EA022820B1 - Пептидный аналог оксинтомодулина - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, подходящий для лечения диабета и/или ожирения.

Description

Изобретение относится к пептидным аналогам оксинтомодулина и к их пегилированным производным для применения в лечении диабета и/или ожирения.

Оксинтомодулин (ОХМ) представляет собой пептидный гормон, состоящий из 37 аминокислот, который высвобождается наряду с глюкагоноподобным пептидом-1 (ОЬР-1) из Ь-клеток тонкого кишечника пропорционально потреблению питательных веществ. Он состоит из целой последовательности глюкагона (Осд), состоящей из 29 аминокислотных остатков, и содержит на С-конце октапептид, образовавшийся в результате тканеспецифичного альтернативного процессинга препроглюкагона. Эндогенный ОХМ быстро разрушается ΐη νίνο под действием дипептидилпептидазы IV и других пептидаз.

Отдельные рецепторы для ОХМ на сегодняшний день обнаружены не были. ОХМ связывает и полностью активирует ΐη νΐίΓο как рецептор ОЬР-1 (ОЬР-1К), так и рецептор глюкагона (Ос§К) с аналогичными эффективностями для обоих рецепторов.

ОХМ участвует в регуляции потребления пищи и в регуляции массы тела. Разовое введение ОХМ людям с нормальной массой тела позволяло снизить чувство голода и уменьшить размер порции на 19%. В 4-недельном исследовании субъектов с избыточной массой тела и ожирением трехкратное ежедневное подкожное введение ОХМ перед приемом пищи вызывало потерю массы тела у данных субъектов на 2,3 кг по сравнению с 0,5 кг в группе плацебо. В данном исследовании тошнота, наиболее частое побочное действие, связанное с терапией, основанной на ОЬР-1 (такой как эксенатид и лираглутид), встречалась значительно реже. ОХМ повышал потребление энергии, вызывая повышенную физическую активность у людей с избыточной массой тела и ожирением, хотя механизм данного эффекта не совсем ясен.

Существует несколько проблем для разработки на основе ОХМ коммерчески рентабельного терапевтического агента. Выше упоминалось, что ОХМ быстро разрушается ΐη νίνο, а также подвергается быстрому почечному клиренсу вследствие его малого размера. Следовательно, желательно идентифицировать пептидные аналоги ОХМ, обладающие улучшенной метаболической стабильностью и для которых характерна сниженная скорость клиренса. Более того, агонистическая активность в отношении Ос§К, характерная для ОХМ, приводит к риску негативного влияния на гликемический контроль. Таким образом, также необходимо оптимизировать эффективность пептидного аналога ОХМ, разработанного для применения в терапии, с сохранением подходящего равновесия между активностями в отношении рецепторов ОЬР-1К и Ос§К. Активация ОЬР-1К отвечает за инсулинотропное действие, тогда как активация обоих рецепторов ОЬР-1К и Ос§К может играть роль в потере массы тела. Следовательно, необходимо получить пептидный аналог ОХМ, который обладает сильной инсулинотропной активностью и вызывает такую потерю массы тела, что его можно применять для лечения инсулиннезависимого диабета и/или ожирения.

Пептиды ОХМ с заменами аминокислот для улучшения стабильности и с дополнительными модификациями для замедления клиренса, такими как пегилирование или липидизация, описаны в АО 2008101017, АО 2006134340, АО 2007100535 и Роса1 и др. Э1аЬе1е§ 58:2258-2266, 2009. Несмотря на то что данные полученные из ОХМ пептиды могут быть потенциально лучше, чем пептид дикого типа, дозы, необходимые для достижения значительного снижения массы тела в модели алиментарного ожирения (ЭЮ) у мышей, обычно выше, чем те, которые считаются целесообразными для коммерциализации лекарственных средств. Например, Роса1 и др. (2009) сообщали о средней потере массы тела на 11 г (~25%) через 13 дней введения дозы 1900 нмоль/кг (~8 мг/кг) через день (РОЭ).

Несмотря на доступность различных пептидов ОХМ и их аналогов сохраняется потребность в более эффективных, стабильных, длительно действующих и хорошо переносимых пептидных аналогах ОХМ, обладающих соотношением активностей в отношении Ос§К/ОЬР-1К, которое оптимизировали таким образом, что эффективность и инсулинотропная активность данного пептида обеспечивает эффективное лечение диабета, предпочтительно диабета 2 типа, и связанных с ним расстройств. Также необходимо предложить пептидные аналоги ОХМ, которые обеспечивают эффективные способы лечения для снижения массы тела. Соответственно в настоящем изобретении добиваются обеспечения эффективного лечения диабета и/или ожирения.

Настоящее изобретение включает пептидный аналог ОХМ с заменами аминокислот, введенными для оптимизирования метаболической стабильности и модулирования относительных активностей в отношении Ос§К/ОЬР-1К, с одновременной оптимизацией общей эффективности. Кроме того, пептидный аналог ОХМ согласно настоящему изобретению пегилирован по выбранным положениям для увеличения действия во времени, что позволяет вводить дозы менее часто.

Согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот

5 10

ΗΪ5- (АНэ) -С1п-С1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-5ег-Азр-Туг-Зег-Ъуз-Туг15 20 25

Ьеи-Азр-Зег-Ъуз-Ьуз-А1а-С1п-С1и-РЬе-Уа1-С1п-Тгр-Ъеи-Ьеи-Азп30 35 (АхЬ) -С1у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а-Хааз8-Хаазэ (5Εζ> ГО ΝΟ: 5)

- 1 022820 в которой Хаа₃₈ представляет собой Суз, Суз-ПЭГ или отсутствует, Хаа₃₉ представляет собой Суз, Суз-ПЭГ или отсутствует и в которой С-концевая аминокислота необязательно амидирована.

Согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот

5 10

ΗΪ5- (ΑίΡ) -С1п-С1у-ТРг-РРе-ТЪг-8ег-А5р-Туг-5ег-Ьуз-Туг15 20 25

Ьеи-Азр-5ег-Ъу8-1,у5-А1а-С1п-С1и-РЬе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ьеи-А5П30 35 (ΑίΡ)-С1у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а (8Εζ) ГО ΝΟ: 1).

Более того, согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот

5 10

Ηίδ-(ΑίΡ)-С1п-С1у-ТРг-РРе-ТРг-8ег-Азр-Туг-5ег-Ьуз-Туг15 20 25

Ьеи-Азр-5ег-Ъуз-Ьуз-А1а-С1п-С1и-РРе-'7а1-С1п-Тгр-Ъеи-Ьеи-Азп30 35 (ΑίΡ) -С1у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а-Суз-Суз (5Е() ГО ΝΟ: 2) /

в которой остаток Суз в положении 38 необязательно пегилирован, и в которой остаток Суз в положении 39 необязательно пегилирован, и карбоксильная группа остатка Суз в положении 39 необязательно амидирована.

Предпочтительно пептидный аналог оксинтомодулина с последовательностью 8ЕС) ГО ΝΟ: 2 пегилирован либо по остатку Суз в положении 38, либо по остатку Суз в положении 39, или по обоим остаткам, при этом молекула полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 40 кДа ковалентно связана с тиольной группой остатка Суз в данных положениях. Более предпочтительно пептидный аналог оксинтомодулина пегилирован по каждому из остатков Суз в положении 38 и положении 39, при этом молекула ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа ковалентно связана с каждой тиольной группой каждого остатка Суз в данных положениях. Возможно, остаток Суз в положении 39 может отсутствовать в последовательности 8ЕС) ГО ΝΟ: 2, оставляя лишь один сайт пегилирования в положении 38.

Более предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот

5 10

Ηίδ-(ΑίΡ)-С1п-С1у-ТРг-РРе-ТЬг-5ег-Азр-Туг-5ег-Ьуз-Туг15 20 25

Ьеи-Азр-5ег-Ъуз-Ъуз-А1а-С1п-С1и-РРе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ьеи-Азп30 35 (ΑίΡ)-С1у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а-Суз(20кВа РЕС)-Суз (20 кДа ПЭГ ) (8Е0 ГО ΝΟ: 3) в которой карбоксильная группа пегилированного Суз в положении 39 необязательно амидирована.

Наиболее предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот 8ЕС) ГО ΝΟ: 3, в которой карбоксильная группа пегилированного Суз в положении 39 амидирована.

Молекула ПЭГ, применяемая в настоящем изобретении, может быть линейной или разветвленной и предпочтительно представляет собой линейную молекулу ПЭГ.

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Дополнительно согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом и необязательно другими терапевтическими ингредиентами.

Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инсулиннезависимого диабета (2 типа) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инсулинозависимого диабета (1 типа) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина.

Настоящее изобретение включает способ лечения ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пеп- 2 022820 тидного аналога оксинтомодулина.

Более того, настоящее изобретение включает способ лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина.

Согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения в качестве лекарственного средства.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулиннезависимого диабета.

Более того, согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулинозависимого диабета.

Более того, согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения ожирения.

Изобретение включает описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения.

Согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулиннезависимого диабета.

Кроме того, настоящее изобретение включает применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулинозависимого диабета.

Более того, согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения ожирения.

Более того, согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению эффективно связывают и активируют как рецептор СЕР-1 (СБР-1К), так и рецептор глюкагона (СедК).

Также было обнаружено, что пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению более устойчивы к расщеплению пептидазами, в частности дипептидилпептидазой IV, чем нативный ОХМ человека. В результате, пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью ΐη νίνο по сравнению с нативным ОХМ человека.

Различные варианты реализации настоящего изобретения способны вызывать снижение потребления пищи у субъектов с избыточной массой тела и ожирением.

Особое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что частота побочных эффектов, таких как тошнота, которая обычно связана с терапией, основанной на СЕР-1, такой как терапия эксенатидом и лираглутидом, снижена или исключена. Настоящее изобретение, следовательно, обладает меньшими побочными эффектами по сравнению с терапией, основанной на СЕР-1.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обеспечивают лучший эффект потери массы тела по сравнению с диким типом ОХМ человека.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения пептидные аналоги оксинтомодулина обеспечивают улучшенную толерантность к глюкозе и липидный профиль у субъектов с диабетом 2 типа и/или связанными с ним метаболическими нарушениями и обеспечивают это эффективнее, чем дикий тип ОХМ человека.

Оксинтомодулин (ОХМ) представляет собой слабый коагонист с полной эффективностью и сбалансированной активностью в отношении рецепторов человека ИСЕР-1Р и ЬСедК со значениями ЕС₅₀, составляющими 6,7±2,7 и 4,1±1,7 нМ соответственно, в клетках НЕК293, стабильно сверхэкспрессирующих соответствующие рецепторы. Последовательность нативного ОХМ человека приведена ниже

Н15-Зег-С1п-С1у-Т11г-Р11е-ТЬг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ЪеиА5р-5ег-Агд-Агд-А1а-С1п-А5р-РНе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-МеГ-Азп-ТЬгЪуз-Агд-А5п-Агд-А5П-А5п-11е-А1а (5Εζ) Ю N0: 4)

Пептидный аналог ОХМ с последовательностью ЗЕС) ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, представляет собой полностью эффективный и активный пептидный аналог оксинтомодулина со значениями ЕС₅₀, составляющими 59,9±4,14 и 2,75±0,55 нМ, в отношении ЬСедК и ИСЕР-1К соответственно. Следовательно, пептидный аналог ОХМ с последовательностью ЗЕО ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, обладает балансом функциональных активностей ΐη νΐίΓο, которые в ~22 раза более селективны в отношении ИСЕР-1К по сравнению с ЬСедК. Сравнимые результаты получили для аффинности связывания, Κι, где пептидный аналог ОХМ с последовательностью ЗЕО ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, оказался в 28 раз более селективным в отношении ИСЕР-1К, по сравнению с ЬСедК, при этом значения Κι составляли 73±23 и 2050±70 нМ соответственно.

Ковалентное присоединение одной или более молекул ПЭГ к определенным остаткам пептидного аналога ОХМ позволяет получить пегилированный пептидный аналог ОХМ с увеличенным временем полужизни и уменьшенной скоростью клиренса по сравнению с таковыми для непегилированного пеп- 3 022820

Более предпочтительно п имеет значения от 425 до 475.

тидного аналога ОХМ и активностью ίη νίίτο в отношении СГР-1И, аналогичной таковой для нативного ОХМ человека. Принимая во внимание малый размер пептидного аналога ОХМ и относительно большой размер молекулы (молекул) ПЭГ, будут ожидать, что пептидный аналог ОХМ, как только он окажется пегилированным, потеряет свою активность в результате стерического препятствия. Тем не менее было обнаружено, что, если поместить молекулу(ы) ПЭГ в конце пептидного аналога оксинтомодулина, а не в середине, активность пептидного аналога в большей степени сохранится. Несколько замен в последовательности повышают эффективность, тем самым компенсируя потерю эффективности вследствие пегилирования, сохраняя при этом подходящее соотношение активностей в отношении ОЬР-1К и Ос§К. Более того, было обнаружено, что присутствие двух молекул ПЭГ на С-конце пептидного аналога оксинтомодулина предпочтительнее, чем присутствие одной молекулы ПЭГ.

Последовательности согласно настоящему изобретению включают стандартные однобуквенные или трехбуквенные коды двадцати встречающихся в природе аминокислот. Другие используемые обозначения описаны далее

АПэ - альфа-аминоизомасляная кислота;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

кДа ПЭГ - молекула ПЭГ со средней молекулярной массой 20000 Да.

Термин ПЭГ в данной заявке означает молекулу полиэтиленгликоля. В обычной форме ПЭГ представляет собой линейный полимер с гидроксильными группами на концах и отвечает формуле НОСН₂СН₂-(СН₂СН₂О)п-СН₂СН₂-ОН, где η равен от приблизительно 8 до приблизительно 4000. Обычно η представляет собой не конкретное значение, а диапазон с приблизительно нормальным распределением около среднего значения. Атом водорода на конце может быть замещен на кэпирующую группу, такую как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно ПЭГ содержит по меньшей мере одну гидроксильную группу, более предпочтительно она представляет собой концевую гидроксильную группу. Данная гидроксильная группа предпочтительно присоединена к линкерному фрагменту, который может реагировать с пептидом с образованием ковалентной связи. В данной области известны многочисленные производные ПЭГ (см., например, патенты США с номерами: 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 6437025; 6448369; 6495659; 6515100 и 6514491 и гаИрзку 8. Вюсопщ§а1е Сйеш. 6:150-165, 1995). Средняя молекулярная масса молекулы ПЭГ, ковалентно присоединенной к пептиду ОХМ согласно настоящему изобретению, может составлять приблизительно 10000, 20000, 30000 или 40000 Да. Предпочтительно молекулярная масса указанной молекулы ПЭГ составляет от 18000 до 22000 Да. Более предпочтительно она составляет от 19000 до 21000 Да. Наиболее предпочтительно она составляет от 20000 до 21000 Да. Еще более предпочтительно она составляет приблизительно 20000 Да. Пегилирующие реагенты могут представлять собой линейные или разветвленные молекулы и могут присутствовать отдельно или последовательно. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат расположенные последовательно молекулы ПЭГ, присоединенные к Сконцу пептида.

Указанные молекулы ПЭГ предпочтительно присоединены к двум остаткам цистеина на С-конце пептида посредством метоксиПЭГ-20кДа-малеимида (фиг. 1) или метоксиПЭГ-20 кДа-йодацетамида (фиг. 2) . На фиг. 1 и 2, η имеет значения от 10 до 2500. Предпочтительно η имеет значения от 350 до 600.

О

Фигура 1 Фигура 2

В частности, указанные молекулы ПЭГ предпочтительно представляют собой метоксиПЭГ-20 кДамалеимид (СН₃О(СН₂СН₂О)_п-(СН₂)₃КНСО(СН₂)₂-малеимид) (ΝΟΡ 8ипЬг1§Ы МЕ-200МА) и присоединены к двум остаткам цистеина на С-конце пептида. Наиболее предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот 8Ер ГО NΟ: 3, в которой молекулы ПЭГ представляют собой метоксиПЭГ-20 кДа-малеимид(СН₃О(СН₂СН₂О)_п-(СН₂)^НСО(СН₂)₂-малеимид) (ХОР 8ипЬг1§й1 МЕ-200МА) и в которой карбоксильная группа пегилированного Суз в положении 39 амидирована (фиг. 3) . На фиг. 3 представлен стандартный однобуквенный код аминокислот, за исключением обведенных прямоугольниками областей, структуры аминокислотных остатков которых были модифицированы.

- 4 022820

Термин пегилирование в данной заявке означает ковалентное присоединение одной или более молекул ПЭГ, как описано выше, к такой молекуле, как пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению.

Инсулинотропная активность относится к способности стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенные уровни глюкозы, тем самым вызывая поглощение глюкозы клетками и снижение уровней глюкозы в плазме. Инсулинотропную активность можно оценить с помощью способов, известных в данной области, включая эксперименты ίη νίίτο, в которых измеряют секрецию инсулина линиями клеток инсулиномы или островками, или эксперименты ίη νίνο, такие как внутривенный глюкозотолерантный тест (1УОТТ), интраперитонеальный глюкозотолерантный тест (ΙΡΟΤΤ) и пероральный глюкозотолерантный тест (ΘΟΤΤ). Инсулинотропную активность у людей обычно измеряют путем измерения уровней инсулина или уровней С-пептида. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обладают сильной инсулинотропной активностью.

Эффективность ίη νίίτο в данной заявке представляет собой меру способности пептидного аналога ОХМ активировать ОЬР-1К или ОсдК в тесте на клетках. Эффективность ίη νίίτο выражают в виде ЕС₅₀, которая представляет собой эффективную концентрацию соединения, которая приводит к половине от максимального повышения измеряемого ответа (в данном случае продукции циклического АМФ) в эксперименте по дозозависимому эффекту.

Термин время полужизни в плазме относится к времени, необходимому для выведения половины соответствующих молекул из плазмы. Альтернативно используется термин время полувыведения. Термин увеличенный или более длительный, используемый в контексте времени полужизни или времени полувыведения из плазмы, указывает на существенное увеличение времени полужизни пегилированного пептидного аналога ОХМ по сравнению с исходной молекулой (например, непегилированной формой пептида или нативным пептидом), определенного при аналогичных условиях. Ожидаемое время полужизни нативного ОХМ у обезьян, например, составляет менее чем 1 ч. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению характеризуются временем полувыведения у обезьяны, составляющим по меньшей мере 24 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 ч. Время полужизни, описанное в данной заявке, представляет собой время полувыведения, которое соответствует конечной линейно-логарифмической скорости выведения. Для специалиста в данной области очевидно, что время полужизни представляет собой выведенный параметр, который изменяется как функция клиренса и объема распределения.

Термин агонист ОЬР-1К длительного действия в данной заявке относится к пептидному аналогу ОЬР-1, ковалентно присоединенному к одной или более молекулам полиэтиленгликоля (ПЭГ). Пегилированные соединения ОЬР-1 описаны в патенте США 7557183.

Клиренс представляет собой меру способности организма выводить лекарственное средство из кровотока. При снижении клиренса вследствие, например, модификаций лекарственного средства, ожидаемое время полужизни увеличится. Тем не менее такая обратная взаимообусловленность соблюдается только когда нет изменений в объеме распределения. Пригодное приближенное соотношение между конечным линейно-логарифмическим временем полужизни (1_1/2), клиренсом (С) и объемом распределения (V) определяется уравнением: ί_1/2=0,693 (ν/С). Клиренс указывает не на выведенное количество лекарственного средства, а на объем биологической жидкости, такой как кровь или плазма, который должен будет полностью освободиться от лекарственного средства, чтобы считать его выведенным. Клиренс выражают в виде объема на единицу времени. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению предпочтительно обладают значением клиренса у обезьян, равным 200 мл/ч/кг или менее, более предпочтительно 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или менее и наиболее предпочтительно 50, 40 или 20 мл/ч/кг или менее.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению как правило вводят парентерально. Парентеральное введение включает, например, системное введение, например, путем внутримышечной, внутривенной, подкожной, внутрикожной или интраперитонеальной инъекции. Пептидный аналог ОХМ вводят субъекту совместно с приемлемым фармацевтическим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом в составе фармацевтической композиции для лечения инсулиннезависимого (2 типа) сахарного диабета (ΝΙΌΌΜ) или обсуждаемых ниже расстройств. Указанная фармацевтическая композиция может представлять собой раствор или суспензию, например такую, в которой пептидный аналог ОХМ образует комплекс с катионом двухвалентного металла, такого как цинк. Пептидный аналог также можно включить в состав твердой лекарственной формы, например, путем лиофилизации или распылительной сушки, которую перед введением снова растворяют в подходящем растворе разбавителя. Подходящие фармацевтические носители могут включать инертные ингредиенты, которые не взаимодействуют с пептидом или производным пептида. Подходящие фармацевтические носители для парентерального введения включают, например, стерильную воду, физиологический солевой раствор, бактериостатический солевой раствор (солевой раствор, содержащий приблизительно 0,9% бензилового спирта), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Хэнкса, раствор лактат Рингера и тому подобные носители. Некоторые примеры подходящих вспомогательных веществ включают лактозу, декстрозу, сахарозу, трегалозу, сорбит и маннит и консерванты, такие как фенол и м-крезол.

- 5 022820

Можно применять стандартные методики приготовления фармацевтических лекарственных форм, такие как описанные в Кетшдрои'к Рйагтасеибса1 8с1спсс5 (Маек РиЬйкШид Сотрапу, Истон, Пенсильвания). В качестве альтернативы, пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут входить в состав лекарственной формы для введения буккальным, пероральным, трансдермальным, назальным или легочным путем. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут входить в состав формы с пролонгированным высвобождением, такой что уровни в плазме крови поддерживаются в эффективном диапазоне в течение более длительных периодов времни после введения.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению можно применять для лечения диабета, особенно, диабета 2 типа (инсулиннезависимого сахарного диабета, ΝΙΌΌΜ). Дополнительные субъекты, которым может помочь лечение пептидными аналогами ОХМ согласно настоящему изобретению, включают субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, субъектов, масса тела которых приблизительно на 25% или более выше нормальной массы тела для роста и телосложения данного субъекта, субъектов, у которых один или более родителей страдает от ΝΙΌΌΜ, субъектов, которые страдают от гестационного диабета, и субъектов с метаболическими расстройствами, такими как расстройства, возникшие в результате снижения секреции эндогенного инсулина. Пептидный аналог ОХМ можно применять для предотвращения развития у субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе диабета 2 типа, предотвращения истощения бета-клеток поджелудочной железы, индукции пролиферации бета-клеток, улучшения функционирования бета-клеток, активации покоящихся бета-клеток, индукции дифференцировки клеток в бета-клетки, стимуляции деления бетаклеток и ингибирования апоптоза бета-клеток. Другие заболевания и состояния, которые можно лечить или предотвращать с помощью соединений согласно настоящему изобретению в способах согласно настоящему изобретению, включают: сахарный диабет взрослого типа у молодых (ΜΘΌΥ) (Негтаи и др., Э1аЬе1е5 43:40, 1994); латентный аутоиммунный сахарный диабет взрослых (ΤΆΌΆ) (ΖίιηιικΙ и др., Э1аЬе1е5 Меб. 11:299, 1994); нарушенную толерантность к глюкозе (ЮТ) (Ехрей СоттШее ои С1а88Йтсабои оГ Э1аЬе1е5 МеШ1и8, Э1аЬе1е5 Саге 22 (Прил. 1):85, 1999); нарушенный уровень глюкозы натощак (ΙΡΟ) (СЬат1е8 и др., Э1аЬе1е5 40:796, 1991); гестационный диабет (МеШдет, Э1аЬе1е5. 40:197, 1991); метаболический синдром X, дислипидемию, гипергликемию, гиперинсулинемию, гипертриглицеридемию и устойчивость к инсулину.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению также можно применять в способах согласно настоящему изобретению для лечения вторичных причин диабета (Ехрей СотшШее ои С1а88Йтсабои оГ Э1аЬе1е5 МеШ1и8, Э1аЬе1е5 Саге 22 (Прил. 1):85, 1999). Такие вторичные причины включают избыток глюкокортикоидов, избыток гормона роста, феохромоцитому и лекарственный диабет. Лекарственные средства, которые могут вызвать диабет, включают, но не ограничены перечисленными, пириминил, никотиновую кислоту, глюкокортикоиды, фенитоин, тиреоидный гормон, β-адренергические агенты, α-интерферон и лекарственные средства, используемые для лечения ВИЧ-инфекции.

Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут эффективно уменьшать потребление пищи и лечить ожирение.

Эффективное количество пептидного аналога ОХМ представляет собой такое количество, которое приводит к желательному терапевтическому и/или профилактическому эффекту, не вызывая неприемлемых побочных эффектов при введении субъекту. Желательный терапевтический эффект включает один или более из следующих эффектов: 1) снижение выраженности симптома(ов), связанного(ых) с заболеванием или состоянием; 2) задержку возникновения симптомов, связанных с указанным заболеванием или состоянием; 3) увеличение продолжительности жизни по сравнению с отсутствием лечения и 4) лучшее качество жизни по сравнению с отсутствием лечения. Например, эффективное количество пептидного аналога ОХМ для лечения №ОЭМ представляет собой такое количество, которое приведет к лучшему контролю за концентрацией глюкозы в крови, чем при отсутствии лечения, что, таким образом, приведет к задержке возникновения осложнений диабета, таких как ретинопатия, невропатия или болезнь почек. Эффективное количество пептидного аналога ОХМ для предупреждения №ОЭМ, например, у субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, представляет собой такое количество, которое задержит, по сравнению с отсутствием лечения, возникновение повышенных уровней глюкозы в крови, которые требуют лечения противогипергликемическими лекарственными средствами, такими как сульфонилмочевины, тиазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины.

Эффективное количество пептидного аналога ОХМ, которое вводят субъекту, также будет зависеть от типа и тяжести заболевания и от особенностей субъекта, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и переносимость лекарственных средств. Доза пептидного аналога ОХМ, эффективная для нормализации уровня глюкозы в крови субъекта, будет зависеть от множества факторов, среди которых включены, без ограничения, пол, масса тела и возраст субъекта, тяжесть неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль пептида, его активность и лекарственная форма.

Типичная еженедельная доза пегилированных пептидных аналогов ОХМ согласно настоящему изо- 6 022820 бретению предпочтительно будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг (общая масса конъюгата). Более предпочтительно еженедельная доза будет находиться в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг. Наиболее предпочтительно еженедельная доза будет находиться в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг.

Субъект представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека, но также может представлять собой животное, включая домашних животных (например, собак, кошек и тому подобных животных), сельскохозяйственных животных (например, коров, овец, свиней, лошадей и тому подобных животных) и лабораторных животных (например, крыс, мышей, морских свинок и тому подобных животных).

Различные предпочтительные особенности и варианты реализации настоящего изобретения далее будут описаны исключительно в качестве примеров.

Пример 1. Синтез пептида.

Пептидный аналог с последовательностью 8Еф ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 2 согласно настоящему изобретению получали путем твердофазного пептидного синтеза на автоматизированном синтезаторе пептидов 8утр1опу от Рто1еш Тсе1то1офс5 1пс. или 433А от Аррйеб ВюууЧепъ. Синтез осуществляли на амидполистирольной смоле Ртос-Кшк (Карр Ро1утеге, Тюбинген, Германия) с заменами, составляющими приблизительно 0,7 ммоль/г. Синтез осуществляли, применяя стратегию использования защитных групп Ртос для основной цепи. Используемые производные боковых цепей аминокислот представляли собой: Атд(РЬЕ), Абп(Тт1), А5р(0Ши), Су5(Тт1), С1п(Тт1), 01и(01Ви), Ηίδ(ΤτΙ), Ьу5(Вос), 8ет(01Ви), ТЬт(01Ви), Тгр(Вос) и Тут(01Ви). Присоединение осуществляли приблизительно с 10 эквивалентами аминокислоты, активированной диизопропилкарбодиимидом (Ю1С) и гидроксибензотриазолом (Н0В1) (молярное отношение 1:1:1), в диметилформамиде (ΌΜΕ) или Ν-метилпирролидоне (ΝΜΡ). Присоединение осуществляли в течение от 45 до 90 мин при комнатной температуре.

Одновременное отщепление от смолы и снятие защитной группы боковой цепи осуществляли в растворе, содержащем трифторуксусную кислоту (ТРА):триизопропилсилан:3,6-диокса-1,8октандитиол:метанол :анизол 90:4:2:2:2 (об./об.) в течение от 1,5 до 2 ч при комнатной температуре. Раствор фильтровали и концентрировали до объема <2 мл и пептиды повторно осаждали холодным диэтиловым эфиром, повторно растворяли в 30-40 мл 10% ацетонитрила и очищали на колонке С18 для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (как правило, \Уа1ег5 8уттейуРтер, 7 мкм, 19*300 мм) при скорости потока, равной 12-15 мл/мин. Образцы элюировали двухступенчатым линейным градиентом АВ от 0 до 25% В в течение 20 мин, а затем от 25 до 75% В в течение 100 мин, где А=0,05% ТРА/вода и В=0,05% ТРА/ацетонитрил. Продукт, как правило, элюировался при 30-35% ацетонитрила. Чистоту и молекулярную массу пептида подтверждали с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на системе Аф1еп1 1100 8епе5 с одноквадрупольным МСдетектором. Разделение методом аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке 2отЬах Есйрке ХЭВС8, 5 мкм, внутренний диаметр 4,6 ммх15 см, с линейным градиентом АВ от 6 до 60% В, в котором А=0,05% ТРА/Н₂0 и В=0,05% ТРА/ацетонитрил, в течение 15 мин и при скорости потока 1 мл/мин. Пептидный аналог очищали до чистоты >95% и подтверждали, что он обладает молекулярной массой, соответствующей рассчитанному значению с точностью до 1 атомной единицы массы (а.е.м.).

Пример 2. Пегилирование пептида, содержащего два остатка Су5 с метоксиПЭГ-мал-20 кДа.

Лиофилизированный пептидный аналог (8Еф ГО N0: 2), полученный согласно примеру 1, взвешивали (обычно 30-50 мг) . Взвешивали 2,1-кратный молярный эквивалент метоксиПЭГ-20 кДа-малеимида (СН₃0 (СН₂СН₂0)_п-(СН₂)^НС0(СН₂)₂-малеимида) (Ν0Ρ 8ипЬй§Ы МЕ-200МА) и объединяли с пептидом. Реагенты растворяли в смеси 50/50 (об./об.) воды/ацетонитрила до концентрации пептида, равной приблизительно 20 мг/мл. Раствор пептидного аналога разбавляли в два раза 100 мМ ацетатом аммония, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЕЭТА). рН 7. Полученную смесь затем перемешивали при комнатной температуре. Осуществляли контроль реакционной смеси с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (разделение путем аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке С18 \Уа1ег5 8уттейу8Ые1ф 3,5 мкм, внутренний диаметр 4,6 ммх10 см при 50°С, с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 5 мин и от 30 до 90% В в течение последующих 30 мин, в котором А=0,05% ТРА/Н₂0 и В=0,05% ТРА/ацетонитрил и скорость потока составляла 1 мл/мин), и обычно через 1-2 ч реакции наблюдалось почти полное исчезновение пика пептида. Появлялось два пика, обусловленных моно- и дипегилированным пептидом, при этом дипегилированный пептид обычно составлял 90-95% общей площади пиков. Образец затем разбавляли до приблизительно 20 мл водой и очищали, как описано в примере 1, с помощью двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 20 мин, а затем от 30 до 80% В в течение 100 мин. Продукт, как правило, элюировался при 3540% ацетонитрила. Осуществляли количественный анализ очищенного пептида по поглощению ультрафиолета (УФ) на 280 нм, применяя рассчитанный на основании последовательности пептида молярный коэффициент поглощения. Выход после очистки был в диапазоне от 70 до 80% в зависимости от количества исходного пептида.

- 7 022820

Пример 3. Анализ на связывание рецептора глюкагона (ЬСсдК).

В анализе на связывание рецептора глюкагона использовали клонированный рецептор глюкагона человека (ЬСсдК) (Ьок δ., Киурет ТЬ., 1еЬпек Ь.Т, Кгатег ТМ.. ^Ьйтоте Т.Е., 8ргесЬег С.А., Ма!Ьеуек 8., Стай Р.Е, В1ддк δ.Η., КокепЪегд С.В. и др. Сепе 140 (2), 203-209 (1994)), выделенный из мембран 293НЕК. КДНК ЬСсдК субклонировали в экспрессионную плазмиду рЬЭ (Ттап8-асДуа1еб ехргеккюп оГ Ги11у датта-сатЪоху1а1еб тесотЪшай Ьитап рго1ет С, ап апЫЬтотЪойс ГасЮг. Сгтпе11 Β.\ν.. Вегд Ό.Τ., \Уа115 1. и Уап δ.Β. Вю/ТесЬпо1оду 5: 1189-1192 (1987)). Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки 293НЕК и осуществляли отбор клеток в 200 мкг/мл гигромицина.

Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, которые растили в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Тг1к-НС1, рН 7,5, 1 мМ МдС1₂, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от КосЬе. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4°С при 1800/д в течение 15 мин. Супернатант отбирали и осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере и повторно гомогенизировали. Смесь центрифугировали при 1800 /д в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты центрифугировали при 1800/д в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000/д в течение 30 мин при 4°С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот при -80°С до использования.

Глюкагон метили радиоактивным йодом посредством процедуры с ¹²⁵1-лактопероксидазой и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в Регкт-Е1тег/ХЕХ (ΝΕΧ207). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение Кс осуществляли с помощью гомологичного конкурирования, вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропанола в материале ¹²⁵1-меченого глюкагона. Кс оценили равной 2,62 нМ и использовали для расчета значений К₁ для всех тестируемых соединений.

Анализ на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения (8РА) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы ^СА), предварительно блокированными в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА), свободном от жирных кислот. Буфер для связывания содержал 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (НЕРЕ8), рН 7,4, 2,5 мМ СаС1₂, 1 мМ МдС1₂, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Т\уееп20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от КосЬе. Глюкагон растворяли в 0,01 N НС1 до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80°С в аликвотах по 30 мкл. Аликвоту глюкагона разбавляли и использовали в анализе на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог ОХМ растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Сотшид 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного глюкагона (неспецифичное связывание (НСС) при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (3 мкг/лунку), 50 мкл меченого ¹²⁵1 глюкагона (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл νθΑ-гранул (150 мкг/лунку). Планшеты запечатывали, перемешивали опрокидыванием и считывали с помощью сцинтилляционного счетчика М1стоВе1а после 12 ч отстаивания при комнатной температуре.

Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания ¹²⁵1-меченого глюкагона в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию 1С50 соединения получали с помощью нелинейной регрессии процента специфичного связывания ¹²⁵1-меченого глюкагона в зависимости от добавленной концентрации соединения. Дозу 1С50 преобразовывали в К₁, применяя уравнение Ченга-Прусоффа (СЬепд Υ., РгикоГГ ν.Η., ВюсЬет. РЬагтасо1. 22, 3099-3108, 1973). К₁ пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8ЕС ГО ΝΟ: 3, в котором Сук (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, составляла 2050+70 нМ для связывания ЬСсдК.

Пример 4. Анализ на связывание рецептора глюкагоноподобного пептида 1 (ЬСЬР-1-К).

В анализе на связывание рецептора СЬР-1 использовали клонированный рецептор глюкагоноподобного пептида 1 человека (ЬСЬР-1К) (Сга/1апо М.Р., Неу Р.Т, ВоткоукЫ Ό., СЫссЫ С.С., 81табет СГО., ВюсЬет ВюрЬук Кек Соттип, 15 октября 1993 г.; 196(1):141-6), выделенный из мембран 293НЕК. КДНК ЬСЬР-1К субклонировали в экспрессионную плазмиду рЬЭ (Тгапк-асОуаЮб ехргеккюп оГ Ги11у даттасагЪохукЦеб гесотЫпаШ Ьитап рго1ет С, ап апЙЬтотЪоЬс ГасЮг. Спппе11 В,\\'., Вегд Э.Т., Vа11к 1. и Υаи 8.В. Вю/ТесЬпо1оду 5: 1189-1192 (1987)). Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки 293 НЕК и осуществляли отбор клеток в 200 мкг/мл гигромицина.

Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, которые растили в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Тг1к-НС1, рН 7,5, 1 мМ МдС1₂, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от КосЬе. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4°С при 1800/д в течение 15 мин. Супернатант отбирали, и осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере, и повторно гомогенизировали. Смесь центрифуги- 8 022820 ровали при 1800хд в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты центрифугировали при 1800хд в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000хд в течение 30 мин при 4°С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот при -80°С до использования.

Глюкагоноподобный пептид 1 (ОЬР-1) метили радиоактивным йодом посредством процедуры с ¹²⁵Ιлактопероксидазой и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в ΡθΓΐ<ίη-Ε1ιηοΓ/ΝΕΝ (ΝΕΧ308). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение Кс осуществляли с помощью гомологичного конкурирования, вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропанола в материале меченого ¹²⁵1 ОЬР-1. Кс оценили равной 0,96 нМ и использовали для расчета значений К₁ для всех тестируемых соединений.

Анализ на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения (8РА) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (\УОА). предварительно блокированными в 1% БСА, не содержащем жирных кислот (ΙΟΝ). Буфер для связывания содержал 25 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 2,5 мМ СаС1₂, 1 мМ МдС1₂, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Т\уссп20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от КосНе. ОЬР-1 растворяли в ФБР до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80°С в аликвотах по 30 мкл. Аликвоты ОЬР-1 размораживали, разбавляли и использовали в анализе на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог ОХМ растворяли в ФБР и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Согшид 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного ОЬР-1 (НСС при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (1 мкг/лунку), 50 мкл меченого ¹²⁵Ι ОЬР-1 (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл ^ОА-гранул (150 мкг/лунку). Планшеты запечатывали, перемешивали опрокидыванием и считывали с помощью сцинтилляционного счетчика М1сгоВе1а после 12 ч отстаивания при комнатной температуре.

Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания ¹²⁵1-меченого ОЬР-1 в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию 1С50 соединения получали с помощью нелинейной регрессии процента специфичного связывания ¹²⁵1-меченого ОЬР-1 в зависимости от добавленной концентрации соединения. Концентрацию 1С50 преобразовывали в К,, применяя уравнение Ченга-Прусоффа (СНепд Υ., РгнюГГ \\'.Н,, ВюсНет. РНагтасо1. 22, 3099-3108, 1973). К₁ пептидного аналога ОХМ с последовательностью 5>ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, в котором Су8 (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, составляла 73+3 нМ для связывания НОЬР-1К.

Пример 5. Функциональный анализ стимулирования цАМФ рецептором глюкагона (НОсдК).

В функциональном анализе стимулирования цАМФ глюкагоном использовали ту же линию клеток, экспрессирующую клонированный НОсдК, что и для анализа на связывание НО1исК, описанного выше в примере 3. Клетки стимулировали пептидным аналогом ОХМ и осуществляли количественный анализ цАМФ, образованного в клетке, применяя гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции (АЬРНАЗсгееп) от Регкш Е1тег (6760625К). Вкратце, цАМФ, образование которого было индуцировано в клетке, конкурирует с биотинилированным цАМФ из набора за связывание с акцепторной гранулой, покрытой антителом против цАМФ, при этом биотинилированный цАМФ также связывается с покрытой стрептавидином донорной гранулой. При повышении уровня цАМФ в клетке происходит разрушение комплекса акцепторная гранула-биотинилированный цАМФ-донорная гранула и наблюдается уменьшение сигнала.

Клетки НОсдК-НЕК293 собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (§рес1аИу МеФа 5-004-В). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза тестовым буфером [25 мМ НЕРЕ8 в буферном солевом растворе Хенкса (НВ§§) с Мд и Са (О1ВСО, 14025-092) с 0,1% свободным от жирных кислот БСА], затем разбавляли до конечной концентрации, равной 125000 клеток на мл. Биотинилированный цАМФ из набора АЬРНА§сгееп добавляли к разбавленным клеткам при конечной концентрации, равной 1 ед./0,04 мл. К разбавленным клеткам также добавляли ингибитор фосфодиэстеразы 1ВМХ (250 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)) до конечной концентрации, равной 500 мкМ. Глюкагон сначала растворяли в 0,01 н. НС1 при концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80°С. После размораживания глюкагон следует использовать в течение 1 ч. Глюкагон, стандарт цАМФ и пептидный аналог ОХМ подвергали серийному разведению в тестовом буфере до 6* конечной концентрации. Функциональный анализ осуществляли в белых полистирольных 96-луночных планшетах Со§!аг малого объема (3688). Реакцию инициировали путем добавления 0,01 мл разбавленных пептидов, глюкагона или цАМФ в 0,04 мл смеси клеток. По прошествии одного часа при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,03 мл лизирующего буфера [10 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 1% №40 и 0,01% свободного от жирных кислот БСА, содержащего 1 единицу каждой из акцепторных и донорных гранул из набора АЬРНАЗсгееп на 0,03 мл]. Добавление лизирующего буфера осуществляли в темноте для предотвращения обесцвечивания детектируемых гранул. Планшеты заворачивали в фольгу, аккуратно встряхивали в течение 1 мин, затем остав- 9 022820 ляли для уравновешивания в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты считывали на приборе Εηνίκίοη от Регкш-Е1тег. Единицы АЕРНАЗсгееп преобразовывали в пмоли образованного на лунку цАМФ на основании стандартной кривой цАМФ. Пмоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для глюкагонового контроля. Значение ЕС₅₀ получали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, в котором Сук (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, подобно ОХМ дикого типа, был полностью эффективен и активен в отношении НОсдР с ЕС₅₀, составляющей 59,9±4,14 нМ.

Пример 6. Функциональный анализ стимулирования цАМФ рецептором глюкагоноподобного пептида 1 (ЬОЬР-1К).

В функциональном анализе стимулирования цАМФ ОЬР-1 использовали ту же линию клеток, экспрессирующую клонированный ЬОЬР-1К, что и для анализа на связывание ЬОЬР-1К, описанного выше в примере 4. Клетки стимулировали пептидным аналогом ОХМ и осуществляли количественный анализ цАМФ, образованного в клетке, применяя гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции (АЬРНЛЗсгееп) от Регкш Е1тег (6760625К). Вкратце, цАМФ, образование которого было индуцировано в клетке, конкурирует с биотинилированным цАМФ из набора за связывание с акцепторной гранулой, покрытой антителом против цАМФ, при этом биотинилированный цАМФ также связывается с покрытой стрептавидином донорной гранулой. При повышении уровня цАМФ в клетке происходит разрушение комплекса акцепторная гранула-биотинилированный цАМФ-донорная гранула и наблюдается уменьшение сигнала.

Клетки ЬОЬР-1К-НЕК293 собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (8реста14у МеФа 5-004-В). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза тестовым буфером [25 мМ НЕРЕ8 в НВ§§ с Мд и Са (01ВС0, 14025-092) с 0,1% свободным от жирных кислот БСА], затем разбавляли до конечной концентрации, равной 125000 клеток на мл. Биотинилированный цАМФ из набора АЬРНАЗсгееп добавляли к разбавленным клеткам при конечной концентрации, равной 1 ед./0,04 мл. К разбавленным клеткам также добавляли ингибитор фосфодиэстеразы 1ВМХ (250 мМ в ДМСО) до конечной концентрации, равной 500 мкМ. ОЬР-1 хранили при концентрации 1 мг/мл в ФБР в виде замороженных аликвот при -80°С. ОЬР-1, стандарт цАМФ и пептидный аналог ОХМ подвергали серийному разведению в тестовом буфере до 6* конечной концентрации. Функциональный анализ осуществляли в белых полистирольных 96-луночных планшетах Сок1аг малого объема (3688). Реакцию инициировали путем добавления 0,01 мл разбавленного пептидного аналога ОХМ, ОЬР-1 или цАМФ в 0,04 мл смеси клеток. По прошествии 1 ч при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,03 мл лизирующего буфера [10 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 1% ΝΓ40 и 0,01% свободного от жирных кислот БСА, содержащего 1 единицу каждой из акцепторных и донорных гранул из набора АЬРНАЗсгееп на 0,03 мл]. Добавление лизирующего буфера осуществляли в темноте для предотвращения обесцвечивания детектируемых гранул. Планшеты заворачивали в фольгу, аккуратно встряхивали в течение 1 мин, затем оставляли для уравновешивания в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты считывали на приборе Е^Шоп от Регкш-Е1тег. Единицы АЬРНАЗсгееп преобразовывали в пмоли образованного на лунку цАМФ на основании стандартной кривой цАМФ. Пмоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для контрольного ОЬР-1. Значение ЕС₅₀ получали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, в котором Сук (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, подобно ОХМ дикого типа, был полностью эффективен и активен в отношении ЬОЬР-ТК с ЕС₅₀, составляющей 2,75±0,55 нМ.

Пример 7. Влияние на потребление пищи, массу тела и состав тела мышей с алиментарным ожирением (ΌΙ0).

Использовали самцов мышей С57ВЬ/6 с алиментарным ожирением (ΌΙ0) в возрасте от трех до четырех месяцев. Животных поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24°С) с 12часовым циклом света/темноты (свет включали в 22:00) и обеспечивали им свободный доступ к пище и воде. Через 2 недели акклиматизации в помещении мышей произвольно делили на группы лечения (п=810/группу), в каждой группе средняя масса тела и масса жира были аналогичны. Перед началом эксперимента мышам инъецировали подкожно (кс) раствор носителя и взвешивали их в течение 2 дней, чтобы они освоились с процедурами.

Носитель или пептидный аналог ОХМ (диапазон доз 6,7-20 нмоль/кг) , растворенный в носителе, вводили путем подкожной инъекции мышам ΌΙ0, которых неограниченно кормили, за 30-90 мин до наступления цикла темноты каждый 3 день в течение от 2 до 4 недель. В то же время измеряли массу тела и массу пищи плюс кормушки. Потребленную за предшествующие 24 ч пищу рассчитывали путем вычитания массы пищи плюс кормушки на данный момент из таковой для предыдущего дня. Абсолютные изменения массы тела рассчитывали путем вычитания массы тела данного животного перед первой инъекцией. В дни 1, 14 и 28 измеряли суммарную массу жира путем ядерного магнитного резонанса (ЯМР), применяя прибор Есйо МеФса1 §ук!ет (Хьюстон, Техас). Свободную от жира массу рассчитывали путем

- 10 022820 вычитания массы жира из общей массы тела.

Исследование 1. Двухнедельное лечение.

Пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован ΐη νίνο, вводили путем подкожной инъекции самцам С57ВЕ/6 с алиментарным ожирением (ΌΙ0) в возрасте 4 месяцев. Пептидный аналог ОХМ инъецировали раз в 3 дня в течение 2 недель при дозах, равных 7,5 и 15 нмоль/кг, и сравнивали с мышами, которым вводили носитель, и животными, которым вводили положительный контроль (7,5 нмоль агониста СЕР-1К длительного действия/кг, который инъецировали каждый 3 день).

Лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, вызывало дозозависимое снижение потребления пищи и массы тела. По окончании 2-недельного периода исследования совокупное потребление пищи в группе, которой вводили 15 нмоль/кг, снижалось на 27% по сравнению с группой, которой вводили носитель. Совокупная потеря массы тела в группе, которой вводили 7,5 нмоль/кг, была аналогична наблюдаемой для положительного контроля, которая представляла собой снижение на приблизительно 9% по сравнению с группой, которой вводили носитель. Совокупная потеря массы тела в группе, которой вводили 15 нмоль/кг (по сравнению с контролем, которому вводили носитель), составляла 18%. Анализ состава тела показал, что потеря массы тела, главным образом, происходила за счет потери массы жира (таблица 1).

Таблица 1. Изменение веса у мышей ΌΙ0 за 14-дневный период лечения (среднее ± стандартная ошибка среднего; .η=8)

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью ЗЕф Ю N0: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован	Общая потеря массы тела (изменение массы тела в г за 14 дней)	Суммарное потребление пищи (всего г за 14 дней)	Потеря массы жира (изменение массы жира в г за 14 дней)
(нмоль/кг) 0 (Носитель)	1,0 ± 0,5	40,7 ± 1,3	0,3 ± 0,3
7,5	-3,1 ± 0,4*	35,0 ± 0,8*	-2,2 ± 0,3*
15	-6,1 ± 0,9*	29,8 ± 1,5*	-3,9 ± 0,7*

Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, уменьшает совокупное потребление пищи и массу тела в 14-дневных исследованиях на мышах ΌΙ0, по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Уменьшение массы тела, главным образом, происходило за счет уменьшения массы жира. *р<0,05 по сравнению с носителем (критерий Дуннетта).

Исследование 2. Четырехнедельное лечение.

Пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (6,7 или 20 нмоль/кг) , и положительный контроль (7,5 или 22,5 нмоль агониста СЕР-1К длительного действия/кг) вводили каждый 3 день путем подкожной инъекции самцам С57ВЕ/6 с алиментарным ожирением (ΌΙ0) в возрасте 4 месяцев в течение 4 недель.

Лечение высокими дозами пептидного аналога ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижало совокупное потребление пищи. При низких дозах пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, снижал массу тела до той же степени, что и в группе положительного контроля. При дозе 20 нмоль/кг пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, вызывал значительно большую потерю массы тела по сравнению с дозой 22,5 нмоль/кг для положительного контроля. Максимальное снижение массы тела (приблизительно 25% от исходной массы тела) было достигнуто через 15 дней лечения. Анализ состава тела подтвердил, что потеря массы тела, связанная с пептидным аналогом ОХМ и положительным контролем, главным образом, происходила за счет потери массы жира (таблица 2).

Действие пептидного аналога ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, дополнительно оценивали с помощью непрямой калориметрии в дни с 21 по 23. Животные, которым вводили пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (20 нмоль/кг), расходовали значительно больше энергии, чем контрольные животные, которым вводили носитель (усредненный расход энергии за 24 ч в день 21 был выше на 18%). Пептидный аналог ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, не привел к существенному изменению уровня двигательной активности по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель.

По завершении исследования уровни инсулина и холестерина в плазме были значительно ниже во всех группах лечения, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель, при этом только в группе, которой вводили высокую дозу пептидного аналога ОХМ с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, наблюдалось значительное снижение уровней лептина. Во всех группах, которым вводили пептид, наблюдались более высокие уровни адипо- 11 022820 нектина в плазме, чем у контрольных животных, которым вводили носитель, но статистически достоверное отличие наблюдалось только для группы, которой вводили высокую дозу пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован.

Таблица 2. Изменение веса у мышей ΌΙ0 за 28-дневный период лечения (среднее ± стандартная ошибка среднего; п=9)

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью ЗЕО Ю ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Общая потеря массы тела (изменение массы тела в г за 28 дней)	Суммарное потребление пищи (всего г за первые 14 дней)	Потеря массы жира (изменение массы жира в г за 28 дней)
0 (Носитель)	0,8 ± 0,2	39,2 ±0,8	0,5 ± 0,1
6,7	-2,0 ± 0,4*	36, 0 ± 1, 1	-0,7 ± 0,2*
20, 0	-11,1 ± 0,9*	26,1 ± 1,4*	-7,5 ± 0,7*

Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, уменьшает совокупное потребление пищи и массу тела в 28-дневных исследованиях на мышах ΌΙ0 по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Уменьшение массы тела, главным образом, происходило за счет уменьшения массы жира. *р<0,05 по сравнению с носителем (критерий Дуннетта).

Пример 8. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении перорального глюкозотолерантного теста или интраперитонеального глюкозотолерантного теста после 2-недельного или 4недельного лечения мышей ΌΙ0 соответственно.

Через 56 ч после последней инъекции мышам ΌΙ0, как описано в примере 7 (исследование 1), мышей лишали пищи на 16 ч перед началом теста на толерантность к глюкозе. В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг через желудочный зонд или путем интраперитонеальной (ΙΡ) инъекции. Кровь отбирали из хвостовой вены через 0, 15, 30, 60 и 120 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Все дозы пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, а также положительный контроль значительно снижали уровень глюкозы в крови, измеренный во все моменты времени перед и после пероральной провокации глюкозой, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (таблица 3).

Интраперитонеальный глюкозотолерантный тест (ΙΡΘΤΤ) осуществляли в день 29, через 3 дня после последней инъекции мышам ΌΙ0, как описано в примере 7 (исследование 2). Низкая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, снижала уровень глюкозы в крови натощак по сравнению с таковым для контрольных животных, которым вводили носитель, но незначительно влияла на уровни глюкозы после интраперитонеальной провокации глюкозой. Высокая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, и обе дозы положительного контроля значительно снижали уровень глюкозы в крови, измеренный во все моменты времени перед и после интраперитонеальной провокации глюкозой, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (таблица 4).

Таблица 3. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от 1+0 до 120 мин) (п=8)

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью ЗЕО Ю ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Площадь под кривой глюкозы (мг*мин/дл)
Среднее	Стандартная ошибка среднего
0 (Носитель)	27771	1434
7,5	17722*	1009
15	17518*	1686

Полученные результаты показали, что через 2 недели лечения мышей ΌΙ0 пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8Ер ГО N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, наблюдалось существенное уменьшение колебаний уровня глюкозы в крови после пероральной нагрузки глюкозой. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (* р<0,05 по сравнению с носителем).

- 12 022820

Таблица 4. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Е0 ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеальной (ΐρ) нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от ΐ+0 до 120 мин) (п=6)

Полученные результаты показали, что через 4 недели лечения мышей ΌΙ0 пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, наблюдалось существенное уменьшение колебаний уровня глюкозы в крови после интраперитонеальной (ΐρ) нагрузки глюкозой. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (* р<0,05 по сравнению с носителем).

Пример 9. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении интраперитонеального глюкозотолерантного теста у худых мышей.

Для данного исследования использовали самцов мышей С57ВЬ/6 в возрасте девяти недель. Животных произвольно делили на группы на основании массы тела. Животным инъецировали носитель или пептидный аналог ОХМ (доза составляла 5,0-15,0 нмоль/кг) за 16 ч до начала теста. Пищу удаляли во время инъекции пептида или носителя. В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг путем интраперитонеальной инъекции. Кровь брали из хвостовой вены через 0, 3, 6, 12 и 30 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Инсулин измеряли с помощью Ме§о§са1е.

Высокая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижала колебания уровня глюкозы в крови, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (таблица 5). Обе дозы пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно повышали концентрации инсулина в плазме по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (табл. 6).

Таблица 5. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от 1+0 до 30 мин) (п=6)

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью 5Е<2 ΙΌ ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Площадь под кривой глюкозы (мг*мин/дл)
Среднее	Стандартная ошибка среднего
Носитель	8718	496
5	7059	476
15	6103*	530

Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (* р<0,05 по сравнению с носителем).

Таблица 6. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Е^ ГО N0: 3, в котором Су§ (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на уровень инсулина в плазме после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Результаты представлены в виде площади под кривой инсулина (= интегрированные значения от 1+0 до 30 мин) (п=6)_

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью ЗЕО Ю ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Площадь под кривой инсулина (нг*мин/мл)
Среднее	Стандартная ошибка среднего
0 (Носитель)	8,14	1,13
5	30,67*	4,76
15	45,26*	6,78

- 13 022820

Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно увеличивал площадь под кривой уровня инсулина в плазме после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (* р<0,05 по сравнению с носителем).

Пример 10. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении перорального глюкозотолерантного теста (ОСТТ) или интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста (ΙΡΟΤΤ) у мышей оЬ/оЬ.

Самцов мышей оЬ/оЬ в возрасте от двух до трех месяцев поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24°С) с 12-часовым циклом света/темноты (свет включали в 22:00 ч) и обеспечивали им свободный доступ к стандартной пище и воде. Через по меньшей мере 2 недели акклиматизации в помещении, после 3-часового голодания измеряли уровень глюкозы в крови из хвостовой вены в 9 утра. Мышей с уровнем глюкозы в крови ниже 180 мг/дл не брали в исследование. Остальных животных произвольно делили на группы лечения (Ν=6-7/ιργτιιιν). в каждой группе средний уровень глюкозы в крови был аналогичен. Мышам обеспечивали доступ к пище до момента инъекции. Животным инъецировали носитель или 7,5 нмоль пептидного аналога ОХМ/кг в 4 ч вечера того же дня. Пищу удаляли во время инъекции. Через 16 ч после инъекции пептида проводили ОСТТ (таблица 7) или ΙΡΟΤΤ (таблица 8). В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг через желудочный зонд (таблица 7) или путем интраперитонеальной инъекции (таблица 8). Кровь брали из хвостовой вены через 0, 15, 30, 60 и 120 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра.

Однократная инъекция пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, нормализовала уровень глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ. Уровни глюкозы в крови, измеренные во все моменты времени после провокации глюкозой, были значительно ниже, чем таковые в контрольной группе, которой вводили носитель.

Таблица 7. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после перорального глюкозотолерантного теста у мышей оЬ/оЬ. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от 1+0 до 120 мин) (п=7)

Доза пептидного	Площадь под кривой :	глюкозы (мг*мин/дл)
аналога ОХМ с последовательностью ЗЕО ΙΏ ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Среднее	Стандартная ошибка среднего
0 (Носитель )	23938	1629
7,5	12266*	1215

Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после перорального глюкозотолерантного теста у мышей оЬ/оЬ. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (*р<0,05 по сравнению с носителем).

Таблица 8. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у мышей оЬ/оЬ. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от 1+0 до 120 мин) (п=6)_

Доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 3, в котором Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (нмоль/кг)	Площадь под кривой глюкозы (мг*мин/дл)
Среднее	Стандартная ошибка среднего
0 (Носитель)	37894	1482
7,5	18878*	3224

Полученные результаты показали, что пептидный аналог с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ΐρ) глюкозотолерантного теста у мышей оЬ/оЬ. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (*р<0,05 по сравнению с носителем).

Пример 11. Мгновенное воздействие на уровни в плазме РСР21, триглицеридов и на экспрессию генов печени у самцов мышей С57ВЕ/6 с алиментарным ожирением.

Для того чтобы исследовать метаболические пути, на которые влияет лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, независимо от потери массы тела, пептидный аналог ОХМ и положительный контроль (агонист ΟΕΡ-1Κ пролонгированного действия) вводили путем подкожной инъекции самцам мышей с алиментарным ожирением (ΌΙ0) в возрасте 3 месяцев. За день до исследования мышей произвольно делили на группы ле- 14 022820 чения (Ν 7/1рупп\·). в каждой группе средняя масса тела была аналогична. В тот же вечер (приблизительно в 10 ч вечера) животных помещали в чистые клетки и вводили им носитель или пептидный аналог ОХМ путем подкожной инъекции. Пептидный аналог ОХМ и контроль вводили при концентрации 22,5 нмоль/кг. Пищу удаляли во время инъекции пептида или носителя. На следующее утро (приблизительно в 10 утра) животных умерщвляли, чтобы собрать плазму и ткань печени. Измеряли концентрации глюкозы и триглицеридов, применяя анализатор химического состава крови НйасЫ. Экспрессию генов определяли с помощью ПЦР-РВ. Уровни малонил-КоА и ацетил-КоА измеряли с помощью ВЭЖХ.

После однократной инъекции уровень глюкозы в плазме во всех группах лечения был значительно ниже по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. Уровень триглицеридов в плазме был ниже по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель, только у мышей, которым вводили пептидный аналог ОХМ с последовательностью 8ЕС) II) NΟ: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, но не у мышей, которым вводили агонист ОЬР-1К пролонгированного действия. Концентрации малонил-КоА и ацетил-КоА в печени были значительно снижены на 63 и 39% соответственно после лечения пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8ЕС) II) NΟ: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. Лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8ЕС) II) NΟ: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, изменяло экспрессию нескольких генов печени, включая повышение экспрессии гена рдс-1а в 7 в раз и снижение экспрессии генов СйКЕВР и РС8К9 на 52 и 61% соответственно. Вдобавок, экспрессия гена РОР21 в печени была повышена в 17 раз в соответствии с 6-кратным повышением РОР21 в кровотоке после незамедлительного лечения пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8ЕС) ГО NΟ: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован. Все наблюдаемые изменения были характерны для мышей, которых лечили пептидным аналогом ОХМ с последовательностью 8ЕС) ГО NΟ: 3, в котором Суз (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован.

Перечень последовательностей

Шз- (АтЪ) -01п-С1у-ТПг-РПе-ТПг-5ег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ЬеиАзр-Зег-Ъу5-Ьу5-А1а-61п-е1и-РНе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ъеи-А5п-(Αί6)61у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а (5Е£) Ю N0:1)

Шз- (АтЪ) -С1п-С1у-ТПг-РПе-ТПг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ЬеиАзр-8ег-Ъу5-Ъуз-А1а-С1п-С1и-РЕе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ьеи-А5п- (АтЬ)61у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а-Суз-Суз (5Е<2 ΙΌ ΝΟ: 2)

Шз- (ΑΪ6) -С1п-С1у-ТЕг-РНе-ТЬг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ЪеиАзр-Зег-Ъуз-Ьуз-А1а-С1п-С1и-РЕе-'Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ьеи-Азп- (Αί6) С1у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а-Суз(20 кДа ПЭГ)-Суз(20 кДа ПЭГ) (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 3), в которой Суз(20 кДа ПЭГ) в положении 39 необязательно амидирован.

Н1з-Зег-С1п-С1у-ТНг-РПе-ТЬг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ЬеиА5р-Зег-Агд-Агд-А1а-С1п-Азр-РЬе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ме1;-А5П-ТЬг—

Ьуз-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а (5Е<2 Ю ΝΟ: 4)

Шз-(Αί6)-С1п-С1у-ТПг-РПе-ТПг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-ПеиАзр-Зег-Ьуз-Ьуз-А1а-61п-С1и-РПе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи-Ъеи-Азп-(АтЬ)01у-Агд-Азп-Агд-Азп-Азп-11е-А1а- Хаазэ-Хаазд (5Εζ) Ιϋ ΝΟ: 5) , в которой Хаазе представляет собой Суз, Суз-ПЭГ или отсутствует; и

Хаазд представляет собой Суз, Суз-ПЭГ или отсутствует.

- 15 022820

Список последовательностей <110> Ε1Ϊ Ы11у апб Сотрапу <120> ПЕПТИДНЫЙ АНАЛОГ ОКСИНТОМОДУЛИНА <130> Х18946 <150> 61/288,888 <151> 2009-12-22 <150> 61/352,576 <151> 2010-06-08 <150> РСТ/и32010/060390 <151> 2010-12-15 <160> 5 <170> РабепЫп νθΓ3ίοη 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (2) .. (2) <223> Хаа в положении 2 представляет собой Αί6 <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (29)..(29) <223> Хаа в положении 29 представляет собой АПэ <400> 1

Ηΐ3 Хаа С1п С1у ТЬг РЬе ТЬг Бег Азр Туг Бег Ьуз Туг Ьеи Азр Бег 15 10 15

Ьуз Ьуз А1а С1п С1и РЬе Уа1 С1п Тгр Ьеи Ьеи Азп Хаа 61у Агд Азп 20 25 30

Агд Азп Азп Не А1а 35 <210> 2 <211> 39 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция

- 16 022820 <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (2) . . (2) <223> Хаа в положении 2 представляет собой ΑίΗ <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (29)..(29) <223> Хаа в положении 29 представляет собой ΑίΗ <400> 2

ΗΪ3 Хаа С1п С1у ТНг РНе ТНг Зег Азр Туг Зег Ьуз Туг Ьеи Азр Зег 15 10 15

Ьуз Ьуз А1а 61п С1и РНе Уа1 С1п Тгр Ьеи Ьеи Азп Хаа С1у Агд Азп 20 25 30

Агд Азп Азп Не АЬа Суз Суз 35 <210> 3 <211> 39 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 представляет собой ΑίΗ <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (29)..(29) <223> Хаа в положении 29 представляет собой ΑίΗ <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (38)..(38) <223> Хаа в положении 38 представляет собой Суз <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (38)..(38) <223> Хаа в положении 38 модифицирован 20-кДа РЕ5 <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 представляет собой Суз <220>

- 17 022820 <221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 модифицирован 20-кДа РЕС <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 может быть амидирован <400> 3

НЬз Хаа С1п С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Туг Зег Ьуз Туг Ьеи Азр Зег 15 10 15

Ьуз Ьуз А1а СЬп СЬи РЬе УаЬ С1п Тгр Ьеи Ьеи Азп Хаа СЬу Агд Азп 20 25 30

Агд Азп Азп Не АЬа Хаа Хаа 35 <210> 4 <211> 37 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 4

НЬз Зег С1п С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Туг Зег Ьуз Туг Ьеи Азр Зег 15 10 15

Агд Агд А1а С1п Азр РЬе Уа1 С1п Тгр Ьеи Мер Азп ТЬг Ьуз Агд Азп 20 25 30

Агд Азп Азп 11е А1а 35 <210> 5 <211> 39 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 представляет собой АтЬ <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ

- 18 022820 <222> (29)..(29) <223> Хаа в положении 29 представляет собой АгЬ <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (38)..(38) <223> Хаа в положении 38 представляет собой Суз или отсутствует <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (38) .. (38) <223> Хаа в положении 38 может быть модифицирован 20-кДа РЕС или 40-кДа РЕС <220>

<221> ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ ЭЛЕМЕНТ <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 представляет собой Суз или отсутствует <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 может быть модифицирован 20-кДа РЕС или 40-кДа РЕС <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (39)..(39) <223> Хаа в положении 39 может быть амидирован <400> 5

ΗΪ3 1

Хаа С1п С1у

ТЬг 5

РЬе ТЬг

Зег Азр

Туг 10

Зег

Ьуз

Туг

Ьеи

Азр 15

Зег

Ьуз

Ьуз

А1а

С1п

С1и

РЬе

Уа1

С1п

Тгр

Ьеи

Ьеи

Азп

Хаа

С1у

Агд

Азп

20

25

30

Агд

Азп

Азп

Не

А1а

Хаа

Хаа

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот

   Н1з-(А1Ь)-О1и-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-Азр-Туг-8ег-Еуз-Туг-Ееи-Азр-8ег-Еуз-Еуз-А1а-О1и-О1и-РЬе-Уа1О1и-Тгр-Ееи-Ееи-Ази-(А1Ь)-О1у-Аг§-Ази-Аг§-Ази-Ази-11е-А1а-Хаа₃₈-Хаа₃₉ (8ЕР ΙΌ N0: 5), в которой Хаа₃₈ представляет собой Суз, Суз-ПЭГ или отсутствует; Хаа₃₈ представляет собой Суз,

   Суз-ПЭГ или отсутствует;

   и в которой С-концевая аминокислота необязательно амидирована.
2. 2. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.1, содержащий последовательность аминокислот

   Н1з-(А1Ь)-О1и-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-Азр-Туг-8ег-Еуз-Туг-Ееи-Азр-8ег-Еуз-Еуз-А1а-О1и-О1и-РЬе-Уа1О1и-Тгр-Ееи-Ееи-Ази-(А1Ь)-О1у-Аг§-Ази-Аг§-Ази-Ази-11е-А1а-Суз-Суз (8ЕР ΙΌ N0: 2), в которой остаток Суз в положении 38 необязательно пегилирован; в которой остаток Суз в положении 39 необязательно пегилирован и карбоксильная группа Суз в положении 39 необязательно амидирована.
3. 3. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.2, где указанный аналог пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 40 кДа, присоединенной к тиольной группе остатка Суз либо в положении 38, либо в положении 39.
4. 4. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп. 1 или 2, где указанный аналог пегилирован по тиолу обоих остатков Суз в положениях 38 и 39 молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 20 кДа в каждом случае и содержит последовательность аминокислот

   Н1з-(А1Ь)-О1и-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-Азр-Туг-8ег-Еуз-Туг-Ееи-Азр-8ег-Еуз-Еуз-А1а-О1и-О1и-РЬе-Уа1О1и-Тгр-Ееи-Ееи-Ази-(А1Ь)-О1у-Аг§-Ази-Аг§-Ази-Ази-11е-А1а-Суз (20 кДа ПЭГ)-Суз (20 кДа ПЭГ) (8ЕР ΙΌ N0: 3), в которой карбоксильная группа пегилированного Суз в положении 39 необязательно амидирована.
5. 5. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-4, где молекула ПЭГ является линейной.
6. 6. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-5, где карбоксильная группа остатка Суз в положении 39 амидирована.
7. 7. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.1, где остаток Суз в положении 39 отсутствует, а оста- 19 022820 ток Суз в положении 38 пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 40 кДа и необязательно амидирован.
8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-7, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
9. 9. Способ лечения инсулиннезависимого диабета у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7.
10. 10. Способ лечения ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7.
11. 11. Применение пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7 для лечения инсулиннезависимого диабета.
12. 12. Применение пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7 для лечения ожирения.