que se completa el protocolo de tratamiento.

Por lo tanto, de acuerdo con la experiencia y los conocimientos, el médico clínico puede modificar cada protocolo para la administración de un componente (agente terapéutico - es decir-, inhibidor de FPT, inhibidor adicional de la vía Ras) del tratamiento de acuerdo con las necesidades individuales del paciente a medida que avanza el tratamiento.

El médico clínico, al juzgar si el tratamiento es eficaz en las dosis administradas considerará el bienestar general del paciente, así como también los signos más definidos, tales como el alivio de los síntomas relacionados con la enfermedad, la inhibición del crecimiento del tumor, el encogimiento real del tumor o la inhibición de la metástasis. El tamaño del tumor puede medirse a través de métodos convencionales, tales como estudios radiológicos, por ejemplo escaneo por tomografía asistida por ordenador (CAT) o formación de imagen por resonancia magnética (abreviadamente MRI por la expresión inglesa Magnetic Resonance Imaging), y pueden usarse mediciones sucesivas para juzgar si el crecimiento del tumor se ha retardado o no o incluso si se ha producido su regresión. El alivio de los síntomas relacionados con la enfermedad, tales como dolor, y la mejora de la condición general, pueden usarse también para juzgar la eficacia del tratamiento. (Naturalmente, tal como se indicó previamente, un tratamiento eficaz empleando los métodos de la presente de la presente invención dará preferiblemente como resultado un nivel sinérgico de muerte de las células cancerosas y/o una regresión del tumor).

Los siguientes son ejemplos (Ejemplos 1-4) de formulaciones de cápsulas para el compuesto inhibidor de FPT:

6

Ejemplos 1 y 2

Formulación de cápsulas

7

Método (Ejemplos 1 y 2)

Preparación de solución sólida

8

El compuesto inhibidor de FPT cristalino y la povidona se disolvieron en cloruro de metileno. La solución se secó usando un secador apropiado de pulverización de disolvente. Luego el residuo se redujo por trituración hasta finas partículas. El polvo se hizo pasar luego a través de un tamiz de malla 30. Se halló que el polvo era amorfo por análisis de rayos X.

La solución sólida de dióxido de silicio^{(1)} y estearato de magnesio^{(2)} se mezcló en un mezclador apropiado durante 10 minutos. La mezcla se compactó usando un compactador de rodillo apropiado y se trituró usando un molino apropiado provisto de un tamiz de malla 30. La croscarmelosa de sodio, el Pluronic F68 y el dióxido de silicio^{(3)} se añadieron a la mezcla triturada y se mezclaron adicionalmente durante 10 minutos. Se preparó una pre-mezcla con estearato de magnesio^{(4)} y con porciones iguales de la mezcla. La premezcla se añadió al resto de la mezcla y se siguió mezclando durante 5 minutos. La mezcla se encapsuló luego en cápsulas de gelatina de envolvente dura.

Ejemplos 3 y 4

Formulación de cápsulas

9

\vskip1.000000\baselineskip

Método (Ejemplos 3 y 4)

Preparación de solución sólida

10

El compuesto inhibidor de FPT cristalino y la povidona se disolvieron en una mezcla de cloruro de metileno y metanol. La solución se secó usando un secador apropiado de pulverización de disolvente. Luego el residuo se redujo por trituración hasta finas partículas. El polvo se hizo pasar luego a través de un tamiz de malla 30. Se halló que el polvo era amorfo por análisis de rayos X.

La solución sólida, el sólido de silicio^{(1)} y estearato de magnesio^{(2)} se mezclaron en un mezclador apropiado durante 10 minutos. La mezcla se compactó usando un compactador de rodillos apropiado y se trituró usando un molino apropiado provisto de un tamiz de malla 30. La croscarmelosa de sodio, el Pluronic F68 y el dióxido de silicio^{(3)} se añadieron a la mezcla triturada y se mezclaron adicionalmente durante 10 minutos. Se preparó una pre-mezcla con estearato de magnesio^{(4)} y con porciones iguales de la mezcla. La premezcla se añadió al resto de la mezcla y se siguió mezclando durante 5 minutos. La mezcla se encapsuló luego en cápsulas de gelatina de envolvente dura.

Para información sobre las formulaciones puede hacerse también referencia a las solicitudes de patente de EE.UU. Nº de serie 08/997168 y 60/068387 (presentadas el 22 de Diciembre de 1997), que se incorporan en la presente memoria expresamente como referencia.

El alcance de esta invención en su aspecto de composición farmacéutica no está limitado por los ejemplos provistos.

Referencias

Alessi, D. R., et al., (1995). J Biol Chem. 270:27489-27494.

Baffington, R. E., et al., (1998). Mol Cell Biol. 18:85-92.

Bishop, W. R., et al., (1995). J Biol Chem. 270:30611-30618.

Campbell, S. L., et al., (1998). Oncogene. 17:1395-1413.

Dengler, W.A., et al., (1995). Anticancer Drugs 6:522-32.

Duckworth, B. C., and Cantley, L. C. (1997). J Biol Chem. 272:27665-27670.

Dudley, D. T., et al., (1995). Proc Natl Acad Sci USA. 92:7686-7689.

Favata, M. F., et al., (1998). J Biol Chem. 273:18623-32.

Fry, D.W., et al., (1994). Science. 9:1093-1095.

Goldstein, N. I., et al., (1995). Clin Cancer Res. 1:1311-1318.

Gorczyca et al., (1993) Cancer Res. 53:1945-51.

Graham, N. (1995). Exp Opin Ther Patents. 5:1269-1285.

Gutkind, J. S. (1998). J Biol Chem. 273:1839-1842.

Heldin, C.H. (1995). Cell. 80:213-23.

Hung, W. C., and Chaung, L. Y. (1998). Int J Oncol. 12:137-140.

James, G. L., et al., (1994). J Biol Chem. 269:27705-27714.

Kohl, N., et al., (1995). Nature Medicine. 1:792.

Kovalenko, M., et al., (1994). Cancer Res. 54:6106-6114.

Lebowitz, P. F., et al., (1997). J Biol Chem. 272:15591-15594.

Levitzki, A., and A. Gazit. (1995). Science. 267:1782-1788.

Liu, M., et al. (1998). Cancer Res. 58:947-4956.

Lowy, D. R., and Willumsen, B. (1993) Annu Rev Biochem. 62:851-809.

Mendelsohn, J. (1992). J Nat’l Cancer Inst Monogr 13:125-131.

Moasser, M.M., et al., (1998). Proc Natl Acad Sci. 95:1369-1374.

Monia, B.P., et al., (1996). Nucleosides and Nucleotides Their Biological Applications-1. Supp 34.

Morrison, D.K., and Cutier, R.E. (1997). Curr Opin Cell Biol. 9:174-179.

Moyer, J. D., et al., (1997). Cancer Res. 57:4838-4848.

Norgaard, P., et al., (1999). Clin Cancer Res. 5:35-42.

Pegram, M.D., et al., (1998). J Clin Oncol. 16:2659-2671.

Raff, M. (1998). Nature. 396:119-122.

Resnicoff, M. (1998). Int J Mol Med. 1:883-888.

Suzuki, N., et al., (1998). Proc Natl Acad Sci USA. 95:15356-15361.

Thomberry, N.A. and Lazebnik, Y. (1998). Science. 281:1312-1316

Trahey, M., and McCormick, F. (1987). Science. 238:542-5.

Wang, HM, et al., (1998). Anticancer Res. 18: 2297-2300.

Whyte, D. B., et al., (1997). J Biol Chem. 272:14459-14464.

Zhang, F. L., (1997). J Biol Chem. 272: 232-10239.

Claims (27)

1. El uso de un inhibidor de FPT en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un paciente por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

11

y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

2. El uso de un inhibidor de la vía de señalización Ras en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un paciente por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

12

y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

3. El uso de un inhibidor de FPT en la fabricación de una composición farmacéutica para producir la regresión del volumen de un tumor en un paciente con cáncer por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

13

y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

4. El uso de un inhibidor de la vía de señalización Ras en la fabricación de una composición farmacéutica para producir la regresión del volumen de un tumor en un paciente con cáncer por administración de:

(1) un inhibidor de FTP de la fórmula siguiente:

14

y (2) un inhibidor de la vía de señalización Ras en cantidades eficaces para inducir un nivel sinérgico de muerte de células cancerosas.

5. El uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el inhibidor de la vía de señalización Ras adicional es un inhibidor de quinasa.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el inhibidor de la vía de señalización Ras adicional inhibe un elemento aguas abajo de Ras en la vía de señalización Ras.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el inhibidor de la vía de señalización Ras adicional es un inhibidor de MEK.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el inhibidor de la vía de señalización Ras adicional es un inhibidor del receptor del factor de crecimiento.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde el inhibidor del receptor del factor de crecimiento es un inhibidor de tirosina-quinasa.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde el inhibidor de tirosina-quinasa es un pequeña molécula seleccionada del grupo que consiste en: (1) un inhibidor del receptor de erbB2, (2) un inhibidor del receptor de PDGF, (3) un inhibidor del receptor de IGF, y (4) un inhibidor de tirosina quinasa del receptor EGF.

11. El uso de la reivindicación 8, en donde el inhibidor del receptor del factor de crecimiento es un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de un receptor del factor de crecimiento.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor erbB2 o un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor del EGF.

13. El uso de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal cuya diana es el receptor de erbB2.

14. El uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el inhibidor de FPT se administra en una cantidad de 1,4 a 400 mg/día.

15. El uso de la reivindicación 14, donde el inhibidor de FPT se administra en una cantidad de 3,5 a 70 mg/día.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor adicional de la vía Ras se administra en una cantidad de 1 a 350 mg/día.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde el inhibidor adicional de la vía Ras se administra en una cantidad de 3,5 a 70 mg/día.

18. El uso de cualquier reivindicación precedente, en donde dicho inhibidor de FPT y dicho inhibidor adicional de vía Ras se administran simultáneamente.

19. El uso de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho inhibidor de FPT y dicho inhibidor de la vía Ras adicional se administran secuencialmente.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde dicho inhibidor adicional de la vía Ras se administra primeramente.

21. El uso de la reivindicación 17, donde dicho inhibidor de FPT se administra primeramente.

22. El uso de la reivindicación 1, donde el cáncer es: cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de ovario, cánceres de hígado, leucemia mieloide, melanoma, cáncer folicular del tiroides, carcinoma de vesícula, glioma, síndrome mielodisplástico, cáncer de mama o cáncer de próstata.

23. El uso de cualquier reivindicación precedente, que comprende además administrar un agente quimioterapéutico.

24. El uso de la reivindicación 23, donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona de: mostaza de uracilo, Clormetina, Ciclofosfamida, Ifosfamida, Melfalan, Clorambucilo, Pipobroman, Trietilenmelamina, Trietilentiofosforamina, Busulfan, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina, Temozolomida, Metotrexato, 5-Fluoruracilo, Floxuridina, Citarabina, 6-mercaptopurina, 6-Tioguanina, fosfato de Fludarabina, Pentostatina, Gemcitabina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Bleomicina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirubicina, Idarubicina, Paclitaxel, Mitramicina, Desoxicoformicina, Mitomicina-C, L-Asparaginasa, Interferones, Etoposida, Teniposido, 17\alpha-Etinifestradiol, Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, Propionato de Dromostanolona, Testolactona, Acetato de Megestrol, Tamoxifeno, Metilprednisolona, Metiltestosterona, Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Acetato de Medroxiprogesterona, Leoprolida, Flutamida, Toremifeno, Zoladex, Cisplatino, Carboplatina, Hidroxiurea, Amsacrina, Procarbazina, Mitotano, Mitoxantrona, Levamisol, Navelbeno, CPT-11, Anastrazol, Letrazol, Capecitabina, Reloxafina, Droloxafina, Gemcitabina, Paclixatel o Hexametilmelamina.

25. El uso de la reivindicación 23, en donde dicho agente antineoplástico es temozolamida.

26. El uso de cualquier reivindicación precedente, en donde dicho tratamiento adicional comprende administrar radiación.

27. El uso de cualquier reivindicación precedente, en donde la muerte celular del cáncer ocurre por apoptosis.