ES2247141T3

ES2247141T3 - 7-beta-hidroxiesteroides neuroprotectores.

Info

Publication number: ES2247141T3
Application number: ES01945490T
Authority: ES
Inventors: Ernst Wulfert; Ashley Ker Pringle; Lars Eric Sundstrom
Original assignee: Hunter Fleming Ltd
Current assignee: Hunter Fleming Ltd
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: CA2414583A1; AU6770501A; EP1294381B1; NO20026244L; CA2414583C; NO332089B1; HUP0301317A3; GB2363984A; AU2001267705B2; CZ305306B6; HUP0301317A2; DE60113112D1; KR100829490B1; NO20026244D0; SI1294381T1; RU2258511C2; HK1052299B; CN100441189C; KR20030034112A; DK1294381T3

Abstract

Uso para la fabricación de un medicamento para la protección contra el daño neuronal de un 7fi-hidroxiesteroideo su éster farmacéuticamente aceptable u otro derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, según la fórmula (I) o (II): donde R1 y R2 son iguales o distintos uno de otro y representan cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, un grupo alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, un grupo arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un grupo formilo, un grupo alquilcarbonilo que tiene de 2 a 7 átomos de carbono, un grupo alquenilcarbonilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, un grupo alquinilcarbonilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, un grupo arilcarbonilo que tiene de 7 a 11 átomos de carbono, un grupo aralquilcarbonilo que tiene de 8 a 15 átomos de carbono, un grupo aralquenilcarbonilo que tiene de 9 a 15 átomos de carbono, o un grupo heterocíclico-carbonilo como se define a continuación; uno de Ra y Rb representa un grupo hidroxi, preferiblemente en la configuración fi, y el otro representa un átomo de hidrógeno, o bien Ra y Rb representan juntamente un grupo oxo; el anillo A, es un anillo de benceno o de ciclohexano; cuando el anillo A es un anillo de ciclohexano, la línea de trazos en el anillo B representa un enlace sencillo o doble de carbono-carbono y y n es 1; o bien cuando el anillo A es un anillo de benceno, la línea de trazos en el anillo B representa un enlace sencillo de carbono-carbono y y n es 0.

Description

7-\beta-hidroxiesteroides neuroprotectores.

La presente invención se refiere al uso de una serie de compuestos 3-hidroxi-7\beta-hidroxiesteroides y de determinados derivados cetónicos de los mismos para protección contra la muerte de las células neuronales, siendo dichos compuestos y derivados por consiguiente útiles en el tratamiento y la prevención de afecciones o de las secuelas de afecciones tales como la Enfermedad de Alzheimer, la Enfermedad de Parkinson, el Trastorno Cognitivo No Demencia (CIND), el ataque neurológico, el trauma cerebral, la lesión del cordón espinal y la lesión de los nervios periféricos; y siendo dichos compuestos y derivados también útiles para acrecentar la función cognitiva.

La producción de metabolitos 7\alpha-hidroxilados de dehidroepiandrosterona (DHEA) in vivo ha sido conocida desde 1959 con la identificación de 7\alpha-hidroxi-DHEA en la orina [J J Schneider, M L Lewbart, Recent Progr. Horm. Res. 15 (1959) 201-230; L Starka et al., Clin. Chim. Acta. 7 (1961) 309-316]. Desde entonces, se ha informado sobre una extensiva 7\alpha-hidroxilación de sustratos 3\beta-hidroxiesteroides (incluyendo la DHEA y la epiandrosterona - EPIA) en preparaciones tisulares de muchos órganos humanos entre los que se incluyen el hígado adulto y fetal, los testes, el epidídimo, la piel, el tejido mamario, la próstata, las células estromales adiposas y las amígdalas. La hidroxilación de DHEA en la posición 7 ha sido también demostrada en hígado de rata y en numerosos órganos y tejidos murinos. Sin embargo, se ha prestado escasa o ninguna atención al equivalente 7\beta. En todos estos estudios, la 7\alpha-hidroxi-DHEA era con mucho el principal metabolito producido. Ciertamente, Doostzadeh et al. [Steroids 63 (1998) 608-614] describieron que la tasa relativa de producción de 7\alpha-hidroxi-DHEA por parte de los microsomas de hígado de ratón era más de quince veces la tasa relativa de producción de 7\beta-hidroxi-DHEA.

Se ha demostrado también que la EPIA, la DHEA y la pregnenolona son rápida y extensivamente transformadas en sus correspondientes 7\alpha-hidroximetabolitos en el cerebro de rata [J M Guiraud et al., Steroids 34 (1979) 241-248; M Warner et al., Endocrinology 124 (1989) 2699-2706; Y Akwa et al., Biochem. J. 288 (1992) 959-964].

La WO97/37664 describe el uso de una variedad de compuestos entre los que se incluyen esteroides 7\alpha-hidroxisustituidos para tratar trastornos neuropsiquiátricos, inmunológicos o endocrinológicos. Entre los trastornos que en la WO97/37664 se sugería que podían ser tratados mediante el uso de estos compuestos está incluida la Enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el mecanismo sugerido para esta acción es el de que se establece la hipótesis de que el trastorno es resultado de un déficit del esteroide 7\alpha-hidroxisustituido en el cerebro, y el tratamiento que se propone en la WO97/37664 rectifica por consiguiente este déficit mediante la administración de un esteroide 7\alpha-hidroxisustituido para sustituir al compuesto que falta. El procedimiento que se describe en la WO97/37664 trata por consiguiente una afección ya existente, en lugar de prevenir la afección o prevenir un empeoramiento de la afección previniendo un adicional daño neuronal. La WO97/37664 no describe por consiguiente un efecto neuroprotector. Lo que se afirma se basa asimismo en la creencia de que el agente activo es el compuesto 7\alpha, y de que el compuesto 7\beta, en caso de estar presente, es inactivo.

La WO94/20111 también describe el uso de una serie de derivados de DHEA para prevenir o reducir la pérdida de viabilidad tisular ocasionada por la adherencia de neutrófilos a células endoteliales. Sin embargo, éste no es el mecanismo en virtud del cual son ocasionados los trastornos que son tratados por la presente invención.

A pesar de que se sabía que los 7\beta-hidroxianálogos de los compuestos descritos en la WO97/37664 son producidos in vivo, los mismos son producidos en cantidades de menos de un 5%, en comparación con el porcentaje de más de un 95% del isómero 7\alpha. Además, no ha sido caracterizado sistema enzimático alguno que sea responsable de la conversión de estos 3-hidroxiesteroides en sus correspondientes 7\beta-hidroxiderivados. Por todas estas razones y a la luz de la investigación que ha sido resumida anteriormente, está claro por la literatura que lo que se preveía en general era que el isómero 7\beta sería inactivo. Como resultado de ello y como está claro por la literatura resumida anteriormente y por mucha más, prácticamente no se ha efectuado investigación alguna acerca de la posible actividad biológica de los compuestos 7\beta.

En contra de estas previsiones, hemos descubierto sorprendentemente que los esteroides 7\beta-hidroxisustituidos sí tienen actividad biológica, y que esta actividad no es la actividad que se describe en la WO97/37664 para los esteroides 7\alpha-hidroxisustituidos. Dicha actividad biológica es en lugar de ello una actividad neuroprotectora tal como la que ha sido demostrada anteriormente, bien que en una distinta clase de compuestos, en la WO99/31049.

En eventos tales como la isquemia y la hipoxia prolongada, que pueden estar o pueden no estar asociadas a la hipoglucemia, se da daño neuronal en distintos grados.

La isquemia se produce típicamente durante los ataques cardíacos, pero el daño que se produce en tales eventos queda prácticamente limitado a los tejidos cardíacos, y han sido desarrollados determinados tratamientos. Con respecto a la presente invención, nos ocupamos de los efectos de la isquemia tanto a corto plazo como a más largo plazo en el cerebro, tal como lo que sucede en el caso de los pacientes de ataque neurológico o como resultado de lesiones en la cabeza, y también en las enfermedades neurodegenerativas de desarrollo más lento en el envejecimiento en las que los niveles subumbrales de isquemia y/o un comprometido suministro de energía pueden contribuir a los cambios degenerativos que se observan en el cerebro. La gravedad de la isquemia depende de la naturaleza del ataque neurológico o de la lesión, pero invariablemente hay daño cerebral, y es a esto a lo que se dirige la presente invención.

Son conocidos en la técnica varios agentes neuroprotectores que intentan aliviar el problema del daño cerebral, pero todos los que son actualmente conocidos tienden a ir asociados a efectos secundarios adversos. Por ejemplo, el MK801 (maleato de dizocilpina) es una molécula que es bastante simple y de la que se sabe que proporciona un nivel de neuroprotección a los pacientes isquémicos. Sin embargo, el MK801 va también asociado a "alarmantes efectos psicotrópicos" (Martindale), así como a adversos efectos motores. Los efectos neuroprotectores están detallados en Brain Research 755 (1997) 36-46 (Pringle, A.K., et al.), quedando dicha publicación incorporada a la presente por referencia. Estos mismos autores también describieron los efectos neuroprotectores de la conotoxina en un informe anterior, pero, a pesar de los efectos neuroprotectores de este compuesto, se observan efectos secundarios adversos in vivo.

Así, la presente invención consiste en el uso para la fabricación de un medicamento para la protección contra el daño neuronal de un 7\beta-hidroxiesteroide o su éster farmacéuticamente aceptable u otro derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, según la fórmula (I) o (II):

1

2

donde

R^{1} y R^{2} son iguales o distintos uno de otro y representan cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alquenilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, un grupo alquinilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, un grupo arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un grupo formilo, un grupo alquilcarbonilo que tiene de 2 a 7 átomos de carbono, un grupo alquenilcarbonilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, un grupo alquinilcarbonilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, un grupo arilcarbonilo que tiene de 7 a 11 átomos de carbono, un grupo aralquilcarbonilo que tiene de 8 a 15 átomos de carbono, un grupo aralquenilcarbonilo que tiene de 9 a 15 átomos de carbono, o un grupo heterocíclico-carbonilo como se define a continuación;

uno de R^{a} y R^{b} representa un grupo hidroxi, preferiblemente en la configuración \beta, y el otro representa un átomo de hidrógeno, o bien R^{a} y R^{b} representan juntamente un grupo oxo;

el anillo A, 3, es un anillo de benceno o ciclohexano;

cuando el anillo A es un anillo de ciclohexano, la línea de trazos en el anillo B representa un enlace sencillo o doble de carbono-carbono y n es 1; o bien cuando el anillo A es un anillo de benceno, la línea de trazos en el anillo B representa un enlace sencillo de carbono-carbono y n es 0;

dicho grupo heterocíclico-carbonilo es un grupo de fórmula R^{3}-CO, donde R^{3} representa un grupo heterocíclico que tiene de 3 a 7 átomos de anillo de los cuales de 1 a 3 son heteroátomos seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de átomos de nitrógeno, átomos de oxígeno y átomos de azufre, y de los cuales el átomo restante o los átomos restantes es al menos un átomo de carbono o son átomos de carbono;

siendo insustituidos o insustituidas o teniendo al menos uno de los siguientes sustituyentes \Psi dichos grupos alquilo, alquenilo y alquinilo y las partes alquilo, alquenilo y alquinilo de dichos grupos alquilcarbonilo, alquenilcarbonilo y alquinilcarbonilo:

sustituyentes \Psi: grupos hidroxi, grupos mercapto, átomos de halógeno, grupos amino, grupos alquilamino que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos dialquilamino en los cuales cada grupo alquilo tiene a 1 a 6 átomos de carbono, grupos carbamoilo, grupos nitro, grupos alcoxi que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos alquiltio que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos carboxi, grupos alcoxicarbonilo y grupos arilo insustituido que tienen de 6 a 10 átomos de carbono;

siendo insustituidos o insustituidas o teniendo al menos uno de los siguientes sustituyentes \xi dichos grupos arilo, dichos grupos heterocíclicos y las partes arilo de dichos grupos arilcarbonilo y dichos grupos aralquilcarbonilo:

sustituyentes \xi: cualesquiera de los sustituyentes \Psi y grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos hidroxialquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono y grupos haloalquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono;

y sales y ésteres farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Una clase particular de 7\beta-hidroxiesteroides que son de especial interés para la presente invención son los 3\beta,7\beta-dihidroxiesteroides y los ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Son ésteres preferidos los ésteres de ácido carboxílico.

Más preferiblemente, en los compuestos de fórmula (I):

R^{1} y R^{2} son iguales o distintos uno de otro y representan cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo fenilo opcionalmente sustituido, un grupo formilo, un grupo alquilcarbonilo que tiene de 2 a 5 átomos de carbono, un grupo arilcarbonilo que tiene de 7 a 11 átomos de carbono, un grupo aralquilcarbonilo que tiene 8 a 15 átomos de carbono o un grupo heterocíclico-carbonilo como se define a continuación;

uno de R^{a} y R^{b} representa un grupo hidroxi en la configuración \beta, y el otro representa un átomo de hidrógeno, o bien R^{a} y R^{b} representan juntamente un grupo oxo;

dicho grupo heterocíclico-carbonilo es un grupo de fórmula R^{3}-CO, donde R^{3} representa un grupo heterocíclico que tiene de 3 a 7 átomos de anillo de los cuales de 1 a 3 son heteroátomos seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de átomos de nitrógeno, átomos de oxígeno y átomos de azufre, y de los cuales el átomo restante o los átomos restantes es al menos un átomo de carbono o son átomos de carbono.

En los compuestos de la presente invención, cuando R^{1}, R^{2} o el sustituyente \xi es un grupo alquilo, éste puede ser un grupo alquilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 6 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1-etilpropilo, 2-etilpropilo, 1,1-dimetilpropilo, hexilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 3-etilbutilo, t-hexilo y 1,1-dimetilpentilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos metilo y etilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representan un grupo alquenilo, éste puede ser un grupo alquenilo de cadena recta o ramificada que tenga de 2 a 6 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos vinilo, 1-propenilo, alilo, isopropenilo, metalilo, 1-, 2-, 3-butenilo, isobutenilo, 1-, 2-, 3-, 4-pentenilo y 1-, 2-, 3-, 4-, 5-hexenilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos alquenilo que tienen de 2 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos vinilo y alilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo alquinilo, éste puede ser un grupo alquinilo de cadena recta o ramificada que tenga de 2 a 6 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos etinilo, 1-, 2-propinilo, 1-, 2-, 3-butinilo, isobutinilo, 1-, 2-, 3-, 4-pentinilo y 1-, 2-, 3-, 4-, 5-hexinilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos alquinilo que tienen de 2 a 4 átomos de carbono.

Cuando R^{1}, R^{2} o el sustituyente \Psi representa un grupo arilo, éste es un grupo carbocíclico aromático que tiene de 6 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos de tales grupos incluyen los grupos fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo e indenilo, de los cuales es preferido el grupo fenilo. Excepto en el caso del sustituyente \alpha, estos grupos pueden ser sustituidos o insustituidos. Cuando el grupo es sustituido, el número de sustituyentes queda limitado tan sólo por el número de posiciones sustituibles, y posiblemente en algunos casos por las limitaciones estéricas. Así, en el caso de los grupos fenilo, el máximo número de sustituyentes es de 5, en el caso de los grupos naftilo el máximo número de sustituyentes es de 7, y así sucesivamente. Sin embargo, un número preferido de sustituyentes es de 1 a 3, y los sustituyentes son como se describe a continuación.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo alquilcarbonilo, éste es un grupo alcanoilo, que puede ser un grupo de cadena recta o ramificada que tenga de 2 a 7 átomos de carbono (es decir, de 1 a 6 átomos de carbono en la parte alquilo), y los ejemplos incluyen los grupos acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo, pivaloilo, hexanoilo y heptanoilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 2 a 5 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos acetilo y propionilo. La parte alquilo de este grupo puede ser sustituida o insustituida, y, en caso de ser sustituida, los sustituyentes son seleccionados de entre los sustituyentes \alpha. Los ejemplos de tales grupos sustituidos incluyen los grupos alanilo, \beta-alanilo, fenilalanilo, asparaginilo, cisteinilo, glicoloilo, glicilo, metionilo, ornitilo, gliceroilo, tropoilo, glutaminilo, glutamilo, homocisteinilo, serilo, homoserilo, treonilo, lactoilo, leucilo, isoleucilo, norleucilo, lisilo, valilo, norvalilo y sarcosilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo alquenilcarbonilo, éste puede ser un grupo alquenilcarbonilo de cadena recta o ramificada que tenga de 3 a 7 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos acriloilo, metacriloilo, crotonilo, isocrotonilo, 3-butenoilo, pentenoilo y hexenoilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos alquenilcarbonilo que tienen de 3 a 5 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos acriloilo y metacriloilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo alquinilcarbonilo, éste puede ser un grupo alquinilcarbonilo de cadena recta o ramificada que tenga de 3 a 7 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos propioloilo, 3-butinilcarbonilo, pentinilcarbonilo y hexinilcarbonilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos alquinilcarbonilo que tienen de 3 a 5 átomos de carbono.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo arilcarbonilo, la parte arilo de éste puede ser cualquiera de los grupos arilo que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los grupos arilcarbonilo preferidos incluyen los grupos benzoilo,
o-, m- o p-toluoilo, o-, m- o p-anisoilo, o-, m- o p-hidroxibenzoilo, picrilo, galoilo, protocatecuoilo, vaniloilo, veratroilo, antraniloilo, 1-naftoilo y 2-naftoilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo aralquilcarbonilo o aralquenilcarbonilo, el grupo arilo y, según el caso, el grupo alquilo o alquenilo puede ser cualquiera de los grupos que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los ejemplos específicos de tales grupos incluyen los grupos fenilacetilo, 3-fenilpropionilo, benciloilo, tirosilo, atropoilo, hidratropoilo y cinamoilo.

Cuando R^{1} o R^{2} representa un grupo heterocíclico-carbonilo, éste es un grupo de fórmula R^{3}-CO-, donde R^{3} representa un grupo heterocíclico que tiene de 3 a 7 átomos de anillo, de los cuales de 1 a 3 son átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre, siendo los restantes átomos de carbono. Al menos uno de los átomos de anillo deberá ser un átomo de carbono. Cuando hay 3 heteroátomos, se prefiere que al menos uno sea un átomo de nitrógeno. Los ejemplos de tales grupos incluyen los grupos 2- y 3-furoilo, 2- y 3-tenoilo, 2-piridincarabonilo, nicotinoilo, isonicotinoilo, prolilo, piperidincarbonilo, piperazincarbonilo y morfolinocarbonilo.

Cuando el sustituyente \Psi o el sustituyente \xi es un grupo alquilamino que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, la parte alquilo puede ser cualquiera de los grupos alquilo que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los ejemplos preferidos de tales grupos alquilamino incluyen los grupos metilamino, etilamino, propilamino, isopropilamino, butilamino, isobutilamino, sec-butilamino, t-butilamino, pentilamino, isopentilamino, neopentilamino, t-pentilamino, hexilamino e isohexilamino, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos metilamino y etilamino.

Cuando el sustituyente \Psi o el sustituyente \xi es un grupo dialquilamino, cada parte alquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono, y los dos grupos alquilo pueden ser iguales o distintos uno de otro. Los grupos alquilo pueden ser cualesquiera de los grupos alquilo que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los ejemplos preferidos de tales grupos dialquilamino incluyen los grupos dimetilamino, metiletilamino, dietilamino, metilpropilamino, dipropilamino, diisopropilamino, etilbutilamino, dibutilamino, di-t-butilamino, metilpentilamino, dipentilamino, diisopentilamino y dihexilamino, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono en cada grupo alquilo, siendo los más preferidos los grupos dimetilamino y dietilamino.

Cuando el sustituyente \Psi o el sustituyente \xi es un grupo alcoxi, éste puede ser un grupo alcoxi de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 6 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, t-butoxi, pentiloxi, isopentiloxi, neopentiloxi, t-pentiloxi, hexiloxi e isohexiloxi, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos metoxi y etoxi.

Cuando el sustituyente \Psi o el sustituyente \xi es un grupo alquiltio que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, la parte alquilo puede ser cualquiera de los grupos alquilo que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los ejemplos preferidos de tales grupos alquiltio incluyen los grupos metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, isobutiltio, sec-butiltio, t-butiltio, pentiltio, isopentiltio, neopentiltio, t-pentiltio, hexiltio e isohexiltio, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos metiltio y etiltio.

Cuando el sustituyente \Psi o el sustituyente \xi es un grupo alcoxicarbonilo, éste puede ser un grupo alcoxicarbonilo de cadena recta o ramificada que tenga de 2 a 7 átomos de carbono, y los ejemplos incluyen los grupos metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, sec-butoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, pentiloxicarbonilo, isopentiloxicarbonilo, neopentiloxicarbonilo, t-pentiloxicarbonilo, hexiloxicarbonilo e isohexiloxicarbonilo, de los cuales son preferidos aquellos grupos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, siendo los más preferidos los grupos metoxicarbonilo y etoxicarbonilo.

Cuando el sustituyente \xi es un grupo hidroxialquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, la parte alquilo puede ser cualquiera de los grupos alquilo que han sido definidos y ejemplificados anteriormente. Los ejemplos preferidos de tales grupos hidroxialquilo incluyen los grupos hidroximetilo, 1- y 2-hidroxietilo, 1-, 2- y 3-hidroxipropilo, 1,2-dihidroxietilo, 1,2,3-trihidroxipropilo, 4-hidroxibutilo, 5-hidroxipentilo y 6-hidroxihexilo.

Cuando el sustituyente \xi es un grupo haloalquilo que tiene de 1 a 6, y preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, la parte alquilo puede ser como la definida y ejemplificada anteriormente, y el átomo de halógeno es preferiblemente cloro, flúor, bromo o yodo. Los ejemplos de tales grupos incluyen los grupos fluorometilo, clorometilo, bromometilo, yodometilo, diclorometilo, difluorometilo, triclorometilo, trifluorometilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2-bromoetilo, 2-yodoetilo, 2,2-dibromoetilo, 2,2,2-tribromoetilo, 3-fluoropropilo, 3-cloropropilo, 4-bromobutilo, 4-fluorobutilo, 5-fluoropentilo y 6-fluorohexilo.

Se comprenderá que cuando el compuesto contiene un grupo de fórmula -OR, donde R es cualquiera de los grupos y átomos que han sido definidos anteriormente en relación con R^{1} etc., la especie activa es probable que sea el compuesto que contiene el grupo hidroxi libre. En consecuencia, puede usarse en lugar del grupo hidroxi cualquier grupo que pueda ser convertido in vivo en un grupo hidroxi.

Los ejemplos específicos de compuestos de la presente invención incluyen:

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Además, se piensa que es activo de la misma manera el siguiente compuesto 7\alpha-hidroxi:

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Hemos descubierto sorprendentemente que estos compuestos pueden ser usados para proporcionar protección contra los daños neuronales agudos y crónicos que son ocasionados por eventos tales como el ataque neurológico, el trauma cerebral y la isquemia cerebral tal como la que puede ser inducida por una hemorragia subaracnoide o como la que se produce durante la cirugía de establecimiento de bypass cardíaco, etc.

Los compuestos de la presente invención pueden ser preparados mediante los de una variedad de procedimientos que son perfectamente conocidos en sí mismos, partiendo de los esteroides de origen. Por ejemplo, dichos compuestos pueden ser preparados por los métodos que se describen en la literatura a la que se ha aludido anteriormente, con lo cual se obtendría una mezcla de los compuestos 7\beta y los correspondientes compuestos 7\alpha, que pueden ser entonces separados mediante la utilización de técnicas que son perfectamente conocidas.

Como ejemplo, la 7\beta-hidroxi-EPIA puede ser obtenida a partir de DHEA por oxidación alílica tras la protección del grupo 3\beta-hidroxi y del grupo 17-cetona usando métodos convencionales. El producto es entonces reducido con un catalizador de compuesto metálico soluble (tal como hidruro sódico) y son desprotegidos los grupos 3\beta-hidroxi y 17-cetona. Los epímeros 7\alpha-hidroxi y 7\beta-hidroxi pueden ser entonces separados por procedimientos convencionales, como por ejemplo por cromatografía en columna, y la 7\beta-hidroxi-EPIA puede ser cristalizada hasta su
pureza.

Se ilustra en el siguiente esquema de reacción un método sintético alternativo:

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En las fórmulas anteriores, TBDMSO representa t-butildimetilsililoxi, y Ac representa acetilo.

En el primer paso del esquema de reacción anteriormente ilustrado, el compuesto de fórmula (III), que es estrona, es protegido por un grupo t-butildimetilsililoxi de manera convencional para dar el compuesto protegido de fórmula (IV). Se hace entonces que este compuesto reaccione con etilenglicol en presencia de un catalizador ácido (tal como ácido p-toluensulfónico) para proteger el grupo ceto en la posición 17 y dar el compuesto de fórmula (V). Puede ser entonces introducido un grupo hidroxi en la posición 6 como se ilustra más adelante en el Ejemplo 3, para dar el compuesto de fórmula (VI), el cual es entonces deshidratado para dar el compuesto de fórmula (VII). Éste es epoxidado para dar el compuesto de fórmula (VIII), el cual es entonces reducido al compuesto de fórmula (IX), con un grupo 7\alpha-hidroxi. El grupo protector t-butildimetilsililo es retirado, siendo así obtenido el compuesto de fórmula (X), y éste es calentado con una cantidad catalítica de un ácido, para obtener 7\alpha-hidroxi-estrona (XI). Ésta es oxidada, usando p. ej. ácido crómico/ácido sulfúrico, para obtener la 7-ceto-estrona (XII), a la cual se hace entonces reaccionar con anhídrido acético, para así obtener el compuesto de fórmula (XIII). Este compuesto es hidrogenado, usando p. ej. hidrógeno en presencia de un catalizador de paladio, para así obtener el compuesto de fórmula (XIV), y finalmente son retirados los grupos acetilo, para así obtener 7\beta-hidroxi-estrona (XV), que es un compuesto de la presente invención. Si se desea, ésta
puede ser reducida, para obtener 7\beta-hidroxi-estradiol (XVI), que es también un compuesto de la presente invención.

Otros 7\beta-hidroxi-compuestos de la presente invención pueden ser preparados de manera similar, siendo así que por ejemplo puede prepararse 7\beta-hidroxi-DHEA como se ilustra mediante el siguiente esquema de reacción:

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En este esquema de reacción, la DHEA (XVII) es acetilada para dar el correspondiente acetato de fórmula (XVIII), al que se hace entonces reaccionar con etilenglicol, para así obtener el cetal de fórmula (XIX). El cetal (XIX) es entonces oxidado como se describe en el Ejemplo 16, para así obtener el correspondiente 7-cetocompuesto (XX), que es entonces desacetilado, para así obtener el compuesto de fórmula (XXI). Éste es reducido, para así obtener 7-hidroxi-17-cetal-EPIA de fórmula (XXII), que es entonces tratada con un ácido para retirar el grupo cetal y obtener 7-hidroxi-EPIA, que es finalmente separada en los isómeros 7\beta y 7\alpha por cromatografía, para así obtener 7\alpha-hidroxi-EPIA (XXIV) y 7\beta-hidroxi-EPIA (XXV).

Los compuestos de la presente invención pueden ser aplicados al paciente si se sospecha que el mismo está en peligro de sufrir un evento isquémico, y en especial un ataque neurológico o una lesión en la cabeza. Tal aplicación profiláctica puede resultar extraordinariamente útil. Sin embargo, también se ha demostrado que los compuestos de la presente invención tienen una actividad útil incluso si son aplicados después de un evento isquémico, pero se comprenderá que se prefiere administrar los compuestos lo antes posible, a fin de evitar la degeneración neuronal en la medida de lo posible. En algunas circunstancias puede ser deseable administrar dosis repetidas, especialmente cuando el paciente siga estando en peligro de su sufrir un evento isquémico.

Los métodos adecuados de administración son en general mediante inyección, a fin de lograr el resultado deseado lo antes posible. Así, es particularmente preferida la inyección intravenosa, pero en algunas circunstancias puede ser preferible administrar el compuesto directamente al fluido cerebroespinal.

La dosis del compuesto de la presente invención variará en dependencia de muchos factores entre los que se incluyen la edad, el peso corporal y el estado general del paciente, así como el modo, la frecuencia y la ruta de administración. Sin embargo, se recomienda en general una dosis de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, siendo más preferida una dosis de 0,05 a 20 mg/kg de peso corporal. Esto puede administrarse en una sola dosis o en dosis divididas.

Se ilustra a continuación más ampliamente la invención mediante los siguientes Ejemplos no limitativos, de los cuales los Ejemplos 1 a 20 ilustran la preparación de compuestos de la presente invención, y los Ejemplos 21 y 22 ilustran su actividad. En los Ejemplos 1 a 20, los números romanos se refieren a las fórmulas que aparecen en los esquemas de reacción que han sido ilustrados anteriormente.

Ejemplo 1 3-t-Butildimetilsilil-estrona (IV)

4,25 g de cloruro de t-butildimetilsililo (28,2 mmoles, 3 eq.) fueron añadidos a una solución de 50 ml de dimetilformamida (DMF) que contenía 2,54 g de estrona (III) (9,41 mmoles, 1 eq.) y 3,84 g de imidazol (56,5 mmoles, 6 eq.) en un matraz de tres cuellos y de 100 ml. La mezcla fue entonces dejada en reposo durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Fue añadida al medio de reacción una solución acuosa de carbonato potásico al 10% en peso/volumen, siendo ello entonces sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue lavada con agua y fue luego secada mediante sulfato sódico anhidro y evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 3,76 g de 3-t-butildimetilsilil-estrona 2 (9,41 mmoles, 100%).

Ejemplo 2 17-Cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (V)

Una solución de 60 ml de tolueno que contenía 3 g de 3-t-butildimetilsilil-estrona (IV) (7,50 mmoles), 3 ml de etilenglicol y una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico fue calentada hasta el reflujo con destilación por arrastre de vapor usando un aparato Dean-Stark por espacio de 24 horas. El medio de reacción fue entonces vertido al interior de 50 ml de una solución acuosa de carbonato potásico al 10% en peso/volumen. La fase orgánica fue decantada. La fase acuosa fue extraída con acetato de etilo. Las fases orgánicas fueron combinadas y evaporadas hasta la sequedad. Fueron obtenidos 3,16 g de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (V) (7,12 mmoles, 95%).

Ejemplo 3 6\alpha-Hidroxi-17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (VI)

En un matraz de tres cuellos y de 1 l, una solución de 100 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF) fue desgasificada mediante barrido con nitrógeno y enfriada hasta -80ºC. Fue añadida al medio de reacción diisopropilamina (20 ml, 143,30 mmoles). Fue añadida gota a gota al medio de reacción una solución de butillitio al 15% en peso/volumen en ciclohexano (89,9 ml, 143,30 mmoles). Tras haber transcurrido 10 minutos, fue añadida gota a gota al medio de reacción una solución de 100 ml de THF anhidro, previamente desgasificado, que contenía 17,5 g de t-butilato potásico. Tras haber transcurrido otros 15 minutos, fue añadida gota a gota al medio de reacción una solución de 50 ml de THF anhidro, previamente desgasificado, que contenía 12,27 g de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (V) (27,63 mmoles). La mezcla de reacción fue dejada en reposo por espacio de 2 horas a -80ºC. Al final de este periodo de tiempo, fueron añadidos gota a gota a -80ºC al medio de reacción 48 ml de borato de trimetilo (429,90 mmoles), y ello fue dejado en reposo a 0ºC por espacio de 1 hora. Fueron entonces añadidos 100 ml de solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% volumétrico. La mezcla de reacción fue dejada en reposo por espacio de 1 hora a temperatura ambiente, y luego fueron añadidos 500 ml de agua. El medio de reacción fue sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue lavada con una solución acuosa de tiosulfato sódico al 10% en peso/volumen, lavada con agua, secada con sulfato sódico anhidro y evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo :
ciclohexano 1/9 y luego 2/8). Fueron obtenidos 6,35 g de 6\alpha-hidroxi-17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona 4 (13,81 mmoles, 50%).

Ejemplo 4 17-Cetal-3-ter-butildimetilsilil-6-dehidroestrona (VII)

Una solución de 40 ml de tolueno que contenía 1,54 g de 6\alpha-hidroxi-17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (VI) (3,35 mmoles), 4 ml de etilenglicol y una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico fue calentada hasta el reflujo con destilación por arrastre de vapor usando un aparato Dean-Stark por espacio de 24 horas. El medio de reacción fue entonces vertido al interior de 50 ml de una solución acuosa de carbonato potásico al 10% en peso/volumen. La fase orgánica fue decantada. La fase acuosa fue entonces sometida a extracción con acetato de etilo. Las fases orgánicas fueron combinadas y evaporadas hasta la sequedad. Fueron obtenidos 1,48 g de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-6-dehidrosterona (VII) (3,35 mmoles, 100%).

Ejemplo 5 17-Cetal-3-ter-butildimetilsilil-6\alpha,7\alpha-epoxiestrona (VIII)

Una solución de 20 ml de diclorometano que contenía 1,16 g de ácido m-clorobenzoico (55%, 3,69 mmoles, 1,1 eq.) fue añadida gota a gota a 0ºC a una solución de 20 ml de diclorometano que contenía 1,85 g de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-6-dehidroestrona (VII) (3,36 mmoles, 1 eq.). Tras haber transcurrido 2 horas, el medio de reacción fue vertido al interior de una solución acuosa de carbonato de hidrógeno y sodio al 10% en peso/volumen, y ello fue entonces sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 1/9). Fueron obtenidos 769 mg de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-6\alpha,7\alpha-epoxiestrona 6 (1,68 mmoles, 50%).

Ejemplo 6 7\alpha-Hidroxi-17-cetal-3-ter-butildimetilsilil-estrona (IX)

200 mg de hidruro de aluminio y litio (5,40 mmoles, 2 eq.) fueron añadidos a una solución de 50 ml de THF anhidro que contenía 1,13 g de 17-cetal-3-t-butildimetilsilil-6\alpha,7\alpha-epoxiestrona 6 (2,60 mmoles, 1 eq.). El medio de reacción fue calentado hasta el reflujo por espacio de 2 horas, y fue luego enfriado, vertido en hielo, filtrado mediante un adyuvante de filtración de Celite (marca de fábrica) y sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada mediante sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 1/9). Fueron obtenidos 837 mg de 7\alpha-hidroxi-17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (IX) (1,82 mmoles, 70%).

Ejemplo 7 7\alpha-Hidroxi-17-cetal-estrona (X)

Una solución de 20 ml de THF que contenía 1,5 g de cloruro tetrabutilamónico (4,78 mmoles, 1,10 eq.) fue añadida a temperatura ambiente a una solución de 50 ml de THF que contenía 2 g de 7\alpha-hidroxi-17-cetal-3-t-butildimetilsilil-estrona (IX) (4,35 mmoles, 1 eq.). El medio de reacción fue vertido al interior de 70 ml de una solución acuosa de carbonato sódico al 10% en peso/volumen. El medio de reacción fue sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 1,39 g de 7\alpha-hidroxi-17-cetal-estrona (X) (4,22 mmoles, 97%).

Ejemplo 8 7\alpha-Hidroxi-estrona (XI)

Fue calentada hasta el reflujo por espacio de 2 horas una solución de 50 ml de acetona que contenía 1 ml de agua, 1,0 g de 7\alpha-hidroxi-17-cetal-estrona (X) (3,03 mmoles) y una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico. El medio de reacción fue entonces vertido al interior de 70 ml de una solución acuosa de carbonato sódico al 10% en peso/volumen. El medio de reacción fue sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 814 mg de 7\alpha-hidroxi-estrona (XI) (2,85 mmoles, 94%), que fue recristalizada utilizando acetato de etilo.

Ejemplo 9 7-Cetoestrona (XII)

Una solución 8N de ácido crómico en ácido sulfúrico fue añadida gota a gota, hasta que persistía el color amarillo, a una solución enfriada a 0ºC de 40 ml de acetona que contenía 300 mg de 7\alpha-hidroxi-estrona (XI) (1,05 mmoles). El medio de reacción fue vertido al interior de 50 ml de agua, y fue luego sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue lavada con una solución acuosa de carbonato sódico, y fue luego secada con sulfato sódico anhidro y evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 3/7). Fueron obtenidos 200 mg de 7-ceto-estrona 10 (0,70 mmoles, 67%).

Ejemplo 10 7-Hidroxi-6-dehidroestrona 3,7-diacetato (XIII)

Fue calentada hasta el reflujo por espacio de 1 hora una solución de 10 ml de anhídrido acético que contenía 5 g de acetato sódico anhidro y 1 g de 7-ceto-estrona (XII) (3,52 mmoles). El medio de reacción fue entonces enfriado, y fue luego vertido al interior de agua y sometido a extracción con dietiléter. La fase orgánica fue lavada con una solución acuosa de carbonato sódico, y fue luego secada con sulfato sódico anhidro y evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 1/9). Fueron obtenidos 1,25 g de 7-hidroxi-6-dehidroestrona-3,7-diacetato (XIII) (3,41 mmoles, 97%).

Ejemplo 11 7-Hidroxiestrona 3,7-diacetato (XIV)

Una solución de 80 ml de ácido acético glacial que contenía 1,0 g de 7-hidroxi-6-dehidroestrona-3,7-diacetato (XIII) (2,72 mmoles) fue hidrogenada con 200 mg de paladio al 10% sobre catalizador de carbón vegetal bajo una presión de hidrógeno de 1 bar. El medio de reacción fue filtrado tras 2 horas y evaporado hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 1/9). Fueron obtenidos 855 mg de 7-hidroxiestrona 3,7-diacetato (XIV) (2,31 mmoles, 85%).

Ejemplo 12 7\beta-Hidroxiestrona (XV)

Fue calentada hasta el reflujo por espacio de 2 horas una solución de 50 ml de metanol que contenía un 1% de hidróxido potásico y 1 g de 7-hidroxiestrona-3,7-diacetato (12) (2,70 mmoles). El medio de reacción fue entonces enfriado, neutralizado y sometido luego a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 695 mg de 7\beta-hidroxiestrona (XV) (2,43 mmoles, 90%), que fue recristalizada utilizando metanol.

Ejemplo 13 7\beta-Hidroxiestradiol (XVI)

264 mg de borohidruro de sodio (7,00 mmoles, 2 eq.) fueron añadidos a una solución de 50 ml de metanol que contenía 1,0 g de 7\beta-hidroxiestrona (13) (3,50 mmoles). El medio de reacción fue vertido al interior de agua y sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 917 mg de 7\beta-hidroxiestradiol 14 (3,18 mmoles, 91%), que fue recristalizado utilizando metanol.

Ejemplo 14 DHEA-3-acetato (XVIII)

Fue calentada hasta el reflujo por espacio de 4 horas una solución de 50 ml de piridina y 50 ml de anhídrido acético que contenía 10 g de DHEA (XVII) (34,72 mmoles). El medio de reacción fue enfriado, vertido al interior de agua y sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro y evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 11,0 g de DHEA-3-acetato (XVIII) (33,33 mmoles, 96%), que fue recristalizado utilizando etanol.

Ejemplo 15 17-Cetal-DHEA-3-acetato (XIX)

Una solución de 100 ml de tolueno que contenía 5 g de DHEA-3-acetato (XVIII) (15,15 mmoles), 5 ml de etilenglicol y una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico fue calentada hasta el reflujo con destilación por arrastre de vapor usando un aparato Dean-Stark por espacio de 24 horas. El medio de reacción fue vertido al interior de 100 ml de una solución acuosa de carbonato potásico al 10% en peso/volumen. La fase orgánica fue decantada. La fase acuosa fue extraída con acetato de etilo. Las fases orgánicas fueron combinadas y evaporadas hasta la sequedad. Fueron obtenidos 5,10 g de 17-cetal-3-DHEA-acetato (XIX) (13,64 mmoles, 90%), que fue recristalizado utilizando etanol.

Ejemplo 16 7-Ceto-17-cetal-DHEA-3-acetato (XX)

Una solución de 70 ml de piridina que contenía 5 g de 17-cetal-DHEA-3-acetato (XIX) (13,37 mmoles) y una cantidad catalítica de Bengal Rose fue irradiada usando una lámpara de vapor de mercurio de presión mediana con burbujeo con oxígeno. Tras haber transcurrido 24 horas fue añadida al medio de reacción una cantidad catalítica de acetato de cobre. Tras 24 horas, el medio de reacción fue evaporado hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo : ciclohexano 3/7). Fueron obtenidos 3,11 g de 7-ceto-17-cetal-DHEA-3-acetato (XX) (8,02 mmoles, 60%).

Ejemplo 17 7-Ceto-17-cetal-DHEA (XXI)

Una solución de 50 ml de metanol que contenía un 1% de hidróxido potásico y 1 g de 7-ceto-17-cetal-DHEA-3-acetato (XX) (2,58 mmoles) fue calentada hasta el reflujo por espacio de 2 horas. El medio de reacción fue entonces enfriado y neutralizado, y fue luego sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 802 mg de 7-ceto-17-cetal-DHEA 5 (2,32 mmoles, 90%), que fue recristalizada utilizando metanol.

Ejemplo 18 7-Hidroxi-17-cetal-EPIA (XXII)

10 g de 7-ceto-17-cetal-DHEA (XXI) (28,90 mmoles) fueron añadidos a una solución de amoníaco líquido a -33ºC que contenía 2,65 g de sodio. Tras haber transcurrido 4 horas, fue añadido cloruro amónico hasta que desapareció el color azul. Fueron entonces añadidos 2,65 g de sodio. Tras haber transcurrido 4 horas, fue añadido de nuevo cloruro amónico hasta que hubo desaparecido el color azul. Fue añadida agua, y se dejó que se evaporase el amoníaco. El medio de reacción fue sometido a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. Fueron obtenidos 6,07 g de 7-hidroxi-17-cetal-EPIA (XXII) (17,34 mmoles, 60%).

Ejemplo 19 7-Hidroxi-EPIA (XXIII)

Fue calentada hasta el reflujo por espacio de 4 horas una solución de 100 ml de acetona que contenía 5 ml de agua, 10 g de 7-hidroxi-17-cetal-EPIA (XXII) (28,57 mmoles, 50%) y una cantidad catalítica de ácido paratoluensulfónico. El medio de reacción fue enfriado, vertido al interior de 100 ml de una solución acuosa de carbonato sódico al 10% en peso/volumen, y sometido luego a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada con sulfato sódico anhidro, y fue luego evaporada hasta la sequedad. El residuo fue purificado por cromatografía rápida (SiO_{2}/acetato de etilo). Fueron obtenidos 5,24 g de 7-hidroxi-EPIA (XXIII) (17,14 mmoles, 60%).

Ejemplo 20 7\alpha-Hidroxi-EPIA (XXIV) y 7\beta-hidroxi-EPIA (XXV)

7-hidroxi-EPIA (XXIII) (5 g) que contenía epímeros 7\alpha y 7\beta en una proporción de 65/35 fue purificada por cromatografía rápida (Al_{2}O_{3}/CHCl_{3}). Fue obtenida primeramente 7\beta-hidroxi-EPIA (XXV) (2,5 g), antes de la 7\alpha-hidroxi-EPIA (XXIV) (1,34 g). La 7\beta-hidroxi-EPIA (XXV) y la 7\alpha-hidroxi-EPIA (XXIV) fueron recristalizadas utilizando acetato de etilo.

Ejemplo 21 Protocolo Para Estudiar el Daño Neuronal Hipóxico

Fueron preparados cultivos de secciones hipocámpicas organotípicas usando el método básico de Pringle et al. (1996, 1997) modificado como se indica a continuación:

Fueron decapitadas crías de rata Wistar (de 8-11 días de edad), y el hipocampo fue disecado rápidamente y puesto en solución salina equilibrada de Gey helada suplementada con 4,5 mg/ml de glucosa. Las secciones fueron separadas y puestas en unidades de cultivo de Millicell CM (4 por cavidad) y mantenidas a 37ºC/5% de CO_{2} por espacio de 14 días. El medio de mantenimiento constaba de un 25% de suero de caballo termoinactivado, un 25% de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y un 50% de medio esencial mínimo con sales de Earle añadidas (MEM) suplementado con glutamina 1mM y 4,5 mg/ml de glucosa. El medio era cambiado cada 3-4 días.

La hipoxia experimental fue llevada a cabo como se ha descrito anteriormente (Pringle et al., 1996; 1997). Dicho brevemente, los cultivos fueron transferidos a medio exento de suero (SFM - 75% de MEM, 25% de HBSS suplementada con glutamina 1mM y 4,5 mg/ml de glucosa) que contenía 5 \mug/ml del colorante de exclusión fluorescente yoduro de propidinio (PI). Se dejó que los cultivos se equilibrasen en SFM (SFM = medio exento de suero) por espacio de 60 minutos antes de la obtención de las imágenes. La fluorescencia del PI fue detectada usando un microscopio invertido Leica equipado con un filtro para rodamina. Fueron excluidos de la continuación del estudio todos los cultivos en los cuales fue detectada fluorescencia de PI en esta etapa. La hipoxia fue inducida transfiriendo los cultivos a SFM (+PI) que había sido saturado con un 95% de N_{2}/5% de CO_{2}. Las placas de cultivo (sin las tapas) fueron entonces encerradas herméticamente en una cámara hermética en la cual la atmósfera era saturada con un 95% de N_{2}/5% de CO_{2} efectuando continuamente un barrido por soplado con gas a razón de 10 l/min. por espacio de diez minutos antes de ser cerradas herméticamente y puestas en la incubadora por espacio de 170 minutos (el tiempo total de hipoxia era por consiguiente de 180 minutos). Al final del periodo hipóxico, los cultivos fueron puestos de nuevo en SFM normóxico que contenía PI, y fueron puestos de nuevo en la incubadora por espacio de 24
horas.

El daño neuronal fue valorado como se ha descrito anteriormente (Pringle et al., 1996; 1997) usando ya sea el programa NIH Image 1.60 que es ejecutado en un ordenador Apple IIsi o bien el programa OpenLab 2.1 (Improvision) que es ejecutado en un Macintosh G4/400. Las imágenes fueron capturadas usando una cámara monocroma, y fueron guardadas en disco óptico para su análisis fuera de línea. Antes de la adición de drogas fueron capturadas las imágenes formadas por transmisión de la luz, y al final del periodo de recuperación de 24 horas post-hipoxia fueron registradas las imágenes de fluorescencia del PI. El área de la capa de células CA1 fue determinada a partir de la imagen formada por transmisión. El área de fluorescencia del PI en las células CA1 fue medida usando la función "Density Slice" dentro del programa NIH Image u OpenLab, y el daño neuronal fue expresado como el porcentaje de las células CA1 en las cuales se detectó fluorescencia de PI superior al fondo.

Los compuestos esteroides fueron preparados haciendo una solución inicial de 1 mg/ml en etanol y diluyendo adicionalmente en SFM. Los compuestos fueron añadidos a los cultivos por espacio de 45 minutos antes de la hipoxia, durante el episodio hipóxico y durante el periodo de recuperación post-hipóxica. Los experimentos de control consistían en cultivos tratados con vehículo solamente.

Resultados

Experimento 1

Fue llevado a cabo un experimento inicial para determinar si la 7\alphaOH-EPIA y la 7\betaOH-EPIA eran neuroprotectoras a una alta concentración de 100 nM. La hipoxia produjo una lesión en un 25,5\pm6,4% de las células CA1. Este daño fue significantemente reducido tanto por la 7\alphaOH-EPIA como por la 7\betaOH-EPIA cuando las mismas estaban presentes tanto antes como después de la hipoxia y durante la misma (véase la tabla I).

TABLA I

Compuesto	N	% de daño en CA1
Hipoxia de Control	17	25.5\pm6.4
Hipoxia + 7\alphaOH-EPIA 100 nM	16	4.0\pm2.9**
Hipoxia + 7\betaOH-EPIA 100 nM	16	9.0\pm4.7*

Experimento 2

Habiendo determinado que tanto los isómeros \alpha como los isómeros \beta de la 7OH-EPIA eran neuroprotectores, valoramos la dependencia de la concentración de este efecto. La hipoxia de control redundó en daño neuronal en un 31,9\pm4,7% de las células CA1. La 7\betaOH-EPIA era significantemente neuroprotectora a una concentración de 10 nM y 100 nM, pero se perdía actividad si la concentración era reducida hasta 1 nM, como se muestra en la siguiente Tabla II.

TABLA II

Compuesto	N	% de daño en CA1
Hipoxia de Control	29	31.9\pm4.7
Hipoxia + 7\betaOH-EPIA 1 nM	15	20.6\pm7.2
Hipoxia + 7\betaOH-EPIA 10 nM	12	11.9\pm4.7*
Hipoxia + 7\betaOH-EPIA 100 nM	13	14.3\pm5.0*

\newpage

Experimento 3

Habiendo observado la actividad neuroprotectora de la 7\betaOH-EPIA, investigamos a continuación si la 7\betaOH-DHEA era neuroprotectora. Fueron incubados cultivos con 7\betaOH-DHEA 100 nM o con vehículo antes y después de la hipoxia y durante la misma. La hipoxia produjo daños en un 29,9\pm6,2% de las células CA1. En los cultivos tratados con 7\betaOH-DHEA se observó una gran y altamente significante reducción del daño neuronal, como se indica en la siguiente Tabla III.

TABLA III

Compuesto	N	% de daño en CA1
Hipoxia de Control	21	29.0\pm6.2
Hipoxia + 7\betaOH-DHEA 100 nM	16	4.2\pm1.9**

Ejemplo 22 Isquemia cerebral global en ratas (oclusión de 4 vasos)

Fue inducida isquemia cerebral mediante oclusión de cuatro vasos (4VO) en ratas Wistar macho (de 250-280 g). Ambas arterias vertebrales fueron ocluidas mediante electrocauterización en anestesia con pentobarbital (60 mg/kg i.p.). Se dejó que los animales se recuperasen por espacio de 24 horas teniendo libre acceso a agua pero no a alimento. Al día siguiente fueron dejadas al descubierto las arterias carótidas bajo anestesia con un 2% de halotano en un 30% de oxígeno/70% de óxido nitroso, y dichas arterias fueron ocluidas por espacio de 10 minutos usando clamps microvasculares. A continuación fueron retirados ambos clamps, y ambas arterias fueron inspeccionadas para proceder a la inmediata reperfusión. Durante la operación y las 3 horas siguientes fue mantenida la normotermia de los animales (37,5\pm0,5ºC) usando una manta calefactora controlada termostáticamente y conectada a un termómetro rectal. A efectos de control, en los animales que fueron sometidos a un simulacro de operación fueron cauterizadas ambas arterias vertebrales en anestesia con pentobarbital, y ambas arterias carótidas comunes fueron dejadas al descubierto pero no pinzadas bajo anestesia con un 2% de halotano en un 30% de oxígeno/70% de óxido nitroso en el día siguiente. La herida fuera tratada con gel de lidocaína, y luego fue suturada. Se mantuvo a los animales bajo una lámpara calefactora a una temperatura ambiente de 30ºC hasta que recuperaron la consciencia.

Fueron investigados siete grupos de animales:

1. (n = 8) compuesto esteroide, 7\beta-OH-EPIA (0,1 mg/kg, i.v. por la vena caudal, tres inyecciones: 15 minutos antes de la inducción de la isquemia, durante la isquemia y 5 minutos después de la reperfusión);

2. (n = 8) compuesto esteroide, 7\beta-OH-EPIA (0,3 mg/kg, i.v., tres inyecciones como se ha descrito en 1.);

3. (n = 8) compuesto esteroide, 7\beta-OH-EPIA (1 mg/kg, i.v., tres inyecciones como se ha descrito en 1.);

4. (n = 8) NBQX (sal disódica por ser más soluble en agua) como sustancia de referencia y control positivo (TOCRIS, Alemania, 30 mg/kg, i.p., tres inyecciones como se ha descrito en 1.);

5. (n = 8) recibieron vehículo (NaCl al 0,9%, que contenía 100 \mul de etanol, tres inyecciones como se ha descrito en 1.);

6. (n = 8) isquemia solamente;

7. (n = 8) controles sometidos a un simulacro de operación.

La NBQX era 2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo(F)quinoxalina, y se sabía de la misma que tiene actividad neuroprotectora [Gill, R., Nordholm, L., Lodge D.: The neuroprotective action of 2,3-dihydroxi-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline (NBQX) in a rat focal ischaemia model. Brain Res. 580, 35-43, 1992].

La 7\beta-OH-EPIA era 7\beta-hidroxiepiandrosterona, que es un compuesto de la presente invención.

Las sustancias fueron disueltas en 100 \mul de etanol y fueron finalmente diluidas con NaCl al 0,9%.

Tras haber transcurrido un tiempo de supervivencia de 7 días tras la isquemia, todos los animales fueron fijados por perfusión transcardíacamente con paraformaldehído al 4%. Los cerebros fueron entonces retirados con cuidado y fueron postfijados en el mismo fijador por espacio de 2 horas. Tras crioprotección en sucrosa al 30%, los cerebros fueron congelados rápidamente en isopentano y almacenados a -80ºC. Secciones de crióstato de veinte micras que comprendían la formación hipocámpica fueron sometidas a coloración de la sustancia de Nissl con azul de toluidina o por fluorescencia con el equipo Neuro Trace.

Análisis de los datos

La gravedad del daño neuronal en la región CA1 hipocámpica tras la isquemia fue evaluada según el número de neuronas supervivientes usando coloración de la sustancia de Nissl. Se calculó en la región CA1 para cada grupo el número medio de neuronas morfológicamente intactas por cada 400 \mum de longitud. La cuenta de células fue llevada a cabo en 3-5 secciones seriales por cada animal y 6 veces en el área de CA1 de 400 \mum por sección usando un microscopio de luz equipado con un objetivo de 20 aumentos. Los datos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student para muestras pareadas. Los datos fueron presentados como la media \pm SEM (SEM = error estándar de la media).

Resultados y Discusión

Los resultados fueron ilustrados en las Figuras 1 a 3 de los dibujos acompañantes.

Las neuronas CA1 hipocámpicas morfológicamente intactas fueron caracterizadas mediante coloración de la sustancia de Nissl (azul de toluidina y Neuro Trace, Fig. 2) con los criterios siguientes: nítida forma de los pericariones neuronales, gran núcleo con un nucleolo marcado positivamente, una pequeña zona citoplasmática alrededor del núcleo con coloración positiva de la sustancia de Nissl, indicando el retículo endoplasmático de superficie rugosa intacto con ribosomas y por consiguiente la intacta maquinaria de síntesis de proteínas.

10 minutos de isquemia global (isquemia moderada) y un tiempo de supervivencia de 7 días conducen a una neurodegeneración de células piramidales selectivamente en la región CA1 hipocámpica (Fig. 1A-1C). El número medio de células piramidales en CA1 de los animales que habían sido sometidos al simulacro de operación era de 121,5\pm4,3 (establecido como el 100%). Por consiguiente, las de un 60% de las neuronas CA1 murieron tras 10 minutos de isquemia global (Fig. 1B). El número de neuronas en el grupo de animales de isquemia e inyección i.v. de vehículo (NaCl más 100 \mul de etanol) aplicado como se ha descrito en el experimento era equiparable al del grupo que fue sometido a isquemia solamente (Fig. 1A, 1B). La NBQX (30 mg/kg, i.v., tres inyecciones como se ha descrito en el experimento) presentó una significante (p = 0,03) neuroprotección en las células piramidales CA1 en comparación con el grupo de isquemia. En comparación con la isquemia solamente, la NBQX conduce a una neuroprotección de un 47,5%, mientras que en comparación con los animales que fueron sometidos al simulacro de operación el efecto protector fue de un 68,5%. La neuroprotección ocasionada por la NBQX estaba de acuerdo con Gill et al., 1992 y Gill 1994, demostrando la validez del modelo de isquemia global que usamos en nuestros experimentos. La 7\beta-OH-EPIA conduce a una neuroprotección dependiente de la concentración de las células piramidales CA1 hipocámpicas después de 10 minutos de isquemia global y de un tiempo de supervivencia de 7 días (Fig. 1A). Los análisis efectuados con la prueba t revelaron un efecto neuroprotector altamente significante de la 7\betaOH-EPIA en concentraciones de 0,1 mg/kg (p = 0,01) y de 0,3 mg/kg (p = 0,0008). En comparación con los del grupo de animales que fueron sometidos a un simulacro de operación, la 7\beta-OH-EPIA presentó un efecto neuroprotector de un 74,8% (a una concentración de 0,1 mg/kg) y de un 83,9% (a una concentración de 0,3 mg/kg) en las células piramidales CA1, respectivamente (Fig. 1C). La 7\beta-OH-EPIA en una concentración de 1,0 mg/kg presentó tan sólo una tendencia a la neuroprotección, pero el efecto no era significante.

En todos los experimentos en los que fue administrada 7\beta-OH-EPIA mediante inyección i.v. antes y después de la isquemia y durante la misma nunca observamos anormalidades en la conducta de los animales.

Leyendas de las Figuras

Número de células piramidales CA1 hipocámpicas morfológicamente intactas en las ratas 7 días después de la isquemia cerebral global en las ratas y bajo la influencia de distintos compuestos.

Fig. 1A: Los datos fueron presentados como el número medio \pm SEM de neuronas intactas por cada 400 \mum de longitud de la región CA1.

Fig. 1B: Los datos fueron expresados como porcentaje de neuronas intactas por cada 400 \mum de longitud de la región CA1 en comparación con los animales que fueron sometidos a un simulacro de operación, para los cuales el porcentaje se estableció como del 100%.

Fig. 1C: Los datos fueron presentados como porcentaje absoluto de neuroprotección cuando se estableció como de cero el número de neuronas supervivientes en el grupo que fue sometido a isquemia y cuando se estableció como del 100% el porcentaje del grupo de animales que fueron sometidos a un simulacro de operación.

Claims

1. Uso para la fabricación de un medicamento para la protección contra el daño neuronal de un 7\beta-hidroxiesteroide o su éster farmacéuticamente aceptable u otro derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, según la fórmula (I) o (II):

11

12

donde

el anillo A, 13 es un anillo de benceno o de ciclohexano;

y sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. Uso según la reivindicación 1, en el cual:

R^{1} y R^{2} son iguales o distintos uno de otro y representan cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo fenilo opcionalmente sustituido, un grupo formilo, un grupo alquilcarbonilo que tiene de 2 a 5 átomos de carbono, un grupo arilcarbonilo que tiene de 7 a 11 átomos de carbono, un grupo aralquilcarbonilo que tiene de 8 a 15 átomos de carbono o un grupo heterocíclico-carbonilo como se define a continuación;

3. Uso según la reivindicación 1, en el cual el esteroide es 7\beta-hidroxi-epiandrosterona.

4. Uso según la reivindicación 1, en el cual el esteroide es 7\beta-hidroxi-dehidroepiandrosterona.

5. Uso según la reivindicación 1, en el cual el esteroide es 7\beta-hidroxi-17\beta-estradiol.

6. Uso según la reivindicación 1, en el cual el esteroide es 7\beta-hidroxi-estrona.

7. Uso según la reivindicación 1, en el cual el esteroide es 7\alpha-hidroxi-estrona.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el daño neuronal es ocasionado por un trastorno crónico.

9. Uso según la reivindicación 8, en el cual el trastorno crónico es la Enfermedad de Alzheimer, la Enfermedad de Parkinson o el Trastorno Cognitivo No Demencia.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el daño neuronal es ocasionado por un trastorno agudo.

11. Uso según la reivindicación 10, en el cual el trastorno agudo es ocasionado por un ataque neurológico, un trauma cerebral, una lesión del cordón espinal o una lesión de los nervios periféricos.