EP1029077A2 - Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren - Google Patents

Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren

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EP1029077A2
EP1029077A2 EP98955529A EP98955529A EP1029077A2 EP 1029077 A2 EP1029077 A2 EP 1029077A2 EP 98955529 A EP98955529 A EP 98955529A EP 98955529 A EP98955529 A EP 98955529A EP 1029077 A2 EP1029077 A2 EP 1029077A2
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
probe
sequence
sequences
primers
Prior art date
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Ceased
Application number
EP98955529A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Kessler
Gerd Haberhausen
Knut Bartl
Henrik Orum
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from DE19814001A external-priority patent/DE19814001A1/de
Priority claimed from DE19814828A external-priority patent/DE19814828A1/de
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP1029077A2 publication Critical patent/EP1029077A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of nucleic acids, in which an amplification of a section of these nucleic acids is carried out and this section must meet certain conditions with regard to its base sequence, and a reagent kit containing two primers and a probe which define this section.
  • nucleic acid sequences are important in the basic area, but of particular importance in various fields of application, e.g. B. in the fields of medical diagnostics, forensic diagnostics, food diagnostics, environmental diagnostics, crop protection and veterinary medicine.
  • oligonucleotides short DNA or RNA
  • polynucleotides longer DNA or RNA
  • the shorter probes have the advantage of greater sequence selectivity compared to the longer probes, but because of the shorter hybridization range, the disadvantage of lower sensitivity.
  • Improved sensitivity and sequence selectivity is achieved with PNA probes (peptide nucleic acids, e.g. WO 92/20702), since these probes have a higher binding affinity for nucleic acids (higher Tm) and are characterized by a higher base discrimination ( ⁇ Tm).
  • probes for nucleic acid detection can carry labeling groups which are suitable either for capturing and / or for detecting hybrid complexes of the probe and the nucleic acid to be detected.
  • one or more probes are used either for hybridization in solution or on solid supports.
  • nucleic acid detection in solution one speaks of homogeneous detection formats, for detection on solid supports and / or mediated by solid supports of heterogeneous detection formats.
  • the heterogeneous detection method e.g. dot blot
  • the nucleic acid to be detected can be pre-bound on the solid support.
  • Hybridization occurs by contacting a solution containing the probe.
  • the probe can be pre-bound on the solid support (e.g.
  • the hybridization takes place by contacting the bound probe with a solution which contains the nucleic acid to be detected.
  • a solution which contains the nucleic acid to be detected.
  • the complex of nucleic acid and probe to be detected can only be formed in solution and the binding to the solid support can only take place afterwards.
  • probe pairs are used which carry energy-transferring groups and which are brought into direct contact via co-hybridization to the nucleic acid to be detected and thereby generate a signal.
  • probes can also be used which, after binding to the nucleic acid to be detected, are converted from a quenched to an unquenched state by enzymatic 5'-nuclease activity in solution.
  • the detection of nucleic acids by probe hybridization alone has only limited sensitivity. Even with sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA, only sensitivity in the pg to fg range is possible.
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitivities in the ag area and a high detection specificity are necessary. This applies both to the detection of foreign nu
  • infectious agents such as. B. HCV, HIV and HBV can be detected in just a few copies in order to ensure successful medical intervention measures, e.g. B. by early drug treatment.
  • the detection of nucleic acid sequences of the infectious agents is advantageous because, due to the availability of nucleic acid amplification techniques (nucleic acid amplification methods), sensitive detection is possible even in an early infection phase (latency phase).
  • nucleic acid amplification techniques nucleic acid amplification methods
  • sensitive detection is possible even in an early infection phase (latency phase).
  • the possibility of the targeted multiplication of the agent to be detected exists only in the case of nucleic acids, but not in the case of immunological detection methods.
  • the detection of nucleic acid hybridization has the advantage that, for. B. the infectious agent can be detected directly after infection and very sensitive.
  • nucleic acid detection must not only be very sensitive, but also very specific and reproducible. The specific and sensitive nucleic acid detection must also be carried out quickly so that targeted therapy can take place immediately.
  • nucleic acid detection methods When detecting the presence or absence of the body's own nucleic acid within certain genomic loci and / or their changes, such as. B. inherited, spontaneous or a mixture of inherited and spontaneous mutations, deletions, inversions, translocations, rearrangements or triplet expansions in the form of specific and / or polymorphic changes, the availability of specific and sensitive nucleic acid detection methods is also advantageous. However, the availability of specific and sensitive nucleic acid detection methods is of great importance not only in the medical sector but also in the other fields of application mentioned.
  • nucleic acid amplification nucleic acid amplification
  • nucleic acid detection reactions detection
  • the nucleic acid to be detected is used in a form that is accessible for the multiplication reactions, e.g. B. in the form of untreated or treated sample material and / or sample material concentration, for. B. by adsorption of the untreated or treated sample material to the surface of a solid support and subsequent absorption of this solid support.
  • Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces. These solid supports do not Substantial purification and / or isolation of the nucleic acids to be detected, but only a concentration of sample material and possibly inactivation and / or elimination of inhibitors for the subsequent nucleic acid amplification and detection reactions. These solid supports also make it possible to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in a form accessible for nucleic acid amplification and detection reactions possible.
  • sample preparation methods contain targeted method steps for nucleic acid-specific and / or sequence-specific binding of the nucleic acid to be detected, e.g. B. the use of solid supports with nucleic acid-specific binding groups and / or nucleic acid capture probes for the selective binding and release of the nucleic acid to be detected by nucleic acid-specific binding and subsequent dissociation between the binding group and / or carrier-bound capture probe and nucleic acid to be detected.
  • This type of solid support requires nucleic acid-specific binding groups and / or nucleic acid capture probes on the surface of the solid support. Therefore, for
  • nucleic acids to be detected e.g. B. in the context of multiplexing, either several solid supports necessary, which is more complex, or solid supports with one or more binding groups and / or with multiple or more capture probes.
  • Multiple capture probes contain several binding sequences for several nucleic acids to be detected. This carrier with several
  • Binding groups and / or several and / or multiple capture probes are, however, more complex to produce. Likewise, the reaction conditions for the targeted binding of several nucleic acids to be detected to carriers with several binding groups and / or capture probes are more difficult to set, or the binding of several types of nucleic acid to be detected to a nucleic acid-specific binding group or to a capture probe with several complementary hybridization sequences is more difficult to set.
  • the multiplication and detection of the provided nucleic acids to be detected takes place in heterogeneous or homogeneous nucleic acid multiplication detection formats.
  • the nucleic acid amplification reactions and detection reactions can either successively (heterogeneous test methods) or simultaneously (homogeneous test methods). Either target-specific nucleic acid amplification reactions, target-dependent signal nucleic acid amplification reactions or signal nucleic acid amplification reactions are used as amplification reactions.
  • Detection systems are used to detect the increased nucleic acids either by incorporating nucleotides and / or by using labeled primers or labeled probes.
  • the detection systems used contain either direct or indirect detection markings or coupled secondary and tertiary detection components. However, the detection of the increased nucleic acids to be detected can also be carried out by spectroscopic or physical methods.
  • Nucleic acid itself but only a detection signal coupled to it is amplified independently of the target.
  • Examples are coupled signal cascades (e.g. SELF cycle) or signaling probe tree or brush structures (e.g. branched DNA).
  • Detection signal in the form of a nucleic acid reporter molecule target sequence - is enzymatically propagated independently.
  • Examples are the Qß replication reaction, in which a Qß reporter molecule is enzymatically propagated, or the ligase chain reaction, in which parts of the nucleic acid reporter molecules are linked enzymatically independently of the sequence.
  • nucleic acid amplification products of the most sensitive and specific exponential target-specific nucleic acid amplification reactions such as PCR (US-A-4,683,202 or EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329) 822) or TAM (WO 91/01384)
  • PCR US-A-4,683,202 or EP-B-0 202 362
  • RT-PCR RT-PCR
  • SDA RNA RNA RNA RNA RNA
  • NASBA EP-A-0 329) 822
  • TAM WO 91/01384
  • target sequence-dependent thermocyclic or isothermal enzymatic elongation opposing primers which are sequence-specific for the nucleic acid to be detected and at the ends of the nucleic acid amplification unit (amplicon) bind deoxyribo or ribo nucleic acids to be detected or their complements and thus limit the nucleic acid amplification products generated.
  • amplicon nu
  • nucleic acid amplification detection methods mentioned with integrated target-specific nucleic acid amplification reactions are most specific due to target sequence-dependent enzymatic nucleic acid amplification cycles. While linear target-specific nucleic acid amplification reactions, such as the cycling probe reaction, only lead to limited sensitivity, result in exponential target-specific ones Nucleic acid amplification reactions such as elongation-based reactions such as the polymerase chain reaction (PCR, RT-PCR, SDA) or transcription-based reactions such as Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TMA) have so far been the most sensitive and most specific signals
  • Target-dependent signal nucleic acid amplification and target-specific nucleic acid amplification such as the gap-filling ligase chain reaction (gap-filling LCR, WO 90/01069)
  • Gap-filling LCR WO 90/01069
  • a target-dependent reaction step compared to the unmodified LCR, this is but limited to limited sequence sections consisting of only 1 or 2 base specifics and thus more limited target specificity
  • Various methods are available for the detection of the nucleic acid formed.
  • the detection of the nucleic acid amplification products formed by fragment or sequence gel analysis is time-consuming and not quantitative.
  • the detection of carrier-bound dot, slot or reverse dot blot methods is also time-consuming and not quantitative.
  • Quantitative sensitive and specific determinations of the nucleic acids to be detected have so far been possible in the context of heterogeneous or homogeneous target-specific exponential nucleic acid amplification reaction formats in which the nucleic acid amplification product either by built-in labels or by hybridization with a probe specific for the nucleic acid to be detected or its complement in a part of the sequence section created by elongation is intercepted.
  • Exponential nucleic acid amplification reaction formats in which nucleic acid-binding dyes are intercalated are also sensitive, but are not sequence-specific.
  • the nucleic acid amplification product z. B either via a primer capture modification or by an immobilized capture probe, which is complementary to an internal sequence section of the nucleic acid amplification product, bound to a solid support and incorporation of a detection-labeled nucleotide, by hybridization with a detection-labeled probe, which is complementary to an internal Sequence section of the nucleic acid
  • Propagation product is detected, or via a primer detection modification.
  • detection has so far been carried out e.g. B. via the hybridization of a probe which is complementary to an internal sequence section of the nucleic acid amplification product and which bears a quenched fluorescence label, the target sequence-dependent enzymatic cancellation of the quenching being carried out by the primer elongation-related release of the quenched fluorescence-labeled nucleotide (WO 92 / 0263.8), or via the attachment and / or intercalation of a detectable molecule or a detectable group.
  • nucleic acid amplification units In all previous quantitative sensitive and specific heterogeneous and homogeneous target-specific exponential nucleic acid amplification reaction formats, nucleic acid amplification units (amplicons) have so far been used which, in addition to the specific primer and probe binding sequences, additional sequences of variable length between the flanking primer binding sequences and the internal one Contained probe binding sequence. This five-part amplicon structure resulted in amplicon lengths greater than the sum of the sequence lengths of the two flanking primers and the internal probe between preferably 100 and 1000 bases (pairs). So far, optimizations of the nucleic acid amplification reaction by means of improved enzyme mixtures have mainly been directed towards longer nucleic acid amplification products.
  • Shorter amplicon lengths have so far only been used to detect special sequences such as e.g. B. in triplet expansions, for in-situ studies or the detection of highly fragmented nucleic acids in the context of antiquity research.
  • these short amplicon lengths were detected in more time-consuming gel formats or in-situ formats, which are characterized by a lack of sensitivity and / or a lack of quantification.
  • Other special short sequences such as short tandem repeats, short interspersed repetitive elements microsatellite sequences or HLA-specific sequences have so far only been used as primer or probe binding sequences, or in combination with other sequences.
  • the five-part nucleic acid amplification products have the disadvantage that they contain, in addition to the specific primer and probe binding sequences, additional sequences which extend the amplicon and reduce the overall specificity with regard to the specificity-generating primer and probe binding reactions.
  • the longer five-part nucleic acid amplification products used to date also have the disadvantage of longer primer elongation times and thus longer overall test times.
  • the sensitivity is also limited by the plateau effects of the enzymes and substrates involved, which are achieved earlier with longer amplicons.
  • Another The disadvantage of longer nucleic acid amplification products is an increasing competition between amplicon counter strand and detector or capture probe and thus reduced sensitivity.
  • Another disadvantage is the increased possibility of non-specific binding due to the additional sequences with the consequence of an increased background and therefore lower sensitivity (lower signal-to-noise ratio).
  • nucleic acid amplification product Another disadvantage of binding the nucleic acid amplification product to carrier-bound capture probes is the steric and kinetic hindrance of longer nucleic acid molecules; therefore nucleic acid amplification products of previous lengths are preferably fragmented before binding by the capture probe. Another disadvantage is the increased susceptibility to fragmentation within the amplicon sequence and thereby destruction of the nucleic acid amplification unit; this leads to lower reproducibility. Another disadvantage is that longer nucleic acid amplification products at low test temperatures of e.g. B. 37 ° C, which are specified in conventional nucleic acid analyzers, hybridize less specifically, since there is a greater difference to the melting temperature. Another disadvantage of five-part nucleic acid amplification products in the detection of several different nucleic acid amplification products is that different nucleic acid amplification lengths are formed, which make multiplex detection more difficult.
  • the aim of the present invention was to provide an alternative detection method for
  • a special object of the invention was to provide a target-dependent exponential nucleic acid amplification method for highly sensitive, highly specific, reproducible and quantifiable detection of one or more single-stranded or double-stranded nucleic acids, which in particular avoids one or more of the disadvantages mentioned.
  • a further object of the invention was to make the selection of the primer and probe sequences so flexible while maintaining the overall specificity that a determination several different nucleic acids to be detected in a unified reaction format using preferably partially identical primer or probe sequences is possible.
  • the invention relates to a method for producing a large number of amplificates of a section of this nucleic acid with the aid of two primers, one of which can bind to a first binding sequence (A) of a strand of the nucleic acid and of which the other to a second binding sequence (C), which is essentially complementary to a sequence C of this strand which does not overlap with A and is located in the 3'-direction of A, contacting the amplificates with a probe with a binding sequence D which is linked to the third one located between sequences A and C.
  • Sequence (B) or the complement (B ') thereof and detection of the formation of a hybrid of an amplificate and the probe, characterized in that the third sequence (B) or the complement (B ') of which does not contain any nucleotides which do not belong to the sequence region E formed from the binding sequence D of the probe and the sequence of the amplificate bound to it belong.
  • the invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.
  • the amplificates can have one or more further regions Y which lie outside the region which contains the sequence information derived from the nucleic acid to be detected.
  • FIG. 3 shows schematically how the binding sequences of the primer and probe are arranged in the case of the present invention.
  • I to VI There are different alternatives I to VI, depending on whether and how the binding sequences overlap. It is only one strand of the amplificate is shown in each case. The same arrangement (only complementary) can be created for a second strand of the amplificate. A similar picture emerges for the intermediate extension products.
  • cases V and VI the case is shown that, in addition to the binding sequence D, the probe also contains further regions X which do not form base pairs with the amplificate and which may be the same or different.
  • VII the sequences Z represent the additional sequences of the five-part amplicons.
  • FIG. 6 shows the connections used in FIG. 5.
  • FIG. 7 shows a region of the HCV genome which is particularly suitable for carrying out the method according to the invention, and a sequence from which the primer and probe sequences are preferably selected.
  • This second sequence is taken from the non-human pathogenic virus HGBV-B.
  • the primer and probe sequences selected from this are therefore sequences which are not specific for HCV (J. Med. Virol. 48: 60-67).
  • FIGS. 8 to 10 Preferred sequences for primers and probes for HCV detection are shown in FIGS. 8 to 10.
  • Nucleic acids that can be detected with the method according to the invention can be of any origin, for example nucleic acids of viroid, viral, bacterial or cellular origin or from yeasts or fungi.
  • Samples (specimen) in which the nucleic acid sequences to be detected or their complement are contained are e.g. B. human, animal, bacterial or vegetable liquids, or liquids from yeast or fungi, excrement, smears, cell suspensions, cultures or tissue, cell or liquid punctures.
  • the nucleic acids are preferably in solution. So that the method according to the invention can fully develop its advantages, it has proven to be useful if the nucleic acid to be detected has a size of at least 40 bp.
  • the nucleic acid can also be a nucleic acid produced by cloning, amplification, in vitro and in vivo amplification.
  • the nucleic acid to be detected can be single-stranded (in particular in the case of RNA) or double-stranded (in particular in the case of DNA). In the case of double-stranded
  • Nucleic acids can be propagated both strands or just one. Single or double-stranded amplificates can be formed from both types of nucleic acids, one or both of which can be used for further detection. The sequence of the probe or probes is selected accordingly.
  • the sample or a control sample can be positive or negative
  • Control nucleic acids or quantification standards can be added, which are treated similarly or identically to the nucleic acids to be detected.
  • internal or external heterologous or homologous DNA or RNA standards containing primer binding sequences homologous and probe binding sequences heterologous to the sequences of the nucleic acids to be detected can be used as standards.
  • primer binding sequences which are heterologous, particularly in the 3 'priming region, and homologous probe binding sequences are also possible to use primer binding sequences which are heterologous, particularly in the 3 'priming region, and homologous probe binding sequences.
  • Analog specimens which do not contain the nucleic acids to be detected or their complement are preferably used as negative controls.
  • the sample Before the multiplication, the sample is preferably subjected to one or more pretreatment steps in order to bring the nucleic acids to be detected into a form capable of replication.
  • a pretreatment of the sample takes place, by means of which the sample is brought into a form from which the nucleic acid to be detected is brought into a form suitable for the transfer of the pretreated sample into a form suitable for multiplication (for example separation interfering components from the sample).
  • the type of pretreatment of the sample depends on the type of sample and the complexity of the biological material in the sample.
  • human body fluids such as B.
  • human blood is first separated of blood cells to produce plasma, serum or blood cell concentrates.
  • the complexity of the biological sample material in the resulting fractions is significantly reduced by the sample pretreatment without the nucleic acid to be detected being substantially isolated.
  • sample pretreatment is carried out, e.g. B. by suspending the sputum or the smear in a liquid, in the case of urine z. B. by centrifugation and further processing of the fractions obtained.
  • tissue punctures sample pretreatment is carried out e.g.
  • sample pretreatment is carried out e.g. B. by centrifugation and further processing of the fractions obtained. In these cases, too, the sample pretreatment reduces the complexity of the biological sample material.
  • the nucleic acid to be detected is converted from the pretreated sample into a form which is accessible for the multiplication.
  • the pretreated sample is lysed in a first reaction step to release the nucleic acid to be detected, eg. B. by proteinase K treatment at elevated temperatures or in deoxyribonucleic acids by alkali.
  • the sample pretreated by lysis is added after the addition of chaotropic agents, such as. As guanidinium hydrochloride or urea, in the presence or absence of soluble alcohols, such as. B. isopropanol, concentrated on the surface of a solid support and subsequent absorption of this solid support.
  • Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces (e.g. magnetic particles, glass fleece with glass-containing surfaces, particles, microtiter plates, reaction vessels, dip sticks or miniaturized reaction chambers, which in turn can also be part of integrated reaction chips).
  • This solid support is preferably used for non-sequence-specific purification, that is to say no substantial isolation of the nucleic acids to be detected from other nucleic acids, but only a concentration of sample material (nucleic acids) and, if appropriate, inactivation and / or elimination of inhibitors for the subsequent ones Nucleic acid amplification and detection reactions.
  • These solid supports also make it possible to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in a form accessible for nucleic acid amplification and detection reactions possible.
  • the lysed pretreated sample for binding the nucleic acid to be detected is brought into contact with solid supports which have been modified with nucleic acid-specific binding groups and / or capture probes specifically for the selective binding of the nucleic acid to be detected, and then the bound nucleic acid to be detected by dissociation between Binding group and / or carrier-bound capture probe and nucleic acid to be detected again eluted.
  • nucleic acid-specific binding groups are PNA homopyrimidine oligomers such as. B. (T) 7 -PNA or nucleic acid-binding low-molecular substances such as. B. nucleic acid intercalators, major groove binders or minor groove binders.
  • capture probes specific for the nucleic acid to be detected are nucleic acid oligomers or nucleic acid polymers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected.
  • Further examples of capture probes specific for the nucleic acid to be detected are PNA oligomers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected.
  • the binding of the nucleic acid-specific binding groups or the capture probes to the solid support can be carried out with or without the interposition of spacers either covalently or via binding pairs, such as. B. BiotimStreptavidin or NLChelat.
  • the nucleic acid sequences used for amplification can be linear or circular and can sequence modifications and / or other modifications, such as. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or equivalents thereof, contain or be methylated, capped, polyadenylated or modified in some other way.
  • the ones used for propagation Nucleic acids or their complement can be of natural origin, fragmented, modified or enzymatic, e.g. B. with the enzyme uracil deglycosylase (UNG), or physically pretreated, propagated, or chemically, photochemically or enzymatically generated, for. B. by chemical oligonucleotide synthesis or in vitro replication, in vitro reverse transcription or in vitro transcription.
  • UNG uracil deglycosylase
  • a section of the nucleic acid to be detected is amplified.
  • this section is also called the amplicon.
  • This contains the sequence region between the outer ends of the binding sequences A and C or the complement thereof of the primer (the primer binding regions), and contains the binding region E of the probe or the complement thereof.
  • the amplicon (preferably the total length of the sequences of regions A, B and C) is preferably shorter than 100 nucleotides, particularly preferably shorter than 60 nucleotides, but preferably longer than 40 nucleotides. However, this does not mean that the total length of the amplificates cannot be longer, e.g. B. if the primers additionally have nucleotides.
  • Such propagation methods are used which permit an amplification of the nucleic acid sequence to be detected or its complement, which result in the formation of tripartite mini-nucleic acid amplification products [Mini Chain Reaction (MCR)].
  • MCR Trim Chain Reaction
  • Target-specific nucleic acid amplification reactions are preferably used.
  • exponential target-specific nucleic acid amplification reactions are particularly preferably used, in which an antiparallel replication of the nucleic acid to be detected or its complement takes place, such as, for. B. elongation-based reactions such.
  • Deoxyribonucleic acids RT-PCR for ribonucleic acids
  • transcription-based reactions such as B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TMA).
  • Thermocyclic exponential elongation-based nucleic acid amplification reactions such as, for. B. uses the polymerase chain reaction.
  • the for The amplification of the nucleic acids to be detected or their complement can be in the form of single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids or ribonucleic acids.
  • the aim of the amplification reaction (amplification) is to produce a large number of amplificates of a section of the nucleic acid to be detected.
  • An amplificate is therefore understood to mean any molecular species produced using sequence information of the nucleic acid.
  • they are nucleic acids.
  • the term "amplificate" includes both single-stranded and double-stranded nucleic acids.
  • an amplificate can also contain further regions outside the mutually pointing ends of the primer binding sites which are not directly related to sequences of the nucleic acid to be amplified.
  • sequences with a length of more than 15 nucleotides preferably do not occur on the nucleic acid to be detected or its complement and cannot hybridize with it by direct base pairing. Amplificates can therefore either be identified with the
  • Amplificates are, for example, the products of asymmetric amplification, i.e. H. an amplification in which the two strands are formed in different amounts (e.g. by using different amounts of primers) or one of the two strands is destroyed again (e.g. by RNase).
  • a primer in the sense of the present invention is understood to mean a molecule which can bind to a nucleic acid T or its complement via base pairings and which can be extended, preferably enzymatically.
  • Preferred are oligonucleotides which can be extended at their 3 'end using the nucleic acid to be detected or a complement thereof as template nucleic acid.
  • Monovalent or multivalent or monofunctional or multifunctional agents which permit nucleic acid-dependent elongation can be used as primers. These agents can also be composed of different types of molecules, e.g. B. Chimeras from PNA and nucleotide (s) or from protein / peptide and nucleotide (s).
  • Oligomers are particularly preferably used as primers which, after addition of a multiplication reagent by addition of at least part of the primer to the nucleic acid to be detected or its complement, initiate a directed replication of one or both strands of the nucleic acid to be detected or its complement.
  • An example of a particularly preferred primer is an oligonucleotide with a free 3 'hydroxyl end.
  • the agents used as primers can contain one or more binding sequences for one or more nucleic acids to be detected or their complement and can sequence modifications, terminal and / or internal sequence additions and / or other modifications such as.
  • Preferred nucleotide equivalents are PNA monomers or PNA oligomers (WO 92/20702) with or without positive and / or negative charges in the backbone and / or in the spacer.
  • the agents used as primers can carry modifications which are suitable either directly or indirectly via a further pair of bonds for detection and / or binding to a solid support.
  • Preferred primer modifications are the fluorescent dyes such.
  • a particularly preferred primer modification is biotin as a capture or detection modification.
  • the primers can contain further sequence regions Y, in particular on its 5 'end (Fig. 2).
  • 5 '-3' links as well as 5'-5 'links and / or 5' -2 'links are possible. They can also additional structural components such. B. spacers, immobilizable groups or solubility-imparting parts of the molecule or areas which can be activated with regard to priming activity, such as, for. B. AP positions.
  • a probe is understood to be a molecule which can hybridize with nucleic acids due to base-base interactions.
  • Preferred probes are therefore oligonucleotides and base-containing nucleic acid mimetics, such as peptide nucleic acids (PNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • the length of a probe, based on the binding sequence D, is preferably between 9 and 30 bases.
  • PNA oligomer probes with or without positive or negative charges in the backbone and or spacers have the additional advantages that they are stable against the degradation of nucleases or proteases because of the different structure of the backbone and the H or NH 2 ends, a higher melting point in binding complexes between nucleic acids and PNA than between two
  • Nucleic acid molecules and the hybrid complex is therefore more stable, can be used at low salt concentrations, has a higher difference in melting points in the case of mismatches and thus better mismatch discrimination is possible, sequences with secondary structures at low salt concentrations are more accessible, the competition between amplicon Ge - Genstrang and probe is lower at low salt concentrations and thus a higher signal yield is achieved and there is the potential to eliminate the amplicon denaturation step at low salt concentrations.
  • Monovalent or multivalent agents can be used as probes, which allow the binding of amplification-dependent elongation products and / or increased nucleic acid sequences.
  • Oligomers or polymers which bind antiparallel to the nucleic acid to be detected can preferably be used as probes. Oligomers are particularly preferably used as probes, which by attaching at least a part of the probe to the nucleic acid to be detected or the complement of which brings about a stable bond to one or both strands of the nucleic acid to be detected or its complement as part of the subsequent reactions.
  • the oligomers can have 5 '-3' linkages as well as 5 '-5' linkages and / or 5 '-2' linkages as well as additional structural components such as e.g. B. spacers or solubility-imparting molecular parts.
  • a binding sequence is preferably understood to mean the sequence of bases which lies between the outermost bases of a particular nucleic acid, a primer or a probe, including a particular nucleic acid, a primer or a probe via base-base interaction, including these outermost bases.
  • the agents used as a probe may contain one or more binding sequences D for one or more nucleic acids to be detected or their complement, but in particular for one strand of the amplificate, and may include sequence modifications, terminal and / or internal sequence additions and / or other modifications such as, for. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof, non-functional nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or equivalents thereof or be methylated, capped or polyadenylated or modified in any other way as long as binding to a strand of the amplificate is possible.
  • Preferred nucleotide equivalents are PNA monomers or PNA oligomers with or without positive and / or negative charges in the backbone and / or spacers.
  • the agents used as probes can carry modifications which are suitable either directly or indirectly via a further binding pair for detection and / or binding to a solid support.
  • Preferred probe modifications are the fluorescent dyes such as, for. B. fluorescein, rhodamine, AMCA or derivatives thereof, binding pairs biotin: (strept-) avidin, digoxigeni anti-digoxigenin, digoxigenin: anti-digoxigenin coupled with equorin, fluorescei anti-fluorescein or ruthenium chelate or equorin.
  • probe modifications are biotin as capture or detection modification, digoxigenin, ruthenium or rhenium chelate or equorin as detection modifications.
  • the portion of the nucleic acid from which a large number of amplicons are to be produced is selected so that it contains three regions A, B and C. Areas A and C are areas which are selected so that one primer can use sequence A as a binding sequence and the complement of area C can serve as a binding sequence for the other primer.
  • a complement is used to form a certain other nucleic acid, e.g. B. a sequence area z.
  • an amplificate or the nucleic acid to be detected is essentially complementary nucleic acid or nucleic acid sequence.
  • Essentially complementary means that the base pairings are selected such that (in the event that hybridization with another nucleic acid, e.g. a probe or a primer) hybridization can still take place under the test conditions or (in the case an extension product of a primer in relation to the template used) the nucleic acid could be formed due to a primer extension reaction using the corresponding nucleic acid.
  • Essentially complementary therefore often means that under stringent conditions more than 90% of the bases of the nucleic acid or sequence under consideration form base pairings with the specific nucleic acid or sequence.
  • Regions A and C are preferably long enough according to the invention that conditions can be found under which primers of a corresponding length can hybridize with the bases in these regions.
  • the regions are therefore preferably longer than 8, particularly preferably longer than 12 nucleotides.
  • preferred ranges also result with regard to the upper limit of the length of regions A and C.
  • the regions A and C are each preferably less than 30, particularly preferably less than 20 nucleotides.
  • the length of the regions is limited by the fact that the primers should be able to hybridize to them in a manner that is not specific to the nucleic acid to be detected. Therefore, the particularly preferred length of the binding sequences A and C is 12 to 20 nucleotides.
  • the areas A and C on the nucleic acid to be detected do not overlap.
  • the section of the nucleic acid to be detected (which corresponds to the amplicon) and thus the amplificates formed therefrom contain a sequence B located between regions A and C (FIGS. 1 to 3).
  • This sequence has a length of one or more nucleotides, preferably more than 4, particularly preferably more than 8 nucleotides.
  • the length of sequence B is limited at the top by the required non-presence of nucleotides which do not belong to the binding sequence of the probe, and in a particular aspect of the invention by the desired nonspecificity of the probe.
  • Sequence B is therefore preferably less than 30, particularly preferably less than 15 nucleotides.
  • Sequence B preferably has a length of between 4 and 30 nucleotides.
  • the length of the sequence B is particularly preferably between 8 and 15 nucleotides.
  • this sequence or the complement thereof also serves to bind the probe.
  • the length of the probe is chosen so that hybridization with the amplificate is possible.
  • the sequence of the probe is selected such that it contains a binding sequence D which is defined by the nucleotides of the probe which form base-base interaction with the amplicon, in particular the nucleotides of the probe which form base interaction between the outermost bases with corresponding bases of the amplicon.
  • the probe is preferably essentially complementary to the nucleotides of the binding sequence E of the amplificate.
  • the binding sequence D or its complement D ' can be 100% complementary to the amplificate, but can also have mismatches (mismatches) between the outer ends of the binding sequence.
  • the probe can contain further groups or residues or also nucleic acid-binding regions (FIG. 3, V, VI).
  • the binding sequence D or D ' is longer than the region B or B' of the amplicon.
  • the binding sequence D or D ' extends into one or both regions A or A' and C or C of the amplicon.
  • Fig. 3, II to IV the amplificate between the mutually pointing ends of regions A and C contains no nucleotides that are not of the binding sequence E or the binding sequences of the Belong to primer.
  • the binding sequence D of the probe overlaps with one of the two binding sequences of the primers in FIGS. 3, II and III.
  • the length of area B corresponds to the length of area D, so that the binding sequence of the probe does not overlap with the binding sequences of the primers (FIGS. 3, 1).
  • the method according to the invention includes the formation of three-part mini amplicons (tripartite mini amplicon) which, in addition to the primer and probe-binding sequences, have no additional sequences and thus avoid the disadvantages in the formation of longer nucleic acid amplification products, on the other hand however, the specificity of the entire amplification format is ensured by binding the primers, by binding the probe and by running the target-dependent enzymatic elongation reaction with all 4 nucleotide or base specificities or natural or artificial analogs, isomers or equivalents thereof.
  • the process according to the invention is therefore also referred to as a mini-chain reaction (MCR).
  • nucleic acid sequences to be detected, or their complement are amplified, unless stated otherwise, following the reaction steps and reaction conditions known to the person skilled in the art.
  • a difference to the conventional methods is the use of specially selected primers and probe sequences, which allow the formation and multiplication of the mini tripartite amplicon. It is essential for the purposes of the invention to add one or more primers which bind to the primer binding sequences of the nucleic acid to be detected, the tripartite mini-amplicon or their complements.
  • Enzymatic active components eg enzymes
  • suitable auxiliary reagents such as buffers
  • Preferred elongation substrates are nucleic acid building blocks or natural or artificial analogs or isomers or equivalents thereof.
  • Agents are used as elongation substrates Construction of a counter strand of the nucleic acid to be detected are suitable.
  • Nucleotides are preferably used as elongation substrates.
  • Preferred nucleotides are dATP, dGTP, dCTP, dTTP and / or dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP and ATP, GTP, CTP, UTP and or ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP.
  • Equivalents are PNA monomers or PNA oligomers with or without positive and / or negative charge in the backbone and / or in the spacer.
  • the elongation substrates can carry modifications as stated above.
  • thermostable enzymatic DNA polymerase activities and mixtures of deoxyribo- and / or ribonucleotides and suitable auxiliary reagents as nucleic acid amplification reagents, for.
  • auxiliary reagents such as. B. salts and optionally detergents.
  • deoxyribo- and ribonucleotides are used, e.g. B. mixtures of AMV or Mo-MLV reverse transcriptase or Tth-DNA polymerase in combination with dATP, dGTP, dCTP, dTTP and / or dUTP and ATP, GTP, CTP, UTP and auxiliary reagents such as. B. salts and optionally detergents.
  • thermocyclic multiplication reactions e.g. PCR, RT-PCR
  • 2- or 3-phase cycles are carried out, preferably 2-phase cycles.
  • the strand separation of the nucleic acid amplification products is carried out at high temperature, preferably 85 ° C.-95 ° C., the common primer annealing and primer elongation at temperatures close to the melting point between primer and elongation counter strand, preferably between 52 ° C and 75 ° C.
  • the strand separation is carried out by supplying energy and or enzymatically, preferably by elevated temperature, microwaves or the application of a voltage via a microelectrode, particularly preferably by elevated temperature. Up to 60 thermal cycles are carried out, preferably 32-42 cycles.
  • isothermal propagation reactions there is a continuous incubation at a medium temperature between 30 ° C and 70 ° C, preferably at 37 ° C - 45 ° C with enzyme mixtures, complexes or domains, or 60 ° C - 65 ° C with mesothermal enzyme mixtures, complexes or domains, in the case of SDA with z.
  • B. mesothermal residual donations and DNA polymerases, e.g. B. from Bacillus stearothermophilus (e.g. BsoBI / Bst DNA-Pol exo); alternative enzymes are Ava I and Bca DNA-Pol exo. It is incubated for up to 2 hours, preferably 30-60 minutes.
  • the multiplication reaction can take place in reaction vessels, capillaries or miniaturized reaction chambers, which can also be part of an integrated reaction chip.
  • DNA polymerase activity dUMP instead of dTMP is incorporated into the increased nucleic acid sequence or its complement.
  • uracil-deglycosylase preferably with a thermolabile embodiment of the enzyme activity, in which the renaturation after thermal denaturation of the enzyme activity takes place more slowly, the fragmentation of the amplification product and thus its property as nucleic acid amplification unit is possible.
  • the UMP-containing amplification product can be incubated after the nucleic acid amplification and detection reaction (sterilization) and / or before a renewed nucleic acid amplification reaction (carry over prevention).
  • psoralen and / or isopsoralen and derivatives thereof and irradiation with UV light can also be used for the functional inactivation of the nucleic acid amplification product.
  • nucleic acid amplification reagents e.g. B. a mixture of AMV or Mo-MLV reverse transcriptase, possibly E. coli DNA polymerase, possibly E. coli RNase H and T7, T3 or SP6-encoded RNA polymerase or Mo-MLV reverse transcriptase and T7, T3 or SP6 RNA polymerase or corresponding mesostable enzymes, e.g. B.
  • the formation of the amplificates is detected with the probe, which binds to the binding sequence B of the amplicon to form a hybrid.
  • the probe can act as a capture or detection probe.
  • the ends of the probe binding sequence lie between the outer ends of the primer binding sequences. The probe can thus be hybridized with one strand of the amplificate.
  • the probe can be bound using known conditions.
  • the method according to the invention is a special embodiment of the so-called hybridization tests, the basic features of which are known to a person skilled in the art in the field of nucleic acid diagnostics. Insofar as experimental details are not given below, the full content of this is "Nucleic acid hybridization", publisher B.D. Harnes and S.J. Higgins, IRL Press, 1986, e.g. B. in Chapters 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J.
  • the known methods also include the chemical synthesis of modified and unmodified oligonucleotides and the selection of hybridization conditions by means of which a specificity can be achieved which depends, among other things, on the extent of the homology between the nucleic acids to be hybridized, their GC content and their length.
  • the probe is added to the reaction mixture after the propagation reaction, preferably in the form of a solution.
  • Reagent conditions are set which allow hybridization of the probe with an amplificate.
  • the binding between the amplified nucleic acid sequence of the amplicon and / or its complement and the probe is preferably carried out at a constant temperature between 20 ° C and 75 ° C, preferably around 0 ° C - 30 ° C, particularly preferably around 0 ° C - 15 ° C below the melting temperature of the binding complex.
  • the incubation time is up to 4 hours, preferably 15-120 minutes, particularly preferably 30-60 minutes.
  • the binding with the amplificate and / or its complement takes place with or without a preceding denaturation step.
  • the reaction without a preceding denaturation step is preferably carried out with PNA oligomers with or without negative and / or positive charges in the backbone and / or in the spacer at low salt concentrations.
  • tripartite mini-amplicons preferably of similar length, particularly preferably of such tripartite mini-amplicons of the same length, allows the setting of standardized incubation conditions for the formation of the different binding complexes in the nucleic acid amplification. This allows the parallel and / or sequential detection of several nucleic acid sequences in the context of multiplex methods.
  • a multiplex amplification method is usually understood to be a method in which either different sequences on a nucleic acid (e.g.
  • the amplicon lengths preferably differ by no more than 20%, particularly preferably by no more than 5 nucleotides.
  • a detection method is preferably used in which a marking can be used for all the detections; for example, all probes for the individual amplificates can be labeled identically, e.g. B. with the same ruthenium complex.
  • This procedure is particularly advantageous for tests in samples from blood banks, since the type of infection is not important for the further usability of the samples for blood donations, but the sample is no longer suitable as blood donation material if any tested infection (e.g. B. HIV or HBV) is present.
  • the primers are selected from highly conserved regions of the analyte nucleic acids in such a way that all of the nucleic acid sequences to be detected are amplified with the one set of (2) primers.
  • a mixture of more than 2 primers is used, of which at least 2 have a different selectivity.
  • One or more of the primers can be specific for all or a subset of the nucleic acids to be detected. This method is particularly preferable when little-related sequences are to be amplified next to each other.
  • nucleic acid sequences to be detected can be amplified next to each other, e.g. B. different subtypes of a virus or bacteria of different genera or species.
  • the detection of the binding complex formed between the amplificate and the probe can be carried out in methods known to the person skilled in the art, in particular in various embodiments, namely direct detection methods, such as, for example, B. with spectroscopic or physical methods, by sequencing or by heterogeneous or homogeneous detection formats.
  • Direct spectroscopic or physical methods are e.g. B. melting temperature determinations, addition of intercalating or nucleic acid binding Dyes or metal atoms or particles, mass spectroscopy, surface plasmon resonance or fluorescence-coupled surface plasmon resonance, or E-wave measurements.
  • the sequenced tripartite mini amplicon can be sequenced via binding of the primer and subsequent enzymatic sequencing according to Sanger.
  • either the primer or the chain termination reagents are preferably labeled.
  • the sequencing products can also be detected using mass spectroscopy. When only limited types of nucleotides are added, corresponding to the flanking nucleotides at the end of the primer, mini-sequencing is possible, which is particularly advantageous for the analysis of polymorphisms.
  • the probe can be used either as a capture probe or as a detector probe, depending on the modification made.
  • multiple probes multiplex formats can be implemented.
  • the probe When using the probe as a capture probe, the probe can either be covalently bound to the solid support or prebound via a binding pair and the formation of the
  • Binding complex between the amplificate and the probe takes place on the solid support.
  • solid supports that contain one type of probe solid supports that contain several or a plurality of types of probes can also be realized, such as, for. B. probe beads or particles (so-called beads), probe test strips, probe panels or probe arrays on solid supports or miniaturized chips, which in turn can also be part of integrated reaction chips.
  • probe beads or particles probe test strips
  • probe panels or probe arrays on solid supports or miniaturized chips which in turn can also be part of integrated reaction chips.
  • These carrier-bound detection systems are particularly suitable for multiplex formats.
  • the complex between the amplificate and capture probe is first pre-formed in solution and then applied to the solid support.
  • the amplicon preferably contains an immobilizable group I which can bind to a group R located on a solid phase.
  • the type of solid phase depends on the group I which enables immobilization. It preferably has an immobilizing group R which can have a binding interaction with I.
  • the immobilizable group a hapten
  • a solid phase can be used which has antibodies against this hapten on its surface.
  • Is the immobilizable group a vitamin, such as. B. biotin
  • the solid phase can contain binding proteins such as avidin or streptavidin immobilized.
  • Particularly preferred residues I and R are biotin and streptavidin. Immobilization via a group on the modified
  • Nucleic acid is particularly advantageous because it can take place under milder conditions than, for example, hybridization reactions.
  • the reaction mixture is preferably filled into a vessel before, during or after the formation of the nucleic acid hybrids, the surface of which can react with the immobilizable group. It is possible to use a solid phase in the form of a porous material, such as a membrane, a fabric or a nonwoven, to which the reaction mixture is applied. Likewise, the use of beads, so-called beads - z. B. magnetic particles or latex particles - possible.
  • the vessel is preferably a cuvette, a tube or a microtiter plate.
  • the solid phase should have at least as many binding sites for the immobilizable group of the probe as there are nucleic acid hybrids and thus nucleic acids to be detected.
  • the preparation of a preferred solid phase is described in EP-A-0 344 578, to which reference is made in full.
  • the liquid phase is removed from the vessel, the porous material or the pelleted beads after the incubation period during which the immobilization reaction takes place.
  • the solid phase can then be washed with a suitable buffer, since the binding of the hybrids to the solid phase is very efficient.
  • the detection of the bound binding complexes can be carried out via the built-in during the nucleic acid sequence amplification reaction
  • Detection modification in the primer and / or a nucleotide and / or the probe is carried out with the aid of known direct or indirect detection types for these modifications according to the prior art.
  • the amount of labeling can be determined fluorometrically.
  • the detectable group is indirect detectable e.g. B. a hapten
  • the modified nucleic acid is preferably reacted with a labeled antibody against the hapten, as described analogously in EP-A-0 324 474.
  • the label on the antibody can be, for example, a color or fluorescent label or, preferably, an enzyme label, such as ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase.
  • an enzyme label such as ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase.
  • Enzyme labeling is the amount of nucleic acid measured by mostly photometric, chemiluminometric or fluorometric monitoring of a reaction of the enzyme with a chromogenic, chemiluminogenic or fluorogenic substrate.
  • the measurement signal is a measure of the amount of originally present nucleic acid to be detected and thus possibly of organisms to be detected.
  • the increased tripartite mini amplicons are bound by nucleic acid capture probes or PNA capture probes, which are covalently immobilized on micro titer plates or magnetic particles.
  • the detection takes place after formation of the binding complex and washing via a biotin modification of one or both primers in the amplificate by addition of avidin-horseradish peroxidase and a mixture of TMB / TMF color substrates.
  • a digoxigenin detection marker is incorporated via one of the nucleotides of the nucleic acid amplification reaction.
  • the binding complex between the amplificate and a biotin-labeled nucleic acid capture probe or PNA capture probe is bound to the surface of a streptavidin-coated reaction vessel. After washing, anti-digoxigenin-horseradish-peroxidase-antibody conjugates are added and the color is verified using the ABTS color substrate.
  • the detection of one or more amplified products after binding is carried out by one or more different covalently (e.g. anthraquinone: UV light coupling or gold surface: SH coupling) or coordinatively (e.g. biotin: Streptavidin) bound capture probes, by washing and by detection of a fluorescent or chemiluminescent signal that either was excited directly by primary light or via surface plasmon resonance or E-wave, with the help of z.
  • covalently e.g. anthraquinone: UV light coupling or gold surface: SH coupling
  • coordinatively e.g. biotin: Streptavidin
  • the probe When using the probe as a detection probe, the probe can bind to the solid phase either simultaneously, before or after binding of the amplificate.
  • the amplificate is bound to the solid phase via modifications which have been incorporated via one or both primers or via the incorporated nucleotides. It is then washed and detected.
  • the complex between the amplificate and the detection probe is first pre-formed in solution and then applied to the solid support and washed.
  • the detection of the solid phase-bound binding complexes between the amplificate and the detection probe takes place via the detection modification of the probe with the help of known direct or indirect detection types for these modifications according to the state of the art.
  • ruthenium chelates are added to the amplificates which contain biotin modifications via one or both primers
  • the detection probes are either ruthenium-labeled oligonucleotides or ruthenium-labeled PNA oligomers. After formation of the binding complex between the ruthenium-labeled detection probe and the biotin-labeled amplificate, the complex is bound to streptavidin-coated magnetic particles, transferred to a measuring cell, attached to an electrode within the measuring cell and generation and measurement of an electochemiluminescence signal.
  • the detection probe is labeled with digoxigenin. After formation of the binding complex between the digoxigenin-labeled detection probe and the biotin-labeled amplificate, the complex is bound by a capture probe which is covalently immobilized on a microtiter plate or on magnetic particles.
  • the detection takes place after formation of the binding complex and washing via a biotin modification of one or both primers in the tripartite mini amplicon by addition of avidin-horseradish peroxidase and a mixture of TMB / TMF color substrates.
  • detection probes When using homogeneous reaction formats, detection probes are used which contain either quenched fluorescent labels, internal base substitutions with double-strand complex-activatable fluorescent dyes or terminal energy donors or acceptors (in combination with corresponding energy donors or acceptors on adjacent primer or E) - Wear probe ends: energy transfer complexes). In these cases, the detection probe is added during the nucleic acid amplification. In the case of the quenched fluorescent labels, fluorescence is activated by dequenching after binding the detection probe to the resulting tripartite mini amplicon and exonucleolytic degradation and release of the fluorescent dye-modified nucleotide.
  • the fluorescence signal is generated by forming the binding complex between the detection probe and the tripartite mini-amplicon that forms.
  • a fluorescence signal is formed by adjacent attachment of the labeled primer and the labeled probe.
  • the resulting fluorescence signals are preferably measured by real-time measurements.
  • fluorescein and rhodamine or derivatives thereof are used as fluorescence and quencher components in the quenched detector probes.
  • ruthenium or rhenium chelates and quinones or derivatives thereof are used as electrochemiluminescent and quencher components in the quenched detector probes.
  • anthraquinone or derivatives thereof are used as internal base substituents of the detector probe.
  • Cy-5 and fluorescein or derivatives thereof are used as energy transfer components.
  • cyanine dyes such. B. SYBR Green or acridine dyes used.
  • binding sequences of the primers and the probe is not specific for the nucleic acid to be detected.
  • Specific in the sense of The invention is a sequence if, based on a continuous sequence of nucleobases, it would in principle be able, under stringent conditions, to bind only with a sequence on the nucleic acid to be detected, but not with nucleic acids of other, undetectable organisms or species or groups of organisms.
  • a sequence is preferably not specific for a sequence if it could hybridize with other nucleic acids under the conditions which are set for carrying out the detection.
  • a general object of the invention is a method for the specific detection of a nucleic acid comprising the steps of producing a multiplicity of amplificates of a section of this nucleic acid with the aid of at least two primers, bringing the amplificates into contact with a probe which is attached to the Can bind amplificate, and detection of the formation of a hybrid from the strand of the amplificate and the probe, characterized in that at least one of the primers is not specific for the nucleic acid to be detected.
  • region B can contain nucleotides which do not belong to the binding sequence E.
  • the binding sequences of the primers and the probe can overlap.
  • GenBank GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR and Swiss-Prot.
  • the search methods are also based on sequence databases such.
  • the Blast program offers the user numerous customization options in order to be able to carry out an individual search, ie to identify those sequences which are specific for one or more analytes or which are not specific, ie also occur in other organisms or not.
  • the selectivity of the detection method does not only result from the selectivity of the individual primers for a specific target, but from the cumulative selectivity of the overall system. So even two primers or two primers and one probe, individually, can be completely unselective, ie individually with one
  • the invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.
  • This contains the primers and preferably also a detection probe.
  • other reagents such as buffers and enzymes, e.g. B. contain a polymerase.
  • the primers contain further sequences at their 5 'end. These sequences are between 1 and 100, particularly preferably between 5 and 80 nucleotides long. So far, it has not been common to choose oligonucleotides with a length of more than 40 nt as primers. In one embodiment, these sequences are chosen such that they cannot hybridize with the nucleic acid to be detected on the primer binding site but on another, not to be detected. It is even possible to choose them so that they are complementary to the sequences that are not on the binding site of the same primer on one Connect the nucleic acid to be detected. So if the primer can also bind to a human genome, the sequences can also be human. It is possible to modify one or both of the primers accordingly.
  • the additional sequences are not so long that they prevent hybridization of the primers with the binding sequences on the nucleic acid to be detected, for example the HCV genome.
  • the additional sequences can also be chosen such that they hybridize more firmly with short partial sequences of the primers in the primer binding site than they bind with other sequences in the primer binding site. In this way, secondary structures within the primers can be resolved and the binding ability of the primers with the nucleic acid to be detected can be improved.
  • Another way to specifically make primers and probes non-selective is to use degenerate bases within the sequence.
  • the region in which the hybridization of the target nucleic acid with the primer or the probe is to take place is expediently chosen in such a way that there are relatively few differences between the target sequence and another sequence which cannot be detected (e.g. another microorganism).
  • the differences that still exist can be largely compensated for by using degenerate bases at the different base positions.
  • Differences in primers (A and G) can be achieved by incorporating the base P (6H, 8H-3,4-dihydro-pyrimido [9,5-C] [1,2] oxazin-7-one, e.g. B. Nucleic Acids Research, Vol.
  • Another option for using non-complementary bases is to replace A with D (diaminopurine or / and replace C with M (methylcytosine).
  • the 5 'end of one primer and the 5' end of the other primer are covalently linked to one another.
  • the forward and reverse primers are linked to one another for the amplification of the same analyte. The result of the amplification is therefore a large number of constructs in which two different amplification strands are covalently linked to one another.
  • a by-product which, however, also
  • the proof can be based on products in which only one of the two primers (parts) is extended.
  • the two linked primers are intended for the amplification of different nucleic acids to be detected (e.g. one for HBV, the other for HGV).
  • the appropriate reverse or forward primers must then be added for the amplification.
  • the 5 'ends of the primer sequences can be linked to one another directly or via a linker. Any type of molecule can be used as a linker, since it is not important to adhere to a specific nucleic acid, the spacing of the bases on a nucleic acid to be detected. However, the linker is preferably not so hydrophobic that the solubility of the conjugate is impaired too much.
  • the linker preferably contains one or more nucleotide sequences which are not directly complementary to the corresponding or other sequences on the nucleic acid (s) to be detected. At least one of the sequences which meet the conditions for the additional sequences of the (monofunctional) primers described above is particularly preferred.
  • These (bifunctional) primer conjugates are also suitable for multiple (at least duplex) determinations of analyte nucleic acids.
  • these conjugates can be prepared in a known manner, although it is preferred to first synthesize the still protected individual sequences chemically, then to activate one end of one individual sequence and to deprotect one end of the other individual sequence.
  • the coupling reaction can proceed relatively automatically through the activation group or can be accelerated by activation reagents.
  • the conjugate is particularly preferably chemically synthesized by continuous sequential extension on a solid phase, without intermediate detachment therefrom.
  • the first partial sequence can first be synthesized with 3'-phosphoramidites as usual.
  • the primers bind to the binding sequences A or C, as described above, and the probe to a region B between the ends of the binding sequences A and C or the complement thereof.
  • the overall specificity of the detection method is retained. If one of the primer sequences is not specific for the nucleic acid to be detected, but also binds to other nucleic acids, no specific nucleic acid amplification product can be formed on the other nucleic acid, since the second primer binding sequence on this nucleic acid is missing. Unspecific nucleic acid amplification products on the other nucleic acid are not detected if the specific binding sequence for the probe is missing.
  • the second primer sequence is also not specific for the nucleic acid to be detected, a specific nucleic acid amplification product can only be formed on the other nucleic acid if both primer binding sequences are in the same nucleic acid amplification unit. This nucleic acid amplification product is also not detected because the specific binding sequence for the probe is missing. If the probe sequence is not specific for the nucleic acid to be detected, but the two primers are specific, none will be
  • Nucleic acid amplification products of the other nucleic acid are formed. If, in addition to the probe sequence, one of the two primer sequences is also not specific for the nucleic acid to be detected, no specific nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed. Nonspecific nucleic acid amplification products of the other nucleic acid that may be are formed, contain other sequences in the probe binding area and are therefore not detected. If all three binding sequences for the two primers and the probe are not specific for the nucleic acid to be detected, no nucleic acid amplification product is formed if at least one of the two primer sequences is not in a nucleic acid amplification unit of the other nucleic acid.
  • a specific nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed, but it cannot be detected.
  • the only case that a specific nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed and detected is when all three sequences lie within a nucleic acid amplification area. However, this can be avoided by selecting the appropriate sequence of the nucleic acid amplification unit, e.g. B. by not selecting the primer hybridization sites simultaneously from the same locus of the same undetectable organism.
  • the amplificates are produced using nucleotides, particularly preferably mononucleotides, which are in each case complementary to A, G, C and or T.
  • Region B or B 'of the nucleic acid to be detected preferably contains all 4 natural nucleobases.
  • partial components (primers or probes) of the different primer-probe combinations can be identical for the different nucleic acids to be detected.
  • the determination of several nucleic acid targets eg. B. possible for different viruses such as HBV, HIV and HCV with a single amplification reaction (multiplex amplification).
  • a technical advantage of the method according to the invention is that a high degree of agreement of the measured values is achieved with multiple determinations of a sample.
  • HCV virus nucleic acids
  • B HCV RNA from the 5 'untranslated region of the HCV genome in a copy number of 10 copies per test with a dynamic range of 10 5 , due to an improved signal-to-noise ratio.
  • primers and probes can be used in the test which have a primer / probe design which is not preferred for the person skilled in the art, namely e.g. B.
  • the short probe has a melting point close to the test temperature, so that the person skilled in the art would not have expected stable binding of the probe to the nucleic acid amplification product.
  • an increase in specificity and sensitivity has so far not been attempted by shortening, but rather by extending the primer probe sequences and / or the nucleic acid amplification product with the signaling components.
  • HCV-RNA is surprisingly also possible specifically and reproducibly in positive HCV plasma samples in which the HCV-RNA was not pre-cleaned in a sequence-specific manner, but was used directly from lysed and concentrated plasma samples over glass surfaces.
  • HCV-negative plasma samples give no signal. This is surprising in that the HCV RNA genome is very labile to fragmentation in plasma lysates.
  • z. B HIV plasma samples, HBV serum samples, Chlamy slide samples from urine or human DNA samples from whole blood, which were also concentrated over glass surfaces, no signal is also obtained with the primers and probes used.
  • the method according to the invention can be used to avoid one or more of the disadvantages described for the prior art or to realize one or more of the following advantages.
  • the PCR cycles can be much shorter. This can shorten the total time of the verification procedures.
  • the sensitivity of the detection can be increased because there is less competition / displacement can take place between the short counterstring of the amplicon and the detector probe.
  • the specificity of the detection is increased because the relative proportion of the internal detector region is increased compared to the total amplicon length.
  • the differentiability of subtypes can be increased.
  • the detection background can be reduced because short amplicons have less potential for unspecific hybridization. For this reason, the signal-to-noise ratio can be increased.
  • the reproducibility of the results can be increased since smaller target regions on RNA genomes are less sensitive to RNA degradation. The possibilities for the formation of secondary structures are reduced.
  • oligonucleotides used are linear and single-stranded.
  • wash buffer 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 70% ethanol
  • the wild-type standard "pHCV-wt” was first amplified by amplifying a section of the HCV genome with the primers KY80 (5 '-gcagaaagcgtctagccatggcgt-
  • the RNA was quantified by photometric measurement of the absorption at 260 nm.
  • Tth polym 10 u dNTP mix 200 ⁇ M (dATP, dCTP, dGTP) / 600 ⁇ M (dUTP)
  • Primer forw. HC2F 0.3 ⁇ M (5 ' -agtatgtgtgtcgtgcagcc-3', SEQ.ID.NO.3)
  • Primer rev. HClF-bio 0.3 ⁇ M (5'bio-tggctctcccgggagtgg-3 ', SEQ.ID.NO.4)
  • the amplification was carried out according to the following cycler protocol: 10 min 37 ° C decontamination by UNG 30 min 60 ° C reverse transcription 1 min 95 ° C denaturation
  • DNA probe 5'-Ru-CTCCAGGACCCC-3 ', SEQ.ID.NO.5
  • HCV-RNA standard 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 and 10 5 copies of HCV-RNA standard were amplified in duplicate determinations.
  • HCV plasma served as positive control and HCV negative plasma and water as negative control.
  • the 5 '-5' -linked oligonucleotide is synthesized on a DNA Synthesizer Model 394A from Applied Biosystems with the standard 1 ⁇ mol synthesis cycle recommended by Applied Biosystems. It becomes a synthesis column which contains 1 ⁇ mol of a carrier material (1) functionalized with the corresponding 5'-O-DMT protected starting nucleoside (available from Applied Biosystems) and 5'-O-DMT-3 'phosphoramidite (2) (available from Applied Biosystems) for the primer 1 sequence and 3 '-O-DMT-5' phosphoramidite (3) (available from Eurogentec / Glen Research) for the primer 2 sequence .
  • a carrier material (1) functionalized with the corresponding 5'-O-DMT protected starting nucleoside (available from Applied Biosystems) and 5'-O-DMT-3 'phosphoramidite (2) (available from Applied Biosystems) for the primer 1 sequence and 3 '-O-DMT-5' phosphoramidite (3) (available from
  • the course of the synthesis is detected via regular trityl value determinations on the synthesizer (autoanalysis). After the synthesis cycle is complete, the automatic carrier elimination closes with conc. Ammonia.
  • the cleavage solution is fed into a special cleavage vessel on the synthesizer. This is then heated in a water bath at 56 ° C. for 5 hours in order to remove all protective groups. After cooling, the solution is rotated in on a rotary evaporator.
  • the oligonucleotide is purified by preparative anion exchange HPLC on a Protein-Pak DEAE 8 HR 10 x 100 mm column (Waters) with 25 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, 0-0.6 M NaCl, pH 8.5 as elution buffer.
  • the analysis is carried out using a Gen-Pak FAX 1.6 x 100 mm anion exchanger HPLC column from Waters.
  • the product fractions are desalted by dialysis (MWCO 1000 from Spectrapore).
  • the desalted oligonucleotide solution is spun in, in dissolved in sterile water, filtered through a sterile 0.2 ⁇ m filter and the concentration determined by UV spectroscopy at 260 nm. Yield: 75 OD
  • primers and probes from the following primer and probe regions can be used:
  • Forward primer selected from the sequence between positions 390 and 417
  • reverse primer selected from the sequence between positions 421 and 448
  • probe selected from the sequence between positions 391 and 440, all based on the HGBV-B sequence the sequence HG22304 available from the EMBL database em-vrl, or from Proc. Natl. Acad. Be USA 1995, 92, 3401-3405 and / or from J. Virol. 69: 5621-5630.
  • the sequence shown in FIG. 7 corresponds to positions 390 to 448 of this sequence, so that the primer and probe positions can be converted directly.
  • Preferred primer / probe combinations result as follows: forward primer selected from one of the sequences: 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-408, reverse primer selected from one of the sequences: 427-448, 427-447, 427-446, 428-
  • 448, 428-447, 428-446, 429-448 and 429-447 probe selected from one of the sequences: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398- 415, 397-415, 396 -415, 395-415, 394-415, 393-415, 392-415, 391-415, 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430 , 408-429, 408-428, 409-
  • forward primer sequence of 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-408
  • reverse primer selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423-
  • 445, 423-444, probe selected from one of the sequences: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398-
  • forward primer sequence of 390-406, 391-406, and 392-406
  • reverse primer selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423- 445, 423-444,
  • Probe selected from one of the sequences: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398- 415, 398-415, 397-415, 396-415, 395-415, 394-415, 393- 415, 392-415, 391-415, 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410-432,, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430 , 409-429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, and 408-428.
  • HIV-positive plasma with an initial concentration of 15000 genome equivalents (geq) HIV per ml was used as the starting material. This plasma was successively diluted by a factor of 10 in negative plasma and, after sample preparation, was amplified in duplicate with the corresponding primer pairs. HIV-negative plasma and water served as controls. To determine the specificity, an HBV and an HCV-positive plasma were also processed. After amplification, all samples were measured (ECL detection, Elecsys® 1010). Primers and probes used:
  • 10 ° were amplified in duplicate determinations. 10 ', 10 ⁇ 10 3 , 10 4 and 10'
  • HBV-positive plasma sample preparation was carried out analogously to the sample preparation described for HCV.
  • the detection was also carried out analogously to the detection described for HCV.
  • MOLECULE TYPE Other nucleic acid
  • DESCRIPTION: / desc "oligodeoxyribonucleotide”
  • xi SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

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Abstract

Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz A der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C', die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C komplementär ist, binden kann, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an eine zwischen den Sequenzen A und C gelegene Sequenz B oder das Komplement davon binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Amplifikat und der Sonde, wobei die zwischen den Bindesequenzen A and C gelegene Sequenz keine Nukleotide enthält, die nicht der Bindesequenz D der Sonde oder ihrem Komplement D' zugehören.

Description

SPEZIFISCHES UND EMPFINDLICHES NUKLEINSÄURENACHWEISVERFAHREN
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem eine Amplifikation eines Teilstückes dieser Nukleinsäuren vorgenommen wird und wobei dieses Teilstück im Hinblick auf seine Basensequenz bestimmte Bedingungen erfüllen muß, sowie ein Reagenzkit enthaltend zwei Primer und eine Sonde, die dieses Teilstück definieren.
Eine der meist angewandten molekularbiologischen Techniken zum Nachweis von Nukleinsäuren ist Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden zum Nachweis homologer Nukleinsäure-Sequenzen. Der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen ist von Bedeutung im Grundlagenbereich, jedoch von besonderer Bedeutung in verschiedenen Anwendungsfeldern, z. B. in den Bereichen medizinische Diagnostik, forensische Diagnostik, Lebensmitteldiagnostik, Umweltdiagnostik, Pflanzenschutz und Tiermedizin.
Als Sonde werden dabei entweder Oligonukleotide (kurze DNA oder RNA) oder Polynukleotide (längere DNA oder RNA) verwendet. Dabei haben die kürzeren Sonden gegenüber den längeren Sonden den Vorteil größerer Sequenzselektivität, wegen des kürzeren Hybridisierungsbereichs aber den Nachteil geringerer Sensitivität. Eine verbesserte Sensitivität und Sequenzselektivität wird mit PNA-Sonden ( Peptidnukleinsäuren, z. B. WO 92/20702) erreicht, da diese Sonden eine höhere Bindungsaffinität zu Nukleinsäuren haben (höherer Tm) und durch eine höhere Basendiskriminierung gekennzeichnet sind (ΔTm). Zusätzlich können Sonden zum Nukleinsäure-Nachweis Markierungsgruppen tragen, die entweder zum Fangen und/oder zur Detektion von Hybridkomplexen aus Sonde und nachzuweisender Nukleinsäure geeignet sind. Zum Nukleinsäure-Nachweis durch Hybridisierung werden eine oder mehrere Sonden entweder zur Hybridisierung in Lösung oder auf festen Trägern verwendet. Bei Nukleinsäure-Nachweisen in Lösung spricht man von homogenen Nachweisformaten, bei Nachweis auf festen Trägern und/oder vermittelt durch feste Träger von heterogenen Nachweisformaten. Bei den heterogenen Nachweisverfahren (z. B. dot blot) kann die nachzuweisende Nukleinsäure auf dem festen Träger vorgebunden sein. Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen mit einer Lösung, die die Sonde enthält. Umgekehrt kann die Sonde auf dem festen Träger vorgebunden sein (z. B. reverse dot blot). Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen der gebundenen Sonde mit einer Lösung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure enthält . Alternativ dazu kann der Komplex aus nachzuweisender Nukleinsäure und Sonde erst in Lösung gebildet werden und die Bindung an den festen Träger erst anschließend erfolgen. Bei homogenen Testformaten werden z. B. Sondenpaare verwendet, die endständig energieübertragende Gruppen tragen und die über Co-Hybridisierung an die nachzuweisende Nukleinsäure in unmittelbaren Kontakt gebracht werden und dadurch ein Signal erzeugen. Alternativ dazu können auch Sonden verwendet werden, die nach Bindung an die nachzuweisende Nukleinsäure durch enzymatische 5'-Nukleaseaktivität in Lösung von einem gequenchten in einen ungequenchten Zustand überführt werden.
Der Nachweis von Nukleinsäuren durch alleinige Sonden-Hybridisierung hat nur begrenzte Sensitivität. So ist selbst mit empfindlichen Detektions-Markierungsgruppen wie 32P, Digoxigenin, Biotin, Fluorescein, Ruthenium-Chelate, Fluorescein, Rhodamin oder AMCA allein nur eine Sensitivität in pg- bis fg-Bereich möglich. Zum empfindlichen Nukleinsäure-Nachweis gerade im medizinisch-diagnostischen Bereich sind jedoch Sensitivitäten im ag-Bereich und eine hohe Nachweisspezifität notwendig. Dies gilt sowohl für den Nachweis von körperfremden Nukleinsäuren z. B. in Form von Infektionserregern, als auch für den Nachweis der An- oder Abwesenheit oder Veränderung körpereigener Nukleinsäuren. Hohe Nachweissensitivität und Nachweisspezifität ist aber auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit. So müssen manche Infektionserreger wie z. B. HCV, HIV und HBV schon in wenigen Kopien nachgewiesen werden, um rechtzeitig erfolgreiche medizinische Interventionsmaßnahmen, z. B. durch frühzeitige Arzneimittelbehandlung, ansetzen zu können. Für solch frühzeitige Nachweise von Infektionserregen ist der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen der Infektionserreger von Vorteil, da wegen der Verfügbarkeit von Nukleinsäure- Vervielfältigungstechniken (Nukleinsäure- Vermehrungsverfahren) ein empfindlicher Nachweis schon in einer frühen Infektionsphase (Latenzphase) möglich ist. Die Möglichkeit der gezielten Vermehrung des nachzuweisenden Agens gibt es nur im Fall von Nukleinsäuren, nicht aber im Fall von immunologischen Nachweisverfahren. Bei diesen Verfahren ist eine Steigerung der nachzuweisenden Infektionserreger-spezifischen Partikel nur über die humorale Immunantwort über Bildung von entsprechenden Infektionserreger-spezifischen Antikörpern möglich; diese Immunantwort erfolgt jedoch erst nach Ablauf der Latenzzeit und ist eine Sekundärreaktion nach Infektion durch den Errger. Daher hat der Nachweis über Nukleinsäure-Hybridisierung den Vorteil, daß z. B. der Infektionserreger direkt nach Infektion und sehr empfindlich nachgewiesen werden kann.
Der Erfolg von medizinischen Interventionsmaßnahmen ist jedoch auch davon abhängig, daß der Infektionserreger nicht nur frühzeitig mit hoher Sensitivität, sondern auch sehr spezifisch nachgewiesen werden kann. Zur gezielten Behandlung ist daher eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Infektionserregern, wie z. B. HAV, HBV, HCV, HTV, verschiedene Herpes- Viren, HPV, sowie die Unterscheidung einzelner Subtypen, wie z. B. HIV-1 und HIV-2, von Bedeutung. Dabei ist aber auch entscheidend, daß quantitative Aussagen gemacht werden können und keine falschpositiven oder falsch-negativen Ergebnisse erhalten werden, da solche falschen Ergebnisse u.U. gravierende therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen können. Dies setzt Richtigkeit und hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse voraus. Daher muß der Nukleinsäure-Nachweis nicht nur sehr sensitiv, sondern auch sehr spezifisch und reproduzierbar sein. Der spezifische und sensitive Nukleinsäure-Nachweis muß auch rasch erfolgen, damit eine gezielte Therapie umgehend erfolgen kann. Oftmals ist auch von Bedeutung, mehrere Infektionserreger wie z. B. HCV, HIV und HBV nebeneinander nachzuweisen, z. B. im Rahmen von Blutbanken-Screeningtests. Dies erfolgt bei derzeit gängigen Nukleinsäure-Nachweistests durch hintereinandergeschaltete Einzelbestimmungen der nachzuweisenden Infektionserreger. Dies hat den Nachteil, daß mehrere Bestimmungen hintereinander durchgeführt werden müssen, was gerade beim Screening von großen Specimen-Stückzahlen nachteilig ist. Im Rahmen dieser Nukleinsäure-Bestimmungen ist wünschenswert, sensitive und spezifische Testmöglichkeiten verfügbar zu haben, die z. B. eine rasche parallele Bestimmung mehrerer Infektionserreger nebeneinander in einer einzigen Probe ermöglichen (Multiplex-Bestimmung).
Beim Nachweis der An- oder Abwesenheit von körpereigener Nukleinsäure innerhalb bestimmter genomischer Loci und/oder deren Veränderungen, wie z. B. ererbte, spontane oder eine Mischung aus ererbten und spontanen Mutationen, Deletionen, Inversionen, Translokationen, Rearrangements oder Triplett-Expansionen in Form von spezifischen und/oder polymorphen Veränderungen, ist ebenfalls die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren von Vorteil. Die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren ist jedoch nicht nur im medizinischen Sektor sondern auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit.
Die bisherigen Testverfahren zum sensitiven und spezifischen Nachweis der An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuren basieren auf der kombinierten Durchführung von Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen (Nukleinsäure-Vermehrung) und Nukleinsäure- Nachweisreaktionen (Detektion).
Die nachzuweisende Nukleinsäure wird dabei in einer für die Vermehrungsreaktionen zugänglichen Form eingesetzt, z. B. in Form von unbehandeltem oder behandeltem Probenmaterial und/oder Probenmaterial-Konzentrierung, z. B. durch Adsorption des unbehandelten oder behandelten Probenmaterials an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen. Durch diese festen Träger erfolgt keine substantielle Reinigung und/oder Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure- Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex- Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugänglichen Form möglich.
Andere Probenvorbereitungs- Verfahren enthalten gezielte Verfahrensschritte zur Nukleinsäure-spezifischen und/oder sequenzspezifischen Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure, z. B. die Verwendung von festen Trägern mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure-Fangsonden zur selektiven Bindung und Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsäure durch Nukleinsäure-spezifische Bindung und anschließende Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsäure. Bei dieser Art von festen Trägern sind Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure- Fangsonden an der Oberfläche der festen Träger notwendig. Daher sind zur
Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex- Verfahren, entweder mehrere feste Träger notwendig, was aufwendiger ist, oder feste Träger mit einer oder mehreren Bindungsgruppen und/oder mit multiplen oder mehreren Fangsonden. Multiple Fangsonden enthalten mehrere Bindungs- Sequenzen für mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Diese Träger mit mehreren
Bindungsgruppen und/oder mehreren und/oder multiplen Fangsonden sind jedoch aufwendiger herzustellen. Ebenfalls sind die Reaktionsbedingungen zur gezielten Bindung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren an Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder Fangsonden schwieriger einzustellen bzw. die Bindung mehrer nachzuweisender Nukleinsäurearten an eine Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppe oder an eine Fangsonde mit mehreren komplementären Hybridisierungssequenzen schwieriger einzustellen.
Die Vermehrung und der Nachweis der bereitgestellten nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt in heterogenen oder homogenen Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisformaten. Die Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen und Detektionreaktionen können entweder hintereinander (heterogene Testverfahren) oder gleichzeitig (homogene Testverfahren) erfolgen. Als Vermehrungsreaktionen werden entweder targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen, targetabhängige Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen oder Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet. Die Verwendung von Detektionssystemen zum Nachweis der vermehrten Nukleinsäuren erfolgt entweder über den Einbau von Nukleotiden und/der die Verwendung von markierten Primern oder markierten Sonden. Die verwendeten Detektionssysteme enthalten entweder direkte oder indirekte Detektionsmarkierungen bzw. gekoppelte sekundäre und tertiäre Nachweiskomponenten. Die Detektion der vermehrten nachzuweisenden Nukleinsäuren kann jedoch auch durch spektroskopische oder pyhsikalische Methoden erfolgen.
Die bisherigen Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten Signal- Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen haben den Nachteil geringer Sensitivität wegen der nicht-exponentiellen Signalvermehrung, erhöhten Störanfälligkeit durch stärkere Tendenz zur Hintergrundsignalbildung durch die Vielzahl der Sondenkomponenten und der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende
Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein daran gekoppeltes Detektionssignal targetunabhängig vermehrt wird. Beispiele sind gekoppelte Signalkaskaden (z. B. SELF- Zyklus) oder signalgebende Sonden-Baum- oder -Bürstenstrukturen (z. B. branched DNA).
Die bisherigen Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten targetabhängigen Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen sind wegen der exponentiellen Signalvermehrung zwar sensitiver als die reinen Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsverfahren, haben aber wiederum den Nachteil der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein davon in einer einleitenden targetabhängigen Primärrektion abgeleitetes
Detektionssignal in Form eines Nukleinsäure-Reportermoleküls Targetsequenz- unabhängig enzymatisch vermehrt wird. Beispiele sind die Qß-Replikationsreaktion, bei der ein Qß-Reportermolekül enzymatisch vermehrt wird, oder die Ligase- Kettenreaktion, bei der Teilstücke der Nukleinsäure-Reportermoleküle sequenzunabhängig enzymatisch verknüpft werden. Als Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der bisher sensitivsten und spezifischsten ex- ponentiellen targetspezifischen Nukleinsaure-Vermehrungsreaktionen wie z B PCR (US-A-4,683,202 bzw EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329 822) oder TAM (WO 91/01384), wurden bisher jeweils einzel- oder doppelstrangige Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte durch targetsequenzabhangige thermozyklische oder isotherme enzymatische Elongation gegenläufige Primer, die sequenzpezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind und an die Enden der Nukleinsaure- Vermehrungseinheit (Amplikon) der nachzuweisenden Desoxyribo- oder Ribo- Nukleinsauren oder deren Komplemente binden und somit die Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte begrenzen, erzeugt Bei diesen Elongationsreaktionen werden alle 4 Basenspezifitaten eingebaut
Die genannten Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierter targetspezifischer Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion sind wegen Targetsequenz-abhangiger enzymatischer Nukleinsaure-Vermehrungszyklen am spezifischsten Wahrend lineare targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen, wie z B die Cycling-Probe- Reaktion, nur zu begrenzter Sensitivität fuhren, ergeben exponentielle targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsrektionen wie Elongations-basierte Reaktionen wie z B die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, RT-PCR, SDA) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z B Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TMA) bisher die sensitivsten und spezifischsten Signale
Mischformen zwischen targetabhangiger Signal-Nukleinsaure- Vermehrung und targetspezifischer Nukleinsäure- Vermehrung, wie z B die Gap-filling Ligase- Kettenreaktion (gap-filling LCR, WO 90/01069), haben zwar gegenüber der nicht- modifizierten LCR einen targetabhangigen Reaktionsschritt, dieser ist aber begrenzt auf limitierte Sequenzabschnitte bestehend aus lediglich 1 oder 2 Basenspezifitaten und damit limitierterer Target-Spezifitat Für den Nachweis der entstandenen Nukleinsäure stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Der Nachweis der gebildeten Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte über Fragment- oder Sequenz-Gelanalyse ist zeitaufwendig und nicht quantitativ. Der Nachweis über trägergebundene Dot-, Slot- oder Reverse-Dot-Blot-V erfahren ist ebenfalls zeitaufwendig und nicht quantitativ.
Quantitative sensitive und spezifische Bestimmungen der nachzuweisenden Nukleinsäuren wurden bisher im Rahmen von heterogenen oder homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs-Reaktionsformaten möglich, bei denen das Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt entweder durch eingebaute Label oder durch Hybridisierung mit einer für die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement spezifischen Sonde in einem Teil des durch Elongation entstandenen Sequenzabschnitts abgefangen wird. Exponentielle Nukleinsäure- Vermehrungs- Reaktionsformate, bei denen eine Interkalation von Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen erfolgt, sind zwar auch sensitiv, aber nicht sequenzspezifisch.
Bei den heterogenen Reaktionsformaten wird das Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt z. B. entweder über eine Primer-Fangmodifikation oder durch eine immobilisierte Fangsonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist, auf einen festen Träger gebunden und über Einbau eines detektionsmarkierten Nukleotids, durch Hybridisierung mit einer detektionsmarkierten Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure-
Vermehrungsprodukts ist, oder über eine Primer-Detektionsmodifikation nachgewiesen. In homogenen Reaktionsformaten erfolgte bisher der Nachweis z. B. über die Hybridisierung einer Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist und die einen gequenchten Fluoreszenz-Label trägt, wobei die Targetsequenz-abhängige enzymatische Aufhebung der Quenchung durch die Primer-Elongations-bedingte Freisetzung des gequenchten Fluoreszenzmarkierten Nukleotids erfolgt (WO 92/0263.8), oder über die Anlagerung und/oder Interkalation eines detektierbaren Moleküls oder einer detektierbaren Gruppe. Bei allen bisherigen quantitativen sensitiven und spezifischen heterogenen und homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs- Reaktionsformaten wurden bisher Nukleinsäure- Vermehrungseinheiten (Amplikons) verwendet, die neben den spezifischen Primer- und Sonden-Bindungssequenzen zusätzliche Sequenzen variabler Länge zwischen den flankierenden Primer- Bindungssequenzen und der internen Sonden-Bindungssequenz enthielten. Diese fünfgeteilte Amplikonsstruktur resultierte in Amplikonlängen größer als die Summe der Sequenzlängen der beiden flankierenden Primer und der internen Sonde zwischen vorzugsweise 100 und 1000 Basen(paaren). Optimierungen der Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion durch verbesserte Enzymmischungen gingen bisher vielmehr hauptsächlich in Richtung längere Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte.
Kürzere Amplikonlängen wurden bisher lediglich zum Nachweis spezieller Sequenzen wie z. B. bei Triplett-Expansionen, für In-situ-Untersuchungen oder den Nachweis stark fragmentierter Nukleinsäuren im Rahmen der Altertumsforschung erzeugt. Diese kurzen Amplikon-Längen wurden j edoch in zeitaufwendigeren Gelformaten oder In-situ- Formaten detektiert, die durch mangelnde Sensitivität und/oder fehlende Quantifizierung gekennzeichnet sind. Andere spezielle kurze Sequenzen wie Short Tandem Repeats, Short Interspersed Repetitive Elements Microsatellite Sequences oder HLA-spezifische Sequenzen, wurden bisher lediglich als Primer- oder Sonden- Bindungssequenzen verwendet, bzw. in Kombination mit anderen Sequenzen.
Die fünfgeteilten Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte haben den Nachteil, daß sie neben den spezifisch Primer und Sonde bindenden Sequenzen noch zusätzliche Sequenzen beinhalten, die das Amplikon verlängern und die Gesamtspezifität im Hinblick auf die Spezifitäts-generierenden Primer- und Sonden-Bindungsreaktionen reduzieren.
Die bisher verwendeten längeren fünfteiligen Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte haben ferner den Nachteil längerer Primer-Elongationszeiten und damit längere Gesamt- Testzeiten. Die Sensitivität ist auch begrenzt durch Plateaueffekte der beteiligten Enzyme und Substrate, die bei längeren Amplikons früher erreicht werden. Ein weiterer Nachteil längerer Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte ist eine zunehmende Kompetition zwischen Amplikon-Gegenstrang und Detektor- oder Fangsonde und somit reduzierter Sensitivität. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Möglichkeit der unspezifischen Bindung bedingt durch die zusätzlichen Sequenzen mit der Folge eines erhöhten Hintergrunds und dadurch geringerer Sensitivität (geringeres Signal-Rausch- Verhältnis). Ein weiterer Nachteil bei der Bindung des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts an trägergebundene Fangsonden ist die sterische und kinetische Hinderung längerer Nukleinsäure-Moleküle; daher werden Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bisheriger Länge vor der Bindung durch die Fangsonde vorzugsweise fragmentiert. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Anfälligkeit gegenüber Fragmentierung innerhalb der Amplikonsequenz und dadurch Zerstörung der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit; dies führt zu geringerer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Nachteil ist, daß längere Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bei niedrigen Testtemperaturen von z. B. 37 °C, die bei gängigen Nukleinsäure- Analysegeräten vorgegeben sind, weniger spezifisch hybridisieren, da eine größere Differenz zur Schmelztemperatur besteht. Ein weiterer Nachteil von fünfteiligen Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten ist beim Nachweis mehrerer verschiedener Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte, daß unterschiedliche Nukleinsäure-Vermehrungslängen gebildet werden, die einen Multiplex-Nachweis erschweren.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives Nachweisverfahren für
Nukleinsäuren bereitzustellen, welches Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Verfahren hat.
Eine spezielle Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein targetabhängiges exponentielles Nukleinsäure- Vermehrungsverfahren zum hochsensitiven, hochspezifischen, reproduzierbaren und quantifizierbaren Nachweis einer oder mehrerer einzelsträngiger oder doppelsträngiger Nukleinsäuren bereitzustellen, welches insbesondere einen oder mehrere der genannten Nachteile vermeidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, unter Erhalt der Gesamtspezifität die Auswahl der Primer- und Sondensequenzen so flexibel zu gestalten, daß eine Bestimmung mehrerer verschiedener nachzuweisender Nukleinsäuren in einem vereinheitlichten Reaktionsformat unter Verwendung von vorzugsweise teilweise gleichen Primer- oder Sonden-Sequenzen möglich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindesequenz (C), die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C dieses Stranges im wesentlichen komplementär ist, binden kann, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus einem Amplifikat und der Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß die zwischen den Bindesequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon keine Nukleotide enthält, die nicht dem aus der Bindesequenz D der Sonde und der hieran gebundenen Sequenz des Amplifikats gebildeten Sequenzbereich E zugehören.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
In Fig. 1 ist schematisch die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnungsweise für die Bereiche auf der nachzuweisenden Nukleinsäure gezeigt.
In Fig. 2 ist die entsprechende Bezeichnungsweise für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte der Primer sowie die Amplifikate (Amplikons) gezeigt. Ebenfalls ist gezeigt, daß die Amplifikate ein oder mehrere weitere Bereiche Y aufweisen können, die außerhalb des Bereiches liegen, der die von der nachzuweisenden Nukleinsäure stammende Sequenzinformation enthält.
In Fig. 3 ist schematisch gezeigt, wie im Falle der vorliegenden Erfindung die Bindesequenzen der Primer und Sonde angeordnet sind. Es ergeben sich verschiedene Alternativen I bis VI, je nachdem, ob und wie die Bindesequenzen überlappen. Es ist jeweils nur ein Strang des Amplifikats gezeigt. Dieselbe Anordnung (nur komplementär) kann für einen zweiten Strang des Amplifikats erstellt werden. Für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte ergibt sich ein ähnliches Bild. Als Fall V und VI ist der Fall gezeigt, daß die Sonde neben der Bindesequenz D noch weitere, nicht mit dem Amplifikat Basenpaarungen ausbildende Bereiche X enthält, die gleich oder verschieden sein können. Zum Vergleich ist der Fall des Standes der Technik als VII gezeigt; die Sequenzen Z repräsentieren die zusätzlichen Sequenzen der fünfteiligen Amplikons.
In Fig. 4 sind Sequenzen der benutzten Bereiche eingezeichnet, nämlich A', B und C.
In Fig. 5 ist die Synthese von 5 '-5 "-verknüpften Primern schematisch gezeigt.
In Fig. 6 sind die in Fig. 5 verwendeten Verbindungen gezeigt.
In Fig. 7 ist eine für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignete Region des HCV-Genoms gezeigt sowie eine Sequenz, aus welcher die Primer- und Sonden- Sequenzen bevorzugt ausgewählt werden. Diese zweite Sequenz ist dem nicht humanpathogenen Virus HGBV-B entnommen. Bei den hieraus gewählten Primer- und Sondensequenzen handelt es sich daher um nicht für HCV spezifische Sequenzen (J. Med. Virol. 48: 60-67).
In Fig. 8 bis 10 sind bevorzugte Sequenzen für Primer und Sonden zum HCV-Nachweis gezeigt.
Nukleinsäuren, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs oder von Hefen oder Pilzen. Proben (Specimen), in denen die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement enthalten sind, sind z. B. humane, tierische, bakterielle oder pflanzliche Flüssigkeiten, oder Flüssigkeiten aus Hefen oder Pilzen, Exkremente, Abstriche, Zellsuspensionen, Kulturen oder Gewebs-, Zeil- oder Flüssigkeits-Punktionen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor. Damit das erfmdungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure eine Größe von mindestens 40 bp aufweist. Die Nukleinsäure kann auch eine durch Klonierung, Amplifikation, in-vitro- und in-vivo- Vermehrung hergestellte Nukleinsäure sein.
Die nachzuweisende Nukleinsäure kann einzelsträngig (insbesondere bei RNA) oder doppelsträngig (insbesondere bei DNA) sein. Für den Fall doppelsträngiger
Nukleinsäuren können beide Stränge vermehrt werden oder aber auch nur einer. Aus beiden Sorten von Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngige Amplifikate gebildet werden, wovon einer oder beide zum weiteren Nachweis verwendet werden können. Entsprechend wird die Sequenz der Sonde oder der Sonden ausgewählt.
Der Probe oder einer Kontrollprobe können positive oder negative
Kontrollnukleinsäuren oder Quantifizierungsstandards zugesetzt sein, die ähnlich oder gleich behandelt werden wie die nachzuweisenden Nukleinsäuren. Als Standards können beispielsweise interne oder externe heterologe oder homologe DNA- oder RNA- Standards, enthaltend Primer-Bindesequenzen homologe und zu den Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäuren heterologe Sonden-Bindesequenzen, verwendet werden. Umgekehrt ist aber auch die Verwendung von besonders im 3 '-Priming- Bereich heterologen Primer-Bindesequenzen und homologen Sonden-Bindesequenzen möglich. Als Negativ-Kontrollen werden bevorzugt analoge Specimen eingesetzt, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement nicht enthalten.
Vor der Vermehrung wird die Probe bevorzugt einem oder mehreren Vorbehandlungsschritten unterzogen, um die nachzuweisenden Nukleinsäuren in eine vermehrungsfähige Form zu bringen. In einem ersten optionalen Schritt findet eine Vorbehandlung der Probe (Specimen) statt, durch welche die Probe in eine Form gebracht wird, aus der die nachzuweisende Nukleinsäure in eine für die Überführung der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung geeignete Form gebracht wird (z.B. Abtrennung störender Bestandteile aus der Probe).
Die Art der Vorbehandlung der Probe hängt von der Art der Probe und der Komplexität des biologischen Materials in der Probe ab. Bei humanen Körperflüssigkeiten wie z. B. Human-Blut erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform zunächst eine Abtrennung von Blutzellen zur Erzeugung von Plasma, Serum oder Blutzellkonzentraten. Durch diesen Trennschritt wird durch die Probenvorbehandlung die Komplexität des biologischen Probenmaterials in den resultierenden Fraktionen deutlich reduziert, ohne daß eine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäure erfolgt. Im Fall von Sputum oder Abstrichen erfolgt eine Probenvorbehandlung, z. B. durch Suspendieren des Sputums bzw. des Abstrichs in einer Flüssigkeit, im Fall von Urin z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Im Fall von Gewebspunktionen erfolgt eine Probenvorbehandlung z. B. durch Suspendierung und Behandlung mit einem Zellverbands-auflösenden Agens. Bei Cerebrosidal-Flüssigkeit erfolgt die Probenvorbehandlung z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Auch in diesen Fällen erfolgt durch die Probenvorbehandlung eine Reduktion der Komplexität des biologischen Probenmaterials.
Danach kann sich ein Schritt anschließen, in dem die nachzuweisende Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung zugängliche Form überführt wird. Dabei werden bevorzugt bekannte Methoden angewandt. In einer bevorzugten Aus- führungsform erfolgt in einem ersten Reaktionsschritt eine Lysebehandlung der vorbehandelten Probe zur Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsäure, z. B. durch Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonukleinsäuren durch Alkali. In einem zweiten Schritt wird die durch Lyse vorbehandelte Probe nach Zugabe von chaotropen Agentien, wie z. B. Guanidinium-Hydrochlorid oder Harnstoff, in An- oder Abwesenheit von löslichen Alkoholen, wie z. B. Isopropanol, an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger konzentriert. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen (z. B. Magnetpartikel, Glasvließe mit glashaltigen Oberflächen, Partikel, Mikrotiterplatten, Reaktionsgefäße, Dip-sticks oder miniaturisierte Reaktionskammern, die wiederum auch Teil von integrierten Reaktionschips sein können). Durch diesen festen Träger erfolgt bevorzugt eine nicht-sequenzspezifische Reinigung, d.h. keine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren von anderen Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-(Nukleinsäuren-)Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäure, z. B. im Rahmen von Multiplex- Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugängliche Form möglich.
In einer anderen Ausführung kann die Überführung der nachzuweisenden Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe nach Nukleinsäure-Freisetzung in einem ersten Schritt durch z. B. Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonukleinsäuren durch Alkali erfolgen. In einem zweiten Schritt wird die lysierte vorbehandelte Probe zur Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit festen Trägern in Kontakt gebracht, die mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Fangsonden spezifisch zur selektiven Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure modifiziert sind, und anschließend die gebundene nachzuweisende Nukleinsäure durch Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsäure wieder eluiert. Beispiele für Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen sind PNA-Homopyrimidin-Oligomere wie z. B. (T)7-PNA oder Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Substanzen wie z. B. Nukleinsäure-Interkalatoren, Major groove-Binder oder Minor groove-Binder. Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind Nukleinsäure- Oligomere oder Nukleinsäure-Polymere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Weitere Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind PNA-Oligomere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Die Bindung der Nukleinsäure- spezifischen Bindungsgruppen oder der Fangsonden an den festen Träger kann mit oder ohne Zwischenschaltung von Abstandshaltern (Spacern) entweder kovalent oder über Bindungspaare, wie z. B. BiotimStreptavidin oder NLChelat erfolgen.
Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäurensequenzen können linear oder zirkulär sein und können Sequenz-Modifikationen und/oder sonstige Modifikationen, wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon, enthalten oder methyliert, gecappt, polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäuren oder deren Komplement können natürlichen Ursprungs sein, fragmentiert, modifiziert oder enzymatisch, z. B. mit dem Enzym Uracil-Deglykosylase (UNG), oder physikalisch vorbehandelt, vorvermehrt, oder chemisch, photochemisch oder enzymatisch erzeugt sein, z. B. durch chemische Oligonukleotidsynthese oder in- vitro-Replikation, in-vitro-Reverse Transkription oder in-vitro-Transkription.
In dem ersten essentiellen Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure amplifiziert. Im Folgenden wird dieses Teilstück auch Amplikon genannt. Dieses enthält zwingend den Sequenzbereich zwischen den äußeren Enden der Bindesequenzen A und C bzw. des Komplements davon der Primer (den Primerbindungsbereichen), und enthält den Bindebereich E der Sonde bzw. das Komplement davon. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Amplikon (bevorzugt die Gesamtlänge der Sequenzen der Bereiche A, B und C) bevorzugt kürzer als 100 Nukleotide, besonders bevorzugt kürzer als 60 Nukleotide, jedoch bevorzugt länger als 40 Nukleotide. Dies bedeutet jedoch nicht, daß die Gesamtlänge der Amplifikate nicht doch größer sein kann, z. B. wenn die Primer zusätzlich Nukleotide aufweisen. Es werden solche Vermehrungsmethoden eingesetzt, die eine Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement erlauben, die in der Bildung von Tripartite-Mini-Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten münden [Mini Chain Reaction (MCR)]. Hierfür stehen prinzipiell alle Nuklein- säureamplifikationsverfahren zur Verfügung, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugt werden targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen verwendet. Besonders bevorzugt werden theoretisch exponentielle targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen verwendet, bei denen eine antiparallele Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement erfolgt, wie z. B. Elongations- basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR für
Desoxyribonukleinsäuren, RT-PCR für Ribonukleinsäuren) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TMA). In besonderer Weise bevorzugt werden thermozyklische exponentielle Elongations-basierte Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion verwendet. Die zur Vermehrung eingesetzten nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement können in Form von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren oder Ribonukleinsäuren vorliegen. Ziel der Vermehrungsreaktion (Amplifikation) ist die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks der nachzuweisenden Nukleinsäure. Unter einem Amplifikat wird daher jede unter Verwendung von Sequenzinformation der Nukleinsäure hergestellte Molekülspezies verstanden. Insbesondere handelt es sich um Nukleinsäuren. Der Begriff "Amplifikat" beinhaltet sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Ein Amplifikat kann neben den die Sequenzinformationen der zugrunde liegenden Nukleinsäure enthaltenden Bereichen (Amplikon) außerhalb der voneinander wegweisenden Enden der Primerbindungsstellen noch weitere Bereiche enthalten, welche nicht in direkter Relation mit Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäure stehen. Bevorzugt kommen gerade solche Sequenzen einer Länge von mehr als 15 Nukleotiden nicht auf der nachzuweisenden Nukleinsäure oder ihrem Komplement vor und können mit dieser nicht durch direkte Basenpaarung hybridisieren. Amplifikate können somit entweder mit der nachzuweisenden
Nukleinsäure selbst oder mit deren Komplement hybridisieren. Amplifikate sind beispielsweise auch die Produkte einer asymmetrischen Amplifikation, d. h. einer Amplifikation, bei der die beiden Stränge in unterschiedlicher Menge gebildet werden (z. B. durch Einsatz unterschiedlicher Mengen an Primern) oder einer der beiden Stränge wieder zerstört wird (z. B. durch RNase).
Unter einem Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, welches über Basenpaarungen an eine Nukleinsäure T oder deren Komplement binden kann und welches, bevorzugt enzymatisch, verlängert werden kann. Bevorzugt sind Oligonukleotide, die an ihrem 3 '-Ende unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure oder einem Komplement hiervon als Templatnukleinsäure verlängert werden können. Als Primer können monovalente oder multivalente oder monofunktionelle oder multifunktionelle Agentien eingesetzt werden, die eine Nukleinsäure-abhängige Elongation zulassen. Diese Agentien können auch aus verschiedenen Molekülarten zusammengesetzt sein, z. B. Chimären aus PNA und Nukleotid(en) oder aus Protein/Peptid und Nukleotid(en). Bevorzugt können als Primer Oligomere oder Polymere einer Bindelänge von zwischen 9 und 30 nt, besonders bevorzugt zwischen 11 und 22 nt verwendet werden, die an die nachzuweisende Nukleinsäure T oder deren Komplement antiparallel binden und die als einer von mehreren Reaktionspartnern für eine enzymatische Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement wirken. Besonders bevorzugt werden als Primer Oligomere verwendet, die nach Zugabe eines Vermehrungsreagenzes durch Anlagerung zumindest eines Teils des Primers an die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement eine gerichtete Replikation einer oder beider Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement initiieren. Ein Beispiel für einen besonders bevorzugten Primer ist ein Oligonukleotid mit einem freien 3 '-Hydroxyl-Ende.
Die als Primer eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement enthalten und können Sequenz-Modifikationen, endständige und/oder interne Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktioneile Nu- kleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen-Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Erforderlich ist, daß sie die geforderten Bindeeigenschaften zur nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. ihrem Komplement haben und verlängerbar sind. Bevorzugte Nukleotid-Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere (WO 92/20702) mit oder ohne positive und/oder negative Ladungen im Rückgrat und/oder im Abstandshalter. Die als Primer eingesetzten Agentien können Modifikationen tragen, die entweder direkt oder indirekt über ein weiteres Bindungspaar zur Detektion und/oder Bindung an einen festen Träger geeignet sind. Bevorzugte Primer- Modifikationen sind die Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Fluorescein, Rhodamin, AMCA oder Derivate davon, einen Partner in einem der Bindungspaare Biotin:(Strept-)Avidin, Digoxigeni Anti-Digoxigenin, Digoxigeni Anti-Digoxigenin gekoppelt mit Äquorin, Fluorescein: Anti-Fluorescein oder Ruthenium- oder Rhenium-Chelat oder Äquorin. Eine besonders bevorzugte Primer-Modifikation ist Biotin als Fang- oder Detektions- Modifikation. Die Primer können weitere Sequenzbereiche Y enthalten, insbesondere an ihrem 5'-Ende (Fig. 2). Hier sind sowohl 5 '-3 '-Verknüpfungen als auch 5'-5'- Verknüpfungen und/oder 5 '-2 '-Verknüpfungen möglich. Außerdem können sie zusätzliche Strukturkomponenten, wie z. B. Abstandshalter, immobilisierbare Gruppen oder Löslichkeits-vermittelnde Molekülteile oder im Hinblick auf Primingaktivität aktivierbare Bereiche haben, wie z. B. AP-Stellen.
Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, welches aufgrund von Basen-Basen- Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren hybridisieren kann. Bevorzugte Sonden sind daher Oligonukleotide sowie basenhaltige Nukleinsäuremimetica, wie Peptidnukleinsäuren (PNA). Die Länge einer Sonde beträgt, bezogen auf die Bindesequenz D, bevorzugt zwischen 9 und 30 Basen.
PNA-Oligomer-Sonden mit oder ohne positive oder negative Ladungen im Rückgrat und oder Abstandshalter haben die zusätzlichen Vorteile, daß sie stabil sind gegenüber dem Abbau von Nukleasen oder Proteasen wegen der verschiedenen Struktur des Rückgrats und der H- bzw. NH2-Enden, einen höheren Schmelzpunkt in Bindungskomplexen zwischen Nukleinsäuren und PNA als zwischen zwei
Nukleinsäure-Molekülen aufwiesen und der Hybridkomplex dadurch stabiler ist, bei niedrigen Salzkonzentrationen anwendbar sind, eine höhere Differenz der Schmelzpunkte bei Fehlpaarungen aufwiesen und somit eine bessere Fehlpaarungs- Diskriminierung möglich ist, Sequenzen mit Sekundärstrukturen bei niedrigen Salzkonzentrationen zugänglicher sind, die Kompetition zwischen Amplikon-Ge- genstrang und Sonde geringer ist bei niedrigen Salzkonzentrationen und dadurch eine höhere Signalausbeute erreicht wird und das Potential zur Eliminierung des Amplikon- Denaturierungsschritts bei niedrigen Salzkonzentrationen besteht.
Als Sonden können monovalente oder multivalente Agentien eingesetzt werden, die eine Bindung vermehrungsabhängiger Elongationsprodukte und/oder vermehrter Nukleinsäuresequenzen zulassen. Bevorzugt können als Sonden Oligomere oder Polymere verwendet werden, die an die nachzuweisende Nukleinsäure antiparallel binden. Besonders bevorzugt werden als Sonden Oligomere verwendet, die durch Anlagerung zumindest eines Teils der Sonde an die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement eine im Rahmen der Folgereaktionen stabile Bindung an einen oder beide Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement herbeiführen. Die Oligomere können sowohl 5 '-3 '-Verknüpfungen als auch 5 '-5 '-Verknüpfungen und/oder 5 '-2 '-Verknüpfungen sowie zusätzliche Strukturkomponenten, wie z. B. Abstandshalter oder Löslichkeits-vermittelnde Molekülteile, enthalten.
Unter einer Bindesequenz wird bevorzugt die Sequenz von Basen verstanden, die zwischen den äußersten, mit einer bestimmten Nukleinsäure, einem Primer oder einer Sonde über Basen-Basen- Wechselwirkung bindenden Basen einer bestimmten Nukleinsäure, einem Primer oder einer Sonde liegt, einschließlich dieser äußersten Basen.
Die als Sonde eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen D für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement, insbesondere jedoch für einen Strang des Amplifikats enthalten und können Sequenz- Modifikationen, endständige und/oder interne Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktioneile Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein, solange die Bindung an einen Strang des Amplifikats möglich ist. Bevorzugte Nukleotid-Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere mit oder ohne positive und/oder negative Ladungen im Rückgrat und/oder Abstandshalter. Die als Sonden eingesetzten Agentien können Modifikationen tragen, die entweder direkt oder indirekt über ein weiteres Bindungspaar zur Detektion und/oder Bindung an einen festen Träger geeignet sind. Bevorzugte Sonden- Modifikationen (nachweisbare Gruppen L, immobilisierbare Gruppen I) sind die Fluo- reszenzfarbstoffe wie z. B. Fluorescein, Rhodamin, AMCA oder Derivate davon, Bindungspaare Biotin:(Strept-)Avidin, Digoxigeni Anti-Digoxigenin, Digoxigenin:Anti-Digoxigenin gekoppelt mit Äquorin, Fluorescei Anti-Fluorescein oder Ruthenium-Chelat oder Äquorin. Besonders bevorzugte Sonden-Modifikation sind Biotin als Fang- oder Detektions-Modifikation, Digoxigenin, Ruthenium- oder Rhenium-Chelat oder Äquorin als Detektions-Modifikationen. In der vorliegenden Erfindung wird das Teilstück der Nukleinsäure, von welchem eine Vielzahl von Amplifikaten hergestellt werden soll, so ausgewählt, daß es drei Bereiche A, B und C enthält. Die Bereiche A und C sind Bereiche, die so gewählt werden, daß der eine Primer die Sequenz A als Bindesequenz benutzen kann und das Komplement des Bereiches C als Bindesequenz für den anderen Primer dienen kann. Unter einem Komplement wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine zu einer bestimmten anderen Nukleinsäure, z. B. einem Sequenzbereich z. B. eines Amplifikats oder der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz verstanden.
Im wesentlichen komplementär bedeutet, daß die Basenpaarungen so gewählt sind, daß (für den Fall, daß eine Hybridisierung mit einer anderen Nukleinsäure, z. B. einer Sonde oder einem Primer) eine Hybridisierung unter den Testbedingungen noch erfolgen kann bzw. (für den Fall eines Verlängerungsprodukts eines Primers im Verhältnis zu dem eingesetzten Templat) die Nukleinsäure aufgrund einer Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsäure gebildet werden konnte. Im wesentlichen komplementär bedeutet daher oft, daß unter stringenten Bedingungen mehr als 90 % der Basen der betrachteten Nukleinsäure bzw. Sequenz mit der bestimmten Nukleinsäure bzw. Sequenz Basenpaarungen ausbilden.
Die Bereiche A und C sind erfindungsgemäß bevorzugt so lang, daß Bedingungen gefunden werden können, bei denen Primer einer entsprechenden Länge mit den Basen in diesen Bereichen hybridisieren können. Daher sind die Bereiche bevorzugt länger als 8, besonders bevorzugt länger als 12 Nukleotide. Auch bezüglich der Obergrenze der Länge der Bereiche A und C ergeben sich im Sinne der Erfindung bevorzugte Bereiche. Die Bereiche A und C sind jeweils bevorzugt kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 20 Nukleotide. Die Länge der Bereiche wird in einem besonderen Aspekt der Erfindung dadurch nach oben begrenzt, daß die Primer in für die nachzuweisende Nukleinsäure unspezifischer Weise daran hybridisieren können sollen. Daher ist die besonders bevorzugte Länge der Bindesequenzen A und C 12 bis 20 Nukleotide. Die Bereiche A und C auf der nachzuweisenden Nukleinsäure überlappen nicht miteinander. Im Sinne der Erfindung enthalten das Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure (welches dem Amplikon entspricht) und somit die hieraus gebildeten Amplifikate eine zwischen den Bereichen A und C gelegene Sequenz B (Fig. 1 bis 3). Diese Sequenz hat eine Länge von ein oder mehr Nukleotiden, bevorzugt mehr als 4, besonders bevorzugt mehr als 8 Nukleotide. Nach oben hin ist die Länge der Sequenz B durch die geforderte Nichtanwesenheit von Nukleotiden, die nicht der Bindesequenz der Sonde zugehören, und in einem besonderen Aspekt der Erfindung durch die gewünschte Unspezifität der Sonde begrenzt. Bevorzugt ist die Sequenz B daher kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 15 Nukleotide. Die Sequenz B hat bevorzugt eine Länge von zwischen 4 und 30 Nukleotiden. Besonders bevorzugt ist die Länge der Sequenz B zwischen 8 und 15 Nukleotiden. Diese Sequenz oder das Komplement davon dienen im Sinne der Erfindung mit zur Bindung der Sonde. Die Länge der Sonde wird so gewählt, daß eine Hybridisierung mit dem Amplifikat möglich ist. Die Sequenz der Sonde wird so gewählt, daß sie eine Bindesequenz D enthält, welche durch die mit dem Amplikon Basen-Basen- Wechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde, insbesondere den zwischen den äußersten mit korrespondierenden Basen des Amplikons Basenwechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde definiert ist. Bevorzugt ist die Sonde im wesentlichen komplementär zu den Nukleotiden der Bindesequenz E des Amplifikats. Die Bindesequenz D bzw. deren Komplement D' kann zu dem Amplifikat zu 100 % komplementär sein, aber auch Mismatche (Fehlpaarungen) zwischen den äußeren Enden der Bindesequenz aufweisen. Die Sonde kann neben der Bindesequenz weitere Gruppen oder Reste oder auch Nukleinsäure-bindende Bereiche enthalten (Fig. 3, V, VI).
Abhängig von der Länge des Bereiches B und der Länge der Bindesequenz D bzw. D' lassen sich unterschiedliche Fallgestaltungen treffen. In einem ersten Fall ist die Bindesequenz D oder D' länger als der Bereich B bzw. B' des Amplikons. In diesem Fall reicht die Bindesequenz D bzw. D' in einen oder beide Bereiche A bzw. A' und C bzw. C des Amplikons hinein. Diese Fälle sind in Fig. 3, II bis IV gezeigt. In diesen Fällen enthält das Amplifikat zwischen den voneinander wegweisenden Enden der Bereiche A und C keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz E oder den Bindesequenzen der Primer zugehören. Die Bindesequenz D der Sonde überlappt in Fig. 3, II und III mit einer der beiden Bindesequenzen der Primer.
In einem weiteren Fall entspricht die Länge des Bereiches B der Länge des Bereiches D, so daß die Bindesequenz der Sonde nicht mit den Bindesequenzen der Primer überlappt (Fig. 3, 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform die Bildung von dreiteiligen Mini-Amplikons (Tripartite-Mini- Amplikon), die neben den Primer und Sonde bindenden Sequenzen keine zusätzlichen Sequenzen aufweisen und somit die Nachteile bei Bildung von längeren Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten vermeiden, wobei andererseits die Spezifität des gesamten Amplifikationsformats durch Bindung der Primer, durch Bindung der Sonde und durch Ablauf der targetabhängigen enzymatischen Elongationsreaktion mit allen 4 Nukleotid- bzw. Basenspezifitaten oder natürlicher oder artifizieller Analoga, Isomere oder Äquivalente davon aber sichergestellt wird. Das erfindungsgemäße Veirnel rungsverfahren wird daher auch als Mini-Chain-Reaction (MCR) bezeichnet.
Die Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement erfolgt, wenn im folgenden nichts anderes ausgesagt ist, unter Befolgung der dem Fachmann bekannten Reaktionsschritte und Reaktionsbedingungen. Ein Unterschied zu den herkömmlichen Verfahren ist der Einsatz der speziell ausgewählten Primer und Sondensequenzen, welche die Bildung und Vermehrung des Mini-Tripartite- Amplikons erlauben. Wesentlich im Sinne der Erfindung ist die Zugabe von eines oder mehrerer Primer, die an die Primer-Bindesequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäure, des Tripartite-Mini-Amplikons beziehungsweise deren Komplemente binden.
Allgemein üblich ist die Zugabe zur Vermehrung befähigender Vermehrungsreagentien. Bevorzugt können als Vermehrungsreagentien enzymatisch aktive Komponenten (z. B. Enzyme) in Kombination mit Elongationssubstraten und geeignete Hilfsreagentien (wie Puffer) verwendet werden. Bevorzugte Elongationssubstrate sind Nukleinsäurebausteine oder natürliche oder artifizielle Analoga oder Isomere oder Äquivalente davon. Als Elongationssubstrate werden Agentien eingesetzt, die zum Aufbau eines Gegenstrangs der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignet sind. Bevorzugt werden als Elongationssubstrate Nukleotide eingesetzt. Bevorzugte Nukleotide sind dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP und ATP, GTP, CTP, UTP und oder ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP. Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere mit oder ohne positive und/oder negative Ladung im Rückgrat und/ oder im Abstandshalter. Die Elongationssubstrate können, wie oben ausgeführt, Modifikationen tragen.
Besonders bevorzugt werden im Fall der PCR als Nukleinsäure- Vermehrungsreagentien Mischungen aus meta- oder thermostabilen enzymatischen DNA-Polymerase- Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und/oder Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagenzien verwendet, z. B. Taq-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und oder dUTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Besonders bevorzugt werden im Fall der RT-PCR als Vermehrungsreagentien Mischungen, Komplexe oder Domänen aus thermostabilen enzymatischen Reverse Transkriptase- und DNA-Polymerase- Aktivitäten und
Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet, z. B. Mischungen aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase oder Tth-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und ATP, GTP, CTP, UTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien.
Bei den thermozyklischen Vermehrungsreaktionen (z. B. PCR, RT-PCR) werden 2- oder 3-phasige Zyklen durchgeführt, bevorzugt 2-phasige Zyklen. Bei den 2-phasigen Zyklen wird die Strangtrennung der Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bei hoher Temperatur, bevorzugt 85 °C - 95 °C, durchgeführt, das gemeinsame Primer- Annealing und Primer-Elongation bei Temperaturen nahe dem Schmelzpunkt zwischen Primer und Elongationsgegenstrang, bevorzugt zwischen 52 °C und 75 °C. Die Strangtrennung erfolgt durch Energiezufuhr und oder enzymatisch, bevorzugt durch erhöhte Temperatur, Mikrowellen oder das Anlegen einer Spannung über eine Mikroelektrode, besonders bevorzugt durch erhöhte Temperatur. Es werden bis zu 60 Thermozyklen durchgeführt, bevorzugt 32 - 42 Zyklen. Bei den isothermen Vermehrungsreaktionen (z. B. SDA) wird eine kontinuierliche Inkubation bei einer mittleren Temperatur zwischen 30 °C und 70 °C durchgefürt, bevorzugt bei 37 °C - 45 °C mit Enzymmischungen, Komplexen oder Domänen, bzw. 60 °C - 65 °C mit mesothermen Enzymmischungen, Komplexen oder Domänen, im Fall von SDA mit z. B. mesothermen Restinktionendonukleasen und DNA-Polyermasen, z. B. aus Bacillus stearothermophilus (z. B. BsoBI/Bst DNA-Pol exo); alternative Enyzme sind Ava I und Bca DNA-Pol exo. Es wird bis zu 2 Stunden inkubiert, bevorzugt 30 - 60 Minuten. Die Vermehrungsreaktion kann in Reaktionsgefäßen, Kapillaren oder miniaturisierten Reaktionskammern erfolgen, die auch Teil eines integrierten Reaktionschips sein können.
Bei Verwendung von dUTP anstelle von oder in Ergänzung zu dTTP wird durch die DNA-Polymerase- Aktivität dUMP anstelle von dTMP in die vermehrte Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement eingebaut. Dies erlaubt durch Inkubation mit der Enzymaktivität Uracil-Deglycosylase, bevorzugt mit einer thermolabilen Ausführungsform der Enzymaktivität, bei der die Renaturierung nach thermischer Denaturierung der Enzymaktivität langsamer erfolgt, die Fragmentierung des Vermehrungsprodukts und somit seiner Eigenschaft als Nukleinsäure- Vermehrungseinheit. Die Inkubation des UMP-haltigen Vermehrungsprodukts kann im Anschluß an die Nukleinsäure- Vermehrungs- und Nachweisreaktion (Sterilisierung) und/oder vor einer erneuten Nukleinsäure-Vermehrungsreaktion (Carry over-Prävention) erfolgen.
Alternativ können auch Psoralen und/oder Isopsoralen und Derivate davon und Bestrahlung mit UV-Licht zur funktioneilen Inaktivierung des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts verwendet werden.
Im Fall von NASBA und TMA können als Nukleinsäure-Vermehrungsreagentien bevorzugt Mischungen, Komplexe oder Domänen aus enzymatischen Reverse Transkriptase-, DNA-Polymerase, RNase H und RNA-Polymerase und Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet werden, z. B. eine Mischung aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase, ggf. E. coli DNA- Polymerase, ggf. E. coli RNase H und T7-, T3- oder SP6-codierte RNA-Polymerase oder Mo-MLV Reverse Transkriptase und T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase oder entsprechende mesostabile Enzyme, z. B. aus Bacillus stearothermophilus in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und ATP, GTP, CTP, UTP, und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Der Reaktionsverlauf der Vermehrungsreaktion bei NASBA, TMA ist isotherm.
Der Nachweis der Bildung der Amplifikate erfolgt mit der Sonde, die an die Bindesequenz B des Amplikons zu einem Hybrid bindet. Die Sonde kann als Fang- oder Detektionssonde fungieren. Die Enden der Bindesequenz der Sonde liegen zwischen den äußeren Enden der Primer-Bindesequenzen. Die Sonde ist somit hybridisierbar mit einem Strang des Amplifikats.
Die Bindung der Sonde kann unter Benutzung bekannter Bedingungen geschehen. Denn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausfuhrungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Harnes und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die chemische Synthese von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden und die Auswahl von Hybridisierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die unter anderem vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt.
Hierzu wird, wenn die Fangsonde (in geschützter Form) nicht schon vorher zugegeben wurde, die Sonde zu der Reaktionsmischung nach der Vermehrungsreaktion, bevorzugt in Form einer Lösung, zugegeben. Dabei werden Reagenzbedingungen eingestellt, die eine Hybridisierung der Sonde mit einem Amplifikat erlauben. Die Bindung zwischen der vermehrten Nukleinsäuresequenz des Amplikons und/oder dessen Komplement und der Sonde erfolgt bevorzugt bei einer konstanten Temperatur zwischen 20 °C und 75 °C, bevorzugt um 0 °C - 30 °C, besonders bevorzugt um 0 °C - 15 °C unterhalb der Schmelztemperatur des Bindekomplexes. Die Inkubationszeit beträgt bis zu 4 Stunden, bevorzugt 15 - 120 Minuten, besonders bevorzugt 30 - 60 Minuten. Die Bindung mit dem Amplifikat und/oder dessen Komplement erfolgt mit oder ohne vorausgehenden Denaturierungsschritt. Die Reaktionsführung ohne vorausgehenden Denaturierungsschritt erfolgt bevorzugt mit PNA-Oligomeren mit oder ohne negative und/oder positive Ladungen im Rückgrat und/oder im Abstandshalter bei niedrigen Salzkonzentrationen.
Bei Verwendung mehrerer Sonden oder multifunktionaler Sonden oder Sonden, die mehrere Bindesequenzen für Amplifikate verschiedener nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplemente aufweisen, können mehrere unterschiedliche Amplifikate oder deren Komplemente gebunden werden. Dabei erlaubt die Bildung von Tripartite-Mini- Amplikons bevorzugt ähnlicher Länge, besonders bevorzugt solcher Tripartite-Mini-Amplikons gleicher Länge, bei der Nukleinsäurevermehrung die Einstellung vereinheitlichter Inkubationsbedingungen für die Bildung der unterschiedlichen Bindekomplexe. Dies erlaubt den parallelen und/oder sequentiellen Nachweis mehrerer Nukleinsäuresequenzen im Rahmen von Multiplex -Verfahren. Unter einem Multiplex- Amplifikationsverfahren wird meist ein Verfahren verstanden, bei dem entweder unterschiedliche Sequenzen auf einer Nukleinsäure (z. B. unterschiedliche Regionen eines Gens) oder aber unterschiedliche Sequenzen auf unterschiedlichen Nukleinsäuren, z. B. aus unterschiedlichen Organismen, z. B. unterschiedlichen Viren, gleichzeitig in einer Amplifikationsmischung vermehrt werden. Solche Verfahren stellen hohe Anforderungen an die Reaktionsbedingungen, da für eine zuverlässige Auswertung die Amplifikationen für die unterschiedlichen Sequenzen eine ähnliche Amplifikations-Effizienz haben müssen. Einen der Einflußfaktoren für unterschiedliche Effizienz auszuräumen, ist Gegenstand der vorligenden Erfindung. Dazu unterscheiden sich die Ampliconlängen bevorzugt um nicht mehr als 20 %, besonders bevorzugt um nicht mehr als 5 Nukleotide. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Multiplexverfahrens werden Amplicons der verschiedenen Sequenzen hergestellt und anschließend die Summe der gebildeten Amplicons bestimmt. Dabei wird bevorzugt ein Nachweisverfahren eingesetzt, bei dem eine Markierung für alle Nachweise verwendet werden kann; so können beispielsweise alle Sonden für die einzelnen Amplifikate gleich markiert sein, z. B. mit dem gleichen Ruthenium-Komplex. Dieses Vorgehen ist insbesondere für Tests in Proben aus Blutbanken vorteilhaft, da es bei der weiteren Verwendbarkeit der Proben für Blutspenden nicht auf die Art einer Infektion ankommt, sondern die Probe schon dann nicht mehr als Blutspendematerial in Frage kommt, wenn irgendeine getestete Infektion (z. B. HIV oder HBV) vorliegt.
Bei den Multiplex-Amplifikationsverfahren unterscheidet man zwischen echten und unechten Multiplex- Verfahren. Bei unechten Verfahren werden die Primer aus stark konservierten Regionen der Analytnukleinsäuren ausgewählt, derart, daß mit dem einen Set von (2) Primern alle nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen amplifiziert werden. Bei echten Multiplex- Verfahren wird ein Gemisch von mehr als 2 Primern eingesetzt, von denen mindestens 2 eine unterschiedliche Selektivität haben. Einer oder mehrere der Primer können für alle oder ein Unterset von nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifisch sein. Dieses Verfahren ist insbesondere dann vorzuziehen, wenn wenig verwandte Sequenzen nebeneinander amplifiziert werden sollen.
Mit Multiplex- Verfahren können verschiedenste Kombinationen von nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen nebeneinander amplifiziert werden, z. B. verschiedene Subtypen eines Virus oder Bakterien verschiedener Genera oder Spezies.
Der Nachweis des gebildeten Bindekomplexes zwischen Amplifikat und Sonde kann in für den Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere in verschiedenen Ausführungsformen erfolgen, nämlich direkten Nachweisverfahren, wie z. B. mit spektroskopischen oder physikalischen Methoden, durch Sequenzierung oder durch heterogene oder homogene Nachweisformate.
Direkte spektroskopische oder physikalische Verfahren sind z. B. Schmelztemperaturbestimmungen, Anlagerung von interkalierenden oder Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen oder Metallatomen oder -partikeln, Massenspektroskopie, Oberflächen- Plasmonenresonanz oder Fluoreszenz-gekoppelte Oberflächen-Plasmonenresonanz, oder E-wave-Messungen.
Die Sequenzierung des gebundenen Tripartite-Mini- Amplikons kann über Bindung des Primers und anschließende enzymatische Sequenzierung nach Sanger erfolgen. Zur Detektion der Sequenzierungsprodukte ist bevorzugt entweder der Primer markiert oder die Kettenabbruchreagentien. Die Sequenzierungsprodukte können auch über Massenspektroskopie nachgewiesen werden. Bei Zugabe lediglich limitierter Nukleotidarten entsprechend den flankierenden Nukleotiden am Primerende ist eine Minisequenzierung möglich, was besonders für die Analyse von Polymorphismen von Vorteil ist.
Bei den heterogenen Nachweisverfahren kann die Sonde abhängig von der angebrachten Modifikation entweder als Fangsonde oder als Detektorsonde verwendet werden. Bei Verwendung mehrerer Sonden sind Multiplexformate realisierbar.
Bei Verwendung der Sonde als Fangsonde kann die Sonde entweder an dem festen Träger kovalent oder über ein Bindungspaar vorgebunden sein und die Bildung des
Bindekomplexes zwischen Amplifikat und der Sonde erfolgt auf dem festen Träger. Bei dieser Ausführungsform können neben festen Trägern, die eine Sondenart enthalten, auch feste Träger realisiert werden, die mehrere bzw. eine Vielzahl von Sondenarten enthalten, wie z. B. Sonden-Perlen bzw. Partikeln (sogenannte beads), Sonden- Teststreifen, Sonden-Panels oder Sonden- Arrays auf festen Trägern oder miniaturisierten Chips, die wiederum auch Teil von integrierten Reaktionschips sein können. Diese trägergebundenen Nachweissysteme sind besonders geeignet für Multiplexformate. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex zwischen Amplifikat und Fangsonde in Lösung erst vorgebildet und anschließend auf den festen Träger aufgebracht. Hierzu enthält das Amplikon bevorzugt eine immobilisierbare Gruppe I, die an eine an einer Festphase befindlichen Gruppe R binden kann.
Die Art der Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevorzugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe beispielsweise ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase bindende Proteine wie Avidin oder Streptavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Streptavidin. Die Immobilisierung über eine Gruppe an der modifizierten
Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridisierungsreaktionen. Bevorzugt wird zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren die Reaktionsmischung vor, während oder nach Bildung der Nukleinsäurehybride in ein Gefäß gefüllt, welches an seiner Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren kann. Es ist möglich, eine Festphase in Form eines porösen Materials, wie einer Membran, eines Gewebes oder eines Vlieses, zu verwenden, aufweiche die Reaktionsmischung aufgegeben wird. Ebenso ist die Verwendung von Perlen, sogenannten beads - z. B. Magnetpartikeln oder Latex- Partikeln - möglich. Das Gefäß ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte mindestens so viele Bindungsstellen für die immobilisierbare Gruppe der Sonde haben wie Nukleinsäurehybride und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vorhanden sind. Die Herstellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A- 0 344 578 beschrieben, aufweiche vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Für die heterogenen Nachweisreaktionen wird nach der Inkubationszeit, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, die flüssige Phase aus dem Gefäß, dem porösen Material oder den pelletierten beads entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, da die Bindung der Hybride an der Festphase sehr effizient ist. Die Detektion der gebundenen Bindekomplexe kann über die während der Nukleinsäuresequenz-Vermehrungsreaktion eingebaute
Detektionsmodifikation im Primer und/oder einem Nukleotid und/oder der Sonde mit Hilfe von bekannten direkten oder indirekten Nachweisarten für diese Modifikationen nach dem Stand der Technik erfolgen.
Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenzlabeln, kann die Menge an Markierung fluorometrisch bestimmt werden. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Farboder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der
Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische, chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vermehrten Tripartite-Mini- Amplikons durch Nukleinsäure-Fangsonden oder PNA-Fangsonden gebunden, die kovalent auf Mikro titerplatten oder Magnetpartikeln immobilisiert sind. Die Detektion erfolgt in dieser bevorzugten Ausführungsform nach Bildung des Bindekomplexes und Waschen über eine Biotin-Modifikation eines oder beider Primer im Amplifikat durch Anlagerung von Avidin-Meerrettich-Peroxydase und einer Mischung aus TMB/TMF- Farbsubstraten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Einbau einer Digoxigenin- Detektionsmarkierung über eines der Nukleotide der Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion. Der Bindekomplex zwischen Amplifikat und einer Biotin- markierten Nukleinsäure-Fangsonde oder PNA-Fangsonde wird auf die Oberfläche eines Streptavidin-beschichteten Reaktionsgefäßes gebunden. Nach Waschen erfolgt Anlagerung von Anti-Digoxigenin-Meerettich-Peroxidase-Antikörperkonjugaten und Farbnachweis mit dem Farbsubstrat ABTS.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis einer oder mehrerer Amplifikate nach Bindung durch eine oder mehrere verschiedene kovalent (z. B. Anthrachinon: UV-Licht-Kopplung oder Gold-Oberfläche: SH-Kopplung) oder koordinativ (z. B. Biotin: Streptavidin) gebundene Fangsonden, durch Waschen und durch Detektion eines Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Signals, das entweder direkt durch Primärlicht oder über Oberflächenplasmonresonanz oder E-wave angeregt wurde, mit Hilfe von z. B. CCD-Kameras oder konfokalen Fluoreszenz-Scannern.
Bei Verwendung der Sonde als Detektionssonde kann die Sonde entweder gleichzeitig, vor oder nach Bindung des Amplifikats an die feste Phase binden. In diesem Fall erfolgt die Bindung des Amplifikats an die feste Phase über Modifikationen, die über einen oder beide Primer oder über die eingebauten Nukleotide eingebaut wurden. Anschließend wird gewaschen und detektiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Komplex zwischen Amplifikat und Detektionssonde in Lösung erst vorgebildet und anschließend auf den festen Träger aufgebracht und gewaschen. Die Detektion der Festphase-gebundenen Bindekomplexe zwischen Amplifikat und Detektionssonde erfolgt über die Detektionsmodifikation der Sonde mit Hilfe von bekannten direkten oder indirekten Nachweisarten für diese Modifikationen nach dem Stand der Technik.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden an die Amplifikate, die über einen oder beide Primer Biotin-Modifikationen enthalten, Ruthenium- Chelat-haltige
Detektionssonden gebunden. Die Detektionssonden sind entweder Ruthenium-markierte Oligonukleotide oder Ruthenium-markierte PNA-Oligomere. Nach Bildung des Bindekomplexes zwischen Ruthenium-markierter Detektionssonde und Biotin- markiertem Amplifikat erfolgt Bindung des Komplexes an Streptavidin-beschichtete Magnetpartikel, Transfer in eine Meßzelle, Anlagerung an eine Elektrode innerhalb der Meßzelle und Erzeugung und Messung eines Elektochemilumineszenz-Signals.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Detektions-Sonde mit Digoxigenin markiert. Nach Bildung des Bindekomplexes zwischen Digoxigenin- markierter Detektionssonde und Biotin-markiertem Amplifikat erfolgt die Bindung des Komplexes durch eine Fangsonde, die kovalent auf einer Mikrotiterplatte oder auf Magnetpartikeln immobilisiert ist. Die Detektion erfolgt in dieser bevorzugten Ausführungsform nach Bildung des Bindekomplexes und Waschen über eine Biotin- Modifikation eines oder beider Primer im Tripartite-Mini- Amplikon durch Anlagerung von Avidin-Meerrettich-Peroxidase und einer Mischung aus TMB/TMF-Farbsubstraten. Bei der Verwendung von homogenen Reaktionsformaten werden Detektionssonden verwendet, die entweder gequenchte Fluoreszenzmarkierungen, interne Basensubstitutionen mit Doppelstrang-Komplex-aktivierbaren Fluoreszenzfarbstoffen oder endständige Energie-Donatoren oder -Akzeptoren (in Kombination mit entsprechenden Energie-Donatoren oder -Akzeptoren an benachbarten Primer- oder -E- Sondenenden: Energy-Transfer-Komplexe) tragen. In diesen Fällen wird die Detektionssonde schon während der Nukleinsäure- Vermehrung zugegeben. Im Fall der gequenchten Fluoreszenzmarkierungen erfolgt eine Fluoreszenzaktivierung durch Dequenching nach Bindung der Detektions-Sonde an das entstehende Tripartite-Mini- Amplikon und exonukleolytischer Abbau und Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoff- modifizierten Nukleotids. Im Fall der internen Basensubstitutionen erfolgt die Erzeugung des Fluoreszenzsignals durch Ausbildung des Bindekomplexes zwischen Detektionssonde und dem sich bildenden Tripartite-Mini- Amplikon. Im Fall der Energie-Transfer-Komplexe erfolgt die Bildung eines Fluoreszenzsignals durch benachbarte Anlagerung des markierten Primers und der markierten Sonde. Die
Messung der resultierenden Fluoreszenzsignale erfolgt jeweils bevorzugt durch Real time-Messungen.
In einer besonderen Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Fluorescein und Rhodamin oder Derivate davon als Fluoreszenz- und Quencher- Komponenten verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Ruthenium- oder Rhenium-Chelate und Quinone oder Derivate davon als Elektrochemilumineszenz- und Quencher-Komponenten verwendet. In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden als interne Basensubstituenten der Detektorsonde Anthrachinon oder Derivate davon verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden Cy-5 und Fluorescein oder Derivate davon als Energie- Transfer-Komponenten verwendet. In einer speziellen Ausführungsform werden Cyanin-Farbstoffe wie z. B. SYBR Green oder Acridin-Farbstoffe verwendet.
Besonders bevorzugt im Sinne dieses ersten Aspekts der Erfindung sind solche Ausführungsformen, bei denen mindestens eine der Bindesequenzen der Primer und der Sonde nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist. Spezifisch im Sinne der Erfindung ist eine Sequenz dann, wenn sie aufgrund einer fortlaufenden Sequenz von Nukleobasen prinzipiell in der Lage wäre, unter stringenten Bedingungen nur mit einer Sequenz auf der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht jedoch mit Nukleinsäuren anderer, nicht nachzuweisender Organismen oder Spezies oder Gruppen von Organismen zu binden. Bevorzugt ist eine Sequenz dann nicht für eine Sequenz spezifisch, wenn sie unter den Bedingungen, welche für die Durchführung des Nachweises eingestellt werden, mit anderen Nukleinsäuren hybridisieren könnte.
Unabhängig von dem bisher beschriebenen ersten Aspekt der Erfindung ist ein übergeordneter Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe mindestens zweier Primer, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde, welche an das Amplifikat binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Strang des Amplifikates und der Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist. In diesem Fall kann der Bereich B Nukleotide enthalten, welche nicht der Bindesequenz E zugehören. Auch hier sind jedoch Überlappungen der Bindesequenzen der Primer und der Sonde möglich.
Homologien zu anderen Genomen (Sequenzen) lassen sich mit Hilfe einer definierten Ausgangssequenz identifizieren. Verwendet wird eine z. B. über das Internet für jeden zugängliche Suchmaschine mit Namen "BLAST" (Basis Local Alignment Search Tool) (Homepage-Addresse: >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/<).
Diese ermöglicht den Zugriff auf diverse andere Sequenz- und Proteindatenbanken, von denen als am wesentlichsten zu benennen sind:
GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR und Swiss-Prot.
Es werden auch BLASTN-Verfahren gemäß Altschul et al. ( 1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 im Rahmen von UWGCG Suchverfahren verwendet.
Die Suchverfahren werden auch auf Sequenzdatenbanken wie z. B. die EMBL-Sequenz- datenbanken, bevorzugt auch virale Sequenzdatenbanken wie z. B. em-vrl angewandt. Das Blast-Programm bietet dem Anwender zahlreiche Anpassungsmöglichkeiten, um eine individuelle Suche ausführen zu können, d. h. solche Sequenzen zu identifizieren, die für einen oder mehrere Analyten spezifisch sind, oder die eben nicht spezifisch sind, d. h. auch in anderen Organismen vorkommen oder nicht. Hierzu wird auch verwiesen auf Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 403-410. Erstaunlicherweise ergibt sich nämlich die Selektivität des Nachweisverfahrens nicht allein aus der Selektivität der einzelnen Primer für ein spezifisches Target, sondern aus der kumulierten Selektivität des Gesamtsystems. So können sogar zwei Primer oder zwei Primer und eine Sonde, einzeln völlig unselektiv sein, d. h. einzeln mit einer
Vielzahl von Targets hybridisieren; dadurch, daß sich die Selektivitäten der einzelnen Primer und Sonde (nur) in der nachzuweisenden Nukleinsäure überlagern, ist eine Gesamtspezifität gegeben. Dadurch, daß man auf die Selektivität der Primer aber bei der Auswahl der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Nukleinsäure nicht so sehr fest- gelegt ist, ist es viel besser möglich, für unterschiedliche Targets kurze Amplicons zu lokalisieren, die in ihrer Länge vollständig oder weitgehend (d. h. über 95 %) übereinstimmen. Dies macht Simultan-Amplifikationen und -Hybridisierungen (wie im Falle von Nukleinsäuresondenarrays) besser realisierbar und reproduzierbar.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens. Dieses enthält die Primer und bevorzugt auch eine Nachweissonde. Es kann jedoch auch weitere Reagenzien, wie Puffer und Enzyme, z. B. eine Polymerase, enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform enthalten die Primer an ihrem 5 '-Ende weitere Sequenzen. Diese Sequenzen sind zwischen 1 und 100, besonders bevorzugt zwischen 5 und 80 Nukleotide lang. Bislang war es nicht üblich, Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 40 nt als Primer zu wählen. In einer Ausführungsform werden diese Sequenzen so gewählt, daß sie gerade nicht mit den an die Primerbindungsstelle auf der nachzuweisenden, aber einer anderen, nicht nachzuweisenden, Nukleinsäure hybridisieren können. Es ist sogar möglich, diese so zu wählen, daß sie komplementär zu den Sequenzen sind, die an die Bindungsstelle desselben Primers auf einer nicht nachzuweisenden Nukleinsäure anschließen. Wenn also der Primer auch an ein humanes Genom binden kann, können die Sequenzen auch human sein. Es ist möglich, einen, aber auch beide der Primer entsprechend zu modifizieren. Die zusätzlichen Sequenzen sind nicht so lang, daß sie eine Hybridisierung der Primer mit den Bindesequenzen auf der nachzuweisenden Nukleinsäure, z.B. dem HCV-Genom verhindern. Die zusätzlichen Sequenzen können auch so gewählt werden, daß sie fester mit kurzen Teilsequenzen der Primer in der Primerbindungsstelle hybridisieren, als diese mit anderen Sequenzen in der Primerbindungsstelle binden. So können Sekundärstrukturen innerhalb der Primer aufgelöst und die Bindefähigkeit der Primer mit der nachzuweisenden Nukleinsäure verbessert werden.
Eine weitere Möglichkeit, Primer und Sonden gezielt unselektiv zu machen, besteht in der Verwendung degenerierter Basen innerhalb der Sequenz. Dabei wird zweckmäßigerweise die Region, in der die Hybridisierung der Targetnukleinsäure mit dem Primer oder der Sonde stattfinden soll, so gewählt, daß relativ wenig Unterschiede zwischen der Targetsequenz und einer anderen, jedoch nicht nachzuweisenden Sequenz (z. B. eines anderen Mikroorganismus) bestehen. Die noch bestehenden Unterschiede können durch den Einsatz degenerierter Basen an den differierenden Basenpositionen weitgehend ausgeglichen werden. So lassen sich Unterschiede von Primern (A bzw. G) durch den Einbau der Base P (6H, 8H-3,4-dihydro-pyrimido[9,5-C][l,2]oxazin-7-on, z. B. Nucleic Acids Research, Vol. 17, 24, 1989, p. 10373-10383) ausgleichen. Dasselbe gilt für Pyrimidine mit der Base K (Nucleorides & Nucleotides, 16 (7-9), 1507-1511 (1997)). Eine noch stärkere Degenierung ist durch den Einsatz von Inosin möglich (US- A-5,585,477; US-A-5,691,134; US-A-5,578,467; J.Biol.Chem. 260, 5, 2605-2608, 1985; Nucl.Acids Res. 1995, 23, 13, 2499-2505), da Inosin Basenpaarung mit allen vier Basen erlaubt.
Eine weitere Möglichkeit, nichtkomplementäre Basen einzusetzen, ist der Ersatz von A durch D (Diaminopurine oder/und der Ersatz von C durch M (Methylcytosin).
In einer weiteren Ausführungsform sind das 5 '-Ende des einen Primers und das 5 '-Ende des anderen Primers miteinander kovalent verknüpft. Hierbei sind zwei unterschiedliche Ausführungsformen denkbar. In einer ersten Ausführungsform sind der forward- und der reverse-Primer für die Amplifikation des gleichen Analyten miteinander verknüpft. Das Ergebnis der Amplifikation sind somit eine Vielzahl von Konstrukten, bei denen zwei unterschiedliche Amplifikatstränge miteinander kovalent verknüpft sind. Als Nebenprodukt, welches jedoch ebenfalls
Grundlage des Nachweises sein kann, werden Produkte gebildet, bei denen nur einer der beiden Primer(teile) verlängert ist.
In einer --weiten Ausführungsform sind die beiden miteinander verknüpften Primer für die Amplifikation unterschiedlicher nachzuweisender Nukleinsäuren (z. B. einer für HBV, der andere für HGV) bestimmt. Zur Amplifikation müssen dann noch die entsprechenden reverse- bzw. forward-Primer zugesetzt werden. Dabei können die 5'- Enden der Primersequenzen direkt oder über einen Linker miteinander verknüpft sein. Als Linker kommt jede Art von Molekül in Frage, da es auf die Einhaltung eines bestimmten, auf den Abstand der Basen auf einer nachzuweisenden Nukleinsäure nicht ankommt. Der Linker ist jedoch bevorzugt nicht so hydrophob, daß die Löslichkeit des Konjugats zu sehr beeinträchtigt wird. Bevorzugt enthält der Linker einen oder mehrere Nukleotidsequenzen, die nicht direkt mit den korrespondierenen oder anderen Sequenzen auf der den nachzuweisenden Nukleinsäure(n) komplementär sind. Besonders bevorzugt ist mindestens eine der Sequenzen eine, welche die Bedingungen für die zusätzlichen Sequenzen der oben beschriebenen (monofunktionellen) Primer erfüllen.
Auch diese (bifunktionellen) Primerkonjugate eignen sich also für multiple (mindestens Duplex) Bestimmungen von Analytnukleinsäuren. Diese Konjugate können prinzipiell auf bekannte Weise hergestellt werden, wenngleich es bevorzugt ist, zunächst die noch geschützten Einzelsequenzen chemisch zu synthetitsieren, dann eines der Enden der einen Einzelsequenz zu aktivieren und eines der Enden der anderen Einzelsequenz zu entschützen. Die Kopplungsreaktion kann durch die Aktivierungsgruppe relativ selbsttätig ablaufen oder durch Aktivierungsreagenzien beschleunigt werden. Besonders bevorzugt wird das Konjugat aber durch durchgehende sequentielle Verlängerung an einer Festphase, ohne zwischenzeitliche Ablösung hiervon, chemisch synthetisiert. Dazu kann zunächst die erste Teilsequenz wie üblich mit 3'- Phosphoramiditen synthetisiert werden. Ab der Verknüpfungsstelle (5'-5'-Link) wird anstelle des 3'-Phosphoramidits ein 5 '-Phosphorami dit eingesetzt. Dies führt zu einer Umkehr der Polarität innerhalb des Konjugats. Die Reaktionssequenz ist beispielhaft in FIG 5, die zugehörigen Reagenzien in FIG 6 gezeigt.
Bevorzugt binden die Primer an die Bindesequenzen A bzw C, wie oben beschrieben, und die Sonde an einen zwischen den Enden der Bindesequenzen A und C gelegenen Bereich B oder das Komplement davon.
Auch wenn mindestens eine Sequenz aus den 3 Bindesequenzen der beiden Primer und der Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure ist, bleibt die Ge- samtspezifität des Nachweisverfahrens erhalten. Ist eine der Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, sondern bindet auch an andere Nukleinsäuren, kann kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, da die zweite Primerbindungssequenz auf dieser Nukleinsäure fehlt. Unspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte auf der anderen Nukleinsäure werden nicht detektiert, wenn die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist auch die zweite Primersequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, kann nur dann ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, wenn beide Primerbindungssequenzen in der gleichen Nukleinsäure- Vermehrungseinheit sind. Dieses Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt wird ebenfalls nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist die Sondensequenz nicht spezifisch für die nach- zuweisende Nukleinsäure, jedoch die beiden Primer spezifisch, werden keine
Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsäure gebildet. Ist zusätzlich zur Sondensequenz auch eine der beiden Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, kann wiederum kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet werden. Unspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsäure, die möglicherweise gebildet werden, enthalten andere Sequenzen im Sondenbindungsbereich und werden daher nicht detektiert. Sind alle drei Bindungssequenzen für die beiden Primer und die Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, wird kein Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt gebildet, wenn mindestens eine der beiden Primersequenzen nicht in einer Nukleinsäure-Vermehrungseinheit der anderen Nukleinsäure liegt. Liegt die Sondensequenz nicht in der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit der beiden Primersequenzen für die andere Nukleinsäure, kann zwar ein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet, aber nicht detektiert werden. Der einzige Fall, daß ein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet und detektiert werden kann, ist, wenn alle drei Sequenzen innerhalb eines Nukleinsäure- Vermehrungsbereichs liegen. Dies kann jedoch durch entsprechende Sequenzauswahl der Nukleinsäure-Vermehrungseinheit vermieden werden, z. B. indem die Primerhybridisierungsstellen nicht gleichzeitig aus demselben Locus desselben nicht nachzuweisenden Organismus gewählt werden.
In einer weiteren Ausführungsform findet die Herstellung der Amplifikate unter Einsatz von Nukleotiden, besonders bevorzugt Mononukleotiden, welche jeweils zu A, G, C und oder T komplementär sind, statt. Bevorzugt enthält der Bereich B bzw. B' der nachzuweisenden Nukleinsäure alle 4 natürlichen Nukleobasen.
In einer weiteren Ausführungsform des neuartigen Verfahrens können Teilkomponenten (Primer oder Sonden) der verschiedenen Primer-Sonden-Kombinationen für die verschiedenen nachzuweisenden Nukleinsäuren identisch sein. Hierdurch wird die Bestimmung mehrerer Nukleinsäuretargets, z. B. für unterschiedliche Viren wie HBV, HIV und HCV mit einer einzigen Amplifikationsreaktion möglich (Multiplex- Amplifikation). Ein technischer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß bei Mehrfachbestimmungen einer Probe ein hoher Grad an Übereinstimmung der Meßwerte erreicht wird.
Im Folgenden sollen die beiden Aspekte der vorliegenden Erfindung anhand eines Nachweises für HCV beschrieben werden. Die Nukleinsäuresequenz von HCV ist beispielsweise in EP-B-0 318 216 beschrieben. Die Sequenzen der beteiligten Komponenten sind in Figur 4 gezeigt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den hochspezifischen und hochsensitiven Nachweis von Virus-Nukleinsäuren wie z. B. HCV-RNA aus der 5 '-nichttranslatierten Region des HCV-Genoms in einer Kopienzahl von 10 Kopien pro Test mit einem dynamischen Bereich von 10 5, bedingt durch ein verbessertes Signal-Rausch- Verhältnis. Dies ist insofern überraschend, da bei dem Test Primer und Sonden einsetzbar sind, die ein für den Fachmann nicht bevorzugtes Primer/Sonden-Design aufweisen, nämlich z. B. Sequenzabschnitte, die zur Primer- Dimer-Bildung neigen, oder Basenfehlpaarungen nahe dem 3 '-Ende. Die kurze Sonde hat einen Schmelzpunkt nahe der Testtemperatur, so daß der Fachmann keine stabile Bindung der Sonde an das Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt erwartet hätte. Bei den bisherigen Tests mit den längeren, fünfteiligen Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten wurde eine Spezifitäts- und Sensitivitätserhöhung bisher nicht über eine Verkürzung, sondern vielmehr eher über eine Verlängerung der Primer-Sonden-Sequenzen und/oder des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts mit den signalgebenden Komponenten versucht.
Der Nachweis von HCV-RNA ist überraschenderweise trotz der kurzen vermehrten Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure auch spezifisch und reproduzierbar in positiven HCV-Plasmaproben möglich, in denen die HCV-RNA nicht sequenzspezifisch vorgereinigt wurde, sondern direkt aus lysierten und über Glasoberflächen aufkonzentrierten Plasmaproben eingesetzt wurde. HCV-negative Plasmaproben ergeben kein Signal. Dies ist insofern überraschend, als das HCV-RNA-Genom sehr labil ist gegenüber Fragmentierung in Plasma-Lysaten. Mit z. B. HlV-Plasmaproben, HBV-Serumproben, Chlamy diaproben aus Urin oder Human-DNA-Proben aus Vollblut, die ebenfalls über Glasoberflächen aufkonzentriert wurden, wird mit den eingesetzten Primern und Sonden ebenfalls kein Signal erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um einen oder mehrere der für den Stand der Technik geschilderten Nachteile zu vermeiden oder um einen oder mehrere der folgenden Vorteile zu realisieren. Die PCR-Zyklen können sehr viel kürzer sein. Die Gesamtzeit der Nachweisverfahren kann dadurch verkürzt werden. Die Sensitivität des Nachweises kann erhöht werden, da weniger Kompetition/Verdrängung zwischen dem kurzen Gegenstrang des Amplikons und der Detektorsonde stattfinden kann. Die Spezifität des Nachweises wird erhöht, da der relative Anteil der internen Detektorregion gegenüber der gesamten Amplikonlänge erhöht wird. Die Differenzier- barkeit von Subtypen kann erhöht werden. Der Nachweishintergrund kann gesenkt werden, da kurze Amplika weniger Potential für unspezifische Hybridisierung mit sich bringen. Aus diesem Grund kann das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann erhöht werden, da kleinere Targetregionen auf RNA-Genomen weniger sensitiv für RNA- Abbau sind. Die Möglichkeiten zur Ausbildung von Sekundär Strukturen werden reduziert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Allgemeines
Alle verwendeten Oligonukleotide sind linear und einzelsträngig.
Beispiel 1
Nachweis von HCV aus menschlichem Blut
a) Probenvorbereitung:
Die RNA-Isolierung aus Plasma erfolgte anhand folgenden Probenvorbereitungsprotokolls:
I . Plasma (420 μl) mit 80 μl Proteinase K (25 mg/ml) mischen und einige Sekunden vortexen 2. Zugabe von 500 μl Lysepuffer (inkl. 1 μg Camer-RNA (polyA)/ml): 5,4 M
Guanidinium-Thiocyanat; 10 roM Harnstoff; 10 mM Tris-HCl; 20 % Triton X 100; pH 4,4
3. vortexen und anschließend 10 min bei RT schütteln
4. Zugabe von 500 μl Isopropanol-MGP (6 mg magnetische Glaspartikel in Isopropanol)
5. vortexen und anschließend 20 min bei RT schütteln
6. Magnetseparation der MGPs
7. Überstand abnehmen und verwerfen
8. Zugabe von 750 μl Waschpuffer: 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 70 % Ethanol
9. MGPs auf Vortex resuspendieren und erneute Magnetseparation
10. Waschvorgang insgesamt 5mal wiederholen
I I. Zugabe von 100 μl DEMC-Wasser zur Elution 12. 15 min bei 80 °C schütteln 13. Magnetseparation
14. 10 μl des Eluats in die RT-PCR einsetzen
b) Klonierung und Präparation des RNA- Standards:
Der Wildtyp Standard "pHCV-wt" wurde zunächst durch Amplifikation eines Ab- Schnitts des HCV-Genoms mit den Primern KY80 (5 '-gcagaaagcgtctagccatggcgt-
3', SEQ.ID.NO.l) und KY78 (5'-ctcgcaagcaccctatcaggcagt-3', SEQ.ID.NO.2) gewonnen und das Amplikon anschließend über eine sog. "blunt-end"-Klonierung in den Vektor pBluescript SK+ kloniert. Nach Vermehrung der bakteriellen Zellen wurde das Plasmid isoliert, durch restriktionsenzymatischen Verdau linearisiert und über eine in-vitro-Transkription das entsprechende RNA-Fragment gewonnen und aufgereinigt.
Die Quantifizierung der RNA erfolgte über photometrische Messung der Absorption bei 260 nm.
Alle hier beschriebenen molekularbiologischen Verfahren können einschlägigen Methodik-Büchern entnommen werden (e.g. Maniatis et al.; Ausubel et al.).
c) RT-PCR assay:
Die Amplifikation erfolgte mit den u.g. Reagentien und nach u.g. Cyclerprotokoll:
Reagentien Endkonzentration im Mastermix
5 x RT-PCR-Puffer l x
MnOAc 2,5 mM
Tth-Polym. lO u dNTP-Mix 200 μM (dATP, dCTP, dGTP) / 600 μM (dUTP)
UNG 2u
Primer forw. HC2F 0.3 μM ( 5'-agtatgtgtgtcgtgcagcc-3', SEQ.ID.NO.3)
Primer rev. HClF-bio 0.3 μM ( 5'bio-tggctctcccgggagtgg-3', SEQ.ID.NO.4)
Die Amplifikation wurde nach folgendem Cyclerprotokoll durchgeführt: 10 min 37 °C Dekontamination durch UNG 30 min 60 °C reverse Transkription 1 min 95 °C Denaturierung
Reagentien Endkonzentration im Mastermix
35 Zyklen:
15 sec 94 °C Denaturierung
20 sec 56 °C Primer- Annealing und Elongation
7 min 72 °C Elongation hold 50 °C
d) Detektion:
Die gesamte Detektionreaktion erfolgte vollautomatisiert an einem Elecsys® 1010- Analyse-Automaten (Boehringer Mannheim GmbH). Kurzbeschreibung:
1. Entnahme von 10 μl Amplifikat und 35 μl Denaturierungslösung (BM-Id-No. 1469053)
2. Inkubation in einem Reaktionsgefäß für 5 min bei 37 °C 3. Zugabe von 130 μl Hybridisierungslösung BM-Id-No. 146 9045 versetzt mit 25 ng/ml Ruthenium-markierter Sonde
4. Inkubation für 30 min bei 37 °C
5. Zugabe von 35 μl einer Elecsys® SA Magnetbeadlsg. (BM-Id-No. 171 9556) 6. Inkubation für 10 min bei 37 °C
7. Messung der Elektrochemilumineszenz von 120 μl des Reaktionsgemisches in der Elecsys® 1010-Meßzelle
Zur Hybridisierung wurden zwei unterschiedliche Ruthenium-gelabelte Sonden verwendet:
PNA-Sonde: Ru-(Ser)2-TCCAGGACCC-Ser-Gly
DNA-Sonde: 5'-Ru-CTCCAGGACCCC-3', SEQ.ID.NO.5
Beispiel 2
Ermittlung der analytischen Sensitivität anhand einer RNA-Standard- Verdünnungsreihe
Amplifiziert wurden in Doppelbestimmungen 101, 102, 103, 104 und 105 Kopien HCV- RNA-Standard. Als Kontrollen dienten ein HCV-negatives Plasma, ein HCV-positives Plasma (nach Probenvorbereitung) und Wasser. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL-Detektion, Elecsys® 1010).
Ergebnis (Einheiten x 100):
• Die Verwendung der Primer HC2F/HC lF-bio führt zu einer sehr guten
Amplifikation in der RT-PCR, gemessen an dem Signalniveau: Hierbei wird der gesamte Detektionsbereich des Elecsys® ausgenutzt (ca. 5 log-Stufen).
• Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdünnungsreihe
• Der Background, gemessen an HCV-negativem Plasma und Wasser, ist relativ gering
» Es ist sowohl die Verwendung von PNA als auch DNA als Sonde möglich Beispiel 3
Überprüfung der HCV-Assay-Spezifität
Hierzu wurden unterschiedliche Ausgangsnukleinsäuren (human-genomische DNA; HIV-RNA, HBV-DNA, Chlamydia-DNA) mit den o.g. Primern und Sonden getestet. Als Positiv-Kontrolle diente HCV-Plasma und als Negativ-Kontrolle HCV-Negativ- Plasma sowie Wasser.
Ergebnis (Einheiten x 100):
• Beide verwendeten Sonden (PNA, DNA) ergeben nur mit ihrem zugehörigen Analyten ein Signal in der ECL-Messung. Das bedeutet: Keine detektierbaren unspezifischen Amplifikationen mit den verwendeten Primern und Sonden. Beispiel 4
Überprüfung der Sonden-Spezifität
Für dieses Experiment wurden unterschiedliche Amplifikate anderer Analyten mit den jeweiligen spezifischen Primern hergestellt und dann gegen die o.g. PNA- und DNA- Sonden hybridisiert. Die Kontrolle der erfolgten Amplifikationen erfolgte mit der jeweiligen zugehörigen Analyt-Sonde.
Ergebnis (Einheiten x 100): (jeweils Mittelwert aus Doppelbestimmung)
• Die Kontrollreaktionen (HIV, HBV, Chlamydia) ergeben den deutlichen Nachweis von Amplifikat mit der entsprechenden Sonde.
• Die verwendeten PNA- sowie DNA-Sonden ergeben nur mit HCV ein spezifisches Signal.
• Es treten keine unspezifischen Hybridisierungen der PNA DNA-Sonden mit anderen Amplifikaten auf. Beispiel 5
Synthese eines 5'-5'-verknüpften Oligonukleotids (3'-(Primer-l)-5'-5'-(Primer-2)-
3'
Die Synthese des 5 '-5 '-verknüpften Oligonukleotids erfolgt an einem DNA Synthesizer Modell 394A der Fa. Applied Biosystems mit dem von Applied Biosystems empfohlenen Standard 1 μmol Synthesecyclus. Es wird eine Synthesesäule, die 1 μmol eines mit dem entsprechenden 5'-O-DMT geschützten Startnukleosid funktionalisierten Trägermaterials (1) (erhältlich von der Fa. Applied Biosystems) enthält sowie 5'-O- DMT-3 '-Phosphoramidite (2) (erhältlich von der Fa. Applied Biosystems) für die Primer- 1 -Sequenz und 3 '-O-DMT-5 '-Phosphoramidite (3) (erhältlich von der Fa. Eurogentec/Glen Research) für die Primer-2-Sequenz verwendet. Der Synthesizer wird mit im ABI Manual empfohlenen Synthesereagenzien (bottle #1-4 = 5'-O-DMT-3'- Phosphoramidite 2 (0,1 M in MeCN), #5-8 = 3 '-O-DMT-5 '-Phosphoramidite 3 (0,1 M in MeCN), #9 Aktivator: Tetrazol (0,5 M in MeCN), #10 konz. Ammoniak p.A., #11 Cap A: Ac2O/Pyridin/THF, #12 Cap B: N-Methylimidazol/THF, #14, TCA in DCM (2%), #15 Oxidationsreagenz: I2/H2O/Pyridin/THF, #18 MeCN, #19 DCM) (alle erhältlich von der Fa. Applied Biosystems) bestückt. Der Verlauf der Synthese wird über regelmäßige Tritylwert-Bestimmungen am Synthesizer (Autoanalysis) detektiert. Nach abgeschlossenem Synthesecyclus schließt sich die automatische Trägerabspaltung mit konz. Ammoniak an. Die Abspaltlösung wird in ein spezielles Abspaltgefäß am Synthesizer geleitet. Diese wird dann noch 5 h im Wasserbad bei 56°C erwärmt, um alle Schutzgruppen abzuspalten. Nach Abkühlen wird die Lösung am Rotationsverdampfer einrotiert. Reinigung des Oligonukleotids erfolgt durch präparative Anionenaustausch- HPLC an einer Protein-Pak DEAE 8 HR 10 x 100 mm Säule (Waters) mit 25 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 0-0.6 M NaCl, pH 8,5 als Elutionspuffer. Die Analytik erfolgt über eine Gen-Pak FAX 1,6 x 100 mm Anionenaustauscher-HPLC-Säule der Fa. Waters. Die Produktfraktionen werden durch Dialyse (MWCO 1000 der Fa. Spectrapore) entsalzt. Die entsalzte Oligonukleotid-Lösung wird einrotiert, in sterilem Wasser gelöst, durch einen sterilen 0,2 μm Filter filtriert und die Konzentration durch UV-Spektroskopie bei 260 nm bestimmt. Ausbeute: 75 OD
Beispiel 6: Alternative Primer und Sonden Kombinationen
Alternativ können Primer und Sonden aus folgenden Primer- und Sonden-Regionen verwendet werden:
Forward Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 390 und 417, reverse Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 421 und 448, Sonde: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 391 und 440, alle bezogen auf die HGBV-B Sequenz aus der Sequenz HG22304 erhältlich aus der EMBL- Datenbank em-vrl, oder aus Proc. Natl. Acad. Sei USA 1995, 92, 3401-3405 und/oder aus J. Virol. 69: 5621-5630. Die in Figur 7 gezeigte Sequenz entspricht den Positionen 390 bis 448 dieser Sequenz, so daß die Primer- und Sondenpositionen direkt umrechenbar sind.
Bevorzugte Primer-/Sonden-Kombinationen ergeben sich folgendermaßen: forward-Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 390-406, 390-408, 391-406, 391- 408, 392-406, und 392-408, reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 427-448, 427-447, 427-446, 428-
448, 428-447, 428-446, 429-448 und 429-447, Sonde ausgewählt aus einer der Sequenzen: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398- 415, 397-415, 396-415, 395-415, 394-415, 393-415, 392-415, 391-415, 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, 408-428, 409-
436, 409-435, 409-434, 409-433, 409-432, 409-431, 409-430, 409-429, 409-428, 410-436, 410-435, 410-434, 410-433, 410-432, 410-431, 410-430, 410-429, und 410-428, oder, bevorzugt:
forward-Primer: Sequenz von 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, und 392- 408, reverse Primer: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423-
445, 423-444, Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398-
415, 397-415, 396-415, 395-415, 394-415, 393-415, 392-415, 391-415, 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410-432, , 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-
430, 409-429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-
428 oder, besonders bevorzugt:
forward Primer: Sequenz von 390-406, 391-406, und 392-406, reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423- 445, 423-444,
Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 402-412, 401-413, 400-414, 399-415, 398- 415, 398-415, 397-415, 396-415, 395-415, 394-415, 393-415, 392-415, 391-415, 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410-432, , 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-428.
Alle diese Sequenzen sind dem HGBV-B Genom entnommen und hybridisieren daher nicht selektiv mit HCV.
Beispiel 7:
Nachweis von HIV
Als Ausgangsmaterial diente ein HIV-positives Plasma mit einer Ausgangskonzentra- tion von 15000 Genomäquivalente (geq) HIV pro ml. Dieses Plasma wurde sukzessive um den Faktor 10 in negativem Plasma verdünnt und nach Probenvorbereitung jeweils in Doppelbestimmungen mit den entsprechenden Primerpaaren amplifiziert. Als Kontrollen dienten ein HIV-negatives Plasma und Wasser. Zur Bestimmung der Spezifität wurde zusätzlich ein HBV- und ein HCV-positives Plasma mitprozessiert. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL-Detektion, Elecsys® 1010). Verwendete Primer und Probes:
Anm.: SK und RAR sind jeweils publizierte Röche Primer/Probes, GH-AI bis GH-A6 neue MCR Primer aus der pol-Region des HIV-Genoms ->3 -
Amplifikationsmix und Thermocvcler-Protokoll Mastermix:
Reagentien Endkonz. in mastermix
5x bicine-buffer lx
MnOAc 2,5 mM dNTPs (incl. dUTP) 200μM/600μM forward primer 0,3 μM reverse primer 0,3 μM
(biotinylated)
Tth-polymerase 10 units
UNG 2 units
Gesamtvolumen: 100 μl
PCR-Cycling:
10 mιn 37°C UNG Dekontaminierung
30 min 60°C Reverse Transcription
30 sec 95°C Denaturierung
5 Zyklen 15 sec 95°C Denaturierung
20 sec 50°C Annealing/Elongation
0 Zyklen 15 sec 94°C Denaturierung
20 sec 60°C Ajinealin-i/Εlongation
7 min 72°C Elongation
50°C
Ergebnis (ECL-counts x 100):
Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdünnungsreihe Beispiel 8: Nachweis von HBV
Amplifiziert wurden in Doppelbestimmungen 10°. 10', 10\ 103, 104 und 10'
Genomaquivalente (geq) HBV. Als Kontrollen dienten em HBV-negatives Plasma und
Wasser. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL-Detektion, Elecsys®
1010).
Probenvorbereitung von HBV-posiuvem Plasma erfolgte analog der für HCV beschriebenen Probenvorbereitung.
Verwendete Primer und Probes:
Anm: Ref. sind Referenz-Primer. Nummer 1 -5 die neuen MCR-HBV-Pπmer. Amplifikationsmix und Thermocvcler-Protokoll
Mastermix:
Reagentien Endkonz. in mastermix lOx PCR buffer lx
MgCl2 3 mM dNTPs (incl. dUTP) 200μM/600μM forward primer 0,3 μM reverse primer 0,3 μM
(biotinylated)
Taq-polymerase 2,5 units
UNG 2 units
Gesamtvolumen: 100 μl
PCR-Cycling:
10 min 37°C UNG Dekontaminierung 10 sec 95°C Denaturierung
5 Zyklen 10 sec 55°C Annealing 10 sec 72°C Elongation 10 sec 90°C Denaturierung
30 Zyklen 10 sec 60°C Annealing 10 sec 72°C Elongation 50°C
Die Detektion erfolgte ebenfalls analog zu der für HCV beschriebenen Detektion.
Ergebnis (ECL-counts x 100):
• Die Signale der MCR-Primer zeigen eine deutlich verbesserte Dynamik im Vergleich zur Referenz
• Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdürmungsreihe
• Der Background, gemessen an HBV-negativem Plasma und Wasser ist relativ gering
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN: (i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH (B) STRASSE: Sandhoferstr. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweis verfahren (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG: (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGT 24 (2) ANGABENZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CTCGCAAGCA CCCTATCAGG CAGT 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nukleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc - "Oligodeoxyribonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
AGTTATGTGT GTCGTGCAGC C 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nukleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TGGCTCTCCC GGGAGTGG 18 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CTCCAGGACC CC 12

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz (A) eines Stranges der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C, die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C im wesentlichen komplementär ist, binden kann,
- Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene Sequenz B oder das Komplement davon binden kann, und
- Nachweis der Bildung eines Hybrides aus einem Amplifikat und der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, daß die zwischen den Bindesequenzen A und C gelegene Sequenz keine Nukleotide enthält, die nicht dem aus der Bindesequenz D der Sonde und der hiervon gebundenen Sequenz des Amplifikats gebildeten Sequenzb ereich E zugehören.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindesequenz D der Sonde mit einer oder beiden Bindesequenzen der Primer überlappt.
3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer an seinem nicht verlängerbaren Teil Nukleotide aufweist, die nicht direkt mit der nachzuweisenden Nukleinsäure oder ihrem
Komplement hybridisieren.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß mindestens eine der Bindesequenzen nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtlänge der Bindesequenzen von dem von der Bindesequenz der Sonde wegweisenden Teil der Bindesequenz des einen Primers bis zu dem ebenfalls von der Bindesequenz der Probe wegweisenden Teil des anderen Primers kleiner ist als 100 Nukleotide.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer immobilisierbar und die Sonde nachweisbar markiert ist.
7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nachweisbar und die Sonde immobilisierbar markiert oder immobilisiert ist.
8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde sowohl durch einen Fluoreszenzquencher als auch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Primer durch eine erste Energietransferkomponente und die Sonde durch eine zweite, davon verschiedene Energietransferkomponente markiert ist.
10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikat durch physikalische und/oder spektroskopische Methoden detektiert wird.
11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch sind.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nicht spezifisch ist für die nachzuweisende Nukleinsäure.
14. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikation jeweils zu A, G, C und T komplementäre Nukleotide eingesetzt werden.
15. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser
Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz A der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C, die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3 '-Richtung von A gelegenen Sequenz C komplementär ist, binden kann, und Nachweis der Amplifikate mittels Massenspektroskopie.
16. Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe mindestens zweier Primer,
- Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde, welche an das Amplifikat binden kann, und
- Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Amplifikat und der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch sind.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nicht spezifisch ist für die nachzuweisende Nukleinsäure.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikation jeweils zu A, G, C und T komplementäre Nukleotide eingesetzt werden.
20. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Amplifikaten von Teilen von Nukleinsäuren, bei dem Primer eingesetzt werden, die eine Amplifikation dieser Teile mit den unterschiedlichen Sequenzen erlauben, dadurch gekennzeichnet, daß die Primer so ausgewählt werden, daß die gebildeten Amplifikate in ihrer Länge um nicht mehr als 20 % unterscheiden und nicht länger als 100 Nukleotide sind.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig Amplifikate von Nukleinsäuren von HIV, HBV und HCV hergestellt werden.
22. Verfahren zum Nachweis von HCV, dadurch gekennzeichnet, daß Primer und Sonden verwendet werden, deren Sequenzen aus Sequenzen von fortlaufenden Basen der HGBV-Sequenzen aus Fig. 7 hierzu komplementären Sequenzen oder
Sequenzen mit mehr als 80% Identität zu diesen Sequenzen entnommen sind.
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