DE69635948T2

DE69635948T2 - Methoden zur modifikation von kohlenhydratanteilen

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Publication number: DE69635948T2
Application number: DE69635948T
Authority: DE
Inventors: Marleen Maras; Roland Contreras
Original assignee: AB Enzymes GmbH
Current assignee: AB Enzymes GmbH
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1996-01-02
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2016-01-03
Also published as: ES2260768T3; PT799318E; EP1715057A2; US5834251A; DK0799318T3; EP1715057A3; EP0799318B2; ES2260768T5; DE69635948T3; DK0799318T4; EP0799318B1; AU4348696A; DE69635948D1; ATE321146T1; WO1996021038A1; EP0799318A1

Description

Die Erfindung ist auf ein Verfahren zum Umwandeln der Glycosylierungsmuster bei Proteinen und rekombinant hergestellten Proteinen, insbesondere therapeutischen Proteinen, gerichtet, die ein Hybrid- oder komplexes Muster haben. Das Verfahren beinhaltet das Kultivieren eines Fadenpilzes oder einer Hefe, um ein Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt zu produzieren, das ein Akzeptorsubstrat für GlcNac Tr I ist. Das Verfahren beinhaltet auch das Umsetzen eines Glycoproteins des Typs mit hohem Mannosegehalt mit einer α-1,2-Mannosidase und GlcNac Tr I in einer Hefe oder einem Fadenpilz, um ein Hybridglycoprotein herzustellen.
Die Glycosylierung beeinflusst viele Eigenschaften eines Glycoproteins, einschließlich der richtigen Proteinfaltung, der Protease-Beständigkeit/-Empfindlichkeit, des intrazellulären Transports und der Kompartimentierung, der Sekretion, der inter- und intra-molekulären Assoziationen, der intermolekularen Affinitäten, des Gewebe-Targeting ("tissue targeting") und der biologischen Halbwertszeit. Die Glycosylierungsmuster können auch signifikant die biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit, die Löslichkeit, die Clearance, die intermolekulare Aggregation und die Antigenität, insbesondere von jenen Proteinen, die therapeutisch in vivo verabreicht werden, verändern.
In den Patenten US 5,324,663 und US 5,272,066 werden Syntheseverfahren zum Modifizieren von Oligosaccharidstrukturen in Glycoproteinen beschrieben.
Die rekombinante Herstellung vieler Proteine kann ihr Glycosylierungsmuster stark verändern. Proteine, die in Bakterien exprimiert werden, sind völlig unglycosyliert. Bäckerhefe-Glycosylierungsmuster sind nicht äquivalent zu ihren Säugetier-Gegenstücken und sind hoch antigen bei Säugern (C.E. Ballou, 1982. J.N. In Strathern et al. (Herausg.). The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Metabolism and Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, S. 335-360).
In ähnlicher Weise werden nicht-komplexe Glycosylanteile beobachtet, wenn Insektenzellen, wie das weit verbreitete Sf9-Baculovirusexpressionssystem, verwendet werden, um Säugetierproteine zu exprimieren (Davidson et al., Biochemistry, 29:2828-2838 (1990; O.P. Bahl et al., in Cell Surface and Extracellular Glycoconjugates – Structure and Function, D.D.Roberts et al., Hrsg., Academics Press, Inc. 1993, S. 245-270). Oligosaccharide mit hohem Mannose- (Man)-Gehalt und Hybridoligosaccharide werden an Proteine synthetisiert, die in Insektenzellen produziert werden. Die Primärstrukturen dieser Glycane sind nicht verschieden von jenen, die an bestimmten Säugetierproteinen, wie Ribonuclease B, Thyroglobin, Gewebe-Plasminogen-Aktivator gefunden wurden (letzterer hat einen gemischten Bestand von Strukturen mit hohem Mannosegehalt und komplexen Strukturen an seiner Glycosylierungsstelle).
Kleine Säugetierzellkulturen sind praktisch für die Verwendung in Laborversuchen zur Säugetiergenexpression. Jedoch sind die Kosten und die Schwierigkeiten der Expression großer Mengen therapeutischer rekombinanter Glycoproteine in Säugetierzellkulturen untragbar. Daher gibt es einen Bedarf für einen Wirt, der in der Lage ist, große Mengen rekombinanter Proteine zu produzieren, die ein Glycosylierungsmuster besitzen oder modifiziert werden können, so dass sie ein Glycosylierungsmuster besitzen, das demjenigen ähnlich ist, das durch Säugetierzellen produziert wird.
Fadenpilze, z.B. Trichoderma, haben bestimmte Vorteile als rekombinante Wirte. Es ist einfach, große Mengen dieser Pilze zu züchten, und sie haben die Fähigkeit, zu glycosylieren und effizient große Ausbeuten rekombinanter Säugetierproteine in das Medium zu sezernieren, was die Isolierung vergleichsweise einfach macht. Zusätzlich ist das Glycosylierungsmuster bei solchen Proteinen dem menschlichen ähnlicher als das der Bäckerhefe. Jedoch gibt es immer noch Unterschiede, die den Wildtyppilz-Glycosylierungsmustern einen strukturellen und funktionellen Nachteil bringen, wenn in vivo die Wirksamkeit eines Proteins einen spezifischen Glycosylierungstyp erfordert. Zum Beispiel sind terminale Sialsäurereste wichtig für das Funktionieren eines Proteins in einem Säugetiersystem, da sie die Glycoprotein-Clearance aus dem Säugetierblutstrom verhindern. Es wird angenommen, dass der Mechanismus hinter der erhöhten biologischen Halbwertszeit sialylierter Moleküle in ihrer verringerten Erkennung durch Lectine begründet liegt (K. Drickamer, J. Biol. Chem. 263:9557-9560 (1988)). Pilzzellen sind jedoch nicht in der Lage, solche Einheiten hinzuzufügen. Glycoproteine, die in Pilzzellen synthetisiert werden, sind unendständige Sialsäure ("asialic").
Ein weiterer Nachteil, dargestellt durch die Unfähigkeit komplexe Glycoproteinanteile zu erzeugen, liegt in der Gegenwart von terminalen Mannoseresten. Glycoproteine, die mit Mannoseresten enden, sind Liganden für Mannose-bindende Proteine auf Makrophagen und Zellen des reticulo-endothelialen Systems (Ezekowitz et al., J. Cell Sci. Suppl. 9:121-133 (1988)). Während dies für einige eingeschränkte Fälle nützlich sein kann, wie für Targeting-Zwecke, hat dies eine unerwünschte pharmakologische Folge für die meisten rekombinanten Proteine – z.B. die rasche Clearance der Verbindung aus dem Blut. Eine rasche Clearance kann in schädlicher Weise die Pharmakokinetik des verabreichten Mittels beeinflussen und sein therapeutisches Potential verringern oder seine Toxizität erhöhen. Daher erschweren rekombinant hergestellte nicht-komplexe Glycosylierungsmuster die Verwendung von rekombinant hergestellten Glycoproteinen für die therapeutische Verwendung beim Mensch (T. Sareneva et al., Interferon Res. 13:267-269 (1993)).
Diese Nachteile können die biologische oder pharmakologische Nützlichkeit von Säugetierproteinen blockieren, die unter Verwendung eines abschließenden Transformationssystems erzeugt wurden. Daher gab es einen lang verspürten Bedarf in der Glycoprotein-Industrie, Glycosylierungsmuster des Hybrid- oder komplexen Typs auf Glycoproteinen in Pilzwirten bereitzustellen, die in vivo- und/oder in vitro-Modifikationen zugänglich sind, was es ihnen ermöglicht, Glycosylierungsmuster zu produzieren, die ähnlich jenen sind, die bei Proteinen höherer Eukaryoten gefunden wurden.
Als der Bedarf für eine wirtschaftliche Herstellung in großem Maßstab von rekombinanten Proteinen, die ein Säugetierglycosylierungsmuster haben, erkannt wurde, untersuchten die Erfinder die Reifung bzw. Verarbeitung von Glycosylresten in Säugetier- und Pilzzellen. Diese Untersuchungen führten zu der Entdeckung, dass Fadenpilze, wie Trichoderma, in der Lage sind, ein gewünschtes Protein in einer unreifen glycosylierten Vorläuferform ("immature glycosylated precursor form") auszuscheiden, die einer in vitro-Reifung bzw. -Verarbeitung zu einem Säugetierglycosylierungsmuster vom Hybridtyp zugänglich ist. Diese Entwicklung resultierte in der Entwicklung von Verfahren zum Herstellen von Hybrid- und komplexen Proteinglycosylierungsmustern, ähnlich jenen, die in Säugetierwirten gefunden wurden.
Demgemäß wird in einer ersten Ausführungsform das Glycosylierungsmuster eines gewünschten glycosylierten Proteins (Glycoprotein) nacheinander durch Reaktion mit N-Acetylglucosaminyltransferase I (GlcNAc Tr I), Galactosyltransferase und Sialyltransferase modifiziert, um ein Protein, das ein Glycosylierungsmuster des Hybrid- oder komplexen Typs mit terminaler Sialsäure bzw. terminalen Sialsäuren ähnlich demjenigen von Säugetierzellen hat, herzustellen.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform das Glycosylierungsmuster eines gewünschten glycosylierten Proteins nacheinander in einer Hefe oder einem Fadenpilz mit α-1,2-Mannosidase, um die Reaktion mit GlcNAc Tr I zu verbessern, Galactosyltransferase und Sialyltransferase modifiziert, um ein Glycosylierungsmuster des Hybridtyps mit einem terminalen Sialsäurerest bzw. -resten ähnlich demjenigen von Säugetierzellen herzustellen.
Demgemäß werden in einer weiteren Ausführungsform Glycoproteine des Typs mit hohem Mannosegehalt exprimiert in und bevorzugt abgeschieden von einem Fadenpilzwirt, der mit GlcNAc Tr I transformiert wurde, und sie wurden durch aufeinander folgende Reaktion mit Galactosyltransferase und Sialyltransferase modifiziert, um ein Glycosylierungsmuster des Hybridtyps mit terminaler Sialsäure herzustellen, eine Struktur ähnlich derjenigen von Säugetierzellen.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform das Glycosylierungsmuster des gewünschten glycosylierten Proteins, das in einem Pilzwirt, wie einer Hefe oder einem Fadenpilz, vorzugsweise Trichoderma oder Aspergillus, die/der mit α-1,2-Mannosidase und/oder GlcNAc Tr I transformiert wurde, durch aufeinander folgendes Umsetzen eines solchen Proteins mit GlcNAc Tr I, falls erforderlich, und mit Galactosyltransferase und Sialyltransferase modifiziert, um ein Protein herzustellen, das ein Glycosylierungsmuster des Hybridtyps mit einer terminalen Sialsäurestruktur ähnlich derjenigen von Säugetierzellen hat.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform die unreife glycosylierte Form ("immature glycosylated form") eines Glycoproteins des Typs mit hohem Mannosegehalt in einem Pilzwirt, wie eine Hefe oder einem Fadenpilz, vorzugsweise Trichoderma oder Aspergillus, die/der mit einem rekombinanten Gen, das für α-1,2-Mannosidase und/oder GlcNAc Tr I, vorzugsweise Human-GlcNAc Tr I, codiert, transformiert wurde, produziert und wird weiter durch in vitro-Reaktion mit einer nicht-spezifischen Mannosidase modifiziert, um ein Protein in einem in vitro-Schritt herzustellen, das ein mono-antennäres komplexes Glycosylierungsmuster hat.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform jedes der obigen Proteine, das ein Glycosylierungsmuster des Hybridtyps hat, durch Reaktion mit einer α-1,2-, α-1,3- und/oder einer α-1,6-Mannosidase in ein komplexes Muster überführt.
1. Figur ist ein Schaubild, das die Umwandlung von Oligosacchariden mit hohem Mannosegehalt (Glycosylstrukturen) in Hybridoligosaccharide nach der Reaktion der Strukturen mit hohem Mannosegehalt mit α-1,2-Mannosidase, GlcNAc Tr I, β-1,4-Galactosyltransferase (gezeigt als Gal Tr) und α-2,6-Sialyltransferase (gezeigt als NeuNAc T) veranschaulicht. Die Umwandlung eines Pilzglycoproteins mit Oligosacchariden mit hohem Mannosegehalt (Glycosylstrukturen) in Hybridstrukturen erfolgt als ein Ergebnis dieser illustrieren Reihe von Reaktionen.
1A. ist ein Schaubild, das die Umwandlung von Hybridoligsacchariden (Glycosylstrukturen) zu Oligosacchariden des komplexen Typs nach der Reaktion der Hybridstrukturen mit einer aspezifischen (nicht-spezifischen) α-Mannosidase darstellt.
2. 2 zeigt eine Karte des Plasmids pCAGGS. Die Hauptabschnitte sind Längen von 1000 bp, die Unterabschnitte sind Längen von 200 Basen. Die Länge ist näherungsweise 4811 bp. AG:β-Actin/β-Globin-Hybridpromotor; SVORI: bidirektionaler Ursprung von SV40; RBS: lac-Operon-Ribosomenbindungsstelle; PolyA: PolyA-Signal des früheren SV40-Bereichs (Pfeil im Uhrzeigersinn) oder des späteren Bereichs (Pfeil entgegen des Uhrzeigersinns); Ori: Eco-pMBI-Ursprung oder Plasmidreplikation; AMP: Ampicillin-Resistenzgen; CMV: CMV-IE-Enhancer; lac: lac-Promotor; rGBf (Plasmidbasen 10-182): partiales Exon 3 und 3'-untranslatierter Bereich und PolyA-Bereich des Kaninchen-β-Globin-Gens; 3FR (Plasmidbasen 183-541): 3'-flankierender Bereich des Kaninchen-β-Globin-Gens.
3. Figur zeigt eine Karte des Plasmids pSCGAL1MF3. Die Hauptabschnitte sind Längen von 500 bp, die Unterabschnitte sind Längen von 100 Basen. Die Länge ist näherungsweise 3477 bp. AMP: Ampicillin-Resistenzgen; ORI: Ursprung der Plasmidreplikation (Eco-pMB1); lac: lac-Promotor; RBS: lac-Operonribosomenbindungsstelle; GAL1: Gal1-Promotor; PREMF: α-Mating-Faktor 1-Präprosequenz, lacZ: LacZα-Gen.
4. Figur zeigt eine Karte des Plamids pCAMFhGNTIf₁, enthaltend ein Humangenfragment, das für N-Acrylglucosaminyltransferase I (hGlcNAc-Tr I) codiert. Die Hauptabschnitte sind Längen von 1000 bp, die Unterabschnitte sind Längen von 200 Basen. Die Länge ist näherungsweise 6223 bp. AMP: Ampicillin-Resistenzgen; ORI: Ursprung der Plasmidreplikation (Eco-pMB1); lac: lac-Promotor; RBS: lac-Operon-Ribosomenbindungsstelle; PREMF: α-Mating-Faktor 1-Präprosequenz; rGBf (Plasmidbasen 1-170): partielles Exon 3 und 3'-untranslatierte Region und PolyA-Bereich des Kaninchen-β-Globingens; 3FR: (Plasmidbasen 171-530): 3'-flankierende Region des Kaninchen-β-Globingens; SVORI: bidirektionaler Ursprung der Replikation von SV40; PolyA-Signal der frühen SV40 (Pfeil im Uhrzeigersinn) oder späten Region (Pfeil entgegen des Uhrzeigersinns), CMV: CMV-IE-Enhancer; Ac: Huhn-β-Actin-Promotor.
Die 4A, 4B, 4C und 4D zeigen die sequenzielle Konstruktion von pCMFhGNTIf1. Alle Abkürzungen sind wie oben. 4A stellt graphisch die Insertion des hGNTI-Fragments in pUC18 dar; 4B stellt graphisch die Extraktion des GAL1-PREMF-Fragments aus pSCGALIMF3 und seine Insertion in pUC18 dar; 4C stellt graphisch die Konstruktion des pUC18-Plasmids dar, das die hGNTI-Sequenz (ohne ihre Signalsequenz) nach der PREMF-Signalsequenz enthält; und 4D stellt graphisch die abschließende Konstruktion von pCAMFhGNTIf1 dar, durch Insertieren des PREMF-hGNTI-Fragments, das aus dem in 4C konstruierten Vektor entnommen worden war, in pCAGGS.
5. 5 zeigt ein Autoradiogramm, das nach Exposition eines Röntgenstrahl-Films gegenüber radioaktiv markierten Glycoproteinen erhalten wurde, die mittels einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt worden waren. Die folgenden GlcNAc Tr I-Substrate wurden wie angemerkt zugefügt: Spur 1: kein Substratprotein zugefügt; Spur 2: Humantransferrin als Negativkontrolle zugefügt; Spur 3: S. cerevisiae-Invertase als eine Negativkontrolle zugefügt; Spur 4: Ovalbumin als eine Positivkontrolle zugefügt; Spur 5: Cellulasen von Trichoderma; Spur 6: Proteine, die von der T. reesei-Mutante RUTC 30 sezerniert wurden.
6. 6 zeigt ein Autoradiogramm, das nach Exposition eines Röntgenstrahlfilms gegenüber radioaktiv markierten Oligosaccharidstrukturen erhalten wurden, die auf einer Dünnschichtchromatographie-Platte (DC) getrennt worden waren. Das Folgende wurde zu dem GlcNAc Tr I enthaltenen Reaktionsgemisch zugefügt: Spur 1: keine Oligosaccharide zu der Reaktion zugefügt; Spuren 2 und 3: Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt aus der Ribonuclease B-Hydrazinolyse, Oxford Glycosystems, (Spur 2) und Man₅Gn auf Mannosidose-Urin, Sanbio, (Spur 3) wurden als Positivkontrollen umgesetzt; Spur 4: Oligosaccharide, die von Trichoderma-Cellulasen isoliert wurden; Spur 5: Oligosaccharide, die von den von der T. reesei-Mutante RUTC 30 abgeschiedenen Proteinen isoliert wurden; Spur 6: Glycosylstrukturen, die von der S. cerevisiae-Invertase freigesetzt wurden, als Negativkontrolle.
7. 7 zeigt ein Autoradiogramm, das nach Exposition eines Röntgenstrahl-Films gegenüber radioaktiv markierten Glycoproteinen erhalten wurde, die mittels einer 12,5 %igen SDS-PAGE getrennt worden waren. Spur 1: der Einbau von radioaktiver 2-Desoxy-2- N-acetylamino-D-glucose (GlcNAc) in CBH I ist gezeigt; Spur 2: eine deutliche elektrophoretische Verschiebung von CBH I wird als die Folge des Einbaus der radioaktiven Sialsäure gezeigt.
8. 8 zeigt die elektrophoretische Trennung von ANTS-Oligosacchariden, die aus T. reesei RUTC 30-Glycoproteinen hergestellt wurden. Spur 1: der CBH I-Verdau; Spur 2: CBH I-Oligosaccharide, die mit A. saitoi-α-1,2-Mannosidase behandelt wurden; Spur 3: Verdau von einem Gemisch aus von T. reesei RUTC 30 sezernierten Proteinen; Spur 4: analog zu Spur 3, aber mit α-1,2-Mannosidase-Behandlung; Spur 5: Rinder-Ribonuclease B-Verdau; M: Molekulargewichtsmarker (a: Maltotetraose; b: Maltopentaose; c: Maltohexaose; d: Maltoheptaose; e: Maltooctaose; f: Maltononaose).
9: 9 zeigt ein Autoradiogramm eines Dünnschichtchromatogramms wie oben, mit dem freie Oligosaccharide getrennt wurden, die mit α-1,2-Mannosidase vorhandelt wurden und nachfolgend mit GlcNAc Tr I und UDP-(¹⁴C)GlcNAc (Uridindiphospho-2-desoxy-2-N-acetylamino-D-¹⁴C-glucose) behandelt wurden. Zu den GlcNAc Tr I-Reaktionsgemischen wurde das folgende zugefügt: Spur 1: Oligosaccharide wurden nicht zugefügt; Spur 2: Man₅GlcNAc (Sanbio), ein Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tri I, wurde als Positivkontrolle zugefügt; Spuren 3 bzw. 4: S. cerevisiae-Invertase-Oligosaccharide nicht vorbehandelt und vorbehandelt mit α-1,2-Mannosidase; Spur 5 bzw. 6: Oligosaccharide aus Trichoderma-Cellulasen (Fluka, Buchs, Schweiz) nicht vorbehandelt und vorbehandelt mit α-1,2-Mannosidase; Spur 7 bzw. 8: Oligosaccharide der t. reesei-Mutante RUTC30 nicht vorbehandelt und vorbehandelt mit α-1,2-Mannosidase.
10. 10 zeigt ein Autoradiogramm einer SDS-PAGE, mit der Glycoproteine getrennt wurden, die mit GlcNAc Tr I und UDP-(¹⁴C)GlcNAc, mit oder ohne "Vorbehandlung" mit A. Saitoi α-1,2-Mannosidase, umgesetzt wurden. Spur 1 bzw. 2: kein Proteinakzeptorsubstrat ohne und mit α-1,2-Mannosidase-Behandlung; Spur 3 bzw. 4: Transferrin ohne und mit Vorhandlung mit α-1,2-Mannosidase; Spur 5 bzw. 6: S. cerevisiae-Invertase ohne und mit Vorhandlung mit α-1,2-Mannosidase; Spur 7 bzw. 8: Ovalbumin ohne und mit Vorbehandlung mit α-1,2-Mannosidase; Spur 9 bzw. 10: Trichoderma-Cellulasen (Fluka, Buchs, Schweiz) ohne und mit Vorbehandlung mit α-1,2-Mannosidase.
11. 11 zeigt ein Autoradiogramm eines 12,5 %igen SDS-PAGE-Gels, das verschiedene Proteine enthielt, die mit GlcNAc Tri I und UDP-(¹⁴C) GlcNAc umgesetzt wurden. Spur 1 ist α-Amylase aus Aspergillus oryzae. Spur 2 ist α-Amylase aus Aspergillus niger. Spur 3 ist ein Ovalbumin (Positivkontrolle). Spur 4 ist kein Protein (Negativkontrolle). Spur 6 ist Papain, verdaut mit Cellobiohydrolase I aus Trichoderma reesei RUTC 30. Spur 7 ist eine Galactosidase, isoliert aus Aspergillus oryzae. Die Marker (M) sind "rainbow"-[¹⁴C]markierte Markerproteine von Amersham, Buckinghamshire, GB.
12. 12 zeigt ein Autoradiogramm eines Dünnschichtchromatogramms, das die Bildung von Hybridstrukturen auf dem Oligosaccharidlevel zeigt. Spur 1 zeigt *GlcNAc, übertragen auf Man₅GlcNAc₂ aus Ribonuclease B. Spur 2 zeigt *Gal verbunden mit *GlcNAc auf kommerziellem Man₅GlcNAc₂. Spur 3 zeigt *Sialsäure übertragen auf *Gal verbunden mit *GlcNAc auf kommerziellem Man₅GlcNAc₂. Die Spuren 4, 5 und 6 sind analog zu den entsprechenden Spuren 1, 2 bzw. 3, aber die Akzeptorsubstrate sind N-Glycane, die aus Proteinen freigesetzt wurden, die von Trichoderma reesei RUTC 30 sezerniert wurden.
In der folgenden Beschreibung wird Bezug auf verschiedene Methoden genommen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekulargenetik, Mikrobiologie und allgemeinen Biologie bekannt sind. Veröffentlichungen und andere Materialien, die solche bekannten Methoden darlegen, auf die Bezug genommen wird, sind hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen, als ob sie zur Gänze dargelegt seien.
Allgemeine Prinzipien der Glycoproteinbiologie und der Strukturanalyse von Glycoprotein sind z.B. in Glycoprotein Analysis in Biomedicine, herausgegeben durch E.F. Hounsell, Humana Press, Totowa, New Jersey (1993) und in Cell Surface and Extracellular Glycoproteins, Structure and Function, herausgegeben durch D.,D. Roberts und R.P. Mecham, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1993), dargelegt.
Allgemeine Prinzipien der Biochemie und Molekularbiologie der Fadenpilze und von Trichoderma sind z.B. in D.B. Finkelstein et al., Hrsg., Biotechnology of Filamentous Fungi: Technology and Products, Butterworth-Heinemann, Verlag, Stoneham, MA (1992) und J.W. Bennett et al., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press – Harcourt Brace Jovanovich, Verlag, San Diego, CA (1991) dargelegt.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein durch einen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. In der Beschreibung, die folgt, wird eine Zahl von Begriffen, die in der Glycoprotein-Technologie verwendet werden, weitreichend verwendet. Um für ein klares und übereinstimmendes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche zu sorgen, einschließlich des Rahmens, der solchen Begriffen gegeben wird, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
"Glycosylierungsmuster" bezieht sich auf eine charakteristische Struktur, Zahl oder Stelle von Oligosaccharidstrukturen, die mit einem Makromolekül, wie ein Protein, assoziiert sind, oder die typisch für einen speziellen Zelltyp oder eine Spezies sind.
"Wildtyp"-Glycosylierungsmuster" bezieht sich auf die charakteristische native Struktur, Zahl oder den Ort von Oligosaccharidstrukturen, die mit einem Makromolekül, wie ein Protein, assoziiert sind, oder die bei einem speziellen Zelltyp oder eine Spezies gefunden wurden.
"O-verknüpfte" Oligosaccharide sind jene Oligosaccharide, die über Threonin oder Serin an eine Peptidhauptkette gebunden sind.
"N-verknüpfte" Oligosaccharide sind jene Oligosaccharide, die über Asparagin, mittels einer Asparagin-N-acetylglucosamin-Verknüpfung, an eine Peptidhauptkette gebunden sind. Die N-verknüpften Oligosaccharide werden auch "N-Glycane" genannt. Alle N-verknüpften Oligosaccharide haben eine gemeinsame Pentasaccharidkernstruktur von Man₃GlcNAc₂ (Mannose₃GlucoseNAcetyl₂) (Glucose kann als Glc und Gluc abgekürzt sein). Sie unterscheiden sich in dem Vorhandensein von und in der Zahl von Verzweigungen (auch Antennen genannt) von peripheren Zuckern wie Fucose und Sialsäure.
N-verknüpfte Oligosaccharide werden gemäß ihrer verzweigten Bestandteile eingeteilt. Wenn der verzweigte Bestandteil nur Mannose ist, wird das Oligosaccharid als "N-Glycan mit hohem Mannosegehalt" ("high mannose N-glycan") bezeichnet. Wie hierin verwendet, bedeutet Oligosaccharid oder Glycosylstruktur "mit hohem Mannosegehalt" ("high mannose") oder "des Typs mit hohem Mannosegehalt" (high-mannose type") ein Oligosaccharid mit zusätzlichen Mannoseresten, die an die äußere Kernstruktur Man₃GlcNAc₂ gebunden sind, und ohne Fucose- oder Sialsäurereste an den freien Enden der Oligosaccharidverzweigungen.
Ein "komplexes" Oligosaccharid oder eine "komplexe" Glycosylstruktur oder ein Oligosaccharid oder eine Glycosylstruktur des "komplexen Typs" bedeutet die Struktur eines Oligosaccharids mit typischer Weise zwei bis sechs äußeren Verzweigungen mit einer Sialyllactosaminsequenz, die an die äußere Kernstruktur Man₃GlcNAc₂ gebunden ist. Ein komplexes N-Glycan hat mindestens eine Verzweigung und bevorzugt mindestens zwei, von alternierenden GlcNAc- und Galactose-(Gal) Resten, die in Oligosacchariden enden, wie z.B.: Neu NAc-, NeuAcα2-6GalNAcα1-, NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα1-, NeuAcα2-3/6Galβ1-, 4GlcNAcβ1-, GlcNAcα1-4-Galβ1- (nur Mucine), Fucα1-2-Galβ1- (Blutgruppe H).
Sulfatester können bei Galactose-, GalNAc- und GlcNAc-Resten auftreten und Phosphatester können bei Mannose-Resten auftreten. NeuAc (Neu: Neuraminsäure; Ac: Acetyl) kann O-acetyliert sein oder durch NeuGl (N-Glycolylneuraminsäure) ersetzt sein. Komplexe N-Glycane können auch Substitutionen des "bisecting"-GlcNAc und der Kernfucose (Fuc) innerhalb der Kette haben.
"Hybrid-N-glycane" haben nur Mannose-Reste in dem Manα1-6-Zweig der Kernstruktur und ein oder zwei komplexe Antennen in dem Manα1-3-Zweig.
Ein "Akzeptorsubstrat" ist ein Oligosaccharid, dessen spezielle Struktur von einem Enzym als Substrat erkannt wird, so dass die Reaktion mit einem solchen Enzym bestimmte Zuckerreste zu diesem Akzeptorsubstrat hinzufügt. Zum Beispiel ist das Oligosaccharid Man₅GlcNAc₂ ein Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I, die erste Glycosyltransferase, die an der Bildung eines komplexen Kohlenhydrats beteiligt ist.
Mit einem "unreifen Vorläufer"-Glycosylierungsmuster oder einer "unreifen Vorläufer"-N-Glycanstruktur ist eine Struktur mit hohem Mannosegehalt gemeint. Gemäß der Erfindung können "unreife" Strukturen zu einer Hybridstruktur oder einer Struktur des komplexen Typs "gereift" werden, durch Behandeln mit Enzymen, die die geeigneten Einheiten der Hybridoligosaccharide oder der Oligosaccharide des komplexen Typs mit oder ohne der Entfernung der Mannose-Reste, wie erforderlich, hinzufügen.
Mit "sequenziell" modifiziert ist gemeint, dass eine Oligosaccharid-(Glycan)-Struktur enzymatisch in einer geordneten Weise modifiziert wird, wobei zwei oder mehr enzymatische Reaktionen derart beteiligt sind, dass mindestens eine Reaktion der anderen vorausgeht. Dies wird auch als eine "Kaskaden"-Serie von enzymatischen Reaktionen bezeichnet.
Mit "Umsetzen eines Proteins mit einem Enzym" ist gemeint, dass das Protein in einem Reaktionsgemisch bereitgestellt wird, das alle benötigten Komponenten enthält, um die inhärente Aktivität des Enzyms zu katalysieren, um ein solches Protein zu modifizieren.
Die Verknüpfung zwischen Monosaccharideinheiten in einem Glycan kann mit irgendeiner der Hydroxylgruppen, mit entweder einer β- oder einer α-anomerischen Konfiguration, sein. Wenn wie unten gezeigt gezeichnet (z.B, bei Kohlenstoffatom 1 ("1" unten) von GlcNAc und Sialsäure), wird die β- oder α-Konfiguration als eine Linie über bzw. unter der Ebene des Monosaccharidrings dargestellt.
Die Pyranoseform von β-D-N-Acetylglucosamin (GlcNAc) ist:
Die Struktur von Sialsäure ist:
wobei R=CH₃-CO-(N-Acetylneuraminsäure)₃ oder CH OH-CO-(N-Glycolylneuraminsäure) ist, die Hydroxylgruppen können mit verschiedenen Acylsubstituenten substituiert sein und jene an C8 und C9 mit zusätzlichen Sialsäureresten.
Bestimmte Abkürzungen werden hierin verwendet, wie sie in dem Fachgebiet üblich sind, wie: "Ac" für Acetyl; "glc" für Glucose; "fuc" für Fucose; "GlcNAc" für N-Actylglucosamin; "man" für Mannose, "PNGase F" für Peptid-N-glycosidase F (EC 3.2.2.18).
Wie hierin verwendet, bedeutet "GlcNAc Tri I" N-Acetylglucosaminyltransferase I.
In Glycoproteinen besitzen potentielle N-Glycosylierungsstellen die Sequenz Asparagin-X-Serin (oder Threonin), wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann. Proteine können manipuliert werden unter Erhalt von künstlichen N-Glycosylierungsstellen oder die natürliche Stelle kann verwendet werden.
Die Verfahren der Erfindung werden mittels Verweis auf den unten beschriebenen Glycosylierungsweg besser verstanden werden. Es wird angenommen, dass die früheren Ereignisse der N-Glycansynthese, die im endoplasmatischen Reticulum ausgeführt werden, bei Hefen, Pflanzen und höheren Eukaryoten und Pilzen identisch sind. Der Weg der N-Glycosylierung von Proteinen in eukaryotischen Zellen folgt im Allgemeinen diesem Muster. Zuerst wird ein Lipid-verbundenes Vorläufer-Oligosaccharid (I):
von dem Lipid übertragen und mit Asn auf dem Zielprotein durch die Wirkung einer Oligosaccharidtransferase gebunden, um (II) zu bilden:
Dies wird auch abgekürzt: Glc₃Man₉GlcNAc₂-Protein. Das Enzym α-1,2-Glucosidase I entfernt dann den terminalen Glucoserest und die α-1,3-Glucosidase II entfernt den zweiten und dritten Glucoserest, wobei (III) zurückbleibt:
Dies ist ein Beispiel einer Glycosylierung des "Typs mit hohem Mannosegehalt". Dies wird auch abgekürzt: Man₉GlcNAc₂-Protein.
Der letzte Schritt in dem rauen endoplasmatischen Reticulum ist das Entfernen eines Mannoserestes. Die verbleibenden Schritte werden im endoplasmatischen Reticulum (ER) und dem Golgi-Apparat durchgeführt. Bis zu diesem Punkt ist der Glycosylierungsweg von sowohl Hefe- als auch Säugetierzellen der gleiche. Jedoch unterscheiden sich die Schritte im cis-Golgi zwischen Hefe und den höheren Eukaryoten. Hefe fügen Mannosen durch die Wirkung einer Mannosyltransferase hinzu, das Ergebnis davon ist eine Glycosylierung des Typs mit hohem Mannosegehalt bei dem glycosylierten Produkt. Jedoch entfernen höhere Eukaryoten drei zusätzliche Mannosen mit α-Mannosidase I; in manchen Fällen findet dieses Trimmen auch im ER statt. Das Ergebnis ist das Produkt (IV):
Dies ist ebenfalls eine Struktur mit "hohem Mannosegehalt" und wird abgekürzt: Man₅GlcNAc₂-Protein. Das energiereiche Zuckernukleotid, UDP-GlcNAc, dient als ein Sub strat für GlcNAc Tr I, um einen GlcNAc-Bestandteil auf (IV) zu übertragen, um (V) zu produzieren:
Dies ist eine Struktur des Hybridtyps und wird abgekürzt: GlcNacMan₅GlcNAc₂-Protein. α-Mannosidase II erkennt dieses Substrat und entfernt zusätzliche Mannosereste, um die Struktur des "Hybridtyps" (VI) zu ergeben:
Dies wird abgekürzt: GlcNacMan₃GlcNAc₂-Protein. Dies kann als ein Substrat für jedes von UDP-GlcNAc, UDP-Gal oder CMP-Sialsäure (SA) und GlcNAc-Transferase (II), Galactosyltransferase bzw. Sialyltransferase dienen, um ein Glycosylierungsmuster des "komplexen Typs", z.B. wie oben gezeigt, zu ergeben (VII):
Die Glycosylierungsmodifikationsenzyme, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, schließen Transferasen und Mannosidasen ein. Mannosereste, die über eine α-1,2-Verknüpfung verbunden sind, sind diejenigen Mannosereste, die in vivo oder in vitro durch eine "spezifische" α-1,2-Mannosidase, wie diejenige von Aspergillus saitoi, entfernt werden können. GlcNAc Tr I ist sehr spezifisch und überträgt GlcNAc nur auf die weniger periphere α-1,3-verknüpfte Mannose einer Man₅GlcNAc₂-Struktur (ein geeignetes Substrat ist oben als Struktur IV gezeigt). Nach der Übertragung von GlcNAc, Galactose und Sialsäure auf Man₅GlcNAc₂ können die verbleibenden α-1,3- und α-1,6-verknüpften Mannosereste in vivo oder in vitro, unter Verwendung einer "aspezifischen" Mannosidase, wie z.B. die kommerziell erhältlich Jackbohnen-Mannosidase, entfernt werden, wobei somit eine Hybridstruktur in eine komplexe umgewandelt wird.
Transferasen, wie die GlcNAc Tr I, Galactosyltransferase und Sialyltransferase, wie hierin exemplarisch genannt, katalysieren die Übertragung eines Monosaccharids von einem energiereichen Zuckerdonor auf ein Akzeptoroligosaccharid. Die verallgemeinerte Reaktion ist: Zuckernukleotid + Akzeptor => Akzeptor-Zucker + Nukleotid.
Um die Reaktion in vitro zu verfolgen, kann ein Zuckernukleotid in einer Form bereitgestellt werden, die den Akzeptor markieren wird. Zum Beispiel ist die spezifische Aktivität der kommerziellen radioaktiv markierten Zuckernukleotide ausreichend hoch, um eine Detektion von fmolen des Akzeptorsubstrats in einem radioaktiven Markierungsassay zu ermöglichen.
Zellmembranen sind weder für Glycosyltransferasen noch für die Zuckernukleotidsubstrate permeabel. Dies ermöglicht die extrazelluläre Veränderung der Zelloberflächenglycosylierung auf intakten Zellen oder dichten Membranpräparaten ("sealed membrane preparations") unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung in jenen Ausführungsformen, in denen die GlcNAc Tr I-Reaktion nicht innerhalb der Wirtszelle auftritt.
GlcNAc Tr I (EC 2.4.1.101) ist die Transferase des mittleren Golgi-Apparates, die die Bildung der komplexen N-verknüpften Kohlenhydrate initiiert. Dieses Enzym ist auch bekannt als UDP-N-Acetylglucosamin:α-3-D-mannosid-β-1,2-N-Acetylglucosaminyltransfrase I. Das Humangen, das für dieses Enzym codiert, wurde kloniert und seine codierende Sequenz veröffentlicht (R. Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:9948-9952 (1990). Andere GlcNAc Tr I-Quellen schließen Kaninchen (M. Sarkar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:234-238 (1991) und Maus (R. Kumar et al., Glycobiology 2:383-393 (1992)) ein.
Andere Enzyme, die bei dem Aufbau der Hybridoligosaccharide, wie in 1 gezeigt, nützlich sind, sind ebenfalls erhältlich und wurden kloniert. Zum Beispiel schließt eine nichteinschränkende Liste Rinder-β-l,4-galactosyltransferase (G. D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183:211-217 (1989)), Human-β-1,4-Galactosyltransferase (K.A. Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657 (1988)), Ratten-α-2,6-Sialyltransfrase (X.C. Wang et al., Glycobiology I:25-31 (1990)) und Kaninchen-α-1,2-Mannosidase (A. Lal et al., J. Biol. Chem. 269:9872-9881 (1994)) oder Maus-α-1-2-Mannosidasen (A. Herscovics et al., J. biol. Chem. 269:9864-9871 (1994)) ein.
Um eine angegebene Sequenz zu klonieren, können die Primer, basierend auf der angegebenen Sequenz, entwickelt werden. Zum Beispiel können Primer, wie jene von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 verwendet werden, um die codierende Sequenz von Human-GlcNAc Tr I, z.B. unter Verwendung von PCR-Techniken, zu vervielfältigen, um eine solche codierende Sequenz in einen Vektor der Wahl zu insertieren, und vorzugsweise in einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine solche codierende Sequenz in einem gewünschten Wirt zu exprimieren.
Das GlcNAc Tr I-Enzym ist nicht glycosyliert. Maus-GlcNAc Tr I wurde von R. Kumar et al., Glycobiology 2:383-393 (1992) exprimiert. Es ist möglich und nützlich, Maus- und Human-GlcNAc Tr I intrazellulär in Bakterien zu exprimieren, aber es kann Proteinaggregate bilden. Aus diesem Grund ist die intrazelluläre Produktion in Bakterien nicht das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von GlcNAc Tr I. Das Enzym kann in Säugetierzellen, wie COS-Zellen, produziert werden, in das Medium abgeschieden werden und direkt in diesem Medium verwendet werden, falls gewünscht; es sollte angemerkt werden, dass die Verwendung des Enzyms in dem verbrauchten Wachstumsmedium nur aus Gründen der Bequemlichkeit erfolgt; die Zellwachstum-Mediumumgebung ist nicht per se erforderlich für die GlcNAc Tr I-Aktivität, da das in Bakterien produzierte Enzym aktiv war. Isolierungsverfahren für das Enzym aus Kaninchenleber sind ebenfalls bekannt (Y. Nishikawa et al., J. Biol. Chem. 263:8270-8281 (1988)).
In den Verfahren der Erfindung werden GlcNAc Tr I-Reaktionen vorzugsweise bei 37°C durchgeführt. Ein Unit ist die Enzymaktivität, die die Übertragung von 1 μmol GlcNAc von UDP-GlcNAc auf Man₅GlcNAc in 1 Minute bei 37°C und pH 6,1 katalysiert. Wie exemplarisch dargestellt, wurden 330 μmol Akzeptorsubstrat und 340 μmol UDP-GlcNAc mit 10 bis 15 μl eines 10-fach konzentrierten COS-Überstands (enthaltend etwa 30 Mikrounits GlcNAc Tri I in einem Reaktionsgemisch mit einem Endvolumen von 30 μl) vollendet. Ein Unit Enzymaktivität setzt 1 μmol Substrat in 1 Minute um. Die Reaktionszeiten werden in Abhängigkeit von der Konzentration und der spezifischen Aktivität des Enzyms variieren, aber im Allgemeinen sind 5 bis 10 Stunden und, wie exemplarisch dargestellt, 1 bis 4 Stunden ausreichend für die Zwecke der Verfahren der Erfindung. Die GlcNAc Tr I-Reaktion kann für eine längere Zeit durchgeführt werden, während der Maßstab der Reaktion erhöht wird (Ichikawa et al., Anal. Biochem. 202:215-238 (1992)).
Um brauchbar zu sein, müssen die Enzyme nicht rein sein, wie exemplarisch unter Verwendung des COS-Zellmediums als Quelle von GlcNAc Tr I dargestellt. Jedoch kann die Isolierung der Glycosyltransferase in großem Maßstab unter Verwendung von Nukleotid-Affinitäts-Adsorbenzien, wie in dem Fachgebiet bekannt, erzielt werden. Die Glycosyltransferase kann durch das Hinzufügen eines Affinitäts-Anhangs ("affinity tag") (wie der Streptavidin-Anhang oder ein Histidin-Anhang) modifiziert werden, um die Aufreinigung zu verstärken und die Aufreinigungskosten zu verringern.
β-1,4-Galactosyltransferase, EC 2.4.1.38, wie diejenige aus Humanmilch, die hierin exemplarisch dargestellt ist, ist kommerziell von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1088-696) und Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erhältlich. Ihre Aufreinigung aus Rindermilch wurde von R. Barker et al., J. Biol.Chem. 247:7135 (1972) beschrieben. In Gegenwart von α-Lactalbumin, wird EC 2.4.1.38 zu EC 2.4.1.22, Lactosesynthetase (auch bekannt als Lactosesynthase und UDP-D-Galactose: D-Glucose-4-β-Galactosyltransferase), und akzeptiert Glucose als ein Substrat für die Übertragung von Galactose, um Lactose zu produzieren (Yoon et al., Glycobiology 2:161-168 (1992)). Dieses Enzym ist kommerziell von Sigma und Oxford Glycosystems erhältlich. Es ist auch einfach aufzureinigen (R. Barker et al., J. Biol. Chem. 247:7135 (1972)). Rinder-Galactosyltransferase kann in der gleichen Weise und unter den gleichen Reaktionsbedingungen verwendet werden wie diejenige vom Menschen. Klonierte β-1,4-Galactosyltransferase wurde in mehreren Systemen exprimiert (siehe A. Masibay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5733-5737 (1989). D. Aoki et al., EMBO J. 9:3171 (1990) und C. Krezdorn et al., Eur. J. Biochem. 212:113-120 (1993)).
Die enzymatischen Reaktionsbedingungen der β-1,4-Galactosyltransferase, EC 2.4.1.38, sind im Stand der Technik bekannt (R.E. Parchment et al., Anal. Biochem. 154:460-469 (1986); H. Nunez und R.Barker, Biochemistry 19: 489-495 (1980)). Das Enzym benötigt einen pH von 8 bis 8,5 und 1 bis 50 mM Mangan, vorzugsweise 20 mM, für eine optimale enzymatische Aktivität. Die Reaktionen werden vorzugsweise bei 37°C durchgeführt, mit etwa 65 mU Enzym und 5 μmol UDP-Galactose pro ml. Ein Unit Enzymaktivität ist die Enzymaktivität, die die Übertragung von 1 μmol Galactose von UDP-Galactose auf Glucose in Gegenwart von α-Lactalbumin in 1 Minute bei 37°C und pH 8,4 katalysiert. Jedoch kann bei der kommerziell erhältlichen Galactosyltransferase (5,5 Units pro mg) in Abwesenheit von α-Lactalbumin und mit GlcNAc als dem Substrat die enzymatische Aktivität verringert sein, z.B. auf etwa 3,5 U/mg. Die Reaktionszeiten werden in Abhängigkeit von der Konzentration und der spezifischen Aktivität des Enzyms variieren, aber allgemein sind 6 bis 10 Stunden für einen kleinen Maßstab und, wie exemplarisch dargestellt, 8 Stunden ausreichend für die Zwecke der Verfahren der Erfindung. Längere Zeiten können erforderlich sein, während der Maßstab der Reaktion erhöht wird.
α-2,6-Sialyltransferase, EC 2.4.99.1, wie diejenige aus Rattenleber, die hier exemplarisch dargestellt ist, ist kommerziell von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 981-583) und von Genzyme, Calbiochem und Sigma erhältlich. Ihre Aufreinigung wurde von J. Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13,835-13,844 (1982) beschrieben. Das Enzym ist auch bekannt als CMP-N-Acetylneuraminat: β-D-Galactosyl-1,4-N-acetyl-β-D-glucosamin-α-2,6-N-Acetylneuraminyltransferase. Der K_m für den Zuckerdonor CMP-NeuAc ist 8,5 × 10^–5 M. Die Akzeptorsequenz ist Galβ1,4GlcNAc-R. Aufreinigungsverfahren für Sialyltransferasen, die an der N-Glycosylsynthese beteiligt sind, sind bekannt (J. Weinstein et al., J. Biol. Chem. 262:17735-17743 (198?)). Über die rekombinante Herstellung von Sialyltransferasen in Säugetier-COS- und -CHO-Zellen wurde berichtet (H. Schachter et al. in "Molecular Glycobiology", M. Fukuda et al., Herausg., IRL Press, S. 88-162 (1994). Die Klonierung von Human-α-2,6-Sialyltransferase wurde in U. Grundmann et al., Nucleic Acids Res. 18:667 (1990) dargestellt.
Ein Unit α-2,6-Sialyltransferase wird 1 μmol N-Acetylneuraminsäure von CMP-N-Acetylneuraminsäure auf Asialo-α₁-glycoprotein bei 37°C übertragen (J. Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13835-13844 (1982)). Das Enzym benötigt einen pH von 6 bis 6,5 optima le Aktivität und 50 mM NaCl werden im Allgemeinen zu dem Assay zugefügt, um die Enzymaktivität zu stabilisieren. Die Reaktionen werden vorzugsweise bei 37°C mit etwa 4 bis 40 mU Enzym, 0,5 bis 5 μmol CMP-NANA pro ml (100 bis 800 μg Akzeptorprotein pro ml wurden in den exemplarisch dargestellten Ausführungsformen verwendet) und vorzugsweise 3,6 μmol durchgeführt. Die Reaktionszeiten werden in Abhängigkeit von der Konzentration und der spezifischen Aktivität des Enzyms variieren, aber allgemein sind 6 bis 10 Stunden für die Synthese in kleinem Maßstab und länger für Anwendungen in großem Maßstab ausreichend für die Zwecke der Verfahren der Erfindung.
α-1,2-Mannosidase (EC 3.2.1.24), wie diejenige aus Aspergillus saitoi, die hierin exemplarisch dargestellt ist, ist kommerziell von Oxford Glycosystems, Oxford, GB erhältlich. Ein Unit Enzym ist die Menge an Enzym, die 1 μmol Mannose aus Bäckerhefe-Mannan pro Minute bei pH 5,0 und 37°C freisetzen wird. In den exemplarisch dargestellten Ausführungsformen wurden 6 μUnit Enzym verwendet, um bis zu 500 μg Protein in einem Endvolumen von 30 μl zu behandeln, und 2 μUnit Enzym wurden verwendet, um etwa 5 μg Rinder-Ribonuclease B-Oligosaccharide (Oxford GlycoSystems Kat. Nr. RP-2500) in einem Endvolumen von 10 μl zu behandeln. Der pH ist vorzugsweise etwa 5,0 für optimale Aktivität des Enzyms aus A. saitoi. Die Reaktionen werden vorzugsweise bei 37°C durchgeführt.
Verfahren zur Detektion der Produkte dieser Reaktionen sind gut bekannt und hierin exemplarisch dargestellt.
Gemäß der Erfindung kann die Modifikation von Glycoproteinen in vitro durch die oben beschriebenen Kohlenhydrat-modifizierenden Enzyme bewirkt werden, die in der Lage sind, Glycosylierungsstrukturen zu synthetisieren oder zu modifizieren. Glycoproteine, die durch Hefe, Fadenpilze und Insektenzellen synthetisiert wurden, können dadurch strukturell und funktionell verschieden von Kohlenhydratstrukturen des Säugetiertyps sein, dass sie die Beschaffenheit des Typs mit hohem Mannosegehalt oder des Hybridtyps haben. Wie durch diese Erfindung ausgeführt, können diese Oligosaccharidstrukturen mit hohem Mannosegehalt jedoch enzymatisch in Hybrid- oder komplexe Strukturen umgewandelt werden, was dazu führt, dass die Kohlenhydratstruktur auf einem von Hefe, Pilzen oder Insekten produzierten Protein ähnlich zu oder identisch mit der Säugetier-produzierten Kohlenhydratstruktur ist.
Es wurde überraschenderweise entdeckt, dass Fadenpilze, wie z.B. Trichoderma, anders als Hefe, Glycoproteine in einer Form synthetisieren, die als ein Akzeptorsubstrat für das Enzym N-Acetylglucosaminyltransferase I (GlcNAc Tr I), insbesondere Human-GlcNAc Tri I, erkennbar ist. Diese Form ist eine "unreife" Säugetierform.
Jedoch ist GlcNAc Tr I nicht natürlich in diesen Wirten vorhanden. Gemäß der Erfindung wird der obige Befund dadurch ausgenutzt, dass das Glycosylierungsmuster eines gewünschten Glycoproteins, z.B. eines rekombinanten Proteins, das in Trichoderma produziert wurde, das eine Struktur hat, die als ein Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I dienen kann, z.B. obige Formel (IV), durch eine Kaskade sequenzieller Reaktionen modifiziert wird, z.B. drei sequenzielle Reaktionen mit den folgenden Enzymen: erstens, GlcNAc Tr I; zweitens, β-1,4-Galactosyltransferase; und drittens, α-2,6-Sialyltransferase. Das Ergebnis dieser Kaskade ist die Produktion eines Glycoproteins, das zumindest ein Hybridglycosylierungsmuster hat, und, wenn alle Verzweigungsenden modifiziert sind, ein Glycosylierungsmuster vom komplexen Typ. Solche Verzweigungen enden vorzugsweise mit terminalen Sialsäureeinheiten ähnlich denjenigen von Säugetierzellen, obwohl andere gewünschte terminale Einheiten verwendet werden können, wie jene, die früher beschrieben wurden.
Wie unten beschrieben, kann ein rekombinanter Wirt in der Weise hergestellt werden, dass die erste Reaktion, diejenige von GlcNAc Tr I, in vivo in dem Wirt vor der Abscheidung des Proteins durchgeführt wird.
Es wurde ebenfalls überraschender Weise festgestellt, dass die Behandlung von Glycoproteinen, die durch Hefe und Trichoderma synthetisiert wurden, mit α-1,2-Mannosidase, um Mannosereste eines solchen Glycoproteins zu trimmen (zu entfernen), Akzeptorsubstratstellen für die enzymatische Wirkung von GlcNAc Tr I (in dem Fall von Hefe) bereitstellt oder (in dem Fall von Trichoderma) vermehrt. Gemäß den Verfahren der Erfindung kann eine Mannosidase verwendet werden, um das Akzeptorsubstrat vor der Reaktion mit GlcNAc Tr I vorzubehandeln, um Zielstellen zu erzeugen oder andererseits die Verfügbarkeit von Zielstellen für die GlcNAc Tr I-Wirkung auf einem solchen Substrat zu erhöhen.
Daher wird in einer ersten Ausführungsform GlcNAc Tr I-Aktivität verwendet, um ein Akzeptorsubstrat des Typs mit hohem Mannosegehalt in eines vom Hybridtyp umzuwandeln. Der Hybridtyp kann dann in einen dazu verschiedenen Hybridtyp oder einen komplexen Typ umgewandelt werden. In einer hoch bevorzugten Ausführungsform ist die Quelle des Akzeptorsubstrats für GlcNAc Tr I ein Glycoprotein, das in einem Fadenpilz, und insbesondere Trichoderma, und ganz besonders T. reesei, produziert worden ist.
Es ist nicht erforderlich, das Produkt jeder Reaktion aus der Mischung vor dem Beginn der nachfolgenden Reaktion zu extrahieren. Der pH und die Assay-Bedingungen (wie das Hinzufügen von divalenten Kationen) können einfach in dem selben Behälter für jede nachfolgende Reaktion angepasst werden, so dass die Handhabung minimiert wird. Zusätzlich kann Festkörper-Technologie ("solid state technology") verwendet werden, um die Enzyme auf einem festen Träger bereitzustellen, und das Akzeptorsubstrat geht einfach durch einen solchen Träger hindurch oder der feste Träger kann in diskontinuierlicher Weise verwendet werden.
Die Glycoproteinquelle des Akzeptorsubstrats kann das native oder das rekombinante Glycoproteinprodukt jedes Wirts sein, der ein solches Glycoprotein in einer verwendbaren Form bereitstellt. Insbesondere ist das Glycoprotein ein natives oder rekombinantes Produkt eines Fadenpilzes, z.B. eines Mitglieds der Genera Absidia, Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Ceratocystis, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Gliocladium, Mortierella, Mucor, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phytophthora, Pythium, Rhizopus, Trichoderma und Verticillium. Insbesondere ist der Wirt ein Mitglied der Genera Aspergillus oder Trichoderma.
Trichoderma-Spezies, die als Wirte für die Herstellung von Akzeptorsubstraten von GlcNAc Tr I nützlich sind, schließen T. reesei, wie QM6a, ALKO2442 oder CBS383.78 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande) oder ATCC13631 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 10852, USA, Typstamm), T. viride (wie CBS189.79 (Best. W. Gams)); T. longibrachiatum, wie CBS816.68 (Typstamm); T. pseudokoningii (wie MUCL 19358; Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain); T. saturnisporum (CBS330.70 (Typstamm)); T. harzianum (CBS316.31 (Best. W. Gams); T. virgatum (T. pseudokoningii) ATCC24961. Besonders bevorzugt ist der Wirt T reesei und insbesondere die T. reesei-Stämme QM9414 (ATCC 26921), RUT-C-30 (ATCC 56765) und hoch produktive Mutanten wie VTT-D-79125, die sich von QM9414 ableiten (Nevalainen, Technical Research Centre of Finland Publications26 (1985), Espoo, Finnland). Die Transformation von Trichoderma kann durch jegliche im Stand der Technik bekannte Technik durchgeführt werden, einschließlich der Technik, die in Europäischen Patentanmeldung EP 0 244 234 gelehrt wird.
Die bevorzugten Spezies von Aspergillus, die nützliche Wirte in den Verfahren der Erfindung sind, schließen A. nidulans, A. awamore und A. niger ein. Verfahren zur Transformation von Aspergillus sind bekannt.
Wie unten beschrieben, sind Hefen, wie Pichia spp. (insbesondere Pichia pastoris), Hansenula spp. (insbesondere Hansenula polymorpha), Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica oder S. cerevisiae, wenn sie in vitro mit α-1,2-Mannosidase vorbehandelt werden, nützliche Wirte, um ein Gen von Interesse zu exprimieren. Hefe wäre als ein Wirt zum Exprimieren des klonierten GlcNAc Tr I-Enzyms nützlich, da es nicht glycosyliert ist.
In einer Ausführungsform wird das Glycoproteinakzeptorsubstrat in das Wachstumsmedium des Produktionswirts sezerniert und wird in vitro durch die Wirkung von Enzymen, wie GlcNAc Tr I, modifiziert, ohne aus einem solchen Medium entfernt zu werden. Falls gewünscht, kann das Medium vor der enzymatischen Modifikation des Genprodukts von Interesse konzentriert werden. Alternativ kann das Glycoproteinakzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I in einer gereinigten oder isolierten Form bereitgestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die codierende Sequenz von GlcNAc Tr I in eine gewünschte Wirtszelle transformiert, von der ebenfalls gewünscht wird, das Protein von Interesse zu synthetisieren, insbesondere eine Wirtszelle, die nicht natürlicher Weise die enzymatischen Modifikationen gemäß den Verfahren der Erfindung katalysiert. In dieser Ausführungsform wird der erste Schritt in der Modifikation des Glycosylierungsmusters, die durch GlcNAc Tr I katalysierte Reaktion, in vivo bewirkt. Die Wirtszelle synthetisiert dann ein Akzeptorsubstrat eines Hybridtyps und scheidet es vorzugsweise ab. Der Hybridtyp wird dann in einen Hybridtyp, der terminale Sialsäuren enthält, durch die zweiten und dritten Schritte der Kaskade in vitro, d.h., das Hinzufügen von Galactoseresten mittels β-1,4-Galactosyltransferase, gefolgt von dem Hinzufügen von Sialsäureresten mittels α-2,6-Sialyltransferase, umgewandelt.
Vorzugsweise wird der rekombinante Wirt sowohl mit GlcNAc Tr I codierenden Sequenzen und, falls gewünscht, mit der codierenden Sequenz für ein Protein von Interesse (dessen Glycosylierungsmuster in vivo durch die Wirkung der exprimierten GlcNAc Tr I modifiziert werden soll) transformiert. Stärker bevorzugt ist der rekombinante Wirt ein Mitglied der Genera Aspergillus oder Trichoderma, wie oben beschrieben.
Der rekombinante Wirt kann ebenfalls mit DNA transformiert werden, die das α-1,2-Mannosidasegen umfasst. In den Ausführungsformen dieser Erfindung kann der rekombinante Wirt mit dem α-1,2-Mannosidasegen zusammen mit den GlcNAc Tr Icodierenden Sequenzen und, falls gewünscht, der codierenden Sequenz für ein Protein von Interesse transformiert werden. In anderen Ausführungsformen dieser Erfindung wird der rekombinante Wirt mit dem α-1,2-Mannosidasegen allein, oder, falls gewünscht, der codierenden Sequenz für ein Protein von Interesse transformiert.
Vektorsysteme sind bekannt, die nützlich sind beim Transformieren von Wirten, insbesondere von den oben beschriebenen Aspergillus- oder Trichoderma-Wirten, für die Produktion von GlcNAc Tr I und Glycoproteinen der Erfindung. Ein separater Vektor kann verwendet werden, um den auswählbaren Marker bereitzustellen.
Die Expression von Genen in einem Wirt erfordert die Verwendung von regulatorischen Bereichen, die in solchen Wirten funktionsfähig sind. Eine breite Vielfalt von Transkriptions- und Translations-regulatorischen Sequenzen kann verwendet werden; Fadenpilze, wie Trichoderma, erkennen im Allgemeinen die Transkriptionskontrollen eukaryotischer Wirte, z.B. diejenigen anderer Fadenpilze und insbesondere Aspergillus.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden genetisch stabile Transformanten von Trichoderma konstruiert, wobei die DNA, die für ein gewünschtes Glycoprotein oder ein Kohlenhydrat-modifizierendes Enzym, wie GlcNAc Tr I, codiert, in das Trichoderma-Wirtschromosom integriert ist. Die codierende Sequenz für das gewünschte Glycoprotein oder Enzym kann aus einer beliebigen Quelle stammen. Eine solche Integration kann de novo innerhalb der Zelle auftreten oder in einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform durch Transformation mit einem Vektor unterstützt sein, der sich funktional selbst in das Wirtschromosom insertiert, z.B. DNA-Elemente, die die Integration von DNA-Sequenzen in Chromosomen fördern.
Nach der Einführung des Vektors werden die Empfängerzellen in einem Selektionsmedium gezüchtet, das auf das Wachstum der transformierten Zellen selektiert. Die Expression der klonierten Gensequenzen) resultiert in der Produktion des gewünschten Glycoproteins und/oder Kohlenhydrat-modifizierenden Enzyms oder in der Produktion gewünschter Fragmente davon. Diese Expression kann in einer kontinuierlichen Weise in den transformierten Zellen stattfinden, oder in einer kontrollierten Weise, wobei z.B. die Expression das Ergebnis eines regulierten Promotors ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein gewünschtes Glycoprotein- oder Kohlenhydrat-modifizierendes Enzym aufgrund des Vorhandenseins einer funktionalen Sekretionssignalsequenz, vorzugsweise ein Signal, das homolog zu dem Wirt ist, in das umgebende Medium abgeschieden. Wenn ein gewünschtes Gen nicht für eine Signalsequenz codiert oder seine Signalsequenz in dem Wirt nicht gut funktioniert, dann kann die für das Glycoprotein codierende Sequenz praktikabler Weise mit einer anderen Signalsequenz, entweder homolog oder heterolog zu dem Wirt, die in einem solchen Wirt funktioniert, verbunden werden. Die gewünschte codierende Sequenz kann mit einer beliebigen Signalsequenz verbunden werden, die die Abscheidung des Glycoproteins aus dem ausgewählten Wirt ermöglicht, z.B. für die Abscheidung aus Trichoderma, kann die Signalsequenz der Trichoderma-Cellulaseenzyme verwendet werden, z.B. kann das Sekretionssignal des Cellobiohydrolase I(CBHI)-, des Cellobiohydrolase II (CBHII)-, des Endoglucanase I (EGI)- oder des Endoglucanase II (EGII)-Proteins verwendet werden. Sekretionssignale der Trichoderma-Xylanasen sind ebenfalls nützlich. Solche Signalsequenzen können mit oder ohne spezifische Proteasestellen entwickelt werden, so dass die Signalpeptidsequenz einer nachfolgenden Entfernung zugänglich ist.
In jenen Ausführungsformen, in denen GlcNAc Tr I intrazellulär innerhalb der Pilzwirtszelle bereitgestellt wird, um intrazellulär auf ein Substrat zu wirken, ist es nicht notwendig und nicht bevorzugt, rekombinant produziertes GlcNAc Tr I in das Medium abzuscheiden, da es notwendig ist, dass es in der Wirtszelle verbleibt, um in vivo in jenen Ausführungsformen aktiv bzw. wirksam zu sein.
Trichoderma ist ein besonders nützlicher und praktischer Wirt für die Synthese der Glycoproteine der Erfindung, weil Trichoderma in der Lage ist, Protein in großen Mengen abzuscheiden, z.B. wurde von Konzentrationen so hoch wie 40 g/l Kulturmedium berichtet; die homologen Cellulase- und Hemicellulase-Promotoren, wie cbh1-, cbh2-, egl1- und egl2-Promotoren von Trichoderma, stellen sehr geeignete Promotoren für die starke Expression von Genen von Interesse bereit, weil sie starke Promotoren sind. Zum Beispiel ist der cbhI-Promotor ein einmalig im Genom vorkommender Promotor ("single copy Promoter"), der normalerweise die Synthese auf bis zu 60 % des abgeschiedenen Proteins aus dem Trichoderma-Wirt ausrichtet. Alternativ kann das Gen von Interesse oder das GlcNAc Tr I-Gen in den CBHI-Locus insertiert werden. Das Trichoderma-Transformationssystem ist sehr vielsei tig und kann für jedes Gen von Interesse angepasst werden. Die Kultur von Trichoderma wird durch eine frühere ausgedehnte Erfahrung in Fermentationstechniken des industriellen Maßstabs unterstützt, z.B. siehe D.B. Finkelstein et al., Hrsg., Biotechnology of Filamentous Fungi: Technology and Products, Butterworth-Heinemann, Verlag, Stoneham, MA (1992).
Die Verfahren der Erfindung sind bei jedem gewünschten Protein von Interesse nützlich, das Glycosylierungsmuster des Typs mit hohem Mannosegehalt enthält. Solche Muster werden als "unreif' betrachtet, wenn sie mit Komplexen oder Hybridmustern verglichen werden.
Insbesondere kann ein Protein von Interesse ein Protein sein, wie ein Immunglobulin oder Hormon, das für einen Patienten, der dergleichen bedarf, bereitgestellt werden soll, insbesondere aus therapeutischen Gründen. Beispiele von Glycohormonen, bei denen die Glycosylierung bei den Eigenschaften eines solchen Hormons eine Rolle spielt, insbesondere bei den therapeutischen Eigenschaften, schließen Erythropoietin (EPO), Human-Choriogonadotropin (HCG), Follitropin (FSH), Thyrotropin (TSH) und Lutropin (LH) ein. Eine Modifikation jeder Peptiduntereinheit gemäß den Verfahren der Erfindung kann durchgeführt werden. Beispiele anderer Proteine von Interesse, deren Biosynthese, Transport oder Funktion durch N-Glycosylierung verändert werden, schließen NCAM, Tenascin, Thrombospondin, Fibronectin, Hormone, Cytokine (insbesondere Interleukin-4 und Interferon-γ), Wachstumsfaktoren, Plasmaproteine, Gerinnungsfaktoren, lösliche Rezeptoren, Immunglobuline (Antikörper), Granulocyte-Macrophage-colony-stimulating-Faktor (GM-CSF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, das HIV-Virus-Glycoprotein gp120, Virushüllenproteine, Immunglobulin D, Antithrombin IIIβ, Plasminogen, den von Willebrand-Faktor, Fibrinogen, Corticosteroid-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Globulin, Folatbindendes Protein, Fibrinectin, Knochen- und Thrombozyten-Osteonectin, den EGF-Rezeptor, Rezeptoren für Insulin und den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I, Rezeptoren für den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Lymphozyten-CD2, MHC-Klasse II-Moleküle, Glucosetransporter, das Erythrozyten-Band-3-Protein, β-2-adrenerge Rezeptoren, den Transferrin-Rezeptor, den VIP-Rezeptor, das Membran-Klasse I-MHC-Protein, den Vasopressin-Rezeptor von LLC-PK1-Zellen, den Low-density-Lipoprotein(LDL)-Rezeptor, den Asialoglycoprotein-Rezeptor, das CD4-Protein, den Thyrotropin-Rezeptor, den PDGF-Rezeptor, Jackbohnen-Concanavalin A, den Kobragift-Faktor, Lactotransferrin, Spinat- Chloroplasten-Kopplungsfaktor, Glandula submandibularis-Mucin, Intestinalbürstensaum-Lactase-Phlorizin-Hydrolase, das Antigefrier-Glycoprotein arktischer Fische, Glucophorin A und β-HCG, und allgemein sezernierte Tierproteine und Pflanzenglycoproteine, die durch Platanenzellen in Kultur abgeschieden werden, sein. Insbesondere jene Proteine, die das Zielen auf spezielle Organe oder Zellen mittels Zucker-Lectin-Erkennung erfordern, sind nützliche Proteinsubstrate für die Modifikation der Glycosylierungsmuster gemäß der Erfindung.
Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere beim Entwickeln eines Proteins zur Verwendung in der Gentherapie nützlich. In einer solchen Therapie zielt ein Protein, wie ein Enzym, das in einer Zelle oder einem Organ fehlerhaft ist bzw. fehlt, auf eine solche Zelle oder ein Organ, indem ein solches Protein mit einem geeigneten Glycosylierungsmuster bereitgestellt wird.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um hohe Level von Glycoproteinen zu produzieren, die für eine Verwendung, z.B. pharmazeutischen Zusammensetzungen wünschenswert sind. Solche Glycoproteine können direkt von den Wirten der Erfindung oder aus dem Kulturmedium erhalten werden. Wenn die gewünschten Aktivitäten in mehr als einem rekombinanten Wirt vorhanden sind (wie Multi-Untereinheitenproteine ("multisubunit proteins")), können solche Präparate aus den geeigneten Wirten isoliert werden und vor der Verwendung in dem Verfahren der Erfindung kombiniert werden, alternativ kann ein Wirt verwendet werden, um alle Untereinheiten des gewünschten Proteins herzustellen.
Um die Glycoproteinpräparate dieser Erfindung zu erhalten, werden die oben beschriebenen rekombinanten Wirte, die die gewünschten Eigenschaften haben (d.h., Wirte, die in der Lage sind, die Glycoproteine zu exprimieren), unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die modifizierten Glycoproteine werden von den Trichoderma-Wirten in das Kulturmedium abgeschieden und die Glycoproteine werden aus dem Kulturmedium durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen. Alternativ, aber weniger wünschenswert, können die Glycoproteine aus den Wirtszellen selbst gewonnen werden.
Das Glycoprotein wird aus dem Kulturmedium oder den Wirtszellen selbst gewonnen unter Verwendung von Routineverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Das Glycoprotein der Erfindung kann lyophilisiert werden oder das Glycoprotein kann auf andere Weise konzentriert und/oder für die Lagerung stabilisiert werden. Die Glycoproteine der Erfindung sind sehr wirtschaftlich bereitzustellen und zu verwenden. Wenn die Glycoproteine in das Kulturmedium abgeschieden werden, muss nur das Kulturmedium zurückgewonnen wer den, um das gewünschte Glycoprotein zu erhalten; es besteht kein Bedarf, ein Glycoprotein aus den Trichoderma-Wirten zu extrahieren, solange es kein Bestreben gibt, das zu tun.
Falls gewünscht, kann ein exprimiertes Glycoprotein weiter aufgereinigt werden in Übereinstimmung mit konventionellen Bedingungen, wie Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese oder dergleichen.
Die Verfahren der Erfindung gewährleisten die Herstellung von Hybrid- oder komplexen Glycosylgruppen auf rekombinanten Glycoproteinen für deren Verwendung als pharmazeutische Mittel in einer sichereren und kosteneffizienteren Weise als derzeit verfügbar. Die Verfahren der Erfindung gewährleisten auch dadurch einen wichtigen Vorteil, dass sie in der Synthese von einheitlichen und genau definierten Glycosylstrukturen resultieren. Die Herstellung einer einzelnen Glycoform kann kritisch sein, wenn es gewünscht ist, einheitliche therapeutische pharmakokinetische Profile zu erhalten.
Wie es von jemanden verstanden würde, der gewöhnliche Kenntnisse des Stands der Technik hat, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gemäß bekannter Verfahren zum Herstellen solcher Zusammensetzungen formuliert werden, wobei die Glycoproteine mit Oligosacchariden des Säugetiertyps mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens kombiniert werden. Geeignete Exzipienzien und ihre Formulierung sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences ((18. Auflage, A.R. Gennaro, Hrsg.), Mack Publishing Co., Easton PA (1990); siehe insbesondere Teil 4, "Testing and Analysis", S. 435-602, und Teil 8, "Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture", S. 1435-1712) beschrieben. Um eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung zu bilden, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, können solche Zusammensetzungen zusätzlich eine wirksame Menge von Salzen, Puffern, Adjuvanzien oder anderen Substanzen enthalten, die die Wirksamkeit der Zusammensetzung verbessern werden.
Pharmazeutische Verfahren können angewendet werden, um die Dauer der Wirkung zu kontrollieren. Präparate mit kontrollierter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zum Komplexieren oder Absorbieren der Zusammensetzungen dieser Erfindung, ihrer Äquivalente oder ihrer funktionellen Derivate erzielt werden. Die kontrollierte Abgabe kann ausgeübt werden, indem geeignete Makromoleküle (z.B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinyl, Pyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und die Konzentration der Makromoleküle sowie die Verfahren zum Einbau ausgewählt werden, um die Freisetzung zu kontrollieren. Ein anderes Verfahren, um die Frei setzung zu kontrollieren, ist das Einschließen der Zusammensetzungen der Erfindung in Partikel eines polymeren Materials, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Po-ly(milchsäure) oder Ethylenvinylacetat-Copolymere. Alternativ ist es möglich, diese Materialien in Mikrokapseln einzuschließen, die z.B. mittels Koazervationstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden, z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methacrylat)-Mikrokapseln, entsprechend oder in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen, z.B. Liposomen, Albuminmikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, wie oben, offenbart.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch für eine orale Verabreichung oder eine parenterale Verabreichung durch Injektion (z.B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion), durch intravenöse oder andere Infusion, durch nasopharyngeale Absorption (intranasopharangeal) ("intranasopharangeally"), für perkutane Verabreichung, für rektale Verabreichung, für Verabreichung über das Auge ("ocularly") oder sublinguale Verabreichung formuliert werden. Die Zusammensetzungen für parenterale Verabreichung können sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen einschließen. Beispiele von nicht-wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Träger, Zusätze oder Verschlussverbände können verwendet werden, um die Hautdurchlässigkeit zu erhöhen und die Absorption zu verstärken. Flüssige Dosierungsformen für orale Verabreichung können allgemein eine Liposomlösung umfassen, die die flüssige Dosierungsform enthält. Geeignete Formen zum Suspendieren von Liposomen schließen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere ein, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die allgemein in dem Fachgebiet verwendet werden, wie gereinigtes Wasser. Neben den inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Netzmittel, emulgierende und suspendierende Mittel oder süßende Mittel, Aromastoffe, färbende oder parfümierende Mittel einschließen.
In einer Ausführungsform können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als eine Creme, Lotion, Salbe oder dergleichen für eine topische Verabreichung auf die Haut formuliert sein. Solche Zusammensetzungen können optional Netzmittel, emulgierende und suspendierende Mittel oder färbende oder parfümierende Mittel enthalten.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch annehmbar" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung ohne die Bewirkung von ernsten Nebeneffekten von dem Empfänger toleriert werden kann. Es wird gesagt, dass ein solches Mittel in einer therapeutisch "wirksamen" Menge oder Konzentration verabreicht wird, wenn diese die gewünschte(n) biologische(n) Wirkungen) erzeugt.
Allgemein kann die Dosierung, die benötigt wird, um für eine wirksame Menge oder Konzentration der Zusammensetzung zu sorgen, durch jemanden mit gewöhnlichen Kenntnissen des Stands der Technik, wie ein Arzt, angepasst werden und wird in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Verabreichungsweg und dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit des Empfängers und gegebenenfalls anderen Variablen variieren.
Der Empfänger des Proteins, das gemäß den Verfahren der Erfindung modifiziert wurde, kann jedes Tier sein, bei dem es gewünscht ist, ein solches Protein zu verabreichen, einschließlich Menschen, Zootiere, Nutztiere (Rind, Schaf und dergleichen) und Haustiere (Katzen, Hunde, Vögel etc.).
Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben. Diese Beispiele zeigen nur wenige konkrete Anwendungen der Erfindung. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es selbstverständlich, zusätzliche ähnliche Anwendungen und Ausführungsformen davon zu erstellen. Daher sollten die Beispiele nicht so interpretiert werden, dass der Rahmen der Erfindung eingeengt wird, sondern nur so, dass die Verwendung der Erfindung verdeutlicht wird.
BEISPIEL 1
Herstellung von Trichoderma reesei-Glycoproteinen
Glycoproteine von dem T. reesei-Mutantenstamm RUTC 30 wurden nach Wachstum in einem Minimalmedium für die Induktion von Cellulasen (Uusitalo et al., J. Biotechn. 17:35-50 (1991)) erhalten. Als Kohlenstoffquellen für das Wachstum wurden Lactose oder eine Mischung von Lactose/Cellulose (2 % Endkonzentration) zugefügt. Die Methode von M.M. Bradford (Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)) wurde verwendet, um die Konzentration der Proteine mit Immunglobulin G als einem Standard zu messen. Für die Glycosyltransferase-Experimente wurden die abgeschiedenen Proteine nachfolgend gegen den zugehörigen Puffer, der in dem nachfolgenden Glycosyltransferase-Assay verwendet wurde, dialysiert. Ein schneller Wechsel auf den neuen Puffer war ohne signifikanten Verlust der Proteine möglich, wenn die Microcon^TM-Ultrazentrifugationsvorrichtungen (Amicon) (Blatt et al., Anal. Biochem. 26:151-173 (1968)) verwendet wurden. Eine Mischung von Cellulasen aus einem zweiten, unbekannten Stamm von T. reesei wurden kommerziell von Fluka Chemie, Buchs, Schweiz bezogen.
BEISPIEL 2
Herstellung von Oligosacchariden
Oligosaccharide wurden gemäß einem Verfahren, das von Verostek et al. (Glycobiology 2:458 (Abstract 1.06) (1992)) beschrieben wurde, hergestellt. Die Oligosaccharide wurden aus den Glycoproteinen (1-20 mg/ml) mittels rekombinanter PNGase F (Tarentino et al., Biochem. 24:4665-4671 (1985)) (Biolabs) freigesetzt. Die Glycoproteine wurden zuerst in 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 0,5 %igem SDS und 1 %igem β-Mercaptoethanol oder in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, gelöst. Die Proteine wurden dann durch Kochen für 10 Minuten denaturiert. Das nicht-ionische Detergens Nonidet P-50^TM wurde zugefügt, um die Inhibierung von PNGase F durch SDS zu verhindern. Die Reaktionsmischung wurde mit 1000 Units PNGase F bei 37°C für 18 Stunden inkubiert. Nach der PNGase F-Behandlung wurden die Proteine und Oligosaccharide durch Hinzufügen von 4 Volumen Aceton bei –20°C präzipitiert. Der 80 % Aceton-, Salz- und SDSs-enthaltende Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem 60 %igem Methanol extrahiert. Der Methanol wurde von den vereinigten Überständen nach Lyophilisierung durch Verdampfen entfernt. Eine weitere Aufreinigung der Oligosaccharide wurde durch einen Durchgang durch eine Bio-Gel P2^TM-Säule (27 cm hoch, 0,5 cm Durchmesser, bezogen von BIORAD) erhalten. Das Vorhandensein von Oligo sacchariden in den verschiedenen gesammelten Fraktionen wurde mittels Orcinol-Färben (Révélateurs pour la chromatographie en couche mince et sur papier, Merch, S. 91 (1980)) ausfindig gemacht. In einem zweiten Durchgang wurden die vereinigten Oligosaccharidenthaltenden Fraktionen durch eine Bio Gel P2^TM (Biorad)-Säule hindurchgeleitet, um Oligosaccharide zu erhalten, die ausreichend rein zur Verwendung in den Glycosyltransferase-Assays waren.
BEISPIEL 3
Amplifikation der genomischen DNA-Sequenz von GlcNAc Tr I
Der codierende Bereich des GlcNAc Tr I-Gens (Genbank Accession Nr. M55621; EMBL Accession Nr. HSGLCNAC; Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9948-9952 (1990); alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen) aus der genomischen DNA eines Kolonkarzinoms wurde unter Verwendung von PCR vervielfältigt und wurde nachfolgend in den Säugetierexpressionsvektor pCAGGS kloniert, der detaillierter in Tabelle 3 beschrieben ist (2 und beschrieben in Niwa et al., Gene 108:193-200 (1991)). Die Human-Kolorektal-Adenokarzinom-Zelllinie DLD-1 wurde als Quelle der genomischen DNA verwendet. Diese Zelllinie ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC CCL 221) erhältlich und ist in Cancer Research 39:1020-1025 (1979) beschrieben. Das Plasmid pCAGGS war die Spinde von J. Miyazaki, Univ. Tokio, Japan. Das Plasmid pCAGGS ist nützlich für die hoch effiziente Expression von Genen unter der Kontrolle des β-Actin/β-Globin-Hybridpromotors und des CMV-IE-Enhancers in verschiedenen Säugetierzellen. pCAGGS trägt einen modifizierten Hühner-β-Actin-Promotor: Spleiß-Akzeptorsequenz des β-Actin-Promotorbereichs ist durch ein Kaninchen-β-Globin-Fragment ersetzt, das einen 3'-Teil des zweiten Introns und einen 5'-Teil des dritten Exons enthält. Der resultierende β-Actin/β-Globin-Hybridpromotor wird als der "AG"-Promotor bezeichnet.
Genomische DNA wurde aus Kolonzellen gemäß der Vorgehensweise, die von T. Maniatis, "Molecular cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989 beschrieben wurde, präpariert. Ein genomisches DNA-Fragment, das den codierenden Bereichs des GlcNAc Tri I-Gens darstellt, wurde mit der Pyrococcus furiosus-Polymerase (Stratagene) und einem Pharmacia-Thermal-Cycler gemäß den Herstelleranweisungen vervielfältigt. Der N-terminale Oligonukleotidprimer bestand aus der Sequenz:
5'-CCAGGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCA-3' (SEQ ID NO: 1).
Der C-terminale Oligonukleotidprimer bestand aus der Sequenz:
5'-CCAGTCGACAGGTGCTAATTCCAGCTAG-3' (SEQ ID NO: 2).
Das Vervielfältigungsprotokoll bestand aus einem initialen denaturierenden Zyklus von 8 Minuten bei 96°C, gefolgt von einem 1-minütigen Annealing-Schritt bei 65°C und schließlich einem 4-minütigen Polymerisationszyklus bei 75°C. Die Vervielfältigung wechselte dann zu 1-minütigen Denaturierung, einem 1-minütigen Annealing und einer 4-minütigen Polymerisation für 24 zusätzliche Zyklen.
BEISPIEL 4
Subklonieren der Polymerasekettenreaktion (PCR)-erzeugten Fragmente
Eine Fraktion der PCR-Fragmente hat aufgrund der Matrizen-unabhängigen terminalen Transferaseaktivität der Pyrococcus furiosus-Polymerase ein einzelnes Adenosinnukleotid, das an das 3'-Ende angefügt ist. Diese Aktivität wurde ausgenutzt, um die vervielfältigten DNA-Fragmente mit der Effizienz des Klonierens mit klebrigen Enden zu klonieren. Um dies zu tun, wurde der pUC18-Vektor (in den das Fragment gebunden würde) wie folgt hergestellt. 1 μg Hind II-verdauter Vektor wurde mit 20 Units terminaler Transferase und 10 μM ddTTP in einem Endvolumen von 30 μl für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. ddTTP wurde verwendet, um den Einbau von nur einem Thymidin an den 3'-Enden des stumpf-verdauten Vektors (Holton et al., Nucleic Acids Research 19(5):1156 (1990)) sicherzustellen. Der Vektor und die PCR-Fragmente wurden unter Verwendung des Gene Clean^TM-Kits von Pharmacia aufgereinigt. Das vervielfältigte GlcNAc Tr I-codierende Fragment (200 ng) wurde schließlich in den pUC18-Vektor (40 ng) bei 12°C für 17 Stunden ligiert. Der erste Teil des Gens ((MLKKQSAGLVLWGAILFVAWNALLLLFFWTRPAPGRPPSVS [SEQ ID NO: 3]), der für die Sekretion und für die Rückhaltung in den mittleren Golgi-Kompartiment codiert, wurde durch eine Nukleotidsequenz ersetzt, die für die "Präpro"-Sekretionssignalsequenz des Hefe-Mating-Faktors codiert. Diese Nukleotidsequenz wurde aus dem Plasmid pSCGAL1MF3-Katalog (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) catalogue of the Laboratorium voor Moleculaire Biologie Plasmidencollectie (LMBP) culture collection an der Universität Gent) nach Verdau mit Stu I- und Xba I-Restriktionsenzymen isoliert. (Die aufgelisteten Materialien, wie sie von dem LMBP erhalten wurden, sind für jeden erhältlich, der sie anfordert.) Die Hefe-Mating-Faktor-Nukleotidsequenz, die verwendet wurde, ist:
Eine Karte des Plasmids pSCGALIMF3 erscheint als 3 und in einer detaillierteren Beschreibung in Tabelle 2.
Um das Plasmid pSCGALIMF3 herzustellen, wurde das Plasmid pSCGAL1MF2 (erhältlich von der LMBP-Sammlung) mit AccI geöffnet, mit der Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und ligiert. Auf diese Weise sind die HindII- und die SalI-Schnittstellen des Polylinkers verloren, eine NruI-Schnittstelle ist in dem Polylinker erzeugt, und die HindII-Schnittstelle innerhalb des Präpro-Sekretionssignals des α-Mating-Faktors 1 wird die einzige ihrer Art.
Die Stu I-Schnittstelle mit stumpfen Enden wurde an Eco 47III-verdautes GlcNAc Tr I in den pUCl8-Vektor ligiert. Die "Präpro-GlcNAc Tr I"-codierende Nukleotidsequenz wurde dann aus dem pUC18-Vektor durch einen Eco RI-, Hind III-Doppelverdau isoliert. Nachfolgend wurde ein Eco RI-Linker an die stumpfendige Hind III-Schnittstelle ligiert, um die Insertion in den Säugetier-pCAGGS-Vektor zu ermöglichen. Gerichtetes Klonieren wurde mit Xba I-, Eco RI-verdautem Vektor und Fragment durchgeführt.
In dieser Expressionkassette wurde der erste Teil des Gens, der für die Sekretions- und Golgi-Rückhaltungssignale codiert, durch eine Nukleotidsequenz ersetzt, die für die "Präpro"-Sekretionssignalsequenz des Hefe-α-Mating-Faktors codiert (Burke et al., J. Biol.Chem. 267:24433-24440 (1992); und A.J. Brake in Yeast Genetic Engineering (Barr et al., Hrsg.), Buttersworths Pub., Stoneham, MA (1989), S. 269-280). Der Vektor wurde pCAMFhGNTIf1 genannt (4). Seine Konstruktion ist in den 4A, 4B, 4C und 4D graphisch dargestellt und ist detaillierter in Tabelle 1 beschrieben. Im Wesentlichen wurde das XbaI-StuI-Fragment von pSCGALIMF3 (oben), das das Präpro-Sekretionssignal des α-Mating-Faktor 1-Gens enthält, an das XbaI-Eco47III-Vektorfragment von pUChGNTI ligiert. Aufgrund der Matrizen-unabhängigen terminalen Transferaseaktivität der Pyrococcus furiosus-Polymerase hat eine Fraktion der PCR-Fragment ein einzelnes Adenosinnukleotid, das an das 3'-Ende angefügt ist. Wir nutzten diese Aktivität aus, um die vervielfältigten DNA-Fragmente mit der Effizienz des Klonierens von klebrigen Enden zu klonieren. Um dies zu tun, wurde der AkzeptorpUC18-Vektor wie folgt hergestellt: 1 μg HindII-verdauter Vektor wurde mit 20 Units terminaler Transferase und 10 μM ddTTP in einem Endvolumen von 30 μl für 1 Stunde bei 37°C inkubiert (Holton und Graham, 1990). Das vervielfältigte GlucNAc Tr I-codierende Fragment (200 ng) wurde in dem behandelten pUC18- (Norrander et al., Gene 26:101-106 (1983))-Vektor (40 ng) bei 12°C für 17 Stunden ligiert. Dieses Zwischenkonstrukt wurde dann mit HindIII und EcoRI verdaut, die klebrigen Enden wurden mit der Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und EcoRI-Linker (5'-CGGAATTCCG-3') wurden zugefügt. Schließlich wurde dieses EcoRI-EcoRI-Fragment mit XbaI und EcoRI verdaut und das resultierende XbaI-EcoRI-Fragment wurde in den XbaI-EcoRI-verdauten pCAGGS-Vektor insertiert. Dieses Expressionsplasmid trägt eine Fusion des präpro-Sekretionssignals des α-Mating-Faktor 1-Gens an das reife Humangen, das für N-Acetylglucosaminyltransferase I (GlcNAc Tr I) codiert, codiert in Sense-Orientierung ("sense orientation") relativ zu dem Hühner-β-Actin-Promotor, dem die CMV-IE-Enhancer-Sequenzen vorausgeht. Die Nukleotidsequenz der Human-GlcNAc Tr I wurde von EMBL Accession Nr. M55621 erhalten.
Nach vorübergehender Transfektion des Vektors zu COS-7-Zellen (ATCC CRL-1651) wurde das exprimierte GlcNAc Tr I-Enzym effizient in Dulbecco-Minimalmedium (Dulbecco's modified eagle medium, R. Dulbecco et al, Virol. 8:396 (1956); J.D.Smith et al., Virol. 12:185 (1960); Tissue Culture Standards Comm., In Vitro 6:2 und 93 und In Vitro 9:6) abgeschieden. Der COS-Überstand wurde etwa zehnfach konzentriert und in dem GlcNAc Tr I-Aktivitätsassays verwendet. GlcNAc Tr I ist enzymatisch gut charakterisiert und verwendet ein Man₅GlcNAc₂-Oligosaccharid als bevorzugtes Akzeptorsubstrat (Nishikawa et al., J. Biol. Chem. 263(17):8270-8281 (1988)). Im Allgemeinen werden Oligosaccharide mit der gemeinsamen Formel R1α 1,6(Manα 1,3Manβ 1,4GlcNAcR2) als Substrate für GlcNAc Tr I akzeptiert, wobei R1 einer oder mehrere Mannosereste ist, die durch α-Bindungen verknüpft sind; R2 kann β1-4(Fucα1-6)GlcNac-Asn-X, β1-4GlcNAc-Asn-X, β1-4GlcNAc oder H sein. Ein GlcNAc-Rest, der von UDP-GlcNAc stammt, wurde in die β1-2-Verknüpfung zu dem Mannoserest eingebaut, der α-1,3 an Man β-1,4GlcNAcR2 gebunden ist (H. Schater, Glycobiology 1(5):453-461 (1991)).
BEISPIEL 5
Der GlcNAc Tr I-Assay
Der Säugetiervektor pCAGGS und die "Präpro-GlcNAc Tr I"-codierenden Sequenzen (pCAMFhGNTIf1) wurden in COS-Zellen gemäß dem Protokoll von McCutchan et al. (J. Nat. Cancer Inst. 41:351-357 (1968)) transfiziert. GlcNAc Tr I wurde in Dulbecco-Minimalmedium ohne Serum abgeschieden. Das Enzym wurde durch Ultrafiltration in Centricon-30^TM Zentrifugationsmikrokonzentratoren ("centrifugal microconcentraters") (Amicon) konzentriert.
Die GlcNAc Tr I-Aktivität wurde gemäß eines Verfahrens, das von Nishikawa et al. (J. Biol.Chem. 263 (17):8270-8281 (1988)) beschrieben wurde, wie folgt bestimmt. In ein Gesamtvolumen von 0,030 ml wurde das Folgende zugefügt: 0,33 mM Man₅Gn; 0,1 M 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) (pH 6,1); 20 mM MnCl₂; 5 mM AMP (als Pyrophosphatase-Inhibitor); 0,1 M GlcNAc (als β-N-Acetylhexoseaminidase-Inhibitor); 0,34 mmol UDP-(¹⁴C)GlcNAc (Amersham); und 10 μl konzentrierter COS-Überstand. Die Inkubation wurde bei 37°C für 1 bis 4 Stunden durchgeführt. Die Proteine wurden dann durch Präzipitation mittels Hinzufügen von 100 %igem eiskaltem Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 66 % von den Oligosacchariden abgetrennt.
Die Oligosaccharide wurden auf Siliziumdioxid 60-Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten unter Verwendung eines Lösungsmittels, das Butanol/Essigsäure/Wasser (20:10:10; V/V/V) enthält, getrennt. Die Platten wurden zweimal in dem gleichen Lösungsmittel entwickelt (Vauhkonen et al., Eur. J. Biochem. 152:43-50 (1985)). Radioaktive Oligosaccharide wurden nach Exposition eines Röntgenstrahlfilms gegenüber der DC-Platte für mehrere Tage sichtbar gemacht.
Die Oligosaccharide wurden auch durch Orcinol-Färben wie folgt sichtbar gemacht. Ein Gemisch von 0,6 % Orcinol in 10 %iger Schwefelsäure und 0,1 % Fe(III)Cl₂ wurde auf die Oberseite der DC-Platte gesprüht, die nachfolgend für 10 bis 15 min auf 100°C erhitzt wurde.
Anstelle der Oligosaccharide wurden, wo angegeben, Glycoproteine zu dem Reaktionsgemisch für GlcNAc Tr I zugefügt. Etwa 10 μg Glycoprotein (z.B. Ovalbumin) wurden zu dem 30 μl-Reaktionsgemisch zugefügt. Die Inkubation bei 37°C fand über eine Dauer von 6 bis 18 Stunden statt. Der Einbau von radioaktivem GlcNAc in die Oligosaccharid-Einheiten auf den Proteinen, die auf einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt wurden (U.K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)), wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.
BEISPIEL 6
Galactosyltransferase- und Sialyltransferase-Prozessierung bzw. -Verarbeitung
Zusätzliche in vitro-Modifikationen von N-Acetylglucosamin-tragenden Glycoproteinen oder Oligosacchariden wurden mit β-1,4-Galactosyltransferase aus Humanmilch und α-2,6-Sialyltransferase aus Rattenleber durchgeführt. Beide Enzyme wurden von Boehringer Mannheim bezogen.
Vor dem Durchführen dieser Verarbeitungsschritte wurde CBH I aus dem GlcNAc Tr I-Reaktionsgemisch aufgereinigt. Eine Beschreibung für die Aufreinigung dieses Proteins ist von Shoemaker et al., Bio/Technology 1:687-690 (1993) erhältlich. Kurz gesagt, wurde das COS-Zellmedium durch eine DEAE-Sepharose-Säule hindurchgeleitet, die in einem 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5, äquilibriert worden war. Die Cellulasen (oder CBH I allein) aus T. reesei in einem Reaktionsgemisch für eine GlcNAc Tr I-Behandlung wurden gegen 50 mM Natriumacetat, pH 5, dialysiert. Dann wurden sie von den COS-Überstandsproteinen durch Aufreinigung über eine DEAE-Sepharose^®-Säule (Volumen: 0,5 ml, etwa 1 cm Höhe, 0,5 cm Durchmesser, Fast Flow-Harz, Pharmacia) abgetrennt. Unter diesen Bedingungen wurde CBH I zurückgehalten.
Ein Salzgradient (Verändern der NaCl-Konzentration von 0 bis 0,1 M in 400 μl Natriumacetat-Puffer, pH 5) entfernte einen wesentlichen Teil der Proteine, die im Reaktionsgemisch für die in vitro-Glycosylierungen vorhanden waren, und CBH I wurde auf der Säule zurückgehalten. Die Salzkonzentration wurde weiter auf 0,2 M (in 800 μl) erhöht und CBH I eluierte bei 0,15 M NaCl oder höher. Die Salzkonzentration wurde weiter erhöht auf 0,5 M (durch Anwenden von 800 μl), um so viel wie möglich des CBH I von der Säule zu eluieren. Die CBH I-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und gegen einen 50 mM Tris-Puffer, pH 8, dialysiert und etwa um das 10-Fache unter Verwendung einer Centricon-Ultrazentrifugationsvorrichtung (Amicon) konzentriert. CBH I wurde dann zu dem Reakti onsgemisch für Galactosyltransferase hinzugefügt: β-1,4-Galactosyltransferase benötigte einen pH von 8-8,5 und das Vorhandensein von Mangan für eine optimale spezifische Aktivität (Schanbacher et al., J.Biol.Chem. 245:5057-5061 (1970); Yoon et al., Glycobiology 2:161-168 (1992)). Zu den GlcNAc Tr I-behandelten Proteinen oder Oligosacchariden wurden hinzugefügt: 0,17 μmol UDP (¹⁴C)Gal (285 mCi)mmol) oder "kalte" UDP-Gal; 2 Milliunits Galactosyltransferase; und MnCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 20 mM in einem Endvolumen von 0,030 ml: Die Galactosylierung wurde bei 37°C für etwa 8 Stunden durchgeführt.
Die α-2,6-Sialyltransferase benötigte einen pH von 6-6,5 für eine optimale Aktivität (Weinstein et al., J. Biol.Chem. 257:13845-13853 (1982)). Zu dem Galactosyltransferase-Reaktionsgemisch wurde das Folgende hinzugegeben: 0,18 μmol CMP (¹⁴C)NANA (281 mCi/mmol) (Amersham) bis zu einer Endkonzentration von 6 mM; 2 Milliunits α-2,6-Sialyltransferase; und NaCl (um die Sialyltransferase zu stabilisieren, Endkonzentration: 50 mM). Der pH wurde durch Hinzufügen von 1 M MES auf 6-6,5 eingestellt. Das Endvolumen des Reaktionsgemischs war 0,050 ml. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C für 8 Stunden inkubiert. Der Einbau von radioaktiven Zuckerresten in Glycoproteine wurde wie oben beschrieben sichtbar gemacht.
In vitro-Modifikationen von glycosylierter Ribonuclease B, die von Oxford Glycosystems bezogen wurde, wurden ebenfalls durchgeführt. Die glycosylierte Ribonuclease B wurde mit GlcNAc Tr I, wie in Beispiel 5 beschrieben, inkubiert. Das resultierende Oligosaccharidprodukt ist in 12, Spur 1 gezeigt. Das resultierende Produkt wurde mit Galactosyltransferase inkubiert: β-1,4-Galactosyltransferase, wie oben beschrieben, um *Gal, das mit GlcNAc bei Man₅GlcNAc₂ verbunden ist, zu produzieren, wie in 12, Spur 2 gezeigt. Dieses Produkt wurde mit α-2,6-Sialyltransferase, wie oben beschrieben, inkubiert, um Sialsäure, die mit *Gal verbunden ist, das mit *GlcNAc bei kommerziellem Man₅GlcNAc₂ verbunden ist, zu produzieren, wie in 12, Spur 3 gezeigt.
Die Verwendung von N-Glycanen, die aus Ribonuclease B freigesetzt wurden, als Akzeptorsubstrate für GlcNAc Tr I, Galactosyltransferase und α-2,6-Sialyltransferase wurde ebenfalls untersucht. Die N-Glycane wurden wie in Beispiel 2 beschrieben freigesetzt. Zwei GlcNAc-akzeptierende Strukturen sind auf die Freisetzung von dem Protein folgend erhältlich. Daher wird auf die sequenzielle Reaktion mit GlcNAc Tr I, Galactosyltransferase und α-2,6-Sialyltransferase folgend, ein komplexeres Glycosylierungsmuster beobachtet, wie in
12, Spuren 4 bis 6 abgebildet. Die erwarteten Hybrid- und komplexen Strukturen wurden jedoch beobachtet.
BEISPIEL 7
Verbesserung der Hybridglycoproteinstrukturen rafft α-1,2-Mannosidase
Glyoproteine (bis zu 100 mg) oder Oligosaccharide (hergestellt von etwa 100 mg Protein) wurden mit 2 bis 6 μUnits α-1,2-Mannosidase von A. saitoi (Oxford Glycosystems) in 100 mM Natriumacetat (pH 5) für 18 Stunden bei 37°C behandelt. Die Glycoproteine wurden gegen 20 mM MES, pH 6,1, dialysiert, bevor sie weiter mit GlcNAc Tr I verarbeitet wurden. Der Einbau von radioaktiven GlcNAc in Oligosaccharide wurde auf einem Röntgenstrahl-Film nach Trennung mittels DC sichtbar gemacht. Radioaktive Signale, ausgehend von (¹⁴C)GlcNAc-Resten auf Proteinen, wurden, wie oben beschrieben, sichtbar gemacht.
BEISPIEL 8
Mannosidase- und Mannosyltransferase-Assays
Die Mannosidase-Aktivität wurde in dem extrazellulären Medium von T. reesei und Aspergillus saitoi bestimmt: T. reesei RUTC 30 wurde in Minimalmedium, gemäß Uusitalo et al. (1991) mit 2 % Lactose als Kohlenstoffquelle angezogen. Das gleiche Medium, mit 2 % Glucose ergänzt, wurde parallel verwendet, um zu bestimmen, ob es einen Einfluss der verschiedenen Kohlenstoffquellen auf die Expression der Mannosidasen gibt. Aspergillus saitoi wurde auf Minimalmedium, gemäß Czapek (Onions und Pitt, Appendix: Media. In D.L. Hawksworth und B.E. Kirop (Hrsg.), Living resources for biotechnology. Cambridge University Press, Cambridge,GB, S. 180-199, 1988), mit 1 % Hefeextrakt und parallel mit 2 % Glucose als den Kohlenstoffquellen angezogen. Nach 4-tägiger Fermentation bei 28°C wurden die Pilzzellen von dem Wachstumsmedium durch Filtration über einen GF/F-Glas-Mikrofaser-Filter (Whatman) abgetrennt.
Das Wachstumsmedium wurde weiter konzentriert (70-fach), unter Verwendung von Centriprep- und Centricon-Ultrazentrifugationsvorrichtungen (M. W. Ausschluss: 10 kD; Amicon). Die Reaktionsgemische zum Bestimmen der Mannosidase-Aktivitäten enthielten in einem Volumen von 20 μl: 500 ng ANTS-markierte Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt von der Ribonuclease B (Oxford Glycosystems); Natriumcacodylat, pH 6,1 (60 mM Endkonzentration); CaCl₂ (20 mM) und 15 μl konzentriertes Wachstumsmedium. Die Inkubation der Reaktionsgemische wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt. Die Oligosaccharide wurden dann auf einem Polyacrylamidgel, wie beschrieben, getrennt.
Die gesammelten Pilzzellen wurden für die Herstellung von Rohextrakten verwendet: Nach Waschen mit 50 mM Natriumcacodylatpuffer wurde das trockene Zellpellet in einem Mörser unter Verwendung von flüssigem Stickstoff gemahlen. Die aufgebrochenen Zellen wurden in eiskalten Natriumcacodylatpuffer (50 mM, pH 6,1) überführt, der MgCl₂ (15 mM) und ein Gemisch von Proteaseinhibitoren (PMSF, Leupeptin, Benzamidin, Aprotinin in Konzentrationen, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Boehringer Mannheim)) enthielt. Die Zellen wurden in dem Puffer für 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Wir verwendeten Differenzialzentrifugation, um 15.000 g-, 40.000 g- und 100.000 g-Membranpellets zu erhalten. Schließlich wurde Triton X-100 (2 % Endkonzentration) zugefügt, um die Enzyme aus den Membranen zu solubilisieren. Die Reaktionsgemische zum Bestimmen der Mannosidasen wurden, wie bereits beschrieben, hergestellt. Die Reaktionsgemische zum Bestimmen der Mannosyltransferasen enthielten in einem Volumen von 20 μl: 100 ng ANTS-markiertes Man₈GlucNAc; 10 μg UDP-Mannose; MnCl₂ (20 mM Endkonzentration) und 10 μl des 100.000 g-Membranpräparats. Die Reaktionsgemische wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert.
BEISPIEL 9
Glycoproteine als Akzeptorsubstrate für GlcNAc Tr I
Verschiedene Glycoproteine wurden in GlcNAc Tr I-Aktivitätsassays verwendet, um zu bestimmen, ob sie Glycosylstrukturen tragen würden, die Substrate für GlCNAc Tr I wären. Ovalbumin, das als Positivkontrolle in diesem Versuch verwendet wurde, hat zwei mögliche Glycosylierungsstellen, aber nur eine Stelle ist tatsächlich glycosyliert. Ein Teil der Oligosaccharide, die auf Ovalbumin vorhanden sind, ist Man₅Gn₂ (Tai et al., J. Biol.Chem. 252:6687-6694 (1977)). Als Negativkontrollen wurden S. cerevisiae-Invertase und Human-Transferrin verwendet. Die Invertase von S. cerevisiae trägt Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt, wobei Man₈Gn₂ die kleinste gebildete Struktur ist (Trimble et al., J. Biol.Chem. 261:9816-9824 (1986)). Transferrin, ein Human-Glycoprotein, hat zwei N-Glycane des komplexen Typs (März et al., Can. J. Biochem. 60:624-630 (1982)). Die meisten Transferrin-Oligosaccharide sind bi-antennär mit Sialsäure als terminalen Zuckerresten.
Die Proteine, die von dem T. reesei-Mutantenstamm RUTC 30 abgeschieden wurden und die Cellulasen von einem unbekannten Stamm von t. reesei (kommerzielle Quelle; Fluka, Buchs, Schweiz) wurden untersucht. Der T. reesei-Mutantenstamm RUTC 30 hat eine erhöhte Kapazität, um Proteine abzuscheiden (Ghosh et al., in Trichoderma reesei Cellulasen: Biochemistry, Genetics, Physiology & Application (Kubicek et al., Hrsg.), Royal Soc. of Chemistry, Cambridge, England (1990), S. 115-138). Die Ergebnisse (5) zeigen, dass radioaktives (¹⁴C)GlcNAc von UDP-(¹⁴C)GlcNAc auf Oligosaccharide auf Ovalbumin und auf den extrazellulären abgeschiedenen Proteinen beider T. reesei-Stämme übertragen wurde. Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Trimming-Enzymen in t. reesei an, die zur in vivo-Bildung von Akzeptor-Oligosacchariden für GlcNAc Tr I in der Lage waren.
Zusätzlich wurde die Verwendung anderer Proteine als Akzeptorsubstrate für GlcNAc Tr I untersucht. Das Vorhandensein eines Substrats für GlcNAc Tr I wurde unter Verwendung des GlcNAc Tr I-Assays, wie oben in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt, indem der Einbau von radioaktivem GlcNAc in das Glycoprotein mittels Autoradiographie von 12,5 %igen SDS-PAGE-Gelen gemessen wurde. Der Einbau von radioaktiv-markiertem GlcNAc wurde gezeigt für α-Amylase aus Aspergillus oryzae, bezogen von Fluka, Buchs, Schweiz, α-Amylase aus Aspergillus niger, ebenfalls bezogen von Fluka; und für Proteine in einem kommerziellen β-Galactosidasepräparat aus Aspergillus oryzae, bezogen von Sigma, St. Louis, MO, USA. Siehe 11. Der Einbau von radioaktiv-markiertem GlcNAc wurde auch für Papain-verdaute Cellobiohydrolyse I aus Trichoderma reesei RUTC 30 gezeigt. Auf den Papain-Verdau folgend, enthält die Cellobiohydrolase I nicht länger das C-terminale Ende des Enzyms, das stark O-glycosyliert ist. Van Tilbeurgh et al., FEBS Lett. 204:223-227 (1986).
BEISPIEL 10
Freie Oligosaccharide als Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I
Die Oligosaccharide der extrazellulären Glycoproteine von Trichoderma wurden isoliert, um weiterhin zu bewerten und zu bestätigen, dass Man_SGlcNAc₂ das GlcNAcakzeptierende N-Glycan war. Die Oligosaccharide wurden enzymatisch mit N-Glycanase entfernt. Dieses Enzym setzt alle Typen von N-verknüpften Zuckerketten durch Spaltung der Glycosylamin-Bindung an Asparaginreste frei (Tarentino et al., Biochemistry 24:4665-4671 (1985)). Die Oligosaccharide wurden dann in einem GlcNAc Tr I-enthaltenden Reaktionsgemisch getestet. Ein kommerzielles Gemisch von Oligosacchariden, die von Man₉GlcNAc₂ bis Man₅GlcNAc₂ reichten, das aus Ribonuclease B durch Hydrazinolyse (Oxford Glyco Systems Nr. RP-2500) erhalten wurde, wurde als eine Positivkontrolle für diesen Versuch verwendet (Liang et al., J.Biochem. 88:51-58 (1980)). Oligosaccharide, die enzymatisch aus S. cerevisiae-Invertase freigesetzt wurden, wurden als Negativkontrollen verwendet. GlcNAc Tr I übertrug radioaktives GlcNAc von UDP-(¹⁴C)GlcNAc auf Pilz-Man₅GlcNAc₂-Glycane. Dies wurde nach Trennung der veränderten Oligosaccharide mittels Dünnschichtchromatographie (DC) detektiert. Die Position der markierten Pilzoligosaccharide, wie mittels Autoradiographie (6) deutlich gemacht, stimmte mit derjenigen der Positivkontrolle überein. Mit dem T. reesei-Mutantenstamm RUTC 30 diente eine zusätzliche Oligosaccharidstruktur, die größer war als Man₅GlcNAc₂, also ein Akzeptor für GlcNAc Tr I. Dies zeigte das Vorhandensein von Unterschieden in den Glycosylierungsmustern auf der Stammebene an.
BEISPIEL 11
Galactosyltransferase- und Sialyltransferase-Assays
Zusätzliche in vitro-Modifikationen von GlcNAc-tragenden Glycoproteinen oder Oligosacchariden wurden mit der kommerziellen β-1,4-Galactosyltransferase (Boehringer Mannheim) aus Humanmilch (Schanbacher et al., J. Biol.Chem. 245:5057-5061 (1970)) und kommerzieller α-2,6-Sialyltransferase (Boehringer Mannheim) aus Rattenleber (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13845-13853 (1982)) durchgeführt. Die Galactosylierung wurde über den Einbau von radioaktiver Galactose in in vitro-synthetisierte, nicht-markierte, GlcNActragende Glycosylstrukturen gezeigt. Der Abschluss des Synthesewegs wurde über den Einbau von radioaktiver Sialsäure an "kalte" Galactose gezeigt, die mittels einer β-1,4-Verknüpfung an GlcNAc angefügt war. Glycoproteine, die in dieser Weise markiert waren, wurden mittels Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Während der Elektrophorese bewegten sich sialylierte Glycoproteine langsamer verglichen mit nichtsialylierten Proteinen. Dies wurde als eine Verschiebung der sialylierten Proteine zu höheren Molekulargewichten beobachtet. Um diesen Effekt deutlich zu zeigen, wurde ein Trichoderma-Protein, nämlich Cellobiohydrolyse I (CBH I), im Besonderen untersucht.
Nach dem GlcNAc Tr I-Verarbeitungsschritt wurde CBH I aus dem COS-Überstandenthaltenden Reaktionsgemisch durch Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose (Shoemaker et al., Bio/Technology 1:687-690 (1983)) aufgereinigt. Der Aufreinigungsschritt vermied jede mögliche Beeinflussung durch COS-Überstandproteine, die ebenfalls ein Akzeptor für Sialyltransferase sein können.
Ein Autoradiogramm wurde mit CBH I-enthaltendem radioaktiven GlcNAc gegen radioaktives sialyliertes CBH I (7) erhalten. Eine deutliche Verschiebung in der elektrophoretischen Mobilität des sialylierten CBH I, verglichen mit der GlcNAc-enthaltenden Form, wurde gezeigt. Dies zeigte, dass es möglich war, die natürlich auftretenden Glycosylstrukturen bei Trichoderma-CBH I zu Hybridstrukturen mit terminalen Sialsäureresten zu modifizieren. Die beiden letzten Modifizierungsschritte wurden bei den freien Oligosacchariden bestätigt. Der Einbau von Galactose, gefolgt durch den Einbau von Sialsäure, verursachte immer eine Verschiebung in dem Molekulargewicht der Oligosaccharidmoleküle. Dies wurde als Verschiebungen in der Mobilität der unterschiedlich veränderten Oligosaccharide in der DC beobachtet.
BEISPIEL 12
Verbesserung der Hybridglycoproteinstruktur durch die Verwendung von α-1,2-Mannosidase
Wenn ein Pilz, wie T. reesei, verwendet wird, wird ein wesentlicher Anteil der Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt kein Akzeptor für GlcNAc Tr I sein. Andererseits verkürzt ("trims") in Säugetierzellen eine α-1,2-Mannosidase, die in dem cis-Kompartiment des Golgi-Apparats vorhanden ist, die meisten, wenn nicht alle, Strukturen mit hohem Mannosegehalt zu Man₅GlcNAc₂ und sichert dadurch, dass die Kohlenhydratketten in den komplexen Typ umwandelbar sind (Tulsiani et al., J. Biol. Chem. 263:5408-5417 (1988)).
Eine kommerzielle α-1,2-Mannosidase (Oxford Glycosystems, Oxford, GB) aus A. saitoi (Yamashita et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 96:1335-1342 (1980)) wurde verwendet, um zu untersuchen, bis zu welchem Ausmaß die Glycosylierungsreifung bzw. -verarbeitung derjenigen von Säugetierzellen ähnelt. Die Wirkung einer Vorinkubation von Pilzoligosacchariden oder -glycoproteinen mit α-1,2-Mannosidase aus dem in vitro-Einbau von GlcNAc in einen GlcNac Tr I-Assay wurde bestimmt.
Oligosaccharide aus Rinder-Ribonuclease B, aus extrazellulären Proteinen von T. reesei wurden mit α-1,2-Mannosidase aus A. saitoi behandelt. Die behandelten und nicht-behandelten N-Glycane wurden verarbeitet und durch Fluorophor-Markierung der reduzierenden Saccharide (8) sichtbar gemacht. In diesem Verfahren wurde das reduzierende Ende von Sacchariden, das, wie oben beschrieben, freigesetzt wurde, mit 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure (ANTS) umgesetzt, wie durch P. Jackson, "Methods in Enzymology.
Guide to techniquies in Glycobiology", Bd. 230, S. 250-265, Hrsg. Lennartz, W. & Hart G. (1994)) beschrieben wurde. Grundsätzlich wurden 10 μl von 0,15 M ANTS in Essigsäure-Wasser-Lösung (3:17 V/V) und 10 μl von 1 M Natriumcyanoborhydrid, gelöst in DMSO, zu den lyophilisierten Oligosacchariden, die enzymatisch aus 400 μg Glycoprotein freigesetzt wurden oder zu 5 μg von Rinder-Ribonuclease B-Oligosacchariden, die kommerziell von Oxford Glycosystems bezogen wurden, zugefügt. Es war keine vorausgehende Aufreinigung der Oligosaccharide auf einer Biogel P2-Säule erforderlich. Nach einer Übernacht-Inkubation bei 37°C wurden die ANTS-markierten Oligosaccharide mittels Hinzufügen von 4 Volumen eiskalten Acetons (bei –20°C) präzipitiert. Die Oligosaccharide wurden durch Zentrifugation (für 4 min bei 10.000 × g) pelletiert. Nicht-reagiertes ANTS in dem Aceton-haltigen Überstand wurde entfernt. Die Oligosaccharide wurde in einem geeigneten Volumen von Glycerin:Wasser (1:4 V/V) wieder aufgelöst und bei –70°C gelagert. Die ANTS-derivatisierten Oligosaccharide wurden auf einem 30 % Acrylamid-, 0,8 % N,N'-Methylenbisacrylamid-Gel (auf dem SE 250 Mighty Small II Elektrophoreseapparat, der auch für die Trennung der Proteine mittels PAGE verwendet wurde) getrennt. Um "kristallklare" Gele zu erhalten, wurde die Gellösung zwischen Kunststoffblätter gegossen, die mit Wasser an die gegossenen Platten angeheftet waren. Das Sammeln der Oligosaccharide ("stacking")wurde bei einem Strom von 15 mA für 30 Minuten ermöglicht, während die Trennung bei einem Strom von 30 mA für 2,5 Stunden stattfand. Als ein Referenzstandard wurde eine Glucose-Leiter ("ladder") aufgeladen, die nach einem Verdau von Weizenstärke (beschrieben von P. Jackson, "Methods in Enzymology. Guide to techniques in Glycobiology", Bd. 230, S. 250-265, Hrsg. W. Lennartz & G. Hart (1994)) erhalten worden war. Die elektrophoretischen Bandenmuster wurden auf einem UV-Durchleuchter ("transilluminator") betrachtet und durch einen roten Filter (Cokin A. 003; Cromofilter SA, Paris, Frankreich) unter Verwendung eines Standard-Schwarz/Weiß-Films fotografiert. Ein Polaroid-Typ 667-Film mit einer Empfindlichkeit von ISO3000 und einer Blende von 4,5 erforderte eine 8-Sekunden-Belichtung (8).
Die N-Glycane des Oligomannosetyps der Ribonuclease B, die von Man₅GlcNAc₂ bis Man₉GlcNAc₂ reichten, wurden alle in Man₅GlcNAc₂ umgewandelt. Dies stimmte mit der Tatsache überein, dass über die Biosynthese von N-verknüpften Zuckerketten bei Ribonuclease B bekannt ist, dass sie bei einer Zwischenstufe der Verarbeitung bzw. Reifung angehalten wird, wie durch die Tatsache gezeigt, dass die Strukturen mit hohem Mannosegehalt nicht alle in Man₅GlcNAc₂ umgewandelt worden waren und zusätzliche Mannosereste nur bei der α-1,2-Verknüpfung hatten. Die Oligosaccharide, die aus einem Gemisch aus Proteinen, die von T. reesei abgeschieden worden waren, isoliert worden waren, wurden teilweise in Man₅GlcNAc₂ umgewandelt, wobei ein wesentlicher Teil des Oligosaccharidpools nicht umgewandelt wurde. Von dem Ausgangsmaterial schien ein Anteil der Oligosaccharide kleiner als Man₈GlcNAc₂ zu sein, während ein anderer Anteil größer war als Man₉GlcNAc₂. In 8 ist nur das Trimmen von T. reesei-Oligosacchariden gezeigt.
Die Pilzoligosaccharide, die mit der α-1,2-Mannosidase aus A. saitoi behandelt worden waren, wurden dann zu einem Reaktionsgemisch für GlcNAc Tr I hinzugefügt. Die Oligosaccharide wurden mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Die α-1,2-Mannosidase-Behandlung in vitro förderte die Bildung eines Akzeptorsubstrats für GlcNAc Tr I (9), weil deutlich mehr radioaktive GlcNAc in die Pilz-Oligosaccharide eingebaut wurde. Ein kleiner Anteil der S. cerevisiae-Invertase-Oligosaccharide wurde ebenfalls auf die GlcNAc-akzeptierende Struktur mit hohem Mannosegehalt verkürzt ("trimmed"). Man₅GlcNAc₂-Glycane, die aus Ovalbumin isoliert wurden, waren die Positivkontrolle für diesen Versuch. Auf dem Autoradiogramm stimmte die Position der markierten Pilzoligosaccharide mit derjenigen der Positivkontrolle überein. Dies bestätigte die Bildung von GlcNAcMan₅GlcNAc₂ in den verschiedenen Reaktionsgemischen.
Bei dem RUTC 30-Trichoderma-Stamm ergab die α-1,2-Mannosidasebehandlung auch mehr eines zweiten, größeren GlcNAc-akzeptierenden Oligosaccharids. Wenn die Mannosidase-Behandlung bei intakten Glycoproteinen (10) wiederholt wurde, waren die Ergebnisse analog zu jenen, die mit den freien Oligosacchariden erhalten wurden. Das heißt, mehr markiertes GlcNAc wurde auf Ovalbumin und T. reesei-Glycoproteine übertragen, wenn sie zuerst mit α-1,2-Mannosidase vorbehandelt wurden. Jetzt wurde GlcNAc auch auf S. cerevisiae-Invertase übertragen.
Zusammenfassend ermöglicht das Verfahren der Erfindung die Herstellung von Säugetier-artigen, Hybridoligosacchariden auf Glycoproteinen, die von dem Fadenpilz T. reesei und seinem Mutantenstamm T. reesei RUTC 30 abgeschieden wurden. Die in vitro-Versuche verwendeten die folgenden Säugetier-Glycosyltransferasen: Human-GlcNAc Tr I, produziert in COS-Zellen; β-1,4-Galactosyltransferase aus Humanmilch und α-2-6-Sialyltransferase aus Rattenleber. Eine Vorinkubation mit α-1,2-Mannosidase aus A. saitoi verbesserte wesentlich den GlcNAc-Einbau in die Pilzproteine. Diese Ausführungsform erzielte einen Pilz, der Oli gosaccharide synthetisierte, die in komplexe Strukturen des Säugetiertyps auf dem einfachsten möglichen Weg umwandelbar waren. Da die ersten Schritte des Synthesewegs der komplexen Kohlenhydrate in vivo in einem Pilz, wie Trichoderma, durchgeführt wurden, war eine Vervollständigung des Glycosylierungswegs durch enzymatische Oligosaccharidsynthese und -modifikation in vitro möglich. als ein Ergebnis dieser Erfindung wird eine stereokontrollierte Oligosaccharidsynthese in der Zukunft möglich sein (Ichikawa et al., Anal. Biochem. 202:215-238 (1992)). Die Tatsache, dass ein Pilz verändert werden kann, um genau definierte und einheitliche Glycosylstrukturen auf seinen abgeschiedenen Proteinen zu bilden, eröffnet Möglichkeiten, die biologische Bedeutung der Oligosacchariddiversität zu untersuchen und Kohlenhydratsynthese bzw. -veränderung ("carbohydrate engineering") durchzuführen. Für bestimmte Proteine kann die Herstellung einer einzelnen Glycoform produziert werden, um ein einheitliches therapeutisches Profil zu erhalten (P. Stanley, Molecular and Cellular Biology 9:377-383 (1989)).
BEISPIEL 13
Analyse des N-Glycan-Profils von T. reesei-Glycoproteine mittels Fluorophor-Markierung
Ein detailliertes Bild, sowohl quantitativ als auch qualitativ, wurde erhalten, wenn die Oligosaccharide mit dem Fluorophor 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonat derivatisiert wurden und nachfolgend elektrophoretisch auf einem Polyacrylamidgel getrennt wurden. In 4 zeigen wir das Oligosaccharidmuster der Cellobiohydrolase I aus T. reesei RUTC 30, das nach der Fermentation in Minimalmedium aufgereinigt wurde (Nyyssönen et al., Bio/Technology 11:591-595 (1993)). Das Muster, das in einem Gemisch von Proteinen, die durch den selben Trichoderma-Stamm abgeschieden wurden, erhalten wurde, aber in einem unterschiedlichen Wachstumsmedium (gemäß Uusitalo et al., 1991), ist ebenfalls gezeigt. Nur ein geringer Anteil von Oligosacchariden aus dem Ausgangsmaterial scheint Man₅GlcNAc₂ zu sein. Reichlicher vorhanden sind Man₆GlcNAc₂-, Man₇GlcNAc₂-, Man₈GlcNA₂- und Man₉GlcNAc₂-Oligosaccharide. N-Glycane, die größer als Man₉GlcNAc₂ sind, wurden ebenfalls gefunden.
Bei reinem CBH I wurden Oligosaccharide isoliert, die sogar kleiner als Man₅GlcNAc₂ waren. Im Allgemeinen sind die Zuckerketten von Trichoderma eindeutig viel kleiner als jene, die von Saccharomyces cerevisiae-Glycoproteinen isoliert wurden. Da das α-1,2-Mannosidase-Trimmen unvollständig ist (8), ist es sehr wahrscheinlich, dass Man nosereste in Verknüpfungen, die von der α-1,2-Verknüpfung verschieden sind, aufgrund der Übertragung auf die Produkte des Trimmens durch eine oder mehrere Mannosyltransferasen vorhanden sind.
BEISPIEL 14
Bestimmung der T. reesei-Mannosidase- und Mannosyltransferase-Aktivitäten und Schlussfolgerungen
Um die Ähnlichkeit zwischen der T. reesei-Glycosylsynthese und dem Säugetiersystem weitergehend im Detail zu untersuchen, versuchten wir, die Mannosidase-Aktivität zu lokalisieren, die für das Oligosaccharidpanel auf den abgeschiedenen Pilzproteinen verantwortlich ist. Zuerst prüften wird, ob Mannosidase in dem extrazellulären Medium des Pilzes vorhanden waren, die gegebenenfalls für ein "Nachabscheidungs"- ("postsecretional") Trimmen der Oligosaccharide auf andere abgeschiedenen Proteinen verantwortlich sein könnten. Wir entwickelten einen Assay, um diese Aktivität wie folgt zu bestimmen: Die Oligosaccharide von Rinderribonuclease B (kommerziell erhältlich als ein Referenz-Panel von Oxford Glycosystems) wurden als Substrat für Mannosidasen verwendet. Eine komplette Umsetzung zu Man₅GlcNAc₂ wird erhalten, wenn genügend α-1,2-Mannosidase vorhanden ist.
Man₅GlcNAc₂ wird weiter verkürzt ("trimmed"), wenn α-1,3- und/oder α-1,6-Mannosidasen vorhanden sind. Nach Markieren mit ANTS wurden die Ribonuclease B-Referenzoligosaccharide zu 70-fach konzentriertem extrazellulären Medium einer 4 Tage alten T. reesei-Kultur (wobei die Pilzzellen entfernt waren) hinzugefügt. Ein 4 Tage alter konzentrierter Kulturüberstand von Aspergillus saitoi wurde als eine Positivkontrolle für diesen Assay verwendet: Es ist bekannt, dass der letztere Organismus verschiedene Mannosidasen (eine α-1,2- und eine α-1,3(6)-Mannosidase) abscheidet, wenn er auf einem Minimalmedium, das Mannan als die Kohlenstoffquelle enthält, angezogen wurde(S.S. Keskar et al., Biotechnology Letters 15:695-690 (1993)). In 7 zeigen wir das Ergebnis einer Übernacht-Inkubation der Reaktionsmischungen: die α-1,2-Mannosidase-Aktivität von A. saitoi ist deutlich detektierbar. Die meisten Ribonuclease B-Oligosaccharide werden zu Man₅GlcNAc₂ verkürzt ("trimmed"). Keine oder nur marginale Mengen von Mannosidase sind in den Medium von T. reesei vorhanden, da das Ribonuclease-Referenzpanel unberührt blieb. Wir erwähnen hier, dass t. reesei viel mehr Proteine in sein Minimalmedium abschied (etwa 300 μg/ml) als das A. saitoi tat (kaum detektierbar, unter Verwendung des Bradford-Assays).
Unter Verwendung des gleichen ANTS-markierten Oligosaccharid-Panels aus Ribonuclease B, fanden wir intrazelluläre Mannosidase-Aktivität in Rohextrakten aus T. reesei, A. saitoi, L929-Mauszellen und S. cerevisiae. Wir versuchten weiterhin, hauptsächlich zwischen Mannosidasen zu unterscheiden, die in der Glycosylierungsreifung bzw. -verarbeitung in dem endoplasmatischen Reticulum, dem Golgi-Apparat aktiv sind und jenen, die in Vakuolen aktiv sind. Unter Verwendung von Differenzialzentrifugation oder Saccharosegradienten, um Organellen zu trennen, die aus T. reesei-Zellen repariert wurden, erhielten wir keine ausreichende Auflösung der verschiedenen Mannosidase-Aktivität in verschiedenen Organellen. Jedoch war die α-1,2-Mannosidase-Aktivität reichlich in den Fraktionen vorhanden, die für Mannosyltransferase-Aktivität angereichert war. Die Bestimmung der Mannosyltransferase-Aktivität wurde nach der Anpassung des Assays durchgeführt, beschrieben von Nakajima und Ballou (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 72:3912-3916 (1975)). Mit Reaktionsgemischen, die UDP-Mannose als Zuckerdonor, ANTS-markiertes Man₈GlcNAc als ein Substrat und Glycosylierungsenzyme, die aus den Membranpräparaten durch Triton X-100 solubilisiert wurden, enthielten, wurde Mannosyltransferase-Aktivität durch Verzögerung in der elektrophoretischen Mobilität der Substratoligosaccharide gezeigt (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die obigen Beispiele zeigen, dass es möglich ist, Säugetier-artige Hybrid-Oligosaccharide auf Glycoproteinen, die von dem Fadenpilz Trichoderma reesei abgeschieden wurden, zu bilden. Säugetier-Glycosyltransferasen, nämlich Human-N-Acetylglucosaminyltransferase I, produziert in COS-Zellen, β-1,4-Galactosyltransferase aus Humanmilch und α-2,6-Sialyltransferase aus Rattenleber, wurden verwendet, um in vitro den Glycosylierungssyntheseweg zu imitieren, wie er in Säugetierzellen auftritt. Eine Vorinkubation mit α-1,2-Mannosidase aus Aspergillus saitoi verbesserte wesentlich den GlcNAc-Einbau in die Pilzproteine. Mit den freien N-Glycanen, die aus Trichoderma reesei-Cellulase isoliert wurden, wurde gezeigt, dass nicht alle Zuckerketten umwandelbar sind in das ideale Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I: Man₅GlcNAc₂. Der Hauptteil der N-verknüpften Oligosaccharide ähnelt den Strukturen mit hohem Mannosegehalt, die auf bestimmten Proteinen von Säugetierzellen vorhanden sind, die hauptsächlich von Man₅GlcNAc₂ bis Man₉GlcNAc₂ reichen. Bei reinem CBH I, das nach Fermentation in Trichoderma-Minimalmedium erhalten wurde (Nyyssönen et al., 1993), scheint ein wesentlicher Anteil der Oligosaccharide sogar kleiner als Man₅GlcNAc₂ zu sein. Unter Verwendung eines anderen Fermentationsmediums erhielten wir jetzt auch Oligosaccharide, die größer waren als Man₉GlcNAc₂. Die elektrophoretische Mobilität von CBH I, das in den verschiedenen Medien produziert wurde, veränderte sich ebenfalls merkbar. Nach Entglycosylierung ("deglycosylation") verschob sich CBH I, hergestellt, wie durch Nyyssönen et al. (1993) beschrieben, nur geringfügig, verglichen mit der Ursprungsform, nach elektrophoretischer Trennung auf einem Polyacrylamid-Gel. Erschöpfender Verdau (lange Inkubationszeit und viele Units N-Glycanase) wurde benötigt, um die Oligosaccharide freizusetzen. Bei den Wachstumsbedingungen, die wir verwenden, wurde CBH I leicht entglycosyliert ("deglycosylated"), was eine ausgeprägte elektrophoretische Verschiebung, verglichen mit dem Originalprotein, verursachte (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Wirkungen, die Umgebungsfaktoren auf die Proteinglycosylierung haben können, sind tiefgründig durch Goochee und Monica (Bio/Technology 8:421-427 (1990), Bio/Technology 9:1347-1355 (1991)) beschrieben worden. Ihre Übersichtsartikel verstärken unsere Ansicht, dass das Wachstumsmedium die Ursache von Unterschieden in den Glycosylmustern sein kann, die auf Trichoderma-Proteinen gefunden wurden.
Die Versuche wurden durchgeführt, um die Lokalisierung der Mannosidase(n) aufzuklären, die für die kleinen N-Glycane auf den von Trichoderma abgeschiedenen Proteinen verantwortlich ist/sind. Die Möglichkeit der Abscheidung von Mannosidasen, die auf die anderen abgeschiedenen Pilzproteine wirken könnten, erscheint sehr unwahrscheinlich. Sogar bei sehr konzentriertem Wachstumsmedium und nach einer langen Inkubationszeit trat überhaupt kein Trimmen der Substrat-Oligosaccharide auf.
Wir nehmen an, dass das Reifen bzw. Verarbeiten in dem Trichoderma-Golgi-Apparat teilweise demjenigen von Säugetierzellen und teilweise demjenigen von Hefe ähnelt: Mannosidasen, die in der Lage sind, die Trichoderma-N-Glycane auf Man₅GlcNac₂ zurück zu kürzen ("trimming back"), scheinen vorhanden zu sein. Andererseits sind auch Mannosyltransferasen, die in der Lage sind, Mannosereste in Verknüpfungen, die von der α-1,2-Verknüpfung verschieden sind, zu übertragen, vorhanden. Die letztere Schlussfolgerung wurde nach Durchführen der Mannosyltransferase-Assays analog zu demjenigen von Nakajima und Ballou (1973) beschriebenen, bestätigt: Unter Verwendung von ANTS-markiertem Man₈GlcNAc als ein Substrat, gelang es uns, den Einbau von bis zu zwei Mannoseresten zu zeigen. Andererseits war Man₅GlcNAc kein Substrat für Mannosyltransferasen. Daher fragen wir uns, ob Man₅GlcNAc₂, die entscheidende Struktur für die Synthese von komplexen Zuckerstrukturen, nicht "in vivo" in T. reesei ein Substrat für Mannosyltransferase(n) sein wird.
Es ist bis jetzt nicht bekannt, wie ähnlich die Glycosylierungssynthese in Trichoderma reesei zu der in Säugetierzellen verläuft. Daher ist es schwierig, zu bewerten, ob dieser Organismus leicht verändert werden kann, so dass mehr, wenn nicht alle, der Glycosylgruppen in Säugetier-ähnliche Strukturen umgewandelt werden. Die in vitro-Versuche sind ein einleitender, erster Schritt zur Veränderung dieses Pilzes, so dass er Oligosaccharid synthetisiert, die in komplexe Strukturen auf dem einfachsten möglichen Weg umwandelbar sind. Wenn die ersten Schritte des Synthesewegs der komplexen Kohlenhydrate in vivo in einem Pilz, wie Trichoderma, auftreten würden, könnte die Vervollständigung des Glycosylierungswegs durch enzymatische Oligosaccharid-Modifikationen an Proteinen in vitro durchgeführt werden. Wir nehmen an, dass eine stereo-kontrollierte Oligosaccharidsynthese in großem Maß in der Zukunft möglich sein wird: Es ist viel Forschung im Gange, um die hohen Kosten, die mit diesen in vitro-Verarbeitungsschritten verbunden sind, zu verringern (Ichikawa et al., 1992). Schließlich kann ein anderer wichtiger Gesichtspunkt, betreffend diese Forschung, erwähnt werden: Die Tatsache, dass ein Pilz verändert werden kann, so dass er genau definierte und einheitliche Glycosylstrukturen auf seinen abgeschiedenen Proteinen synthetisiert. Für bestimmte Proteine kann die Herstellung einer einzelnen Glycoform gewünscht sein, um ein einheitliches therapeutisches Profil zu erhalten.
BEISPIEL 15
Transformation von T. reesei mit GlcNac Tri I-codierenden Sequenzen und Expression des modifizierten Glycoproteins von dem Trichoderma-Wirt
Wie oben beschrieben, wird ein DNA-Vektor konstruiert, der die codierende Sequenz von Human-GlcNAc Tr I (Genbank Accession No. M55621; EMBL ID No. HSGLCNAC) enthält, und zwar der Art, dass die DNA, die die codierende Sequenz für das GlcNAc Tr I-Enzym bereitstellt, durchführbar an den CBHI-Promotor und -Terminator gebunden ist. Ein solcher Vektor wird in T. reesei transformiert unter Verwendung der Technik, die in EP 0 244 234 beschrieben ist, und die positiven Transformanten werden ausgewählt.
Eine der positiven Transformanten wird weiter mit einem zweiten Vektor transformiert, der zu Ovalbumin in einer Form codiert, dass es von dem Trichoderma-Wirt abgeschieden wurde, und Transformanten, die sowohl GlcNAc Tr I als auch Ovalbumin exprimierten, wurden ausgewählt.
Ovalbumin, das in das Trichoderma-Medium abgeschieden wird, ist bereits zu einer ersten Hybridform durch die intrazelluläre Wirkung von GlcNac Tr I verarbeitet bzw. gereift.
Dieses Ovalbumin wird weiter verarbeitet bzw. gereift unter Verwendung von β-1,4-Galactosyltransferase und α-2,6-Sialytransferase, wie in Beispiel 11 beschrieben.
BEISPIEL 16
Transformation von T. reesei mit GlcNAc Tr I-codierenden Sequenzen und Expression des modifizierten Glycoproteins von dem Trichoderma-Wirt
Wie in Beispiel 15, außer, dass das Ovalbumin mit einer nicht-spezifischen α-Mannosidase nach Behandlung mit β-1,4-Galactosyltransferase oder nach Behandlung mit α-2,6-Sialyltransferase verarbeitet bzw. gereift wird.
BEISPIEL 17
Transformation von T. reesei mit GlcNAc Tr I-codierenden Sequenzen und Expression des modifizierten Glycoproteins von dem Trichoderma-Wirt
Wie in Beispiel 15 oder Beispiel 16, außer dass das Gen von Interesse für Erythropoietin (EPO), Human-Choriogonadotropin (HCG), Follitropin (FSH), Thyrotropin (TSH), Lutropin (LH), NCAM, Tenascin, Thrombospondin, Fibronectin, Hormone, Cytokine (insbesondere Interleukin-4 und Interferon-γ), Wachstumsfaktoren, Plasmaproteine, Gerinnungsfaktoren, lösliche Rezeptoren, einen Antikörper, Granulocyte-Macrophage-colony-stimulating-Faktor (GM-CSF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, HIV-Virus-Glycoprotein gp120, Virushüllenproteine, Immunglobulin D, Antithrombin IIIβ, Plasminogen, den von Willebrand-Faktor, Fibrinogen, Corticosteroid-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Globulin, Folatbindendes Protein, Fibrinectin, Knochen- und Thrombozyten-Osteonectin, EGF-Rezeptor, Rezeptoren für Insulin und den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I, Rezeptoren für den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Lymphozyten-CD2, MHC-Klasse II-Moleküle, Glucosetransporter, das Erythrozyten-Band-3-Protein, β-2-adrenerge Rezeptoren, Transferrin-Rezeptor, VIP-Rezeptor, Membran-Klasse I-MHC-Protein, Vasopressin-Rezeptor von LLC-PK1-Zellen, Low-density-Lipoprotein-Rezeptor, Asialoglycoprotein-Rezeptor, CD4-Protein, Thyrotropin-Rezeptor, PDGF-Rezeptor, Jackbohnen-Concanavalin A, Kobragift-Faktor, Lactotransferrin, Spinat-Chloroplasten-Kopplungsfaktor, Glandula submandibularis-Mucin, Intestinalbürstensaum-Lactase-Phlorizin-Hydrolase, das Antigefrier-Glycoprotein arktischer Fische, LDL-Rezeptor, Glucophorin A und β-HCG, eine Peptiduntereinheit von einem der obigen oder ein funktionelles Fragment von einem der obigen codiert.
BEISPIEL 18
Modifikation von in Hefe produzierten Proteinen
Ein Protein von Interesse, insbesondere ein in den Beispielen 15 und 17 beschriebenes, wird in einer Hefe, ausgewählt aus Pichia spp. (insbesondere Pichia pastoris), Hansenula spp. (insbesondere Hansenula polymorpha), Kluyveromyces lactis, Yarrowia Lipolytica oder S. cerevisiae, produziert und behandelt, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit einer α-1,2-Mannosidase vor der aufeinander folgenden Behandlung mit GlcNAc Tr I, β-1,4-Glactosyltransferase und α-2,6-Sialyltransferase.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Hybridglycoproteins, da durch gekennzeichnet, dass das Verfahren Kultivieren eines Fadenpilzes derart, dass ein Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt produziert wird, das ein Akzeptorsubstrat für GlcNAc Tr I ist, und Umsetzen des genannten Glycoproteins des Typs mit hohem Mannosegehalt mit GlcNAc Tr I umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt ein Protein ist, das zu dem Pilz homolog ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt ein Protein ist, das für den Pilz heterolog ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Pilz ein Trichoderma oder Aspergillus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Pilz Trichoderma reesei, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt intrazellulär in dem Pilz mit GlcNAc Tr I umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt mit α-1,2-Mannosidase umgesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridglycoproteins in einer Hefe oder einem Fadenpilz, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: (a) Umsetzen eines Glycoproteins des Typs mit hohem Mannosegehalt, das in einer Hefe oder einem Fadenpilz produziert wurde, in vivo mit einer α-1,2-Mannosidase und (b) Umsetzen des Glycoproteins von Schritt (a) mit GlcNAc Tr I.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei Schritt (b) intrazellulär erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hefe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Mitglied von Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae und Yarrowia lipolytica besteht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Pichia spp. Pichia pastoris ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei Hansenula spp. Hansenula polymorpha ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Hefe S. cerevisiae ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Pilz Trichoderma oder Aspergillus ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Pilz Trichoderma reesei, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt mit UDP-GlcNAc umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, das außerdem Umsetzen des Hybridglycoproteins mit β-1,4-Galaktosyltransfase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Hybridglycoprotein mit UDP-Galaktose umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, das außerdem Umsetzen des Hybridglycoproteins mit α-2,6-Sialyltransferase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Hybridglycoprotein mit CMP-Sialsäure umgesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Umsetzungsschritte in vitro durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt vor der Umsetzung mit GlcNAc Tr I mit α-1,2-Mannosidase umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei das Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt ein Man₅GlcNAc₂ mit der Struktur
ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei das Hybridglycoprotein ein GlcNAcMan₅GlcNAc mit der Struktur
ist.