ES2227845T3

ES2227845T3 - Composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa.

Info

Publication number: ES2227845T3
Application number: ES98928964T
Authority: ES
Inventors: Jean-Luc Philippe Bettiol; Michael Stanford Showell
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2018-06-10
Also published as: JP2001515130A; MXPA00001618A; JP2001515126A; KR20010022908A; DE69810309T2; BR9811192A; CA2301167A1; CN1276826A; BR9811186A; MXPA00001613A; DE69835214D1; ATE276344T1; HUP0003670A3; CA2300696A1; CN1306566A; JP4090690B2; DE69835214T2; EP1009794A1; EP1036151A1; JP2001515129A

Abstract

Una composición detergente que comprende un ingrediente detergente, una enzima mananasa a un nivel del 0, 0001% al 0, 1% de enzima pura en peso de la composición total y una enzima proteasa.

Description

Composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa.

Antecedentes de la invención

El rendimiento de un detergente se juzga teniendo en cuenta una serie de factores, como la capacidad para eliminar manchas y la capacidad para evitar la redeposición de las manchas o de los productos de degradación de las manchas en los artículos para lavar. Por esta razón, las composiciones detergentes incluyen en la actualidad una compleja combinación de ingredientes activos que cumplen ciertas demandas específicas. En particular, las actuales formulaciones detergentes generalmente incluyen enzimas detergentes que proporcionan ventajas de limpieza y cuidado de los tejidos.

Las manchas y la suciedad de alimentos y cosméticos constituyen la mayor parte de las manchas/suciedad relevantes para el consumidor y a menudo comprenden aditivos alimentarios tales como espesantes o estabilizantes. De hecho, las gomas hidrocoloides y los emulsionantes son aditivos alimentarios de uso habitual. El término "goma" significa un grupo de polisacáridos útiles para la industria (polímero de cadena larga) o sus derivados que se hidratan en agua caliente o fría para dar soluciones viscosas, dispersiones o geles. Las gomas se clasifican en naturales y modificadas. Las gomas naturales incluyen extractos de algas, extruídos vegetales, gomas de semilla o raíz y gomas obtenidas por fermentación microbiana. Las gomas modificadas (semisintéticas) incluyen derivados de la celulosa y el almidón y ciertas gomas sintéticas tales como la pectina con bajo contenido de metoxil, el propilenglicol alginato y la goma guar de carboximetilo e hidropropilo (gomas en la Encyclopedia Chemical Technology, 4ª ed. Vol. 12, pp 842-862, J. Baird, división Kelco de Merck). Véase también Carbohydrate Chemistry for Food Scientists (Eagan Press - 1997) por R. L. Whistler y J.N. BeMiller, cap. 4, pp 63-89 y "Direct Food Additives in Fruit Processing" por P. Laslo, Bioprinciples and Applications, cap. II, pp 313-325 (1996) Technomie publishing. Algunas de estas gomas, como la goma guar (E412) o de algarroba (E410), se utilizan ampliamente solas o combinadas en numerosas aplicaciones alimentarias ("Gums in ECT" 4ª ed., Vol. 12 págs. 842-862, J. Baird, división Kelco de
Merck).

La goma guar de estas manchas de alimentos y productos cosméticos procede del endosperma de la semilla de la planta leguminosa Cyamopsis tetragonoloba. La goma guar (también denominada guaraná) extraída de la semilla dicotiledónea se compone de una cadena principal con una unidad 1-4, \beta-D-manopiranosil y se utiliza como agente espesante en productos para aderezo, congelados y cosméticos (H.-D. Belitz, Food Chemistry pág. 243, versión inglesa de la segunda edición, Springer Verlag, 1987, ISBN 0-387-15043-9 (US)), (Carbohydrate Chemistry for Food Scientists, R.L. Wilstler, Eagan Press, 1997, ISBN 0-913250-92-9) e (Industrial Gum, segunda edición, R.L. Whistler pág. 308, Academic Press, 1973, ISBN, 0-12-74-6252-x). La goma de algarroba (también denominada pan de San Juan Bautista) se utiliza asimismo en la industria alimentaria y se extrae de la semilla de un árbol de hoja perenne que se cultiva en la zona mediterránea. La goma de algarroba probablemente difiere de la estructura de la goma guar solamente en un número menor de cadenas laterales de D-galactosilo y tienen la misma cadena principal de 1-4, \beta-D-manopiranosilo. En las semillas leguminosas, la galactomanano hidrosoluble es el principal carbohidrato de almacenamiento y comprende hasta un 20% del peso total seco en algunos casos. La galactomanano tiene una \alpha-galactosa unida a residuos O-6 de manosa y también puede ser acetilada en diferentes grados en el O-2 y O-3 de los residuos de manosa.

Desde hace tiempo se sabe que las enzimas proteasa en las composiciones detergentes permiten eliminar los restos proteináceos de alimentos en las vajillas y superficies rígidas o proporcionan una acción limpiadora de manchas proteináceas así como de otras manchas que se encuentran de forma típica en las aplicaciones de lavado.

Sin embargo, existe una demanda continua de formulaciones de composiciones detergentes con una mayor capacidad limpiadora, especialmente de manchas incrustadas que se encuentran de forma típica en prendas de vestir con una prolongada historia de uso. Este objetivo se ha conseguido formulando composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa.

Se ha descubierto de forma sorprendente que estas composiciones enzimáticas proporcionan una mayor capacidad de limpieza debido al efecto sinérgico del sistema enzimático mixto, es decir, una mayor eliminación de manchas, especialmente de manchas incrustadas que se encuentran de forma típica en las prendas de vestir con una historia prolongada de uso.

También se ha descubierto que el rendimiento de las composiciones detergentes de la presente invención se ve mejorado por la adición de tensioactivos seleccionados, un aditivo reforzante de la detergencia y/o un sistema blanqueante.

Se han identificado mananasas en diferentes microorganismos Bacillus. Por ejemplo, Talbot y col., Appl. Environ. Microbiol., vol. 56, No. 11, pp. 3505-3510 (1990) describen una \beta-mananasa derivada de Bacillus stearotermophilus en forma dímera con un PM de 162 kDa y un pH óptimo de 5,5-7,5. Mendoza y col., World J. Micobio. Boitech., vol. 10, no. 5, pp. 551-555 (1994) describen una \beta-mananasa derivada de Bacillus subtilisis que tiene un PM de 38 kDa, una actividad óptima a pH 5,0 / 55ºC y un pI de 4,8. En JP0304706 se describe una \beta-mananasa derivada de Bacillus sp. que tiene un PM de 37+/- 3 kDa medido por filtración en gel, un pH óptimo de 8-10 y un pI de 5,3-5,4. En JP63056289 se describe la producción de una \beta-mannase alcalina termoestable que hidroliza enlaces \beta-1,4-D-manopiranósido de p. ej., mananos para obtener mano:oligo:sacáridos. La JP63036774 se refiere a un microorganismo Bacillus FERM P-8856 que produce \beta-mananasa y -manosidasa a un pH alcalino. Una mananasa purificada de Bacillus amiloliquefaciens y su método de preparación de uso para el blanqueado de pasta y papel se describe en WO97/11164. En WO91/18974 se describe una hemicelulasa como la glucanasa, xilanasa o mananasa, activas a pH y temperatura extremos así como la producción de las mismas. En WO94/25576 se describe una enzima que presenta una actividad mananasa derivada de Aspergillus aculeatus CBS 101.43 que pueden utilizarse para diferentes fines para los que se desea una degradación o modificación de la pared celular de plantas o algas. En WO93/24622 se describe una mananasa aislada de Trichoderma reesie para el blanqueado de pastas lignocelulósicas.

En WO95/35362 se describen composiciones limpiadoras que comprenden enzimas de degradación de la pared celular vegetal tales como pectin-esterasas, pectin-liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, ramnogalacturonasa, xilanasa, arabinofuranidasa, acetilxilan esterasa, glucuronidasa, ferúlico esterasa, cumárico esterasa, galactanasa, mananasa, liquenasa y arabinanasa. En WO96/36569 se describen composiciones para prevenir y/o eliminar películas biológicas en superficies que comprenden al menos una mananasa, opcionalmente junto con al menos una enzima del grupo que consta de carbohidrasas, proteasas, lipasas y/o glicoproteasa. La EP 755 999 se refiere a composiciones detergentes que comprenden una amilasa específica y una proteasa. La EP 709 452 se refiere a composiciones limpiadoras que comprenden una xilanasa. La WO96/16154 se refiere a composiciones detergentes que contienen lipasa y proteasa. Las composiciones detergentes descritas en 3 referencias también pueden comprender otros muchos ingredientes opcionales incluidas otras enzimas detergentes. Aproximadamente 23 enzimas diferentes se encuentran listadas como otras enzimas también adecuadas, incluida la hemicelulasa.

Sin embargo, nunca antes se había reconocido la combinación sinérgica de una mananasa y una proteasa para mejorar el rendimiento de limpieza en una composición detergente.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa para conseguir una mayor capacidad limpiadora.

Descripción detallada de la invención

Un elemento esencial de la composición detergente de la presente invención es una enzima mananasa. La mananasa proporciona ventajas considerables de eliminación de manchas en aquellas manchas que contienen goma hidrocoloide tales como la goma guar utilizada como aditivo alimentario. El segundo elemento esencial de la presente invención es una enzima proteasa. La proteasa es conocida por su capacidad para eliminar manchas proteináceas.

Aún no habiéndose comprobado teóricamente, se cree que las manchas que contienen proteína tales como las manchas de chocolate de alimentos, manchas de pudding de chocolate y/o manchas de productos cosméticos pueden también contener aditivos tales como gomas hidrocoloides. Estas gomas hidrocoloides son, por ejemplo, la goma guar o la goma de algarroba. Cuando estas manchas están presentes, se ha descubierto que el uso de proteasas no es suficientemente eficaz para proporcionar unas ventajas considerables de eficacia limpiadora. De forma similar, el uso de solamente mananasa no es suficiente para proporcionar ventajas considerables de rendimiento. De hecho, se cree que la combinación de la proteína y la goma hidrocoloide en las composiciones alimentarias es muy viscosa y es menos sensible a la acción enzimática.

Especialmente en el campo de los detergentes para lavado es bien sabido que la encrustación de manchas se produce en artículos en uso tales como almohadas, paños de cocina y camisetas. Se cree que estas manchas son difíciles de eliminar por la presencia de productos proteináceos adhesivos de la piel y por la presencia de gomas hidrocoloides, hemicelulosa y productos derivados presentes en la superficie del tejido que adhieren las manchas. Estas gomas hidrocoloides, hemicelulosa y productos derivados pueden proceder del tejido o de las manchas. Se cree que la combinación de proteína y goma hidrocoloide resulta muy viscosa y se adhiere al tejido por lo que resulta menos sensible a la acción enzimática.

Se ha descubierto de forma sorprendente que la combinación de una mananasa con una proteasa, preferentemente con la proteasa subtilisina para lavado, proporciona considerables ventajas en cuanto a eficacia limpiadora.

Además, el uso combinado de la enzima mananasa con la enzima proteasa proporciona una mejor limpieza, especialmente de manchas de alimentos y cosméticos en las superficies rígidas tales como las de vajillas o cualquier otra superficie rígida de cocina.

También se sabe que los tejidos de algodón pueden contener porciones manosa dentro de las fibras de celulosa. Estas porciones de manosa pueden adherir otras manchas tales como la suciedad del cuerpo a los tejidos de algodón. Se ha descubierto de forma sorprendente que el uso combinado de las enzimas mananasa y proteasa proporciona una eficacia de limpieza considerable también de estas manchas corporales, especialmente a baja temperatura.

La enzima mananasa

Un elemento fundamental de las composiciones detergentes de la presente invención es una enzima mananasa.

La presente invención abarca las tres siguientes enzimas de degradación de la mananasa: la EC 3.2.1.25 \beta-manosidasa, la EC 3.2.1.78 endo-1,4-\beta-manosidasa, en adelante "mananasa", y la EC 3.2.1.100 1,4-\beta-manobiosidasa (clasificación IUPAC- Nomenclatura de enzimas, 1992 ISBN 0-12-227165-3 Academic Press).

Más preferiblemente, las composiciones detergentes de la presente invención comprenden una \beta-1,4-manosidasa (EC 3.2.1.78), en adelante "mananasa". El término "mananasa" o "galactomananasa" significa una enzima mananasa definida de acuerdo con la técnica cuya denominación oficial es manano-endo-1,4-beta-manosidasa, que tiene los nombres alternativos de beta-mananasa y endo-1,4-mananasa y que cataliza la reacción: hidrólisis aleatoria de uniones 1,4-beta-D-manosídicas en mananos, galactomananos, glucomananos y galactoglucomananos.

En particular, las mananasas (EC 3.2.1.78) constituyen un grupo de polisacarasas que degradan los mananos y representan enzimas que son capaces de escindir cadenas poliosa que contienen unidades manosa, es decir, son capaces de escindir enlaces glicosídicos en mananos, glucomananos, galactomananos y galactoglucomananos. Los mananos son polisacáridos que tienen una cadena principal compuesta por \beta-1,4-manosa unida; los glucomananos son polisacáridos que tienen una cadena principal en donde se alternan de forma más o menos regular \beta-1,4-manosa unida y glucosa; y los galactomananos y los galactoglucomananos son mananos y glucomananos con ramificaciones laterales de \alpha-1,6-galactosa unida. Estos compuestos pueden ser acetilados.

La degradación de los galactomananos y los galactoglucomananos se ve facilitada por una eliminación total o parcial de las ramificaciones laterales de la galactosa. También la degradación de los mananos, glucomananos, galactomananos y galactogluco-mananos acetilados se ve facilitada por la desacetilación total o parcial. Los grupos acetilo pueden ser eliminados por álcalis o por manano acetilesterasas. Los oligómeros que son liberados de las mananasas o por una combinación de mananasas y \alpha-galactosidasa y/o manano acetil esterasas también pueden degradarse para liberar maltosa libre por la acción de la \beta-manosidasa y/o \beta-glucosidasa.

Las mananasas han sido identificadas en diferentes microorganismos Bacillus. Por ejemplo, Talbot y col., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 56, No. 11, pp. 3505-3510 (1990) describen una beta-mananasa derivada del Bacillus stearotermophilus en forma dímera que tiene un peso molecular de 162 kDa y un pH óptimo de 5,5-7,5. Mendoza y col., World J. Microbiol. Biotech., Vol. 10, núm. 5, pág. 551-555 (1994) describen una beta-mananasa derivada del Bacillus subtilis que tiene un peso molecular de 38 kDa, una actividad óptima a pH 5,0 y 55ºC y un pI de 4,8. En JP-0304706 se describe una beta-mananasa derivada del Bacillus sp., que tiene un peso molecular de 37\pm 3 kDa medido por filtración en gel, un pH óptimo de 8-10 y un pI de 5,3-5,4. En JP-63056289 se describe la producción de una beta-mananasa alcalina termoestable que hidroliza los enlaces beta-1,4-D-manopiranósido de, p. ej., mananos para formar mano-oligosacáridos. JP-63036774 se refiere al microorganismo Bacillus FERM P-8856 que produce beta-mananosa y beta-manosidasa a pH alcalino. En JP-08051975 se describen beta-mananasas alcalinas del Bacillus sp.AM-001 alcalófilo. Una mananasa purificada de Bacillus amiloliquefaciens útil para el blanqueado de pasta y papel y un método de preparación de la misma se describe en WO 97/11164. En WO 91/18974 se describe una hemicelulasa como una glucanasa, xilanasa o mananasa activa a un pH y una temperatura extremos. En WO 94/25576 se describe una enzima de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, que presenta actividad mananasa y puede ser útil para la degradación o modificación de la pared celular de plantas o algas. En WO 93/24622 se describe una mananasa aislada de Trichoderma reseei útil para el blanqueado de pastas lignocelulósicas. Una hemicelulasa capaz de degradar una hemicelulosa que contienen manano se describe en WO91/18974 y una mananasa purificada de Bacillus amiloliquefaciens se describe en WO97/11164.

En particular, esta enzima mananasa será una mananasa alcalina como se define más adelante, con máxima preferencia una mananasa procedente de una fuente bacteriana. Especialmente, la composición detergente de la presente invención comprenderá una mananasa alcalina seleccionada de la mananasa de la cepa Bacillus agaradherens y/o de la cepa Bacillus subtilisis 168, gen yght.

El término "enzima mananasa alcalina" significa que comprende las enzimas con una actividad enzimática de al menos un 10%, preferiblemente de al menos un 25%, más preferiblemente de al menos un 40%, de su actividad máxima a un determinado pH de 7 a 12, preferiblemente de 7,5 a 10,5.

Con máxima preferencia, la composición detergente de la presente invención comprenderá la mananasa alcalina de Bacillus agaradherens. Dicha mananasa es:

i): un polipéptido producido por Bacillus agaradherens, NCIMB 40482, o

ii): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las posiciones 32-343 de SEC.2, o

iii): un análogo del polipéptido definido en i) o ii) que es al menos un 70% homólogo con dicho polipéptido, o se deriva de dicho polipéptido por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, o es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo policlonal dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada.

La presente invención también abarca un polipéptido aislado con actividad mananasa seleccionado del grupo que consta de:

(a): moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido con actividad mananasa y que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC. 1 del nucleótido 97 al nucleótido 1029;

(b): especies homólogas de (a);

(c): moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido con actividad mananasa que es idéntico al menos en un 70% a la secuencia de aminoácidos de SEC. 2 desde el residuo de aminoácido 32 al residuo de aminoácido 343;

(d): moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y

(e): secuencias degeneradas de los nucleótidos de (a), (b), (c) o (d).

El plásmido pSJ1678 que comprende la molécula de polinucleótido (la secuencia de ADN) que codifica una mananasa de la presente invención ha sido transformado en una cepa de Escherichia coli que ha sido depositada por los inventores, de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes, en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, el 18 de mayo de 1998 con el número de depósito DSM 12180.

Una segunda enzima muy preferida es la mananasa de la cepa 168 de Bacillus subtilisis, en donde la mananasa:

i): está codificada por la parte codificante de la secuencia de ADN que se muestra en la SEC. 5 o un análogo de dicha secuencia, y/o

ii): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos según SEC.6, o

iii): un análogo del polipéptido definido en ii) que es homólogo al menos en un 70% a dicho polipéptido, o está derivado de dicho polipéptido por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, o reacciona inmunológicamente con un anticuerpo policlonal frente a dicho polipéptido en forma purificada.

(a): moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido con actividad mananasa y que comprenden una secuencia de nucleótidos según SEC. 5

(b): especie homólogas de (a);

(c): moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido con actividad mananasa idéntico en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos SEC. 6;

(d): moléculas complementarias a (a), (b) o (c); y

(e): secuencias degeneradas de nucleótidos de (a), (b), (c) o (d).

Definiciones

Antes de estudiar la presente invención en más detalle, deben definirse los siguientes términos:

El término "ortólogo" (o "especie homóloga") significa un polipéptido o una proteína obtenida de una especie que tiene homología con un polipéptido o una proteína análoga de una especie diferente.

El término "parálogo" significa un polipéptido o una proteína obtenida de una determinada especie que tiene homología con un polipéptido o una proteína diferente de la misma especie.

El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés unido de forma operable a segmentos adicionales que realizan su transcripción. Estos segmentos adicionales pueden incluir secuencias del promotor y del terminador y también pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un mejorador y una señal de poliadenilación. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN plásmido o viral o pueden contener elementos de ambos. El vector de expresión de la invención puede ser cualquier vector de expresión que se somete adecuadamente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Así, el vector puede ser un vector que se replica de forma autónoma, es decir un vector que existe como una entidad cromosómica independiente cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en
el(los) que ha sido integrado.

El término "expresado de forma recombinante" utilizado en la presente memoria en relación con la expresión de un polipéptido o proteína sigue la definición estándar en la técnica. La expresión recombinante de una proteína se realiza generalmente utilizando un vector de expresión como se ha descrito anteriormente.

El término "aislado", cuando se aplica a una molécula de polinucleótido, significa que el polinucleótido ha sido sacado de su medio genético natural y, por tanto, está libre de otras secuencias codificantes extrañas o no deseadas y se encuentra en una forma adecuada para su uso en sistemas de producción de proteínas de ingeniería genética. Estas moléculas aisladas están separadas de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los que están normalmente asociadas pero pueden incluir regiones 5' y 3' naturales no traducidas tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas resulta evidente para el experto en la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

El término "un polinucleótido aislado" también pueden sustituirse por "un polinucleótido clonado". Cuando el término "aislado" se aplica a una proteína/polipéptido indica que la proteína se encuentra en una condición diferente a su entorno natural. En una forma preferida, la proteína aislada está prácticamente libre de otras proteínas, en especial de otras proteínas homólogas (es decir, "impurezas homólogas" (ver más abajo)). Es preferible proporcionar la proteína en una forma pura superior al 40%, más preferiblemente en una forma pura superior al 60%. Aún más preferiblemente se prefiere proporcionar la proteína en una forma de alta pureza, es decir, con una pureza superior al 80%, más preferiblemente superior al 95% y aún más preferiblemente superior al 99%, de acuerdo con la determinación SDS-PAGE.

El término "proteína/polipéptido aislado" puede sustituirse también por "proteína/polipéptido purificado".

El término "impurezas homólogas" significa cualquier impureza (p. ej., otro polipéptido diferente al polipéptido de la invención) que proceda de la célula homóloga de la que se ha obtenido originalmente el polipéptido de la invención.

El término "obtenido de" utilizado en la presente memoria en relación con una fuente microbiana específica significa que el polinucleótido y/o el polipéptido procede de una fuente específica o de una célula en la que se ha insertado un gen de la fuente.

El término "unido de forma operable", referido a segmentos de ADN, significa que los segmentos están dispuestos de forma que funcionen de acuerdo con sus fines previstos, p. ej., que la transcripción se inicie en el promotor y prosiga por el segmento codificante hasta el terminador.

El término "polinucleótido" significa un polímero de cadena simple o doble de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leído desde el extremo 5' hasta el extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vitro o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas.

El término "complementos de moléculas de polinucleótido" significa moléculas de polinucleótido que tienen una secuencia de bases complementarias y una orientación invertida con respecto a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a la 5' CCCGTGCAT 3'.

El término "secuencia degenerada de nucleótidos" significa una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (con respecto a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término "promotor" significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que unen la ARN polimerasa e inician la transcripción. Las secuencias del promotor se encuentran normalmente, aunque no siempre, en las regiones no codificantes 5' de genes.

El término "secuencia de señales de secreción" significa una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido de secreción") que, como un componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una vía de secreción de una célula en la que es sintetizado. Generalmente el péptido mayor es escindido para eliminar el péptido de secreción durante el tránsito a través de la vía de secreción.

Cómo utilizar una secuencia de la invención para obtener otras secuencias relacionadas

La información incluida en la presente memoria relativa a una secuencia de polinucleótidos que codifica una mananasa de la invención puede utilizarse como herramienta para identificar otras mananasas homólogas. Por ejemplo, puede utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias que codifican otras mananasas homólogas procedentes de diferentes fuentes microbianas, en particular de diferentes especies de Bacillus.

Valoración del ensayo de actividad

La actividad mananasa de un polipéptido de la invención con actividad mananasa puede analizarse mediante métodos de ensayo estándar conocidos en la técnica, tales como la aplicación de una solución experimental a orificios de 4 mm de diámetro realizados en placas de agar que contienen un 0,2% de AZCL galactomanano (goma de algarroba), es decir, un sustrato para el ensayo de endo-1,4-beta-D-mananasa disponible como CatNo.I- AZGMA de la empresa Megazyme, US\textdollar110,00/3 gramos (sitio web de Megazyme: http://www.megazyme.com/Purchase/index.html).

Polinucleótidos

Un polinucleótido aislado de la invención se hibrida a regiones de tamaño similar de la SEC. 1, o a una secuencia complementaria a este, en condiciones de rigurosidad media como mínimo.

En particular los polinucleótidos de la invención hibridan a una sonda de ADN de doble cadena desnaturalizada que comprende la secuencia completa que se muestra en las posiciones 97-1029 de SEC. 1 o cualquier sonda que comprenda una subsecuencia de SEC. 1 con una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de bases en condiciones de rigurosidad media como mínimo, pero preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad como se describe en detalle más adelante. Las condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación con una rigurosidad de media a alta entre una sonda de nucleótido y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica la humectación previa del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN que se van a hibridar en 5 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico, Sambrook y col. 1989) durante 10min. y la hibridación previa del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x Solución Denhardt (Sambrook y col. 1989), SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado sonicado (Sambrook y col. 1989), seguido de la hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. y Vogelestein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), marcada con 32P-dCTP (actividad específica superior a 1 x 109 cpm/\mug) durante 12 horas a 45ºC. A continuación se lava el filtro dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, SDS al 0,5% al menos a 60ºC (rigurosidad media), aún más preferiblemente al menos a 65ºC (rigurosidad media/alta), aún más preferiblemente al menos a 70ºC (rigurosidad alta) y aún más preferiblemente al menos a 75ºC (rigurosidad muy alta).

Las moléculas a las que hibridiza la sonda de oligonucleótidos en estas condiciones se detectan con una película de rayos X.

Como se ha mencionado anteriormente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para aislar ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. Los genes que codifican ADN y ARN de interés pueden ser clonados en genotecas o bibliotecas de ADN utilizando métodos conocidos en la técnica.

A continuación se identifican y aislan los polinucleótidos que codifican polipéptidos con actividad mananasa de la invención, por ejemplo, mediante hibridación o PCR.

La presente invención también proporciona polipéptidos y polinucleótidos contraparte de diferentes cepas bacterianas (ortólogos o parálogos). De especial interés son los polipéptidos con actividad mananasa de cepas alcalófilas gram-positivas, incluida la especie Bacillus.

Las especies homólogas de un polipéptido con actividad mananasa de la presente invención pueden ser clonadas utilizando la información y las composiciones proporcionadas por la presente invención junto con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, una secuencia de ADN de la presente invención puede ser clonada utilizando ADN cromosómico obtenido de un tipo de célula que expresa la proteína. Las fuentes adecuadas de ADN pueden identificarse analizando Northern blots con sondas diseñadas de acuerdo con las secuencias descritas en la presente memoria. A continuación se prepara una genoteca a partir de ADN cromosómico de una línea celular positiva. Una secuencia de ADN de la invención que codifica un polipéptido con actividad mananasa puede aislarse por diferentes métodos como, por ejemplo, con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en la presente especificación y reivindicaciones o con uno o más juegos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Una secuencia de ADN de la invención también puede ser clonada utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis, patente US-4.683.202) utilizando cebadores diseñados a partir de las secuencias descritas en la presente memoria. Con otro método, puede utilizarse la genoteca de ADN para transformar o transfectar células huésped y puede detectarse la expresión del ADN de interés con un anticuerpo (monoclonal o policlonal) dirigido contra la mananasa clonada de B. agaradherens, NCIMB 40482, expresada y purificada como se describe en Materiales y Métodos y en el Ejemplo 1, o mediante un ensayo de actividad relacionado con un polipéptido con actividad mananasa.

La mananasa que codifica parte de la secuencia de ADN clonado en el plásmido pSJ1678 presente en Escherichia coli DSM 12180 y/o una secuencia de ADN análoga de la invención puede ser clonada a partir de una cepa de la especie bacteriana Bacillus agaradherens, preferiblemente la cepa NCIMB 40482, para obtener la enzima con actividad de degradación de manano o un microorganismo diferente o relacionado como se describe en la presente memoria.

De forma alternativa, la secuencia análoga puede ser construida a partir de la secuencia de ADN que puede obtenerse del plásmido presente en Escherichia coli DSM 12180 (que se cree es idéntico a la secuencia SEC.1 adjunta), p. ej., una subsecuencia de la misma y/o mediante introducción de sustituciones de nucleótido que no originen otra secuencia de aminoácidos de la mananasa codificada por la secuencia de ADN pero que corresponda al uso de codon del microorganismo huésped previsto para la producción de la enzima, o mediante introducción de sustituciones de nucleótido que puedan originar una secuencia diferente de aminoácidos (es decir, una variante de la enzima de degradación de manano de la invención).

Polipéptidos

La secuencia de aminoácidos 32-343 de SEC. 2 es una secuencia de mananasa madura.

La presente invención también proporciona polipéptidos con actividad mananasa que son prácticamente homólogos al polipéptido de SEC.2 y especies homólogas (parálogas u ortólogas) de los mismos. El término "prácticamente homólogo" se utiliza en la presente memoria para designar polipéptidos que tienen una identidad de secuencia del 70%, preferiblemente al menos del 80%, más preferiblemente al menos del 85% y aún más preferiblemente al menos del 90%, con la secuencia de los aminoácidos 32-343 de SEC.2 o sus ortólogos o parálogos. Estos polipéptidos serán más preferiblemente idénticos al menos en un 95%, y con máxima preferencia idénticos en un 98% o más, a la secuencia de aminoácidos 32-343 de SEC.2 o sus ortólogos o parálogos. El porcentaje de identidad de la secuencia se determina mediante métodos convencionales, utilizando programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP que se incluye en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) según Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Para la comparación de secuencias de polipéptidos se utiliza el método GAP con los siguientes valores: penalización de creación GAP de 3,0 y penalización de extensión GAP de 0,1.

La identidad de secuencia de moléculas de polinucleótido se determina mediante métodos similares utilizando los siguientes valores de GAP para la comparación de secuencias de ADN: penalización de creación GAP de 5,0 y penalización de extensión GAP de 0,3.

La preparación de la enzima de la invención procede preferiblemente de un microorganismo, preferiblemente de una bacteria, una archea o un hongo, especialmente de una bacteria como, p. ej., una bacteria perteneciente a Bacillus, preferiblemente de una cepa alcalófila de Bacillus que puede seleccionarse del grupo que consta de la especie Bacillus agaradherens y especies Bacillus muy relacionadas en las que todas las especies son preferiblemente al menos un 95%, y aún más preferiblemente al menos un 98%, homólogas al Bacillus agaradherens en cuanto a secuencias del ADNr 16S alineadas.

Las proteínas y polipéptidos prácticamente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácido conservadoras (ver Tabla 2) y otras sustituciones que no afectan de forma considerable al plegamiento o a la actividad de la proteína o polipéptido; pequeñas deleciones, de forma típica de uno a aproximadamente 30 aminoácidos, y pequeñas extensiones de terminal amino o carboxilo, tales como un residuo metionina con terminal amino, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20-25 residuos o una pequeña extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad), tales como un tracto poli-histidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3, 1991. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Existen en el mercado ADN que codifican etiquetas de afinidad (p. ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).

Sin embargo, aunque los cambios descritos anteriormente preferiblemente son de naturaleza menor, estos cambios también pueden ser de naturaleza mayor como, p. ej., la fusión de polipéptidos mayores de hasta 300 aminoácidos o más como extensiones de terminales amino o carboxilo a un polipéptido mananasa de la invención.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácido conservadoras

Básicas	:	arginina, lisina, histidina
Ácidas	:	ácido glutámico, ácido aspártico
Polares	:	glutamina, asparagina
Hidrófobas	:	leucina, isoleucina, valina
Aromáticas	:	fenilalanina, triptófano, tirosina
Pequeñas	:	glicina, alanina, serina, treonina, metionina

Además de los 20 aminoácidos estándar, pueden sustituirse aminoácidos no estándar (p. ej., 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) por residuos de aminoácido de un polipéptido según la invención. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden sustituirse por residuos aminoácido. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados tras la síntesis proteica y/o tienen una estructura química en sus cadena(s) laterales(s)
diferente a la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales pueden obtenerse mediante síntesis química, o preferiblemente, son productos comerciales que incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, dehidroprolina, 3-metilprolina y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos con actividad mananasa de la presente invención pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula y en las moléculas mutantes resultantes se analiza la actividad biológica (es decir, la actividad mananasa) para identificar los residuos aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton y col., J. Biol. En Chem. 271:4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede ser determinado mediante análisis de la estructura física mediante técnicas como, p. ej., resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, junto con la mutación de nuevos sitios de contacto de aminoácidos. Véase, por ejemplo, de Vos y col., Science 255:306-312, 1992; Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas del análisis de homologías con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido según la invención.

Pueden realizarse y analizarse múltiples sustituciones de aminoácidos utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o redistribución seguidos de un procedimiento de detección adecuado como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-57, 1988), Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989), WO95/17413, o WO 95/22625. Estos autores describen métodos para aleatorizar de forma simultánea dos o más posiciones en un polipéptido, o recombinar/ redistribuir diferente mutaciones (WO95/17413, WO95/22625), para a continuación seleccionar un polipéptido funcional y secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitidas en cada posición. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen la técnica de "phage display" (p. ej., Lowman y col., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner y col., patente de EE.UU. núm. 5.223.409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire y col., Gene 46:145, 1986; Ner y col., ADN 7:127, 1988).

Los métodos de mutagénesis/ redistribución descritos anteriormente pueden combinarse con métodos de detección automáticos de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados clonados en las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos puede ser recuperadas de las células huésped y secuenciadas rápidamente utilizando equipos modernos. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de los residuos individuales de aminoácido en un polipéptido de interés y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Utilizando los métodos mencionados anteriormente, el experto en la materia puede identificar y/o preparar diferentes polipéptidos que son prácticamente homólogos a los residuos 32 a 343 de SEC. 2 y conservar la actividad mananasa de la proteína salvaje.

Obtención de proteínas

Las proteínas y polipéptidos de la presente invención, incluidas las proteínas de longitud completa, fragmentos de las mismas y proteínas de fusión, puede ser obtenidas en células huésped manipuladas genéticamente mediante técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos de célula que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y cultivados e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Las células bacterianas, en especial las células cultivadas de microorganismos gram-positivos, son las preferidas. Las células gram-positivas del género Bacillus son especialmente preferidas como, p. ej., las del grupo que consta de Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearotermophilus, Bacillus alqualophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, y Bacillus agaradherens, y en especial el Bacillus agaradherens.

Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en diferentes células huésped han sido descritas por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc., NY, 1987; y "Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria", Sonensheim y col., 1993, American Society for Microbiology, lavadoton D.C.

En general, una secuencia de ADN que codifica una mananasa de la presente invención está unida de forma operable a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, lo que incluye generalmente un promotor y un terminador de la transcripción dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá generalmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque el experto en la técnica reconocerá que en ciertos sistemas pueden proporcionarse marcadores seleccionables en vectores separados y que la replicación del ADN exógeno puede realizarse mediante integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño de rutina para el experto en la técnica. Muchos de estos elementos se encuentran descritos en la bibliografía y son comercializados por proveedores del mercado.

Para dirigir un polipéptido a la vía de secreción de una célula huésped, en el vector de expresión se encuentra una secuencia de señales de secreción (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia). La secuencia de señales de secreción puede ser la del polipéptido, o puede derivarse de otra proteína secretada o sintetizada ex novo. En la técnica se conocen numerosas secuencias de señales de secreción adecuadas, citándose como referencia "Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria", Sonensheim y col., 1993, American Society for Microbiology, lavadoton D.C.; y Cutting, S. M.(eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley y Sons, 1990, para una descripción más detallada de las secuencias de señales de secreción adecuadas, especialmente para la secreción en una célula huésped Bacillus. La secuencia de señales de secreción se une a la secuencia de ADN en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señales de secreción están generalmente en la posición 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal pueden estar en otra posición en la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej., Welch y col., patente de EE.UU. núm. 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. núm. 5.143.830).

Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan mediante procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células huésped elegidas. En la técnica se conocen diferentes medios adecuados, incluidos los medios definidos y los medios complejos, y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener estos componentes como factores de crecimiento o suero, según las necesidades. El medio de crecimiento generalmente seleccionará células que contengan el ADN añadido por vía exógena mediante, por ejemplo, selección de la sustancia o deficiencia de un nutriente esencial que es complementada por el marcador seleccionable transportado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula huésped.

Aislamiento de proteínas

Cuando el polipéptido recombinante expresado es secretado, este puede ser purificado del medio de cultivo. Preferiblemente las células huésped de expresión son eliminadas del medio antes de purificar el polipéptido (p. ej., mediante centrifugación).

Cuando el polipéptido recombinante expresado no es secretado de la célula huésped, la célula huésped es preferiblemente alterada y el polipéptido se libera a un "extracto" acuoso que es la primera fase de estas técnicas de purificación. Preferiblemente las células huésped de expresión son recogidas del medio antes de la alteración celular (p. ej., mediante centrifugación).

La alteración celular puede realizarse mediante técnicas convencionales tales como digestión de lisozimas o forzando las células a través de alta presión. Para una descripción más detallada de estas técnicas de alteración celular, véase Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlag.

Ya sean o no secretados los polipéptidos recombinantes (o polipéptidos quiméricos) expresados, estos pueden ser purificados mediante fraccionamiento y/o métodos y medios de purificación convencionales.

Para fraccionar las muestras puede utilizarse la precipitación con sulfato amónico y la extracción con un ácido o un agente caotrópico. Las etapas de purificación ilustrativas pueden incluir hidroxiapatita, exclusión de tamaños, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa. Los medios de intercambio aniónico adecuados incluyen derivados de dextranos, agarosa, celulosa, poliacrilamida y sílices especiales. Se prefieren los derivados de PEI, DEAE, QAE y Q, siendo el DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) especialmente preferido. Los medios cromatográficos ilustrativos incluyen aquellos medios derivados con grupos fenilo, butilo u octilo tales como Phenil-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia); o resinas poliacrílicas tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas). Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno y resinas reticuladas de poliacrilamida que son insolubles en las condiciones en las que van a ser utilizadas. Estos soportes pueden ser modificados con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos carbohidrato. Los ejemplos de acoplamientos incluyen la activación de bromuro de cianógeno, la activación de N-hidroxisuccinimida, la activación de epóxido, la activación de sulfhidrilo, la activación de hidrazida y los carboxil derivados y amino derivados para la química de acoplamiento carbodiimida. Estos medios y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente utilizados en la técnica y son productos de proveedores comerciales.

La elección de un determinado método es una cuestión de diseño rutinario y viene determinada en parte por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988.

Los polipéptidos de la invención o los fragmentos de los mismos también pueden prepararse mediante síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo inicial de aminoácido metionina.

Utilizando la información sobre secuencias de la presente memoria puede clonarse una secuencia de ADN de longitud completa que codifica una mananasa de la invención y que comprende la secuencia de ADN que se muestra en la SEC. 1, al menos la secuencia de ADN desde la posición 97 a la posición 1029.

La clonación se realiza por procedimientos estándar conocidos en la técnica como, por ejemplo:

preparando una genoteca de una cepa Bacillus, especialmente la cepa B. agaradherens, NCIMB 40482;

\sqbullet colocando esta genoteca en placas de sustrato adecuadas;

\sqbullet identificando un clon que comprende una secuencia de polinucleótidos de la invención mediante técnicas estándar de hibridación y una sonda basada en la SEC. 1; o

\sqbullet identificando un clon de dicha genoteca de Bacillus agaradherens NCIMB 40482 mediante PCR inversa con cebadores basados en la información sobre secuencias de la SEC. 1. Para más información sobre PCR inversa véase M.J. MCPherson y col. ("PCR A practical approach" Information Press Ltd, Oxford, Inglaterra).

A la vista de la información sobre secuencias descrita en la presente memoria (SEC. 1, SEC. 2) el aislamiento de secuencias homólogas de polinucleótidos que codifican la mananasa homóloga de la invención mediante una estrategia similar utilizando genotecas de microorganismos microbianos relacionados, en particular genotecas de otras cepas del género Bacillus tales como la especie alcalófila de Bacillus representa un trabajo de rutina para el experto en la
materia.

De forma alternativa, el ADN que codifica la enzima de la invención que degrada manano o galactomanano puede ser clonado adecuadamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, a partir de una fuente adecuada como cualquiera de los microorganismos anteriormente mencionados utilizando sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas de acuerdo con la secuencia de ADN que puede obtenerse del plásmido presente en Escherichia coli DSM 12180.

De la misma forma, la molécula de polinucleótido de la invención puede ser aislada de Escherichia coli, DSM 12180, en la que se deposita el plásmido obtenido por clonación como se ha descrito anteriormente. Asimismo, la presente invención se refiere a un cultivo biológico aislado prácticamente puro de la cepa Escherichia coli, DSM 12180.

En este contexto el término "preparación de la enzima" significa un producto enzimático de fermentación convencional, posiblemente aislado y purificado, a partir de una única especie de un microorganismo, en donde dicha preparación normalmente comprende diferentes actividades enzimáticas; o una mezcla de enzimas monocomponente, preferiblemente enzimas derivadas de especies bacterianas o fúngicas utilizando técnicas recombinantes convencionales, cuyas enzimas han sido fermentadas y posiblemente aisladas y purificadas por separado y que pueden proceder de especies diferentes, preferiblemente especies fúngicas o bacterianas; o el producto de fermentación de un microorganismo que actúa como una célula huésped para expresar una mananasa recombinante, pero en donde dicho microorganismo produce al mismo tiempo otras enzimas, p. ej., enzimas de degradación de pectina, proteasas o celulasas, siendo productos de fermentación naturales del microorganismo, es decir, el complejo enzimático obtenido de forma convencional por el correspondiente microorganismo natural.

Un método de obtención de la preparación de la enzima de la invención, en donde el método comprende el cultivo de un microorganismo, p. ej., una cepa salvaje, capaz de producir la mananasa en unas condiciones que permitan la producción de la enzima y la recuperación de la enzima del cultivo. El cultivo puede ser realizado utilizando técnicas de fermentación convencionales, p. ej., cultivo en frascos o fermentadores con agitación para garantizar una suficiente aireación en un medio de crecimiento que induzca la producción de la enzima mananasa. El medio de crecimiento puede contener una fuente de N convencional como, p. ej., peptona, extracto de levadura o casaminoácidos, una cantidd reducida de una fuente convencional de C como, p. ej., dextrosa o sucrosa y un inductor como la goma guar o la goma de algarroba. La recuperación puede realizarse utilizando técnicas convencionales como, p. ej., separación de biomasa y sobrenadante por centrifugación o filtración, recuperación del sobrenadante o alteración de células si la enzima de interés es intracelular, tal vez seguido de otra purificación según EP 0 406 314 o por cristalización según WO 97/15660.

Reactividad cruzada inmunológica

Los anticuerpos policlonales utilizados para determinar la reactividad cruzada inmunológica pueden prepararse utilizando una enzima mananasa purificada. De forma más específica, puede obtenerse antisuero frente a la mananasa de la invención inmunizando conejos (u otros roedores) según el método descrito por N. Axelsen y col. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publicationes, 1973, Chapter 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publicationes, 1982 (de forma más específica en p. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden obtenerse del antisuero, por ejemplo, mediante precipitación de sales ((NH_{4})_{2} SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej., enDEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de proteínas puede realizarse mediante análisis de doble difusión de Outcherlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publicationes, 1967, págs. 655-706), mediante inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen y col., supra, cap. 3 y 4), o mediante inmunoelectroforesis tipo Rocket (N. Axelsen y col., cap. 2).

Ejemplos de bacterias útiles para obtener la enzima o la preparación de la enzima de la invención son bacterias gram-positivas, preferiblemente de la subdivisión Bacillus/Lactobacillus, preferiblemente una cepa del género Bacillus, más preferiblemente una cepa Bacillus agaradherens, especialmente la cepa Bacillus agaradherens, NCIMB 40482.

La presente invención incluye una mananasa aislada que tiene las propiedades descritas anteriormente y que está libre de impurezas homólogas y que se obtiene utilizando técnicas recombinantes convencionales.

Determinación de la actividad catalítica (ManU) de la mananasa

Ensayo colorimétrico: Sustrato:0,2% de AZCL-galactomanano (Megazyme, Australia) de goma de algarroba en tampón glicina 0,1 M, pH 10,0. El ensayo se realiza en un microtubo Eppendorf de 1,5 ml en un termomezclador con agitador y control de temperatura a 40ºC. Incubar 0,750 ml de sustrato con 0,05 ml de enzima durante 20min., centrifugar durante 4 minutos a 15000 rpm. Se mide el color del sobrenadante a 600 nm en una cubeta de 1 cm. Un ManU (unidades mananasa) proporciona 0,24 abs en 1 cm.

Obtención del Bacillus agaradherens mananasa NCIMB 40482 Cepas

Bacillus agaradherens NCIMB 40482 comprende la enzima mananasa que codifica la secuencia de ADN.

E. Cepa coli: Se prepararon células de E. coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, un exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321) y se transformaron mediante electroporación utilizando un electroporator Gene Pulser^{TM} de BIO-RAD de acuerdo con las indicaciones del proveedor.

B. subtilis PL2306. Esta cepa es el B. subtilis DN1885 con genes apr y npr alterados (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, un exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321) alterada en la unidad transcripcional del conocido gen celulasa de Bacillus subtilis, para obtener células negativas de celulasa. La alteración se realizó prácticamente según (Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch y Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, pág. 618).

Se prepararon células competentes y se transformaron como describen Yasbin, R.E., Wilson, G.A. y Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121:296-304.

Plásmidos

pSJ1678 (como se describe en detalle en WO 94/19454).

pMOL944: Este plásmido es un derivado pUB110 que prácticamente contiene elementos que hacen que el plásmido sea propagable en Bacillus subtilis, un gen resistente a la canamicina y un promotor fuerte y un péptido señal clonado del gen amyL de B. licheniformis ATCC14580. El péptido señal contiene un sitio SacII que le convierte en adecuado para clonar el ADN que codifica la parte madura de una proteína en fusión con el péptido señal. Esto da lugar a la expresión de una Pre-proteína que está dirigida hacia el exterior de la célula.

El plásmido se construyó utilizando técnicas de ingeniería genética convencionales que se describen brevemente a continuación.

Construcción de pMOL944

El plásmido pUB110 (McKenzie, T. y col., 1986, Plasmid 15:93-103) fue digerido con la enzima de restricción única NciI. Un fragmento PCR amplificado del promotor amyL codificado en el plásmido pDN1981 (P.L. Jørgensen y col., 1990, Gene, 96, p. 37-41) fue digerido con NciI e insertado en el pUB110 digerido con NciI para obtener el plásmido pSJ2624.

Los dos cebadores PCR utilizados tienen las siguientes secuencias:

#LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'

#LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGA
AGAT-3'

El cebador #LWN5494 inserta un sitio NotI en el plásmido.

A continuación el plásmido pSJ2624 fue digerido con SacI y NotI y un nuevo fragmento PCR amplificado en el promotor amyL codificado en el pDN1981 fue digerido con SacI y NotI y este fragmento de ADN se insertó en el pSJ2624 digerido con SacI-NotI para obtener el plásmido pSJ2670.

Esta clonación sustituye a la primera clonación del promotor amyL con el mismo promotor pero en la dirección contraria. Los dos cebadores utilizados para la amplificación PCR tienen las siguientes secuencias:

#LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGA
T-3'

#LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'

El plásmido pSJ2670 fue digerido con las enzimas de restricción PstI y BclI y un fragmento PCR amplificado procedente de una secuencia de ADN clonada que codifica la amilasa alcalina SP722 (descrita en la solicitud de patente internacional publicada como WO95/26397) fue digerido con PstI y BclI e insertado para obtener el plásmido pMOL944. Los dos cebadores utilizados para la amplificación PCR tienen la siguiente secuencia:

#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3'

#LWN7901 5'-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3'

El cebador #LWN7901 inserta un sitio SacII en el plásmido.

Clonación del gen mananasa del Bacillus agaradherens Preparación del ADN genómico

Se propagó la cepa Bacillus agaradherens NCIMB 40482 en medio líquido según WO94/01532. Tras 16 horas de incubación a 30ºC y centrifugación a 300 rpm se cosecharon las células y se aisló el ADN genómico mediante el método descrito por Pitcher y col. (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).

Construcción de la genoteca

El ADN genómico fue parcialmente digerido con la enzima de restricción Sau3A y fraccionado por tamaño mediante electroforesis en gel agarosa al 0,7%. Se aislaron fragmentos de 2 a 7 kb de tamaño mediante electroforesis sobre papel de celulosa DEAE (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298).

Los fragmentos aislados de ADN se ligaron al ADN del plásmido pSJ1678 digerido con BamHI y la mezcla ligada se utilizó para transformar E. coli SJ2.

Identificación de clones positivos

Una genoteca de ADN en E. coli, construida como se ha descrito anteriormente, fue analizada en placas de agar LB que contenían un 0,2% de AZCL-galactomanano (Megazyme) y 9 \mug/ml de cloramfenicol y se incubó durante la noche a 37ºC. Los clones que expresan la actividad mananasa aparecieron con un halo de difusión azul. El plásmido de ADN de uno de estos clones fue aislado mediante Qiagen Plasmid Spin Preps en 1 ml de caldo de cultivo nocturno (células incubadas a 37ºC en TY con 9 \mug/ml de cloramfenicol y agitación a 250 rpm).

Este clon (MB525) también fue caracterizado mediante secuenciación de ADN del fragmento ADN Sau3A clonado. La secuenciación de ADN se realizó mediante "primerwalking", utilizando el kit Taq deoxy-C terminalycle sequencing (Perkin-Elmer, USA), terminadores con etiqueta fluorescente y oligonucleótidos adecuados como cebadores.

El análisis de los datos de secuencia se realizó según Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395. La secuencia que codifica la mananasa se muestra en la SEC. 1. La secuencia derivada de proteína se muestra en la
SEC. 2.

Subclonación y expresión de la mananasa en B. subtilis

La mananasa que codifica la secuencia de ADN de la invención fue amplificada mediante PCR utilizando el juego PCR de cebadores que consta de estos dos oligonucleótidos:

\newpage

Mananasa.upper.SacII

5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3'

Mananasa.lower.NotI

5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATT TTC G-3'

Se han subrayado los sitios de restricción SacII y NotII.

El ADN cromosómico aislado de B. agaradherens NCIMB 40482 descrito anteriormente se utilizó como plantilla en una reacción PCR utilizando polimerasa Amplitaq ADN (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción PCR se realizó en tampón PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01% (p/v)) que contiene 200 \muM de cada dNTP, 2,5 unidades de AmpliTaq polimerasa (Perkin-Elmer, Cetus, USA) y 100 pmol de cada cebador.

La reacción PCR se realizó utilizando un ciclador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Se realizó una incubación a 94ºC durante 1min. seguida de 30 ciclos de PCR con un perfil de ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s., apareamiento a 60ºC durante 1min. y extensión a 72ºC durante 2 min. Se analizaron cinco alicuotas de -\mul del producto de amplificación mediante electroforesis en 0,7% de gel de agarosa (NuSieve, FMC). El aspecto de un tamaño de fragmento de ADN de 1,4 kb indicó que la amplificación del segmento de gen era adecuada.

Subclonación de fragmentos PCR

Cuarenta y cinco alícuotas de -\mul de los productos PCR generados como se ha descrito anteriormente se purificaron utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se eluyó en 50 \mul de Tris-HCl 10mM, pH 8,5.

5 \mug de pMOL944 y 25 \mul del fragmento PCR purificado fueron digeridos con SacII y NotI, sometidos a electroforesis en 0,8% de gel de agarosa de baja temperatura de gelificación (SeaPlaque GTG, FMC), los fragmentos relevantes fueron retirados de los geles y purificados utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento PCR de ADN aislado se unió a continuación al pMOL944 digerido con SacII-NotI y purificado. La unión se realizó durante la noche a 16ºC utilizando 0,5 \mug de cada fragmento de ADN, 1 U de T4 ADN ligasa y tampón ligasa T4 (Boehringer Mannheim, Alemania).

La mezcla ligada se utilizó para transformar el B. subtilis PL2306 competente. Las células transformadas se colocaron en placas LBPG con 10 \mug/ml de canamicina. Tras 18 horas de incubación a 37ºC se observaron colonias en las placas. Se analizaron diferentes clones mediante aislamiento de plásmido de ADN en el caldo de cultivo nocturno.

Uno de estos clones positivos se frotó varias veces en placas de agar como se ha descrito anteriormente y este clon se denominó MB594. El clon MB594 se cultivó durante la noche en TY-10 \mug/ml de canamicina a 37ºC y al día siguiente se utilizó 1 ml de células para aislar el plásmido de las células utilizando el kit Qiaprep Spin Plasmidminiprep 27106 de acuerdo con las instrucciones del fabricante para las preparaciones de plásmido B. subtilis. Este ADN fue secuenciado para revelar la secuencia de ADN correspondiente a la parte madura de la mananasa, es decir, las posiciones 94-1404 de la SEC. 3 adjunta. La proteína madura derivada se muestra en la SEC. 4. Parece que el extremo 3' de la mananasa codificada por la secuencia de SEC.1 ha sido cambiado por el que se muestra en la SEC. 3 debido al diseño del cebador inferior utilizado en el PCR. La secuencia resultante de aminoácidos se muestra en la SEC. 4 y es evidente que el C terminal de la SEC. 2 (SHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR) ha cambiado al C terminal de la SEC. 4 (IIMLGK).

Medios

TY (según Ausubel, F. M. y col. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley y Sons, 1995).

Agar LB (según Ausubel, F. M. y col. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley y Sons, 1995).

LBPG es agar LB (véase más arriba) complementado con 0,5% de glucosa y fosfato potásico 0,05 M, pH 7,0

El medio BPX se describe en EP 0 506 780 (WO 91/09129).

Expresión, purificación y caracterización de la mananasa de Bacillus agaradherens

El clon MB 594 obtenido como se ha descrito anteriormente en la sección Materiales y métodos se cultivó en 25 x 200 ml de medio BPX con 10 \mug/ml de canamicina en dos frascos difusores para agitación de 500 ml durante 5 días a 37ºC a 300 rpm.

Se recogieron 6500 ml del líquido de cultivo del frasco del clon MB 594 (lote #9813) y se ajustó el pH a 5,5. Se añadieron 146 ml de agente catiónico (C521) y 292 ml de agente aniónico (A130) durante la agitación para conseguir la floculación. El producto floculado se separó por centrifugación utilizando una centrifuga Sorval RC 3B a 9000 rpm durante 20 min. a 6ºC. El sobrenadante se clarificó utilizando filtros de vidrio GF/D y C de Whatman y finalmente se concentró en un filtron con un valor de corte de 10 kDa.

750 ml de este concentrado se ajustó a pH 7,5 utilizando hidróxido sódico. La solución transparente se trató mediante cromatografía de intercambio aniónico con una columna Q-Sepharose de 900 ml equilibrada con Tris 50 mmol a pH 7,5. La actividad mananasa unida se eluyó con un gradiente de cloruro sódico.

La enzima pura presentó una banda única en SDS-p. con un peso molecular de 38 kDa. La secuencia de aminoácidos de la enzima mananasa, es decir, la secuencia de ADN traducida, se muestra en la SEC. 2.

Determinación de las constantes cinéticas

Sustrato: Goma de algarroba y análisis de los azúcares reductores (PHBAH). Goma de algarroba de Sigma
(G-0753).

En la determinación cinética con diferentes concentraciones de goma de algarroba e incubación durante 20 min. a 40ºC a pH 10 se obtuvo un valor:

Kcat: 467/s.

K_{m}: 0,08 g/l

PM: 38 kDa

pI (punto isoeléctrico): 4,2

La temperatura óptima de la mananasa fue de 60ºC.

El perfil de actividad pH presentó una actividad máxima entre pH 8 y pH 10.

Con la DSC (calorimetría diferencial de barrido) se obtiene una temperatura de 77ºC como punto de fusión a pH 7,5 en tampón Tris, lo que indica que esta enzima es muy termoestable.

El detergente cuando se utiliza un 0,2% de AZCL-galactomanano de goma de algarroba como sustrato y una incubación según las indicaciones anteriores a 40ºC presenta una excelente compatibilidad con los detergentes líquidos convencionales y una buena compatibilidad con los detergentes en polvo convencionales.

Obtención de la mananasa de Bacillus subtilisis 168

La \beta-mananasa de Bacillus subtilisis se identificó y purificó de la siguiente forma: Se buscó la homología del genoma Bacillus subtilis con una secuencia de genes de \beta-mananasa de Bacillus sp conocida (Mendoza y col., Biochemica et Biophysica Acta 1243:552-554, 1995). La región codificante de ydhT, cuyo producto era desconocido, presentó una similitud del 58% con la \beta-mananasa de Bacillus conocida. Para amplificar las secuencias que codifican la porción madura de la \beta-mananasa se diseñaron los siguientes oligonucleótidos: 5'-GCT CAA TTG GCG CAT ACT GTG TCG CCT GTG-3' y 5'-GAC GGA TCC CGG ATT CAC TCA ACG ATT GGC G-3'. El ADN total genómico de la cepa 1A95 de Bacillus subtilis se utilizó como plantilla para amplificar la región madura ydhT utilizando los cebadores antes mencionados. La PCR se realiza con el kit GENE-AMP PCR con AMPLITAQ DNA Polymerase (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA). Tras un período inicial de fusión de 5 min. a 95ºC se ejecutaron 25 ciclos del siguiente programa: fusión a 95ºC durante 1 min., apareamiento a 55ºC durante 2 min. y extensión a 72ºC durante 2 min. Tras el último ciclo, la reacción se mantuvo a 72ºC durante 10 min. para completar la extensión. Los productos PCR se purificaron utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, Chatsworth, CA).

La región madura ydhT amplificada de la cepa 1A95 de Bacillus subtilis se insertó en el vector de expresión pPG1524 (descrito anteriormente) de la siguiente forma: El fragmento 1028bp amplificado fue digerido con Mfe I y BamH I. El vector de expresión pPG1527 fue digerido con EcoR I y BamH I. Los productos de restricción se purificaron con el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen, Chatsworth, CA). Se ligaron los dos fragmentos utilizando T4 ADN ligasa (13 h., 16ºC) y a continuación se utilizaron para transformar la cepa DH5-\alpha de E. coli competente. Se cultivaron colonias resistentes a la ampicilina para las preparaciones de ADN. A continuación se identificó el ADN mediante análisis de restricción. El plásmido pPG3200 contiene la región madura del gen ydhT. A continuación se utilizó el plásmido pPG3200 para transformar la cepa PG 632 de Bacillus subtilis competente (Saunders y col., 1992).

Se tomaron siete clones de Bacillus subtilis resistentes a la canamicina y un clon de control PG 632 y se cultivaron en 20 ml de medio 20/20/5 (20 g/l de triptona, 20 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl) al que se añadió 1 ml de maltrina al 25%, 120 \mul de MnCl_{2} 10 mM y 20 \mul l de canamicina 50 mg/m. Los clones se cultivaron durante la noche en frascos difusores de 250 ml agitando a 250 rpm y a 37ºC para expresar la proteína. Las células se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos. Un \mul de cada sobrenadante se diluyó en 99 \mul de acetato sódico 50 mM (pH 6,0). Se valoró un \mul de esta dilución utilizando la endo-1,4-\beta-mananasa de Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irlanda) según las instrucciones del fabricante. Se leyó la absorbancia a 590 nm en un espectrofotómetro Beckman DU640. El clon 7 fue el que presentó la máxima absorbancia (1,67). El control PG632 no presentó absorbancia a 590 nm.

El sobrenadante se analizó mediante SDS-p. en un gel de Tris-glicina al 10-20% (Novex, San Diego, Ca) para confirmar el tamaño de proteína esperado de 38 kDa. Las muestras se prepararon como se indica a continuación. Una muestra de 500 \mul del clon 7 ydhT y los sobrenadantes PG 632 se precipitaron con 55,5 \mul de ácido tricloroacético al 100% (Sigma), se lavaron con 100 \mul de ácido tricloroacético al 5%, se resuspendieron en 50 \mul de muestra tampón SDS Tris-glicina (Novex) y se mantuvieron a ebullición durante 5 minutos. Un \mul de cada muestra se sometió a elecroforesis en gel a 30 mA durante 90 minutos. Se observó una ancha banda de proteína a 38 kDa para el clon 7 ydhT.

Se fermentaron 10 l del clon 7 ydhT de Bacillus subtilis en un fermentador B. Braun Biostat C. Las condiciones de fermentación fueron las siguientes: Las células se cultivaron durante 18 horas en un medio rico similar al 20/20/5 a 37ºC. Al finalizar el ciclo de fermentación se retiraron las células y el sobrenadante se concentró a 1 litro utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial. El rendimiento final de \beta-mananasa en el sobrenadante concentrado fue de 3 g/l.

La purificación de la \beta-mananasa del sobrenadante de la fermentación se realizó de la siguiente forma: 500 ml del sobrenadante se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min. a 4ºC. A continuación el sobrenadante centrifugado se dializó durante la noche a 4ºC con dos cambios de 4 l de fosfato potásico 10 mM (pH 7,2) a través de un Spectrapor de 12.000-14.000 mol.p. con membrana cutoff (Spectrum). El sobrenadante dializado se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min. a 4ºC. Se equilibró una columna de intercambio aniónico de flujo rápido Q Sepharose (Pharmacia) de 200 ml con 1 litro de fosfato potásico 10 mM (pH 7,2) a 20ºC y se cargaron en la columna 300 ml de sobrenadante. Se recogieron dos fracciones de flujo de pasada de 210 ml (muestra A) y de 175 ml (muestra B). Las dos fracciones se valoraron como se ha descrito anteriormente salvo que las muestras se diluyeron con 199 \mul de acetato sódico 50 mM (pH 6,0), presentando una absorbancia de 0,38 y de 0,52, respectivamente. Se añadieron dos \mul de cada muestra a 8 \mul de tampón muestra SDS tris-glicina (Novex, CA) y se llevaron a ebullición durante 5min. Las muestras resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de tris-glicina al 10-20% (Novex, Ca) a 30 mA durante 90 minutos. En cada muestra se encontraba presente una banda principal correspondiente a 38 kDa que comprendía más del 95% de la proteína total. Se realizó una determinación de proteína BCA (Pierce) en ambas muestras según las instrucciones del fabricante y utilizando como patrón albúmina de suero bovino. Las muestras A y B contenían 1,3 mg/ml y 1,6 mg/ml de \beta-mananasa, respectivamente. La identidad de la proteína se confirmó mediante espectrometría de masas por ionización y análisis de secuencias de aminoácidos terminales.

Las muestras de \beta-mananasa purificadas se utilizaron para caracterizar la actividad de las enzimas de la siguiente forma: En todas las determinaciones se utilizó endo-1,4-\beta-mananasa de Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irlanda) como se ha descrito anteriormente. La actividad en el intervalo de pH de 3,0-9,0 se determinó en tampón citrato fosfato 50 mM, la actividad a pH 9,5 se determinó en CAPSO 50 mM (Sigma) y la actividad en el intervalo de pH de 10,0-11,0 se determinó en tampón CAPS 50 mM. El pH óptimo para la Bacillus subtilis \beta-mananasa resultó ser de 6,0-6,5. Los perfiles de actividad de temperatura se realizaron en tampón citrato fosfato 50 mM (pH 6,5). La enzima presentó una actividad óptima a 40-45ºC. La Bacillus subtilis \beta-mananasa mantuvo una actividad considerable a temperaturas inferiores a 15ºC y superiores a 80ºC. La actividad específica frente al \beta-1,4-galactomanano determinada fue de 160.000 \mumol/min\cdotmg \beta-mananasa utilizando endo-1,4-\beta-mananasa de Beta-Mannazyme Tabs (Megazyme, Irlanda) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la Bacillus subtilisis \beta-mananasa se muestran en la SEC. 5 y 6.

La mananasa se incorpora en las composiciones de la invención a un nivel del 0,0001% al 0,1%, preferiblemente del 0,0005% al 0,1% y más preferiblemente del 0,001% al 0,02%, de enzima pura en peso de la composi-
ción.

La enzima de la invención comprende, además del núcleo de la enzima que comprende el dominio catalíticamente activo, también un dominio de unión a celulosa (CBD), estando el domino de unión a celulosa y el núcleo (el dominio catalíticamente activo) de la enzima unidos de forma operable. El dominio de unión a celulosa (CBD) puede existir como parte integrante de la enzima codificada o puede introducirse un CBD de otro origen en la enzima para crear una enzima híbrida. En este contexto, el término "dominio de unión a celulosa" debe entenderse según la definición de Peter Tomme y col. "Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler y Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica más de 120 dominios de unión a celulosa distribuidos en 10 familias (I-X) y demuestra que los CBDs se encuentran en diferentes enzimas como celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetil esterasas o quitinasas. Los CBDs también se han encontrado en algas, p. ej., en el alga roja Porphyra purpurea, como una proteína de unión a polisacáridos no hidrolíticos (véase Tomme y col., op.cit.) Sin embargo, la mayoría de los CBDs proceden de celulasas y xilanasas y se encuentran en los N y C terminales de proteínas o son internos. Las enzimas híbridas son conocidas en la técnica (véase, p. ej., WO 90/00609 y WO 95/16782) y pueden prepararse mediante transformación en una célula huésped de una estructura ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio de unión a celulosa ligado, con o sin un conector, a una secuencia de ADN que codifica la enzima mananasa y cultivando la célula huésped para expresar el gen fusionado. Las enzimas híbridas pueden describirse mediante la siguiente fórmula:

CBD - MR - X

en donde CBD es la región N terminal o C terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos el dominio de unión a celulosa; MR es la región media (el conector) y puede ser un enlace, o un grupo de enlace corto preferiblemente de 2 a 100 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente de 2 a 100 aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región N terminal o C terminal de la enzima de la invención.

Las enzimas anteriormente mencionadas pueden tener cualquier origen adecuado como, p. ej., vegetal, animal, bacteriano, fúngico o de levadura. El origen también puede ser mesófilo o extremófilo (psicrófilo, psicrotrófico, termófilo, barófilo, alcalófilo, acidófilo o halófilo). Pueden utilizarse formas purificadas o no purificadas de estas enzimas. En la actualidad es práctica habitual modificar las enzimas salvajes mediante técnicas de ingeniería proteica o genética para optimizar su eficacia en las composiciones limpiadoras de la invención. Por ejemplo, las variantes puede diseñarse para aumentar la compatibilidad de la enzima con respecto a los ingredientes de uso común en estas composiciones. De forma alternativa, la variante puede ser diseñada de forma que el pH óptimo, la estabilidad del blanqueante o quelante y la actividad catalítica de la variante de la enzima se ajusten a la aplicación de limpieza en cuestión.

En particular, debe dedicarse especial atención a los aminoácidos sensibles a la oxidación para la estabilidad del blanqueante y en el caso de cargas superficiales para la compatibilidad del tensioactivo. Puede modificarse el punto isoeléctrico de estas enzimas sustituyendo algunos aminoácidos cargados de forma que, p. ej., un aumento del punto isoeléctrico puede ayudar a mejorar la compatibilidad con los tensioactivos aniónicos. La estabilidad de las enzimas también puede mejorarse creando, p. ej., puentes de sal adicionales para hacer que los sitios de unión a metales aumenten la estabilidad del quelante.

Proteasa

El segundo elemento esencial de las composiciones detergentes de la presente invención es una enzima proteasa.

Las proteasas adecuadas son las proteasas EC 3.4.-.- según la clasificación IUPAC, preferiblemente la endoproteasa serina EC 3.4.21.-, según la clasificación IUPAC y más preferiblemente las proteasas subtilisinas EC 3.4.21.62 según la clasificación IUPAC. Estas proteasas EC 3.4.21.62 son las subtilisinas que se obtienen de determinadas cepas de B. subtilis y B. licheniformis (subtilisinas BPN y BPN'). Una proteasa adecuada se obtiene de una cepa de Bacillus con una actividad máxima en el intervalo de pH 8-12, desarrollada y comercializada bajo el nombre comercial ESPERASE® por Novo Industries A/S, Dinamarca, en adelante "Novo". La preparación de esta enzima y de enzimas análogas se describe en el documento GB 1.243.784 de Novo. Otras proteasas adecuadas incluyen ALCALASE®, DURAZYM® y SAVINASE® de Novo y MAXATASE®, MAXACAL®, PROPERASE® y MAXAPEM® (proteína de ingeniería Maxacal) de Gist-Brocades. Las enzimas proteolíticas también abarcan serinproteasas bacterianas modificadas, como las descritas en la solicitud de patente europea EP 251 466, presentada el 28 de abril de 1987 (en especial las páginas 17, 24 y 98) y denominada en la presente memoria "proteasa B", y en la solicitud de patente europea 199.404, otorgada a Venegas el 29 de octubre de 1986, que se refiere a una enzima serina proteolítica bacteriana modificada, denominada en la presente memoria "proteasa A". Resulta adecuada la proteasa denominada en la presente memoria "proteasa C", que es una variante de una serinproteasa alcalina de Bacillus en la que la lisina sustituye a la arginina en la posición 27, la tirosina sustituye a la valina en la posición 104, la serina sustituye a la asparagina en la posición 123 y la alanina sustituye a la treonina en la posición 274. La proteasa C se describe en EP 451 244 correspondiente a WO 91/06637, publicada el 16 de mayo de 1991. Las variantes modificadas genéticamente, en especial de proteasa C, también se incluyen en la presente memoria.

Una proteasa preferida, en adelante "proteasa D" es una variante de la carbonil hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza y que se deriva de un precursor carbonil hidrolasa por sustitución de un aminoácido diferente por una pluralidad de restos aminoácido en una posición en dicha carbonil hidrolasa equivalente a la posición +76, preferiblemente también junto con una o más posiciones de residuos aminoácido equivalentes a las seleccionadas del grupo que consta de +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 según la numeración de Bacillus amiloliquefaciens subtilisina, según WO95/10591 y en la solicitud de patente de C. Ghosh, y col., "Bleaching Compositions Comprising Protease Enzymes" WO 95/10592, presentada el 13 de octubre de 1994. También resulta adecuada una variante carbonil hidrolasa de la proteasa descrita en WO95/10591 que tiene una secuencia de aminoácidos derivada por sustitución de una pluralidad de residuos aminoácido sustituídos en la enzima precursora en la posición +210 junto con uno o más de los siguientes residuos: +33, +62, +67, +76, +100, +101, +103, +104, +107, +128, +129, +130, +132, +135, +156, +158, +164, +166, +167, +170, +209, +215, +217, +218 y +222, en donde la posición numerada corresponde a la subtilisina natural de Bacillus amiloliquefaciens o a residuos aminoácido equivalentes en otras carbonil hidrolasas o subtilisinas tales como la subtilisina Bacillus lentus (solicitud de patente codependiente WO 98/55634, presentada el 4 de junio de 1997).

También adecuadas para la presente invención son las proteasas descritas en las solicitudes de patente EP 251 446 y WO 91/06637, la proteasa BLAP® descrita en WO91/02792 y sus variantes descritas en WO 95/23221.

Véase también una proteasa de Bacillus sp. NCIMB 40338 de pH elevado descrita en WO 93/18140 A concedida a Novo. Los detergentes enzimáticos que comprenden una proteasa, una o más de otras enzimas y un inhibidor reversible de la proteasa se encuentran descritos en WO 92/03529 A concedida a Novo. También se dispone de una proteasa con menor adsorción y mayor hidrólisis según WO 95/07791 concedida a Procter & Gamble. Una proteasa recombinante tipo tripsina para los detergentes adecuados de la presente invención se describen en WO 94/25583 concedida a Novo. Otras proteasas adecuadas se encuentran descritas en EP 516 200 concedida a Unilever.

Las enzimas proteolíticas se incorporan a las composiciones detergentes de la presente invención a un nivel del 0,0001% al 2%, preferiblemente del 0,001% al 0,2% y más preferiblemente del 0,005% al 0,1%, de enzima pura en peso de la composición.

Componentes detergentes

Las composiciones detergentes de la invención deben contener al menos un componente detergente adicional. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales y los niveles de incorporación de las mismas dependerán de la forma física de la composición y de la naturaleza de la operación de limpieza para la que van a ser utilizados.

Las composiciones detergentes de la presente invención preferiblemente comprenden también un ingrediente detergente seleccionado de un tensioactivo seleccionado, otra enzima, un aditivo reforzante de la detergencia y/o un sistema blanqueante.

Las composiciones detergentes según la invención pueden estar en forma de líquido, pasta, gel, pastilla, comprimido, pulverizador, espuma, polvo o gránulo. Las composiciones granuladas también pueden estar en forma "compacta" y las composiciones líquidas también pueden estar en forma "concentrada".

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición detergente que comprende una mananasa y una proteasa (ejemplos 1-16). En una segunda realización, la presente invención se refiere a composiciones detergentes para lavavajillas o para uso doméstico (ejemplos 17-22).

Las composiciones de la invención pueden, por ejemplo, estar formuladas como composiciones para lavado manual o automático de vajillas, composiciones detergentes para lavado a mano o en máquina incluidas composiciones de aditivo de lavado y composiciones adecuadas para su uso en el remojo y/o pretratamiento de tejidos manchados, composiciones suavizantes para el aclarado y composiciones para su uso en operaciones generales de limpieza de superficies rígidas del hogar.

Cuando las composiciones de la invención están formuladas como composiciones para su uso en métodos de lavado manual de vajillas preferiblemente contienen un tensioactivo y preferiblemente otros compuestos detergentes seleccionados de compuestos poliméricos orgánicos, reforzadores de espuma, iones de metales del grupo II, disolventes, hidrótropos y enzimas adicionales.

Cuando las composiciones de la invención están formuladas como composiciones adecuadas para su uso en un método para lavado en lavadora, preferiblemente contienen un tensioactivo y un aditivo reforzante de la detergencia y además uno o más componentes detergentes preferiblemente seleccionados de compuestos poliméricos orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, antiespumantes, dispersantes, dispersantes de jabón de cal, suspensores de manchas y agentes anti-redeposición e inhibidores de la corrosión. Las composiciones de lavado también pueden contener suavizantes como componentes detergentes adicionales. Estas composiciones que contienen una mananasa y una proteasa pueden proporcionar limpieza de tejidos, eliminación de manchas y conservación de la blancura cuando se formulan como composiciones detergentes para lavado.

Las composiciones de la invención también pueden ser utilizadas como aditivos detergentes en forma sólida o líquida. Estos aditivos pretenden complementar o mejorar el rendimiento de las composiciones detergentes convencionales y pueden ser añadidos en cualquier fase del proceso de limpieza.

En caso necesario, la densidad de las composiciones detergentes de la presente invención es de 400 a 1200 g/litro, preferiblemente de 500 a 950 g/litro, de composición medida a 20ºC.

La forma "compacta" de las composiciones de la presente invención queda reflejada de forma óptima por la densidad y, en términos de composición, por la cantidad de diluyente inorgánico. Los diluyentes inorgánicos son ingredientes convencionales de composiciones detergentes en polvo; en las composiciones detergentes convencionales los diluyentes están presentes en cantidades importantes, de forma típica del 17 al 35% en peso de la composición total. En las composiciones compactas, el diluyente está presente en cantidades que no superan el 15% de la composición total, más preferiblemente que no superan el 10% y con máxima preferencia que no superan el 5% en peso de la composición. Los diluyentes inorgánicos, como los utilizados en las presentes composiciones, se seleccionan de las sales de metales alcalinos y alcalinotérros de sulfatos y cloruros. Un diluyente preferido es el sulfato
sódico.

Las composiciones líquidas detergentes según la presente invención también pueden estar en "forma concentrada", en cuyo caso las composiciones líquidas detergentes según la presente invención contendrán una cantidad de agua inferior a la de los detergentes líquidos convencionales. De forma típica el contenido de agua del detergente líquido concentrado es preferiblemente inferior al 40%, más preferiblemente inferior al 30% y con máxima preferencia inferior al 20%, en peso de la composición detergente.

Los compuestos detergentes adecuados de uso en la presente invención se seleccionan del grupo que consta de los compuestos que figuran a continuación:

Sistema tensioactivo

Las composiciones detergentes según la presente invención generalmente comprenden un sistema tensioactivo en donde el tensioactivo puede ser seleccionado de tensioactivos no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o de ión híbrido y/o semi-polares. Preferiblemente, las composiciones detergentes de la presente invención comprenderán un tensioactivo no iónico, un tensioactivo aniónico y/o un tensioactivo catiónico.

Se ha descubierto de forma sorprendente que la composición detergente de la presente invención que también comprende un tensioactivo no iónico, un tensioactivo aniónico y/o un tensioactivo catiónico, mejora la capacidad de eliminación de manchas.

Aún no habiéndose comprobado teóricamente, se cree que la hidrólisis enzimática produce pequeñas partículas que son más fácilmente eliminadas por los tensioactivos no iónicos que se sabe actúan sobre la suciedad en forma de partículas. Los tensioactivos no iónicos preferidos son el alquil etoxilato AE3-AE7. También se cree que la combinación del tensioactivo catiónico eficaz para los tejidos y la hidrólisis de las enzimas combinadas proporciona un mayor rendimiento.

El tensioactivo está de forma típica presente a un nivel del 0,1% al 60% en peso. Los niveles de incorporación más preferidos son del 1% al 35% en peso y con máxima preferencia del 1% al 30% en peso de las composiciones detergentes según la invención.

El tensioactivo se formula preferiblemente para que sea compatible con los componentes enzimáticos presentes en la composición. En las composiciones líquidas o en gel, el tensioactivo está con máxima preferencia formulado de forma que favorezca, o al menos no degrade, la estabilidad de cualquier enzima en estas composiciones.

Tensioactivos no iónicos

Los condensados de polietileno, polipropileno y óxido de polibutileno de los alquil fenoles son adecuados para su uso como el tensioactivo no iónico de los sistemas tensioactivos de la presente invención, siendo los condensados de óxido de polietileno los preferidos. Estos compuestos incluyen los productos de condensación de alquil fenoles que tienen un grupo alquilo con de 6 a 14 átomos de carbono y preferiblemente de 8 a 14 átomos de carbono, en una configuración de cadena lineal o ramificada con el óxido de alquileno. En una realización preferida, el óxido de etileno está presente en una cantidad de 2 a 25 moles, más preferiblemente de 3 a 15 moles, de óxido de etileno por mol de alquil fenol. Los tensioactivos no iónicos comerciales de este tipo incluyen Igepal^{TM} CO-630, comercializado por GAF Corporation; y Triton^{TM} X-45, X-114, X-100 y X-102, comercializados todos ellos por Rohm & Haas Company. Estos tensioactivos se denominan normalmente alquilfenol alcoxilatos (p. ej., alquil fenol etoxilatos).

Los productos de condensación de los alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de 1 a 25 moles de óxido de etileno son adecuados para su uso como el tensioactivo no iónico de los sistemas de tensioactivos no iónicos de la presente invención. La cadena alquílica del alcohol alifático puede ser lineal o ramificada, primaria o secundaria y, generalmente contiene de 8 a 22 átomos de carbono. Resultan preferidos los productos de condensación de alcoholes con un grupo alquilo que contiene de 8 a 20 átomos de carbono y más preferiblemente de 10 a 18 átomos de carbono, y con de 2 a 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol. Dichos productos de condensación contienen de 2 a 7 moles de óxido de etileno, y con máxima preferencia de 2 a 5 moles de óxido de etileno, por mol de alcohol. Ejemplos de tensioactivos no iónicos comerciales de este tipo incluyen Tergitol^{TM} 15-S-9 (producto de condensación del alcohol C_{11}-C_{15} lineal con 9 moles de óxido de etileno), Tergitol^{TM} 24-L-6 NPM (producto de condensación del alcohol primario C_{12}-C_{14} con 6 moles de óxido de etileno y una distribución reducida de peso molecular), ambos comercializados por Union Carbide Corporation; Neodol^{TM} 45-9 (producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 23-3 (producto de condensación del alcohol lineal C_{12}-C_{13} con 3,0 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 45-7 (producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15} con 7 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 45-5 (producto de condensación del alcohol lineal C_{14}-C_{15} con 5 moles de óxido de etileno) comercializados por Shell Chemical Company, Kyro^{TM} EOB (producto de condensación del alcohol C_{13}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno), comercializado por The Procter & Gamble Company y Genapol LA O3O o O5O (producto de condensación del alcohol C_{12}-C_{14} con 3 ó 5 moles de óxido de etileno) comercializado por Hoechst. El intervalo de HLB preferido en estos productos es de 8-11 y el más preferido de 8-10.

También útiles para su uso como el tensioactivo no iónico del sistema tensioactivo de la presente invención son los alquilpolisacáridos descritos en la patente de EE.UU. núm. 4.565.647, otorgada a Llenado el 21 de enero de 1986, que tiene un grupo hidrófobo con de 6 a 30 átomos de carbono y preferiblemente de 10 a 16 átomos de carbono, y un polisacárido, p. ej., un poliglicósido, grupo hidrófilo que contiene de 1,3 a 10, preferiblemente de 1,3 a 3 y con máxima preferencia de 1,3 a 2,7, unidades sacárido. Puede utilizarse cualquier sacárido reductor que contenga 5 ó 6 átomos de carbono y, p. ej., los restos glucosa, galactosa y galactosil pueden sustituirse por restos glucosil (opcionalmente el grupo hidrófobo está unido en las posiciones 2, 3, 4 proporcionando una glucosa o galactosa como contraposición a un glucósido o galactósido). Los enlaces entre sacáridos pueden estar, por ejemplo, entre la posición 1 de las unidades sacárido adicionales y las posiciones 2, 3, 4 y/o 6 en las unidades sacárido precedentes.

Los alquilpoliglicósidos preferidos tienen la fórmula:

R^{2}O(C_{n}H_{2n}O)_{t}(glicosilo)_{x}

en donde R^{2} se selecciona del grupo que consta de alquil, alquilfenil, hidroxialquil, hidroxialquilfenil y mezclas de los mismos en los que los grupos alquilo contienen de 10 a 18, preferiblemente de 12 a 14, átomos de carbono; n es 2 ó 3, preferiblemente 2; t es de 0 a 10, preferiblemente 0; y x es de 1,3 a 10, preferiblemente de 1,3 a 3 y con máxima preferencia de 1,3 a 2,7. El glicosilo está preferiblemente derivado de la glucosa. Para preparar estos compuestos se forma primero el alcohol o el alquilpolietoxi-alcohol y luego se hace reaccionar este con glucosa o con una fuente de glucosa para obtener el glucósido (unión en la posición 1). Las unidades glicosilo adicionales pueden unirse entonces entre su posición 1 y las posiciones 2, 3, 4 y/o 6 de las unidades glicosilo precedentes, preferible y predominantemente en la posición 2.

Los productos de condensación del óxido de etileno con una base hidrófoba formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol resultan también adecuados para su uso como sistemas adicionales de tensioactivo no iónico de la presente invención. La porción hidrófoba de estos compuestos tendrá preferiblemente un peso molecular de 1500 a 1800 y será insoluble en agua. La adición de restos de polioxietileno a esta porción hidrófoba tiende a aumentar la solubilidad en agua de la molécula en su conjunto conservándose el carácter líquido del producto hasta el punto en que el contenido de polioxietileno es aproximadamente el 50% del peso total del producto de condensación, lo que equivale a una condensación de hasta 40 moles de óxido de etileno. Los ejemplos de compuestos de este tipo incluyen algunos tensioactivos comerciales Plurafac^{TM} LF404 y Pluronic^{TM}, comercializados por BASF.

También adecuados para su uso como el tensioactivo no iónico del sistema tensioactivo no iónico de la presente invención son los productos de condensación del óxido de etileno y el producto resultante de la reacción entre óxido de propileno y etilendiamina. El resto hidrófobo de estos productos consta del producto de reacción entre la etilendiamina y el exceso de óxido de propileno y generalmente tiene un peso molecular de 2500 a 3000. Este resto hidrófobo se condensa con óxido de etileno hasta el punto en que el producto de condensación contiene del 40% al 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso molecular de 5.000 a 11.000. Ejemplos de este tipo de tensioactivo no iónico incluyen algunos de los compuestos comerciales Tetronic^{TM}, comercializados por BASF.

Para su uso como el tensioactivo no iónico del sistema tensioactivo de la presente invención resultan preferidos los condensados de óxido de polietileno de alquil fenoles, los productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de 1 a 25 moles de óxido de etileno, los alquilpolisacáridos y mezclas de los mismos. Los más preferidos son los alquil C_{8}-C_{14} fenol etoxilatos que tienen de 3 a 15 grupos etoxi y los alcohol C_{8}-C_{18} etoxilados (preferiblemente C_{10} de media) que tienen de 2 a 10 grupos etoxi, y mezclas de los mismos.

Los tensioactivos no iónicos más preferidos son los tensioactivos de polihidroxiamida de ácidos grasos de la fórmula:

R^{2} ---

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--- Z,

en donde R^{1} es H, o R^{1} es C_{1-4} hidrocarbil, 2-hidroxi etil, 2-hidroxi propil o una mezcla de los mismos, R^{2} es hidrocarbil C_{5-31}, y Z es un polihidroxihidrocarbilo que tiene una cadena hidrocarbilo lineal con al menos 3 hidroxilos unidos directamente a la cadena, o un derivado alcoxilado de los mismos. Preferiblemente, R^{1} es metilo, R^{2} es una cadena lineal alquil C_{11-15} o alquil o alquenil C_{16-18} tales como coco alquil o mezclas de los mismos y Z procede de un azúcar reductorcomo glucosa, fructosa, maltosa o lactosa en una reacción de aminación reductora.

Tensioactivos aniónicos

Los tensioactivos aniónicos preferidos para el fin de la presente invención son los tensioactivos tipo alquil éster sulfatos y tipo alquilbenceno lineales. Los tensioactivos aniónicos adecuados para su uso en la presente invención son los tensioactivos de tipo sulfonato de alquilbenceno y alquil éster sulfonato lineales incluidos los ésteres lineales de ácidos carboxílicos C_{8}-C_{20} (es decir, ácidos grasos) sulfonados con SO_{3} gaseoso según "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), pp. 323-329. Las materias primas adecuadas incluyen sustancias grasas naturales como las derivadas de sebo o aceite de palmiste.

Los tensioactivos de tipo alquil éster sulfonato preferidos, especialmente para las aplicaciones de lavado, comprenden tensioactivos de tipo alquil éster sulfonato de la fórmula estructural siguiente:

R^{3} ---

\delm{C}{\delm{\para}{SO _{3} M}}

H --–

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OR^{4}

en donde R^{3} es un C_{8}-C_{20} hidrocarbilo, preferiblemente un alquilo, o combinaciones de los mismos, R^{4} es un C_{1}-C_{6} hidrocarbilo, preferiblemente un alquilo, o combinaciones de los mismos y M es un catión que forma una sal soluble en agua con el alquil éster sulfonato. Los cationes formadores de sales adecuados incluyen metales tales como sodio, potasio y litio y cationes amonio sustituidos o no sustituidos tales como monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina. Preferiblemente, R^{3} es alquil C_{10}-C_{16} y R^{4} es metilo, etilo o isopropilo. Especialmente preferidos son los ésteres metilsulfonato, en donde R^{3} es alquil C_{10}-C_{16}.

Otros tensioactivos aniónicos adecuados incluyen los tensioactivos de tipo alquilsulfato que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula ROSO_{3}M en donde R preferiblemente es un C_{10}-C_{24} hidrocarbilo, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente alquil C_{10}-C_{20}, más preferiblemente un alquil o hidroxialquil C_{12}-C_{18} y M es H o un catión, p. ej., un catión de metales alcalinos (p. ej., sodio, potasio, litio), o cationes amonio o amonio sustituido (p. ej., cationes metilamonio, dimetil amonio y trimetil amonio y cationes amonio cuaternarios tales como cationes tetrametil-amonio y dimetil piperidinio y cationes amonio cuaternarios derivados de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina y mezclas de los mismos). De forma típica, las cadenas alquílicas de C_{12}-C_{16} son las preferidas para temperaturas de lavado bajas (p. ej., inferiores a aproximadamente 50ºC) y las cadenas alquílicas C_{16-18} son las preferidas para temperaturas de lavado altas (p. ej., superiores a aproximadamente 50ºC).

En las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluirse otros tensioactivos aniónicos útiles para los fines detersivos. Estos pueden incluir sales (por ejemplo, de sodio, potasio, amonio y sales de amonio sustituido tales como sales de monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos C_{8}-C_{22} primarios o secundarios, olefinsulfonatos C_{8}-C_{24}, ácidos policarboxílicos sulfonados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metales alcalinotérreos, p. ej., según la especificación de la patente británica 1.082.179, alquil C_{8}-C_{24} poliglicolétersulfatos (que contienen hasta 10 moles de óxido de etileno); alquil glicerol sulfonatos, acil glicerol sulfonatos grasos, oleil glicerol sulfatos grasos, éter sulfúrico del alquil fenol óxido de etileno, sulfonatos de parafina, alquil fosfatos, isetionatos tales como los acil isetionatos, N-acil tauratos, alquil succinamatos y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente monoésteres C_{12}-C_{18} saturados e insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente diésteres C_{6}-C_{12}saturados e insaturados), acil sarcosinatos, sulfatos de alquilpolisacáridos tales como los sulfatos de alquilpoliglucósido (los compuestos no iónicos no sulfatados se describen más adelante), alquilsulfatos primarios ramificados y alquil polietoxi carboxilatos tales como los de la fórmula RO(CH_{2}CH_{2}O)_{k}-CH_{2}COO-M+ en donde R es un alquil C_{8}-C_{22}, k es un entero de 1 a 10 y M es un catión soluble formador de sales. También resultan adecuados los ácidos resínicos y los ácidos resínicos hidrogenados tales como la colofonia, la colofonia hidrogenada, los ácidos resínicos y los ácidos resínicos hidrogenados presentes en el tall-oil (aceite de coníferas) o derivados de éste.

Otros ejemplos se encuentran descritos en "Surface Active Agents and Detergents" (Vol. I y II, der Schwartz, Perry y Berch). Varios de dichos tensioactivos también se describen de manera general en la patente de EE.UU. núm. 3.929.678, concedida el 30 de diciembre de 1975 a Laughlin y col., desde la columna 23, línea 58, hasta la columna 29, línea 23.

Si están incluidas, las composiciones detergentes de la presente invención de forma típica comprenden del 1% al 40% y preferiblemente del 3% al 20%, en peso de estos tensioactivos aniónicos.

Los tensioactivos aniónicos muy preferidos incluyen los de tipo sulfato alquil alcoxilado que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula RO(A)_{m}SO3M en donde R es un grupo alquil o hidroxialquil C_{10}-C_{24} no sustituido que tiene un componente alquil C_{10}-C_{24}, preferiblemente un grupo alquil o hidroxialquil C_{12}-C_{20} y más preferiblemente un grupo alquil o hidroxialquil C_{12}-C_{18}, A es una unidad etoxi o propoxi, m es un número mayor de cero, de forma típica de 0,5 a 6, más preferiblemente de 0,5 a 3 y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión de metal (p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio) o un catión amonio o amonio sustituido En la presente memoria se contemplan alquilsulfatos etoxilados así como alquilsulfatos propoxilados. Ejemplos específicos de cationes amonio sustituido incluyen cationes metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio y cationes amonio cuaternario tales como cationes tetrametilamonio y dimetil piperdinio y los derivados de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina y mezclas de los mismos. Ejemplos de tensioactivos son alquil C_{12}-C_{18} polietoxilato (1.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(1.0)M), alquil C_{12}-C_{18} polietoxilato (2.25) sulfato (C_{12}-C_{18}E(2.25)M), alquil C_{12}-C_{18} polietoxilato (3.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(3.0)M) y alquil C_{12}-C_{18} polietoxilato (4.0) sulfato (C_{12}-C_{18}E(4.0)M), en donde M se selecciona adecuadamente de sodio y potasio.

Tensioactivos catiónicos

Los tensioactivos detersivos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones detergentes de la presente invención son aquellos que tienen un grupo hidrocarbilo de cadena larga. Ejemplos de estos tensioactivos catiónicos incluyen los tensioactivos de tipo amonio tales como los halogenuros de alquiltrimetilamonio y los tensioactivos que tienen la fórmula:

[R^{2}(OR^{3})_{y}][R^{4}(OR^{3})_{y}]_{2}R^{5}N+X-

en donde R^{2} es un grupo alquilo o alquilbencilo que tiene de 8 a 18 átomos de carbono en la cadena alquílica, cada R^{3} se selecciona del grupo que consta de -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})-, -CH_{2}CH(CH_{2}OH)-, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}- y mezclas de los mismos; cada R^{4} se selecciona del grupo que consta de alquil C_{1}-C_{4}, hidroxialquil C_{1}-C_{4}, estructuras de anillo bencílico formadas por la unión de dos grupos R^{4}, -CH_{2}CHOH-CHOHCOR^{6}CHOHCH_{2}OH en donde R^{6} es cualquier hexosa o polímero de hexosa que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 e hidrógeno cuando y no es 0; R^{5} es el mismo que R^{4} o es un cadena alquílica en donde el número total de átomos de carbono de R^{2} más R^{5} no es más de aproximadamente 18; cada y es de 0 a 10 y la suma de los valores y es de 0 a 15; y X es cualquier anión compatible.

Los tensioactivos de tipo amonio cuaternario adecuados para la presente invención tienen la fórmula (I):

1

en donde R_{1} es un alquil (C_{6}-C_{10}) o alquilamidoalquil de cadena corta de la fórmula (II):

2

y es de 2 a 4, preferiblemente 3,

en donde R_{2} es H o un alquil C_{1}-C_{3},

en donde x es de 0 a 4, preferiblemente de 0 a 2 y con máxima preferencia 0,

en donde R_{3}, R_{4} y R_{5} son iguales o diferentes y pueden ser un alquil (C1-C3) o un alquil alcoxilado de cadena corta de la fórmula III,

en donde X^{-} es un contraión, preferiblemente un haluro, p. ej., cloruro o metilsulfato.

3

R_{6} es C_{1}-C_{4} y z es 1 ó 2.

Los tensioactivos de tipo amonio cuaternario preferidos son aquellos definidos por la fórmula I en donde

R_{1} es C_{8}, C_{10} o mezclas de los mismos, x=o,

R_{3}, R_{4} = CH_{3} y R_{5} = CH_{2}CH_{2}OH.

Los tensioactivos catiónicos altamente preferidos son los compuestos amónicos cuaternarios hidrosolubles útiles en la presente composición que tienen la fórmula:

(i)R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}N^{+}X^{-}

en donde R_{1} es alquil C_{8}-C_{16}, cada uno de R_{2}, R_{3} y R_{4} son, independientemente entre sí, alquil C_{1}-C_{4}, hidroxi alquil C_{1}-C_{4}, bencilo y -(C_{2}H_{40})_{x}H en donde x tiene un valor de 2 a 5 y X es un anión. No más de uno de R_{2}, R_{3} o R_{4} puede ser bencilo.

La longitud de cadena alquílica preferida para R_{1} es C_{12}-C_{15}, en especial cuando el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivadas de aceite de coco o de palmiste o está derivado se ha obtenido de forma sintética por acumulación de olefinas o alcoholes OXO. Los grupos preferidos para R_{2}, R_{3} y R_{4} son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X puede ser seleccionado de iones haluro, metosulfato, acetato y fosfato.

Ejemplos de compuestos amónicos cuaternarios adecuados de fórmula (i) de uso en la presente invención son:

cloruro o bromuro de coco trimetil amonio;

cloruro o bromuro de coco metil dihidroxietil amonio;

cloruro de decil trietil amonio;

cloruro o bromuro de decil dimetil hidroxietil amonio;

cloruro o bromuro de C_{12-15} dimetil hidroxietil amonio;

cloruro o bromuro de coco dimetil hidroxietil amonio;

metilsulfato de miristil trimetil amonio;

cloruro o bromuro de lauril dimetil bencil amonio;

cloruro o bromuro de lauril dimetil (etenoxi)_{4} amonio;

ésteres de colina (compuestos de fórmula (i) en donde R_{1} es alquil CH_{2}-CH_{2}-O-C-

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

_{12-14} y R_{2}R_{3}R_{4} son metilo). Dialquil imidazolinas [compuestos de fórmula (i)]

Otros tensioactivos catiónicos útiles en la presente invención se describen también en la patente de EE.UU. núm. 4.228.044, otorgada el 14 de octubre de 1980 a Cambre, y en la solicitud de patente europea EP 000.224.

Los componentes catiónicos suavizantes de tejidos típicos incluyen sustancias activas suavizantes de tejidos a base de amonio cuaternario insolubles en agua o su correspondiente precursor amina, siendo los más generalmente utilizados el cloruro amónico con doble cadena alquílica larga o el metil sulfato.

De estos, los suavizantes catiónicos preferidos incluyen los siguientes:

1)

\;

dicloruro de dimetilamonio de sebo (DTDMAC);

2)

\;

cloruro de dimetilamonio de sebo dihidrogenado;

3)

\;

dimetilamonio metilsulfato de sebo dihidrogenado;

4)

\;

cloruro de diestearil dimetilamonio;

5)

\;

cloruro de dioleil dimetilamonio;

6)

\;

cloruro de dipalmitil hidroxietil metil amonio;

7)

\;

cloruro de estearil bencil dimetilamonio;

8)

\;

cloruro de trimetilamonio de sebo;

9)

\;

cloruro de trimetilamonio de sebo hidrogenado;

10)

\;

cloruro de alquil C_{12}-_{14} hidroxietil dimetilamonio;

11)

\;

cloruro de alquil C_{12-18} dihidroxietil metil amonio;

12)

\;

cloruro de di(estearoiloxietil) dimetilamonio (DSOEDMAC);

13)

\;

cloruro de di(sebo-oxi-etil) dimetilamonio;

14)

\;

metilsulfato de disebo imidazolinio;

15)

\;

metilsulfato de 1-(2-seboilamidoetil)-2-seboil imidazolinio.

Se han presentado los compuestos amónicos cuaternarios biodegradables como alternativas a los cloruros amónicos de doble cadena alquílica larga y los metil sulfatos tradicionalmente utilizados. Estos compuestos amónicos cuaternarios contienen grupos alqu(en)ilo de cadena larga interrumpidos por grupos funcionales tales como grupos carboxilo. Los productos y composiciones suavizantes de tejidos que los contienen se describen en numerosas publicaciones como, p. ej., EP-A-0.040.562 y EP-A-0.239.910.

Los compuestos amónicos cuaternarios y precursores de amina de la presente invención tienen las fórmulas (I) o (II) siguientes:

4

en donde Q se selecciona de -O-C(O)-, -C(O)-O-, -O-C(O)-O-, -NR^{4}-C(O)-, -C(O)-NR^{4}-;

R^{1} es (CH_{2})_{n}-Q-T^{2} o T^{3};

R^{2} es (CH_{2})_{m}-Q-T^{4} o T^{5} o R^{3};

R^{3} es alquil C_{1}-C_{4} o hidroxialquil C_{1}-C_{4} o H;

R^{4} es H o alquil C_{1}-C_{4} o hidroxialquil C_{1}-C_{4};

T^{1}, T^{2}, T^{3}, T^{4}, T^{5} son, independientemente entre sí, alquil o alquenil C_{11}-C_{22};

n y m son enteros de 1 a 4; y

X^{-} es un anión compatible con el suavizante. Entre los ejemplos no limitativos de aniones compatibles con el suavizante se incluyen el cloruro o el metil sulfato.

La cadena alquilo o alquenilo T^{1}, T^{2}, T^{3}, T^{4}, T^{5} debe contener al menos 11 átomos de carbono y preferiblemente al menos 16 átomos de carbono. La cadena puede ser lineal o ramificada. El sebo es una fuente adecuada y económica de compuestos alquilo y alquenilo de cadena larga. Los compuestos en donde T^{1}, T^{2}, T^{3}, T^{4}, T^{5} representan la mezcla de compuestos de cadena larga de sebo son los especialmente preferidos.

Ejemplos específicos de compuestos amónicos cuaternarios adecuados para su uso en las composiciones acuosas suavizantes de tejidos de la presente invención incluyen:

1)

\;

cloruro de N,N-di(seboil-oxi-etil)-N,N-dimetil amonio;

2)

\;

N,N-di(seboil-oxi-etil)-N-metil, N-(2-hidroxietil) amonio metil sulfato;

3)

\;

cloruro de N,N-di(2-seboil-oxi-2-oxo-etil)-N,N-dimetil amonio;

4)

\;

cloruro de N,N-di(2-seboil-oxi-etilcarbonil-oxi-etil)-N,N-dimetil amonio;

5)

\;

cloruro de N-(2-seboil-oxi-2-etil)-N-(2-seboil-oxi-2-oxo-etil)-N,N-dimetil amonio;

6)

\;

cloruro de N,N,N-tri(seboil-oxi-etil)-N-metil amonio;

7)

\;

cloruro de N-(2-seboil-oxi-2-oxo-etil)-N-(seboil-N,N-dimetil-amonio y

8)

\;

cloruro de 1,2-diseboil-oxi-3-trimetilamonio propano;

y mezclas de cualquiera de los productos anteriores.

Si están incluidos, las composiciones detergentes de la presente invención comprenden de forma típica del 0,2% al 25%, preferiblemente del 1% al 8%, en peso de estos tensioactivos catiónicos.

Agente blanqueador

Se ha descubierto de forma sorprendente que las composiciones detergentes de la presente invención que también comprenden un agente blanqueador, especialmente un sistema activador del efecto blanqueador, mejoran la eliminación de manchas y suciedad de alimentos, facilitan la limpieza de zonas negruzcas y conservan la blancura. Aún no habiéndose comprobado teóricamente, se cree que las partículas cromóforas más pequeñas resultantes de la hidrólisis de enzimas combinadas son más fácilmente atacadas por los sistemas de activación del blanqueado, especialmente a baja temperatura.

Estos agentes blanqueadores incluyen peróxido de hidrógeno, PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de partícula de 400-800 micras. Estos componentes blanqueadores pueden incluir uno o más agentes blanqueadores liberadores de oxígeno y, dependiendo del agente blanqueador elegido, uno o más activadores del efecto blanqueador. Si están presentes, los compuestos blanqueadores liberadores de oxígeno estarán presentes de forma típica a niveles del 1% al 25%.

El componente blanqueador de uso en la presente invención puede ser cualquiera de los agentes blanqueadores útiles para composiciones detergentes, incluidos los blanqueadores liberadores de oxígeno así como otros conocidos en la técnica. El agente blanqueador adecuado en la presente invención puede ser un agente blanqueador activado o no activado.

Una clase de agentes blanqueadores liberadores de oxígeno de uso en la presente invención abarca los agentes blanqueadores a base de ácido percarboxílico y las sales de los mismos. Ejemplos adecuados de esta clase de agentes incluyen el monoperoxiftalato de magnesio hexahidrato la sal magnésica del ácido meta-cloro perbenzoico, el ácido 4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico y el ácido diperoxidodecanodioico. Estos agentes blanqueadores se describen en la patente de EE.UU. núm. 4.483.781, la solicitud de patente US-740.446, la solicitud de patente europea 0.133.354 y la patente de EE.UU. núm. 4.412.934. Entre los agentes blanqueadores altamente preferidos también se incluye el ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico, descrito en la patente de EE.UU. núm. 4.634.551.

Otra categoría de agentes blanqueadores de uso en la presente invención abarca los agentes blanqueadores con halógeno. Ejemplos de agentes blanqueadores con hipohalito incluyen, por ejemplo, el ácido tricloro isocianúrico, los dicloroisocianuratos de sodio y potasio y las N-cloroalcano sulfonamidas y las N-bromo alcanosulfonamidas. Estos productos se añaden normalmente del 0,5% al 10% en peso y preferiblemente del 1% al 5% en peso del producto terminado.

Los agentes liberadores de peróxido de hidrógeno pueden utilizarse junto con activadores del efecto blanqueador tales como la tetraacetiletilendiamina (TAED), el nonanoiloxibenceno-sulfonato (NOBS, descrito en de EE.UU. núm. 4.412.934), el 3,5,-trimetilhexanoloxibencenosulfonato (ISONOBS, descrito en EP 120.591), la pentaacetilglucosa (PAG) o el éster fenolsulfonato del ácido N-nonanoil-6-aminocaproico (NACA-OBS, descrito en WO94/28106), que son perhidrolizados para formar un perácido que actúa como el blanqueador activo proporcionando un mejor efecto blanqueador. Activadores también adecuados son los ésteres acilados del ácido cítrico y una imida acíclica asimétrica activadora del efecto blanqueador de la fórmula siguiente (según la solicitud de patente codependiente WO98/04664 de Procter & Gamble):

5

en donde R_{1} es un grupo alquil C_{7}-C_{13} de cadena lineal o ramificada, saturado o no saturado, R_{2} es un grupo alquil C_{1}-C_{8}, de cadena lineal o ramificada, saturado o no saturado y R_{3} es un grupo alquil C_{1}-C_{4} de cadena lineal o ramificada, saturado o no saturado.

Agentes blanqueadores útiles, incluidos los peroxiácidos y sistemas de blanqueado que comprenden activadores del efecto blanqueador y los compuestos blanqueadores peroxigenados para su uso en composiciones detergentes según la invención, se encuentran descritos en nuestras solicitudes codependientes EP 723 580, WO97/00937, WO95/27772, WO95/27773, WO95/27774 y WO95/27775.

El peróxido de hidrógeno también puede estar presente si se añade un sistema enzimático (es decir, una enzima y un sustrato para la misma) capaces de generar peróxido de hidrógeno al comienzo o durante el proceso de lavado y/o aclarado. Estos sistemas enzimáticos se describen en la solicitud de patente EP 537 381 presentada el 9 de octubre de 1991.

Los catalizadores que contienen metales para su uso en las composiciones blanqueadoras incluyen catalizadores que contienen cobalto, tales como las sales de acetato de pentaamina de cobalto(III), y los catalizadores que contienen manganeso, como los descritos en EPA 549 271, EPA 549 272, EPA 458 397, US-5.246.621, EPA 458 398, US-5.194.416 y US-5.114.611. Una composición blanqueadora que comprende un compuesto peroxi, un catalizador blanqueante que contiene manganeso y un agente quelante se describe en la solicitud de patente EP 718 398.

Agentes blanqueadores distintos de los agentes blanqueadores oxigenados también son conocidos por la técnica y pueden ser utilizados en la presente invención. Un tipo de agente blanqueador no oxigenado de especial interés son los agentes blanqueadores fotoactivados tales como las ftalocianinas de zinc y/o de aluminio sulfonadas. Estos productos pueden ser depositados en el sustrato durante el proceso de lavado. Tras la irradiación con luz, en presencia de oxígeno, como, p. ej., colgando las prendas a secar al aire libre, el ftalocianuro de zinc sulfonado es activado y, por tanto, el sustrato es blanqueado. El ftalocianuro de zinc y un proceso blanqueante fotoactivado preferidos se encuentran descritos en la patente de EE.UU. núm. 4.033.718. De forma típica, las composiciones detergentes contendrán del 0,025% al 1,25% en peso de ftalocianuro de zinc sulfonado.

Sistema de aditivo reforzante de la detergencia

Las composiciones detergentes de la presente invención comprenderán preferiblemente un aditivo reforzante de la detergencia, más preferiblemente zeolita, un silicato sódico laminar y/o un tripolifosfato sódico. Se ha descubierto de forma sorprendente que la composición detergente de la presente invención que también comprende un aditivo reforzante de la detergencia proporciona un mejor rendimiento de limpieza. Aún no habiéndose comprobado teóricamente, se cree que la incrustación de calcio sobre las manchas que contienen gomas hidrocoloides limita la hidrólisis enzimática. Por tanto, se espera que el uso de un aditivo reforzante de la detergencia elimine el calcio atrapado y favorezca la acción de la combinación de enzimas de la presente invención.

Cualquier sistema de aditivo reforzante de la detergencia convencional es adecuado para el uso en la presente invención, incluidos los productos de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos, ácido alquil succínico o ácido alquenil succínico y ácidos grasos, productos tales como etilendiamino-tetraacetato, dietilentriamino-pentametilenacetato, secuestrantes de iones de metal tales como aminopolifosfonatos, en especial ácido etilendiamino-tetrametilen fosfónico y ácido dietilentriamino-pentametilen fosfónico. En la presente invención también pueden utilizarse aditivos reforzantes de fosfato.

Los aditivos reforzantes de la detergencia adecuados pueden ser un producto inorgánico de intercambio iónico, generalmente un producto inorgánico de aluminosilicato hidratado, más en especial una zeolita sintética hidratada como la zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP.

Otro aditivo reforzante inorgánico adecuado es el silicato laminar, p. ej., SKS-6 (Hoechst). SKS-6 es un silicato laminar cristalino que consta de silicato sódico (Na_{2}Si_{2}O_{5}).

Los policarboxilatos adecuados que contienen un grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólico y derivados éter de los mismos como los descritos en las patentes belgas 831.368, 821.369 y 821.370. Los policarboxilatos que contienen dos grupos carboxi incluyen las sales hidrosolubles del ácido succínico, ácido malónico, ácido (etilendioxi) diacético, ácido maleico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico, así como los éteres carboxílicos descritos en las patentes alemanas 2.446.686 y 2.446.687 y en la patente de EE.UU. núm. 3.935.257 y los sulfinil carboxilatos descritos en la patente belga 840,623. Los policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi incluyen, en particular, citratos, aconitratos y citraconatos hidrosolubles así como derivados succinato tales como el carboximetiloxisuccinato descrito en la patente británica 1.379.241, lactoxisuccinatos descritos en la solicitud de patente holandesa 7205873 y los oxipolicarboxilatos tales como los 2-oxa-1,1,3-propano tricarboxilatos descritos en la patente británica 1.387.447.

Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos carboxi incluyen los oxidisuccinatos descritos en la patente británica 1.261.829, los 1,1,2,2-etano tetracarboxilatos, los 1,1,3,3-propano tetracarboxilatos y los 1,1,2,3-propano tetracarboxilatos. Los policarboxilatos que contienen sustituyentes sulfo incluyen los derivados sulfosuccinato descritos en las patentes británicas núms. 1.398.421 y 1.398.422 y en la patente de EE.UU. núm. 3.936.448 y los citratos pirolizados sulfonados descritos en la patente británica 1.082.179, mientras que los policarboxilatos que contienen sustituyentes fosfona se describen en la patente británica 1.439.000.

Los policarboxilatos alicíclicos y heterocíclicos incluyen ciclopentano-cis,cis,cis-tetracarboxilatos, ciclopentadienido-pentacarboxilatos, 2,3,4,5-tetrahidro-furan-cis,cis,cis-tetracarboxilatos, 2,5-tetrahidro-furan-cis-dicarboxilatos, 2,2,5,5-tetrahidrofuran-tetracarboxilatos, 1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos y derivados carboximetilo de alcoholes polihídricos tales como sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos incluyen el ácido melítico, el ácido piromelítico y los derivados del ácido ftálico descritos en la patente británica 1.425.343.

De los anteriormente mencionados, los policarboxilatos preferidos son los hidroxicarboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi por molécula y más en particular los citratos.

Los sistemas de aditivos reforzantes de la detergencia preferidos para su uso en las presentes composiciones incluyen una mezcla de un aditivo reforzante de aluminosilicato insoluble en agua como la zeolita A o de un silicato laminar (SKS-6) y un agente quelante de carboxilato hidrosoluble como el ácido cítrico. Otros sistemas de aditivo reforzante de la detergencia preferidos incluyen una mezcla de un aditivo reforzante de la detergencia de aluminosilicato insoluble en agua como la zeolita A y un agente quelante de carboxilato hidrosoluble como el ácido cítrico. Los sistemas de aditivo reforzante de la detergencia preferidos para su uso en las composiciones líquidas detergentes de la presente invención son los jabones y los policarboxilatos.

Otros aditivos reforzantes de la detergencia que pueden formar parte del sistema de aditivo reforzante de la detergencia para su uso en composiciones granuladas incluyen productos inorgánicos tales como carbonatos, bicarbonatos, silicatos de metales alcalinos y productos orgánicos como los fosfonatos, amino polialquilen fosfonatos y amino policarboxilatos orgánicos.

Otras sales orgánicas hidrosolubles adecuadas son los ácidos homo poliméricos o copoliméricos o sus sales, en los que el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Polímeros de este tipo se describen en GB-A-1.596.756. Ejemplos de estas sales son los poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maleico, teniendo dichos copolímeros un peso molecular de 20.000 a 70.000 y en especial de aproximadamente 40.000.

Las sales mejoradoras de la detergencia están normalmente incluidas en cantidades del 5% al 80% en peso de la composición, de preferencia del 10% al 70% y por lo general del 30% al 60% en peso.

Otros sistemas tensioactivos

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener tensioactivos catiónicos, anfolíticos, de ión híbrido y semi-polares, así como tensioactivos no iónicos y/o aniónicos diferentes a los ya descritos en la presente memoria.

Los tensioactivos anfolíticos son también adecuados para su uso en las composiciones detergentes de la presente invención. Estos tensioactivos puede describirse de forma general como derivados alifáticos de aminas secundarias o terciarias, o derivados alifáticos de aminas secundarias y terciarias heterocíclicas en las que el radical alifático puede ser una cadena lineal o ramificada. Uno de los sustituyentes alifáticos contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, de forma típica de 8 a 18 átomos de carbono y al menos uno contiene un grupo aniónico hidrosoluble, p. ej., carboxi, sulfonato, sulfato. Para ejemplos de tensioactivos anfolíticos véase la patente de EE.UU. núm. 3.929.678 concedida a Laughlin y col. el 30 de diciembre de 1975, columna 19, líneas 18-35.

Si están incluidas, las composiciones detergentes de la presente invención de forma típica comprenden del 0,2% al 15%, preferiblemente del 1% al 10% en peso de estos tensioactivos anfolíticos.

Los tensioactivos de ión híbrido también resultan adecuados para su uso en composiciones detergentes. Estos tensioactivos se pueden describir a grandes rasgos como derivados de aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas secundarias y terciarias heterocíclicas o derivados de compuestos de amonio cuaternario, compuestos de fosfonio cuaternario o compuestos de sulfonio terciario. Para ejemplos de tensioactivos de iones híbridos véase la patente de EE.UU. núm. 3.929.678, otorgada el 30 de diciembre de 1975 a Laughlin y col., de la línea 38 de la columna 19 hasta la línea 48 de la columna 22.

Si están incluidos, las composiciones detergentes de la presente invención de forma típica comprenden del 0,2% al 15%, preferiblemente del 1% al 10% en peso de estos tensioactivos de ión híbrido.

Los tensioactivos no iónicos semipolares son una categoría especial de tensioactivos no iónicos que incluyen óxidos de amina hidrosolubles que contienen un resto alquilo de 10 a 18 átomos de carbono y 2 restos seleccionados del grupo que consta de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen de 1 a 3 átomos de carbono; óxidos de fosfina hidrosolubles que contienen un resto alquilo de 10 a 18 átomos de carbono y 2 restos seleccionados del grupo que consta de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen de 1 a 3 átomos de carbono; y sulfóxidos hidrosolubles que contienen un resto alquilo de 10 a 18 átomos de carbono y un resto seleccionado del grupo que consta de restos alquilo e hidroxialquilo de 1 a 3 átomos de carbono.

Los tensioactivos detergentes no iónicos semipolares incluyen los tensioactivos de tipo óxido de amina que tienen la fórmula:

R^{3}(OR^{4}

\uelm{)}{\uelm{ \uparrow }{0}}

xN(R^{5})2

en donde R^{3} es un grupo alquilo, hidroxialquilo o alquil fenilo o mezclas de los mismos que contienen de 8 a 22 átomos de carbono; R^{4} es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene de 2 a 3 átomos de carbono o mezclas de los mismos; x es de 0 a 3; y cada uno de R^{5} es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene de 1 a 3 átomos de carbono o un grupo óxido de polietileno que contiene de 1 a 3 grupos óxido de etileno. Los grupos R^{5} pueden estar unidos entre sí, por ejemplo a través de un átomo de oxígeno o de nitrógeno, para formar una estructura de anillo.

Estos tensioactivos de tipo óxido de amina incluyen, en particular, óxidos de alquil C_{10}-C_{18}-dimetil-amina y óxidos de alcoxi C_{8}-C_{12}-etil-hidroxi-etil-amina.

Si está incluidos, las composiciones limpiadoras de la presente invención de forma típica comprenden del 0,2% al 15%, preferiblemente del 1% al 10% en peso de estos tensioactivos no iónicos semipolares.

La composición detergente de la presente invención también puede comprender un cotensioactivo seleccionado del grupo de aminas primarias o terciarias.

Las aminas primarias adecuadas para su uso en la presente invención incluyen aminas según la fórmula R_{1}NH_{2} en donde R_{1} es una cadena alquílica C_{6}-C_{12}, preferiblemente C_{6}-C_{10} o R_{4}X(CH_{2})_{n}, X es -O-, -C(O)NH- o -NH-, R_{4} es un cadena alquílica C_{6}-C_{12}, n es de 1 a 5 y preferiblemente 3. Las cadenas alquílicas R_{1} pueden ser lineales o ramificadas y puede estar interrumpida por hasta 12, preferiblemente menos de 5, restos de óxido de etileno.

Las aminas preferidas según la fórmula anterior son n-alquil aminas. Las aminas adecuadas de uso en la presente invención pueden ser seleccionadas de 1-hexilamina, 1-octilamina, 1-decilamina y laurilamina. Otras aminas primarias preferidas incluyen C_{8}-C_{10} oxipropilamina, octiloxipropilamina, 2-etilhexil-oxipropilamina, lauril amido propilamina y amido propilamina.

Las aminas terciarias adecuadas de uso en la presente invención incluyen aminas terciarias que tienen la fórmula R_{1}R_{2}R_{3}N en donde R_{1} y R_{2} son cadenas alquílicas C_{1}-C_{8} o

--- (CH_{2} ---

\uelm{C}{\uelm{\para}{R ^{5} }}

H --- O)_{x}H

R_{3} es o una cadena alquílica C_{6}-C_{12},preferiblemente una cadena alquílica C_{6}-C_{10} o R_{3} es R_{4}X(CH_{2})_{n}, en donde X es -O-, -C(O)NH- o -NH-, R_{4} es una cadena alquílica C_{4}-C_{12}, n es de 1 a 5, preferiblemente de 2 a 3. R_{5} es H o un grupo alquil C_{1}-C_{2} y x es de 1 a 6.

R_{3} y R_{4} pueden ser cadenas alquílicas lineales o ramificadas; las cadenas alquílicas R_{3} pueden estar interrumpidas por hasta 12, preferiblemente menos de 5, restos de óxido de etileno.

Las aminas terciarias preferidas son R_{1}R_{2}R_{3}N en donde R_{1} es una cadena alquílica C_{6}-C_{12}, R_{2} y R_{3} son alquil
C_{1}-C_{3} o

--- (CH_{2} ---

\uelm{C}{\uelm{\para}{R _{5} }}

H --- O)_{x}H

en donde R_{5} es H o CH_{3} y x = 1-2.

También preferidas son las amidoaminas de la fórmula:

R_{1} --–

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--– NH --- (CH_{2})_{n} --- N --- (R_{2})_{2}

en donde R_{1} es alquil C_{6}-C_{12}; n es 2-4,

preferiblemente n es 3; R_{2} y R_{3} son C_{1}-C_{4}.

Las aminas más preferidas de la presente invención incluyen 1-octilamina, 1-hexilamina, 1-decilamina, 1-dodecilamina, C_{8-10}-oxipropilamina, N-coco-1-3-diaminopropano, coco-alquildimetilamina, laurildimetilamina, lauril-bis(hidroxietil)amina, coco-bis(hidroxietil)amina, lauril amina propoxilada en 2 moles, octil amina propoxilada en 2 moles, lauril amidopropildimetilamina, C_{8-10} amidopropildimetilamina y C_{10} amidopropildimetilamina.

Las aminas más preferidas para su uso en las composiciones de la presente invención son 1-hexilamina, 1-octilamina, 1-decilamina y 1-dodecilamina. Especialmente deseables son la n-dodecildimetilamina, la bishidroxietilcocoalquilamina y la oleilamina 7 veces etoxilada, la lauril amido propilamina y la cocoamido propilamina.

Enzimas detergentes convencionales

Las composiciones detergentes también pueden comprender, además de las enzimas mananasa y proteasa, una o más enzimas que mejoran la eficacia de limpieza, el cuidado de los tejidos y/o la higienización.

Dichas enzimas incluyen enzimas seleccionadas de celulasas, hemicelulasas, peroxidasas, gluco-amilasas, amilasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratanasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, \beta-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa o mezclas de las mismas.

Una combinación preferida es una composición detergente que tiene una mezcla de enzimas aplicables convencionales como amilasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa junto con una o más enzimas de degradación de la pared celular vegetal.

Las celulasas útiles en la presente invención incluyen celulasas bacterianas y fúngicas. Preferiblemente, tendrán un pH óptimo de 5 a 12 y una actividad específica superior a 50 CEVU/mg (unidad de viscosidad de celulosa). Las celulasas adecuadas se describen en la patente de EE.UU. núm. 4.435.307 concedida a Barbesgoard y col. y en las patentes JP61078384 y WO96/02653 que describen la celulasa fúngica obtenida de Humicola insolens, Trichoderma, Thielavia y Sporotrichum, respectivamente. En EP 739 982 se describen celulasas aisladas de una nueva especie de Bacillus. Celulasas adecuadas también se describen en GB-A-2.075.028; GB-A-2.095.275; DE-OS-2.247.832 y WO95/26398.

Ejemplos de estas celulasas son las celulasas obtenidas de una cepa de Humicola insolens (Humicola grisea var. termoidea), en especial la cepa Humicola DSM 1800.

Otras celulasas adecuadas son las celulasas procedentes de Humicola insolens que tienen un peso molecular de aproximadamente 50 KDa, un punto isoeléctrico de 5,5 y que contienen 415 aminoácidos; y una endoglucanasa ^{-}43 kD derivada de Humicola insolens, DSM 1800, que presenta actividad celulasa. Un componente endoglucanasa preferido tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la solicitud de patente PCT WO 91/17243. Celulasas también adecuadas son las celulasas EGIII de Trichoderma longibrachiatum descritas en WO94/21801, concedida a Genencor el 29 de septiembre de 1994. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen ventajas de protección del color. Ejemplos de estas celulasas son las celulasas descritas en la solicitud de patente europea EP 495257, publicada el 6 de noviembre de 1991 (Novo). Carezyme y Celluzyme (Novo Nordisk A/S) son especialmente útiles. Véase también las WO91/17244 y WO91/21801. Otras celulasas adecuadas con propiedades de protección de los tejidos y/o limpieza se encuentran descritas en WO96/34092, WO96/17994 y WO95/24471.

Dichas celulasas se incorporan normalmente en la composición detergente a niveles del 0,0001% al 2% de enzima pura en peso de la composición detergente.

Las enzimas peroxidasa se utilizan junto con fuentes de oxígeno, p. ej., percarbonato, perborato, persulfato, peróxido de hidrógeno, etc. y con un sustrato fenólico como molécula mejoradora del blanqueante. Éstas se utilizan para el "blanqueo en solución", es decir para evitar la transferencia de colorantes o pigmentos separados de los sustratos durante las operaciones de lavado a otros sustratos en la solución de lavado. Las enzimas peroxidasa son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano, ligninasa y haloperoxidasa como la cloro-peroxidasa y la bromo-peroxidasa. Las composiciones detergentes que contienen peroxidasa se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional PCT WO 89/099813, WO89/09813 y en la solicitud de patente europea EP 540 784, publicada el 6 de noviembre de 1991. También resulta adecuada la enzima lacasa.

Los mejoradores están generalmente comprendidos a un nivel del 0,1% al 5% en peso de la composición total. Los mejoradores preferidos son la fentiazina y la fenoxasina sustituidas, el ácido 10-fenotiazinpropiónico (PPT), el ácido 10-etilfenotiazin-4-carboxílico (EPC), el ácido 10-fenoxazinpropiónico (POP) y la 10-metilfenoxazina (descritos en WO 94/12621), los siringatos (alquil C3-C5 siringatos sustituidos) y los fenoles sustituidos. El percarbonato sódico o el perborato son fuentes de peróxido de hidrógeno preferidas.

Dichas peroxidasas se incorporan normalmente en la composición detergente a niveles del 0,0001% al 2% de enzima pura en peso de la composición detergente.

Otras enzimas preferidas que pueden ser incluidas en las composiciones detergentes de la presente invención incluyen las lipasas. Las enzimas lipasa adecuadas para el uso detersivo incluyen aquellas producidas por microorganismos del grupo Pseudomonas, tales como la Pseudomonas stutzeri ATCC 19.154, descrita en la patente británica 1.372.034. Las lipasas adecuadas incluyen aquellas que presentan una reacción cruzada inmunológica positiva con el anticuerpo de la lipasa, producida por el microorganismo Pseudomonas fluorescent IAM 1057. Esta lipasa es comercializada por Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya, Japón, bajo la marca registrada Lipasa P "Amano," en adelante "Amano-P". Otras lipasas comerciales adecuadas incluyen Amano-CES, lipasas ex Chromobacter viscosum, por ejemplo, Chromobacter viscosum var. liplyticum NRRLB 3673 de Toyo Jozo Co., Tagata, Japón; lipasas de Chromobacter viscosum de U.S. Biochemical Corp., EE.UU. y Disoynth Co., Holanda, y lipasas de Pseudomonas gladioli. Lipasas especialmente adecuadas son las lipasas tales como M1 Lipase® y Lipomax® (Gist-Brocades) y Lipolase® y Lipolasa Ultra®(Novo) que han resultado ser muy eficaces cuando se utilizan junto con las composiciones de la presente invención. También adecuadas son las enzimas lipolíticas según EP 258 068, WO 92/05249 y WO 95/22615 de Novo Nordisk y WO 94/03578, WO 95/35381 y WO 96/00292 de Unilever.

También son adecuadas las cutinasas [EC 3.1.1.50] que pueden ser consideradas como un tipo especial de lipasas, es decir, lipasas que no requieren una activación interfacial. La adición de cutinasas a composiciones detergentes ha sido descrita en, p. ej., WO-A-88/09367 (Genencor), WO 90/09446 (Plant Genetic System) y WO 94/14963 y WO 94/14964 (Unilever).

Las lipasas y/o cutinasas se incorporan normalmente en la composición detergente a niveles del 0,0001% al 2% de enzima pura en peso de la composición detergente.

Pueden incluirse amilasas (\alpha y/o \beta) para eliminar las manchas de carbohidrato. WO94/02597, concedida a Novo Nordisk A/S el 3 de febrero de 1994, describe composiciones detergentes que incorporan amilasas mutantes. Véase también WO95/10603, concedida a Novo Nordisk A/S el 20 de abril de 1995. Otras amilasas conocidas para su uso en composiciones detergentes incluyen las \alpha-amilasas y las \beta-amilasas. Las \alpha-amilasas son conocidas en la técnica e incluyen las descritas en US-5.003.257; EP 252.666; WO/91/00353; FR 2.676.456; EP 285.123; EP 525.610; EP 368.341 y la especificación de la patente británica 1.296.839 (Novo). Otras amilasas adecuadas son las amilasas con estabilidad mejorada descritas en WO94/18314, publicada el 18 de agosto de 1994 y WO96/05295, Genencor, publicada el 22 de febrero de 1996, y variantes de amilasa que tiene una modificación adicional en el precursor inmediato comercializada por Novo Nordisk A/S, descritas en WO 95/10603 y publicada en abril de 1995. También adecuadas son las amilasas descritas en EP 277 216, WO95/26397 y WO96/23873 (todas de Novo Nordisk).

Ejemplos de \alpha-amilasas comerciales son Purafect Ox Am® de Genencor® y Termamyl®, Ban®, Fungamyl® y Duramyl®, todas ellas comercializadas por Novo Nordisk A/S, Dinamarca. En WO95/26397 se describen otras amilasas adecuadas: las \alpha-amilasas se caracterizan porque tienen una actividad específica al menos superior en un 25% a la actividad específica de Termamyl® a una temperatura de 25ºC a 55ºC y a un pH de 8 a 10, medida mediante el ensayo Phadebas® de actividad de \alpha-amilasa. Resultan adecuadas las variantes de las enzimas anteriores, descritas en WO96/23873 (Novo Nordisk). Otras enzimas amilolíticas con mejores propiedades de nivel de actividad y con una combinación de termoestabilidad y un mayor nivel de actividad se encuentran descritas en WO95/35382.

Las enzimas amilolíticas se incorporan en las composiciones detergentes de la presente invención a un nivel del 0,0001% al 2%, preferiblemente del 0,00018% al 0,06% y más preferiblemente del 0,00024% al 0,048% de enzima pura en peso de la composición.

Las enzimas anteriormente mencionadas pueden ser de cualquier origen adecuado, tales como vegetal, animal, bacteriano, fúngico o levadura. El origen también puede ser mesófilo o extremófilo (psicrófilo, psicrotrófico, termófilo, barófilo, alcalófilo, acidófilo o halófilo). Pueden utilizarse formas purificadas o no purificadas de estas enzimas. En la actualidad, es habitual modificar las enzimas salvajes mediante técnicas de ingeniería genética o proteica para optimizar su eficacia en las composiciones detergentes de la invención. Por ejemplo, las variantes pueden ser diseñadas para aumentar la compatibilidad de la enzima con los ingredientes habituales de estas composiciones. De forma alternativa, la variante puede ser diseñada para ajustar el pH óptimo, la estabilidad del blanqueante o del quelante y la actividad catalítica de la enzima variante a la aplicación de limpieza en cuestión.

En particular, deberá tenerse especial cuidado con los aminoácidos sensibles a la oxidación para mantener la estabilidad del blanqueante y con las cargas superficiales en cuanto a la compatibilidad con el tensioactivo. El punto isoeléctrico de estas enzimas puede ser modificado sustituyendo algunos aminoácidos cargados, p. ej., un aumento del punto isoeléctrico puede mejorar la compatibilidad con los tensioactivos aniónicos. También puede mejorarse la estabilidad de las enzimas creando, p. ej., puentes de sal adicionales y haciendo que los sitios de unión del calcio aumenten la estabilidad del quelante. Deberá dedicarse especial atención a las celulasas ya que la mayoría de las celulasas tienen dominios de unión separados (CBD). Pueden alterarse las propiedades de estas enzimas modificando estos dominios.

Dichas enzimas se incorporan normalmente en la composición detergente a niveles del 0,0001% al 2% de enzima pura en peso de la composición detergente. Las enzimas pueden añadirse como ingredientes individuales separados (pellets, granulados, líquidos estabilizados, etc.) que contienen una enzima o como mezclas de dos o más enzimas (p. ej., cogranulados).

Otros ingredientes detergentes adecuados que pueden añadirse son inactivadores de la oxidación de enzimas que se encuentran descritos en EP 553 607, publicada el 31 de enero de 1992. Ejemplos de estos inactivadores de la oxidación de enzimas son las tetraetilen poliaminas etoxiladas.

Una serie de productos enzimáticos y medios para su incorporación en composiciones detergentes sintéticas se describen también en WO 93/07263 A y WO 93/07260 A concedida a Genencor International, WO 89/08694 A concedida a Novo y US-3.553.139, concedida el 5 de enero de 1971 a McCarty y col. También se describen enzimas en la patente de EE.UU. núm. 4.101.457, concedida a Place y col. el 18 de julio de 1978, y en la patente de EE.UU. núm. 4.507.219, concedida a Hughes el 26 de marzo de 1985. Productos enzimáticos útiles para formulaciones de detergente líquidos y para la incorporación de los mismos en dichas formulaciones se describen en la patente de EE.UU. núm. 4.261.868, concedida a Hora y col. el 14 de abril de 1981. Las enzimas para uso en detergentes pueden estabilizarse mediante diferentes técnicas. En la patente de EE.UU. núm. 3.600.319, concedida el 17 de agosto de 1971 a Gedge y col., y en EP 199.405 y EP 200.586, concedidas el 29 de octubre de 1986 a Venegas, se describen e ilustran técnicas para la estabilización de enzimas. Los sistemas de estabilización de enzimas se describen también, por ejemplo, en la patente de EE.UU. núm. 3.519.570. Un Bacillus, sp. AC13, útil que produce proteasas, xilanasas y celulasas, se describe en WO 94/01532 A concedida a Novo.

Ventajas para el cuidado de los colores y los tejidos

También pueden incluirse tecnologías que proporcionan un tipo de ventaja de protección del color. Ejemplos de estas tecnologías son los metalo catalizadores para la conservación del color. Estos metalo catalizadores se encuentran descritos en la solicitud de patente codependiente europea EP 596 184. Los fijadores de colorantes, la dispersión de poliolefinas antiarrugas y una mejor absorbancia de agua, aroma y un polímero con función amino (WO 38/12256) para el cuidado de los colores y la eficacia del aroma son también ejemplos de tecnologías para el cuidado del color y de los tejidos y se encuentran descritas en la solicitud de patente codependiente EP 841 390, presentada el 7 de noviembre de 1996.

Los suavizantes de los tejidos también pueden ser incorporados en las composiciones detergentes de acuerdo con la presente invención. Estos agentes pueden ser de tipo inorgánico u orgánico. Ejemplos de suavizantes inorgánicos son las arcillas tipo esmectita descritas en GB-A-1 400 898 y en USP 5.019.292. Los suavizantes orgánicos para los tejidos incluyen las aminas terciarias insolubles en agua como las descritas en GB-A1 514 276 y EP-B0 011 340 y su combinación con mono sales de amonio cuaternario C12-C14, que se describen en EP-B-0 026 527 y EP-B-0 026 528, y las diamidas de cadena larga como las descritas en EP-B-0 242 919. Otros ingredientes orgánicos útiles de los sistemas suavizantes de tejidos incluyen los productos de óxido de polietileno de elevado peso molecular como los descritos en EP-A-0 299 575 y 0 313 146.

Los niveles de arcilla tipo esmectita son normalmente del 2% al 20%, más preferiblemente del 5% al 15% en peso, añadiéndose el producto como un componente mezclado en seco al resto de la formulación. Los suavizantes orgánicos de los tejidos tales como las aminas terciarias insolubles en agua o los productos diamida de cadena larga son incorporados a niveles del 0,5% al 5% en peso, normalmente del 1% al 3% en peso mientras que los productos de óxido de polietileno de elevado peso molecular y los productos catiónicos hidrosolubles se añaden a niveles del 0,1% al 2%, normalmente del 0,15% al 1,5% en peso. Estos productos se añaden normalmente a la porción secada por aspersión de la composición, aunque en algunos casos puede resultar más adecuado añadirlos como materia en forma de partículas secada por aspersión o pulverizarlas como un líquido molido sobre otros componentes sólidos de la composición.

Agentes quelantes

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener opcionalmente uno o más agentes quelantes de hierro y/o manganeso. Los agentes quelantes de este tipo se pueden seleccionar del grupo formado por aminocarboxilatos, aminofosfonatos, agentes quelantes aromáticos polifuncionalmente sustituidos y sus mezclas, todos ellos tal como se definen a continuación. Sin estar respaldado por la teoría, se piensa que la ventaja de estos productos se debe, en parte, a su excepcional capacidad para separar iones hierro y manganeso de soluciones de lavado mediante la formación de quelatos solubles.

Los amino carboxilatos útiles como agentes quelantes opcionales incluyen etilendiaminotetraacetatos, N-hidroxietiletilendiaminotriacetatos, nitrilotriacetatos, etilendiamina tetraproprionatos, trietilenotetraami-nohexaacetatos, dietilentriaminopentaacetatos y etanoldiglicinas, sales de metales alcalinos, amonio y amonio sustituido y mezclas de los mismos.

Los amino fosfonatos son también adecuados para su uso como agentes quelantes en las composiciones de la invención cuando en las composiciones detergentes se permiten al menos bajos niveles de fósforo total, e incluyen etilendiaminotetrakis (metilenfosfonatos) tales como DEQUEST. Preferiblemente, estos amino fosfonatos no contienen grupos alquilo o alquenilo con más de 6 átomos de carbono.

Los agentes quelantes aromáticos polifuncionalmente sustituidos son también útiles en las composiciones de esta invención. Véase la patente de EE.UU. núm. 3.812.044, concedida el 21 de mayo de 1974 a Connor y col. Compuestos preferidos de este tipo en forma ácida son los dihidroxidisulfobencenos tales como el 1,2-dihidroxi-3,5-disulfobenceno.

Un quelante biodegradable preferido para su uso en la presente invención es el disuccinato de etilendiamina ("EDDS"), especialmente el isómero [S,S] según se describe en la patente de EE.UU. núm. 4.704.233, concedida el 3 de noviembre de 1987 a Hartman y Perkins.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener sales hidrosolubles del ácido metil glicino diacético (MGDA) (o forma ácida) como quelante o co-aditivo reforzante útil con, por ejemplo, aditivos reforzantes insolubles tales como zeolitas, silicatos laminares y similares.

Si se utilizan, estos agentes quelantes generalmente comprenderán del 0,1% a aproximadamente el 15% en peso de las composiciones detergentes de la invención. Más preferiblemente, si se utilizan, los agentes quelantes comprenderán del 0,1% al 3,0% en peso de estas composiciones.

Antiespumante

Otro ingrediente opcional es un antiespumante, ilustrado por siliconas y mezclas de sílice-silicona. Por lo general, las siliconas están representadas por productos de polisiloxano alquilados mientras que la sílice se utiliza normalmente en formas finamente divididas como aerogeles y xerogeles de sílice y sílices hidrófobas de diferentes tipos. Estos productos pueden ser incorporados en forma de partículas en las que el antiespumante se incorpora ventajosamente de forma liberable en un vehiculante impermeable, prácticamente detergente no activo en la superficie, hidrosoluble o dispersable en agua. De forma alternativa el antiespumante puede disolverse o dispersarse en un vehiculante líquido y aplicarse pulverizándolo sobre uno o más de los demás componentes.

Un regulador de la espuma de silicona preferido se describe en la patente de EE.UU. núm. 3 933 672 concedida a Bartollota y col. Otros antiespumantes especialmente útiles son los antiespumantes autoemulsionantes de silicona, descritos en la solicitud de patente alemana DTOS 2 646 126, publicada el 28 de abril de 1977. Un ejemplo de estos compuestos es DC-544, comercializado por Dow Corning, que es un copolímero siloxano-glicol. Un agente controlador de la espuma especialmente preferido es el sistema antiespumante que comprende una mezcla de aceites de silicona y 2-alquil-alcanoles. Los 2-alquil-alcanoles adecuados son el 2-butil-octanol comercializado bajo la marca registrada Isofol 12 R.

Este sistema antiespumante se encuentran descrito en EP 593 841, publicada el 10 de noviembre de 1992.

Los agentes reguladores de la espuma de silicona especialmente preferidos se encuentran descritos en EP 573 699. Dichas composiciones pueden comprender una mezcla de silicona/sílice junto con sílice de humo no porosa como Aerosil®.

Los antiespumantes anteriormente descritos se utilizan normalmente a niveles del 0,001% al 2% en peso, preferiblemente del 0,01% al 1% en peso, de la composición.

Otros

Pueden utilizarse otros componentes utilizados en composiciones detergentes tales como suspensores de manchas, agentes repelentes de manchas, abrillantadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de empañado, agentes colorantes y/o aromas encapsulados o no encapsulados.

Productos encapsulantes especialmente adecuados son cápsulas hidrosolubles que constan de una matriz de polisacárido y polihidroxi compuestos tales como los descritos en GB 1.464.616. Otros productos hidrosolubles encapsulantes adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres del almidón sin gelatinizar de ácidos dicarboxílicos sustituidos tales como los descritos en US 3.455.838. Estas dextrinas derivadas de ésteres se preparan, preferiblemente, a partir de estos almidones como maíz céreo, sorgo céreo, sago, tapioca y patata. Ejemplos adecuados de dichos productos encapsulantes incluyen N-Lok fabricado por National Starch. El producto encapsulante N-Lok consta de un almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón se modifica añadiendo grupos monofuncionales sustituidos tales como el anhídrido del ácido octenil succínico.

Los agentes anti-redeposición y suspensores de manchas adecuados de la presente invención incluyen derivados de la celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa y ácidos policarboxílicos homo poliméricos o copoliméricos o sus sales. Los polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y los copolímeros anhídrido maleico-ácido acrílico anteriormente mencionados como aditivos reforzantes de la detergencia, así como copolímeros del anhídrido maleico con etileno, metilvinil éter o ácido metacrílico, constituyendo el anhídrido maleico al menos el 20 mol% del copolímero. Estos productos son normalmente utilizados a niveles del 0,5% al 10% en peso, más preferiblemente del 0,75% al 8% y con máxima preferencia del 1% al 6% en peso de la composi-
ción.

Los abrillantadores ópticos preferidos son de tipo aniónico como, por, ejemplo, 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato disódico, 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato disódico, 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato disódico, 4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2-sulfonato monosódico, 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato disódico, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-disulfonato disódico, 4,4'bis(2-anilino-4-(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'disulfonato disódico, 2(estilbil-4''-(nafto-1',2',4,5)-1,2,3-triazol-2''-sulfonato sódico y 4,4'-bis(2-sulfoestiril)bifenilo. Los abrillantadores altamente preferidos son los abrillantadores específicos descritos en EP 753 567.

Otros productos poliméricos útiles son los polietilenglicoles, en especial los de peso molecular de 1000 a 10000, más preferibles los de 2000 a 8000 y con máxima preferencia los de aproximadamente 4000. Estos son utilizados a niveles del 0,20% al 5% y más preferiblemente del 0,25% al 2,5% en peso. Estos polímeros y las sales anteriormente mencionadas de policarboxilato homopoliméricas o copoliméricas son valiosas para mejorar la conservación de la blancura, la deposición de cenizas en los tejidos y la eficacia de limpieza de manchas de barro, proteínas y oxidables en presencia de impurezas de metales de transición.

Los agentes repelentes de manchas útiles en las composiciones de la presente invención son copolímeros o terpolímeros del ácido tereftálico convencionales con unidades etilenglicol y/o propilenglicol en diferentes disposiciones. Ejemplos de estos polímeros se describen en las patentes de asignación común US4116885 y 4711730 y en la solicitud de patente europea publicada 0 272 033. Un polímero especialmente preferido de acuerdo con EP-A-0 272 033 es de fórmula:

(CH_{3} (PEG)_{43})_{0,75} (POH)_{0,25}[(T-PO)_{2,8}(T-PEG)_{0,4}]T(POH)_{0,25}((PEG)_{43}CH_{3})_{0,75}

en donde PEG es -(OC_{2}H_{4})O-, PO es (OC_{3}H_{6}O) y T es (pcOC_{6}H_{4}CO).

También son muy útiles los poliésteres modificados como los copolímeros aleatorios del dimetil tereftalato, dimetil sulfoisoftalato, etilenglicol y 1-2 propano diol, los grupos terminales que constan en primer lugar de sulfobenzoato y en segundo lugar de monoésteres de etilenglicol y/o propanodiol. El objetivo es obtener un polímero terminalmente protegido en ambos extremos por grupos sulfobenzoato, "en primer lugar", en el presente contexto significa que la mayoría de dichos copolímeros de la presente invención estarán terminalmente protegidos por grupos sulfobenzoato. Sin embargo, algunos copolímeros estarán menos que totalmente terminalmente protegidos y por tanto, sus grupos terminales pueden constar de monoéster de etilenglicol y/o propano 1-2 diol, por lo que los mismos constan "en segundo lugar" de estas especies.

Los poliésteres seleccionados en la presente invención contienen un 46% en peso de ácido dimetil tereftálico, un 16% en peso de propano -1,2 diol, un 10% en peso de etilenglicol, un 13% en peso de ácido dimetil sulfobenzoico y un 15% en peso de ácido sulfoisoftálico y tienen un peso molecular de 3.000. Los poliésteres y su método de preparación se encuentran descritos en detalle en EPA 311 342.

Es bien conocido en la técnica que el cloro libre en el agua del grifo desactiva rápidamente las enzimas comprendidas en las composiciones detergentes. Por tanto, el uso de inactivadores de cloro tales como perborato, sulfato amónico, sulfito sódico o polietilenimina a un nivel superior al 0,1% en peso de la composición total en las fórmulas proporcionará una mejor estabilidad durante el lavado de las enzimas detergentes. Composiciones que comprenden un inactivador de cloro se encuentran descritas en la solicitud de patente europea EP 553 607 publicada el 31 de enero de 1992.

Los policarboxilatos alcoxilados, tales como los preparados a partir de poliacrilatos, son útiles en esta invención para proporcionar un comportamiento adicional de eliminación de la grasa. Estos productos se encuentran descritos en WO 91/08281. Químicamente, estos productos comprenden poliacrilatos con una cadena lateral etoxi por cada 7-8 unidades acrilato. Las cadenas laterales son de la fórmula -(CH_{2}CH_{2}O)_{m}(CH_{2})_{n}CH_{3}, en donde m es 2-3 y n es 6-12. Las cadenas laterales están enlazadas con éster a la "cadena principal" de poliacrilato para proporcionar una estructura de tipo polímero "combinado". El peso molecular puede variar pero de forma típica es de 2000 a 50.000. Estos policarboxilatos alcoxilados pueden comprender del 0,05% al 10% en peso de las composiciones de la presente invención.

Dispersantes

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener dispersantes. Las sales orgánicas hidrosolubles adecuadas son los ácidos homopoliméricos o copoliméricos o sus sales, en donde el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Polímeros de este tipo se describen en GB-A-1.596.756. Ejemplos de estas sales son los poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maleico, teniendo estos copolímeros un peso molecular de 1.000 a 100.000.

En especial, en las composiciones detergentes de la presente invención puede añadirse un copolímero de acrilato y metilacrilato como, p. ej., el 480N que tiene un peso molecular de 4000 a un nivel del 0,5% al 20% en peso de la composición.

Las composiciones de la invención pueden contener un compuesto peptizador de jabón de cal, que tiene preferiblemente una capacidad dispersante de jabón de cal (LSDP) como se define más adelante, de no más de 8, preferiblemente de no más de 7 y con máxima preferencia de no más de 6. El compuesto peptizador de jabón de cal está preferiblemente presente a un nivel del 0% al 20% en peso.

Una cuantificación de la eficacia de un peptizador de jabón de cal se obtiene mediante la capacidad dispersante del jabón de cal (LSDP) que se determina mediante en ensayo de dispersante de jabón de cal según un artículo de H.C. Borghetty y C.A. Bergman, J. Am. Oil. En Chem. Soc., vol. 27, págs. 88-90, (1950). Este método de ensayo de dispersión del jabón de cal es ampliamente utilizado por técnicos en este campo de la técnica y se referencia, por ejemplo, en los siguientes artículos; W.N. Linfield, Surfactant science Series, vol. 7, pág. 3; W.N. Linfield, Tenside surf. det., vol. 27, págs. 159-163, (1990); y M.K. Nagarajan, W.F. Masler, Cosmetics and Toiletries, vol. 104, págs. 71-73, (1989). Rl LSDP es la relación de peso (%) entre el agente dispersante y el oleato sódico necesario para dispersar los depósitos de jabón de cal formados por 0,025 g de oleato sódico en 30 ml de agua de 333 ppm de dureza equivalente de CaC_{3} (Ca:Mg=3:2).

Los tensioactivos con una buena acción peptizadora de jabón de cal incluirán ciertos óxidos de amina, betaínas, sulfobetaínas, alquil etoxisulfatos y alcoholes etoxilados.

Entre los tensioactivos ilustrativos que tienen una LSDP de no más de 8 para su uso en la presente invención se incluyen el dimetil óxido de amina C_{16}-C_{18}, los alquil C_{12}-C_{18} etoxisulfatos con un grado medio de etoxilación de 1-5, en especial el tensioactivo alquil C_{12}-C_{15} etoxisulfato con un grado de etoxilación de 3 (LSDP=4) y los alcoholes etoxilados C_{14}-C_{15} con un grado medio de etoxilación de 12 (LSDP=6) o de 30, comercializados bajo las marcas registradas Lutensol A012 y Lutensol A030, respectivamente, por BASF GmbH.

Los peptizadores de jabón de cal poliméricos adecuados de uso en la presente invención se encuentran descritos en el artículo de M.K. Nagarajan, W.F. Masler, que se encuentra en Cosmetics and Toiletries, vol. 104, págs. 71-73, (1989).

También pueden utilizarse como peptizadores de jabón de cal los blanqueadoras hidrófobos tales como 4-[N-octanoil-6-aminohexanoil]benceno sulfonato, 4-[N-nonanoil-6-aminohexanoil] benceno sulfonato, 4-[N-decanoil-6-aminohexanoil]benceno sulfonato y mezclas de los mismos; y el nonanoiloxi benceno sulfonato junto con formulaciones blanqueadoras hidrófilas/hidrófobas.

Inhibición de la transferencia de colorantes

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir compuestos para inhibir la transferencia de colorantes de un tejido a otro de colorantes solubilizados y suspendidos que se encuentran durante las operaciones de lavado de tejidos de color.

Agentes poliméricos inhibidores de la transferencia de colorantes

Las composiciones detergentes según la presente invención comprenden también del 0,001% al 10%, preferiblemente del 0,01% al 2% y más preferiblemente del 0,05% al 1% en peso de agentes inhibidores de la transferencia de colorantes poliméricos. Dichos agentes inhibidores de la transferencia de colorantes poliméricos se incorporan normalmente a las composiciones detergentes para inhibir la transferencia de colorantes de telas de color a las demás telas lavadas con ellas. Estos polímeros tienen la capacidad de formar complejos o adsorber los colorantes fugitivos desprendidos de las telas de color antes de que dichos colorantes puedan unirse a otros artículos presentes en la operación de lavado.

Agentes inhibidores de la transferencia de colorantes poliméricos especialmente adecuados son los polímeros de N-óxido de poliamina, los copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, los polímeros de polivinilpirrolidona, las poliviniloxazolidonas y los polivinilimidazoles o mezclas de los mismos.

La adición de estos polímeros también mejora el rendimiento de las enzimas según la invención.

a) Polímeros de N-óxido de poliamina

Los polímeros de N-óxido de poliamina adecuados para su uso en la invención contienen unidades con la siguiente fórmula estructural:

(I)

\melm{\delm{\para}{R}}{A}{\uelm{\para}{P}}

_{x}

en donde P es una unidad polimerizable, el grupo R-N-O puede estar unido a o formar parte de la unidad polimerizable, o una combinación de ambos.

A

\;

es

\;

NC,

\;

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

O,

\;

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

,

\;

-O-,

\;

-

\uelm{S}{\uelm{\dpara}{O}}

-,

\;

-N-;

\;

x

\;

es

\;

0

\;

o

\;

1;

R son grupos alifáticos, alifáticos etoxilados, aromáticos, heterocíclicos o alicíclicos o cualquier combinación de los mismos, en donde el nitrógeno del grupo N-O puede estar unido o formar parte de estos grupos.

El grupo N-O puede estar representado por las estructuras generales siguientes:

(R1)x-

\melm{\delm{\para}{(B) _{2} }}{N}{\uelm{\para}{O}}

-(R2)y

\hskip3cm

=

\uelm{N}{\uelm{\para}{O}}

-(R1)x

en donde R1, R2 y R3 son grupos alifáticos, aromáticos, heterocíclicos o alicíclicos o combinaciones de los mismos, x o/y y o/y z es 0 ó 1 y en donde el nitrógeno del grupo N-O puede estar unido o formar parte de estos grupos.

El grupo N-O puede formar parte de la unidad polimerizable (P) o puede estar unido a la cadena principal polimérica, o una combinación de ambos.

Los N-óxidos de poliamina adecuados en donde el grupo N-O forma parte de la unidad polimerizable comprenden N-óxidos de poliamina en donde R se selecciona de grupos alifáticos, aromáticos, alicíclicos o heterocíclicos.

Una clase de dichos N-óxidos de poliamina comprende el grupo de N-óxidos de poliamina en donde el nitrógeno del grupo N-O forma parte del grupo R. Los N-óxidos de poliamina preferidos son aquellos en donde R es un grupo heterocíclico tal como pirridina, pirrol, imidazol, pirrolidina, piperidina, quinolina, acridina y derivados de los mismos.

Otra clase de dichos N-óxidos de poliamina comprende el grupo de N-óxidos de poliamina en donde el nitrógeno del grupo N-O está unido al grupo R.

Otros N-óxidos de poliamina adecuados son los óxidos de poliamina en donde el grupo N-O está unido a la unidad polimerizable.

Una clase preferida de estos N-óxidos de poliamina son los N-óxidos de poliamina que tienen la fórmula general (I) en donde R es un grupo aromático, heterocíclico o alicíclico y el nitrógeno del grupo funcional N-O forma parte de dicho grupo R.

Ejemplos de estas clases son los óxidos de poliamina en donde R es un compuesto heterocíclico como pirridina, pirrol, imidazol y derivados de los mismos.

Otra clase preferida de N-óxidos de poliamina son los óxidos de poliamina que tienen la fórmula general (I) en donde R son grupos aromáticos, heterocíclicos o alicíclicos y el nitrógeno del grupo funcional N-O está unido a dichos grupos R.

Ejemplos de estas clases son los óxidos de poliamina en donde los grupos R pueden ser aromáticos como fenilo.

Puede utilizarse cualquier cadena principal polimérica con tal de que el polímero de óxido de amina formado sea soluble en agua y tenga propiedades inhibidoras de la transferencia de tintes. Ejemplos de cadenas principales poliméricas adecuadas pueden ser: polivinilos, polialquilenos, poliésteres, poliéteres, poliamidas, poliimidas, poliacrilatos y mezclas de los mismos.

Los polímeros de N-óxido de amina de la presente invención de forma típica tienen una relación amina:N-óxido de amina de 10:1 a 1:1000000. Sin embargo, puede modificarse la cantidad de grupos óxido de amina presentes en el polímero de polióxido de amina mediante una adecuada copolimerización o mediante un adecuado grado de N-oxidación. Preferiblemente, la relación amina:N-óxido de amina es de 2:3 a 1:1000000, más preferiblemente de 1:4 a 1:1.000.000 y con máxima preferencia de 1:7 a 1:1.000.000. Los polímeros de la presente invención abarcan copolímeros aleatorios o de bloque en donde un tipo de monómero es un N-óxido de amina y otro tipo de monómero puede ser un N-óxido de amina o no. La unidad óxido de amina de los N-óxidos de poliamina tiene un PKa < 10, preferiblemente un PKa < 7 y más preferiblemente un PKa < 6.

Los óxidos de poliamina pueden obtenerse con casi cualquier grado de polimerización. El grado de polimerización no es crítico siempre que el producto tenga la solubilidad en agua y la capacidad de suspensión del colorante deseadas.

De forma típica, el peso molecular medio es de 500 a 1.000.000; preferiblemente de 1.000 a 50.000, más preferiblemente de 2.000 a 30.000 y con máxima preferencia de 3.000 a 20.000.

b) Copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol

Los polímeros de N-vinilimidazol y N-vinilpirrolidona utilizados en la presente invención tienen un peso molecular medio de 5.000-1.000.000 y preferiblemente de 5.000 a 200.000.

Los polímeros muy preferidos para su uso en composiciones detergentes según la presente invención comprenden un polímero seleccionado de copolímeros de N-vinilimidazol y N-vinilpirrolidona en donde dicho polímero tiene un peso molecular medio de 5.000 a 50.000, más preferiblemente de 8.000 a 30.000 y con máxima preferencia de 10.000 a 20.000.

El intevalo de peso molecular medio se determinó mediante dispersión de luz según Barth H.G. y Mays J.W. Chemical análisis vol. 113, "Modern Methods of Polymer Characterization".

Los copolímeros de N-vinilimidazol y N-vinilpirrolidona altamente preferidos tienen un peso molecular medio de 5.000 a 50.000, más preferiblemente de 8.000 a 30.000 y con máxima preferencia de 10.000 a 20.000.

Los copolímeros de N-vinilimidazol y N-vinilpirrolidona caracterizados por tener dicho intervalo de peso molecular medio proporcionan una excelente capacidad de inhibición de la transferencia de colorantes y no afectan negativamente al rendimiento de limpieza de las composiciones detergentes formuladas con ellos.

El copolímero de N-vinilimidazol y N-vinilpirrolidona de la presente invención tiene una relación molar N-vinilimidazol / N-vinilpirrolidona de 1 a 0,2, más preferiblemente de 0,8 a 0,3 y con máxima preferencia de 0,6 a 0,4.

c) Polivinilpirrolidona

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden utilizar polivinilpirrolidona ("PVP") con un peso molecular medio de 2.500 a 400.000, preferiblemente de 5.000 a 200.000, más preferiblemente de 5.000 a 50.000 y con máxima preferencia de 5.000 a 15.000. Las polivinilpirrolidonas adecuadas son comercializadas por ISP Corporation, New York, NY y Montreal, Canadá, bajo los nombres comerciales PVP K-15 (peso molecular 10.000), PVP K-30 (peso molecular medio 40.000), PVP K-60 (peso molecular medio 160.000) y PVP K-90 (peso molecular medio 360.000). Otras polivinilpirrolidonas adecuadas comercializadas por BASF Cooperation incluyen Sokalan HP 165 y Sokalan HP 12, polivinilpirrolidonas que son conocidas para el experto en el campo de los detergentes (véase, por ejemplo, EP-A-262.897 y EP-A-256.696).

d) Poliviniloxazolidona

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden utilizar poliviniloxazolidona como agente polimérico inhibidor de la transferencia de colorantes. Dichas poliviniloxazolidonas tienen un peso molecular medio de 2.500 a 400.000, preferiblemente de 5.000 a 200.000, más preferiblemente de 5.000 a 50.000 y con máxima preferencia de 5.000 a 15.000.

e) Polivinilimidazol

Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden utilizar polivinilimidazol como agente polimérico inhibidor de la transferencia de colorantes. Dichos polivinilimidazoles tienen un peso molecular medio de 2.500 a 400.000, preferiblemente de 5.000 a 200.000, más preferiblemente de 5.000 a 50.000 y con máxima preferencia de 5.000 a 15.000.

f) Polímeros reticulados

Los polímeros reticulados son polímeros cuya cadena principal está interconectada hasta un cierto grado. Estos enlaces pueden ser de naturaleza química o física, posiblemente con grupos activos en la cadena principal o en las cadenas laterales. Los polímeros reticulados han sido descritos en Journal of Polymer Science, volumen 22, págs. 1035-1039.

En una realización, los polímeros reticulados se preparan de manera que formen una estructura rígida tridimensional que pueda atrapar a los colorantes en los poros formados por la estructura tridimensional. En otra realización, los polímeros reticulados atrapan los colorantes por hinchamiento. Estos polímeros reticulados se encuentran descritos en EP 719 856.

Método de lavado

Las composiciones de la invención pueden ser utilizadas en prácticamente cualquier método de lavado o limpieza, incluidos los métodos de remojo, los métodos de pretratamiento y los métodos con pasos de aclarado en los que puede añadirse una composición separada mejoradora del aclarado.

El proceso descrito en la presente memoria comprende poner en contacto telas, vajillas o cualquier otra superficie rígida con una solución limpiadora en la forma habitual que se ilustra más adelante.

El proceso de la invención se realiza adecuadamente durante el proceso de limpieza. El método de limpieza se realiza preferiblemente de 5ºC a 95ºC, especialmente de 10ºC a 60ºC. El pH de la solución de tratamiento es preferiblemente de 7 a 12.

Un método de lavado en lavavajillas preferido comprende el tratamiento de los artículos manchados con un líquido acuoso en el que se ha disuelto una cantidad eficaz de composición para lavado o aclarado en lavavajillas. Una cantidad eficaz convencional de composición para lavado en lavavajillas significa de 8-60 g de producto disuelto o dispersado en un volumen de lavado de 3-10 litros. Según un método de lavado manual de vajillas, los platos manchados se ponen en contacto con un cantidad eficaz de la composición para vajillas, de forma típica de 0,5-20 g (para el lavado de 25 platos). Los métodos de lavado manual de vajillas preferidos incluyen la aplicación de una solución concentrada a las superficies de los platos o el remojo en un gran volumen de solución diluida de la composición detergente.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar las composiciones de la presente invención aunque sin necesariamente limitar o definir de otro modo el ámbito de la invención.

En las composiciones detergentes, los niveles de enzima se expresan por enzima pura en peso de la composición total y, salvo que se especifique lo contrario, los ingredientes detergentes se expresan en peso de la composición total. Las abreviaturas de los componentes en la presente memoria tienen el siguiente significado:

LAS: : Sulfonato sódico de alquil C_{11-13} benceno lineal.

TAS: : Sebo alquilsulfato sódico.

CxyAS: : Alquilsulfato sódico C_{1x}-C_{1y}.

CxySAS: : (2,3) alquil C_{1x}-C_{1y} sulfato sódico secundario.

CxyEz: : Alcohol primario condensado C_{1x}-C_{1y} predominantemente lineal con una media de z moles {}\hskip1mm de óxido de etileno.

CxyEzS: : Alquilsulfato sódico condensado C_{1x}-C_{1y} con una media de z moles de óxido de etileno.

QAS: : R_{2}.N+(CH_{3})_{2}(C_{2}H_{4}OH) con R_{2} = C_{12}-C_{14}.

QAS 1: : R_{2}.N+(CH_{3})_{2}(C_{2}H_{4}OH) con R_{2} = C_{8}-C_{11}.

APA: : Amido propil dimetil amina C_{8-10}.

Jabón: : Alquil carboxilato sódico lineal derivado de una mezcla 80/20 de ácidos grasos de sebo y {}\hskip1mm coco.

No iónico: : Alcohol graso etoxilado/propoxilado mixto C_{13}-C_{15} con un grado medio de etoxilación de 3,8 {}\hskip1mm y un grado medio de propoxilación de 4,5.

Neodol 45-13: : Alcohol primario etoxilado C14-C15 lineal, comercializado por Shell Chemical CO.

STS: : Toluensulfonato sódico.

CFAA: : Alquil C_{12}-C_{14} N-metil glucamida.

TFAA: : Alquil C_{16}-C_{18}N-metil glucamida.

TPKFA: : Ácidos grasos C_{12}-C_{14} de la destilación primaria de crudo.

Silicato: : Silicato sódico amorfo (relación SiO_{2}:Na_{2}O = 1,6-3,2).

Metasilicato: : Metasilicato sódico (relación SiO_{2}:Na_{2}O = 1,0).

Zeolita A: : Aluminosilicato sódico hidratado de fórmula Na_{12}(APO_{2}SiO_{2})_{12}. 27H_{2}O que tiene un tamaño {}\hskip1mm de partícula primario de 0,1 a 10 micras (peso expresado como base anhidra).

Na-SKS-6: : Silicato laminar cristalino de fórmula \delta-Na_{2}Si_{2}O_{5}.

Citrato: : Citrato trisódico dihidrato con una actividad del 86,4% y una distribución de tamaño de {}\hskip1mm partícula de 425 a 850 micras.

Ácido cítrico: : Ácido cítrico anhidro.

Borato: : Borato sódico.

Carbonato: : Carbonato sódico anhidro con un tamaño de partícula de 200 a 900 micras.

Bicarbonato: : Carbonato ácido de sodio anhidro con una distribución de tamaño de partícula de 400 a 1200 {}\hskip1mm micras.

Sulfato: : Sulfato sódico anhidro.

Sulfato de magnesio: : Sulfato de magnesio anhidro.

STPP: : Tripolifosfato sódico.

TSPP: : Pirofosfato tetrasódico.

MA/AA: : Copolímero aleatorio con una relación 4:1 de acrilato:maleato y un peso molecular medio de {}\hskip1mm aproximadamente 70.000 a 80.000.

MA/AA 1: : Copolímero aleatorio con una relación 6:4 de acrilato:maleato y un peso molecular medio de {}\hskip1mm aproximadamente 10.000.

AA: : Polímero de poliacrilato sódico con un peso molecular medio de 4.500.

PA30: : Ácido poliacrílico con un peso molecular medio de aproximadamente 4.500 a 8.000.

480N: : Copolímero aleatorio con una relación 7:3 de acrilato:metacrilato y un peso molecular medio {}\hskip1mm de aproximadamente 3.500.

Poligel/carbopol: : Poliacrilatos reticulados de elevado peso molecular.

PB1: : Perborato sódico anhidro monohidrato de fórmula nominal NaBO_{2}.H_{2}O_{2}.

PB4: : Perborato sódico tetrahidrato de fórmula nominal NaBO_{2}.3H_{2}O.H_{2}O_{2}.

Percarbonato: : Percarbonato sódico anhidro de fórmula nominal 2Na_{2}CO_{3}.3H_{2}O_{2}.

NaDCC: : Dicloroisocianurato sódico.

TAED: : Tetraacetiletilendiamina.

NOBS: : Sulfonato de nonanoiloxibenceno en forma de sal sódica.

NACA-OBS: : Sulfonato de (6-nonamidocaproil) oxibenceno.

DTPA: : Ácido dietilentriamino pentaacético.

HEDP: : Ácido 1,1-hidroxietano difosfónico.

DETPMP: : Dietiltriamino penta(metilen) fosfonato, comercializado por Monsanto bajo la marca regis- {}\hskip1mm trada Dequest 2060.

EDDS: : Ácido etilendiamino-N,N'-disuccínico, isómero (S,S) en la forma de su sal sódica.

MnTACN: : 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano de manganeso.

Blanqueante fotoactivado: : Ftalocianuro de zinc sulfonado encapsulado en polímero soluble en dextrina.

Blanqueante fotoactivado 1: : Ftalocianuro de aluminio sulfonado encapsulado en polímero soluble en dextrina.

PAAC: : Sal de pentaamino acetato de cobalto(III).

Parafina: : Aceite de parafina comercializado bajo la marca registrada Winog 70 por Wintershall.

NaBz: : Benzoato sódico.

BzP: : Peróxido de benzoilo.

Mananasa: : Mananasa de Bacillus agaradherens, NCIMB 40482.

Proteasa: : Enzima proteolítica comercializada bajo la marca registrada Savinase, Alcalase, Durazym por {}\hskip-0.5mm Novo Nordisk A/S, Maxacal, Maxapem comercializada por Gist-Brocades y proteasas {}\hskip1mm descritas en las patentes WO91/06637 y/o WO95/10591 y/o EP 251 446.

Amilasa: : Enzima amilolítica comercializada bajo la marca registrada Purafact Ox Am® descrita en WO {}\hskip1mm 94/18314, WO96/05295 comercializada por Genencor; Termamil®, Fungamil® y Duramil®, {}\hskip1mm todas comercializadas por Novo Nordisk A/S, y las descritas en WO95/26397.

Lipasa: : Enzima lipolítica comercializada bajo la marca registrada Lipolase, Lipolasa Ultra por Novo {}\hskip1mm Nordisk A/S y Lipomax por Gist-Brocades.

Celulasa: : Enzima celulítica comercializada bajo las marcas registradas Carezyme, Celluzyme y/o Endo- {}\hskip1mm lasa por Novo Nordisk A/S.

CMC: : Carboximetilcelulosa sódica.

PVP: : Polímero de polivinilo, con un peso molecular medio de 60.000.

PVNO: : N-óxido de polivinilpiridina, con un peso molecular medio de 50.000.

PVPVI: : Copolímero de vinilimidazol y vinilpirrolidona, con un peso molecular medio de 20.000.

Abrillantador 1: : 4,4'-bis(2-sulfoestiril)bifenil disódico.

Abrillantador 2: : 4,4'-bis(4-anilino-6-morfolino-1,3,5-triazin-2-il) estilbeno-2,2'-disulfonato disódico.

Antiespumante de silicona: : Controlador de espuma de polidimetilsiloxano con copolímero de siloxano-oxialquileno co- {}\hskip1mm mo agente dispersante con una relación entre dicho controlador de espuma y dicho agente {}\hskip1mm dispersante de 10:1 a 100:1.

Antiespumante: : 12% de silicona/sílice, 18% de alcohol estearílico,70% de almidón en forma granulada.

Opacificante: : Mezcla acuosa de látex de monoestireno, comercializada por BASF AG bajo la marca regis- {}\hskip1mm trada Lytron 621.

SRP 1: : Poliésteres terminalmente protegidos con anión.

SRP 2: : Polímero de bloque corto de poli(1,2 propilentereftalato) dietoxilado.

QEA: : bis((C_{2}H_{5}O)(C_{2}H_{4}O)_{n})(CH_{3}) -N^{+}-C_{6}H_{12}-N^{+}-(CH_{3}) bis((C_{2}H_{5}O)-(C_{2}H_{4}O))_{n}, donde n es de 20 {}\hskip1mm a 30.

PEI: : Polietilenimina con un peso molecular medio de 1800 y un grado de etoxilación medio de 7 {}\hskip1mm residuos etilenoxi por nitrógeno.

SCS: : Cumeno sulfonato sódico.

HPMPEO: : Óxido de polietileno de elevado peso molecular.

PEGx: : Polietilenglicol, con un peso molecular de x.

PEO: : Óxido de polietileno, con un peso molecular medio de 5.000.

TEPAE: : Etoxilato de tetraetilenpentaamina.

BTA: : Benzotriazol.

pH: : Medido como solución al 1% en agua destilada a 20ºC.

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Ejemplo 1

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes de alta densidad para lavado:

6

7

Ejemplo 2

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes granuladas para lavado de particular utilidad en las condiciones de lavado a máquina en Europa:

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8

9

10

Ejemplo 3

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes de particular utilidad en las condiciones de lavado a máquina en Europa:

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11

12

Ejemplo 4

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes granuladas:

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13

14

15

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Ejemplo 5

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes que no contienen blanqueantes de especial utilidad para el lavado de ropa de color:

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17

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Ejemplo 6

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes:

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18

19

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Ejemplo 7

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20

21

Ejemplo 8

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22

23

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Ejemplo 9

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24

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Ejemplo 10

Se prepararon las siguientes formulaciones detergentes líquidas según la presente invención (los niveles se expresan en partes por peso y las enzimas en enzima pura):

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Ejemplo 11

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Ejemplo 12

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes líquidas (los niveles se expresan en partes por peso y las enzimas en enzima pura):

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27

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Ejemplo 13

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28

Ejemplo 14

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes granuladas para tejidos con una acción "suavizante durante el lavado":

29

30

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Ejemplo 15

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes en forma de pastilla de jabón (los niveles se expresan en partes por peso y las enzimas en enzima pura):

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31

32

Ejemplo 16

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes con aditivos:

33

Ejemplo 17

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes compactas y de alta densidad (0,96 Kg/l) para lavado de vajillas:

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34

35

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Ejemplo 18

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes granuladas para lavado de vajillas con una densidad aparente de 1,02 kg/l:

36

37

Ejemplo 19

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones detergentes en forma de comprimido comprimiendo una composición detergente granulada para lavado de vajillas a una presión de 13 KN/cm^{2} en una prensa rotatoria estándar de 12 cabezales:

38

380

39

Ejemplo 20

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones líquidas para lavado de vajillas:

40

400

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Ejemplo 21

Se prepararon según la presente invención las siguientes composiciones limpiadoras líquidas para superficies rígidas:

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41

410

Ejemplo 22

Se preparó según la presente invención la siguiente composición en pulverizador para la limpieza de superficies rígidas y la eliminación del moho en el hogar:

Mananasa	0,01
Amilasa	0,01
Proteasa	0,01
Octilsulfato sódico	2,0
Dodecilsulfato sódico	4,0
Hidróxido sódico	0,8
Silicato	0,04
Butil carbitol*	4,0
Aroma	0,35
Agua y componentes minoritarios	hasta el 100%

*Dietilenglicol monobutil éter

: (1) INFORMACIÓN GENERAL:

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: SOLICITANTE:

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: NOMBRE: The Procter & Gamble Company

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: CALLE: One Procter & Gamble Plaza

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: CIUDAD: Cincinnati, OHIO

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: PAÍS: EE.UU.

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: CÓDIGO POSTAL: 45202

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: TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones detergentes que comprenden una mananasa y una proteasa.

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: NÚMERO DE SECUENCIAS:6

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: FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:

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: TIPO DE SOPORTE: Disquette

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: ORDENADOR: PC compatible con IBM

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: SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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: SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0 Versión 1.25 (EPO)

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SEC.1

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 1407 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: CADENA: simple

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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: FUENTE ORIGINAL

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: CARACTERÍSTICA:

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: NOMBRE/CLAVE: CDS

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: POSICIONES: 1-1482

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. 1

42

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SEC.2

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 493 aminoácidos

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: TIPO: aminoácido

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. 2

43

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SEC.3

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 1407 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: CADENA: simple

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. 3

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44

45

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SEC.4

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 468 aminoácidos

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: TIPO: aminoácido

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. 4

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46

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SEC.5

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 1029 pares de bases

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: TIPO: ácido nucleico

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: CADENA: simple

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC.5

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SEC.6

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: LONGITUD: 363 aminoácidos

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: TIPO: aminoácido

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: TOPOLOGÍA: lineal

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: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. 6

48

Claims

1. Una composición detergente que comprende un ingrediente detergente, una enzima mananasa a un nivel del 0,0001% al 0,1% de enzima pura en peso de la composición total y una enzima proteasa.

2. Una composición detergente según la reivindicación 1, en la que dicha mananasa está presente a un nivel del 0,001% al 0,02% de enzima pura en peso de la composición total.

3. Una composición detergente según las reivindicaciones 1-2, en la que la enzima proteasa está presente a un nivel del 0,0001% al 2% de enzima pura en peso de la composición.

4. Una composición detergente según las reivindicaciones 1-3, en la que la enzima proteasa está presente a un nivel del 0,005% al 0,1% de enzima pura en peso de la composición.

5. Una composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteasa es una proteasa endo-serina EC 3.4.21 según la clasificación IUPAC y variantes de la misma.

6. Una composición detergente según la reivindicación 5, en la que la proteasa es una proteasa subtilisina EC 3.4.21.62 según la clasificación IUPAC y variantes de la misma.

7. Una composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende también un tensioactivo seleccionado de tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos y/o mezclas de los mismos.

8. Una composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que también comprende un agente blanqueador.

9. Una composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que también comprende un aditivo reforzante de la detergencia, preferiblemente una zeolita, un silicato sódico laminar, un tripolifosfato sódico y/o mezclas de los mismos.

10. Un método para limpiar tejidos, vajillas o superficies rígidas con una composición detergente para limpieza según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.