NO332089B1 - Anvendelse av et 7ß-hydroksysteroid eller en farmasoytisk aksepterbar ester eller et annet derivat for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot neuronskade - Google Patents

Abstract

3-hydroksy-7B hydroksysteroider og 3-okso-7B-hydroksysteroider samt farmasøytisk aksepterbare estere derav er anvendbare for beskyttelse mot neuronskade.

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder anvendelse av en serie av 3-hydroksy-7p-hydroksysteroidforbindelser og visse ketonderivater av disse for beskyttelse mot nervecelledød, og forbindelsene er således anvendbare ved behandling og forebyggelse av tilstander eller følgene av tilstander som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kognitiv svekkelse uten demens (CIND), slag, hjernetraume og skader på ryggmarg og perifere nerver; de er også anvendbare for å fremme den kognitive funksjon.

Dannelsen av 7a-hydroksylerte metabolitter av dehydroepiandrosteron

(DHEA) in vivo har vært kjent siden 1959 med påvisning av 7a-hydroksy-DHEA i urin [JJ. Schneider, MX. Lewbart, Recent Progr. Horm. Res. 15 (1959) 201-230; L. Starka et al., Clin. Chim. Acta. 7 (1961) 309-316)]. Siden da er omfattende 7a-hydroksylering av 3p-hydroksysteroidsubstrater (innbefattet DHEA og epiandrosteron - EPLA) blitt rapportert i vevspreparater fra mange humane organer, innbefattet voksen og føtal lever, testis, bitestikler, hud, brystvev, prostata, adipøse stromaceller og tonsiller. Hydroksylering av DHEA i 7-posisjon er også blitt påvist i rottelever og i flere muse vev og -organer. Imidlertid er liten eller ingen oppmerksomhet blitt rettet mot 7P-ekvivalenten. I alle disse undersøkelsene var 7a-hydroksy-DHEA den metabolitt det absolutt ble dannet mest av. Faktisk rapporterte Doostzadeh et al. [Steroids 63 (1998) 608-614] at dannelseshastigheten for 7a-hydroksy-DHEA for muselevermikrosomer var mer enn 15 ganger høyere enn dannelseshastigheten for 7P-hydroksy-DHEA.

EPIA, DHEA og pregnenolon er også blitt vist å omformes hurtig og omfattende til de tilsvarende 7a-hydroksymetabolitter i rottehjerne [J.M. Guiraud et al., Steroids 34 (1979) 241-248; M. Warner et al., Endocrinology 124 (1989) 2699-2706; Y. Akwa et al., Biochem. J. 288 (1992) 959-964)].

WO 97/37664 beskriver anvendelse av en rekke forbindelser, innbefattet 7a-hydroksysubstituerte steroider, for behandling av neuropsykiatriske forstyrrelser, immunforstyrrelser og endokrine forstyrrelser. Blant forstyrrelsene som det i WO 97/37664 foreslås at disse forbindelsene kan anvendes for å behandle, inngår Alzheimers sykdom. Mekanismen som foreslås for denne virkning, er imidlertid at det antas at forstyrrelsen skyldes mangel på det 7a-hydroksysubstituerte steroid i hjernen, og behandlingen som foreslås i WO 97/37664, korrigerer således denne mangel ved tilførsel av et 7a-hydroksysubstituert steroid for å erstatte den manglende forbindelse. Fremgangsmåten som beskrives i WO 97/37664, behandler således en eksisterende tilstand, snarere enn å forebygge tilstanden eller forhindre en forverring av tilstanden ved å forhindre ytterligere neuronskade. WO 97/37664 beskriver derfor ingen neurobeskyttende virkning. Den bygger også på den antagelse at det aktive middel er 7a-forbindelsen og at 7P-forbindelsen dersom denne foreligger, er inaktiv.

WO 94/20111 beskriver også anvendelse av en rekke DHEA-derivater for å forebygge eller redusere tap av vevslevedyktighet grunnet adhesjon av nøytrofile celler til endotelceller. Dette er imidlertid ikke mekanismen som ligger bak forstyrrelsene som behandles ved foreliggende oppfinnelse.

Selv om det var kjent at 7P-hydroksyanalogene av forbindelsene som beskrives i WO 97/37664 ble dannet in vivo, dannes de i mengder som utgjør mindre enn 5%, sammenlignet med mer enn 95% av 7a-isomeren. Videre har intet enzymsystem som er ansvarlig for overføring av disse 3-hydroksysteroidene til de tilsvarende 7P-hydroksyderivater, blitt beskrevet. Av alle disse grunner, og i lys av den forskning som oppsummeres ovenfor, er det klart fra litteraturen at den generelle forventning var at 7P-isomeren ville være inaktiv. Som en følge av dette, og som det klart fremgår av litteraturen som oppsummeres ovenfor, og mye annet, er i det vesentlige ingen undersøkelse av mulig biologisk aktivitet av 7P-forbindelsene blitt utført.

I strid med denne forventning har vi overraskende nok funnet at de 7P-hydroksysubstituerte steroider har en biologisk aktivitet, og at denne aktivitet ikke er aktiviteten som beskrives i WO 97/37664 for de 7a-hydroksysubstituerte steroider. Det er snarere snakk om en neurobeskyttende aktivitet tilsvarende den som tidligere er blitt påvist, om enn i en annen klasse av forbindelser, i WO 99/31049.

Under begivenheter som forlenget hypoksi og iskemi, forbundet med hypoglykemi eller ikke, opptrer neuronskade i varierende grad.

Iskemi opptrer typisk under hjerteanfall, men skaden som opptrer under slike omstendigheter, er i det vesentlige begrenset til hjertevevene, og visse behandlingsformer er blitt utviklet. Når det gjelder foreliggende oppfinnelse, er vi opptatt av virkningene av både korttidsiskemi og iskemi over lengre tid i hjernen, f.eks. hos slagpasienter eller som en følge av hodeskader, og også ved mer langsomt utviklende neurodegenerative sykdommer som følge av alder, hvor kronisk iskemi under terskelnivået og/eller en kompromittert energitilførsel kan bidra til de observerte degenerative endringer i hjernen. Omfanget av iskemien avhenger av slaget eller skadens natur, men det vil uten unntak forekomme hjerneskade, og dette er hva foreliggende oppfinnelse er rettet mot.

Forskjellige neurobeskyttende midler som forsøker å lette problemet med hjerneskade, er kjent innen faget, men alle de som i dag er kjent, er forbundet med uheldige bivirkninger. For eksempel er MK801 (dizocilpinmaleat) et temmelig enkelt molekyl som vites å gi et nivå av neurobeskyttelse hos iskemiske pasienter. MK801 er imidlertid også forbundet med "alarmerende psykotropiske virkninger" (Martindale), så vel som uønskede, motoriske virkninger. De neurobeskyttende virkningene beskrives i detalj i Brain Research 755 (1997) 36-46 (Pringle, A.K. et al.). De samme forfattere be-skrev også de neurobeskyttende virkninger av conotoksin i en tidligere artikkel, men trass i denne forbindelses neurobeskyttende virkninger observeres uønskede bivirkninger in vivo.

Foreliggende oppfinnelse består således i anvendelse av et 70-hydroksysteroid eller en farmasøytisk aksepterbar ester eller et annet derivat derav for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot neuronskade, hvor steroidet er en forbindelse med formel (I) eller (II):

hvor

R og R uavhengig av hverandre står for et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, en alkenylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, en alkynylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, en arylgruppe med fra 6 til 10 karbonatomer, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe med fra 2 til 7 karbonatomer, en alkenylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, en alkynylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe med fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe med fra 8 til 15 karbonatomer, en aralkenylkarbonylgruppe med fra 9 til 15 karbonatomer eller en heterosyklisk gruppe-karbonylgruppe som definert nedenfor,

én av Ra og R<b>står for en hydroksygruppe fortrinnsvis i Ø-konfigurasjon, og den andre står for et hydrogenatom, eller Ra og R<b>sammen står for en oksogruppe,

ringen A,

er en benzenring eller sykloheksanring,

dersom ring A er en sykloheksanring, den prikkede linje i ring B står for en enkelt eller dobbelt karbon-karbonbinding og n er 1, eller dersom ring A er en benzenring, den prikkede linje i ring B står for en enkelt karbon-karbonbinding og n er 0,

den heterosykliske gruppe-karbonylgruppen er en gruppe med formel R -CO, hvori R står for en heterosyklisk gruppe med fra 3 til 7 ringatomer av hvilke fra 1 til 3 er heteroatomer utvalgt blant nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det eller de gjenværende atomer, av hvilke det minst er ett, er karbonatomer,

hvor alkylgruppen, alkenylgruppen og alkynylgruppen samt alkyl-, alkenyl- og alkynyldelen av alkylkarbonylgruppen, alkenylkarbonylgruppen og alkynylkarbonylgruppen er usubstituert eller har minst én av følgende substituenter\|/: substituenter\|/: hydroksygrupper, merkaptogrupper, halogenatomer, aminogrupper, alkylaminogrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, dialkylaminogrupper hvori hver alkylgruppe har fra 1 til 6 karbonatomer, karbamoylgrupper, nitrogrupper, alkoksygrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, alkyltiogrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, karboksygrupper, alkoksykarbonylgrupper og usubstituerte arylgrupper med fra 6 til 10 karbonatomer,

hvor arylgruppene, de heterosykliske gruppene og aryldelen av arylkarbonylgruppene og aralkylkarbonylgruppene er usubstituert eller har minst én av følgende substituenter

substituenter enhver av substituentene\|/og alkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, hydroksyalkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer og haloalkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer,

eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller en ester derav.

En spesiell klasse av 7|3-hydroksysteroider som er av spesiell interesse for foreliggende oppfinnelse, er 3|3,7|3-hydroksysteroidene og farmasøytisk aksepterbare estere av disse.

Foretrukne estere er karboksylsyreestere.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er, i formel (I), R<1>og R<2>uavhengig av hverandre et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, en eventuelt substituert fenylgruppe, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe med fra 2 til 5 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe med fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe med fra 8 til 15 karbonatomer eller en heterosyklisk gruppe-karbonylgruppe som definert nedenfor,

én av Ra og R<b>står for en hydroksygruppe i Ø-konfigurasjon, og den andre står for et hydrogenatom, eller Ra og R<b>sammen står for en oksogruppe,

hvor den heterosykliske gruppe-karbonylgruppen er en gruppe med formel R<3->CO, hvori R<3>står for en heterosyklisk gruppe med fra 3 til 7 ringatomer av hvilke 1

til 3 er heteroatomer utvalgt blant nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det eller de gjenværende atomer, av hvilke det minst er ett, er karbonatomer.

En utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelse hvor neuronskaden er forårsaket av en kronisk forstyrrelse.

Enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelse hvor den kroniske forstyrrelsen er Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom eller kognitiv forstyrrelse uten demens.

Enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelse hvor neuronskaden er forårsaket av en akutt forstyrrelse.

Ytterligere en utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelse hvor den akutte forstyrrelsen er forårsaket av slag, hjernetraume, ryggmargsskade eller perifer nerveskade

I forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hvoriR<1>, R<2>, R<4>eller substituenten £, er en alkylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sek.-butyl, t-butyl, pentyl, 1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 3-metylbutyl, 1-etylpropyl, 2-etylpropyl, 1,1-dimetylpropyl, heksyl, 1-metylpentyl, 2-metylpentyl, 3-metylpentyl, 4-metylpentyl, 1-etylbutyl, 2-etylbutyl, 3-etylbutyl, t-heksyl og 1,1-dimetylpentyl, av hvilke grupper med fra 1 til 4 karbonatomer foretrekkes, og hvor metylgruppen og etylgruppen er mest foretrukne.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en alkenylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkenylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter vinyl, 1-propenyl, allyl, isopropenyl, metallyl, 1-, 2-, 3-butenyl, isobutenyl, 1-, 2-, 3-, 4-pentenyl og 1-, 2-, 3-, 4-, 5-heksenyl, hvorav alkenylgrupper med fra 2 til 4 karbonatomer foretrekkes, og hvorav vinylgruppen og allylgruppen er mest foretrukne.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en alkynylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkynylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter etynyl, 1-, 2-propynyl, 1-, 2-, 3-butynyl, isobutynyl, 1-, 2-, 3-, 4-pentynyl og 1-, 2-, 3-, 4-, 5-heksynyl, hvorav alkynylgrupper med fra 2 til 4 karbonatomer foretrekkes.

Dersom R<1>, R<2>, R<4>eller substituenten ¥ står for en arylgruppe, er denne en aromatisk, karbosyklisk gruppe med fra 6 til 10 karbonatomer. Eksempler på slike grupper omfatter fenyl, 1-naftyl, 2-naftyl og indenyl, av hvilke fenylgruppen foretrekkes. Bortsett fra når det gjelder substituent a, kan disse gruppene være substituert eller usubstituert. Dersom gruppen er substituert, er antall substituenter kun begrenset av antall substituerbare posisjoner, og, muligens i noen tilfeller, av steriske grunner. Når det gjelder fenylgruppene, er således det maksimale antall substituenter 5, for naftylgrupper er det maksimale antall substituenter 7 osv. Et foretrukket antall substituenter er imidlertid fra 1 til 3, og substituentene er som beskrevet i det påfølgende.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en alkylkarbonylgruppe, er dette en alkanoylgruppe som kan være en uforgrenet eller forgrenet gruppe med fra 2 til 7 karbonatomer (dvs. fra 1 til 6 karbonatomer i alkyldelen), og eksempler omfatter acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, heksanoyl og heptanoyl, av hvilke grupper med fra 2 til 5 karbonatomer foretrekkes, og hvorav acetylgruppen og propionylgruppen er mest foretrukne. Alkyldelen i denne gruppen kan være substituert eller usubstituert, og dersom den er substituert, er substituentene utvalgt blant substituentene a. Eksempler på slike substituerte grupper omfatter alanyl, (3-alanyl, fenylalanyl, asparaginyl, cysteinyl, glykoloyl, glysyl, metionyl, ornityl, glyseroyl, tropoyl, glutaminyl, glutamyl, homocysteinyl, seryl, homoseryl, treonyl, laktoyl, leucyl, isoleucyl, norleucyl, lysyl, valyl, norvalyl og sarkosyl.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en alkenylkarbonylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkenylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter akryloyl, metakryloyl, krotonoyl, isokrotonoyl, 3-butenoyl, pentenoyl og heksenoyl, hvorav alkenylkarbonylgrupper med fra 3 til 5 karbonatomer foretrekkes, og hvorav akryloylgruppen og metakryloylgruppen er mest foretrukne.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en alkynylkarbonylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkynylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter propioloyl, 3-butynylkarbonyl, pentynylkarbonyl og heksynylkarbonyl, hvorav alkynylkarbonylgrupper med fra 3 til 5 karbonatomer foretrekkes.

Dersom R<c>, R<1>, R2 eller R<4>står for en arylkarbonylgruppe, kan aryldelen av denne være enhver av arylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne arylkarbonylgrupper omfatter benzoyl, o-, m- eller p-toluoyl, o-, m- eller p_-anisoyl, o-, m- eller p_-hydroksybenzoyl, pikryl, galloyl, protocatechuoyl, vannilloyl, veratroyl, antraniloyl, 1-naftoyl og 2-naftoyl.

Dersom R<1>, R2 eller R<4>står for en aralkylkarbonylgruppe eller en aralkenylkarbonylgruppe, kan arylgruppen og alkyl- hhv. alkenylgruppen være enhver av gruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Spesifikke eksempler på slike grupper omfatter fenacetyl, 3-fenylpropionyl, benziloyl, tyrosyl, atropopyl, hydratropoyl og cinnamoyl.

Dersom R<c>,R<1>, R2 eller R<4>står for en heterosyklisk gruppe-karbonylgruppe, er dette en gruppe med formel R<3->CO-, hvori R<3>står for en heterosyklisk gruppe med fra 3 til 7 ringatomer av hvilke 1 til 3 er nitrogen-, oksygen-eller svovelatomer, og den gjenværende er karbonatomer. Minst ett av ringatomene bør være et karbonatom. Dersom det foreligger 3 heteroatomer, foretrekkes det at minst ett av disse er et nitrogenatom. Eksempler på slike grupper omfatter 2- og 3-furoyl, 2- og 3-tenoyl, 2-pyridinkarbonyl, nikotinoyl, isonikotinoyl, prolyl, piperidinkarbonyl, piperazinkarbonyl og morfolinokarbonyl.

Dersom R<c>er en alkanoylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet gruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, heksanoyl og heptanoyl, hvorav grupper med fra 2 til 5 karbonatomer foretrekkes, hvorav acetylgruppen og propionylgruppen er ytterligere foretrukne, og hvorav acetylgruppen er mest foretrukket.

Dersom substituenten\|/eller substituenten % er en alkylaminogruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være enhver av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike alkylaminogrupper omfatter metylamino, etylamino, propylamino, isopropylamino, butylamino, isobutylamino, sek.-butylamino, t-butylamino, pentylamino, isopentylamino, neopentylamino, t-pentylamino, heksylamino og isoheksylamino, hvorav grupper med fra 1 til 4 karbonatomer foretrekkes og hvorav metylaminogruppen og etylaminogruppen er mest foretrukne.

Dersom substituenten\|/eller substituenten\|/er en dialkylaminogruppe, har hver alkylgruppe fra 1 til 6 karbonatomer, og de to alkylgruppene kan være like eller forskjellige. Alkylgruppene kan være hvilke som helst av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike dialkylaminogrupper omfatter dimetylamino, metyletylamino, dietylamino, metylpropylamino, dipropylamino, diisopropylamino, etylbutylamino, dibutylamino, di-t-butylamino, metylpentylamino, dipentylamino, diisopentylamino og diheksylamino, hvorav grupper med fra 1 til 4 karbonatomer i hver alkylgruppe foretrekkes, og hvorav dimetylaminogruppen og dietylaminogruppen er mest foretrukne.

Dersom substituenten\|/eller substituenten t, er en alkoksygruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkoksygruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter metoksy-, etoksy-, propoksy-, isopropoksy-, butoksy-, isobut-oksy-, sek.-butoksy-, t-butoksy-, pentyloksy-, isopentyloksy-, neopentyloksy-, t-pentyloksy-, heksyloksy- og isoheksyloksygrupper, hvorav grupper med fra 1 til 4 karbonatomer foretrekkes, og hvorav metoksygruppen og etoksygruppen er mest foretrukne.

Dersom substituenten\|/eller substituenten C, er en alkyltiogruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være enhver av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike alkyltiogrupper omfatter metyltio, etyltio, propyltio, isopropyltio, butyltio, isobutyltio, sek.-butyltio, t-butyltio, pentyltio, isopentyltio, neopentyltio, t-pentyltio, heksyltio og isoheksyltio, hvorav grupper med fra 1 til 4 karbonatomer foretrekkes, og hvorav metyltiogruppen og etyltiogruppen er mest foretrukket.

Dersom substituenten\|/eller substituenten £ er en

alkoksykarbonylgruppe, kan denne være en uforgrenet eller forgrenet alkoksykarbonylgruppe med fra 2 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, propoksykarbonyl, isopropoksykarbonyl, butoksykarbonyl, isobutoksykarbonyl, sek.-butoksykarbonyl, t-butoksykarbonyl, pentyloksykarbonyl, isopentyloksykarbonyl, neopentyloksykarbonyl, t-pentyloksykarbonyl, heksyloksykarbonyl og isoheksyloksykarbonyl, hvorav grupper med fra 1 til 4 karbonatomer foretrekkes, og hvorav metoksykarbonylgruppen og etoksykarbonylgruppen er mest foretrukne.

Dersom substituenten £, er en hydroksyalkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være enhver av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike hydroksyalkylgrupper omfatter hydroksymetyl, 1- og 2-hydroksyetyl, 1-, 2- og 3-hydroksypropyl, 1,2-dihydroksyetyl, 1,2,3-trihydroksypropyl, 4-hydroksybutyl, 5-hydroksypentyl og 6-hydroksyheksyl.

Dersom substituenten £, er en haloalkylgruppe med fra 1 til 6, fortrinnsvis fra 1 til 4, karbonatomer, kan alkyldelen være som definert og eksemplifisert ovenfor, og halogenatomet er fortrinnsvis klor, fluor, brom eller jod. Eksempler på slike grupper omfatter fluormetyl, klormetyl, brommetyl, jodmetyl, diklormetyl, difluormetyl, triklormetyl, trifluormetyl, 2,2,2-trikloretyl, 2-kloretyl, 2-fluoretyl, 2-brometyl, 2-jodetyl, 2,2-dibrometyl, 2,2,2-tribrometyl, 3-fluorpropyl, 3-klorpropyl, 4-brombutyl, 4-fluorbutyl, 5-fluorpentyl og 6-fluorheksyl.

Det vil forstås at dersom forbindelsen inneholder en gruppe med formel - OR, hvori R er enhver av gruppene og atomene som er definert ovenfor når det gjelder R1, etc., er det aktive molekyl sannsynligvis forbindelsen som inneholder den frie hydroksygruppe. Følgelig kan enhver gruppe som in vivo kan overføres til en hydroksygruppe, anvendes istedenfor hydroksygruppen.

Spesifikke eksempler på forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter:

7P-hydroksy-epiandrosteron

(7p-hydroksy-EPIA)

7p-hydroksy-dehydroepiandrosteron

(7p-hydroksy-DHEA)

7p-hydroksy-17p-østradiol T-hydroksy-pregnenolon

7P-hydroksy-østron

I tillegg antas følgende 7a-hydroksyforbindelse å være aktiv på samme måte:

7a-hydroksyøstron

Vi har overraskende funnet at disse forbindelsene kan anvendes som beskyttelse mot akutt og kronisk neuronskade grunnet begivenheter som slag, hjernetraume og cerebral iskemi, f.eks. indusert ved subarachnoid blødning, opptredende under hjerte-"bypass"-kirurgi, etc.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter som er velkjente i seg selv, med utgangspunkt i utgangssteroidene. De kan f.eks. fremstilles ved fremgangsmåtene som beskrives i litteraturen det vises til ovenfor, som vil gi en blanding av 70- og tilsvarende 7a-forbindelser som så kan separeres ved velkjente teknikker.

Som et eksempel kan 7p-hydroksy-EPIA erholdes fra DHEA ved allylisk oksidasjon etter beskyttelse av 3 P-hydroksy gruppen og 17-ketongruppen ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter. Produktet reduseres så med en løselig metallforbindelseskatalysator (f.eks. natriumhydrid), og 3 P-hydroksy gruppen og 17-ketongruppen avbeskyttes. 7a-hydroksy- og 7p-hydroksyepimeren kan så separeres ved konvensjonelle midler, f.eks. kolonnekromatografi, og 7P-hydroksy-EPIA kan krystalliseres til renhet.

En alternativ syntesefremgangsmåte er vist i det påfølgende reaksjonsskjema:

I formlene ovenfor står TBDMSO for t-butyldimetylsilyloksy og Ac for acetyl.

I første trinn i reaksjonsskjemaet ovenfor beskyttes forbindelsen med formel (III), østron, med en t-butyldimetylsilyloksygruppe på konvensjonell måte for erholdelse av den beskyttede forbindelse med formel (IV). Denne får så reagere med etylenglykol i nærvær av en syrekatalysator (f.eks. p-toluensulfonsyre) for beskyttelse av ketogruppen i 17-posisjon og erholdelse av forbindelsen med formel (V). En hydroksygruppe kan så innføres i 6-posisjon som illustrert i det påfølgende i eksempel 3 for erholdelse av forbindelsen med formel (VI), som så dehydreres for erholdelse av forbindelsen med formel (VII). Denne epoksideres for erholdelse av forbindelsen med formel (VIII), som så reduseres til forbindelsen med formel (IX), med en 7a-hydroksygruppe. Den beskyttende t-butyldimetylsilylgruppe fjernes for erholdelse av forbindelsen med formel (X), og denne oppvarmes med en katalytisk syremengde for erholdelse av 7a-hydroksyøstron (XI). Dette oksideres, f.eks. ved anvendelse av kromsyre/svovelsyre, for erholdelse av 7-ketoøstron (XII), som så får reagere med eddiksyreanhydrid for erholdelse av forbindelsen med formel (XIII). Denne forbindelse hydrogeneres, f.eks. ved anvendelse av hydrogen i nærvær av en palladiumkatalysator, for erholdelse av forbindelsen med formel (XIV), og endelig fjernes acetylgruppene for erholdelse av 7P-hydroksyøstron (XV), en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Om ønskelig, kan denne reduseres for erholdelse av 7P-hydroksyøstradiol (XVI), som også er en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Andre 7P-hydroksyforbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på tilsvarende måte, f.eks. kan 7P-hydroksy-DHEA fremstilles som vist i det påfølgende reaksjonsskjema:

I dette reaksjonsskjema acetyleres DHEA (XVII) for erholdelse av det tilsvarende acetat med formel (XVIII) som så får reagere med etylenglykol for erholdelse av ketalet med formel (XIX). Ketalet (XIX) oksideres så som beskrevet i eksempel 16 for erholdelse av den tilsvarende 7-ketoforbindelse (XX), som så deacetyleres for erholdelse av forbindelsen med formel (XXI). Denne reduseres for erholdelse av 7-hydroksy-17-ketal-EPIA med formel (XXII), som så behandles med en syre for fjerning av ketalgruppen og erholdelse av 7-hydroksy-EPIA, som til slutt separeres i 7P-isomeren og 7a-isomeren ved kromatografi for erholdelse av 7a-hydroksy-EPIA (XXIV) og 7p-hydroksy-EPIA (XXV).

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres til pasienten dersom man tror det er fare for en iskemisk begivenhet, fortrinnsvis et slag eller en hodeskade. Slik profylaktisk tilførsel kan være uhyre nyttig. Det er imidlertid også blitt vist at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har anvendbar aktivitet også ved tilførsel etter en iskemisk begivenhet, men det vil forstås at det foretrekkes å tilføre forbindelsene så tidlig som mulig for mest mulig å unngå neurondegenerering. I noen tilfeller kan det være ønskelig å tilføre gjentatte doser, særlig dersom pasienten forblir utsatt for en iskemisk begivenhet.

Egnede tilførselsfremgangsmåter er generelt ved injeksjon for å oppnå det ønskede resultat så hurtig som mulig. Således foretrekkes spesielt intravenøs injeksjon, men i noen tilfeller kan det være å foretrekke å tilføre forbindelsen direkte inn i cerebrospinalvæsken.

Dosen av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse vil variere avhengig av mange faktorer, innbefattet pasientens alder, kroppsvekt og generelle tilstand, så vel som tilførselsfremgangsmåte, tilførselshyppighet og tilførselsvei. Imidlertid anbefales generelt en dose på mellom 0,01 og 50 mg/kg/kroppsvekt, hvor en dose på mellom 0,05 og 20 mg/kg kroppsvekt er mer foretrukket. Dette kan tilføres i en enkeltdose eller oppdelt på flere doser.

Oppfinnelsen illustreres videre ved de påfølgende, ikke-begrensende eksempler, hvorav eksemplene 1 til 20 illustrerer fremstilling av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, og eksemplene 21 og 22 illustrerer deres aktivitet. I eksemplene 1 til 20 viser romertall til formlene i reaksjonsskjemaene vist ovenfor.

Eksempel 1

3- t- butyldimetylsiryløstron ( IV)

4,25 g t-butyldimetylsilylklorid (28,2 mmol, 3 ekv.) ble tilsatt til en løsning av 50 ml dimetylformamid (DMF) tilsatt 2,54 g østron ( III) (9,41 mmol, 1 ekv.) og 3,84 g imidazol (56,5 mmol, 6 ekv.) i en 100 ml kolbe med tre halser. Blandingen ble så inkubert over natten ved romtemperatur under nitrogenatmosfære. En 10%

(vekt/vol) vandig kaliumkarbonatløsning ble tilsatt til reaksjonsblandingen som så ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med vann og så tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 3,76 g 3-t-butyldimetylsilyløstron 2 (9,41 mmol, 100%).

Eksempel 2

17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvløstron ( V)

En løsning av 60 ml toluen tilsatt 3 g 3-t-butyldimetylsilyløstron ( IV)

(7,50 mmol), 3 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet til refluks ved dampdestillering ved anvendelse av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble så uthelt i 50 ml av en 10% (vekt/vol) vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble avdekantert. Vannfasen ble ekstrahert med etylacetat. De organiske fasene ble slått sammen og inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 3,16 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron (V) (7,12 mmol, 95%).

Eksempel 3

6a- hydroksv- l 7- ketal- 3- t- butyldimetylsilyløstron ( VI)

I en 1 1 kolbe med tre halser ble en løsning av 100 ml vannfritt tetrahydrofuran (THF) avgasset ved gjennombobling av nitrogen og avkjølt til -80 °C. Diisopropylamin (20 ml, 143,30 mmol) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. En 15%

(vekt/vol) butyllitiumløsning i sykloheksan (89,9 ml, 143,30 mmol) ble tilsatt dråpevis til reaksjonsblandingen. Etter 10 minutter ble en løsning bestående av 100 ml vannfritt THF som på forhånd var avgasset og som inneholdt 17,5 g kalium-t-butylat, tilsatt dråpevis til reaksjonsblandingen. Etter ytterligere 15 minutter ble en løsning av 50 ml vannfritt THF som på forhånd var avgasset og som inneholdt 12,27 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron (V) (27,63 mmol), tilsatt dråpevis til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 2 timer ved -80 °C. Etter dette tidsrom ble 48 ml trimetylborat (429,90 mmol) tilsatt dråpevis ved -80 °C til reaksjonsblandingen som ble inkubert ved 0 °C i 1 time. 100 ml 30% (vol/vol) vandig hydrogenperoksidløsning ble så tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur, hvoretter 500 ml vann ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med 10% (vekt/vol) vandig natriumtiosulfatløsning og med vann, tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (SiCVetylacetat:sykloheksan 1/9, så 2/8). 6,35 g 6a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron 4 (13,81 mmol, 50%) ble erholdt.

Eksempel 4

17- ketal- 3- tert.- butvldimetylsilvl- 6- dehvdroøstron ( VII)

En løsning av 40 ml toluen tilsatt 1,54 g 6a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron ( VI) (3,35 mmol), 4 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet til refluks ved dampdestillering ved anvendelse av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble så uthelt i 50 ml 10%

(vekt/vol) vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble avdekantert. Vannfasen ble så ekstrahert med etylacetat. De organiske fasene ble slått sammen og

inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 1,48 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6-dehydroøstron ( VID (3,35 mmol, 100%).

Eksempel 5

17- ketal- 3- tetr.- butvldimetvlsilyl- 6a, 7a- epoksvøstron ( VIII)

En løsning av 20 ml diklormetan tilsatt 1,16 g m-klorbenzosyre (55%, 3,69 mmol, 1,1 ekv.) ble tilsatt dråpevis ved 0 °C til en løsning av 20 ml diklormetan inneholdende 1,85 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6-dehydroøstron ( VII) (3,36 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsblandingen ble etter 2 timer uthelt i en 10% (vekt/vol) vandig natriumhydrogenkarbonatløsning og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 1/9). 769 mg 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6a,7a-epoksyøstron 6 (1,68 mmol, 50%) ble erholdt.

Eksempel 6

7a- hydroksy- l 7- ketal- 3- tetr.- burvldimerylsilyløstron ( IX)

200 mg litiumaluminiumhydrid (5,40 mmol, 2 ekv.) ble tilsatt til en løsning av 50 ml vannfritt THF tilsatt 1,13 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6a,7a-epoksyøstron 6 (2,60 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til refluks i 2 timer og så avkjølt, uthelt i is, filtrert gjennom en Celite-filterhjelp og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (SiCVetylacetatrsykloheksan 1/9). 8,37 mg 7a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron (IX) (1,82 mmol, 70%) ble erholdt.

Eksempel 7

7a- hydroksv- 17- ketaløstron ( X)

En løsning av 20 ml THF tilsatt 1,5 g tetrabutylammoniumklorid (4,78 mmol, 1,10 ekv.) ble ved romtemperatur tilsatt til en løsning av 50 ml THF tilsatt 2 g 7a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyløstron ( IX) (4,35 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsblandingen ble uthelt i 70 ml av en 10% (vekt/vol) vandig natriumkarbonat-løsning. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. 1,39 7a-hydroksy-17-ketaløstron (X) (4,22 mmol, 97%) ble erholdt.

Eksempel 8

7a- hydroksyøstron ( XI)

En løsning av 50 ml aceton tilsatt 1 ml vann, 1,0 g 7a-hydroksy-17-ketaløstron (X) (3,03 mmol) og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet til refluks i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble så uthelt i 70 ml 10% (vekt/vol) vandig natriumkarbonatløsning. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 814 mg 7a-hydroksyøstron ( XI) (2,85 mmol, 94%), som ble rekrystallisert fra etylacetat.

Eksempel 9

7- ketoøstron ( XII)

En 8 N løsning av kromsyre i svovelsyre ble dråpevis tilsatt til en løsning avkjølt til 0 °C med 40 ml aceton tilsatt 300 mg 7a-hydroksyøstron ( XI) (1,05 mmol) inntil gulfargen vedvarte. Reaksjonsblandingen ble uthelt i 50 ml vann og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med en vandig natriumkarbonatløsning og så tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 3/7). 200 mg 7-ketoøstron 10 (0,70 mmol, 67%) ble erholdt.

Eksempel 10

7- hvdroksv- 6- dehydroøstron- 3, 7- diacetat ( XIII)

En løsning med 10 ml eddiksyreanhydrid tilsatt 5 g vannfritt natriumacetat og 1 g 7-ketoøstron ( XII) (3,52 mmol) ble oppvarmet til refluks i 1 time. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt, uthelt i vann og ekstrahert med dietyleter. Den organiske fase ble vasket med en vandig natriumkarbonatløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 1/9). 1,25 g 7-hydroksy-6-dehydroøstron-3,7-diacetat ( XIII) (3,41 mmol, 97%) ble erholdt.

Eksempel 11

7- hydroksyøstron- 3, 7- diacetat ( XIV)

En løsning med 80 ml iseddik tilsatt 1,0 g 7-hydroksy-6-dehydroøstron-3,7-diacetat ( XIII) (2,72 mmol), ble hydrogenen med 200 mg 10% palladium på trekull-katalysator under et hydrogentrykk på 100 kPa. Reaksjonsblandingen ble filtrert etter 2 timer og inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 1/9). 855 mg 7-hydroksyøstron-3,7-diacetat ( XIV) (2,31 mmol, 85%) ble erholdt.

Eksempel 12

7f3- hydroksyøstron ( XV)

En løsning av 50 ml metanol tilsatt 1% kaliumhydroksid og 1 g 7-hydroksyøstron-3,7-diacetat 12 (2,70 mmol) ble oppvarmet til refluks i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt og nøytralisert og deretter ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 695 mg 7p-hydroksyøstron ( XV) (2,43 mmol, 90%) som ble rekrystallisert fra metanol.

Eksempel 13

7f3- hvdroksvøstradiol ( XVI)

264 mg natriumborhydrid (7,00 mmol, 2 ekv.) ble tilsatt til en løsning av 50 ml metanol inneholdende 1,0 g 7P-hydroksyøstron 13_ (3,50 mmol). Reaksjonsblandingen ble uthelt i vann og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 917 mg 7P-hydroksyøstradiol 14 (3,18 mmol, 91%) som ble rekrystallisert fra metanol.

Eksempel 14

DHEA- 3- acetat ( XVIII)

En løsning av 50 ml pyridin og 50 ml eddiksyreanhydrid tilsatt 10 g DHEA ( XVII) (34,72 mmol) ble oppvarmet til refluks i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, uthelt i vann og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 11,0 g DHEA-3-acetat ( XVIII) (33,33 mmol, 96%) som ble rekrystallisert fra etanol.

Eksempel 15

17- ketal- DHEA- 3- acetat ( XIX)

En løsning av 100 ml toluen tilsatt 5 g DHEA-3-acetat ( XVIII) (15,15 mmol), 5 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet til refluks ved dampdestillering og anvendelse av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble uthelt i 100 ml 10% (vekt/vol) vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble avdekantert. Vannfasen ble ekstrahert med etylacetat. De organiske faser ble slått sammen og inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 5,10 g 17-ketal-3-DHEA-acetat ( XIX) (13,64 mmol, 90%) som ble rekrystallisert fra etanol.

Eksempel 16

7- keto- 17- ketal- DHEA- 3- acetat ( XX)

En løsning av 70 ml pyridin tilsatt 5 g 17-ketal-DHEA-3-acetat ( XIX)

(13,37 mmol) og en katalytisk mengde Bengal-rosa ble bestrålt ved anvendelse av en kvikksølvdamplampe med middels trykk under gjennombobling av oksygen. En katalytisk mengde kobberacetat ble tilsatt til reaksjonsblandingen etter 24 timer. Etter 24 timer ble reaksjonsblandingen inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 3/7). 3,11 g 7-keto-17-ketal-DHEA-3-acetat ( XX) (8,02 mmol, 60%) ble erholdt.

Eksempel 17

7- keto- 17- ketal- DHEA ( XXI)

En løsning av 50 ml metanol tilsatt 1% kaliumhydroksid og 1 g 7-keto-17-ketal-DHEA-3-acetat ( XX) (2,58 mmol) ble oppvarmet til refluks i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt og nøytralisert og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 802 mg 7-keto-17-ketal-DHEA 5 (2,32 mmol, 90%) som ble rekrystallisert fra metanol.

Eksempel 18

7- hvdroksv- 17- ketal- EPIA ( XXII)

10 g 7-keto-17-ketal-DHEA ( XXI) (28,90 mmol) ble tilsatt til en flytende ammoniakkløsning ved -33 °C tilsatt 2,65 g natrium. Etter 4 timer ble ammoniumklorid tilsatt inntil blåfargen forsvant. 2,65 g natrium ble så tilsatt. Etter 4 timer ble ammoniumklorid igjen tilsatt inntil blåfargen forsvant. Vann ble tilsatt og ammoniakken avdampet. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Det ble erholdt 6,07 g 7-hydroksy-17-ketal-EPIA ( XXII) (17,34 mmol, 60%).

Eksempel 19

7- hvdroksv- EPIA ( XXIII)

En løsning av 100 ml aceton tilsatt 5 ml vann, 10 g 7-hydroksy-17-ketal-EPIA ( XXII) (28,57 mmol, 50%) og en katalytisk mengde para-toluensulfonsyre ble oppvarmet til refluks i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, uthelt i 100 ml 10%

(vekt/vol) vandig natriumkarbonatløsning og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og så inndampet til tørrhet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat). 5,24 g 7-hydroksy-EPIA ( XXIII) (17,14 mmol, 60%) ble erholdt.

Eksempel 20

7a- hvdroksv- EPIA ( XXIV) & 7B- hvdroksv- EPIA ( XXV)

7-hydroksy-EPIA ( XXIII) (5 g) inneholdende 7a- og 7p-epimerer i forholdet 65/35 ble renset ved flashkromatografi (A1203/CHC13). 7p-hydroksy-EPIA ( XXV) (2,5 g) ble erholdt først, før 7a-hydroksy-EPIA ( XXIV) (1,34 g). 7p-hydroksy-EPIA ( XXV) og 7a-hydroksy-EPIA ( XXIV) ble rekrystallisert fra etylacetat.

Eksempel 21

Fremgangsmåte for undersøkelse av hvpoksisk neuronskade

Organotypiske snittkulturer fra hippocampus ble fremstilt ved anvendelse av den basale fremgangsmåte til Pringle et al. (1996,1997), modifisert som følger: Wistar-rotteunger (8-11 dager gamle) ble dekapitert og hippocampus hurtig dissekert i iskald Geys balanserte saltløsning tilsatt 4,5 mg/ml glukose. Snittene ble separert og utsådd i Millicell CM-dyrkningsinnsater (4 pr. brønn) og inkubert ved 37 °C/5% CO2i 14 dager. Vedlikeholdsmediet besto av 25% varmeinaktivert hesteserum, 25% Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og 50% minimalt essensielt medium tilsatt Earles salter (MEM), tilsatt 1 mM glutamin og 4,5 mg/ml glukose. Mediet ble skiftet hver 3. til hver 4. dag.

Eksperimentell hypoksi ble utført som beskrevet tidligere (Pringle et al., 1996, 1997). Kort beskrevet ble kulturene overført til serumfritt medium (SFM - 75% MEM, 25% HBSS tilsatt 1 mM glutamin og 4,5 mg/ml glukose) inneholdende 5 ug/ml av det fluorescerende eksklusjonsfargestoff propidiumjodid (PI). Kulturene ble ekvilibrert i SFM i 60 minutter før bildedannelsen. PI-fluorescens ble påvist ved anvendelse av et invertert Leica-mikroskop utstyrt med et rhodamin filtersett. Kulturer hvori PI-fluorescens ble påvist på dette stadium, ble ikke undersøkt videre. Hypoksi ble indusert ved å overføre kulturene til SFM (+PI) som var mettet med 95% N2/5% C02. Dyrkningsskålene (uten lokk) ble så forseglet i et lufttett kammer hvori atmosfæren var mettet med 95% N2/5% C02 ved kontinuerlig gjennomblåsing av gass ved 10 l/min i 10 minutter før forseglingen og plassert i inkubatoren i 170 minutter (den totale hypoksitid var derfor 180 minutter). Etter dette tidsrom med hypoksi ble kulturene overført til normoksisk SFM tilsatt PI og plassert i inkubatoren i ytterligere 24 timer.

Neuronskade ble anslått som beskrevet tidligere (Pringle et al., 1996, 1997) ved anvendelse av enten NIH Image 1.60 og en Apple Ilsi-datamaskin eller OpenLab 2.1 (Improvision) og en Macintosh G4/400. Bilder ble innfanget ved anvendelse av et monokromt kamera og lagret i et optisk platelager for senere analyse. Lystransmisjonsbilder ble innfanget før tilsetning av medikamenter og PI-fluorescensbilder tatt opp etter gjenvinningstiden på 24 timer etter hypoksien. Arealet av CAl-cellelaget ble bestemt ut fra transmisjonsbildet. Arealet med PI-fluorescens i CA1 ble målt ved å anvende tetthetssnittfunksjonen i NIH Image eller OpenLab, og neuronskaden ble uttrykt som den prosent av CA1 hvori PI-fluorescens ble påvist over bakgrunnsnivået.

Steroidforbindelser ble fremstilt ved å lage en utgangsløsning med 1 mg/ml i etanol og videre fortynning i SFM. Forbindelsene ble tilsatt til kulturene i 45 minutter før hypoksien, under hypoksien og under den posthypoksiske gjenvinningstid. Kontrolleksperimentene besto av kulturer som kun ble behandlet med bærerstoff.

Resultater

Eksperiment 1:

Et innledende eksperiment ble utført for å fastslå hvorvidt 7aOH-EPIA og 7POH-EPIA var neurobeskyttende ved en høy konsentrasjon på 100 nM. Hypoksien ga en lesjon i 25,5±6,4% av CAL Denne skaden ble signifikant redusert av både 7aOH-EPIA og 7POH-EPIA når disse forelå før, under og etter hypoksien (se tabell I).

Eksperiment 2:

Etter å ha fastslått at både a- og P-isomerer av 70H-EPIA var neurobeskyttende, anslo vi konsentrasjonsavhengigheten av denne virkningen. Kontrollhypoksi førte til neuronskade i 31,9±4,7% av CAL 7pOH-EPIA var signifikant neurobeskyttende ved 10 nM og 100 nM, men aktiviteten forsvant dersom konsentrasjonen ble redusert til 1 nM, som vist i tabell II nedenfor.

Eksperiment 3:

Etter å ha observert den neurobeskyttende aktivitet av 7pOH-EPIA undersøkte vi hvorvidt 7POH-DHEA var neurobeskyttende. Kulturer ble inkubert med enten 100 nM 7POH-DHEA eller med bærerstoff før, under og etter hypoksien. Hypoksi ga skade i 29,0±6,2% av CAL I kulturer behandlet med 7pOH-DHEA ble en kraftig, svært signifikant reduksjon av neuronskaden observert, som vist i tabell III nedenfor.

Eksempel 22

Global, cerebral iskemi hos rotter ( okklusjon av 4 kar)

Cerebral iskemi ble indusert ved okklusjon av 4 kar (4 VO) i Wistar-hannrotter (250-280 g). Begge de vertebrale arterier ble okkludert ved elektrokauterisering under pentobarbitalbedøvelse (60 mg/kg intraperitonealt). Dyrene fikk gjenvinne seg i 24 timer med fri tilgang på vann, men uten for. Neste dag ble halsarteriene eksponert under bedøvelse med 2% halotan i 30% oksygen/70% dinitrogenoksid og okkludert i 10 minutter ved anvendelse av mikrovaskulære klyper. Deretter ble de to klypene fjernet, og begge arterier ble inspisert for umiddelbar reperfusjon. Under operasjonen og i de påfølgende 3 timer ble normal temperatur i dyrene (37,5±0,5 °C) opprettholdt ved anvendelse av et termostatkontrollert varmeteppe koblet til et rektalt termometer. Som kontroll ble de to vertebralarteriene kauterisert hos narreopererte dyr under pentobarbitalbedøvelse, og de to halsarteriene ble eksponert, men ikke sammenklemt, under bedøvelse med 2% halotan i 30% oksygen/70% dinitrogenoksid neste dag. Såret ble behandlet med lidokaingel og så gjensydd. Dyrene ble holdt ved en temperatur i omgivelsene på 30 °C under en varme-lampe inntil de ble bevisste.

7 dyregrupper ble undersøkt:

1. (n=8) steroidforbindelse: 7P-OH EPIA (0,1 mg/kg, i.v., via halevenen, tre injeksjoner: 15 minutter før induksjon av iskemi, under iskemien og 5

minutter etter reperfusjon),

2. (n=8) steroidforbindelse: 7P-OH EPIA (0,3 mg/kg, i.v., tre injeksjoner som beskrevet i 1.), 3. (n=8) steroidforbindelse: 7P-OH EPIA (1 mg/kg, i.v., tre injeksjoner som beskrevet i 1.), 4. (n=8) NBQX (dinatriumsaltet siden dette er mer vannløselig) som referanseforbindelse og positiv kontroll (TOCRIS, Tyskland, 30 mg/kg,

i.p., tre injeksjoner som beskrevet i 1.),

5. (n=8) ble tilført bærerstoff (0,9% NaCl tilsatt 100 ul etanol), tre injeksjoner som beskrevet i 1.),

6. (n=8) kun iskemi,

7. (n=8) narreopererte kontrolldyr.

NBQX er 2,3-dihydroksy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)kinoksalin og vites å ha neurobeskyttende aktivitet [Gill, R., Nordholm, L., Lodge D.: The neuroprotective action of 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline (NBQX) in a rat focal ischaemia model. Brain Res. 580, 35-43,1992].

7P-OH EPIA er 7P-hydroksyepiandrosteron, en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsene ble løst i 100 (xl etanol og så fortynnet med 0,9% NaCl.

Etter en overlevelsestid på 7 dager etter iskemien ble alle dyr perfusjonsfiksert transkardialt med 4% paraformaldehyd. Hjernene ble så forsiktig tatt ut og postfiksert i samme fikseringsmiddel i 2 timer. Etter kryobeskyttelse i 30% sukrose ble hjernene hurtig nedfrosset i isopentan og lagret ved -80 °C. Kryostatsnitt på 20 mikrometer som omfattet hippocampusstrukturen, ble Nissl-farget med toluidinblått eller Neuro Trace-fluorescens.

Dataanalyse:

Omfanget av neuronskade i CAl-området i hippocampus etter iskemi ble evaluert som antall overlevende neuroner ved anvendelse av Nissl-farging. Det gjennomsnittlige antall morfologisk intakte neuroner pr. 400 um lengde ble beregnet i CA1-området for hver gruppe. Celletellingen ble utført i 3-5 seriesnitt pr. dyr og 6 ganger 400 um CA 1-område pr. snitt ved anvendelse av et lysmikroskop utstyrt med et 20 x objektiv. Resultatene ble analysert statistisk ved en paret Students t-test. Resultatene ble presentert som middelverdi ± SEM.

Resultater og diskusjon

Resultatene vises i figurene 1 til 3 i de vedlagte figurer.

Morfologisk intakte neuroner fra C Al-området i hippocampus blekarakterisert vedNissl-farging (toluidinblått og Neuro Trace, fig. 2) ut fra følgende kriterier: klar form av et neuronalt perikarya, stor kjerne med positivt farget nukleolus, en liten cytoplasmatisk sone rundt kjernen med positiv Nissl-farging, som viser intakt, ru, endoplasmatisk retikulum med ribosomer og følgelig intakt

proteinsyntesemaskineri.

10 minutter med global iskemi (mild iskemi) og en overlevelsestid på 7 dager fører til neurodegenerering av pyramideceller selektivt i CA 1-området i hippocampus (fig. 1A-1C). Det gjennomsnittlige antall pyramideceller i CA1 hos narreopererte dyr var 121,5±4,3 (satt til 100%). Følgelig døde 60% av CA1-neuronene etter 10 minutter med global iskemi (fig. IB). Antall neuroner i dyregruppen med iskemi og intravenøs injeksjon av bærerstoff (NaCl pluss 100 ul etanol) tilført som beskrevet i eksperimentet, var sammenlignbart med antallet i gruppen med iskemi alene (fig. IA, IB). NBQX (30 mg/kg, i.v., tre injeksjoner som beskrevet i eksperimentet) viste signifikant (p=0,03) neurobeskyttelse av CA 1-pyramideceller sammenlignet med iskemigruppen. Sammenlignet med iskemi alene, fører NBQX til 47,5% neurobeskyttelse, mens den beskyttende virkning sammenlignet med de narreopererte dyr, var 68,5%. Neurobeskyttelsen som oppnås med NBQX, var i samsvar med Gill et al., 1992 og Gill 1994, noe som viser gyldigheten av den globale iskemimodell vi benyttet i våre eksperimenter. 7P-OH EPIA fører til en konsen-trasjonsavhengig neurobeskyttelse av pyramideceller i CA1-området i hippocampus etter 10 minutter med global iskemi og en overlevelsestid på 7 dager (fig. IA). T-testanalyse viste en svært signifikant neurobeskyttende virkning av 7P-OH EPIA i konsentrasjoner på 0,1 mg/kg (p=0,01) og 0,3 mg/kg (p=0,0008). Sammenlignet med den narreopererte gruppen viste 7P-OH EPIA en neurobeskyttende virkning på 74,8%

(0,1 mg/kg) og 83,9% (0,3 mg/kg) på CA1-pyramideceller (fig. 1C). 7p-OH EPIA i en konsentrasjon på 1,0 mg/kg viste bare en tendens til neurobeskyttelse, men virkningen var ikke signifikant.

I ingen av eksperimentene hvor 7P-OH EPIA ble injisert intravenøst før, under og etter iskemien, observerte vi atferdsmessige unormaliteter hos dyrene.

Figurtekster:

Antall morfologisk intakte pyramideceller i CA 1-området av hippocampus hos rotter 7 dager etter global, cerebral iskemi og under påvirkning av forskjellige forbindelser. Fig. IA: Resultatene gis som gjennomsnittsantall ± SEM intakte neuroner pr. 400 um lengde av CA 1-området. Fig. IB: Resultatene uttrykkes som prosent intakte neuroner pr. 400 um lengde av CA1-området sammenlignet med narreopererte dyr satt til 100%. Fig. 1C: Resultatene gis som den absolutte prosent neurobeskyttelse hvor antall overlevende neuroner i iskemigruppen ble satt til null og antall overlevende neuroner i den narreopererte gruppe til 100%.

Claims (9)

1. Anvendelse av et 7P-hydroksysteroid eller en farmasøytisk aksepterbar ester eller et annet derivat derav for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot neuronskade, hvor steroidet er en forbindelse med formel (I) eller (II):

hvor R<1>og R<2>uavhengig av hverandre står for et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, en alkenylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, en alkynylgruppe med fra 2 til 6 karbonatomer, en arylgruppe med fra 6 til 10 karbonatomer, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe med fra 2 til 7 karbonatomer, en alkenylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, en alkynylkarbonylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe med fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe med fra 8 til 15 karbonatomer, en aralkenylkarbonylgruppe med fra 9 til 15 karbonatomer eller en heterosyklisk gruppe-karbonylgruppe som definert nedenfor, én av Ra og R<b>står for en hydroksygruppe fortrinnsvis i P-konfigurasjon, og den andre står for et hydrogenatom, eller Ra og R<b>sammen står for en oksogruppe, ringen A,

er en benzenring eller sykloheksanring, dersom ring A er en sykloheksanring, den prikkede linje i ring B står for en enkelt eller dobbelt karbon-karbonbinding og n er 1, eller dersom ring A er en benzenring, den prikkede linje i ring B står for en enkelt karbon-karbonbinding og n er 0, den heterosykliske gruppe-karbonylgruppen er en gruppe med formel R<3->CO, hvori R<3>står for en heterosyklisk gruppe med fra 3 til 7 ringatomer av hvilke fra 1 til 3 er heteroatomer utvalgt blant nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det eller de gjenværende atomer, av hvilke det minst er ett, er karbonatomer, hvor alkylgruppen, alkenylgruppen og alkynylgruppen samt alkyl-, alkenyl- og alkynyldelen av alkylkarbonylgruppen, alkenylkarbonylgruppen og alkynylkarbonylgruppen er usubstituert eller har minst én av følgende substituenter\|/: substituenter \|/: hydroksygrupper, merkaptogrupper, halogenatomer, aminogrupper, alkylaminogrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, dialkylaminogrupper hvori hver alkylgruppe har fra 1 til 6 karbonatomer, karbamoylgrupper, nitrogrupper, alkoksygrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, alkyltiogrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, karboksygrupper, alkoksykarbonylgrupper og usubstituerte arylgrupper med fra 6 til 10 karbonatomer, hvor arylgruppene, de heterosykliske gruppene og aryldelen av arylkarbonylgruppene og aralkylkarbonylgruppene er usubstituert eller har minst én av følgende substituenter & substituenter enhver av substituentene\|/og alkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, hydroksyalkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer og haloalkylgrupper med fra 1 til 6 karbonatomer, eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller en ester derav.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor: R1 og R<2>uavhengig av hverandre står for et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 karbonatomer, en eventuelt substituert fenylgruppe, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe med fra 2 til 5 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe med fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe med fra 8 til 15 karbonatomer eller en heterosyklisk gruppe-karbonylgruppe som definert nedenfor, én av Ra og R<b>står for en hydroksygruppe i Ø-konfigurasjon, og den andre står for et hydrogenatom, eller Ra og R<b>sammen står for en oksogruppe, hvor den heterosykliske gruppe-karbonylgruppen er en gruppe med formel R<3->CO, hvori R<3>står for en heterosyklisk gruppe med fra 3 til 7 ringatomer av hvilke 1 til 3 er heteroatomer utvalgt blant nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det eller de gjenværende atomer, av hvilke det minst er ett, er karbonatomer.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7p-hydroksy-dehydroepiandrosteron.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7P-hydroksy-17P-østradiol.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7P-hydroksyøstron.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor neuronskaden er forårsaket av en kronisk forstyrrelse.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor den kroniske forstyrrelsen er Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom eller kognitiv forstyrrelse uten demens.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor neuronskaden er forårsaket av en akutt forstyrrelse.

9. Anvendelse ifølge krav 10, hvor den akutte forstyrrelsen er forårsaket av slag, hjernetraume, ryggmargsskade eller perifer nerveskade.