ES2260768T3 - Metodos para modificar restos de hidratos de carbono. - Google Patents
Metodos para modificar restos de hidratos de carbono.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA CONVERTIR GRUPOS DE GLUCOSILACION DE UN ELEVADO NUMERO DE RESTOS DE MANOSA EN GRUPOS DE GLUCOSILACION HIBRIDOS O COMPLEJOS.
Description
Métodos para modificar restos de hidratos de
carbono.
La invención se refiere a un procedimiento para
convertir modelos de glucosilación en proteínas y proteínas
producidas por recombinación, especialmente proteínas terapéuticas,
que tienen un modelo híbrido o complejo. El procedimiento implica
cultivar un hongo filamentoso o una levadura para producir una
glucoproteína del tipo rica en manosa que es un sustrato aceptor
para GlcNacTrI. El procedimiento también implica hacer reaccionar
una glucoproteína del tipo rica en manosa con una
\alpha-1,2-manosidasa y GlcNac TrI
en una levadura u hongo filamentoso para producir una glucoproteína
híbrida.
La glucosilación afecta a muchas propiedades de
una glucoproteína, incluyendo el plegamiento apropiado de la
proteína, la sensibilidad/resistencia a proteasa, el tráfico
intracelular y la compartimentalización, la secreción, las
asociaciones inter e intramoleculares, las afinidades
intermoleculares, la selección de diana tisular y la semivida
biológica. Los modelos de glucosilación también alteran de manera
significativa la actividad, solubilidad, aclaramiento, agregación
intermolecular y antigenicidad biológicas, especialmente de aquellas
proteínas que se administran terapéuticamente in vivo.
En las patentes de los EE.UU. 5.324.663 y
5.272.066 se describen métodos de síntesis para modificar
estructuras de oligosacáridos en glucoproteínas.
La producción recombinante de muchas proteínas
puede alterar mucho su modelo de glucosilación. Las proteínas
expresadas en bacterias están completamente sin glucosilar. Los
modelos de glucosilación de la levadura de panadería no son
equivalentes a los homólogos mamíferos y son muy antigénicos en
mamíferos (Ballou, C. E., 1982. En Strathern, J. N. et al.
(eds). The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces.
Metabolism and Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, págs. 335-360).
De manera similar, se observan restos de
glucosilo no complejos cuando se utilizan células de insecto, tales
como el popular sistema de expresión de baculovirus Sf9, para
expresar proteínas de mamífero (Davidson et al.,
Biochemistry, 29:2828-2838 (1990); Bahl, O .P. et
al., en Cell Surface and Extracellular Glycoconjugates -
Structure and Function, D. D. Roberts et al., eds., Academic
Press, Inc. 1993 págs. 245-270). Se sintetizan
oligosacáridos híbridos y ricos en manosa (Man) en proteínas
producidas en células de insecto. Las estructuras primarias de estos
glucanos no son diferentes de las encontradas en ciertas proteínas
de mamífero tales como ribonucleasa B, tiroglobina, activador
tisular de plasminógeno (este último tiene en sus sitios de
glucosilación una población mixta de estructuras complejas y ricas
en manosa).
Los cultivos pequeños de células de mamífero son
prácticos para el uso en experimentos de expresión génica de
mamíferos en laboratorio. Sin embargo, el coste y las dificultades
para expresar grandes cantidades de glucoproteínas recombinantes
terapéuticas en cultivos de células de mamífero son prohibitivos.
Por lo tanto, se necesita un huésped que pueda producir grandes
cantidades de proteínas recombinantes y que posea, o pueda
modificarse para que posea, un modelo de glucosilación que sea
similar al producido por las células de mamífero.
Los hongos filamentosos, por ejemplo
Trichoderma, tienen ciertas ventajas como huéspedes
recombinantes. Es fácil hacer crecer grandes cantidades de estos
hongos y tienen la capacidad de glucosilar y secretar de manera
eficaz grandes producciones de proteínas recombinantes de mamífero
hacia el medio, haciendo relativamente fácil el aislamiento. Además,
el modelo de glucosilación en tales proteínas es más similar a los
humanos que el de la levadura de panadería. Sin embargo, todavía
hay diferencias, lo que coloca a los modelos de glucosilación
fúngica de tipo natural en una desventaja estructural y funcional
cuando la eficacia in vivo de una proteína requiere un tipo
específico de glucosilación. Por ejemplo, los residuos terminales de
ácido siálico son importantes en el funcionamiento de una proteína
en un sistema de mamífero, ya que impiden el aclaramiento de la
glucoproteína desde el torrente sanguíneo del mamífero. Se cree que
el mecanismo detrás del aumento de la semivida biológica de
moléculas sialiladas está en su menor reconocimiento por parte de
lectinas (Drickamer, K., J. Biol. Chem.
263:9557-9560 (1988)). Sin embargo, las células
fúngicas no pueden añadir tales unidades. Las glucoproteínas
sintetizadas en células fúngicas no tienen siálico.
Otra desventaja presentada por la incapacidad de
generar restos de glucoproteína complejos está en la presencia de
residuos terminales de manosa. Las glucoproteínas que terminan en
residuos de manosa son ligandos para proteínas que se unen a manosa
en macrófagos y células del sistema reticuloendotelial (Ezekowitz
et al., J. Cell Sci. Suppl. 9:121-133
(1988)). Mientras esto puede ser útil en algunos casos limitados, en
lo que respecta a fines de selección de diana, esto tiene una
consecuencia farmacológica indeseable para la mayoría de proteínas
recombinantes - por ejemplo, el rápido aclaramiento del compuesto
desde la sangre. El rápido aclaramiento puede afectar de manera
deletérea a la farmacocinética del agente administrado y disminuir
su potencial terapéutico y aumentar su toxicidad. Por tanto, los
modelos de glucosilación no complejos producidos por recombinación
dificultan el uso de glucoproteínas obtenidas por recombinación para
uso terapéutico humano (Sareneva, T. et al., Interferon Res.
13:267-269
(1993)).
(1993)).
Estas desventajas puede bloquear la utilidad
biológica o farmacológica de las proteínas mamíferas generadas
utilizando sistemas de transformación final. Por tanto, en la
industria de glucoproteínas se ha sentido desde hace tiempo una
necesidad de proporcionar modelos de glucosilación de tipo complejo
o híbrido en glucoproteínas en huéspedes fúngicos, que pueden
modificarse in vivo y/o in vitro, lo que les permite
producir modelos de glucosilación similares a los encontrados en
proteínas de eucariotas superiores.
Reconociendo la necesidad de una producción
económica a gran escala de proteínas recombinantes que tienen un
modelo de glucosilación mamífero, los inventores han investigado el
tratamiento de residuo glucosilo en células de mamífero y fúngicas.
Estos estudios han conducido al descubrimiento de que hongos
filamentosos tales como Trichoderma pueden secretar una
proteína deseada en forma de precursor inmaduro glucosilado que
puede tratarse in vitro hasta un modelo de glucosilación
mamífero de tipo híbrido. Este descubrimiento ha dado como resultado
el desarrollo de métodos para preparar modelos de glucosilación de
proteína complejos e híbridos, similares a los encontrados en
huéspedes mamíferos.
Por consiguiente, en una primera realización, se
modifica secuencialmente el modelo de glucosilación de una proteína
glucosilada deseada (glucoproteína) mediante la reacción con
N-acetilglucosaminil-transferasa I
(GlcNAc Tr I), galactosiltransferasa y sialiltransferasa, de modo
que se produce una proteína que tiene un modelo de glucosilación de
tipo complejo o híbrido con ácido(s) siálico(s)
terminal(es) similar al de las células de mamífero.
Por consiguiente, en una realización adicional,
se modifica secuencialmente el modelo de glucosilación de una
proteína glucosilada deseada en una levadura u hongo filamentoso con
\alpha-1,2-manosidasa, para
mejorar la reacción con GlcNAc Tr I, galactosiltransferasa y
sialiltransferasa, de modo que se produce un modelo de
glucosilación de tipo híbrido con un residuo(s)
ácido(s) siálico(s) terminal(es) similar al de
células de mamífero.
Por consiguiente, en una realización adicional,
glucoproteínas del tipo ricas en manosa se expresan en, y
preferiblemente se secretan a partir de, un huésped fúngico
filamentoso que se ha transformado con GlcNAc Tr I, y se modifican
mediante reacción secuencial con galactosiltransferasa y
sialiltransferasa de modo que se produce un modelo de glucosilación
de tipo híbrido con un ácido siálico terminal, una estructura
similar a la de las células de mamífero.
Por consiguiente, en una realización adicional,
se modifica el patrón de glucosilación de la proteína glucosilada
deseada producida en un huésped fúngico, tal como levadura u hongo
filamentoso, preferiblemente Trichoderma o
Aspergillus, que se ha transformado con
\alpha-1,2-manosidasa y/o GlcNAc
Tr I, haciendo reaccionar manera secuencial una proteína de este
tipo con GlcNAc Tr I, si fuera necesario, y con
galactosiltransferasa y sialiltransferasa, de modo que se produce
una proteína que tiene un modelo de glucosilación de tipo híbrido
con una estructura de ácido siálico terminal similar a la de células
de mamífero.
Por consiguiente, en una realización adicional,
se produce la forma glucosilada inmadura de una glucoproteína de
tipo rica en manosa en un huésped fúngico, tal como una levadura u
hongo filamentosos, preferiblemente Trichoderma o
Aspergillus, que se ha transformado con un gen recombinante
que codifica para
\alpha-1,2-manosidasa y/o GlcNAc
Tr I, preferiblemente GlcNAc Tr I humana, y se modifica
adicionalmente mediante una reacción in vitro con manosidasa
no específica, de modo que se produce una proteína que tiene un
modelo de glucosilación mono-antenal en una etapa
in vitro.
Por consiguiente, en una realización adicional,
se convierte cualquiera de las proteínas anteriores que tienen un
modelo de glucosilación de tipo híbrido a un modelo complejo
mediante reacciones con \alpha-1,2-;
\alpha-1,3-; y/o
\alpha-1,6-manosidasa.
Figura 1. La figura 1 es un diagrama que ilustra
la conversión de oligosacáridos ricos en manosa (estructuras de
glucosilo) en oligosacáridos híbridos tras la reacción con
estructuras ricas en manosa con
\alpha-1,2-manosidasa, GlcNAc Tr
I, \beta-1,4 galactosiltransferasa (mostrada como
GalTr), y \alpha-2,6 sialiltransferasa (mostrada
como NeuNAc T). La conversión de oligosacáridos ricos en manosa de
glucoproteína fúngica (estructura glucosiladas) en estructuras
híbridas se produce como resultado de esta serie ilustrada de
reacciones.
Figura 1A. La figura 1A es un diagrama que
ilustra la conversión de oligosacáridos híbridos (estructuras de
glucosilo) en oligosacáridos de tipo complejo tras la reacción de
estructuras híbridas con una \alpha-manosidasa
inespecífica (no específica).
Figura 2. La figura 2 muestra un mapa del
plásmido pCAGGS. Las principales divisiones son de longitudes de
1.000 pb, las subdivisiones son de longitudes de 200 bases. La
longitud es de aproximadamente 4.811 pb. Promotor híbrido de AG:
\beta-actina/\beta-globina;
SVORI: origen bidireccional de SV40; RBS: sitio de unión de
ribosoma del operón lac, poliA: señal poli A de la región
temprana (flecha en sentido horario) o región tardía (flecha en
sentido antihorario) de SV40; Ori: origen de
Eco-pMBI o replicación del plásmido; AMP: gen de
resistencia a ampicilina; CMV: potenciador de
CMV-IE; lac: promotor lac; rGBf (bases de plásmido
10 - 182): región sin traducir parcial del exón 3 y 3' y sitio poli
A del gen de \beta-globina de conejo; 3FR (bases
de plásmido 183 - 541): región flanqueante en 3' del gen de
\beta-globina de conejo.
Figura 3. La figura 3 muestra un mapa del
plásmido pscgal1mf3. Las principales divisiones son de longitudes de
500 pb, las subdivisiones son de longitudes de 100 bases. La
longitud es de aproximadamente 3.477 pb. AMP: gen de resistencia a
ampicilina; ORI: origen de replicación de plásmido
(Eco-pMB1) lac: promotor lac; RBS: sitio de unión de
ribosoma del operón lac, GAL1: promotor Gal1, PREMF:
secuencia prepro de factor 1 de apareamiento \alpha; lacZ: gen de
LacZ\alpha.
Figura 4. La figura 4 muestra un mapa del
plásmido pCAMFhGNTIF_{1}, que contiene un fragmento de gen humano
que codifica para la N-acetilglucosaminiltransferasa
I (hGlcNAc-Tr I). Las principales divisiones son de
longitudes de 1.000 pb, las subdivisiones son de longitudes de 200
bases. La longitud es de aproximadamente 6.223 pb. AMP: gen de
resistencia a ampicilina; ORI: origen replicación del plásmido
(Eco-pmbi); lac: promotor lac; RBS: sitio de unión
de ribosoma del operón lac; PREMF: secuencia prepro de factor 1 de
apareamiento \alpha; rGBf (bases de plásmido 1 - 170): región sin
traducir parcial del exón 3 y 3' y sitio poli A del gen de
\beta-globina de conejo; 3FR (bases de plásmido
171 - 530): región flanqueante en 3' del gen de
\beta-globina de conejo; SVORI: origen
bidireccional de replicación de SV40; poli A: señal de poli A de la
región temprana (flecha en sentido horario) o tardía (flecha en
sentido antihorario) de SV40; CMV: potenciador de
CMV-IE; Ac: promotor de
\beta-actina de pollo.
Las figuras 4A, 4B, 4C y 4D muestran la
construcción secuencial de pCAMFhGNTIf1. Todas las abreviaturas son
como anteriormente. La figura 4A esquematiza la inserción del
fragmento hGNTI en pUC18; la figura 4B esquematiza la extracción
del fragmento GAL1-PREMF de pSCGAL1MF3 y su
inserción en pUC18; la figura 4C esquematiza la construcción del
plásmido puc18 que contiene la secuencia hGNTI (sin su secuencia
señal) tras la secuencia señal de PREMF; y la figura 4D esquematiza
la construcción final de pCAMFhGNTIf1 mediante la inserción del
fragmento PREMF-hGNTI que se había tomado del vector
construido en la figura 4C en pCAGGS.
Figura 5. La figura 5 muestra un autorradiograma
que se obtuvo tras la exposición de una película de rayos X a
glucoproteínas radiomarcadas que se habían separado en una
electroforesis en gel SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE). Se añadieron los siguientes sustratos
de GlcNAc Tr I como se observa: banda 1, sin proteína de sustrato
añadida; banda 2, transferrina humana añadida como control
negativo; banda 3, invertasa de S. cerevisiae añadida como
control negativo; banda 4, ovoalbúmina añadida como control
positivo; banda 5, celulasas de Trichoderma; banda 6,
proteínas secretadas a partir del mutante RUTC 30 de T.
reesei.
Figura 6. La figura 6 muestra un autorradiograma
que se obtuvo tras la exposición de una película de rayos X a
estructuras de oligosacáridos radiomarcados que se habían separado
en una placa de cromatografía en capa fina (CCF). Se añadió lo
siguiente a la mezcla de reacción que contiene GlcNAc Tr I: banda I,
sin oligosacáridos añadidos a la reacción; bandas 2 y 3, se hicieron
reaccionar oligosacáridos ricos en manosa a partir de hidrazinolisis
de ribonucleasa B, Oxford Glycosystems, (banda 2), y, Man_{5}Gn a
partir de la orina de manosidosis, Sanbio, (banda 3), como
controles positivos; banda 4, oligosacáridos aislados de celulasas
de Trichoderma; banda 5, oligosacáridos aislados de proteínas
secretadas a partir del mutante RUTC 30 de T. reesei; banda
6, estructuras de glucosilo liberadas a partir de la invertasa de
S. cerevisiae como control negativo.
Figura 7. La figura 7 muestra un autorradiograma
que se obtuvo tras la exposición de una película de rayos X a
glucoproteínas radiomarcadas que se habían separado en
SDS-PAGE al 12,5%. Banda 1, se muestra la
incorporación de
2-desoxi-2-N-acetilamino-D-glucosa
radiactiva (GlcNAc) en CBH I; banda 2, se muestra un claro
desplazamiento electroforético de CBH I que fue la consecuencia de
la incorporación de ácido siálico radiactivo.
Figura 8. La figura 8 muestra la resolución
electroforética de oligosacáridos de ANTS preparada a partir de
glucoproteínas de T. reesei RUTC 30. Banda 1: el producto de
digestión de CBH I; banda 2: oligosacáridos de CBH I tratados con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi; banda 3: producto de digestión a partir de una mezcla de
proteínas secretadas por T. reesei; banda 4: análoga a la
banda 3, pero con un tratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa; banda 5:
producto de digestión de ribonucleasa B bovina; M: marcadores de
peso molecular (a: maltotetraosa; b: maltopentaosa; c: maltohexaosa;
d: matoheptaosa; e: maltoctaosa; f: maltononaosa).
Figura 9. La figura 9 muestra un autorradiograma
de un cromatograma en capa fina como anteriormente, que separa
oligosacáridos libres pretratados con
\alpha-1,2-manosidasa y tratados
posteriormente con GlcNAc Tr I y UDP-(^{14}C)GlcNAc
(uridina
difosfo-2-desoxi-2-N-acetilamino-D-^{14}C-glucosa).
A las mezclas de reacción de GlcNAc Tr I, se añadió lo siguiente:
banda 1, no se añadieron oligosacáridos; banda 2, se añadió
Man_{5}GlcNAc (Sanbio), un sustrato aceptor para GlcNAc Tr I,
como control positivo; bandas 3 y 4, respectivamente, oligosacáridos
de invertasa de S. cerevisiae sin pretratar o pretratados
con \alpha-1,2-manosidasa; bandas
5 y 6, respectivamente, oligosacáridos a partir de celulasas de
Trichoderma (Fluka, Buchs, Suiza) sin pretratar o pretratados
con \alpha-1,2-manosidasa; bandas
7 y 8, respectivamente, oligosacáridos a partir del mutante RUTC 30
de T. reesei sin pretratar y pretratados con
\alpha-1,2-manosidasa.
Figura 10. La figura 10 muestra un
autorradiograma de glucoproteínas de separación en
SDS-PAGE que se hicieron reaccionar con GlcNAc Tr I
y UDP-(^{14}C)GlcNAc, con o sin "pretratamiento" con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi. Bandas 1 y 2, respectivamente, sin sustrato aceptor de
proteína sin y con tratamiento de
\alpha-1,2-manosidasa; bandas 3 y
4, respectivamente, transferrina sin y con pretratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa; bandas 5 y
6, respectivamente, invertasa de S. cerevisiae sin y con
pretratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa; bandas 7 y
8, respectivamente, ovalbúmina sin y con pretratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa; bandas 9 y
10, respectivamente, celulasas de Trichoderma (Fluka, Buchs,
Suiza) sin y con pretratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa.
Figura 11. La figura 11 muestra un
autorradiograma de gel SDS-PAGE al 12,5% que
contiene diversas proteínas que se hicieron reaccionar con GlcNAc Tr
I y UDP-(^{14}C)GlcNAc. La banda 1 es
\alpha-amilasa de Aspergillus oryzae. La
banda 2 es \alpha-amilasa de Aspergillus
niger. La banda 3 es ovalbúmina (control positivo). La banda 4
es ausencia de proteína (control negativo). La banda 6 es
celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei RUTC 30 digerida
por papaína. La banda 7 es una galactosidasa aislada a partir de
Aspergillus oryzae. Los marcadores (M) son proteínas
marcadoras marcadas con [^{14}C] de "arco iris"
("rainbow") de Amersham, Buckinghamshire, RU.
Figura 12. La figura 12 muestra un
autorradiograma de un cromatograma en capa fina que demuestra la
formación de estructuras híbridas en el nivel de oligosacárido. La
banda 1 muestra *GlcNAc transferida a Man_{5}GlcNAc_{2} de
ribonucleasa B. La banda 2 muestra *Gal unido a *GlcNAc en
Man_{5}GlcNAc_{2} comercial. La banda 3 muestra *ácido siálico
transferido a *Gal unido a *GlcNAc en Man_{5}GlcNAc_{2}
comercial. Las bandas 4, 5 y 6 son análogas a las bandas 1, 2, y 3
respectivamente, pero los sustratos aceptores son
N-glucanos liberados a partir de proteínas
secretadas por Trichoderma reesei RUTC 30.
En la siguiente descripción, se hará referencia
a diversas metodologías conocidas por los expertos en las técnicas
de genética molecular, microbiología y biología general. Las
publicaciones y otros materiales que exponen tales metodologías a
los que se hace referencia se incorporan en el presente documento
mediante referencia en su totalidad como si se expusieran a
continuación al completo.
Principios generales de la biología de
glucoproteínas y del análisis estructural de glucoproteínas se
exponen, por ejemplo en Glycoprotein Analysis in Biomedicine,
editado por E. F. Hounsell, Humana Press, Totowa, New Jersey
(1993), y en Cell Surface and Extracellular Glycoproteins, Structure
and Function, editado por D. D. Roberts y R. P. Mecham, Academic
Press, Inc., San Diego, CA. (1993).
Principios generales de la bioquímica y biología
molecular de hongos filamentosos y Trichoderma se exponen,
por ejemplo, en Finkelstein, D.B. et al., eds., Biotechnology
of Filamentous Fungi: Technology and Products,
Butterworth-Heinemann, editores, Stoneham, Mass.
(1992), y Bennett, J. W. et al., More Gene Manipulations in
Fungi, Academic Press - Harcourt Brace Jovanovich, editores, San
Diego, CA. (1991).
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento
tienen el mismo significado tal como los comprende un experto en la
técnica a la que pertenece esta invención. En la descripción que
sigue, se utilizan mucho varios términos utilizados en tecnología de
glucoproteínas. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y
coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones,
incluyendo el alcance que ha de darse a tales términos, se
proporcionan las siguientes definiciones.
"Modelo de glucosilación" se refiere a una
estructura, número o situación característicos de estructuras de
oligosacárido asociadas con una macromolécula, tal como una
proteína, o habitual de un tipo celular específico o de una
especie.
"Modelo de glucosilación de tipo natural"
se refiere a una estructura, número o situación característicos
naturales de estructuras de oligosacárido que se asocian con una
macromolécula, tal como una proteína, o se encuentran en un tipo
celular específico o de una especie.
Oligosacáridos "unidos a O" son los
oligosacáridos que se unen a la estructura peptídica a través de
treonina o serina.
Oligosacáridos "unidos a N" son los
oligosacáridos que se unen a la estructura peptídica a través de
asparragina, mediante un enlace
asparragina-N-acetilglucosamino. Los
oligosacáridos unidos a N también se llaman
"N-glucanos". Todos los oligosacáridos unidos
a N tienen un núcleo pentasacárido común de Man_{3}GlcNAc_{2}
(Manosa_{3}GlucosaNace-
til_{2}) (la glucosa puede abreviarse como Glc y Gluc). Difieren en la presencia de, y en el número de ramificaciones (también llamadas antenas) de azúcares periféricos tales como fucosa y ácido siálico.
til_{2}) (la glucosa puede abreviarse como Glc y Gluc). Difieren en la presencia de, y en el número de ramificaciones (también llamadas antenas) de azúcares periféricos tales como fucosa y ácido siálico.
Los oligosacáridos unidos a N se clasifican
según sus constituyentes ramificados. Si el constituyente ramificado
sólo es manosa, el oligosacárido ha de ser
"N-glucano rico en manosa". Tal como se utiliza
en el presente documento oligosacárido o estructura de glucosilo de
"rica en manosa" o "de tipo rico en manosa" significa un
oligosacárido con residuos adicionales de
\alpha-manosa unidos a la estructura externa de
núcleo de Man_{3}GlcNAc_{2} y sin residuos de fucosa o ácido
siálico en los extremos libres de las ramificaciones de
oligosacárido.
Un oligosacárido o estructura de glucosilo
"compleja" o "de tipo complejo" significa la estructura de
un oligosacárido con, normalmente, de dos a seis ramificaciones
externas con una secuencia de sialil-lactosamina
unida a una estructura externa de núcleo de Man_{3}GlcNAc_{2}.
Un N-glucano complejo tiene al menos una
ramificación, y preferiblemente al menos dos, de residuos alternos
de GlcNAc y galactosa (Gal) que terminan en oligosacáridos tales
como, por ejemplo: NeuNAc-;
NeuAc\alpha2-6GalNAc\alpha1-;
NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-GalNAc\alpha1-;
NeuAc\alpha2-3/6Gal\beta1-4GlcNAc\alpha1-4Gal\beta1-
(sólo mucinas); Fuc\alpha1-2Gal\beta1- (grupo
sanguíneo H);
\newpage
Pueden haber ésteres de sulfato en residuos de
galactosa, GalNAc, y GlcNAc, y puede haber ésteres de fosfato en
residuos de manosa. El NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo)
puede O-acetilarse o reemplazarse por NeuGl (ácido
N-glucolilneuramínico). N-glucanos
complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias de
GlcNAc dividido en dos partes y fucosa de núcleo (Fuc).
Los "N-glucanos híbridos"
sólo tienen residuos de manosa en la ramificación de
Man\alpha1-6 del núcleo y una o más antenas
complejas en la ramificación de Man\alpha1-3.
Un "sustrato aceptor" es un oligosacárido,
cuya estructura específica la reconoce como sustrato una enzima, de
manera que una reacción con una enzima como tal añade ciertos
residuos de azúcar a dicho sustrato aceptor. Por ejemplo, el
oligosacárido Man_{5}GlcNAc_{2} es un sustrato aceptor para
GlcNAc Tr I, la primera glucosiltransferasa implicada en formación
de hidratos de carbono complejos.
Por un modelo de glucosilación de un
"precursor inmaduro" o estructura de N-glucano
se entiende una estructura rica en manosa. Según la invención,
pueden "madurarse" las estructuras "inmaduras" a una
estructura de tipo complejo o híbrida mediante el tratamiento con
enzimas que añaden las unidades apropiadas de los oligosacáridos de
tipo complejo o híbridos, con o sin la eliminación de residuos de
manosa según sea necesario.
Por "modificado secuencialmente" se
entiende que se modifica enzimáticamente una estructura de
oligosacárido (glucano) de manera ordenada, lo que supone dos o más
reacciones enzimáticas de manera que al menos una reacción precede
a la otra. A esto también se le denomina serie "en cascada" de
reacciones enzimáticas.
Por "hacer reaccionar una proteína con una
enzima" se entiende que se proporciona la proteína en una mezcla
de reacción que contiene todos los componentes requeridos para
catalizar la actividad inherente a la enzima para modificar tal
proteína.
La unión entre unidades de monosacárido en un
glucano puede ser a cualquiera de los grupos hidroxilo, bien con
una configuración anomérica \beta o bien \alpha. Cuando se
dibuja tal como se muestra a continuación (por ejemplo en el carbono
1 ("1" a continuación) de GlcNAc y ácido siálico), la
configuración \beta o \alpha se representa como una línea por
encima o por debajo del plano del anillo de monosacárido,
respectivamente.
La forma piranosa de
\beta-D-N-acetilglucosamina
(GlcNAc) es:
La estructura del ácido siálico es:
en la que
R=CH_{3}-CO-(ácido
N-acetilneuramínico)_{3} o
CHOH-CO-(N-ácido glicolilneuramínico); los grupos
hidroxilo pueden sustituirse con diferentes sustituyentes acilo y
aquellos en C8 y C9 con residuos adicionales de ácido
siálico.
Ciertas abreviaturas se utilizan en el presente
documento ya que son comunes en la técnica, tales como: "Ac"
para acetilo; "glc" para glucosa; "fuc" para fucosa;
"GlcNAc" para N-acetilglucosamina; "man"
para manosa; "PNGasa F" para
péptido-N-glucosidasa F (EC
3.2.2.18).
Tal como se utiliza en el presente documento,
"GlcNAc Tr I" significa
N-acetilglucosaminil-transferasa
I.
En glucoproteínas, los sitios potenciales de
N-glucosilación contienen la secuencia
asparragina-X-serina (o treonina),
en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. Las
proteínas pueden crearse para que contengan sitios artificiales de
N-glucosilación, o puede utilizarse el sitio
natural.
Los métodos de la invención se comprenderán
mejor mediante la referencia a la ruta de glucosilación tal como se
describe a continuación. Se cree que los acontecimientos tempranos
de la síntesis de N-glucano que se efectúa en el
retículo endoplásmico son idénticos en levaduras, plantas y
eucariotas superiores y hongos. Normalmente, la ruta de
N-glucosilación de proteínas en células eucariotas
sigue este modelo. En primer lugar, un oligosacárido precursor
unido a lípido (I):
se transfiere desde el lípido y se
le une una Asn en la proteína seleccionada como diana a través de la
acción de una oligosacariltransferasa para formar
(II):
Esto también se abrevia:
Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2}-proteína. Entonces la
enzima \alpha-1,2 glucosidasa I elimina el residuo
terminal de glucosa, y la \alpha-1,3 glucosidasa
II elimina el segundo y el tercer residuos de glucosa para dejar
(III):
Esto es un ejemplo de una glucosilación "rica
en manosa". Esto también se abrevia:
Man_{9}GlcNAc_{2}-proteína.
La etapa final en el retículo endoplásmico
rugoso es la eliminación de un residuo de manosa. Las etapas
restantes se llevan a cabo en el retículo endoplásmico (RE) y el
aparato de Golgi. Hasta este punto, la ruta de glucosilación tanto
de las levaduras como de las células de mamífero es la misma. Sin
embargo, las etapas en la Golgi-cis difieren entre
las levaduras y los eucariotas superiores. La levadura añade manosas
mediante la acción de manosiltransferasas, cuyo resultado es una
glucosilación del tipo rica en manosa en el producto glucosilado.
Sin embargo, los eucariotas superiores eliminan tres manosas
adicionales, con \alpha-manosidasa I; en algunos
casos, este corte también tiene lugar en el RE. El resultado es el
producto (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ésta también es una estructura "rica en
manosa" y se abrevia:
Man_{5}GlcNAc_{2}-proteína. El
azúcar-nucleótido de alta energía,
UDP-GlcNAc, sirve como un sustrato para GlcNAc Tr I
para transferir un resto de GlcNAc a (IV) para producir (V):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta es una estructura de tipo híbrido y se
abrevia: GlcNacMan_{5}GlcNAc_{2}-proteína. La
\alpha-manosidasa II reconoce este sustrato y
elimina los residuos de manosa adicionales para dar como resultado
la estructura de "tipo híbrido" (VI):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esto se abrevia:
GlcNacMan_{3}GlcNAc_{2}-proteína. Ésta puede
servir como un sustrato para cualquiera de
UDP-GlcNAc, UDP-Gal o CMP-ácido
siálico (SA) y GlcNAc-transferasa II,
galactosiltransferasa o sialiltransferasa, respectivamente, para
producir un modelo de glucosilación de "tipo complejo", por
ejemplo tal como se muestra a continuación (VII):
Las enzimas de modificación de la glucosilación
que son útiles en los métodos de la invención incluyen transferasas
y manosidasas. Los residuos de manosa que están unidos mediante un
enlace \alpha1,2 son aquellos residuos de manosa que pueden
eliminarse in vivo o in vitro mediante una \alpha1,2
manosidasa "específica", tal como la de Aspergillus
saitoi. La GlcNAc Tr I es muy específica y sólo transfiere
GlcNAc a la manosa menos periférica unida por \alpha1,3 de una
estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} (un sustrato apropiado se
muestra como la estructura IV, anteriormente). Tras la
transferencia de GlcNAc, galactosa y ácido siálico a
Man_{5}GlcNAc_{2}, pueden eliminarse los residuos de manosa
unidos por \alpha1,3 y \alpha1,6 restantes in vivo o
in vitro utilizando una manosidasa "inespecífica" tal
como, por ejemplo, la manosidasa de la judía de caballo,
convirtiendo así una estructura híbrida en una compleja.
Las transferasas tales como la GlcNAcTr I,
galactosiltransferasa y sialiltransferasa dadas como ejemplo en el
presente documento, catalizan la transferencia de un monosacárido
desde donante de azúcar de alta energía a un oligosacárido aceptor.
La reacción generalizada es: azúcar-nucleótido +
aceptor \rightarrow azúcar aceptor + nucleótido.
Para seguir la reacción in vitro, puede
proporcionarse un azúcar-nucleótido en una forma que
marcará al aceptor. Por ejemplo, la actividad específica de los
azúcar-nucleótidos radiomarcados comerciales es
suficientemente alta como para permitir la detección de fmoles de
un sustrato aceptor en un ensayo radiomarcado.
Ni las glucosiltransferasas ni los sustratos de
azúcar-nucleótido son permeables para las membranas
celulares. Esto permite la alteración extracelular de la
glucosilación de la superficie celular en células intactas o
preparaciones de membrana sellada, utilizando el método de la
invención en aquellas realizaciones en las que la reacción de
GlcNAc Tr I no se da dentro de la célula huésped.
La GlcNAcTr I (EC 2.4.1.101) es la transferasa
del Golgi medial que inicia la formación de hidratos de carbono
complejos unidos a N. Esta enzima también se conoce como
UDP-N-acetilglucosamina:
\alpha-3-D-manósido-\beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa
I. Se ha clonado el gen humano que codifica para esta enzima y se
ha publicado su secuencia codificante (Kumar, R. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:9948-9952 (1990).
Otras fuentes de GlcNAc Tr I incluyen al conejo (Sarkar, M. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:234-238
(1991) y al ratón (Kumar, R. et al., Glycobiology
2:383-393 (1992)).
Otras enzimas útiles en la construcción del
oligosacárido híbrido, tal como se muestra en la figura 1, también
están disponibles y se han clonado. Por ejemplo, una lista no
limitante incluye \beta(1,4)galactosiltransferasa
bovina (D'Agostaro, G. et al., Eur. J. Biochem.
183:211-217 (1989),
\beta(1,4)galactosiltransferasa humana (Masri, K.
A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657 (1988),
\alpha(2,6)sialiltransferasa de rata (Wang, X. C.
et al., Glycobiology 1:25-31 (1990), y
\alpha1,2 manosidasas de conejo (Lal, A. et al., J. Biol.
Chem. 269:9872-9881 (1994)) o con
\alpha1-2 manosidasas de ratón (Herscovics, A.
et al., J. Biol. Chem. 269:9864-9871
(1994)).
Para clonar una secuencia notificada, pueden
diseñarse cebadores basándose en la secuencia notificada. Por
ejemplo, pueden utilizarse cebadores tales como los de la SEQ ID NO:
1 y la SEQ ID NO: 2 para amplificar la secuencia codificante para
la GlcNAc Tr I humana, por ejemplo, utilizando técnicas de PCR, de
modo que se inserta dicha secuencia codificante en cualquier vector
de elección, y preferiblemente un vector de expresión que pueda
expresar tal secuencia codificante en un huésped deseado.
La enzima GlcNAc Tr I no está glucosilada.
Kumar, R. et al., Glycobiology 2:383-393
(1992) han expresado la GlcNAc Tr I de ratón. Es posible y útil
expresar la GlcNAc Tr I de ratón y humana intracelularmente en
bacterias, pero puede formar agregados de proteína. Por esta razón,
la producción intracelular en bacterias no es el método preferido
para la producción de GlcNAc Tr I. La enzima puede producirse en
células de mamífero tales como células COS, puede secretarse hacia
el medio, y utilizarse directamente en ese medio si se desea; debe
observarse que el uso de la enzima en el medio de crecimiento
utilizado es simplemente por conveniencia; el entorno del medio de
crecimiento celular no es necesario per se para la actividad
de la GlcNAc Tr I ya que la enzima producida en la bacteria era
activa. También se conocen los métodos de aislamiento para la enzima
a partir de hígado de conejo (Nishikawa, Y. et al., J. Biol.
Chem. 263:8270-8281 (1988)).
En los métodos de la invención, las reacciones
de GlcNAcTr I preferiblemente se llevan a cabo a 37ºC. Una unidad es
la actividad enzimática que cataliza la transferencia de 1 \mumol
de GlcNAc desde UDP-GlcNAc hasta Man_{5}GlcNAc en
un minuto a 37ºC y pH 6,1. Como se muestra en los ejemplos, se
utilizaron 330 \mumol de sustrato aceptor y 340 \mumol de
UDP-GlcNAc con 10-15 \mul de un
sobrenadante de COS concentrado en diez veces (que contiene
aproximadamente 30 microunidades de GlcNAc Tr I) en una mezcla de
reacción con un volumen final de 30 \mul. Una unidad de actividad
enzimática convierte 1 \mumol de sustrato en un minuto. Los
tiempos de reacción variarán dependiendo de la concentración y la
actividad específica de la enzima, pero generalmente de
5-10 horas, y como se muestra en los ejemplos, de
1-4 horas, son suficientes para los fines de los
métodos de la invención. La reacción de GlcNAc Tr I puede llevarse a
cabo durante más tiempo según se aumenta la escala de la reacción
(Ichikawa et al., Anal. Biochem. 202:215-238
(1992)).
No es necesario que las enzimas sean puras para
ser útiles, tal como se muestra en los ejemplos utilizando el medio
de células COS como una fuente de GlcNAc Tr I. Sin embargo, puede
lograrse un aislamiento a gran escala de glucosiltransferasas
utilizando adsorbentes de afinidad por nucleótidos, tal como se
conoce en la técnica. Puede modificarse la glucosiltransferasa
mediante la adición de una etiqueta de afinidad (tal como una
etiqueta de estreptavidina o una cola de histidina) con el fin de
potenciar la purificación y reducir los costes de purificación.
La \beta-1,4
galactosiltransferasa, EC 2.4.1.38, tal como la de la leche humana
que se muestra en los ejemplos del presente documento, está
comercialmente disponible de Boehringer Mannheim (Nº de catálogo
1088-696), y Sigma Chemical Co., St. Louis,
Missouri. Su purificación a partir de leche bovina la notificó
Barker, R. et al., J. Biol. Chem. 247:7135 (1972). En la
presencia de \alpha-lactoalbúmina, EC 2.4.1.38 se
convierte en EC 2.4.1.22, lactosa sintetasa (también conocida como
lactosa sintasa y UDP-D-galactosa:
D-glucosa
4\beta-galactosiltransferasa), y acepta glucosa
como un sustrato para la transferencia de galactosa para producir
lactosa (Yoon et al., Glycobiology 2:161-168
(1992)). Esta enzima está comercialmente disponible de Sigma y
Oxford Glycosystems. También es fácil purificar (Barker, R. et
al., J. Biol. Chem. 247:7135 (1972)). Puede utilizarse la
galactosiltransferasa bovina de la misma manera y en las mismas
condiciones de reacción que las de la humana. La
\beta-1,4 galactosiltransferasa clonada se ha
expresado en diversos sistemas (véase, Masibay, A. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5733-5737 (1989),
Aoki, D. et al., EMBO J. 9:3171 (1990) y Krezdorn, C. et
al., Eur. J. Biochem. 212:113-120 (1993)).
Las condiciones de reacción enzimática de
\beta-1,4 galactosiltransferasa, EC 2.4.1.38 se
conocen en la técnica (Parchment, R. E. et al., Anal.
Biochem. 154:460-469 (1986); Nunez, H. y Barker, R.,
Biochemistry 19:489-495 (1980)). La enzima requiere
un pH de 8-8,5 y manganeso 1-50 mM,
preferiblemente 20 mM, para una actividad enzimática óptima.
Preferiblemente, las reacciones se llevan a cabo a 37ºC, con
aproximadamente 65 mU de enzima y 5 \mumol de
UDP-galactosa por ml. Una unidad de actividad
enzimática es la actividad enzimática que cataliza la transferencia
de 1 \mumol de galactosa desde UDP-galactosa hasta
glucosa en la presencia de \alpha-lactoalbúmina,
en 1 minuto a 37ºC y pH 8,4. Sin embargo, para una
galactosiltransferasa comercialmente disponible (5,5 unidades por
mg), en ausencia de \alpha-lactoalbúmina y con
GlcNAc como sustrato, puede reducirse la actividad enzimática, por
ejemplo, a aproximadamente 3,5 U/mg. Los tiempos de reacción
variarán dependiendo de la concentración y actividad específica de
la enzima, pero generalmente de 6-10 horas para
pequeña escala, y, como se muestra en los ejemplos, 8 horas, son
suficientes para los fines
de los métodos de la invención. Pueden ser necesarios tiempos más largos según se aumenta la escala de la reacción.
de los métodos de la invención. Pueden ser necesarios tiempos más largos según se aumenta la escala de la reacción.
La \alpha-2,6
sialiltransferasa, EC 2.4.99.1, tal como la del hígado de rata que
se muestra en los ejemplos del presente documento, está
comercialmente disponible de Boehringer Mannheim (Nº de catálogo
981-583), y Genzyme, Calbiochem y Sigma. Su
purificación la notificó Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem.
257:13.835-13.844 (1982). La enzima también se
conoce como
CMP-acetilneuraminita:\beta-D-galactosil-1,4-N-acetil-\beta-D-glucosamina
\alpha-2,6-N-acetilneuraminiltransferasa.
La K_{m} para el donante de azúcar CMP-NeuAc es
8,5 x 10^{-5} M. La secuencia del aceptor es Gal\beta1,
4GlcNAcR. Se conocen los métodos de purificación para
sialiltransferasas que participan en la síntesis de
N-glucosilo (Weinstein, J. et al., J. Biol.
Chem. 262:17735-17743 (1987)). Se ha notificado la
producción recombinante de sialiltransferasas en células CHO y COS
de mamífero (Schachter, H. et al., en "Molecular
Glycobiology," Fukuda, M. et al., eds., IRL Press, págs.
88-162 (1994). La clonación de la
\alpha-2,6 sialiltransferasa humana se notificó en
Grundmann, U. et al., Nucleic Acids Res. 18:667 (1990).
Una unidad de \alpha-2,6
sialiltransferasa transferirá 1 \mumol de ácido
N-acetilneuramínico desde el ácido
CMP-N-acetilneuramínico a
asialo-\alpha_{1}-glucoproteína
en 1 minuto a 37ºC (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem.
257:13835-13844 (1982)). La enzima requiere un pH de
6-6,5 para una actividad óptima, y generalmente se
añade 50 mM de NaCl al ensayo para estabilizar la actividad
enzimática. Preferiblemente las reacciones se llevan a cabo a 37ºC,
con aproximadamente de 4-40 mU de enzima,
0,5-5 \mumol de CMP-NANA por ml
(se utilizaron 100-800 \mug de proteína aceptora
por ml en la realizaciones mostradas como ejemplo), y
preferiblemente 3,6 \mumol. Los tiempos de reacción variarán
dependiendo de la concentración y actividad específica de la
enzima, pero generalmente de 6-10 horas para
síntesis a pequeña escala, y tiempos más largos para la aplicación a
gran escala, son suficientes para los fines de los métodos de la
invención.
La \alpha-1,2 manosidasa (EC
3.2.1.24), tal como la del Aspergillus saitoi que se muestra
en los ejemplos del presente documento, está comercialmente
disponible de Oxford Glycosystems, Oxford, RU. Una unidad de enzima
es la cantidad de enzima que liberará un \mumol de manosa a partir
del manano de la levadura de panadería por minuto a pH 5,0 y 37ºC.
En las realizaciones mostradas como ejemplo, se utilizaron 6 \mu
unidades de enzima para tratar hasta 500 \mug de proteína en un
volumen final de 30 \mul, y se utilizaron 2 \mu unidades de
enzima para tratar aproximadamente 5 \mug de oligosacáridos de
ribonucleasa B bovina (Oxford GlycoSystems, Nº de cat.
RP-2500) en 10 \mul de volumen final.
Preferiblemente el pH es de aproximadamente 5,0 para la actividad
óptima de la enzima de A. saitoi. Preferiblemente las
reacciones se llevaron a cabo a 37ºC.
Los métodos para la detección de los productos
de estas reacciones son bien conocidos y se muestran en los ejemplos
del presente documento.
Según la invención, puede efectuarse la
modificación de glucoproteínas in vitro mediante enzimas
modificadoras de hidratos de carbono descritas anteriormente que
pueden sintetizar o modificar las estructuras de glucosilación. Las
glucoproteínas sintetizadas por levaduras, hongos filamentosos y
células de insectos, pueden ser estructural y funcionalmente
distintas a las estructuras de hidrato de carbono de tipo mamífero a
la hora de tener un carácter de tipo híbrido o rico en manosa. Sin
embargo, tal como se realiza en esta invención, estas estructuras
de oligosacárido rico en manosa pueden convertirse enzimáticamente
en una estructura compleja o híbrida, haciendo que la estructura de
hidrato de carbono de la proteína producida en levadura, hongo o
insecto sea más similar a, o idéntica a, la estructura de hidrato de
carbono producida en mamífero.
Sorprendentemente se ha descubierto que los
hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Trichoderma, al
contrario que las levaduras, sintetizan glucoproteínas en una forma
que es reconocible como un sustrato aceptor para la enzima
N-acetilglucosaminil transferasa I (GlcNAc Tr I),
especialmente GlcNAc Tr I humana. Esta forma es una forma
"inmadura" de mamífero.
Sin embargo, la GlcNAc Tr I no está presente de
forma natural en estos huéspedes. Según la invención, el hallazgo
anterior se explota de tal manera que el modelo de glucosilación de
una glucoproteína deseada, por ejemplo, una proteína recombinante
que se produjo en Trichoderma, que tiene una estructura que
sirve como sustrato aceptor para GlcNAc Tr I, por ejemplo, la
fórmula (IV) anterior, se modifica mediante una cascada de
reacciones secuenciales, por ejemplo tres reacciones secuenciales
con las siguientes enzimas: en primer lugar, GlcNAc Tr I; en
segundo lugar, \beta-1,4 galactosiltransferasa; y
en tercer lugar, \alpha-2,6 sialiltransferasa. El
resultado de esta cascada es la producción de una glucoproteína que
tiene al menos un modelo de glucosilación híbrido, y, cuando se
modifican todas las ramificaciones terminales, un modelo de
glucosilación de tipo complejo. Preferiblemente, tales
ramificaciones terminan con unidades de ácido siálico terminal,
similar a las de las células de mamífero, aunque, según se desee
pueden utilizarse otras unidades terminales, tal como las descritas
anteriormente.
Tal como se describe a continuación, puede
prepararse un huésped recombinante de manera que la primera
reacción, la de la GlcNAc Tr I, se lleve a cabo in vivo, en
el huésped, antes de la secreción de la proteína.
Sorprendentemente también se ha hallado que el
tratamiento de glucoproteínas que se han sintetizado por levaduras
y Trichoderma, con
\alpha-1,2-manosidasa, de manera
que se cortan (eliminan) los residuos de manosa de tal
glucoproteína, proporciona (en el caso de la levadura) o potencia
(en el caso de Trichoderma), sitios de sustrato aceptor para
la acción enzimática de GlNAc Tr I. Según los métodos de la
invención, puede utilizarse una manosidasa para pretratar el
sustrato aceptor antes de la reacción con GlcNAc Tr I, para crear, o
si no potenciar la disponibilidad de sitios seleccionados como diana
para la acción de GlcNAc Tr I sobre ese sustrato.
Por tanto, en una primera realización, se
utiliza la actividad de GlcNAc Tr I para convertir un sustrato
aceptor de un tipo rico en manosa en un tipo híbrido. Entonces el
tipo híbrido puede convertirse en un tipo híbrido diferente, o, en
un tipo complejo. En una realización muy preferida, la fuente del
sustrato aceptor para GlcNAc Tr I es una glucoproteína que se ha
producido en un hongo filamentoso, y especialmente en
Trichoderma, y lo más especialmente en T. reesei.
No es necesario extraer de la mezcla el producto
de cada reacción antes de empezar la reacción posterior. Las
condiciones de pH y ensayo (tales como la adición de cationes
divalentes) pueden ajustarse simplemente en el mismo recipiente
para cada reacción posterior de manera que se minimiza la
manipulación. Adicionalmente, puede utilizarse la tecnología de
estado sólido para proporcionar las enzimas sobre un soporte sólido
y simplemente hacer pasar el sustrato aceptor a través de tal
soporte o puede utilizarse el soporte sólido en forma
discontinua.
La fuente de glucoproteínas del sustrato aceptor
puede ser producto de glucoproteína nativa o recombinante de
cualquier huésped que proporciona tal glucoproteína en forma
utilizable. Especialmente, la glucoproteína es un producto nativo o
recombinante de hongos filamentosos, por ejemplo un miembro de los
géneros Absidia, Acremonium, Alternaria, Aspergillus,
Aureobasidium, Beauveria, Ceratocystis, Chaetomium, Cladosporium,
Collectotrichum, Fusarium, Gliocladium, Mortierella, Mucor,
Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phytophthora, Pythium,
Rhizopus, Trichoderma, y Verticillium. Lo más
especialmente, es que el huésped sea un miembro de los géneros
Aspergillus o Trichoderma.
Las especies de Trichoderma útiles como
huéspedes para la producción de aceptores sustrato de GlcNAc Tr I
incluyen T. reesei, tal como QM6a, ALKO2442 o CBS383.78
(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273,
3740 AG Baarn, Países Bajos, o, ATCC13631 (Colección americana de
cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 10852,
EE.UU., tipo); T. viridae (tal como CBS189.79 (det. W. Gams);
T. longibrachiatum, tal como CBS816.68 (tipo); T.
pseudokoningii (tal como MUCL19358; Mycothéque de l'Université
Catholique de Louvain; T. saturnisporum CBS330.70 (tipo);
T. harzianum CBS316.31 (det. W. Gams); T. virgatum
(T. pseudokoningii) ATCC24961. Lo más preferiblemente es que
el huésped sea T. reesei y especialmente las cepas de T.
reesei QM9414 (ATCC 26921),
RUT-C-30 (ATCC 56765), y mutantes
altamente productivos como
VTT-D-79125, que se deriva de QM9414
(Nevalainen, Technical Research Centre of Finland Publications 26,
(1985), Espoo, Finlandia). La transformación de Trichoderma
puede llevarse a cabo por cualquier técnica conocida en la técnica,
incluyendo la técnica que se enseña en la solicitud de patente
europea EP 244.234.
Especies preferidas de Aspergillus que
son huéspedes útiles en los métodos de la invención incluyen A.
nidulans, A. awamore y A niger. Se conocen los métodos
para la transformación de Aspergillus.
Tal como se describe a continuación, cuando se
pretratan in vitro con \alpha1,2 manosidasa, son huéspedes
útiles levaduras tales como Pichia spp. (especialmente
Pichia pastoris), Hansenula spp. (especialmente
Hansenula polymorpha), Kluyveromyces lactis, Yarrowia
lipolytica, o S. cerevisiae para expresar el gen de
interés. Las levaduras serían útiles como huésped para expresar la
enzima GlcNAc TrI clonada ya que no está glucosilada.
En una realización, el sustrato aceptor de
glucoproteína se secreta hacia el medio de crecimiento del huésped
de producción y se modifica in vitro mediante la acción de
enzimas tales como GlcNAc Tr I sin eliminarse de ese medio. Si se
desea, puede concentrarse el medio antes de la modificación
enzimática del producto génico de interés. Alternativamente, puede
proporcionarse el sustrato aceptor de glucoproteína a la GlcNAc Tr I
en forma purificada o aislada.
En una realización preferida de la invención, se
transforma la secuencia codificante para GlcNAc Tr I en una célula
huésped deseada de la que también se desea sintetizar la proteína de
interés, especialmente, una célula huésped que no cataliza de manera
natural las modificaciones enzimáticas según los métodos de la
invención.
En esta realización, la primera etapa en la
modificación del modelo de glucosilación, la reacción catalizada por
GlcNAc Tr I se efectúa in vivo. Entonces la célula huésped
sintetiza, y preferiblemente secreta, un sustrato aceptor de tipo
híbrido. Entonces, el tipo híbrido se convierte en un tipo híbrido
que contiene ácidos siálicos terminales mediante la segunda y la
tercera etapa de la cascada in vitro, es decir, la adición de
residuos de galactosa con \beta-1,4
galactosiltransferasa, seguido de la adición de residuos de ácido
siálico con
\alpha-2,6-sialiltransferasa.
Preferiblemente, el huésped recombinante que se
transforma con ambas secuencias codificantes para GlcNAc Tr I y, si
se desea, con la secuencia codificante para una proteína de interés
(cuyo modelo de glucosilación ha de modificarse in vivo
mediante la acción de la GlcNAc Tr I expresada). Más
preferiblemente, el huésped recombinantes es un miembro de los
géneros Aspergillus o Trichoderma tal como se
describió anteriormente.
El huésped recombinante también puede
transformarse con ADN que comprende el gen de
\alpha-1,2-manosidasa. En las
realizaciones de esta invención, puede transformarse el huésped
recombinante con el gen de la
\alpha-1,2-manosidasa junto con
las secuencias codificantes para GlcNAc Tr I y, si se desea, la
secuencia codificante para una proteína de interés. En otras
realizaciones de esta invención, se transforma el huésped
recombinante con el gen de
\alpha-1,2-manosidasa solo, o, si
se desea, la secuencia codificante para la proteína de interés.
Se sabe que los sistemas de vector son útiles en
la transformación de huéspedes, especialmente los huéspedes de
Aspergillus o Trichoderma descritos anteriormente para
la producción de GlcNAc Tr I y las glucoproteínas de la invención.
Puede utilizarse un vector separado para proporcionar el marcador
seleccionable.
La expresión de genes en un huésped requiere el
uso de regiones reguladoras funcionales en tales huéspedes. Pueden
emplearse una gran variedad de secuencias reguladores de
transcripción y traducción; generalmente los hongos filamentosos
tales como Trichoderma reconocen los controles de
transcripción del huésped eucariota, tales como, por ejemplo, los de
otros hongos filamentosos, y especialmente, Aspergillus.
En una realización preferida, se construyen
transformantes genéticamente estables de Trichoderma mediante
los cuales se integra ADN que codifica para una glucoproteína
deseada o una enzima que modifica hidratos de carbono como GlcNAc
Tr I dentro del cromosoma huésped de Trichoderma. La
secuencia codificante para la glucoproteína o enzima deseadas puede
ser de cualquier fuente. Tal integración puede darse de novo dentro
de la célula o, en una realización más preferida, puede asistirse
mediante la transformación con un vector que se inserta
funcionalmente él mismo dentro del cromosoma del huésped, por
ejemplo, elementos de ADN que promueven la integración de
secuencias de ADN en los cromosomas.
Tras la introducción del vector, se cultivan
células receptoras en un medio selectivo, que selecciona para el
crecimiento de células transformadas. La expresión de la(s)
secuencia(s) génica(s) clonada(s) da como
resultado la producción de la glucoproteína y/o la enzima
modificadora de hidratos de carbono deseada, o la producción de
fragmentos deseados de las mismas. Esta expresión puede tener lugar
de manera continua en las células transformadas, o de manera
controlada, por ejemplo, en la que la expresión es el resultado de
un promotor regulado.
En una realización preferida, se secreta una
enzima modificadora de hidratos de carbono o una glucoproteína
deseadas hacia el medio de alrededor debido a la presencia de una
secuencia señal de secreción funcional, preferiblemente una señal
homóloga a la del huésped. Si un gen deseado no codifica para una
secuencia señal, o si su secuencia señal no funciona bien en el
huésped, entonces puede unirse operativamente la secuencia que
codifica para la glucoproteína a otra secuencia señal, bien homóloga
o heteróloga para el huésped, que funcione en tal huésped. La
secuencia codificante deseada puede unirse a cualquier secuencia
señal lo que permitirá la secreción de la glucoproteína desde el
huésped seleccionado, por ejemplo, para la secreción desde
Trichoderma, puede utilizarse la secuencia señal de las
enzimas celulasas de Trichoderma, por ejemplo, puede
utilizarse la señal de secreción de la proteína celobiohidrolasa I
(CBHI), celobiohidrolasa II (CBHII), endoglucanasa I (EGI) o
endoglucanasa II (EGII). También son útiles las señales de secreción
de la xilanasas de Trichoderma. Pueden diseñarse tales
secuencias señal con o sin sitios específicos de proteasa de manera
que la secuencia de péptido señal puede eliminarse
posteriormente.
En las realizaciones en las que se proporciona
GlcNAc Tr I intracelularmente dentro de la célula huésped fúngica de
manera que actúe intracelularmente sobre un sustrato, no es
necesario, y no es preferible, secretar GlcNAc Tr I producida por
recombinación hacia el medio, ya que es necesario que permanezca en
la célula huésped para que sea activa in vivo en esas
realizaciones.
Trichoderma es un huésped especialmente
útil y práctico para la síntesis de glucoproteínas de la invención
porque Trichoderma puede secretar proteína en grandes
cantidades, por ejemplo, se han notificado medios de cultivo de
concentraciones tan altas como 40 g/l; los promotores homólogos de
celulasa y hemicelulasa tales como los promotores de
Trichoderma cbh1, cbh2, egl1 y egl1
proporcionan promotores muy convenientes para la expresión alta de
genes de interés ya que son promotores fuertes. Por ejemplo, el
promotor cbh1 es un promotor de copia única que normalmente
dirige la síntesis de hasta el 60% de la proteína secretada desde el
huésped Trichoderma. Alternativamente, puede insertarse el
gen de interés, o el gen de GlcNAc Tr I, en el locus CBHI. El
sistema de transformación de Trichoderma es muy versátil y
puede adaptarse para cualquier gen de interés. El cultivo de
Trichoderma se apoya en la extensa experiencia previa en
técnicas de fermentación a escala industrial, por ejemplo, véase
Finkelstein, D. B. et al., eds., Biotechnology of Filamentous
Fungi: Technology and Products,
Butterworth-Heinemann, editores, Stoneham, Mass.
(1992).
Los métodos de la invención son útiles con
cualquier proteína de interés deseada que contenga modelos de
glucosilación del tipo rica en manosa. Se considera que tales
modelos son "inmaduros" cuando se comparan con modelos
complejos o híbridos.
Especialmente, una proteína de interés puede ser
una proteína, tal como una inmunoglobulina u hormona, que ha de
proporcionarse a un paciente que necesite la misma, especialmente
por razones terapéuticas. Ejemplos de glucohormonas en los que la
glucosilación desempeña un papel en las propiedades de tal hormona,
especialmente en las propiedades terapéuticas, se incluye
eritropoyetina (EPO), coriogonadotropina humana (HCG), folitropina
(FSH), tirotropina (TSH) y lutropina (LH). Puede llevarse a cabo la
modificación de cada subunidad peptídica según los métodos de la
invención. Ejemplos de otras proteínas de interés cuya biosíntesis,
transporte o función se altera mediante
N-glucosilación incluyen NCAM (moléculas de adhesión
neuronal), tenascina, trombospondina, fibronectina, hormonas,
citocinas, (especialmente interleucina-4 e
interferón gamma), factores de crecimiento, proteínas plasmáticas,
factores de coagulación, receptores solubles, inmunoglobulinas
(anticuerpos), factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
factor de crecimiento endotelial vascular, glucoproteína gp120 del
virus VIH, proteínas de la cubierta vírica, inmunoglobulina D,
antitrombina III\beta, plasminógeno, factor de von Willebrand,
fibrinógeno, globulina que se une a corticosteroides, globulina que
se une a tiroxina, proteína que se une a folato, fibronectina,
osteonectina ósea y plaquetaria, receptor de EGF, receptores de
insulina y de factor de crecimiento similar a insulina I, receptor
del factor de crecimiento de fibroblastos básico, linfocitos CD2,
moléculas de CMH de clase II, transportadores de glucosa, proteína
eritrocitaria de banda 3, receptores \beta-2
adrenérgicos, receptor de transferrina, receptor de VIP (péptido
intestinal vasoactivo), proteína de membrana de CMH de clase I,
receptor de vasopresina de células LLC-PK1, receptor
de lipoproteína de baja densidad, receptor de asialoglucoproteína,
proteína CD4, receptor de tirotropina, receptor de PDGF,
concanavalina A de judía de caballo, factor de veneno de cobra,
lactotransferrina, factor de apareamiento de cloroplasto de la
espinaca, mucina de la glándula submaxilar,
lactasa-florizina hidrolasa del borde en cepillo
intestinal, glucoproteína anticongelante del pez del ártico,
receptor de LDL, glucoforina A, y \beta-HCG, y,
generalmente, proteínas animales secretadas y glucoproteínas de
plantas secretadas por células de sicomoro en cultivo.
Especialmente, las proteínas que requieren la selección como diana
de órganos o células específicas a través del reconocimiento
azúcar-lectina son útiles como sustratos de proteína
para la modificación de modelos de glucosilación según la
invención.
El método de la invención es especialmente útil
en el diseño de una proteína para uso en terapia genética; en una
terapia como tal, una proteína, tal como una enzima, que es
deficiente en una célula u órgano, está seleccionando como diana a
tal célula u órgano proporcionando tal proteína con un modelo de
glucosilación apropiado.
Según esta invención, se proporciona un método
para producir altos niveles de glucoproteínas que son deseables
para el uso, por ejemplo, en composiciones farmacéuticas. Tales
glucoproteínas pueden obtenerse directamente a partir de los
huéspedes de la invención o del medio de cultivo. Además, si
actividades deseadas están presentes en más de un huésped
recombinante (tales como proteínas de subunidad múltiple), tales
preparaciones pueden aislarse a partir de huéspedes apropiados y
combinarse antes del uso en el método de la invención;
alternativamente puede utilizarse un huésped para obtener todas las
subunidades de la proteína deseada.
Para obtener las preparaciones de glucoproteína
de esta invención, se cultivan los huéspedes recombinantes descritos
anteriormente que tienen las propiedades deseadas (es decir,
huéspedes que pueden expresar las glucoproteínas) en condiciones
adecuadas, se secretan las glucoproteínas modificadas a partir de
los huéspedes de Trichoderma hacia el medio de cultivo, y se
recuperan las glucoproteínas a partir del medio de cultivo mediante
métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, pero de manera
menos deseable, pueden recuperarse las glucoproteínas a partir de
las mismas células huésped.
Se recupera la glucoproteína a partir del medio
de cultivo o de las mismas células huésped utilizando métodos
habituales que se conocen bien en la técnica. Puede liofilizarse la
glucoproteína de la invención o si no puede concentrarse y/o
estabilizarse la glucoproteína para el almacenamiento. Las
glucoproteínas de la invención son muy fáciles de proporcionar y
utilizar. Si se secretan las glucoproteínas hacia el medio de
cultivo, sólo se necesita recuperar el medio de cultivo para obtener
la glucoproteína deseada, no se necesita extraer una glucoproteína
a partir de los huéspedes de Trichoderma a no ser que se
desee hacer así.
Si se desea, puede purificarse adicionalmente
una glucoproteína expresada según las condiciones convencionales,
tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía
de afinidad, electroforesis, o similar.
Los métodos de la invención proporcionan la
obtención de grupos glucosilo complejos o híbridos en glucoproteínas
recombinantes para su uso como agentes farmacéuticos de una manera
más segura y rentable que de la que se dispone actualmente. Los
métodos de la invención proporcionan un beneficio importante porque
dan como resultado la síntesis de estructuras de glucosilo uniformes
y bien definidas. La producción de una única glucoforma puede ser
crítica si se desea obtener perfiles farmacocinéticos terapéuticos
uniformes.
Como entendería alguien con experiencia habitual
en la técnica, pueden formularse las composiciones farmacéuticas de
la presente invención según los métodos conocidos para preparar
tales composiciones, mediante los cuales se combinan las
glucoproteínas con oligosacáridos de tipo mamífero con un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Los excipientes adecuados y su
formulación se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences de
Remington (ed. 18, Gennaro, A. R., ed.), Mack Publishing Co.,
Easton, Pa. (1990); véase especialmente la parte 4, "Testing and
Analysis," págs. 435-602, y la parte 8,
"Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture," págs.
1435-1712). Con el fin de formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para una administración eficaz,
tales composiciones pueden contener adicionalmente una cantidad
eficaz de sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que
mejorarán la eficacia de la composición.
Pueden emplearse métodos farmacéuticos para
controlar la duración de la acción. Pueden lograrse preparaciones de
liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o
absorber las composiciones de esta invención, sus equivalentes, o
sus derivados funcionales. Puede ejercerse la administración
controlada mediante la selección de macromoléculas apropiadas (por
ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona,
acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o
sulfato de protamina) y la concentración de las macromoléculas así
como los métodos de la incorporación con el fin de controlar la
liberación. Otro método para controlar la liberación es incorporar
las composiciones de la invención dentro de partículas de un
material polimérico tal como poliésteres, poliaminoácidos,
hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de acetato de
etilenvinilo. Alternativamente, es posible atrapar estos materiales
en microcápsulas preparadas, por ejemplo mediante técnicas de
coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas
de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en
sistemas de administración coloidal de fármacos, por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Pharmaceutical Sciences de Remington, citado anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención también pueden formularse para administración por vía
oral, o por vía parenteral mediante inyección (por ejemplo mediante
inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa), mediante
infusión intravenosa u otra, mediante absorción nasofaríngea (vía
intranasofaríngea), vía percutánea, vía rectal, vía ocular o vía
sublingual. Las composiciones para administración por vía parenteral
pueden incluir disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no
acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son
propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como
aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato
de etilo. Pueden utilizarse vehículos, coadyuvantes o apósitos
oclusivos para aumentar la permeabilidad de la piel y potenciar la
absorción. Las formas farmacéuticas líquidas para la administración
oral pueden comprender generalmente una disolución de liposoma que
contiene la forma farmacéutica líquida. Las formas adecuadas para la
suspensión de liposomas incluyen emulsiones, suspensiones,
disoluciones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes
que se utilizan habitualmente en la técnica, tales como agua
purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones
también pueden incluir agentes humectantes, agentes emulsionantes y
de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes o de
perfume.
En una realización, pueden formularse las
composiciones farmacéuticas de la presente invención como una crema,
una loción, una pomada, o similar, para la administración tópica a
la piel. Tales composiciones pueden contener opcionalmente agentes
humectantes, emulsionantes y de suspensión, o agentes colorantes o
de perfume.
Se dice que una composición es
"farmacológicamente aceptable" si su administración la puede
tolerar el receptor sin la producción de efectos secundarios
graves. Se dice que un agente como tal se administra en una cantidad
o concentración terapéuticamente "eficaz" si produce el (los)
efecto(s) biológico(s) deseado(s).
Generalmente, la dosis que se necesita para
proporcionar una cantidad o concentración eficaz de la composición
puede ajustarla alguien experto en la técnica, tal como un médico, y
variará dependiendo de factores tales como la vía de administración
y la edad, el estado, el sexo y el grado de la enfermedad, si la
hay, del receptor, y de otras variables.
El receptor de las proteínas modificadas según
los métodos de la invención puede ser cualquier animal en el que se
desee administrar tal proteína, incluyendo seres humanos, animales
de zoo, animales de granja (bovinos, ovinos y similares), y
mascotas (gatos, perros, pájaros, etc.).
La invención se describe con más detalle en los
siguientes ejemplos. Estos ejemplos sólo muestran unas pocas
aplicaciones concretas de la invención. El crear aplicaciones
similares y realizaciones de las mismas es evidente en sí mismo
para alguien experto en la técnica. Por tanto, los ejemplos no deben
interpretarse como una limitación del alcance de la invención sino
más bien sólo como una aclaración del uso de la invención.
Se obtuvieron las glucoproteínas a partir de la
cepa mutante RUTC 30 de T. reesei tras el crecimiento en un
medio mínimo para la inducción de celulasas (Uusitalo et al.,
J. Biotechn. 17:35-50 (1991)). Como fuentes de
carbono para el crecimiento, se añadieron lactosa o una combinación
de lactosa/celulosa (concentración final del 2%). Se utilizó el
método de Bradford, M. M. (Anal. Biochem.
72:248-254(1976)) para medir la concentración
de las proteínas con inmunoglobulina G como patrón. Para los
experimentos de glucosiltransferasa, se dializaron posteriormente
las proteínas secretadas frente al tampón apropiado utilizado en el
ensayo de glucosiltransferasa posterior. Fue posible un cambio
rápido al nuevo tampón sin pérdida significativa de las proteínas
cuando se usaron dispositivos de ultracentrifugación Microcon^{MR}
(Amicon) (Blatt et al., Anal. Biochem.
26:151-173 (1968)). Se obtuvo comercialmente una
mezcla de celulasas a partir de una segunda cepa de T. reesei
desconocida, de Fluka Chemie, Buchs, Suiza.
Se prepararon los oligosacáridos según un método
descrito por Verostek et al. (Glycobiology 2:458 (Abstract
1.06) (1992)). Se liberaron oligosacáridos de las glucoproteínas (1
- 20 mg/ml) mediante PNGasa F recombinante (Tarentino et
al., Biochem. 24:4665-4671 (1985)) (Biolabs). Se
disolvieron primero las glucoproteínas en fosfato de sodio 50 mM
(pH 7,5), 0,5% de SDS y 1% de
\beta-mercaptoetanol, o en Tris- HCl 50 mM, pH
7,0. Entonces se desnaturalizaron las proteínas hirviendo durante 10
minutos. Se añadió el detergente no iónico Nonidet
P-40^{MR} para evitar la inhibición de PNGasa F
mediante SDS. Se incubó la mezcla de reacción con 1.000 unidades de
PNGasa F a 37ºC durante 18 horas. Tras el tratamiento con PNGasa F,
se precipitaron las proteínas y los oligosacáridos añadiendo cuatro
volúmenes de acetona a menos 20ºC. Se desechó el sobrenadante que
contenía un 80% de sal de acetona y SDS, y el sedimento se extrajo
dos veces con metanol al 60% helado. Se eliminó el etanol de los
sobrenadantes combinados tras la liofilización mediante evaporación.
Se consiguió la purificación adicional de los oligosacáridos
mediante pase a través de una columna Bio-Gel
P2^{MR} (27 cm de altura, 0,5 cm de diámetro; obtenida de BIORAD).
Se localizó la presencia de oligosacáridos en las diferentes
fracciones recogidas por tinción con orcinol (Révélateurs pour la
chromatographie en couche mince et sur papier, Merck, pág. 91
(1980)). En una segunda serie, se hicieron pasar las fracciones
combinadas que contienen oligosacáridos sobre una columna
Bio-Gel P2^{MR} (Biorad) para obtener
oligosacáridos que fueran suficientemente puros para utilizarlos en
los ensayos de glucosiltransferasa.
Se amplificó la región codificante del gen
GlcNAc Tr I (Nº de registro Genbank M55621; Nº de registro EMBL
HSGLCNAC; Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:9948-9952 (1990); todos incorporados en el
presente documento mediante referencia) a partir de ADN genómico de
carcinoma de colon utilizando PCR y se clonó posteriormente en el
vector de expresión de mamíferos pCAGGS, que se describe con más
detalle en la tabla 3 (figura 2 y descrito en Niwa et al.,
Gene 108:193-200 (1991)). Se utilizó la línea
celular de adenocarcinoma colorrectal humano DLD-1
como fuente de ADN genómico. Esta línea celular está disponible de
la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, (ATCC
CCL 221) y se describe en Cancer Research
39:1020-1025 (1979)). El plásmido pCAGGS fue
obsequio de J. Miyazaki, Univ. Tokio, Japón. El plásmido pCAGGS es
útil para la expresión altamente eficaz de genes bajo el control del
promotor híbrido
\beta-actina/\beta-globina y del
potenciador CMV-IE en diversas células de
mamíferos. El pCAGGS porta un promotor de
\beta-actina de pollo modificado: la secuencia
aceptora de empalme de la región de promotor de
\beta-actina se sustituye por un fragmento de
\beta-globina de conejo que contiene una parte en
3' del segundo intrón y una parte en 5' del tercer exón. El promotor
híbrido de
\beta-actina/\beta-globina
resultante se designa como el promotor "AG".
Se preparó ADN genómico a partir de células de
colon, según el procedimiento descrito por Maniatis, T.,
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición, Sambrook
et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
1989. Se amplificó un fragmento de ADN genómico que representa la
región codificante del gen GlcNAc Tr I con polimerasa de
Pyrococcus furiosus (Stratagene) y un ciclador térmico de
Pharmacia según las instrucciones del fabricante. El cebador de
oligonucleótidos N-terminal consiste en la
secuencia:
5'-CCAGGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCA-3'
(SEQ ID NO: 1).
El cebador de oligonucleótidos
C-terminal consistió en la secuencia:
5'-CCAGTCGACAGGTGCTAATTCCAGCTAG-3'
(SEQ ID NO: 2).
El protocolo de amplificación consistió en un
ciclo de desnaturalización inicial de 8 minutos a 96ºC, seguido de
una etapa de hibridación de 1 minuto a 65ºC y finalmente un ciclo de
polimerización de 4 minutos a 75ºC. La amplificación se cambió
luego a una desnaturalización de 1 minuto, hibridación de 1 minuto y
polimerización de 4 minutos durante 24 ciclos adicionales.
Una fracción de los fragmentos de PCR tiene un
único nucleótido de adenosina añadido al extremo 3' debido a la
actividad transferasa terminal independiente del molde de la
polimerasa de Pyrococcus furiosus. Se explotó esta actividad
para clonar los fragmentos de ADN amplificado con la eficacia de la
clonación de extremos cohesivos. Para hacer esto, se preparó el
vector pUC18 (dentro de cuyo fragmento se uniría) tal como sigue. Se
incubó el vector digerido con Hind-II de un \mug
con 20 unidades de transferasa terminal y ddTTP 10 \muM en un
volumen final de 30 \mul durante 1 hora a 37ºC. Se utilizó ddTTP
para garantizar la incorporación de sólo una timidina en los
extremos 3' del vector digerido romo (Holton et al., Nucleic
Acids Research 19(5):1156 (1990)). Se purificaron el vector
y los fragmentos de PCR utilizando el kit Gene Clean^{MR} de
Pharmacia. Se ligó finalmente el fragmento (200 ng) codificante de
GlcNAc Tr I amplificado en el vector pUC18 (40 ng) a 12ºC durante 17
horas. La primera parte del gen
(MLKKQSAGLVLWGAILFVAWNALLLLFFWTRPAPGRPPSVS [SEQ ID NO: 3]) que
codificaba para la secreción y para la retención en el compartimento
de Golgi medial se sustituyó con una secuencia de nucleótido que
codifica para la secuencia señal "prepro" de secreción del
factor de apareamiento de levadura. Se aisló esta secuencia de
nucleótido a partir del plásmido pSCGAL1MF3 (catálogo de las Belgian
Coordinated Collections of Microorganism (BCCM) (Colección
Coordinada Belga de Microorganismos) de la colección de cultivos
del Laboratorium voor Moleculaire Biologie Plasmidencollectie (LMBP)
en la Universidad de Gent) tras la digestión con las enzimas de
restricción Stu I y Xba I. (Los materiales enumerados tal como se
obtuvieron del LMBP están disponibles para cualquiera que los
solicite). La secuencia de nucleótidos del factor de apareamiento de
levaduras que se utilizó es
En la figura 3 aparece un mapa de plásmido
pSCGAL1MF3 y una descripción más detallada en la tabla 2.
Para obtener el plásmido pSCGAL1MF3, se abrió
plásmido pSCGAL1MF2 (disponible de la colección de LMBP) con
AccI, se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa
y se ligó. De esta manera, se pierden los sitios HindII y
SalI del poliligador (polilinker), se crea un sitio
NruI en el poliligador, y el sitio HindII dentro de
la señal de secreción prepro del factor 1 de apareamiento \alpha
se convierte en único.
Se ligó el lado Stu I terminado en extremos
romos a GlcNAc Tr I digerido con Eco 47III en el vector pUC18. Se
aisló entonces la secuencia de nucleótidos codificante
"prepro-GlcNAc Tr I" a partir del vector pUC18
mediante una digestión doble con Eco RI, Hind III. Posteriormente,
se ligó un ligador (linker) de Eco RI al sitio Hind III terminado
en extremos romos para permitir la inserción en el vector pCAGGS de
mamíferos. Se realizó la clonación direccional con el vector y
fragmento digeridos con Xba I, Eco RI.
En este casete de expresión, se sustituyó la
primera parte del gen que codificaba para las señales de secreción y
retención de Golgi, por una secuencia de nucleótidos que codificaba
para la secuencia señal "prepro" de secreción del factor de
apareamiento \alpha de levadura (Burke et al., J. Biol.
Chem. 267:24433-24440 (1992); y Brake, A. J., en
Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds.), Buttersworths
Pub., Stoneham, MA (1989), págs. 269-280). El
vector se denominó pCAMFhGNTIf1 (figura 4). Se representa un
diagrama de su construcción en las figuras 4A, 4B, 4C y 4D y se
describe con más detalle en la tabla 1. Fundamentalmente, se ligó el
fragmento XbaI-StuI de pSCGAL1MF3 (anterior), que
contenía la señal prepro de secreción del gen del factor 1 de
apareamiento \alpha al fragmento de vector
XbaI-Eco47III de pUChGNTI. Debido a la actividad
transferasa terminal independiente del molde de la polimerasa de
Pyrococcus furiosus, una fracción de los fragmentos de PCR
tiene un único nucleótido adenosina añadido al extremo 3'. Se
explotó esta actividad para clonar los fragmentos de ADN
amplificados con la eficacia de clonación en extremos cohesivos.
Para hacer esto, se preparó el vector pUC18 aceptor como sigue: se
incubó 1 \mug del vector digerido con Hind II con 20
unidades de transferasa terminal y ddTTP 10 \muM en un volumen
final de 30 \mul durante 1 hora a 37ºC (Holton y Graham, 1990). Se
ligó el fragmento codificante de GlucNAc Tr I (200 ng) amplificado
en el vector pUC18 (40 ng) tratado (Norrander et al., Gene
26:101-106 (1983)) a 12ºC durante 17 horas. Se
digirió entonces este constructo intermedio con HindIII y
EcoRI, se rellenaron los extremos cohesivos con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa y se añadieron ligadores de EcoRI
(5'-CGGAATTCCG-3'). Finalmente, se
digirió este fragmento EcoRI-EcoRI con XbaI y
EcoRI y se insertó el fragmento XbaI-EcoRI
resultante en el vector pCAGGS digerido con
XbaI-EcoRI. Este plásmido de expresión lleva una
fusión de la señal prepro de secreción del gen del factor 1 de
apareamiento \alpha a la
N-acetilglucosaminiltransferasa I que codifica para
gen humano maduro (GlcNAc Tr I), codificado en la orientación
sentido con respecto al promotor de \beta-actina
de pollo que está precedido de la secuencia potenciadora
CMV-IE. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos del
GlcNAc Tr I humano de EMBL con Nº de registro M55621.
Tras la transfección transitoria del vector a
células COS-7 (ATCC CRL-1651), se
secretó eficazmente la enzima GlcNAc Tr I expresada en medio mínimo
Dulbecco (medio Eagle modificado por Dulbecco, Dulbecco, R. et
al., Virol. 8:396 (1959); Smith, J. D. et al., Virol.
12:185 (1960); Tissue Culture Standards Comm., In Vitro 6:2
y 93 e In Vitro 9:6). Se concentró en aproximadamente 10
veces el sobrenadante de COS y se utilizó en los ensayos de
actividad GlcNAc Tr I. GlcNAc Tr I está enzimáticamente bien
caracterizado y utiliza un oligosacárido Man_{5}GlcNAc_{2} como
un sustrato aceptor preferido (Nishikawa et al., J. Biol.
Chem. 263(17):8270-8281 (1988)). En general,
se aceptan como sustratos para GlcNAc Tr I oligosacáridos con la
fórmula común R1\alpha 1,6(Man\alpha 1,3Man\beta
1,4GlcNAcR2), donde R1 es uno o más residuos de manosa unidos
mediante enlaces \alpha; R2 puede ser
\beta1-4(Fuc\alpha1-6)GlcNAc-Asn-X,
\beta1-4GlcNAc-Asn-X,
\beta1-4GlcNAc o H). Se incorporó un residuo de
GlcNAc derivado de UDP-GlcNAc en el enlace
\beta1-2 al residuo de manosa unido en
\alpha-1,3 a Man \beta 1,4GlcNAcR2 (Schachter,
H., Glycobiology 1(5):453-461 (1991)).
Se transfectaron el vector de mamíferos pCAGGS y
las secuencias codificantes "prepro-GlcNAc Tr
I" (pCAMFh
GNTIf1) en células COS según el protocolo de McCutchan et al. (J. Nat. Cancer Inst. 41:351-357 (1968)). Se secretó GlcNAc Tr I en medio mínimo Dulbecco sin suero. Se concentró la enzima mediante ultrafiltración en microconcentradores centrífugos Centricon-30^{MR} (Amicon).
GNTIf1) en células COS según el protocolo de McCutchan et al. (J. Nat. Cancer Inst. 41:351-357 (1968)). Se secretó GlcNAc Tr I en medio mínimo Dulbecco sin suero. Se concentró la enzima mediante ultrafiltración en microconcentradores centrífugos Centricon-30^{MR} (Amicon).
Se ensayó la actividad GlcNAc Tr I según un
método descrito por Nishikawa et al. (J. Biol. Chem.
263(17):8270-8281 (1988)) tal como sigue. En
un volumen total de 0,030 ml, se añadió lo siguiente: Man_{5}Gn
0,33 mM; ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico
(MES) 0,1 M (pH 6,1); MnCl_{2} 20 mM; AMP 5 mM (como inhibidor de
pirofosfatasa); GlcNAc 0,1 M (como inhibidor de
\beta-N-acetilhexosa-aminidasa);
0,34 mmol de UDP-(^{14}C)GlcNAc (Amersham); y 10 \mul
de sobrenadante COS concentrado. La incubación fue a 37ºC durante de
1 a 4 horas. Se separaron entonces las proteínas de los
oligosacáridos mediante precipitación mediante la adición de etanol
helado al 100% hasta una concentración final del 66%.
Se separaron los oligosacáridos sobre placas de
capa fina de alta resolución de sílice 60 utilizando un disolvente
que contenía butanol/ácido acético/agua (20:10:10; v/v/v). Se
desarrollaron las placas dos veces en el mismo disolvente (Vauhkonen
et al., Eur. J. Biochem. 152:43-50 (1985)).
Se visualizaron los oligosacáridos radioactivos tras la exposición
de la placa de CCF a una película de rayos X durante varios
días.
También se visualizaron los oligosacáridos
mediante tinción con orcinol, tal como sigue. Se pulverizó una
mezcla de 0,6% de orcinol en ácido sulfúrico al 10% y 0,1% de
Fe(III)Cl_{2} en la parte superior de la placa de
CCF que se calentó posteriormente hasta 100ºC durante de 10 a 15
minutos.
En lugar de oligosacáridos, cuando se
observaron, se añadieron glucoproteínas a la mezcla de reacción para
GlcNAc Tr I. Se añadieron aproximadamente 10 \mug de
glucoproteína (por ejemplo, ovoalbúmina) a la mezcla de reacción de
30 \mul. La incubación a 37ºC fue durante un periodo de 6 a 18
horas. La incorporación de GlcNAc radioactivo dentro de las
unidades de oligosacáridos sobre las proteínas, separadas sobre un
gel de SDS-poliacrilamida (Laemmli, U.K., Nature
227:680-685 (1970)), se visualizó mediante
autorradiografía.
Se realizaron modificaciones in vitro
adicionales de glucoproteínas que llevan
N-acetilglucosamina u oligosacáridos con
\beta-1,4-galactosiltransferasa a
partir de leche humana y con
\alpha-2,6-sialiltransferasa a
partir de hígado de rata. Se obtuvieron ambas enzimas de Boehringer
Mannheim.
Antes de realizar estas etapas de tratamiento,
se purificó CBH I a partir de la mezcla de reacción de GlcNAc Tr I.
Una descripción para la purificación de esta proteína está
disponible en Shoemaker et al., Bio/Technology
1:687-690 (1993). Brevemente, se pasó el medio
celular COS por una columna de DEAE-sepharose que se
había equilibrado en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Las
celulasas (o CBH I solo) de T. reesei en una mezcla de
reacción para el tratamiento de GlcNAc Tr I se dializaron frente a
un tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Luego, se separaron de
las proteínas del sobrenadante de COS mediante purificación en una
columna de DEAE Sepharose® (volumen: 0,5 ml, aproximadamente 1 cm
de altura, 0,5 cm de diámetro, resina de flujo rápido, Pharmacia).
Bajo estas condiciones se retuvo CBH I.
Un gradiente salino (cambiando la concentración
de NaCl desde 0 hasta 0,1 M en 400 \mul de tampón de acetato de
sodio, pH 5) eliminó una parte sustancial de las proteínas presentes
en la mezcla de reacción para las glucosilaciones in vitro,
y se retuvo CBH I en la columna. La concentración de sal se aumentó
aún más hasta 0,2 M (en 800 \mul), y CBH I eluyó en NaCl 0,15 M o
superior. La concentración de sal se aumentó aún más hasta 0,5 M
(aplicando 800 \mul) con el fin de eluir tanto como fuera posible
del CBH I de la columna. Se combinaron las fracciones que contienen
CBH I y se dializaron frente a un tampón Tris 50 mM, pH 8, y se
concentraron en aproximadamente 10 veces, utilizando un dispositivo
de ultracentrifugación Centricon (Amicon). Se añadió entonces CBH I
a la mezcla de reacción para galactosiltransferasa:
\beta-1,4-galactosiltransferasa
requirió un pH de 8 - 8,5 y la presencia de manganeso para
actividad específica óptima (Schanbacher et al., J. Biol.
Chem. 245:5057-5061 (1970); Yoon et al.,
Glycobiology 2:161-168 (1992)). A las proteínas
tratadas con GlcNAc Tr I u oligosacáridos se añadieron: 0,17
\mumol de UDP (^{14}C)Gal (285 mCi/mmol) o
UDP-Gal "frío"; 2 miliunidades de
galactosiltransferasa; y MnCl_{2} hasta una concentración final de
20 mM en un volumen final de 0,030 ml. Se realizó la galactosilación
a 37ºC durante aproximadamente 8
horas.
horas.
La
\alpha-2,6-sialiltransferasa
requirió un pH de 6 - 6,5 para la actividad óptima (Weinstein et
al., J. Biol. Chem. 257:13845-13853 (1982)). A
la mezcla de reacción de galactosiltransferasa se añadieron los
siguientes: 0,18 \mumol de CMP(^{14}C)NANA (281
mCi/mmol) (Amersham) hasta una concentración final de 6 mM; 2
miliunidades de
\alpha-2,6-sialiltransferasa; y
NaCl (para estabilizar la sialiltransferasa, concentración final: 50
mM). Se ajustó el pH a 6 - 6,5 mediante la adición de MES 1 M. El
volumen final de la mezcla de reacción fue 0,050 ml. Se incubó la
mezcla de reacción a 37ºC durante 8 horas. Se visualizó la
incorporación de residuos de azúcar radioactivos en las
glucoproteínas tal como se describió anteriormente.
También se realizaron modificaciones in
vitro de ribonucleasa B glucosilada, obtenida de Oxford
Glycosystems. Se incubó la ribonucleasa B glucosilada con GlcNAc Tr
I, tal como se describe en el ejemplo 5. El producto de
oligosacárido resultante se muestra en la figura 12, banda 1. Se
incubó el producto resultante con galactosiltransferasa:
\beta-1,4-galactosiltransferasa
tal como se describió anteriormente para producir *Gal unido a
GlcNAc en Man_{5}GlcNAc_{2} tal como se muestra en la figura 12,
banda 2. Se incubó este producto con
\alpha-2,6-sialiltransferasa tal
como se describe previamente para producir ácido siálico unido a
*Gal unido a *GlcNAc en Man_{5}GlcNAc_{2} comercial tal como se
muestra en la figura 12, banda 3.
También se estudió la utilización de
N-glucanos, liberados a partir de ribonucleasa B,
como sustratos aceptores para GlcNAc Tr I, galactosiltransferasa, y
\alpha-2,6-sialiltransferasa. Se
liberaron los N-glucanos tal como se describe en
el ejemplo 2. Siguiendo la liberación a partir de la proteína, dos
estructuras aceptoras de GlcNAc están disponibles. Por lo tanto, un
modelo de glucosilación más complejo se observa siguiendo la
reacción secuencial con GlcNAc Tr I, galactosiltransferasa, y
\alpha-2,6-sialiltransferasa, tal
como se representa en la figura 12, bandas 4 - 6. Sin embargo, se
observaron las estructuras híbrida y compleja esperadas.
Se trataron las glucoproteínas (hasta 100 mg) u
oligosacáridos (preparados a partir de aproximadamente 100 mg de
proteína) con de 2 a 6 \mu unidades de
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi (Oxford Glycosystems) en acetato de sodio 100 mM (pH 5)
durante 18 horas a 37ºC. Se dializaron las glucoproteínas frente a
MES 20 mM, pH 6,1, antes de tratar adicionalmente con GlcNAc Tr I.
Se visualizó la incorporación de GlcNAc radioactivo en
oligosacáridos sobre una película de rayos X tras la separación
mediante CCF. Se visualizaron señales radioactivas que se originan a
partir de residuos (^{14}C)GlcNAc en proteínas tal como se
describió anteriormente.
Se ensayó la actividad manosidasa en el medio
extracelular a partir de T. reesei y Aspergillus
satoi: se hizo crecer T. reesei RUTC 30 en medio mínimo,
según Uusitalo et al. (1991) con lactosa al 2% como fuente de
carbono. Se utilizó paralelamente el mismo medio, complementado con
glucosa al 2%, con el fin de determinar si existe una influencia de
fuentes de carbono diferentes sobre la expresión de las manosidasas.
Se hizo crecer Aspergillus saitoi sobre un medio mínimo según
Czapek (Onions y Pitt, apéndice: Media. En Hawksworth, D. L. y
Kirsop, B. E., (Eds.), Living resources for biotechnology.
Cambridge University Press, Cambridge, UK, págs.
180-199, 1988) con extracto de levadura al 1% y,
paralelamente con glucosa al 2% como fuentes de carbono. Tras 4 días
de fermentación a 28ºC, se separaron células fúngicas del medio de
crecimiento mediante filtración sobre un filtro de microfibra de
vidrio GF/F (Whatman).
Se concentró adicionalmente el medio de
crecimiento (70 veces), utilizando dispositivos de
ultracentrifugación centriprep y centricon (punto de corte de PM: 10
kD; Amicon). Las mezclas de reacción para ensayar las actividades
de manosidasa contenían en un volumen de 20 \mul: 500 ng de
oligosacáridos ricos en manosa marcados con ANTS a partir de
ribonucleasa B (Oxford Glycosystems); cacodilato de sodio pH 6,1
(concentración final de 60 mM); CaCl_{2} (20 mM) y 15 \mul de
medio de crecimiento concentrado. La incubación de las mezclas de
reacción fue durante la noche a 37ºC. Se separaron luego los
oligosacáridos sobre un gel de poliacrilamida, tal como se
describe.
Se utilizaron las células fúngicas recogidas
para la preparación de los extractos brutos: tras lavar con tampón
de cacodilato de sodio 50 mM, se machacó el sedimento celular seco
en un mortero utilizando nitrógeno líquido. Se transfirieron las
células rotas a tampón de cacodilato de sodio helado (50 mM, pH 6,1)
que contenía MgCl_{2} (15 mM) y un combinado de inhibidores de
proteasa (PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), leupeptina,
benzamidina, aprotinina en concentraciones prescritas por el
fabricante (Boehringer Mannheim). Se dejaron las células en el
tampón sobre hielo durante 30 minutos. Se utilizó centrifugación
diferencial para obtener sedimentos de membrana de 15.000 g, 40.000
g y 100.000 g. Finalmente se añadió Triton X 100 (concentración
final del 2%) a las enzimas solubilizadas de las membranas. Se
prepararon las mezclas de reacción para ensayar las manosidasas tal
como ya se ha descrito. Las mezclas de reacción para ensayar las
manosiltransferasas contenían en un volumen de 20 \mul: 100 ng de
Man_{8}GlucNAc marcado con ANTS; 10 \mug de
UDP-manosa; MnCl_{2} (concentración final de 20
mM) y 10 \mul de la preparación de membrana de 100.000 g. Se
incubaron las mezclas de reacción durante 4 horas a 37ºC.
Se utilizaron diferentes glucoproteínas en los
ensayos de actividad de GlcNAc Tr I para determinar si estaban
portando estructuras de glucosilo que fueran sustratos para GlcNAc
Tr I. La ovoalbúmina, que se utilizó como control positivo en este
experimento, tiene dos sitios de glucosilación candidatos, pero sólo
un sitio está realmente glucosilado. Una fracción de los
oligosacáridos que están presentes en la ovoalbúmina es
Man_{5}Gn_{2} (Tai et al., J. Biol. Chem.
252:6687-6694 (1977)). Como controles negativos, se
utilizaron invertasa de S. cerevisiae y transferrina humana.
La invertasa de S. cerevisiae porta oligosacáridos ricos en
manosa con Man_{8}Gn_{2} siendo la estructura más pequeña que
se forma (Trimble et al., J. Biol. Chem.
261:9815-9824 (1986)). La transferrina, una
glucoproteína humana, tiene dos N-glucanos de tipo
complejo (Marz et al., Can. J. Biochem.
60:624-630 (1982)). La mayoría de los oligosacáridos
de transferrina son bi-antenales con ácido siálico
como residuos de azúcar terminales.
Se estudiaron las proteínas secretadas a partir
de la cepa RUTC 30 mutante de T. reesei y las celulasas de
una cepa desconocida de T. reesei (fuente comercial; Fluka,
Buchs, Suiza). La cepa RUTC 30 mutante de T. reesei tiene
una capacidad incrementada para secretar proteínas (Ghosh et
al., en Trichoderma reesei Cellulases: Biochemistry, Genetics,
Physiology & Application (Kubicek et al., eds.), Royal
Soc. of Chemistry, Cambridge, Inglaterra (1990), págs.
115-138). Los resultados (figura 5) muestran que el
(^{14}C)GlcNAc radioactivo se transfirió desde
UDP-(^{14}C)GlcNAc hasta los oligosacáridos en ovoalbúmina
y en proteínas secretadas extracelulares a partir de ambas cepas de
T. reesei. Estos resultados indicaron que la presencia de
enzimas de corte en T. reesei que pudieron formar in
vivo oligosacáridos aceptores para GlcNAc Tr I.
Adicionalmente, se estudió la utilización de
otras proteínas como sustratos aceptores para GlcNAc Tr I. Se
determinó la presencia de un sustrato para GlcNAc Tr I utilizando el
ensayo de GlcNAc Tr I descrito anteriormente en el ejemplo 5,
midiendo la incorporación de GlcNAc radiactivo en la glucoproteína
mediante autorradiografía de geles de SDS-PAGE al
12,5%. Se demostró la incorporación de GlcNAc radiomarcado para
\alpha-amilasa de Aspergillus oryzae,
obtenida de Fluka, Buchs, Suiza; \alpha-amilasa de
Aspergillus niger, también obtenida de Fluka; y para las
proteínas en una preparación de
\beta-galactosidasa comercial de Aspergillus
oryzae, obtenida de Sigma, St. Louis, MO, USA. Véase la figura
11. También se demostró la incorporación de GlcNAc radiomarcado para
la celobiohidrolasa I digerida con papaína de Trichoderma
reesei RUTC 30. Tras la digestión con papaína, la
celobiohidrolasa I no contiene más el extremo
C-terminal de la enzima que está fuertemente
O-glucosilada. Van Tilbeurgh et al., FEBS
Lett. 204:223-227 (1986).
Se aislaron los oligosacáridos de glucoproteínas
extracelulares de Trichoderma para evaluar adicionalmente y
confirmar que Man_{5}GlcNAc_{2} fue el N-glucano
aceptor de GlcNAc. Se eliminaron enzimáticamente los oligosacáridos
con N-glucanasa. Esta enzima libera todos los tipos
de cadenas de azúcar unidas a N mediante escisión de la unión
glucosilamina en residuos de asparagina (Tarentino et al.,
Biochemistry 24:4665-4671 (1985)). Luego se probaron
los oligosacáridos en una mezcla de reacción que contiene GlcNAc Tr
I. Una mezcla comercial de oligosacáridos que oscila desde
Man_{9}GlcNAc_{2} hasta Man_{5}GlcNAc_{2} obtenida a partir
de ribonucleasa B mediante hidrazinolisis (Oxford GlycoSystems Nº
RP-2500) se utilizó como control positivo para este
experimento (Liang et al., J. Biochem.
88:51-58 (1980)). Los oligosacáridos que habían
sido liberados enzimáticamente a partir de invertasa de S.
cerevisiae se utilizaron como controles negativos. GlcNAc Tr I
transfirió GlcNAc radioactivo desde el UDP-(^{14}C)GlcNAc
hasta los glucanos fúngicos Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto se detectó
tras la separación de los oligosacáridos manipulados mediante
cromatografía de capa fina (CCF). La posición de los oligosacáridos
fúngicos marcados, tal como se revela mediante autorradiografía
(figura 6), coincidió con los del control positivo. Con la cepa RUTC
30 mutante de T. reesei una estructura de oligosacárido
adicional que era mayor que Man_{5}GlcNAc_{2} también actuó como
un aceptor para GlcNAc Tr I. Esto indicó la existencia de
diferencias en los modelos de glucosilación al nivel de la
cepa.
cepa.
Se realizaron modificaciones in vitro
adicionales de glucoproteínas que llevan GlcNAc u oligosacáridos con
la \beta-1,4-galactosiltransferasa
comercial (Boehringer Mannheim) de leche humana (Schanbacher et
al., J. Biol. Chem. 245:5057-5061 (1970)) y
\alpha-2,6-sialiltransferasa
comercial (Boehringer Mannheim) de hígado de rata (Weinstein et
al., J. Biol. Chem. 257:13845-13853 (1982)). Se
demostró la galactosilación mediante la incorporación de galactosa
radioactiva sobre estructuras de glucosilo sintetizadas in
vitro, no marcadas, que llevan GlcNAc. Se demostró la
finalización de la ruta sintética mediante la incorporación de ácido
siálico radioactivo sobre galactosa "fría" que se añadió en
una unión \beta-1,4 a GlcNAc. Se separaron las
glucoproteínas marcadas de esta manera mediante electroforesis
sobre un gel de SDS-poliacrilamida. Durante la
electroforesis, las glucoproteínas sializadas se desplazaron más
lentamente comparadas con las proteínas no sializadas. Esto se
observó como un desplazamiento de las proteínas hacia pesos
moleculares más elevados. Para demostrar claramente este efecto, se
examinó una proteína de Trichoderma, concretamente
celobiohidrolasa I (CBH I), en particular.
Tras la etapa de tratamiento de GlcNAc Tr I, se
purificó CBH I a partir de la mezcla de reacción que contiene
sobrenadante de COS mediante cromatografía de intercambio iónico
sobre DEAE Sepharose (Shoemaker et al., Bio/Technology
1:687-690 (1983)). La etapa de purificación evitó
cualquier interferencia posible mediante proteínas del sobrenadante
de COS, que también puede ser un aceptor para sialiltransferasa.
Se obtuvo un autorradiograma con GlcNAc
radioactivo que contiene CBH I frente a CBH I sializado radioactivo
(figura 7). Se mostró un desplazamiento limpio en la movilidad
electroforética del CBH I sializado comparado con la forma que
contiene GlcNAc. Esto demostró que era posible modificar las
estructuras de glucosilo que se producen de forma natural en CBH I
de Trichoderma en estructuras híbridas con restos de ácido
siálico terminales. Se confirmaron las dos etapas de modificación
finales sobre los oligosacáridos libres. La incorporación de
galactosa seguida de la incorporación de ácido siálico, causó
siempre un desplazamiento del peso molecular de las moléculas de
oligosacárido. Esto se observó como desplazamientos en la movilidad
de los diferentes oligosacáridos manipulados en la CCF.
Cuando se utiliza un hongo tal como T.
reesei para producir proteínas heterólogas terapéuticamente
valiosas, una fracción sustancial de los oligosacáridos ricos en
manosa no será un aceptor para GlcNAc Tr I. Por otro lado, en
células de mamíferos, una
\alpha-1,2-manosidasa que está
presente en el compartimento cis del aparato de Golgi corta la
mayoría, si no todas, las estructuras ricas en manosa en
Man_{5}GlcNAc_{2} y así asegura que las cadenas de hidrato de
carbono se puedan convertir en el tipo complejo (Tulsiani et
al., J. Biol. Chem. 263:5408-5417 (1988)).
Se utilizó una
\alpha-1,2-manosidasa comercial
(Oxford Glycosystems, Oxford, UK) de A. saitoi (Yamashita
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
96:1335-1342 (1980)) para investigar en qué medida
el tratamiento de glucosilación se asemeja al de las células de
mamíferos. Se determinó el efecto de la incubación previa de
oligosacáridos fúngicos o glucoproteínas con
\alpha-1,2-manosidasa en la
incorporación in vitro de GlcNAc en un ensayo de GlcNAc Tr
I.
Se trataron los oligosacáridos de ribonucleasa B
de bovino, de proteínas extracelulares de T. reesei, con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi. Se procesaron los N-glucanos tratados y
no tratados y se visualizaron mediante marcado con fluoróforo de
los sacáridos reductores (figura 8). En este método, se hizo
reaccionar el extremo reductor de los sacáridos, liberados tal como
se describió anteriormente, con ácido
8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfónico
(ANTS), tal como se describe por Jackson, P., "Methods in
Enzymology. Guide to techniques in Glycobiology", Vol. 230, págs.
250-265, Eds. Lennartz, W. & Hart, G. (1994)).
Básicamente, 10 \mul de ANTS 0,15 M en disolución de ácido
acético - agua (3:17 v/v) y 10 \mul de cianoborohidruro de sodio 1
M disuelto en DMSO se añadieron a oligosacáridos liofilizados,
liberados enzimáticamente a partir de 400 \mug de glucoproteína, o
a 5 \mug de oligosacáridos de ribonucleasa B de bovino, obtenidos
comercialmente de Oxford Glycosystems. No se necesitó la
purificación previa de los oligosacáridos en una columna Biogel P2.
Tras la incubación durante la noche a 37ºC, se precipitaron los
oligosacáridos marcados con ANTS mediante adición de 4 volúmenes de
acetona helada (a menos 20ºC). Se depositaron los oligosacáridos
mediante centrifugación (durante 4 minutos a 10.000 x g). Se
eliminó el ANTS no reaccionado en el sobrenadante que contiene
acetona. Se redisolvieron los oligosacáridos en un volumen apropiado
de glicerol:agua (1:4 v/v) y se almacenaron a menos 70ºC. Se
separaron los oligosacáridos derivatizados con ANTS sobre un gel de
acrilamida al 30% y
N,N'-metilen-bisacrilamida al 0,8%
(en el aparato electroforético SE 250 Mighty Small II, que también
se utiliza para la separación de proteínas mediante PAGE). Con el
fin de obtener geles "transparentes como el cristal", se vertió
la disolución del gel entre láminas de plástico que estaban
adheridas a las placas molde con agua. Se permitió el apilamiento de
los oligosacáridos en una corriente de 15 mA durante 30 minutos,
mientras que la separación ocurrió a 30 mA durante 2,5 horas. Como
patrón de referencia, se cargó una escala de glucosa, obtenida tras
la digestión de almidón de trigo (descrita por Jackson, P.,
"Methods in Enzymology. Guide to techniques in Glycobiology",
Vol. 230, págs. 250-265, Eds. Lennartz, W. &
Hart, G. (1994)). Se examinaron los modelos de banda
electroforéticos en un transiluminador UV y se fotografiaron a
través de un filtro rojo (Cokin A. 003; Cromofilter SA, París,
Francia), utilizando una película en blanco y negro convencional.
Una película Polaroid de tipo 667 con una velocidad de ISO3000 y una
apertura de 4,5 requirió una exposición de 8 segundos
(figura 8).
(figura 8).
Se convirtieron todos los
N-glucanos de tipo oligomanosa de la ribonucleasa B,
que oscilan desde Man_{5}GlcNAc_{2} hasta
Man_{9}GlcNAc_{2}, a Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto estuvo de
acuerdo con el hecho de que se sabe que la biosíntesis de cadenas de
azúcar unidas a N sobre la ribonucleasa B se detiene en una etapa
intermedia del tratamiento, tal como se demuestra por el hecho de
que las estructuras ricas en manosa no se habían convertido todas a
Man_{5}GlcNAc_{2} y tenían restos de manosa de más solamente en
la unión \alpha-1,2. Se convirtieron parcialmente
los oligosacáridos que se habían aislado a partir de una mezcla de
proteínas secretadas a partir de T. reesei a
Man_{5}GlcNAc_{2}, mientras que una parte sustancial de la
reserva de oligosacáridos no se convirtió. Del material de partida,
una fracción de los oligosacáridos parecía ser más pequeña que
Man_{8}GlcNAc_{2}, mientras que otra fracción era más grande
que Man_{9}GlcNAc_{2}. En la figura 8, sólo se muestra el corte
de los oligosacáridos de T. reesei.
Se añadieron entonces los oligosacáridos
fúngicos que se habían tratado con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi a una mezcla de reacción para GlcNAc Tr I. Se analizaron
los oligosacáridos mediante cromatografía de capa fina. El
tratamiento in vitro con
\alpha-1,2-manosidasa favoreció la
formación de sustrato aceptor para GlcNAc Tr I (figura 9) porque se
incorporó mucho más GlcNAc radioactivo dentro de los oligosacáridos
fúngicos. Se cortó también una pequeña fracción de los
oligosacáridos de invertasa de S. cerevisiae a la estructura
rica en manosa que acepta GlcNAc. Los glucanos de
Man_{5}GlcNAc_{2} aislados de ovoalbúmina fueron el control
positivo para este experimento. En el autorradiograma, la posición
de los oligosacáridos fúngicos marcados coincidió con la del
control positivo. Esto confirmó la formación de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en las diferentes mezclas de
reacción.
Con la cepa de Trichoderma RUTC 30, el
tratamiento con
\alpha-1,2-manosidasa también dio
lugar a más de un segundo oligosacárido que acepta GlcNAc más
grande. Cuando se repitió el tratamiento con manosidasa sobre
glucoproteínas intactas (figura 10) los resultados fueron análogos a
los obtenidos con oligosacáridos libres. Es decir, se transfirió
más GlcNAc marcado a la ovoalbúmina y a las glucoproteínas de T.
reesei cuando primero se trataron previamente con
\alpha-1,2-manosidasa. Ahora se
transfirió también GlcNAc a invertasa de S. cerevisiae.
En resumen, el método de la invención permite la
producción de oligosacáridos híbridos similares a los de los
mamíferos sobre glucoproteínas secretadas a partir del hongo
filamentoso T. reesei y de su cepa mutante T. reesei
RUTC 30. Los experimentos in vitro utilizaron las siguientes
glucosiltransferasas de mamíferos: GlcNAc Tr I humana producida en
células COS;
\beta-1,4-galactosiltransferasa de
leche humana y
\alpha-2,6-sialiltransferasa de
hígado de rata. La incubación previa con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi mejoró sustancialmente la incorporación de GlcNAc en las
proteínas fúngicas. Esta realización obtuvo un hongo que sintetizaba
oligosacáridos que se podían convertir en estructuras de tipo
mamífero complejas de la forma más simple posible. Ya que las
primeras etapas de la compleja ruta sintética de hidratos de carbono
se llevaron a cabo in vivo en un hongo tal como
Trichoderma, la finalización de la ruta de glucosilación fue
posible mediante síntesis y modificación de oligosacáridos
enzimáticas in vitro. Como resultado de la presente
invención, la síntesis de oligosacáridos controlada estéricamente a
gran escala será posible en el futuro (Ichikawa et al., Anal.
Biochem. 202:215-238 (1992)). El hecho de que un
hongo pueda manipularse para construir estructuras de glucosilo bien
definidas y uniformes sobre sus proteínas secretadas ofrece
posibilidades para investigar la importancia biológica de la
diversidad de oligosacáridos y para realizar ingeniería genética de
hidratos de carbono. Para ciertas proteínas, la producción de una
glucoforma individual puede producirse para obtener un perfil
terapéutico uniforme (Stanley, P., Molecular y Cellular Biology
9:377-383 (1989)).
Se obtubo una imagen detallada, tanto
cuantitativa como cualitativamente, cuando se derivatizaron los
oligosacáridos con el fluoróforo
8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonato
y posteriormente se separaron electroforéticamente sobre un gel de
poliacrilamida. En la figura 4, de demuestra el modelo de
oligosacárido de celobiohidrolasa I de T. reesei RUTC 30,
purificada tras la fermentación en medio mínimo (Nyyssönen et
al., Bio/Technology 11:591-595 (1993)). También
se conoce el modelo obtenido con una mezcla de proteínas secretadas
por la misma cepa de Trichoderma, pero en un medio de
crecimiento diferente (según Uusitalo et al., 1991). Sólo una
fracción menor de oligosacáridos del material de partida parece ser
Man_{5}GlucNAC_{2}. Más abundantes son los oligosacáridos
Man_{6}GlucNAC_{2}, Man_{7}GlucNAC_{2},
Man_{8}GlucNAC_{2} y Man_{9}GlucNAC_{2}. También se
encontraron N-glucanos más grandes que
Man_{9}GlucNAC_{2}.
Con CBH I puro, se aislaron oligosacáridos
incluso más pequeños que Man_{5}GlucNAC_{2}. En general, las
cadenas de azúcar de Trichoderma son claramente mucho más
pequeñas que las aisladas a partir de glucoproteínas de
Saccharomyces cerevisiae. Ya que el corte con
\alpha-1,2-manosidasa es
incompleto (figura 8), es muy probable que restos de manosa estén
presentes en uniones diferentes a la unión
\alpha-1,2 debido a transferencia a productos de
corte mediante una o más transferasas de manosilo.
Con el fin de investigar más en detalle el
parecido entre la síntesis de glucosilo de T. reesei y el
sistema de mamíferos, se trató de localizar la actividad manosidasa
responsable del panel de oligosacáridos sobre las proteínas
fúngicas secretadas. Primero, se comprobó si las manosidasas estaban
presentes en el medio extracelular del hongo, que podría ser al
final responsable del corte "tras la secreción" de los
oligosacáridos sobre otras proteínas secretadas. Se desarrolló un
ensayo para determinar esta actividad tal como sigue: se utilizaron
oligosacáridos de ribonucleasa B de bovino (comercialmente
disponible como un panel de referencia de Oxford Glycosystems) como
sustrato para manosidasas. Se obtiene una conversión completa a
Man_{5}GlucNAC_{2} si suficiente
\alpha-1,2-manosidasa está
presente. Se corta Man_{5}GlucNAC_{2} aún más si
\alpha-1,3 y/o
\alpha-1,6-manosidasas están
presentes. Tras marcar con ANTS, se añadieron los oligosacáridos de
referencia de ribonucleasa B al medio extracelular concentrado en
70 veces de un cultivo de T. reesei de cuatro días (con
células fúngicas eliminadas). Se utilizó un sobrenadante de cultivo
concentrado de cuatro días de Aspergillus saitoi como control
positivo para este ensayo: se sabe que éste microorganismo secreta
diferentes manosidasas (una \alpha-1,2 y una
\alpha-1,3(6)-manosidasa)
cuando se hace crecer sobre medio mínimo que contiene manano como
fuente de carbono (Keskar, S.S. et al., Biotechnology Letters
15:695-690 (1993)). En la figura 7, se demuestra el
resultado de una incubación durante la noche de las mezclas de
reacción: la actividad
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi es claramente detectable. Se corta la mayoría de
oligosacáridos de ribonucleasa B a Man_{5}GlucNAC_{2}. Ninguna
cantidad o sólo cantidades marginales de manosidasa están presentes
en el medio de T. reesei, puesto que el panel de referencia
de ribonucleasa permaneció intacto. Se menciona aquí que T.
reesei secretó muchas más proteínas en su medio mínimo
(aproximadamente 300 \mug/ml) que A. saitoi (apenas
detectable, utilizando el ensayo de Bradford).
Utilizando el mismo panel de oligosacáridos
marcados con ANTS de ribonucleasa B, se encontró actividad
manosidasa intracelular en extractos crudos de T. reesei,
A. saitoi, células de ratón L929 y de S. cerevisiae.
Además se intentó discriminar principalmente entre manosidasas
activas en el tratamiento de glucosilación en el retículo
endoplásmico, en el aparato de Golgi y aquellas activas en vacuolas.
Utilizando centrifugación diferencial o gradientes de sacarosa para
separar orgánulos, preparados a partir de células de T.
reesei, no se obtuvo suficiente resolución de actividades
manosidasa diferentes en orgánulos diferentes. Sin embargo, la
actividad \alpha-1,2 manosidasa estuvo presente
abundantemente en fracciones que se enriquecieron para la actividad
manosiltransferasa. Se hizo la determinación de la actividad
manosiltransferasa tras la adaptación del ensayo, descrita por
Nakajima y Ballou (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72:3912-3916 (1975)). Con mezclas de reacción que
contienen UDP-manosa como donador de azúcar,
Man_{8}GlucNAC marcado con ANTS como sustrato y enzimas de
glucosilación solubilizadas a partir de las preparaciones de
membrana mediante Tritón X 100, se demostró la actividad
manosiltransferasa mediante retardo en la movilidad electroforética
de los oligosacáridos sustrato (no se muestran los resultados).
Los ejemplos anteriores demuestran que es
posible construir oligosacáridos híbridos similares a los de los
mamíferos sobre glucoproteínas secretadas a partir del hongo
filamentoso Trichoderma reesei. Se utilizaron
glucosiltransferasas de mamífero, concretamente
N-acetilglucosaminiltransferasa I humana producida
en células COS,
\beta-1,4-galactosiltransferasa de
leche humana, y
\alpha-2,6-sialiltransferasa de
hígado de rata, para imitar in vitro la ruta de síntesis de
glucosilación tal como ocurre en las células de mamíferos. La
incubación previa con
\alpha-1,2-manosidasa de
Aspergillus saitoi mejoró sustancialmente la incorporación de
GlucNAc sobre las proteínas fúngicas. Con N-glucanos
libres aislados a partir de celulasas de Trichoderma reesei,
se demostró que no todas las cadenas de azúcar se podían convertir
en el sustrato aceptor ideal para GlucNAc Tr I:
Man_{5}GlucNAC_{2}. La mayoría de los oligosacáridos unidos a N
se asemejan a las estructuras ricas en manosa presentes en ciertas
proteínas de células de mamífero, oscilando predominantemente desde
Man_{5}GlucNAC_{2} hasta Man_{9}GlucNAC_{2}. Con CBH I
puro, obtenido tras la fermentación en medio mínimo de
Trichoderma (Nyyssonen et al., 1993) una fracción
sustancial de los oligosacáridos parece ser incluso más pequeña que
Man_{5}GlucNAC_{2}. Utilizando otro medio de fermentación, se
obtuvieron ahora también oligosacáridos más grandes que
Man_{9}GlucNAC_{2}. La movilidad electroforética de CBH I
producida en los diferentes medios también cambió notablemente.
Tras la desglucosilación, el CBH I producido tal como se describe
por Nyyssonen et al., (1993) se desplazó sólo ligeramente
comparado con la forma original tras la separación electroforética
sobre un gel de poliacrilamida. Se necesitó la digestión exhaustiva
(tiempo de incubación prolongado y muchas unidades de
N-glucanasa) para liberar oligosacáridos. Con las
condiciones de crecimiento que se utilizaron, se desglucosiló
fácilmente CBH I, dando lugar a un desplazamiento electroforético
pronunciado comparado con la proteína original (no se muestran los
resultados). Los efectos que factores ambientales pueden tener sobre
la glucosilación de proteínas se describen en profundidad por
Goochee y Monica (Bio/Technology 8:421-427 (1990),
Bio/Technology 9:1347-1355 (1991)). Sus revistas
refuerzan nuestra creencia de que el medio de crecimiento puede ser
la causa de las diferencias en los modelos de glucosilo encontrados
en proteínas
de Trichoderma.
de Trichoderma.
A partir de los experimentos, se elucidó la
localización de la(s) manosidasa(s)
responsable(s) de los pequeños N-glucanos en
proteínas secretadas de Trichoderma. La posibilidad de
secreción de manosidasas que puedan actuar sobre las otras
proteínas fúngicas secretadas parece ser muy poco probable. Incluso
con medio de crecimiento muy concentrado y tras un tiempo de
incubación prolongado, no se produjo corte alguno de los
oligosacáridos
sustrato.
sustrato.
Se supone que el tratamiento en el aparato de
Golgi de Trichoderma se asemeja parcialmente al de células de
mamíferos y parcialmente al de levadura: manosidasas que pueden
cortar de nuevo los N-glucanos de
Trichoderma a Man_{5}GlucNAC_{2} parecen estar presentes.
Por otro lado, también están presentes manosiltransferasas que
pueden transferir residuos de manosa en uniones diferentes de la
unión \alpha-1,2. Se confirmó ésta última
conclusión tras realizar los ensayos de manosiltransferasa, análogos
al descrito por Nakajima y Ballou (1973): utilizando
Man_{8}GlucNAc marcado con ANTS como sustrato, se consiguió
demostrar la incorporación de hasta dos residuos de manosa. Por otro
lado, Man_{5}GlucNAc no fue sustrato para manosiltransferasas. Por
lo tanto, queda la pregunta de si Man_{5}GlucNAC_{2}, la
estructura crucial para la síntesis de estructuras de azúcar
complejas, no será un sustrato para manosiltransferasa(s)
"in vivo" en T. reesei.
Todavía no se sabe cómo de similar a la de
células de mamífero avanza la síntesis de glucosilación en
Trichoderma reesei. Por lo tanto, es difícil evaluar si este
microorganismo se puede manipular fácilmente para tener más, si no
todos, los grupos glucosilo convertidos en estructuras similares a
las de los mamíferos. Los experimentos in vitro son una
primera etapa introductoria para la manipulación de este hongo, de
modo que sintetice oligosacáridos que se pueden convertir en
estructuras complejas de la forma más simple posible. Si las
primeras etapas de la ruta de síntesis de hidratos de carbono
complejos se produjeran in vivo en un hongo, tal como
Trichoderma, se podría realizar la finalización de la ruta de
glucosilación mediante modificación de oligosacáridos enzimática
in vitro sobre proteínas. Se cree que la síntesis de
oligosacáridos a gran escala controlada estéricamente será posible
en el futuro: mucha investigación está en progreso para reducir los
gastos elevados asociados a estas etapas de tratamiento in
vitro (Ichikawa et al., 1992). Finalmente, se puede
mencionar otro aspecto importante que concierne a esta
investigación: el hecho de que un hongo pueda manipularse para
sintetizar estructuras de glucosilo bien definidas y uniformes
sobre sus proteínas secretadas. Para ciertas proteínas, puede
desearse la producción de una glucoforma individual para obtener un
perfil terapéutico uniforme.
\newpage
Se construye un vector de ADN que contiene la
secuencia codificante de GlcNAc Tr I humano (Nº Registro Genbank
M55621; EMBL ID Nº HSGLCNAC) tal como se describió anteriormente, y
de manera que el ADN que provee la secuencia codificante para la
enzima de GlcNAc Tr I se una operativamente al promotor y al
terminador de CBHI. Se transforma tal vector dentro de T.
reesei, utilizando la técnica descrita en el documento EP
244.234, y se seleccionan los transformantes positivos.
Uno de los transformantes positivos se
transforma adicionalmente con un segundo vector, que codifica para
ovoalbúmina en una forma que se secretó a partir del huésped de
Trichoderma, y se seleccionaron los transformantes que
expresaban tanto GlcNAc Tr I como ovoalbúmina.
Se trata ya la ovoalbúmina que se secreta en el
medio de Trichoderma a una primera forma híbrida mediante la
acción intracelular de GlcNAc Tr I. Se trata adicionalmente esta
ovoalbúmina utilizando
\beta-1,4-galactosiltransferasa y
\alpha-2,6-sialiltransferasa, tal
como se describe en el ejemplo 11.
Al igual que en el ejemplo 15, excepto que se
trata la ovoalbúmina con \alpha-manosidasa no
específica tras tratamiento con
\beta-1,4-galactosiltransferasa, o
tras el tratamiento con
\alpha-2,6-sialiltransferasa.
Al igual que en el ejemplo 15 o el ejemplo 16,
excepto que el gen de interés codifica para eritropoyetina (EPO),
coriogonadotropina humana (HCG), folitropina (FSH), tirotropina
(TSH), lutropina (LH), molécula de adhesión celular neural (NCAM),
tenascina, trombospondina, fibronectina, hormonas, citocinas,
interleucina-4, interferona gamma, factores de
crecimiento, proteínas de plasma, factores de coagulación,
receptores solubles, un anticuerpo, factor estimulador de colonias
de granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
factor de crecimiento endotelial vascular, glucoproteína gp120 del
virus VIH, proteínas de cubierta virales, inmunoglobulina D,
antitrombina III\beta, plasminógeno, factor von Willebrand,
fibrinógeno, globulina que se une a corticosteroide, globulina que
se une a tiroxina, proteína que se une a folato, fibronectina,
osteonectina de hueso y plaquetas, receptor de EGF, receptores de
insulina y de factor de crecimiento similar a insulina I, receptor
de factor de crecimiento de fibroblastos básico, linfocitos CD2,
moléculas de CMH de clase II, transportadores de glucosa, proteína
eritrocitaria de banda 3, receptores \beta-2
adrenérgicos, receptor de transferrina, receptor de VIP, proteína
de CMH de clase I de membrana, receptor de vasopresina de células
LLC-PK1, receptor de lipoproteína de baja densidad,
receptor de asialoglucoproteína, proteína CD4, receptor de
tirotropina, receptor de PDGF, concanavalina A de judía de caballo,
factor de veneno de cobra, lactotransferrina, factor de apareamiento
de cloroplasto de espinaca, mucina de la glándula submaxilar,
lactasa-florizina hidrolasa del borde en cepillo
intestinal, glucoproteína anticongelante de pez del ártico, receptor
de LDL, glucoforina A o \beta-HCG, una subunidad
de péptido de cualquiera de las anteriores o un fragmento funcional
de cualquiera de las
anteriores.
anteriores.
Se produce una proteína de interés,
especialmente una descrita en los ejemplos 15 y 17, en una levadura
seleccionada a partir de Pichia spp (especialmente Pichia
pastoris), Hansenula spp (especialmente Hansenula
polimorfa), Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolítica, o
S. cerevisiae y se trata tal como se describe en el ejemplo
12 con una \alpha-1,2-manosidasa
previamente al tratamiento secuencial con GlcNAc Tr I,
\beta-1,4-galactosiltransferasa y
\alpha-2,6-sialiltransferasa.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Información huésped/plásmido
- \quad
- Nº almacenamiento: 3124
- \quad
- Tipo de bacteria huésped: MC1061
- \quad
- Plásmido ayudante (helper):
- \quad
- Resistencia huésped/plásmido: amp
- \quad
- Temperatura: 37ºC
- \quad
- Información adicional:
\hrule
Descripción del plásmido
- CG:
- preMF\alpha1/hGlcNAc-Tl (fusión de la secuencia señal prepro de secreción del gen del factor 1 de apareamiento \alpha de S. cerevisiae al fragmento de ADNc humano que codifica para N-acetilglucosaminiltransferasa I madura)
\vskip1.000000\baselineskip
- SN:
- 3124
- RU:
- uso restringido
\vskip1.000000\baselineskip
- PG:
- EU-VARIA
- SF:
- p3124.SEQ
\hskip0,1cmDT:{}\hskip6,8cmLU:
FT: | Código | Iniciación | Terminación | Descripción | Comentarios |
LEN | 6230U | PLÁSMIDO DE LONGITUD | |||
CLO | 1D | 170D | rGlBf | PARTE EXÓN | |
3+3UTR+poliR DE \beta-GLOBINA DE CONEJO | |||||
CLO | 171D | 529D | 3FR | REGIÓN FLANQUEANTE EN | |
3' DE GEN DE \beta-GLOBINA DE CONEJO | |||||
PRO | 689D | 605D | lac | PROMOTOR | |
ORI | 747D | 948D | SVORI | FRAGMENTO DE SV40 QUE CONTIENE | |
ORI BIDIRECCIONAL | |||||
SIG | 951D | 1025D | poliA | SEÑAL DE poliA DE LA REGIÓN | |
TEMPRANA DE SV40 | |||||
SIG | 1025D | 951D | poliA | SEÑAL DE poliA DE LA REGIÓN | |
TARDÍA DE SV40 | |||||
ORI | 1540U | 1140U | ORI | PLÁSMIDO ORIGEN | |
SEL | 2943D | 2083D | AMP | GEN DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS | |
CLO | 3053D | 3460D | hCMV | POTENCIADOR DE hCMV-IE | |
PRO | 3472U | 4705D | Ac | PROMOTOR DE \beta-ACTINA DE POLLO | |
SIG | 4721D | 4975D | preMF | SECUENCIA PREPRO DEL FACTOR 1 DE | |
APAREAMIENTO \alpha DE S. cerevisiae | |||||
GEN | 4976D | 6190D | GNTlf | SECUENCIA MADURA QUE CONTIENE | |
EL FRAGMENTO hGlcNAC-Tl |
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- HC:
- E.coli
- \quad
- Células de mamíferos (células COS para expresión transitoria; otras para transformación permanente)
\hskip0.2cmIM:
- OR:
- Eco-pMB1
- \quad
- SV40
- PC:
- pCAGGS; pSCGAL1MF3; pUChGNTl1
- PR:
- hCMV-IE (potenciador del promotor)
- \quad
- CHl-Ac
- \quad
- Eco-lac
- RB:
- Eco-lacZ
- RF:
- Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9948-9952
- \quad
- Marleen Maras y Roland Contreras
- RK:
- Iniciación de la secuencia de nucleótidos en la mitad del sitio EcoRI.
- \quad
- Este plásmido se construyó tal como sigue: 1) se ligó el fragmento XbaI-StuI de pSCGAL1MF3, que contenía la secuencia señal prepro de secreción del gen del factor 1 de apareamiento \alpha de S. cerevisiae, al fragmento de vector XbaI-Eco47III de pUChGNTl1; 2) se digirió entonces esta construcción intermedia con HindIII y EcoRI, se rellenaron los extremos cohesivos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se añadieron ligadores de EcoRI (5'-CGGAATTCCG-3'); 3) finalmente, se digirió este fragmento EcoRI-EcoRI con XbaI y EcoRI y el fragmento XbaI-EcoRI resultante se insertó en el vector pCAGGS digerido con XbaI-EcoRI.
- \quad
- Este plásmido de expresión porta una fusión de la secuencia señal prepro de secreción del gen del factor 1 de apareamiento \alpha de S. cerevisiae que codifica para N-acetilglucosaminiltransferasa I, clonado en la orientación sentido con respecto al promotor de \beta-actina de pollo, que está precedido por la secuencia potenciadora CMV-IE.
- \quad
- La secuencia de nucleótidos del gen GlcNAc-Tl humano se obtuvo de la base de datos de secuencias de nucleótidos EMBL (Nº de registro M55621).
- SE:
- Amp
\hskip0.2cmTE:
\hskip0.2cmVS:
\hskip0.2cmSD:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Información huésped/plásmido
- \quad
- Nº de almacenamiento: 3123
- \quad
- Tipo de bacteria huésped: MC1061
- \quad
- Plásmido ayudante:
- \quad
- Resistencia huésped/plásmido: amp
- \quad
- Temperatura: 37ºC
- \quad
- Información adicional:
\hrule
Descripción del plásmido
- CG:
- preMF \alpha1 (señal prepro de secreción del gen del factor 1 de apareamiento \alpha de S. cerevisiae)
\vskip1.000000\baselineskip
- SN:
- 3123
- RU:
- -
\vskip1.000000\baselineskip
- PG:
- LEVADURA
- SF:
- p3123.SEQ
\hskip0,1cmDT:{}\hskip6,8cmLU:
FT: | Código | Iniciación | Terminación | Descripción | Comentarios |
LEN | 3477U | PLÁSMIDO DE LONGITUD | |||
GEN | 451D | 238D | lacZ | ADN de lacZ\alpha | |
SIG | 716D | 452D | preMF | SECUENCIA PREPRO DEL FACTOR 1 DE | |
APAREAMIENTO \alpha DE S. cerevisiae | |||||
PRO | 1211U | 828D | GAL1 | PROMOTOR | |
PRO | 1382U | 1299D | lac | PROMOTOR | |
ORI | 1860U | 1470U | ORI | PLÁSMIDO ORIGEN | |
SEL | 3277D | 2417D | AMP | GEN DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS |
\vskip1.000000\baselineskip
- HC:
- E.coli
\hskip0.2cmIM:
- OR:
- Eco-pMB1
- PC:
- pSCGAL1MF2
- PR:
- Sce-GAL1
- \quad
- Eco-lac
- RB:
- Eco-lacZ
- RF:
- Peter Impe y Roland Contreras
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- RK:
- Iniciación de la secuencia de nucleótidos entre el gen de resistencia a ampicilina y el ADN de lacZ.
- \quad
- Este plásmido se construyó tal como sigue: se abrió pSCGAL1MF2 con AccI, se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se ligó. De esta manera, se pierden los sitios HindIII y Sall del poliligador, y se crea un sitio NruI en el poliligador, y se convierte en único el sitio HindII dentro de la señal prepro de secreción del gen 1 del factor de apareamiento \alpha de S. cerevisiae.
- \quad
- U-MamI sólo corta en cepas gram negativas.
- SE:
- amp
\hskip0.2cmTE:
- VS:
- PLÁSMIDO
\hskip0.2cmSD:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información huésped/plásmido
- \quad
- Nº de almacenamiento: 2453
- \quad
- Tipo de bacteria huésped: MC1061
- \quad
- Plásmido ayudante:
- \quad
- Resistencia huésped/plásmido: amp
- \quad
- Temperatura: 37ºC
- \quad
- Información adicional:
\hrule
Descripción del plásmido
\hskip0.2cmCG:
\vskip1.000000\baselineskip
- SN:
- 2453
- RU:
- Uso restringido
\vskip1.000000\baselineskip
- PG:
- EU-VARIA
- SF:
- pCAGGS.SEQ
\hskip0,1cmDT:{}\hskip6,8cmLU:
FT: | Código | Iniciación | Terminación | Descripción | Comentarios |
LEN | 4818U | PLÁSMIDO DE LONGITUD | |||
CLO | 10D | 182D | rGIBf | PARTE EXÓN | |
3+3UTR+poliR DE \beta-GLOBINA DE CONEJO | |||||
CLO | 183D | 541D | 3FR | REGIÓN FLANQUEANTE EN | |
3' DE GEN DE \beta-GLOBINA DE CONEJO | |||||
PRO | 701U | 618D | lac | PROMOTOR | |
ORI | 859U | 961D | SVORI | FRAGMENTO SV40, QUE CONTIENE | |
ORI BIDIRECCIONAL | |||||
SIG | 953D | 1037D | poliA | SEÑAL poliA DE LA REGIÓN | |
TEMPRANA de SV40 | |||||
SIG | 1037D | 963D | poliA | SEÑAL poliA DE LA REGIÓN | |
TARDÍA DE SV40 | |||||
ORI | 1555U | 1145U | ORI | PLÁSMIDO ORIGEN | |
SEL | 2955D | 2095D | AMP | GEN DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS | |
CLO | 3095D | 3472D | CMV | POTENCIADOR DE CMV-IE | |
PRO | 3464U | 4819D | AG | PROMOTOR HÍBRIDO DE | |
\beta-ACTINA/ \beta-GLOBINA: VÉASE RK |
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- HC:
- E.COLI
- \quad
- Células de mamíferos (células COS para expresión transitoria; otras para transformación permanente)
\hskip0.2cmIM:
- OR:
- Eco-pMB1
- \quad
- SV40
- PC:
- puc13; pAGS-3 (ninguno de ellos está presente en las existencias físicas)
- PR:
- CHI/RAB-AG
- \quad
- hCMV-IE (potenciador del promotor)
- \quad
- Eco-lac
- RB:
- Eco-lacZ
- RF:
- Este plásmido fue una donación del Prof. J. Miyazaki (Universidad de Tokio, Japón).
- \quad
- Niwa et al., Gene 108 (1991), 193-200
- \quad
- Peter Vanhoenacker
- RK:
- Iniciación de la secuencia de nucleótidos en la mitad del sitio EcoRI no único.
- \quad
- La secuencia de nucleótidos del plásmido se reconstruyó según la información en la publicación de Niwa et al., 1991. Se verificaron experimentalmente los siguientes sitios de restricción (Marc Van de Craen y Vera Goossens): BgIII, BsaAI, HindII, MstiI, NcoI, SspI, PvuII, XbaI y XhoI. Este plásmido es útil para una expresión altamente eficaz de los genes bajo el control del promotor híbrido de \beta-actina/\beta-globina de conejo + el potenciador de CMV-IE en varias células de mamíferos.
- \quad
- pCAGGS porta un promotor de \beta-actina de pollo modificado: la secuencia aceptora de empalme de la región de promotor de \beta-actina se sustituye por un fragmento de \beta-globina de conejo que contiene una parte en 3' del segundo intrón y una parte en 5' del tercer exón. El promotor híbrido de \beta-actina/\beta-globina resultante se designa como el promotor AG.
- \quad
- U-BcII sólo corta en cepas gram negativas.
- SE:
- amp
\hskip0.2cmTE:
- VS:
- LANZADERA
\hskip0.2cmSD:
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para modificar restos de hidratos de carbono
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGGATGCT GAAGAAGCAG TCTGCA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGTCGACA GGTGCTAATT CCAGCTAG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Lys Lys Gln Ser Ala Gly Leu Val Leu
Trp Gly Ala Ile Leu}
\sac{Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu
Phe Phe Trp Thr Arg Pro}
\sac{Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 255 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..255
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Procedimiento para producir una glucoproteína
híbrida, caracterizada porque dicho procedimiento comprende
cultivar un hongo filamentoso de manera que produzca una
glucoproteína del tipo rica en manosa que es un sustrato aceptor
para GlcNAc Tr I, y hacer reaccionar dicha glucoproteína del tipo
rica en manosa con GlcNAc Tr I.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una proteína
que es homóloga a dicho hongo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una proteína
que es heteróloga a dicho hongo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho hongo es Trichoderma o Aspergillus.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho hongo es Trichoderma reesei, Aspergillus
niger o Aspergillus oryzae.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa se hace
reaccionar con GlcNAc Tr I intracelularmente en dicho hongo.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa se hace
reaccionar con
\alpha-1,2-manosidasa.
8. Procedimiento para producir una glucoproteína
híbrida en una levadura u hongo filamentoso, caracterizado
porque dicho procedimiento comprende
- (a)
- hacer reaccionar una glucoproteína del tipo rica en manosa producida en una levadura u hongo filamentoso con una \alpha-1,2-manosidasa in vivo; y
- (b)
- hacer reaccionar la glucoproteína de la etapa (a) con GlcCAc Tr I.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la etapa (8) se produce intracelularmente.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha levadura se selecciona del grupo que consiste en un
miembro de Pichia spp., Hansenula spp.,
Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, y Yarrowia
lipolytica.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha Pichia spp. es Pichia pastoris.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha Hansenula spp. es Hansenula
polymorpha.
13. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha levadura es S. cerevisiae.
14. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicho hongo es Trichoderma o Aspergillus.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que dicho hongo es Trichoderma reesei, Aspergillus
niger o Aspergillus oryzae.
16. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 8, en el que la glucoproteína del tipo rica en manosa
se hace reaccionar con una UDP-GlcNAc.
17. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 8, que comprende además hacer reaccionar dicha
glucoproteína híbrida con
\beta-1,4-galactosiltransferasa.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con
UDP-galactosa.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
que comprende además hacer reaccionar dicha glucoproteína híbrida
con
\alpha-2,6-sialiltransferasa.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con CMP-ácido
siálico.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 17-20, en el que dichas etapas de
reacción se llevan a cabo in vitro.
22. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con una
\alpha-1,2-manosidasa antes de
dicha reacción con GlcNAc Tr I.
23. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 8, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en
manosa es una Man_{5}GlcNAc_{2} que tiene la estructura
24. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 8, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en
manosa es una
Glc-NAc-Man_{5}GlcNAc que tiene la
estructura
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