CZ305306B6

CZ305306B6 - Použití 7β-hydroxysteroidu nebo jeho farmaceuticky přijatelného esteru nebo jeho jiného derivátu pro přípravu léčiva pro ochranu před poškozením nervových buněk

Info

Publication number: CZ305306B6
Application number: CZ2003-78A
Authority: CZ
Inventors: Ernst WĂĽlfert; Ashley Ker Pringle; Lars Eric Sundstrom
Original assignee: Hunter-Fleming Limited
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2015-07-22
Also published as: DK1294381T3; PL359105A1; CA2414583A1; JP2004501195A; AU2001267705B2; RU2258511C2; HU229265B1; KR100829490B1; AU6770501A; US20100130459A1; HUP0301317A2; GB0016027D0; ES2247141T3; SI1294381T1; PL200698B1; CN100441189C; NO332089B1; EP1294381B1; IL153540A; DE60113112T2

Abstract

Použití 3-Hydroxy-7.beta.-hydroxysteroidů a 3-oxo-7.beta.-hydroxysteroidů a jejich farmaceuticky přijatelných esterů pro výrobu léčiva pro ochranu před poškozením nervových buněk.

Description

Produkce 7ct-hydroxylovaných metabolitů dehydroepiandrosteronu (DHEA) in vivo je známa od roku 1959, kdy byl identifikován 7oc-hydroxydehydroepiandrosteron v moči (Schneider, J. J.; Lewbart, M. L.: Recent Progr. Horm. Res. 15 (1959), 201-230; Starka, L. et al: Clin. Chim. Acta 7 (1961) 309-316). Od té doby byla publikována řada zpráv o rozsáhlé 7cc-hydroxylaci 3βhydroxysteroidních substrátů (včetně DHEA a epiandrosteronu - ΕΡΙΑ) ve tkáňových preparátech mnoha lidských orgánů, včetně jater dospělých i plodu, varlat, nadvarlat, pokožky, savčí tkáně, prostaty, tukových stromálních buněk a mandlí. Hydroxylace DHEA v poloze 7 byla též doložena v krysích játrech a v řadě myších tkání a orgánů. Žádná nebo jen minimální pozornost byla však věnována 7p-ekvivalentu. Ve všech těchto studiích byl 7a-hydroxydehydroepiandrosteron zdaleka nejvíce produkovaným metabolitem - např. Doostzadech et al (Steroids 63 (1998) 608-614) uvedli, že rychlost produkce 7a-hydroxydehydroepiandrosteronu mikrosomy myších jater byla více než 15krát vyšší než rychlost produkce 7(3-hydroxyanalogu.

Bylo též doloženo, že ΕΡΙΑ, DHEA a pregnenolon jsou v krysím mozku rychle a rozsáhle transformovány na jejich odpovídající 7a-hydroxymetabolity (Guiraud, J. M. et al: Steroids 34 (1979) 241-248; Warner, M. et al·. Endocrinology 124 (1989) 2699-2706; Akwa, Y. et al·. Biochem. J. 288 (1992) 959-964).

Dokument WO 97/37 664 popisuje použití řady sloučenin včetně 7a-hydroxysubstituováných steroidů v léčbě neuropsychiatrických, imunitních nebo endokrinních poruch, např. Alzheimerovy choroby. Mechanismus těchto poruch však podle dokumentu WO 97/37 664 spočívá v nedostatku 7a-hydroxysubstituovaných steroidů v mozku a léčba zahrnuje podávání 7a-hydroxysubstituovaných steroidů, aby byl tento předpokládaný deficit doplněn. Postup popsaný v dokumentu WO 97/37 664 tedy léčí již existující chorobný stav, spíše než by se preventivně snažil předcházet jeho vzniku nebo zhoršení dalšího poškození nervových buněk. Dokument WO 97/37 664 tedy nepopisuje neuroprotektivní účinek. Vychází též z předpokladu, že aktivní látkou je 7a-hydroxysloučenina a že 7(3-hydroxysloučenina, pokud je vůbec přítomna, je neaktivní.

Dokument WO 94/20 111 popisuje též využití řady derivátů DHEA pro prevenci nebo snížení ztráty životnosti tkáně, způsobené adhezí neutrofilů na buňky endothelu. To však není mechanismus způsobující poruchy léčené způsobem podle vynálezu.

7[3-Hydroxyanalogy sloučenin popsaných v dokumentu WO 97/37 664 jsou produkovány in vivo, a to v množství méně než 5 % v porovnání s 95 % 7a-izomeru. Navíc nebyl nikdy charakterizován žádný enzymový systém zodpovědný za přeměnu 3—hydroxysteroidů vjejich 7(3-hydroxyderiváty. Z těchto důvodů a na základě dosavadního stavu techniky shrnutého výše z literatury vyplývá, že 7(3-hydroxyizomery jsou obecně považovány za neaktivní. V důsledku

- 1 CZ 305306 B6 toho nebylo zatím v podstatě provedeno žádné stanovení případné biologické aktivity 7βhydroxysloučenin, jak jasně vyplývá z výše uvedeného přehledu literatury i z dalších skutečností.

Navzdory těmto předpokladům jsme s překvapením zjistili, že 7P-hydroxysteroidy mají biologickou aktivitu, která je odlišná od aktivity 7a-hydroxysteroidů popsané v dokumentu WO 97/37 664. Jde spíše o neuroprotektivní aktivitu, jak byla demonstrována v dokumentu WO 99/31 049, ačkoliv u jiné skupiny sloučenin.

Při stavech jako prodloužená hypoxie nebo ischémie, které mohou a nemusejí souviset s hypoglykémií, dochází někdy k poškození nervových buněk v různém rozsahu.

K ischémii dochází typicky při srdečních infarktech, avšak poškození, které v těchto případech vzniká, je omezeno v podstatě na srdeční tkáně; kromě toho byly již vyvinuty určité způsoby léčby. Tento vynález se týká spíše krátkodobé i dlouhodobé ischémie mozku, která vzniká jako důsledek mrtvice nebo poranění hlavy a též při pomaleji se vyvíjejících neurodegenerativních onemocněních při stárnutí, kde mohou chronické podprahové hodnoty ischémie a/nebo omezený přísun energie vést k pozorovaným degenerativním změnám na mozku. Vážnost ischemického stavu závisí na charakteru mrtvice nebo poranění, jde však vždy o poškození nervových buněk, kterého se týká tento vynález.

V dosavadním stavu techniky jsou známa různá neuroprotektivní činidla, která mají zmírňovat problém poškození nervových buněk, jsou však většinou spojena s vážnými vedlejšími účinky. Např. MK801 (maleát dizocilpinu) je poměrně jednoduchá molekula, která prokazatelně poskytuje určitou úroveň neuroprotekce ischemickým pacientům. Je však spojena též s „alarmujícími psychotropními účinky“ (Martindale) a vážnými motorickými poruchami. Neuroprotektivní účinky jsou detailně popsány v Brain Research 755 (1997) 34-36 (Pringle, A. K. et al), citovaném zde tímto jako odkaz. Tíž autoři popsali dříve i neuroprotektivní účinky konotoxinu; také u této sloučeniny byly nicméně pozorovány vážné vedlejší účinky in vivo.

Podstata vynálezu

Tento vynález spočívá v použití 73-hydroxysteroidu nebo jeho farmaceuticky přijatelného esteru nebo jiného jeho derivátu pro přípravu léčiva pro ochranu před poškozením nervových buněk, obecného vzorce I nebo II:

-2CZ 305306 B6

ve kterém R¹ a R² jsou stejné nebo navzájem různé a představují atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, alkynylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu s 6 až 10 atomy uhlíku, formylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu s 2 až 7 atomy uhlíku, alkenylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, alkynylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, arylkarbonylovou skupinu se 7 až 11 atomy uhlíku, aralkylkarbonylovou skupinu s 8 až 15 atomy uhlíku, aralkenylkarbonylovou skupinu s 9 až 15 atomy uhlíku nebo heterocyklokarbonylovou skupinu, jak je definována níže, jeden ze substituentů R^a a R^b představuje hydroxy skupinu, přednostně v β-konfiguraci, a druhý substituent představuje atom vodíku, nebo R^a a R^b společně tvoří oxoskupinu, kruh A

je benzenový nebo cyklohexanový kruh, kde pokud kruh A je cyklohexanový kruh, přerušovaná čára v kruhu B představuje jednoduchou nebo dvojnou vazbu uhlík-uhlík a n je 1, nebo je pokud kruh A benzenový kruh, představuje přerušovaná čára v kruhu B jednoduchou vazbu uhlík-uhlík a n je 0, výše uvedená heterocyklokarbonylová skupina je skupina obecného vzorce R³-CO, kde R³ představuje heterocyklickou skupinu s 3 až 7 atomy kruhu, z nichž 1 až 3 atomy jsou heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující atomy dusíku, kyslíku a síry a alespoň jedním zbývajícím atomem je atom uhlíku, tyto alkylové, alkenylové a alkynylové skupiny a alkylové, alkenylové a alkynylové části uvedených alkylkarbonylových, alkenylkarbonylových a alkynylkarbonylových skupin jsou nesubstituované nebo mají alespoň jeden z následujících substituentů ψ, zahrnujících hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, atomy halogenů, aminoskupiny, alkylaminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny v nichž má každá alkylová skupina 1 až 6 atomů uhlíku, karbamoylové skupiny, nitroskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, karboxyskupiny, alkoxykarbonylové skupiny a nesubstituované atylové skupiny s 6 až 10 atomy uhlíku;

tyto arylové skupiny, heterocyklické skupiny a arylové části arylkarbonylových skupin a aralkylkarbonylových skupin jsou nesubstituované nebo mají alespoň jeden z následujících substituentů ζ, zahrnujících:

- 3 CZ 305306 B6 kterýkoliv ze substituentů ψ, a alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku a haloalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, a jejich farmaceuticky přijatelné soli a estery.

Skupinou 73-hydroxysteroidů, které je podle tohoto vynálezu věnován zvláštní zájem, jsou 3p,7|3-dihydroxysteroidy a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Zvláště výhodnými estery jsou estery karboxylových kyselin.

Pro přípravu léčiva podle vynálezu pro ochranu nervových buněk před poškozením je zvláště výhodné, jestliže v obecné sloučenině vzorce I jsou substituenty R¹ a R² stejné nebojsou navzájem různé a kde každý z nich představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, případně substituovanou fenylovou skupinu, formylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu s 2 až 5 atomy uhlíku, arylkarbonylovou skupinu se 7 až 11 atomy uhlíku, aralkylkarbonylovou skupinu s 8 až 15 atomy uhlíku nebo heterocyklickou karbonylovou skupinu definovanou níže, jedním ze substituentů R^a a R^b je hydroxyskupina v β-konfiguraci a druhým je atom vodíku nebo R^a a R^b představují společně oxoskupinu, heterocyklokarbonylová skupina je skupina obecného vzorce R³-CO, kde R³ je heterocyklická skupina s 3 až 7 atomy kruhu, z nichž 1 až 3 jsou heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující atomy dusíku, kyslíku nebo síry a alespoň jedním zbývajícím atomem je atom uhlíku.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹, R² nebo substituent ζ je alkylová skupina, může mít tato alkylová skupina výhodně přímý nebo rozvětvený řetězec s 1 až 6 atomy uhlíku, příkladem je methylová, ethylová, propylová, isopropylová, butylová, isobutylová, seA-butylová, tercbutylová, pentylová, 1-methylbutylová, 2-methylbutylová, 3-methylbutylová, 1-ethylpropylová, 2-ethylpropylová, 1,1-dimethylpropylová, hexylová, 1-methylpentylová, 2-methylpentylová, 3methylpentylová, 4-methylpentylová, 1-ethylbutylová, 2-ethylbutylová, 3-ethylbutylová, terchexylová a 1,1-dimethylpentylová skupina, přičemž výhodnější je skupina s 1 až 4 atomy uhlíku a nejvýhodnější je methylová a ethylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹ nebo R² je alkenylová skupina, může tato alkenylová skupina mít přímý nebo rozvětvený řetězec s 2 až 6 atomy uhlíku, příkladem je vinylová, 1propenyl, allyl, isopropenyl, methallyl, buten-1-, -2-, —3—yl, isobutenyl, penten-1-, -2-, -3-, —4—yl a hexen-1-, -2-, -3-, -4-, —5—yl, přičemž jsou výhodnější alkenyly s 2 až 4 atomy uhlíku a nejvýhodnější vinyl a allyl.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹ nebo R² je alkynylová skupina, má tato skupina přímý nebo rozvětvený řetězec s 2 až 6 atomy uhlíku, příkladem je ethynylová, 1-, 2-propynylová, 1-, 2-, 3-butynylová, isobutynylová, 1-, 2-, 3-, 4-pentynylová a 1-, 2-, 3-, 4-, 5-hexynylová skupina, za kterých jsou výhodnější alkynylové skupiny s 2 až 4 atomy uhlíku.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹, R² nebo substituent ψ je arylová skupina, je touto skupinou aromatická karbocyklická skupina s6 až 10 atomy uhlíku. Příkladem je fenylová, 1naftylová, 2-naftylová a adenylová skupina, ze kterých je nej výhodnější fenylová skupina. Mimo případ substituentu a jsou tyto skupiny substituované nebo nesubstituované. Pokud je skupina substituovaná, je počet substituentů omezen pouze počtem substituovatelných poloh, případně v některých případech sterickými faktory. Tak je v případě fenylu maximální počet substituentů 5, v případě naftylu 7 atd. Nicméně, je výhodné, pokud je počet substituentů od 1 do 3 a těmito substituenty jsou ty, které jsou popsány níže.

-4CZ 305306 B6

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituentem R¹ nebo R² je alkylkarbonylová skupina, je touto skupinou alkanoylová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 2 až 7 atomy uhlíku (tj. s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části) a příklady zahrnují acetylovou, propionylovou, butyrylovou, isobutyrylovou, valerylovou, isovalerylovou, pivaloylovou, hexanoylovou a heptanoylovou skupinu, přičemž výhodnější jsou skupiny s 2 až 5 atomy uhlíku a nej výhodnější je acetylová a propionylová skupina. Alkylová část této skupiny je s výhodou substituovaná nebo nesubstituovaná, kde pokud je substituovaná jsou substituenty vybrány ze skupiny obsahující substituenty a. Příklady takových substituovaných skupin zahrnují alanylovou, β-alanylovou, fenylalanylovou, asparaginylovou, cysteinylovou, glykoloylovou, glycylovou, methionylovou, omithylovou, glyceroylovou, tropoylovou, glutaminylovou, glutamylovou, homocysteinylovou, serylovou, homoserylovou, threonylovou, laktoylovou, leucylovou, isoleucylovou, norleucylovou, lysylovou, valylovou, norvalylovou a sarkosylovou skupinu.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituentem R¹ nebo R² je alkenylkarbonylová skupina, může tato skupina mít přímý nebo rozvětvený řetězec s 3 až 7 atomy uhlíku, příkladem je akryloylová, methakiyloylová, krotonoylová, isokrotonoylová, 3-butenoylová, pentenoylová a hexenoylová skupina, za nichž jsou výhodnější skupiny s 3 až 5 atomy uhlíku a nejvýhodnější je akryloylová a methakryloylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituentem R¹ nebo R² je alkynylkarbonylová skupina, má tato skupina přímý nebo rozvětvený řetězec s 3 až 7 atomy uhlíku, příkladem je propioloylová, 3-butynylkarbonylová, pentynylkarbonylová a hexynylkarbonylová skupina, přičemž výhodněji jsou skupiny s 3 až 5 atomy uhlíku.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹ nebo R² je arylkarbonylová skupina, je arylovou částí této skupiny kterákoli arylová skupina definovaná či uvedená výše. Zvláště výhodnými arylkarbonylovými skupinami jsou benzoylová, o-, m- nebo p-toluoylová, o-, m- nebo 77-anisoylová, 0-, m- nebo 77-hydroxybenzoylová, pikrylová, galoylová, protokatechoylová, vaniloylová, varatroylová, antraniloylová, 1-nafltoylová a 2-naftoylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituentem R¹ nebo R² je aralkylkarbonylová skupina nebo aralkenylkarbonylová skupina, mohou být kteroukoliv z výše definovaných a v příkladech uvedených skupin výše arylová a v určitých případech i alkylová nebo alkenylová skupina. Specifickými příklady těchto skupin jsou fenylacetylová, 3-fenylpropionylová, benzyloylová, tyrosylová, atropoylová, hydratropoylová a cinnamoylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde R¹ nebo R² je heterocyklická karbonylová skupina, je touto skupinou skupina obecného vzorce R³-CO, kde R³ je heterocyklická skupina s 3 až 7 atomy kruhu, z nichž 1 až 3 atomy jsou heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující atomy dusíku, kyslíku nebo síry a zbývající atomy jsou atomy uhlíku. Alespoň jedním z atomů kruhu by měl být atom uhlíku. Pokud jsou přítomné 3 heteroatomy, je alespoň 1 žních s výhodou atom dusíku. Příkladem je 2- a 3-furoylová, 2- a 3-thenoylová, 2-pyridinkarbonylová, nikotinoylová, isonikotinoylová, prolylová, piperidinkarbonylová, piperazinkarbonylová a morfolinkarbonylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituentem ψ nebo substituentem ζ je alkylaminoskupina s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylovou částí může být kterákoliv z alkylových skupin definovaných či uvedených výše. Výhodné příklady takových alkylaminoskupin zahrnují methylamino-, ethylamino-, propylamino-, isopropylamino-, butylamino-, isobutylamino-, .se£-butylamino-, řerc-butylamino-, pentylamino-, isopentylamino-, neopentylamino-, fórc-pentylamino-, hexylamino- a isohexylaminoskupiny, přičemž jsou výhodnější skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a nej výhodnější methylamino- a ethylaminoskupiny.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ψ nebo substituent ζ je dialkylaminoskupina, má každá alkylová část 1 až 6 atomů uhlíku a dvě alkylové skupiny mohou být stejné nebo vzájemně různé. Tyto alkylové skupiny mohou být kterékoli z alkylových skupin definovaných či

-5 CZ 305306 B6 uvedených výše. Výhodné příklady takových dialkylaminoskupin zahrnují dimethylamino-, ethylmethylamino-, d iethy lamino-, methylpropylamino-, dipropylamino-, diisopropylamino-, butylethylamino-, dibutylamino-, di-terc-butylamino-, methylpentylamino-, dipentylamino-, diisopentylamino- a dihexylaminoskupiny, přičemž výhodnější jsou skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé alkylové skupině a nej výhodnější jsou dimethylamino- a diethylaminoskupiny.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ψ nebo substituent ζ je alkoxyskupina, může jí být alkoxyskupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku a příklady obsahují methoxy-, ethoxy-, propoxy-, isopropoxy-, butoxy-, isobutoxy-, .se/r-butoxy-, fórc-butoxy-, pentyloxy-, isopentyloxy-, neopentyloxy-, fórc-pentyloxy-, hexyloxy- a isohexyloxyskupiny, přičemž výhodnější jsou skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a nejvýhodnější methoxya ethoxyskupiny.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ψ nebo substituent ζ je alkylthioskupina s 1 až 6 atomy uhlíku, může alkylová část být kteroukoliv z alkylových skupin definovaných či uvedených výše. Výhodné příklady takových alkylthioskupin zahrnují methylthio-, ethylthio-, propylthio-, isopropylthio-, butylthio-, isobutylthio-, .se/cbutylthio—, fórc-butylthio-, pentylthio-, isopentylthio-, neopentylthio-, Zerc-pentylthio-, hexylthio- a isohexylthioskupiny, přičemž jsou výhodnější skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a nejvýhodnější methylthio- a ethylthioskupiny.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ψ nebo substituent ζ je alkoxykarbonylová skupina, má tato skupina přímý nebo rozvětvený řetězec s 2 až 7 atomy uhlíku a příklady obsahují methoxykarbonylovou, ethoxykarbonylovou, propoxykarbonylovou, isopropoxykarbonylovou, butoxykarbonylovou, isobutoxykarbonylovou, .seU-butoxykarbonylovou, fórc-butoxykarbonylovou, pentyloxykarbonylovou, isopentyloxykarbonylovou, neopentyloxykarbonylovou, tercpentyloxykarbonylovou, hexyloxykarbonylovou a isohexyloxykarbonylovou skupinu, přičemž výhodnější jsou skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a nejvýhodnější methoxykarbonylová a ethoxykarbonylová skupina.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ζ je hydroxyalkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, je alkylovou částí výhodně kterákoli z alkylových skupin definovaných či uvedených výše. Výhodné příklady takových hydroxyalkylových skupin zahrnují hydroxymethylovou, 1a 2-hydroxyethylovou, 1-, 2- a 3-hydroxypropylovou, 1,2-dihydroxyethylovou, 1,2,3—trihydroxypropylovou, 4-hydroxybutylovou, 5-hydroxypentylovou a 6-hydroxyhexylovou skupinu.

Ve sloučeninách podle vynálezu, kde substituent ζ je halogenalkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, je alkylová část výhodně kterákoliv z alkylových skupin definovaných či uvedených výše a halogenovým atomem je s výhodou fluor, chlor, brom nebo jod. Příklady takových skupin zahrnují fluormethylovou, chlormethylovou, brommethylovou, jodmethylovou, dichlormethylovou, difluormethylovou, trichlormethylovou, trifluormethylovou,

2.2.2- trichlorethylovou, 2-chlorethylovou, 2-fluorethylovou, 2-bromethylovou, 2-jodethylovou,

2.2- dibromethylovou, 2,2,2-tribromethylovou, 3-fluorpropylovou, 3-chlorpropylovou, 4-brombutylovou, 4-fluorbutylovou, 5-fluorpentylovou a 6-fluorhexylovou skupinu.

Bude zajisté oceněno, že pokud sloučenina obsahuje skupinu obecného vzorce -OR, kde R je kterákoli ze skupin a atomů definovaných výše ve vztahu k R¹ atd., je pravděpodobné, že aktivní sloučenina bude obsahovat volné hydroxyskupiny. Stejně tak kterákoli skupina, která může být in vivo přeměněna na hydroxyskupinu, může být využita namísto hydroxyskupiny.

-6CZ 305306 B6

Příklady sloučenin podle vynálezu zahrnují:

7P-hydroxyepiandrosteron (7p-hydroxy-EPIA)

7p-hydroxydehydroepiandrosteron (7 β-hydroxy-DHE A)

7p-hydroxy-l 7p-estradiol

-7CZ 305306 B6

Navíc k tomu se následující 7a-hydroxysloučenina považuje za takovou, jejíž aktivita se proje-

a-hydroxyestron

S překvapením jsme zjistili, že tyto látky jsou účinné při ochraně před akutním a chronickým poškozením nervových buněk, které jsou způsobeny např. mrtvicí, mozkovými traumaty a cerebrální ischémií, vyvolanou např. subarachnoidálním krvácením nebo vznikající při zavedení srdečního bypassu.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny různými postupy, velmi dobře známými, vycházejícími z matečných steroidů. Například je možné je připravit postupem popsaným v literatuře uvedené výše, kdy vznikne směs 7β a odpovídajících 7a sloučenin, které mohou být dále odděleny známými technikami.

Např. 7(3-hydroxy ΕΡΙΑ lze připravit z DHEA pomocí allylické oxidací po protekci 3[3-hydroxyskupiny a 17-ketoskupiny běžnými postupy. Produkt je pak zredukován katalyzátorem s rozpustnou kovovou sloučeninou, jako je hydrid sodný, a 3f3-hydroxyskupina a 17-ketoskupina jsou deprotekovány. 7a-hydroxy- a 7p-hydroxyepimery jsou pak separovány běžnými postupy, např.

sloupcovou chromatografií, a 7(3-hydroxyepiandrosteron je krystalizován za vzniku čisté látky. Alternativní syntetický postup je popsán v následujícím reakčním schématu:

-8CZ 305306 B6

Ve výše uvedených vzorcích TBDMSO znamená /ere-butyldimethylsilyloxy- a Ac znamená acetyl.

V prvním kroku reakčního schématu je sloučenina III, estron, protektována běžným způsobem pomocí tere-butyldimethylsilyloxyskupiny za vzniku protektované sloučeniny IV. Ta pak reaguje s ethylenglykolem v přítomnosti kyselého katalyzátoru (např. p-toluensulfonové kyseliny), čímž dojde k protekci ketoskupiny v poloze 17 za vzniku sloučeniny V. V 6-té poloze je připoio jena hydroxyskupina, jak je popsáno níže v příkladu 3, za vzniku sloučeniny VI, která dá dehydratací vznik sloučenině VII. Epoxidací sloučeniny VII vzniká sloučenina VIII, která je redukována na sloučeninu IX obsahující 7a-hydroxyskupinu. Chránící fórc-butyldimethylsilyloxyskupina je odstraněna za vzniku sloučeniny X, která je následně zahřáta s katalytickým množstvím kyseliny za vzniku 7a-hydroxyestronu XI. Ten je oxidován, např. pomocí kyseliny chro15 mové nebo sírové za vzniku 7-ketoestronu XII, který reaguje s acetanhydridem za vzniku sloučeniny XIII. Tato sloučenina je hydrogenována, např. vodíkem na palladiu, za vzniku sloučeniny XIV. Pak jsou odstraněny acetyly a vzniká 7|3-hydroxyestron XV, sloučenina podle vynálezu.

-9CZ 305306 B6

Ta může být případně zredukována za vzniku 7p-hydroxyestradiolu XVI, taktéž sloučeniny podle vynálezu.

Ostatní 7p-hydroxysloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny obdobně, např. 7(35 hydroxy-DHEA může být připravena v souladu s následujícím schématem:

V tomto reakčním schématu II DHEA XVII acetylován za vzniku acetátu vzorce XVIII, který ío dále reaguje s ethylenglykolem za vzniku ketalu XIX. Ten je oxidován, jak je popsáno v příkladu

16, za vzniku 7-ketosloučeniny XX, která je deacetylována za vzniku sloučeniny XXI, která dá redukcí vznik 7-hydroxy-17-ketal-EPIA XXII. Ketal je odstraněn reakcí s kyselinou a vzniká 7-hydroxy-EPIA, který je chromatografický separován na 7β- a 7a-izomery za vzniku 7ahydroxy-EPIA XXIV a 7(3-hydroxy-EPIA XXV.

Sloučeniny podle vynálezu lze podávat pacientům s rizikem ischemické příhody, zvláště mrtvice nebo poranění hlavy. Taková profylaxe může mít velmi významné účinky. Bylo však doloženo,

- 10CZ 305306 B6 že sloučeniny podle vynálezu jsou účinné i při podání po ischemické příhodě, je však výhodné podávat tyto sloučeniny co nejdříve, aby se maximálně zabránilo degeneraci nervových buněk. Za některých okolností je žádoucí podávat sloučeniny opakovaně, zvláště pokud riziko ischemické příhody u pacienta přetrvává.

Vhodným způsobem podávání jsou obecně injekce, které umožňují dosažení požadovaného účinku v nejkratší možné době. Zvláště výhodná je pak intravenózní injekce, v některých případech může být však vhodnější aplikace přímo do mozkomíšní tekutiny.

Dávka sloučeniny podle vynálezu závisí na mnoha faktorech, jako je věk, tělesná hmotnost a celkový stav pacienta, dále způsob, častost a forma podávání. Obecně se však doporučuje dávka 0,01 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou dávka 0,05 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Toto množství lze podávat najednou nebo v několika dávkách.

Vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady, z nichž příklady 1 až 20 ilustrují přípravu sloučenin podle vynálezu a příklady 21 a 22 ilustrují jejich účinek. V příkladech 1 až 20 se římské číslice vztahují k vzorcům v reakčních schématech uvedených výše.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1: 3-férc-butyldimethylsilyl-estron IV

4,25 g fórc-butyldimethylsilylchloridu (28,2 mmol, 3 ekvivalenty) byly přidány k roztoku 50 ml dimethylformamidu (DMF) obsahujícímu 2,54 g estronu III (9,41 mmol, 1 ekvivalent) a 3,84 g imidazolu (56,5 mmol, 6 ekvivalentů) ve lOOml trojhrdlé baňce. Směs byla ponechána přes noc při teplotě místnosti v dusíkové atmosféře. Do reakčního média byl přidán 10 obj. % roztok uhličitanu draselného ve vodě a médium bylo následně extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla promyta vodou, usušena bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Bylo získáno 3,76 g (9,41 mmol, 100 hmotn. %) 3-(/erc-butyldimethylsilyl)estronu IV.

Příklad 2: 17-ketal-3-(Zerc-butyldimethylsilyl)estron V

Roztok 60 ml toluenu obsahujícího 3 g 3-(Zerc-butyldimethylsilyl)estronu IV (7,50 mmol), 3 ml ethylenglykolu a katalytické množství /Moluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem při destilaci s vodní parou za použití Dean-Starkovy aparatury po dobu 24 hodin. Reakční médium bylo pak vlito do 50 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu draselného ve vodě. Organická fáze byla dekantována. Vodná fáze byla extrahována ethyl-acetátem. Organická fáze byly spojeny a odpařeny do sucha. Bylo získáno 3,16 g (7,12 mmol, 95 hmotn. %) 17-ketal-3-(řercbutyldimethylsilyl)estronu V.

Příklad 3: 6a-hydroxy-17-ketal-3-(Zerc-butyldimethylsilyl)estron VI

V 11 trojhrdlé baňce bylo 100 ml bezvodého tetrahydrofuranu (THF) odvzdušněno probubláním dusíkem a ochlazeno na -80 °C. Do reakčního média byl přidán diisopropylamin (20 ml, 143,30 mmol) a dále po kapkách 15 obj. % roztoku butyllithia v cyklohexanu. (89,9 ml, 143,30 mmol). Po 10 minutách byl kreakčnímu médiu po kapkách přidán roztok 17.5 g tercbutyrátu draselného ve 100 ml bezvodého THF, předem odvzdušněného. Po dalších 15 minutách byl přikapán roztok 12,27 g 17-ketal-3-(fórc-butyldimethylsilyl)estronu V (27,63 mmol) v 50 ml bezvodého THF, předem odvzdušněného. Reakční směs byla ponechána při -80 °C po dobu 2 hodin. Po této době bylo k reakčnímu médiu při -80 °C přikapáno 48 ml trimethylborátu (429,90 mmol) a médium bylo ponecháno při 0 °C po dobu 1 hodiny. Bylo přidáno 100 ml

- 11 CZ 305306 B6 obj. % peroxidu vodíku ve vodě, reakční směs byla ponechána po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a bylo přidáno 500 ml vody. Reakční směs byla extrahována ethyl-acetátem. Organická fáze byla promyta 10 obj. % roztoku thiosíranu sodného ve vodě, pak vodou, byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Reakční směs byla dále purifikována nízkotlakou sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 1/9, pak 2/8. Bylo získáno 6,35 g (13,81 mmol, 50 hmotn. %) 6a-hydroxy-17-ketal-3-(fórc-butyldimethylsilyl)estronu VI.

Příklad 4: 17-ketal-3-/erc-butyldimethylsilyl-6-dehydroestron VII

Roztok 40 ml toluenu obsahující 1,54 g 6a-hydroxy-17-ketal-3-(terc-butyldimethylsilyl)estronu VI (3,35 mmol), 4 ml ethylenglykolu a katalytické množství p-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem při destilaci s vodní parou za použití Dean-Starkovy aparatury po dobu 24 hodin. Reakční médium bylo pak vlito do 50 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu draselného ve vodě. Organická fáze byla dekantována. Vodná fáze byla extrahována ethyl-acetátem. Organické fáze byly spojeny a odpařeny do sucha. Bylo získáno 1,48 g (3,53 mmol, 100 hmotn. %) 17-ketal-3-/erc-butyldimethylsilyl-6-dehydroestronu VII.

Příklad 5: 17-ketal-3-/erc-butyldimethylsilyl-6a,7a-epoxyestron VIII

Roztok 20 ml dichlormethanu obsahující 1,16 g /w-chlorbenzoové kyseliny (55 hmotn. %, 3,69 mmol, 1,1 ekvivalentu) byl po kapkách při 0 °C přidán k roztoku 20 ml dichlormethanu obsahujícímu 1,85 g 17-ketal-3-/erc-butyldimethylsilyl-6-dehydroestronu VII (3,36 mmol, 1 ekvivalent). Reakční médium bylo po 2 hodinách vlito do 10 obj. % roztoku uhličitanu sodného ve vodě a pak extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Směs byla dále purifikována sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 1/9). Bylo získáno 769 mg (1,68 mmol, 50 hmotn. %) 17ketal-3-fórc-butyldimethylsilyl-6a,7a-epoxyestronu VIII.

Příklad 6: 7a-hydroxy-17-ketal-3-(terc-butyldimethylsilyl)estron IX

200 mg tetrahydrohlinitanu lithného (5,40 mmol, 2 ekvivalenty) bylo přidáno k roztoku 50 ml bezvodého THF obsahujícího 1,13 g 17-ketal-3-/erc-butyldimethylsilyl-6a,7a-epoxyestronu VIII (2,60 mmol, 1 ekvivalent). Reakční médium bylo zahříváno pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, pak ochlazeno, vlito na led, zfiltrováno přes celitový (obchodní značka) filtr a extrahováno ethyl-acetátem). Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 1/9). Bylo získáno 837 mg (1,82 mmol, 70 hmotn. %) 7ahydroxy-17-ketal-3-tezc-butyldimethylsilyl)estronu IX.

Příklad 7: 7a-hydroxy-17-ketalestron X

Roztok 20 ml THF obsahující 1,5 g tetrabutylamoniumchloridu (4,78 mmol, 1,10 ekvivalentu) byl přidán za teploty místnosti k roztoku 50 ml THF obsahujícího 2 g 7a-hydroxy-17-ketal-3(fórc-butyldimethylsilyl)estronu IX (4,35 mmol, 1 ekvivalent). Reakční médium bylo vlito do 70 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu sodného ve vodě a pak extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Bylo získáno 1,39 g (4,22 mmol, 97 hmotn. %) 7a-hydroxy-l 7-ketalestronu X.

- 12CZ 305306 B6

Příklad 8: 7a-hydroxyestron XI

Roztok 50 ml acetonu obsahující 1 ml vody, 1,0 g 7a-hydroxy-17-ketalestronu X (3,03 mmol) a katalytické množství /?-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Reakční médium bylo vlito do 70 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu sodného ve vodě a pak extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Bylo získáno 814 mg (2,85 mmol, 94 hmotn. %) 7a-hydroxyestronu XI, který byl rekrystalizován z ethyl-acetátu.

Příklad 9: 7-ketoestron XII

4M kyselina chromová v kyselině sírové byla při 0 °C po kapkách přidávána k roztoku 40 ml acetonu obsahujícího 300 mg 7oc-hydroxyestronu XI (1,05 mmol), dokud nebylo žluté zabarvení roztoku stálé. Reakční médium bylo vlito do 50 ml vody a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla promyta vodným roztokem uhličitanu sodného, usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 3/7). Bylo získáno 200 mg (0,70 mmol, 67 hmotn. %) 7-ketoestronu XII.

Příklad 10: 7-hydroxy-6-dehydroestron-3,7-diacetát XIII

Roztok 10 ml acetanhydridu obsahující 5 g bezvodého acetátu sodného a 1 g 7-ketoestronu XII (3,52 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. Reakční médium bylo pak ochlazeno, vlito do vody a extrahováno diethyletherem. Organická fáze byla promyta vodným roztokem uhličitanu sodného a pak usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 1/9). Bylo získáno 1,25 g (3,41 mmol, 97 hmotn. %) 7-hydroxy-6-dehydroestron-3,7-diacetátu XIII.

Příklad 11: 7-hydroxyestron-3,7-diacetát XIV

Roztok 80 ml ledové kyseliny octové obsahující 1,0 g 7-hydroxy-6-dehydroestron-3,7-diacetátu XIII (2,72 mmol) byl hydrogenován 200 mg 10% palladia na uhlí pod tlakem vodíku 10⁵ Pa. Reakční médium bylo po dvou hodinách zfiltrováno a odpařeno do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát:cyklohexan 1/9). Bylo získáno 855 mg (2,31 mmol, 85 hmotn. %) 7-hydroxyestron-3,7-diacetátu XIV.

Příklad 12: 7p-hydroxyestron XV

Roztok 50 ml methanolu obsahující 1 hmotn. % hydroxidu draselného a 1 g 7-hydroxyestron3,7-diacetátu XIV (2,70 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Reakční médium bylo pak ochlazeno, neutralizováno a extrahováno ethylacetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 695 mg (2,43 mmol, 90 hmotn. %) 7P-hydroxyestronu XV, který byl rekrystalizován z methanolu.

Příklad 13: 7|3-hydroxyestradiol XVI

264 mg tetrahydroboritanu sodného (7,00 mmol, 2 ekvivalenty) bylo přidáno k roztoku 50 ml methanolu obsahujícího 1,0 g 7[3-hydroxyestronu XV (3,50 mmol). Reakční médium bylo vlito

- 13 CZ 305306 B6 do vody a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 917 mg (3,18 mmol, 91 hmotn. %) 7(3-hydroxyestradiolu XVI, který byl rekrystalizován z methanolu.

Příklad 14: dehydroepiandrosteron-3-acetát XVIII

Roztok 50 ml pyridinu a 50 ml acetanhydridu obsahující 10 g dehydroepiandrosteronu XVII (34,72 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Reakční médium bylo ochlazeno, vlito do vody a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Bylo získáno 11,0 g (33,33 mmol, 96 hmotn. %) dehydroepiandrosteron-3-acetátu XVIII, který byl rekrystalizován z ethanolu.

Příklad 15: 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetát XIX

Roztok 100 ml toluenu obsahující 5g dehydroepiandrosteron-3-acetátu XVIII (15,15 mmol), 5 ml ethylenglykolu a katalytické množství /-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem při destilaci s vodní parou za použití Dean-Starkovy aparatury po dobu 24 hodin. Reakční médium bylo pak vlito do 100 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu draselného ve vodě. Organická fáze byla dekantována. Vodná fáze byla extrahována ethyl-acetátem. Organické fáze byly spojeny a odpařeny do sucha. Bylo získáno 5,10 g (13,64 mmol, 90 hmotn. %) 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu XIX, který byl rekrystalizován z ethanolu.

Příklad 16: 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetát XX

Roztok 70 ml pyridinu obsahující 5g 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu XIX (13,37 mmol) a katalytické množství bengálské červeně byl ozařován střednětlakou rtuťovou výbojkou s kyslíkovým výstřelkováním. Po 24 hodinách bylo do reakčního média přidáno katalytické množství acetátu měďnatého. Po 24 hodinách bylo reakční médium odpařeno do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO2/ethyl-acetát:cyklohexan 3/7). Bylo získáno 3,11 g (8,02 mmol, 60 hmotn. %) 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátuXX.

Příklad 17: 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteron XXI

Roztok 50 ml methanolu obsahující 1 hmotn. % hydroxidu draselného a 1 g 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteron—3—acetátu XX (2,58 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Reakční médium bylo pak ochlazeno, neutralizováno a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 802 mg (2,32 mmol, 90 hmotn. %) 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteronu XXI, který byl rekrystalizován z methanolu.

Příklad 18: 7-hydroxy-l7-ketalepiandrosteron XXII g 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteronu XXI (28,90 mmol) bylo při -33 °C přidáno ke kapalnému roztoku amoniaku obsahujícímu 2,65 g sodíku. Po 4 hodinách byl přidáván chlorid amonný, dokud nezmizelo modré zabarvení roztoku. Pak bylo přidáno znovu 2,65 g sodíku a po 4 hodinách byl opět přidáván chlorid amonný, dokud nezmizelo modré zabarvení roztoku. Pak byla přidána voda a amoniak byl odpařen. Reakční médium bylo extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 6,07 g (17,34 mmol, 60 hmotn. %) 7-hydroxy-l 7-ketalepiandrosteronu XXII.

- 14CZ 305306 B6

Příklad 19: 7-hydroxyepiandrosteron XXIII

Roztok 100 ml acetonu obsahující 5 ml vody, 10 g 7-hydroxy-17-ketalepiandrosteronu XXII (28,57 mmol, 50 hmotn. %) a katalytické množství //-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Reakční médium bylo pak ochlazeno, vlito do 100 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu sodného ve vodě a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO₂/ethyl-acetát). Bylo získáno 5,24 g (17,14 mmol, 60 hmotn. %) 7-hydroxyepiandrosteronu XXIII.

Příklad 20: 7a-hydroxyepiandrosteron XXIV a 7(3-hydroxyepiandrosteron XXV

7-hydroxyepiandrosteron XXIII (5 g) obsahující epimery 7a a 7β v poměru 65/35 byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (A1₂O₃/CHC1₃). Nejdříve byl získán 7|3-hydroxyepiandrosteron XXV (2,5 g), pak 7a-hydroxyepiandrosteron XXIV (1,34 g). 7a-Hydroxyepiandrosteron XXIV a 7(3-hydroxyepiandrosteron XXV byly rekrystalizovány z ethyl-acetátu.

Příklad 21: Protokol pro studium hypoxického poškození nervových buněk

Organotypické kultury řezů hippocampu byly připraveny základním postupem podle Pringle et al (1996, 1997) a modifikovány následujícím způsobem:

Mláďata krysy kmene Wistar (8 až 11 dní stará) byla zabita a hippocampus byl rychle oddělen do ledového Geyova rovnovážného solného roztoku obsahujícího glukosu v množství 4,5 mg/ml. Řezy byly separovány a vloženy do insertů kultury Millicell CM (4 na misku) a udržovány po dobu 14 dní za podmínek 37 °C/5 % CO₂. Médium mělo složení 25 % tepelně inaktivovaného koňského séra, 25 % Hankova rovnovážného solného roztoku (HBSS) a 50 % minimálního základního média s přídavkem Earlových solí (MEM) s 1 mM glutaminu a 4,5 mg/ml glukosy. Médium bylo vyměňováno každé 3 až 4 dny.

Experimentální hypoxie byla provedena, jak bylo dříve popsáno (Pringle et al, 1996, 1997). Stručně shrnuto, kultury byly převedeny do média neobsahujícího sérum (SFM - 75 % MEM, 25 % HBSS a 1 mM glutaminu a 4,5 mg/ml glukosy) obsahujícího 5 pg/ml fluorescenčního exkluzního barviva propidiumjodidu (PI). Kultury byly před měřením fluorescence ekvilibrovány v tomto médiu po dobu 60 minut. Fluorescence PI byla stanovena invertovaným mikroskopem Leica se sadou rhodaminových filtrů. Všechny kultury, u nichž byla v tomto stadiu naměřena fluorescence PI, byly z dalších experimentů vyloučeny. Hypoxie byla indukována převedením kultur do SFM (+ PI), které bylo nasyceno 95 % N₂/5 % CO₂. Misky s kulturami byly pak umístěny do vzduchotěsné komory, v níž byla atmosféra nasycena 95% N₂/5 % CO₂ koeficientem profukováním plynem rychlostí 10 1/min po dobu 10 minut před uzavřením, a inkubovány po dobu 170 minut (celková doba hypoxie byla tedy 180 minut). Nakonec byly hypoxické kultury vráceny do SFM s PI v normální atmosféře a inkubovány po dobu dalších 24 hodin.

Poškození nervových buněk bylo stanoveno, jak bylo popsáno dříve (Pringle et al, 1996, 1997), za použití buď NIH Image 1.60 na počítači Apple lisí, nebo OpenLab 2.1 (Improvision) na počítači Macintosh G4/400.K zobrazení byla použita monochromní kamera a zobrazení byla uložena na optický disk pro pozdější analýzu. Zobrazení přenosu světla byla zachycena bezprostředně před přídavkem léčiv a zobrazení fluorescence PI byla naměřena na konci dvacetičtyřhodinového posthypoxického zotavovacího období. Oblast buněčné vrstvy CA1 byla určena ze zobrazení přenosu světla. Oblast fluorescence PI v CA 1 byla měřena za použití funkce hustoty

- 15CZ 305306 B6 řezu, která je součástí NIH Image nebo OpenLab, a poškození nervových buněk bylo stanoveno jako podíl CA1, kde byla fluorescence Pl detekována vyšší než pozadí.

Steroidní sloučeniny byly připraveny tak, že výchozí roztok v ethanolu o koncentraci 1 mg/ml byl dále rozředěn SMF. Sloučeniny byly přidány ke kulturám 45 minut před hypoxií, během hypoxie a posthypoxického zotavovacího období. Kontrolní pokusy byly kultury ošetřeny pouze vehikulem.

Výsledky

Pokus 1

Účelem výchozího pokusu bylo určit, zda jsou 7a-hydroxyepiandrosteron a 7(3-hydroxyepiandrosteron neuroprotektivní při vysoké koncentraci 100 nM. Hypoxií vznikla léze v 25,5+6,4 % CA1. Toto poškození bylo značně sníženo 7a-hydroxyepiandrosteronem i 7p-hydroxyepiandrosteronem podávanými před hypoxií, během ní i po ní (viz tab. 1).

Tabulka 1

Sloučenina Kontrolní hypoxie Hypoxie + 100 nM 7a-hydroxyepiandrosteronu Hypoxie + 100 nM 7P-hydroxyepiandrosteronu

N 17 16 16

Podíl poškození CA1 (%) 25,5+6,4 4,0±2,9*‘ 9,0±4,7*

Pokus 2

Po potvrzení neuroprotektivního účinku 7a-hydroxyepiandrosteronu i 7(3-hydroxyepiandrosteronu byla stanovena závislost tohoto účinku na koncentraci sloučenin. Kontrolní hypoxie způsobila poškození nervových buněk 31,9±4,7 % CA1. 7(3-Hydroxyepiandrosteron byl významně neuroprotektivní při koncentraci 10 nM a 100 nM, ale jeho účinek se ztratil, pokud koncentrace klesla na 1 nM, jak dokládá tabulka 2.

Tabulka 2

Sloučenina Kontrolní hypoxie Hypoxie + 1 nM 7p-hydroxyepiandrosteronu Hypoxie +10 nM 7p-hydroxyepiandrosteronu Hypoxie +100 nM 73-hydroxyepiandrosteronu

N 29 15 12 13

Podíl poškození CA1 (%) 31,9±4,7 20,6+7,2 11,9±4,7* 14,3±5,0*

Pokus 3

Po prostudování neuroprotektivního účinku 7f3-hydroxyepiandrosteronu i byl testován neuroprotektivní účinek i 7|3-hydroxydehydroepiandrosteronu. Kultury byly inkubovány buď se 100 nM 7(3-hydroxydehydroepiandrosteronu, nebo s vehikulem, a to s podáním před hypoxií, během ní i po ní. Hypoxie způsobila poškození 29,0+6,2 % CA1. V kulturách ošetřených 7(3-hydroxydehydroepiandrosteronem bylo pozorováno značné a vysoce signifikantní snížení poškození nervových buněk, jak znázorňuje tabulka 3.

- 16CZ 305306 B6

Tabulka 3

Sloučenina Kontrolní hypoxie Hypoxie + 100 nM 7P-hydroxydehydroepiandrosteronu

N 21 16

Podíl poškození CA1 (%) 29,0±6,2 4,2±1,9**

Příklad 22: Celková mozková ischémie krys (4 cévní okluze)

Mozková ischémie byla vyvolána 4 cévními okluzemi (4VO) u samce krysy kmene Wistar (250 až 280 g). Vertebrální artérie byly uzavřeny elektrokauterizací ve fenobarbitalní anestézii (60 mg/kg intraperitoneálně). Zvířata byla ponechána 24 hodit se zotavit, přičemž měla volný přístup k vodě, ne však k potravě. Další den byly krční artérie vystaveny anestézii 2% halotanu v 30 % kyslíku/70 % oxidu dusného a uzavřeny na dobu 10 minut pomocí mikrovaskulámích svorek. Pak byly svorky odstraněny a u artérií byla zkoumána okamžitá reperfúze. Během operace a 3 hodiny po ní byla normální tělesná teplota zvířat (37,5±0,5 °C) udržována termostaticky kontrolovanou vyhřívanou přikrývkou připojenou k rektálnímu teploměru. U kontrolních zvířat byly vertebrální artérie též kauterizovány ve fenobarbitální anestézii a pak byly následující den vystaveny anestézii 2% halotanu v 30 % kyslíku/70 % oxidu dusného, ovšem bez uzavření svorkami. Zranění bylo ošetřeno lidokainovým gelem a sešito. Zvířata byla umístěna pod zahřívací lampu při 30 °C, dokud nenabyla vědomí.

Bylo studováno 7 skupin zvířat:

1. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7j3-hydroxyepiandrosteron (0,1 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 minut po reperfúzi)

2. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7P~hydroxyepiandrosteron (0,3 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 minut po reperfúzi)

3. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7|3-hydroxyepiandrosteron (1 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 minut po reperfúzi)

4. (8 zvířat) NBQX (disodná sůl z důvodu lepší rozpustnosti ve vodě) jako referenční látka a pozitivní kontrola (TOCRIS, SRN, 30 mg/kg, intraperitoneálně, 3 injekce, jak je popsáno výše)

5. (8 zvířat) vehikulum (0,9% NaCl s obsahem 100 μΐ ethanolu), 3 injekce, jak je popsáno výše

6. (8 zvířat) pouze ischémie

7. (8 zvířat) operovaná kontrolní zvířata.

NBQX je 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)chinoxalin, což je látka s prokázanou neuroprotektivní aktivitou (Gill, R.; Nordholm, L.; Lodge, D.: The neuroprotective action of 2,3dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)quinoxaline (NBQX) in a rat focal ischaemia model. Brain Res. 580, 35-43, 1992).

Látky byly rozpuštěny ve 100 μΐ ethanolu a pak zředěny 0,9% NaCl.

Po přežití 7 dní po ischémii byla zvířatům fixována perfúze 4% paraformaldehydem do srdce. Mozky byly opatrně vyjmuty a fixovány v témž médiu po dobu 2 hodin. Po kryoprotekci ve 30% sacharose byly mozky rychle zmraženy v isopentanu a uchovávány při -80 °C. Dvacetimikro- 17CZ 305306 B6 metrové kryostatické řezy obsahující útvar hippocampu byly obarveny Nisslovou metodou toluidinovou modří nebo fluorescencí NeuroTrace.

Analýza dat

Vážnost poškození v oblasti CA1 hippocampu po ischémii byla vyhodnocena počtem přeživších nervových buněk detekovaných Nisslovým barvením. Pro každou skupinu byl v CA1 oblasti stanoven střední počet morfologicky nepoškozených nervových buněk na délku 400 pm. Spočítání buněk bylo provedeno v 3 až 5 sériových řezech u každého zvířete a v šesti 400μπι oblastech CA1 v každém řezu pomocí světelného mikroskopu s objektivem 20x. Data byla statisticky vyhodnocena Studentovým T-testem a jsou udána jako střední hodnota ± odchylka.

Výsledky a diskuse

Výsledky znázorňují obrázky 1 až 3.

Morfologicky nepoškozené nervové buňky CA1 hippocampu byly charakterizovány Nisslovým barvením (toluidinová modř nebo fluorescence NeuroTrace, obr. 2) podle následujících kritérií: jasný tvar perikarya nervové buňky, velké jádro s pozitivně obarveným jadérkem, malá oblast cytoplasmy okolo jádra s pozitivním Nisslovým obarvením, označující přítomnost neporušeného hrubého endoplasmatického retikula s ribosomy, což signalizuje neporušenou schopnost syntézy proteinů.

minut celkové ischémie (mírná ischémie) a doba přežití 7 dní vedou k neurodegeneraci pyramidálních buněk výlučně v oblasti CA1 hippocampu (obr. 1A-1C). Střední počet pyramidálních buněk vCAl kontrolních operovaných zvířat byl 121,5±4,3 (uvažováno jako 100 %). Po 10 minutách celkové ischémie zahynulo 60 % nervových buněk CA1 (obr. 1B). Počet nervových buněk u zvířat ve skupině vystavené ischémii a intravenózní injekci vehikula (NaCl + 100 μΐ ethanolu) aplikované, jak je popsáno výše, byl srovnatelný se skupinou vystavenou pouze ischémii (obr. ΙΑ, 1B). NBQX (30 mg/kg, 3 intravenózní injekce, jak je popsáno výše) vykazoval signifikantní neuroprotekci (p=0,03) pyramidálních buněk CA1 ve srovnání s ischemickou skupinou. V porovnání s čistě ischemickou skupinou vyvolává NBQX 47,5% neuroprotekci, zatímco ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty byl jeho neuroprotektivní účinek 68,5 %. Neuroprotekce vyvolaná NBQX byla v souladu s Gill et al, 1992, a Gill 1994, kde byla demonstrována platnost modelu celkové ischémie použitého v našich experimentech. 7|3-Hydroxyepiandrosteron má neuroprotektivní účinek na pyramidální buňky CA1 hippocampu po 10 minutách celkové ischémie a 7 dnech přežití, který je závislý na koncentraci (obr. 1A). Analýza T-testem odhalila vysoce signifikantní neuroprotektivní účinek 7f3-hydroxyepiandrosteronu v koncentracích 0,1 mg/kg (p=0,01) a 0,3 mg/kg (p=0,000 8). Ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty byl neuroprotektivní účinek 7|3-hydroxyepiandrosteronu na pyramidální buňky CA1 74,8 % (pro 0,1 mg/kg) a 83,9% (pro 0,3 mg/kg) (obr. IC). 7[3-Hydroxyepiandrosteron v koncentraci 1,0 mg/kg vykazoval pouze tendenci neuroprotekce, ale jeho účinek nebyl signifikantní.

V žádném z experimentů s 7[3-hydroxyepiandrosteronem injikovaném před ischémii, během ní i po ní nebyly pozorovány žádné abnormality v chování zvířat.

Vysvětlivky k obrázkům:

Počet morfologicky nepoškozených pyramidálních buněk CA 1 hippocampu u krys po 7 dnech po celkové mozkové ischémii při vlivu různých sloučenin.

Obrázek 1 A: Data byla uvedena jako střední počet ± odchylka nepoškozených nervových buněk na 400 pm délky oblasti CA1.

-18CZ 305306 B6

Obrázek IB: Data jsou vyjádřena jako podíl nepoškozených nervových buněk na 400 pm délky oblasti CA1 ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty (100 %).

Obrázek IC: Data byla vyhodnocena jako absolutní procento neuroprotekce, když počet přeživších nervových buněk v ischemické skupině byl považován za 0 % a počet přeživších nervových buněk ve skupině operovaných kontrolních zvířat byl považován za 100 %.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká použití 3-hydroxy-7p-hydroxysteroidu, 3-oxo-7(3-hydroxysteroidu ajejich farmaceuticky přijatelných esterů pro přípravu léčiva pro ochranu před poškozením nervových buněk.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití 7[3-hydroxysteroidu obecného vzorce I nebo II:

nebo jeho farmaceuticky přijatelného esteru, přičemž v uvedených obecných vzorcích I nebo II substituenty R¹ a R² jsou stejné nebo navzájem různé a představují atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, alkynylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, arylovou skupinu s 6 až 10 atomy uhlíku, formylovou skupinu, alkylkarbonyllovou skupinu s 2 až 7 atomy uhlíku, alkenylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, alkynylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, arylkarbonylovou skupinu se 7 až 11 atomy uhlíku, aralkylkarbonylovou skupinu s 8 až 15 atomy uhlíku, aralkenylkarbonylovou skupinu s 9 až 15 atomy uhlíku nebo heterocyklickou karbonylovou skupinu, jak jsou definovány dále, jeden ze substituentů R^a a R^b představuje hydroxy skupinu, přednostně v β-konfiguraci, a druhý substituent představuje atom vodíku, nebo R^a a R^b společně tvoří oxoskupinu,

- 19CZ 305306 B6 kruh A je benzenový nebo cyklohexanový kruh, přičemž pokud kruh A je cyklohexanový kruh, přerušovaná čára v kruhu B představuje jednoduchou nebo dvojnou vazbu uhlík-uhlík a n je 1, zatímco pokud kruh A je benzenový kruh, přerušovaná čára v kruhu B představuje jednoduchou vazbu uhlík-uhlík a n je 0, výše uvedená heterocyklická karbonylová skupina je skupinou obecného vzorce R³-CO, ve kterém R³ představuje heterocyklickou skupinu s 3 až 7 atomy kruhu, z nichž 1 až 3 atomy jsou heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující atomy dusíku, atomy kyslíku a atomy síry a alespoň jedním zbývajícím atomem je atom uhlíku, výše uvedené alkylové, alkenylové a alkynylové skupiny a alkylové, alkenylové a alkynylové části uvedených alkylkarbonylových, alkenylkarbonylových a alkynylkarbonylových skupin jsou nesubstituované nebo mají alespoň jeden z následujících substituentů ψ: hydroxylové skupiny, merkaptoskupiny, atomy halogenů, aminoskupiny, alkylaminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny v nichž každá alkylová skupina má 1 až 6 uhlíkových atomů, karbamoylové skupiny, nitroskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkylthioskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, karboxylové skupiny, alkoxykarbonylové skupiny a nesubstituované arylové skupiny s 6 až 10 atomy uhlíku, přičemž výše uvedené arylové skupiny, heterocyklické skupiny a arylové části arylkarbonylových skupin a aralkylkarbonylových skupin jsou nesubstituované nebo mají alespoň jeden z následujících substituentů ζ, kterými jsou: kterýkoliv ze substituentů ψ, a alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, a halogenalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, a jejich farmaceuticky přijatelné soli a estery pro výrobu léčiva pro ochranu před poškozením nervových buněk.

2. Použití podle nároku 1, kde substituenty R¹ a R² jsou stejné nebojsou navzájem různé a každý z nich představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, případně substituovanou fenylovou skupinu, formylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu s 2 až 5 atomy uhlíku, arylkarbonylovou skupinu se 7 až 11 atomy uhlíku, arylalkylkarbonylovou skupinu s 8 až 15 atomy uhlíku nebo heterocyklokarbonylovou skupinu definovanou níže, jedním ze substituentů R^a a R^b je hydroxyskupina v β-konfiguraci, a druhým je atom vodíku nebo R^a a R^b představují společně oxoskupinu, výše uvedenou heterocyklokarbonylovou skupinou je skupina obecného vzorce R -CO, kde R představuje heterocyklickou skupinu s 3 až 7 atomy kruhu, z nichž 1 až 3 jsou heteroatomy vybrané ze skupiny obsahující atomy dusíku, atomy kyslíku a atomy síry a alespoň jedním zbývajícím atomem je atom uhlíku.

-20CZ 305306 B6

3. Použití podle nároku 1, kde steroidem je 7|3-hydroxyepiandrosteron.

4. Použití podle nároku 1, kde steroidem je 7|3-hydroxydehydroepiandrosteron.

5. Použití podle nároku 1, kde steroidem je 7 β-hydroxy-17{3-estradiol.

6. Použití podle nároku 1, kde steroidem je 7β-hydroxyestron.

7. Použití podle nároku 1, kde steroidem je 7a-hydroxyestron.

8. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, kde poškození nervových buněk je způsobeno chronickou poruchou.

9. Použití podle nároku 8, kde chronickou poruchou je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba nebo kognitivní porucha nikoliv však demence.

10. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, kde poškození nervových buněk je způsobeno akutní poruchou.

11. Použití podle nároku 10, kde akutní porucha je způsobena mrtvicí, mozkovým traumatem, poraněním páteřní míchy nebo periferních nervů.

3 výkresy