KR20120096022A

KR20120096022A - 옥신토모듈린 펩티드 유사체

Info

Publication number: KR20120096022A
Application number: KR1020127016089A
Authority: KR
Inventors: 조르제 알시나-페르난데즈; 웨인 데이비드 콘
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-08-29
Also published as: TN2012000302A1; CN102740873A; WO2011087672A1; MY160773A; TWI423812B; HN2012001321A; EP2515928A1; PT2515928E; MA33825B1; JP2013515057A; US8367607B2; AU2010341651A1; CA2784671C; SG181430A1; EA022820B1; KR101399671B1; CA2784671A1; AU2010341651B2; CR20120338A; DK2515928T3

Abstract

본 발명은 당뇨병 및/또는 비만의 치료에서 유용한 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다.

Description

옥신토모듈린 펩티드 유사체{OXYNTOMODULIN PEPTIDE ANALOGUE}

본 발명은 당뇨병 및/또는 비만의 치료에서 사용하기 위한 옥신토모듈린 펩티드 유사체 및 그의 PEG화된 유도체에 관한 것이다.

옥신토모듈린 (OXM)은 글루카곤-유사-펩티드 1 (GLP-1)과 함께, 영양소 섭취에 비례하여 소장의 L-세포로부터 방출되는 37개의 아미노산으로 된 펩티드 호르몬이다. 이는 프리프로글루카곤의 조직-특이적인 대체 프로세싱의 결과로서 C-말단에 옥타펩티드 확장부를 가진, 전장의 29개의 잔기 서열의 글루카곤 (Gcg)으로 구성된 것이다. 내인성 OXM은 생체내에서 디펩티딜 펩티다제 IV 및 다른 펩티다제에 의해 빠르게 분해된다.

OXM에 대해 특유한 수용체는 아직 확인된 바 없다. OXM은 시험관내에서 GLP-1 수용체 (GLP-1R) 및 글루카곤 수용체 (GcgR), 둘 모두에 결합하여 이를 완전하게 활성화시키며, 두 수용체에서의 효능은 유사하다.

OXM은 음식물 섭취 및 체중 조절에 관여한다. 정상 체중인 인간 대상체에게 OXM을 급성 투여한 결과, 배고픔을 덜 느꼈고, 식사량 크기는 19%만큼 감소하였다. 과체중의 비만인 대상체에서 4주간 진행된 연구에서, 위약군의 경우, 0.5 kg인 것과 비교하여, 1일 3회에 걸쳐 OXM을 식전에 피하 투여한 결과, 체중이 2.3 kg 감소되었다. 상기 시험에서, GLP-1 기반 요법 (예를 들어, 엑세나티드 및 리라글루티드)과 관련하여 가장 보편적으로 발생하는 부작용인 구역도 현저히 덜 일반적으로 일어났다. OXM은 비록 그의 효과 기전이 명확하지는 않지만, 과체중의 비만인 인간에서 신체 활동의 증가를 촉진시킴으로써 에너지 사용량을 증가시켰다.

OXM은 상업적으로 실행 가능한 치료제로의 개발을 위한 여러 도전 과제를 제시한다. 상기에서 언급한 바와 같이, OXM은 그 크기가 작기 때문에 생체내에서 빠르게 분해되고, 그뿐만 아니라, 신장에서 빠르게 청소된다. 따라서, 대사 안정성이 개선되고, 클리어런스율이 감소된 OXM 펩티드 유사체를 찾아내는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, OXM에 내재된 GcgR 효능제 활성이 혈당 조절에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 위험을 제시한다. 따라서, GLP-1R 활성 및 GcgR 활성 간의 적절한 균형을 유지하면서, 치료학적 용도로 디자인된 OXM 펩티드 유사체의 효능을 최적화시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. GLP-1R 및 GcgR, 둘 모두의 활성화는 체중 감소 효과에 있어 중요한 역할을 할 수 있는 반면, GLP-1R의 활성화는 인슐린 분비 자극성(insulinotropic) 효과를 담당한다. 따라서, 비-인슐린 의존성 당뇨병 및/또는 비만 치료에 사용될 수 있도록, 강력한 인슐린 분비 자극 활성을 가지고, 체중 감소를 촉진시키는 것인 OXM 펩티드 유사체를 생산하는 것이 바람직할 수 있다.

안정성을 개선시키기 위해 아미노산이 치환되고, 클리어런스를 저속화시키기 위해 추가의 변형, 예를 들어, PEG화 또는 지질화가 이루어진 OXM 펩티드는 WO 2008101017, WO2006134340, WO2007100535, 및 문헌 [Pocai et al., Diabetes 58:2258-2266, 2009]에 개시되어 있다. 이러한 OXM 유래의 펩티드는 야생형 펩티드보다는잠재적으로 개선된 것으로 보일 수 있지만, 식이-유도성 비만 (DIO) 마우스 모델에서 상당히 큰 체중 감소를 달성하기 위해 필요한 용량은 전형적으로는 제약 상품화를 위해 실현가능한 것으로 간주될 수 있는 것보다 더 높다. 예를 들어, 문헌 [Pocai et al., (2009)]에는 이틀에 한번씩 (QOD) 1,900 nmol/kg (약 8 mg kg)을 13일 동안 투여한 후에는 평균 11 g (약 25%)의 체중 감소가 이루어진 것으로 기록되어 있다.

다양한 OXM 펩티드 및 그의 유사체의 이용가능성에도 불구하고, 펩티드의 효능 및 인슐린 분비 자극 활성이 당뇨병, 바람직하게, 제2형 당뇨병 및 관련 질병 치료에 효과가 있도록 최적화된 GcgR/GLP-1R 활성 비를 가진, 효능이 더 크고, 안정적이며, 장시간 작용하고, 우수한 내성을 가진 OXM 펩티드 유사체가 여전히 요구되고 있다. 효과적인 치료를 통해 체중을 감소시키는, 그의 OXM 펩티드 유사체를 생산하는 것 또한 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은 당뇨병 및/또는 비만을 효과적으로 치료하고자 하는 것이다.

본 발명은 전반적인 효능은 최적화시키면서, 대사 안정성을 최적화시키고 상대적인 GcgR/GLP-1R 활성을 조절하기 위해 아미노산 치환이 도입된 OXM 펩티드 유사체를 포함한다. 추가로, 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 시간당 일어나는 작용을 증진시키기 위해 선택된 위치에서 PEG화됨으로써 보다 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다:

상기 서열에서, Xaa₃₈은 Cys, Cys-PEG이거나, 또는 존재하지 않고, Xaa₃₉는 Cys, Cys-PEG이거나, 또는 존재하지 않으며, 또한, C-말단 아미노산은 임의로 아미드화된다.

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추가로, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다:

상기 서열에서, 38번 위치의 Cys 잔기는 임의로 PEG화되고, 여기서, 39번 위치의 Cys 잔기는 임의로 PEG화되며, 39번 위치의 Cys의 카르복실 기는 임의로 아미드화된다.

바람직하게, 서열 2의 옥신토모듈린 펩티드 유사체는 38번 위치의 Cys 잔기 또는 39번 위치의 Cys 중 하나에서, 또는 그 둘 모두 상에서, 이들 위치에서의 Cys 잔기의 티올 기에 공유적으로 연결된 40 kDa의 PEG 분자로 PEG화된 것이다. 더욱 바람직하게, 옥신토모듈린 펩티드 유사체는 38번 위치 및 39번 위치의 각 Cys 잔기 상에서, 이들 위치에서의 각 Cys 잔기의 각 티올 기에 공유적으로 연결된 20 kDa의 PEG 분자로 PEG화된 것이다. 임의로, 39번 위치의 Cys 잔기는 서열 2에 존재하지 않을 수 있으며, 이로써 38번 위치가 PEG화를 위한 단일 부위로 남게 된다.

더욱 바람직한 옥신토모듈린 펩티드 유사체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

상기 서열에서, 39번 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기는 임의로 아미드화된다.

가장 바람직한 옥신토모듈린 펩티드 유사체는 39번 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기가 아미드화된 것인, 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 PEG 분자는 선형 또는 분지형일 수 있고, 바람직하게는 선형 PEG 분자이다.

본 발명은 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제 및 임의의 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 비-인슐린 의존성 (제2형) 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 비-인슐린 의존성 (제2형) 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비-인슐린 의존성 (제2형) 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 인슐린 의존성 (제1형) 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 인슐린 의존성 (제1형) 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 인슐린 의존성 (제1형) 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비만을 치료하는 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 비-인슐린 의존성 당뇨병 및 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 비-인슐린 의존성 당뇨병 및 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비-인슐린 의존성 당뇨병 및 비만을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다.

추가로, 본 발명은 비-인슐린 의존성 당뇨병의 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다.

추가로, 본 발명은 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다.

추가로, 본 발명은 비만의 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제공한다.

본 발명은 비-인슐린 의존성 당뇨병 및 비만의 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 포함한다.

본 발명은 비-인슐린 의존성 당뇨병 치료용 의약의 제조에서 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 인슐린 의존성 당뇨병 치료용 의약의 제조에서 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 비만 치료용 의약의 제조에서 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 비-인슐린 의존성 당뇨병 및 비만 치료용 의약의 제조에서 상기 정의된 옥신토모듈린 펩티드 유사체의 용도를 제공한다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 GLP-1 수용체 (GLP-1R) 및 글루카곤 수용체 (GcgR) 둘 모두에 효과적으로 결합하여 그들을 활성화시킨다.

또한, 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 펩티다제, 특히, 디펩티딜 펩티다제 IV에 의한 분해에 대해 천연의 인간 OXM보다 더 큰 저항성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 천연 인간 OXM에 비하여 개선된 생체내 안정성을 가진다.

본 발명에 따른 다양한 실시양태는 과체중 및 비만인 대상체의 음식물 섭취를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 특별한 이점은 GLP-1 기반 요법, 예를 들어, 엑세나티드 및 리라글루티드와 관련하여 보편적으로 발생하는 부작용, 예를 들어, 구역의 빈도가 감소되거나, 또는 일어나지 않는다는 점이다. 따라서, 본 발명은 GLP-1 기반 요법과 비교하여 부작용이 감소되어 있다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 야생형 인간 OXM과 비교하여 우수한 체중 감소 효과를 가진다.

본 발명의 한 실시양태에 따라, 옥신토모듈린 펩티드 유사체는 제2형 당뇨병 및/또는 관련 대사 장애를 앓는 대상체에서 개선된 내당능 및 지질 프로파일을 가지며, 이로써 야생형 인간 OXM보다 더 효과적이다.

옥신토모듈린 (OXM)은 hGLP-1R 및 hGcgR에서 완전한 유효성과 균형잡힌 효능을 가진 약한 공동-효능제이며, 각 수용체를 안정적으로 과다발현하는 HEK293 세포에서의 EC₅₀ 값은 각각 6.7 ± 2.7 nM 및 4.1 ± 1.7 nM이다. 천연 인간 OXM 서열은 하기에 제시한다:

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39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 완전히 유효성이고 효능이 있는 옥신토모듈린 펩티드 유사체로서, hGcgR 및 hGLP-1R에 대한 EC₅₀은 각각 59.9 ± 4.14 nM 및 2.75 ± 0.55 nM이다. 따라서, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 hGcgR에 비해 hGLP-1R에 대해서 약 22배 더 큰 선택성을 지닌, 시험관내 기능성 활성의 균형을 가진다. 결합 친화도, Ki에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었는데, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 hGcgR에 비해 hGLP-1R에 대해서 28배 더 큰 선택성을 지니며, 여기서, 그의 Ki 값은 각각 73 ± 23 nM 및 2,050 ± 70 nM이다.

하나 이상의 PEG 분자가 OXM 펩티드 유사체의 특정 잔기에 공유적으로 부착되면, 비-PEG화된 OXM 펩티드 유사체와 비교하였을 때, 반감기는 연장되고, 클리어런스율은 감소되며, GLP-1R에서의 시험관내 효능은 천연 인간 OXM과 유사한 PEG화된 OXM 펩티드 유사체를 얻게 된다. OXM 펩티드 유사체의 크기는 작고, PEG 분자(들)의 크기는 상대적으로 크다는 것을 고려해 볼 때, 예상컨대, 일단 PEG화되면, OXM 펩티드 유사체는 입체 장애의 결과로서 활성을 상실할 수 있을 것이다. 그러나, 옥신토모듈린 펩티드 유사체가 중간 부분이 아닌, 그의 말단에서 PEG화되면, 펩티드 유사체의 활성은 더 큰 정도로까지 보유되는 것으로 밝혀졌다. 서열에서의 여러 치환을 통해, GLP-1R 및 GcgR에서의 활성은 적절한 비로 유지되면서, 효능은 증진되고, 이로써 PEG화에 기인한 효능 상실은 상쇄된다. 추가로, 옥신토모듈린 펩티드 유사체의 C-말단 종단부에 2개의 PEG 분자가 존재하는 것이 단일의 PEG보다 더 바람직할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 서열은 20종의 천연적으로 발생되는 아미노산에 대한 표준 1문자 또는 3문자 코드를 함유한다. 사용되는 다른 코드는 하기와 같이 정의된다:

Aib = 알파 아미노 이소부티르산

PEG = 폴리에틸렌 글리콜

PEG20K = 평균 분자량이 20,000 Da인 PEG 분자.

본원에서 사용되는 바, "PEG"라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 그의 전형적인 형태의 경우, PEG는 말단 히드록실 기를 가진 선형 중합체로서, 이는 식 HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-OH (여기서, n은 약 8 내지 약 4,000이다)를 가진다. 전형적으로, n은 이산값이 아니며, 평균값 주변의 대략적인 가우스 분포(Gaussian distribution)를 가진 범위로 구성된다. 말단 수소는 캡핑기, 예를 들어, 알킬기 또는 알카놀기로 치환될 수 있다. 바람직하게, PEG는 적어도 하나의 히드록시 기를 가지며, 더욱 바람직하게, 이는 말단 히드록시 기이다. 이러한 히드록시 기는 바람직하게 펩티드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 링커 모이어티에 부착된다. 당업계에는 많은 PEG 유도체가 존재한다 (예를 들어, (미국 특허 번호: 5,445,090; 5,900,461; 5,932,462; 6,436,386; 6,448,369; 6,437,025; 6,448,369; 6,495,659; 6,515,100 및 6,514,491 및 문헌 [Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6: 150-165, 1995])를 참조한다). 본 발명의 OXM 펩티드에 공유적으로 부착되는 PEG 분자의 평균 분자량은 대략 10,000, 20,000, 30,000, 또는 40,000 달톤일 수 있다. PEG 분자는 바람직하게, 18,000 내지 22,000 달톤이다. 더욱 바람직하게는, 19,000 내지 21,000 달톤이다. 가장 바람직하게는 20,000 내지 21,000 달톤이다. 대략 20,000 달톤인 것이 더욱 더 바람직하다. PEG화 시약은 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 단일로 또는 나란히 직렬로 존재할 수 있다. 본 발명의 PEG화된 OXM 펩티드 유사체는 바람직하게 펩티드의 C-말단에 부착된 직렬형 PEG 분자를 가진다. PEG 분자는 바람직하게 mPEG-20kDa 말레이미드 (도식 1) 또는 mPEG-20kDa 아이오도아세트아미드 (도식 2)에 의해 펩티드의 C-말단 종단부의 2개의 시스테인 잔기에 부착된다. 도식 1 및 도식 2에서, n은 10 내지 2,500이다. 바람직하게, n은 350 내지 600이다. 더욱 바람직하게, n은 425 내지 475이다.

특히, PEG 분자는 바람직하게, mPEG-20kDa 말레이미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-말레이미드) (NOF 선브라이트(NOF Sunbright) ME-200MA)이고, 이는 펩티드의 C-말단의 2개의 시스테인 잔기에 부착된다. 가장 바람직한 옥신토모듈린 펩티드 유사체는, PEG 분자가 mPEG-20kDa 말레이미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-말레이미드) (NOF 선브라이트 ME-200MA)이고, 39번 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기가 아미드화된 것인, 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다 (도식 3). 도식 3은 표준 1문자 아미노산 코드를 함유하며, 단, 예외적으로, 박스로 표시된 영역은 이들 아미노산 잔기에 대한 구조를 확대하여 나타내었다.

본원에서 사용되는 바, "PEG화"라는 용어는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자를 분자, 예를 들어, 본 발명의 OXM 펩티드 유사체에 공유적으로 부착시키는 것을 의미한다.

"인슐린 분비 자극 활성"이란 글루코스 수준 상승에 대한 반응으로 인슐린 분비를 자극하여 세포가 글루코스를 흡수하도록 하고, 혈장 글루코스 수준을 감소시키는 능력을 의미한다. 인슐린 분비 자극 활성은 인슐린종 세포주 또는 섬에 의한 인슐린 분비를 측정하는 시험관내 실험, 또는 생체내 실험, 예를 들어, 정맥내 내당능 검사 (IVGTT), 복강내 내당능 검사 (IPGTT), 및 경구 내당능 검사 (OGTT)를 비롯한, 당업계에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 인슐린 분비 자극 활성은 통상적으로 인슐린 수준 또는 C-펩티드 수준을 측정함으로써 인간에서 측정된다. 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 강력한 인슐린 분비 자극 활성을 가진다.

본원에서 사용되는 바, "시험관내 효능"이란 세포 기반 검정에서 GLP-1R 또는 GcgR을 활성화시킬 수 있는 OXM 펩티드 유사체의 능력에 대한 척도이다. 시험관내 효능은 용량-반응 실험에서 측정되는 반응 (이 경우, 시클릭 AMP 생산)의 최대 증가의 절반만큼 증가시키는 화합물의 유효 농도인 "EC₅₀"으로서 표현된다.

"혈장 반감기"라는 용어는 관련 분자의 절반이 혈장으로부터 제거되는 데 소요되는 시간을 의미한다. 별법으로 사용되는 용어로는 "제거 반감기"가 있다. 혈장 반감기 또는 제거 반감기와 관련하여 사용되는 "확장된" 또는 "연장된"이라는 용어는 동등한 조건하에서 측정하였을 때, PEG화된 OXM 펩티드 유사체의 반감기가 참조 분자 (예를 들어, 비-PEG화된 형태의 펩티드 또는 천연 펩티드)의 반감기에 비하여 유의하게 증가한 것을 나타낸다. 예를 들어, 원숭이에서의 천연 OXM의 반감기는 1 hr 미만인 것으로 예상된다. 본 발명의 PEG화된 OXM 펩티드 유사체는 원숭이에서 적어도 24 hr, 가장 바람직하게는 적어도 48 hr의 제거 반감기를 가진다. 본원에 기록된 반감기는 제거 반감기로서, 이는 단말 로그-선형 제거 속도에 상응한다. 반감기가 클리어런스 및 분포 부피, 둘 모두의 함수로 변화하는 도출된 파라미터라는 것을 당업자는 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "장기 작용 GLP-1R 효능제"라는 용어는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자에 공유적으로 부착된 GLP-1 펩티드 유사체를 의미한다. PEG화된 GLP-1 화합물은 미국 특허 7,557,183에 개시되어 있다.

클리어런스란 순환으로부터 약물을 제거할 수 있는 신체 능력에 대한 척도이다. 예를 들어, 약물 변형으로 인해 클리어런스가 감소함에 따라, 반감기는 증가할 것으로 예상된다. 그러나, 이러한 상반 관계는 오직 분포 부피에 변화가 없는 경우에만 그러한다. 단말 로그-선형 반감기 (t_½), 클리어런스 (C), 및 분포 부피 (V) 사이의 유용한 근사적 관계는 등식:

로 제시된다. 클리어런스는 얼마나 많은 양의 약물이 제거되는가를 나타내기 보다는, 오히려 제거되어야 하는 약물이 완전히 없는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈장의 부피를 표시한다. 클리어런스는 시간 단위당 부피로서 표시된다. 원숭이에서 본 발명의 PEG화된 OXM 펩티드 유사체의 클리어런스 값은 바람직하게 200 ml/h/kg 이하, 더욱 바람직하게, 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 및 가장 바람직하게, 50, 40 또는 20 ml/h/kg 이하이다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 전형적으로 비경구적으로 투여될 것이다. 비경구 투여로는 예를 들어, 전신 투여, 예를 들어, 근육내, 정맥내, 피하, 진피내, 또는 복강내 주사에 의한 것을 포함한다. 이 OXM 펩티드 유사체는 비-인슐린 의존성 (제2형) 당뇨병, NIDDM, 또는 하기에 논의되는 장애를 치료하기 위한 제약 조성물의 일부로서 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 대상체에게 투여된다. 제약 조성물은, 예를 들어, 그 중에서 OXM 펩티드 유사체가 2가 금속 양이온, 예를 들어, 아연과 착체를 형성하고 있는 용액, 또는 현탁액일 수 있다. 펩티드 유사체는 또한 예를 들어, 동결건조 또는 분무 건조에 의해 고체 제제로 제제화될 수 있고, 이후 투여 전에 적합한 희석 용액 중에서 재구성된다. 적합한 제약 담체는 펩티드 또는 펩티드 유도체와 상호작용하지 않는 불활성 성분을 함유할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제약 담체로는 예를 들어, 멸균수, 생리학적 염수, 정균성 염수 (약 0.9% mg/ml의 벤질 알콜을 함유하는 염수), 포스페이트 완충 염수, 행크스(Hank's) 용액, 링거(Ringer's)-락테이트 등이 포함된다. 적합한 부형제의 일부 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 및 만니톨, 및 보존제, 예를 들어, 페놀, 및 m-크레졸이 포함된다.

표준 제약 제제 기법, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, PA)]에 기재되어 있는 기법이 사용될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 협측, 경구, 경피, 비강 또는 폐 경로를 통한 투여용으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 혈액 혈장 수준이 투여 후 연장된 시간 기간 동안 유효 범위로 유지되도록 연장 방출용으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 당뇨병, 구체적으로 제2형 당뇨병 (비-인슐린 의존성 당뇨병, NIDDM)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 OXM 펩티드 유사체를 사용한 치료가 이익이 될 수 있는 추가의 대상체로는 내당능 장애 또는 공복 혈당 장애를 앓는 대상체, 대상체의 신장 및 체격에 대해 그의 체중이 정상 체중보다 약 25% 이상 더 큰 대상체, 부모 중 한 분 이상이 NIDDM을 앓는 대상체, 임신성 당뇨병을 앓은 대상체, 및 대사 장애, 예를 들어, 내인성 인슐린 분비 감소로 인해 유발되는 것과 같은 대사 장애를 앓는 대상체가 포함된다. OXM 펩티드 유사체는 내당능 장애를 앓는 대상체에서 계속 진행되어 제2형 당뇨병으로 발전하지 못하도록 예방하고, 췌장 β-세포 퇴화를 예방하고, β-세포 증식을 유도하고, β-세포 기능을 개선시키고, 휴면 β-세포를 활성화시키고, 세포가 β-세포로 분화되는 것을 촉진시키고, β-세포 복제를 자극시키고, β-세포 아폽토시스를 억제시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 본 발명의 화합물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 다른 질환 및 상태로는 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY) (문헌 [Herman, et al., Diabetes 43:40, 1994]); 성인 잠재성 자가면역성 당뇨병 (LADA) (문헌 [Zimmet, et al., Diabetes Med. 11:299, 1994]); 내당능 장애 (IGT) (문헌 [Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999]); 공복 혈당 장애 (IFG) (문헌 [Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991]); 임신성 당뇨병 (문헌 [Metzger, Diabetes, 40: 197, 1991]); 대사 증후군 X, 이상지질혈증, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트리글리세리드혈증, 및 인슐린 저항성을 포함한다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 또한 당뇨병의 2차적 원인을 치료하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다 (문헌 [Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999). 그러한 2차적 원인으로는 과량의 글루코코르티코이드, 과량의 성장 호르몬, 크로뮴친화세포종, 및 약물-유도성 당뇨병이 포함된다. 당뇨병을 유도할 수 있는 약물로는 피리미닐, 니코틴산, 글루코코르티코이드, 페니토인, 갑상선 호르몬, β-아드레날린제, α-인터페론 및 HIV 감염 치료에 사용되는 약물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 OXM 펩티드 유사체는 음식물 섭취 억제 및 비만 치료에 효과적일 수 있다.

OXM 펩티드 유사체의 "유효량"이란 대상체에게 투여되었을 때, 허용될 수 없는 부작용을 유발하지 않으면서, 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 산출하는 양이다. "원하는 치료 효과"로는 하기 중 하나 이상이 포함된다: 1) 질환 또는 상태와 관련된 증상(들)의 호전; 2) 질환 또는 상태와 관련된 증상 발병의 지연; 3) 치료하지 않은 경우와 비교하였을 때, 장수명 증가; 및 4) 치료하지 않은 경우와 비교하였을 때, 보다 우수한 삶의 질. 예를 들어, NIDDM 치료를 위한 OXM 펩티드 유사체의 "유효량"은 치료하지 않았을 때보다 혈당 농도를 더 잘 조절함으로써 당뇨병 합병증, 예를 들어, 망막병증, 신경병증, 또는 신장 질환의 발병을 지연시키는 양이다. 예를 들어, 내당능 장애 또는 공복 혈당 장애를 앓는 대상체에서 NIDDM을 예방하기 위한 OXM 펩티드 유사체의 "유효량"은 치료하지 않은 경우와 비교하였을 때, 항고혈당 약물, 예를 들어, 술포닐우레아, 티아졸리딘디온, 인슐린, 및/또는 비스구아니딘으로의 치료를 필요로 하는 혈당 수준 상승이 발병되는 것을 지연시키는 양이다.

대상체에게 투여되는 OXM 펩티드 유사체의 "유효량"은 또한 질환 유형 및 중증도, 및 대상체의 특징, 예를 들어, 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 것이다. 대상체의 혈당을 정상화시키는 데 유효한 OXM 펩티드 유사체의 용량은, 제한없이, 대상체의 성별, 체중 및 연령, 혈당 조절 불능의 중증도, 투여 경로, 및 생체이용률, 펩티드의 약동학적 프로파일, 효능, 및 제형을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 PEG화된 OXM 펩티드 유사체의 전형적인 주 1회 용량의 범위는 바람직하게 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg (접합체 총 중량)이 될 것이다. 더욱 바람직하게, 주 1회 용량의 범위는 약 1 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 30 mg이 될 것이다. 가장 바람직하게, 주 1회 용량의 범위는 약 5 mg 내지 약 30 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 5 mg이 될 것이다.

"대상체"는 포유동물, 바람직하게, 인간이지만, 이는 또한 애완 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등), 가축 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 기니 피그 등)을 비롯한 동물일 수도 있다.

이제 본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 실시양태는 실시예를 통해서만 설명될 것이다.

실시예 1: 펩티드 합성

본 발명의 서열 1 및 서열 2에 따른 펩티드 유사체는 프로테인 테크놀로지스 인크. 심포니(Protein Technologies Inc. Symphony) 또는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 433A 자동 펩티드 합성기 상에서 고상 펩티드 합성에 의해 생성하였다. 대략 0.7 mmol/g으로 치환된 Fmoc-링크(Fmoc-Rink) 아미드 폴리스티렌 수지 (랩프 폴리미어(Rapp Polymere: 독일 튜빙겐)) 상에서 합성을 수행하였다. Fmoc 주쇄 보호기 전략법을 사용하여 합성을 수행하였다. 사용된 아미노산 측쇄 유도체는 하기와 같았다: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc), 및 Tyr(OtBu). 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 N-메틸 피롤리디논 (NMP) 중, 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 활성화된, 대략 10 등량의 아미노산 (1:1:1 몰비)을 사용하여 커플링을 수행하였다. 커플링은 실온에서 45 내지 90분 동안 수행하였다.

실온에서 1.5 내지 2 hr 동안 트리플루오로아세트산 (TFA):트리이소프로필실란:3,6-디옥사-1,8-옥탄-디티올:메탄올:아니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 수지로부터의 절단 및 측쇄 보호기 제거를 동시에 수행하였다. 용액을 여과하고, < 2 mL로 농축시키고, 저온의 디에틸 에테르를 사용하여 펩티드를 침전시키고, 30-40 mL의 10% 아세토니트릴 중에 다시 용해시키고, 12-15 mL/min의 유량으로 C₁₈ 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 칼럼 (전형적으로 워터스 시메트리프렙(Waters SymmetryPrep) 7 um, 19 x 300 mm) 상에서 정제하였다. 20분에 걸친 0 내지 25% B에 이어 100분에 걸친 25 내지 75% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/물 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴)로 샘플을 용리시켰다. 생성물은 일반적으로 30-35% 아세토니트릴에서 용리되었다. 단일 사중극자 MS 검출기가 장착된 애질런트 1100 시리즈(Agilent 1100 Series) 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS) 시스템 상에서 펩티드 순도 및 분자량을 확인하였다. 15분에 걸친 6 내지 60% B로 이루어진 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 ml/min)로 조르박스 이클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C8, 5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 15 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행하였다. 펩티드 유사체를 순도 > 95%로 정제하고, 1 원자 질량 단위 (amu) 이내의 계산치에 상응하는 분자량을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 2: mPEG - MAL -20 kDa 을 사용한, 2개의 Cys 잔기를 함유하는 펩티드의 PEG화

실시예 1에 따라 생성된 동결건조된 펩티드 유사체 (서열 2)를 (전형적으로 30-50 mg) 저울로 달았다. 2.1배의 몰 당량의 mPEG-20kDa 말레이미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-말레이미드) (NOF 선브라이트 ME-200MA)를 저울로 달고, 펩티드와 배합하였다. 반응물을 50/50 (v/v) 물/아세토니트릴 혼합물에 용해시켜 펩티드 농도가 대략 20 mg/mL가 되도록 만들었다. 100 mM 아세트산암모늄, 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (pH 7)을 사용하여 펩티드 유사체 용액을 2배로 희석시켰다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 분석용 역상 HPLC (5분에 걸친 0 내지 30% B에 이어 30 min에 걸친 30 내지 90% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 ml/min)로 50℃에서 워터스 시메트리쉴드(Waters SymmetryShield) C1 8, 3.5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 10 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행)에 의해 반응 혼합물을 모니터링하고, 전형적으로 1-2시간의 반응 시간이 경과한 후, 펩티드 피크가 거의 완전하게 소실된 것으로 나타났다. 모노- 및 디-PEG화된 펩티드에 기인한 2개의 피크가 출현하였고, 디-PEG화된 펩티드는 전형적으로 전체 피크 면적의 90-95%를 구성하였다. 이어서, 물을 사용하여 샘플을 약 20 mL로 희석하고, 20분에 걸친 0 내지 30% B에 이어 100분에 걸친 30 내지 80% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배로 실시예 1에서와 같이 정제하였다. 생성물은 일반적으로 35-40% 아세토니트릴에서 용리되었다. 펩티드 서열에 기초한 몰 흡광 계수 계산치를 사용하여 280 nm에서의 자외선 (UV) 흡광도에 의해 정제된 펩티드를 정량하였다. 정제 후 수율은 출발 펩티드의 양으로 기준으로 하여 70 내지 80% 범위였다.

실시예 3: 글루카곤 수용체 ( hGcgR ) 결합 검정

글루카곤 수용체 결합 검정은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 인간 글루카곤 수용체 (hGcgR)를 사용하였다 (문헌 [Lok S, Kuijper JL, Jelinek LJ, Kramer JM, Whitmore TE, Sprecher CA, Mathewes S, Grant FJ, Biggs SH, Rosenberg GB, et al. Gene 140 (2), 203-209 (1994)]). hGcgR cDNA를 발현 플라스미드 phD에 서브클로닝시켰다 (문헌 [Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)]). 상기 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 ㎍/ml 히그로마이신을 사용하여 선별하였다.

현탁 배양물로부터 얻은 세포를 사용하여 조 혈장 막을 제조하였다. 세포를 얼음 상에서 EDTA를 함유하지 않은, 25 mM 트리스 HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, DNAse1, 20 ug/ml, 및 로슈 컴플리트 인히비터스(Roche Complete Inhibitors)를 함유하는 저장성 완충제 중에 용해시켰다. 25 스트로크 동안 테플론(Teflon) 막자를 사용하는 유리 다운스(glass dounce) 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 균질화하였다. 균질화물을 4℃에서 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 다시 균질화하였다. 혼합물을 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 2차 상청액을 1차 상청액과 함께 합하였다. 합한 상청액을 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30 min 동안 25,000 x g로 원심분리하였다. 막 펠릿을 균질화용 완충제 중에 재현탁시키고, 냉동 분취물로서 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.

¹²⁵I-락토퍼옥시다제 절차에 의해 글루카곤을 방사성아이오딘화시키고, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)/NEN (NEX207)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 약 2,200 Ci/mmol이었다. ¹²⁵I-표지된 글루카곤 물질 중 프로판올 함량이 높기 때문에 포화 결합 대신 상동성 경쟁에 의해 K_D를 측정하였다. K_D는 2.62 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.

앞서 1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드를 사용하여 섬광 근접 검정 (SPA)을 이용함으로써 수용체 결합 검정을 수행하였다. 결합 완충제는 EDTA없이, 25 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) (pH 7.4), 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.1% 지방산 무함유 BSA, 0.003% 트윈20(Tween20), 및 로슈 컴플리트 인히비터스를 함유하였다. 글루카곤을 0.01 N HCl 중에 1 mg/ml로 용해시키고, 30 ㎕ 분취량으로 -80℃에서 급속 냉동시켰다. 글루카곤 분취량을 희석시키고, 1 hr 이내에 결합 검정에 사용하였다. OXM 펩티드 유사체를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 용해시키고, 결합 완충제 중에 연속 희석시켰다. 이어서, 40 ㎕ 검정용 결합 완충제 또는 저온의 글루카곤 (비-특이 결합 (NSB), 최종 1 μM)을 함유하는 코닝(Corning) 3632 투명 바닥 검정용 플레이트로 10 ㎕의 희석된 화합물 또는 PBS를 옮겨 놓았다. 이어서, 90 ㎕ 막 (3 ㎍/웰), 50 ㎕ ¹²⁵I-표지된 글루카곤 (반응물 중 최종 농도 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 회전시켜 혼합하고, 실온에서 12 hr의 정치 시간이 경과한 후, 마이크로베타(MicroBeta) 섬광 계수기를 사용하여 판독하였다.

결과를 화합물의 존재하에서의 특이적 ¹²⁵I-표지된 글루카곤 결합의 비율로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC₅₀ 농도는 ¹²⁵I-표지된 글루카곤의 특이적 결합율(%) 대 첨가된 화합물의 농도에 관한 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 등식을 사용하여 IC₅₀ 용량을 Ki로 전환시켰다 (문헌 [Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973]). 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 Ki는 hGcgR 결합에 대해 2,050 ± 70 nM이었다.

실시예 4: 글루카곤-유사-펩티드 1 ( hGLP -1-R) 수용체 결합 검정

GLP-1 수용체 결합 검정은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (hGLP-1R)를 사용하였다 (문헌 [Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15; 196(1): 141-6]). hGLP-1R cDNA를 발현 플라스미드 phD에 서브클로닝시켰다 (문헌 [Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)]). 상기 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 ㎍/ml 히그로마이신을 사용하여 선별하였다.

현탁 배양물로부터 얻은 세포를 사용하여 조 혈장 막을 제조하였다. 세포를 얼음 상에서 EDTA를 함유하지 않은, 25 mM 트리스 HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, DNAse1, 20 ug/ml, 및 로슈 컴플리트 인히비터스를 함유하는 저장성 완충제 중에서 용해시켰다. 25 스트로크 동안 테플론 막자를 사용하는 유리 다운스 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 균질화하였다. 균질화물을 4℃에서 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 다시 균질화하였다. 혼합물을 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 2차 상청액을 1차 상청액과 함께 합하였다. 합한 상청액을 15 min 동안 1,800 x g로 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30 min 동안 25,000 x g로 원심분리하였다. 막 펠릿을 균질화용 완충제 중에 재현탁시키고, 사용시까지 -80℃에서 냉동 분취물로서 저장하였다.

¹²⁵I-락토퍼옥시다제 절차에 의해 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)을 방사성아이오딘화시키고, 퍼킨-엘머/NEN (NEX308)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 약 2,200 Ci/mmol이었다. ¹²⁵I-표지된 GLP-1 물질 중 프로판올 함량이 높기 때문에 포화 결합 대신 상동성 경쟁에 의해 K_D를 측정하였다. K_D는 0.96 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.

앞서 1% 지방산 무함유 BSA (ICN)로 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드를 사용하여 섬광 근접 검정 (SPA)을 이용함으로써 수용체 결합 검정을 수행하였다. 결합 완충제는 EDTA없이, 25 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.1% 지방산 무함유 BSA, 0.003% 트윈20, 및 로슈 컴플리트 인히비터스를 함유하였다. GLP-1을 PBS 중에 1 mg/ml로 용해시키고, 30 ㎕ 분취량으로 -80℃에서 급속 냉동시켰다. GLP-1 분취량을 해동시키고, 희석시키고, 1 hr 이내에 결합 검정에 사용하였다. OXM 펩티드 유사체를 PBS 중에 용해시키고, 결합 완충제 중에 연속 희석시켰다. 이어서, 40 ㎕ 검정용 결합 완충제 또는 저온의 GLP-1 (NSB, 최종 1 μM)을 함유하는 코닝 3632 투명 바닥 검정용 플레이트로 10 ㎕의 희석된 화합물 또는 PBS를 옮겨 놓았다. 이어서, 90 ㎕ 막 (1 ㎍/웰), 50 ㎕ ¹²⁵I-표지된 GLP-1 (반응물 중 최종 농도 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 회전시켜 혼합하고, 실온에서 12 hr의 정치 시간이 경과한 후, 마이크로베타 섬광 계수기를 사용하여 판독하였다.

결과를 화합물의 존재하에서의 특이적 ¹²⁵I-표지된 GLP-1 결합의 비율로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC₅₀ 농도는 ¹²⁵I-표지된 GLP-1의 특이적 결합율(%) 대 첨가된 화합물의 농도에 관한 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. 쳉-프루소프 등식을 사용하여 IC₅₀ 농도를 Ki로 전환시켰다 (문헌 [Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973]). 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 Ki는 hGLP-1R 결합에 대해 73 ± 23 nM이었다.

실시예 5: 글루카곤 수용체 ( hGcgR )-자극성 cAMP 기능 검정

글루카곤 자극성 cAMP 기능 검정은 상기 실시예 3에 기재된 hGlucR 결합 검정에 사용된 것과 동일한, 클로닝된 hGcgR 발현 세포주를 사용하였다. OXM 펩티드 유사체를 사용하여 세포를 자극시키고, 퍼킨 엘머 (6760625R)로부터 입수한 증폭 발광 근접 균질 검정(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) (알파 스크린(Alpha Screen))을 사용하여 세포내에서 생성된 cAMP를 정량하였다. 간략하면, 세포내에서 유도된 cAMP는 키트로부터의 비오티닐화된 cAMP의 코팅된 항-cAMP 항체 어셉터 비드 및 스트렙타비딘 코팅된 도너 비드에의 결합에 대해 경쟁하였다. 세포내 cAMP 수준이 증가함에 따라, 어셉터 비드-비오티닐화된 cAMP-도너 비드 복합체가 파괴되었고, 이를 통해 관찰되는 신호는 감소하였다.

무효소 세포 해리 용액(Enzyme-Free Cell Dissociation Solution) (스페셜티 메디아(Specialty Media) 5-004-B)을 사용하여 서브컨플루언트 조직 배양용 디쉬로부터 hGcgR-HEK293 세포를 수거하였다. 세포를 저속으로 펠릿화하고, 검정용 완충제 [0.1% 지방산 무함유 BSA와 함께 Mg 및 Ca를 함유하는, 행크스 완충 염 용액 (HBSS) 중 25 mM HEPES (깁코(GIBCO), 14025-092)]로 3회에 걸쳐 세척한 후, 최종 농도가 125,000개의 세포/ml가 되도록 희석시켰다. 알파 스크린 키트로부터의 비오티닐화된 cAMP를 최종 농도 1 유닛/0.04 ml로 희석된 세포에 첨가하였다. 포스포디에스테라제 억제제인 IBMX (디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 250 mM)를 또한 최종 농도 500 uM로 희석된 세포에 첨가하였다. 먼저 글루카곤을 1 mg/ml로 0.01 N HCl 중에 용해시키고, -80℃에서 급속 냉동시켰다. 해동시에는 1 hr 이내에 글루카곤을 사용하여야 했다. 글루카곤, cAMP 표준, 및 OXM 펩티드 유사체를 검정용 완충제 중에 6X 최종 농도로 연속 희석시켰다. 기능 검정은 96 웰, 저부피의 백색 폴리스티렌 코스타 플레이트(Costar Plates) (3688) 중에서 수행하였다. 0.01 ml의 희석된 펩티드, 글루카곤, 또는 cAMP를 0.04 ml의 세포 혼합물에 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 실온에서 1시간 경과 후, 0.03 ml의 용해 완충제 [10 mM HEPES (pH 7.4), 1% NP40, 및 0.01% 지방산 무함유 BSA (알파 스크린 키트로부터의 각 1 유닛/0.03 ml의 어셉터 및 도너 비드 함유)]를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 검출 비드의 표백을 막기 위해 용해 완충제의 첨가는 암실에서 수행하였다. 플레이트를 호일로 랩핑하고, 1 min 동안 완만하게 진탕시킨 후, 실온에서 밤새 방치시켜 평형화시켰다. 퍼킨-엘머 엔비젼(Perkin-Elmer Envision) 기기 상에서 플레이트를 판독하였다. cAMP 표준 곡선에 기반하여 알파 스크린 유닛을 웰당 생성되는 cAMP (pmole)로 전환하였다. 각 웰에서 생성된 cAMP (pmole)를 글루카곤 대조군을 사용하여 관찰된 최대 반응율(%)로 전환시켰다. 최대 반응율(%) 대 첨가된 펩티드 농도를 사용하여 비선형 회귀 분석에 의해 EC₅₀ 값을 도출하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 야생형 OXM과 같이 hGcgR에서 완전히 유효성이고 효능이 있었으며, EC₅₀은 59.9 ± 4.14 nM이었다.

실시예 6: 글루카곤-유사-펩티드 1 수용체 ( hGLP -1R)-자극성 cAMP 기능 검정.

GLP-1 자극성 cAMP 기능 검정은 상기 실시예 4에 기재된 hGLP-1R 결합 검정에 사용된 것과 동일한, 클로닝된 hGLP-1R 발현 세포주를 사용하였다. OXM 펩티드 유사체를 사용하여 세포를 자극시키고, 퍼킨 엘머 (6760625R)로부터 입수한 증폭 발광 근접 균질 검정 (알파 스크린)을 사용하여 세포내에서 생성된 cAMP를 정량하였다. 간략하면, 세포내에서 유도된 cAMP는 키트로부터의 비오티닐화된 cAMP의 코팅된 항-cAMP 항체 어셉터 비드 및 스트렙타비딘 코팅된 도너 비드에의 결합에 대해 경쟁하였다. 세포내 cAMP 수준이 증가함에 따라, 어셉터 비드-비오티닐화된 cAMP-도너 비드 복합체가 파괴되었고, 이를 통해 관찰되는 신호는 감소하였다.

무효소 세포 해리 용액 (스페셜티 메디아 5-004-B)을 사용하여 서브컨플루언트 조직 배양용 디쉬로부터 hGLP-1R-HEK293 세포를 수거하였다. 세포를 저속으로 펠릿화하고, 검정용 완충제 [0.1% 지방산 무함유 BSA와 함께 Mg 및 Ca를 함유하는, HBSS 중 25 mM HEPES (깁코, 14025-092)]로 3회에 걸쳐 세척한 후, 최종 농도가 125,000개의 세포/ml가 되도록 희석시켰다. 알파 스크린 키트로부터의 비오티닐화된 cAMP를 최종 농도 1 유닛/0.04 ml로 상기 희석된 세포에 첨가하였다. 포스포디에스테라제 억제제인 IBMX (DMSO 중 250 mM)를 또한 최종 농도 500 μM로 상기 희석된 세포에 첨가하였다. GLP-1을 -80℃에서 냉동 분취량으로서 PBS 중 1 mg/ml로 저장하였다. GLP-1, cAMP 표준, 및 OXM 펩티드 유사체를 검정용 완충제 중에 6X 최종 농도로 연속 희석시켰다. 기능 검정은 96 웰, 저부피의 백색 폴리스티렌 코스타 플레이트 (3688) 중에서 수행하였다. 0.01 ml의 희석된 OXM 펩티드 유사체, GLP-1, 또는 cAMP를 0.04 ml의 세포 혼합물에 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 실온에서 1 hr 경과 후, 0.03 ml의 용해 완충제 [10 mM HEPES (pH 7.4), 1% NP40, 및 0.01% 지방산 무함유 BSA (알파 스크린 키트로부터의 각 1 유닛/0.03 ml의 어셉터 및 도너 비드 함유)]를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 검출 비드의 표백을 막기 위해 용해 완충제의 첨가는 암실에서 수행하였다. 플레이트를 호일로 랩핑하고, 1 min 동안 완만하게 진탕시킨 후, 실온에서 밤새 방치시켜 평형화시켰다. 퍼킨-엘머 엔비젼 기기 상에서 플레이트를 판독하였다. cAMP 표준 곡선에 기반하여 알파 스크린 유닛을 웰당 생성되는 cAMP (pmole)로 전환하였다. 각 웰에서 생성된 cAMP (pmole)를 GLP-1 대조군을 사용하여 관찰된 최대 반응율(%)로 전환시켰다. 최대 반응율(%) 대 첨가된 펩티드 농도를 사용하여 비선형 회귀 분석에 의해 EC₅₀ 값을 도출하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 야생형 OXM과 같이 hGLP-1R에서 완전히 유효성이고 효능이 있었으며, EC₅₀은 2.75 ± 0.55 nM이었다.

실시예 7: 식이-유도성 비만 ( DIO ) 마우스에서 음식물 섭취, 체중 및 신체 조성에 대해 미치는 효과

3 내지 4개월된 수컷, 식이-유도성 비만 (DIO) C57BL/6 마우스를 사용하였다. 명기/암기 사이클이 12시간씩 주기적으로 진행되는 (22:00에 점등) 온도 조절형 (24℃) 시설에서 동물들을 개별적으로 하우징하였고, 동물들은 먹이 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 2주간의 상기 시설에의 순응 시간이 경과한 후, 마우스를 임의 추출하여 처리군 (n= 1군당 8-10마리)으로 나누었고, 각 군의 평균 체중 및 지방량은 유사하였다. 실험을 수행하기 전에, 비히클 용액을 마우스에 피하 (sc) 주사하고, 마우스가 본 절차에 순응하는 2일 동안 체중을 측정하였다.

2 내지 4주 동안 매 3일마다 암기 사이클이 시작되기 30-90분 전에 비히클, 또는 비히클 중에 용해된 OXM 펩티드 유사체 (용량 범위 6.7-20 nmole/kg)를 자유로이 섭식시킨 DIO 마우스에 sc 주사하여 투여하였다. 체중 및 먹이 + 호퍼의 중량을 동시에 측정하였다. 현재의 먹이 + 호퍼 중량을 전날의 것으로부터 감산하여 지난 24시간 동안 섭취한 먹이량을 계산하였다. 체중의 절대 변화는 1차 주사 이전의 동물의 체중을 감산함으로써 계산하였다. 1, 14 및 28일째, 에코 메디컬 시스템(Echo Medical System) (텍사스주 휴스턴) 기기를 사용하여 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 총 지방량을 측정하였다. 전체 체중으로부터 지방량을 감산함으로써 제지방량을 계산하였다.

연구 1: 2주 처리

39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체를 생체내에서 4개월된 수컷, 식이-유도성 비만 (DIO) C57BL/6에 피하 주사하여 투여하였다. OXM 펩티드 유사체를 7.5 및 15 nmole/kg의 용량으로 2주 동안 매 3일마다 1번씩 주사하고, 비히클 처리된 마우스 및 양성 대조군 (매 3일마다 주사된 7.5 nmole/kg의 장기 작용 GLP-1R 효능제) 처리된 동물과 비교하였다.

39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체로 처리한 결과, 먹이 섭취량 및 체중이 용량 의존적으로 감소하였다. 2주간의 연구 기간 종결시, 15 nmole/kg 군에서 누적 먹이 섭취량은 비히클군과 비교하였을 때 27%만큼 감소하였다. 7.5 nmole/kg 처리군의 누적 체중 감소는 양성 대조군에서 관찰된 것과 유사하였으며, 이는 비히클군과 비교하였을 때 약 9% 감소였다. 15 nmole/kg 처리군의 비히클 조절형 누적 체중 감소는 18%였다. 신체 조성을 분석한 결과, 체중 감소는 주로 지방량 감소를 통해 이루어진 것으로 나타났다 (표 1).

상기 데이터를 통해, 14일간의 DIO 마우스 연구에서 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 비히클 처리된 마우스와 비교하여 누적 먹이 섭취량 및 체중을 감소시킨 것으로 나타났다. 체중 감소는 주로 지방량 감소를 통해 이루어졌다. *p<0.05 대 비히클 (던넷 검정(Dunnett's test)).

연구 2: 4주 처리

39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체 (6.7 또는 20 nmole/kg) 및 양성 대조군 (7.5 또는 22.5 nmole/kg의 장기 작용 GLP-1R 효능제)을 4주 동안 매 3일마다 4개월된 수컷, 식이-유도성 비만 (DIO) C57BL/6에 피하 주사하여 투여하였다.

39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체를 고용량으로 처리한 결과, 누적 먹이 섭취량이 유의하게 감소하였다. 보다 저용량에서, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 체중을 양성 대조군에서 관찰된 것과 유사한 정도로 감소시켰다. 20 nmole/kg 용량에서, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 22.5 nmole/kg 용량의 양성 대조군과 비교하였을 때, 유의하게 더 크게 체중을 감소시켰다. 처리 후 15일이 경과하였을 때 체중 감소가 최대치 (처음 체중의 약 25%)에 도달하였다. 신체 조성을 분석한 결과, OXM 펩티드 유사체 및 양성 대조군과 관련하여 일어난 체중 감소는 주로 지방량 감소를 통해 이루어진 것으로 확인되었다 (표 2).

21일째 내지 23일째 간접 열량측정법을 사용하여 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 효과를 추가로 평가하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체 (20 nmole/kg)로 처리된 동물의 경우, 비히클 처리 대조군보다 에너지 소비량이 유의하게 더 높았다 (평균적으로 21일째 24시간 동안의 에너지 소비량은 18% 증가하였다). 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체는 운동 활성 수준에 있어서는 비히클 처리군과 비교하여 유의한 변화를 일으키지 못했다.

연구 완료시, 혈장 인슐린 및 콜레스테롤 수준은 비히클 처리 대조군보다 모든 처리군에서 유의하게 더 낮았던 반면, 렙틴 수준은 오직 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 고용량으로 처리된 군에서만 유의하게 감소하였다. 혈장 아디포넥틴 수준은 비히클 처리 대조군보다 모든 펩티드 처리군에서 더 높았던 반면, 오직 고용량의, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체로 처리된 군만이 통계학상 유의한 차이를 보였다.

상기 데이터를 통해, 28일간의 DIO 마우스 연구에서 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 비히클 처리된 마우스와 비교하여 누적 먹이 섭취량 및 체중을 감소시킨 것으로 나타났다. 체중 감소는 주로 지방량 감소를 통해 이루어졌다. *p<0.05 대 비히클 (던넷 검정).

실시예 8: DIO 마우스에서 2주 또는 4주간의 처리 후 각각 경구 내당능 검사 또는 복강내 내당능 검사 동안 혈당 변동에 미치는 효과

DIO 마우스에서 실시예 7 (연구 1)에 기재된 바와 같이 최종 주사 후 56시간 경과시, 내당능 검사를 개시하기 이전에 16시간 동안 마우스를 금식시켰다. 0 시점에서, 경구 위관 영양 또는 복강내 (IP) 주사에 의해 2 g/kg 덱스트로스를 동물에게 투여하였다. 당부하 후 0, 15, 30, 60 및 120분째 꼬리 정맥 출혈에 의해 채혈하였다. 혈당측정기에 의해 글루코스 농도를 측정하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 모든 용량 뿐만 아니라, 양성 대조군은 비히클 처리된 대조군과 비교하였을 때 경구 당부하 이전 및 이후의 모든 시점에서 혈당을 유의하게 강하시켰다 (표 3).

DIO 마우스에서 29일째, 실시예 7 (연구 2)에 기재된 바와 같이 최종 주사 후 3일째 복강내 내당능 검사 (IPGTT)를 수행하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 저용량은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 공복 혈당을 감소시킨 반면, IP 당부하 이후의 글루코스 수준에는 거의 영향을 미치지 못했다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 고용량, 및 두 용량 모두의 양성 대조군은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 IP 당부하 이전 및 이후 측정된 모든 시점에서 혈당을 유의하게 강하시켰다 (표 4).

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체를 사용하여 DIO 마우스를 2주간 처리한 후, 경구 당부하 후 혈당 변동이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체를 사용하여 DIO 마우스를 4주간 처리한 후, 복강내 (ip) 당부하 후 혈당 변동이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

실시예 9: 마른 마우스에서 복강내 내당능 검사 동안 혈당 변동에 미치는 효과

본 연구에서는 9주령된 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 먹이를 먹었을 때의 체중에 기초하여 동물을 임의 추출하여 각 군들로 나누었다. 검사 개시 16시간 전에 비히클 또는 OXM 펩티드 유사체 (용량 5.0-15.0 nmole/kg)를 동물에 주사하였다. 펩티드 또는 비히클 주사시에는 먹이를 제거하였다. 0 시점에서, IP 주사에 의해 2 g/kg 덱스트로스를 동물에게 투여하였다. 당부하 후 0, 3, 6, 12 및 30분째 꼬리 정맥 출혈에 의해 채혈하였다. 혈당측정기에 의해 글루코스 농도를 측정하였다. 인슐린은 메소스케일(Mesoscale)에 의해 측정하였다.

39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 고용량은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 혈당 변동을 유의하게 강하시켰다 (표 5). 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 두 용량 모두는 비히클 처리된 대조군과 비교하여 혈장 인슐린 농도를 유의하게 증가시켰다 (표 6).

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 마른 마우스에서 복강내 (ip) 내당능 검사 후 혈당 변동을 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 마른 마우스에서 복강내 (ip) 내당능 검사 후 혈장 인슐린 AUC를 유의하게 증가시킨 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

실시예 10: ob / ob 마우스에서 경구 내당능 검사 ( OGTT ) 또는 복강내 (ip) 내당능 검사 ( IPGTT ) 동안 혈당 변동에 미치는 효과

2 내지 3개월된 수컷 ob/ob 마우스를 명기/암기 사이클이 12시간씩 주기적으로 진행되는 (22:00에 점등) 온도 조절형 (24℃) 시설에서 개별적으로 하우징하였고, 표준 사료 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 적어도 2주간의 상기 시설에의 순응 시간이 경과한 후, 9 AM에 꼬리 정맥 출혈에 의해 3시간 공복 혈당을 측정하였다. 혈당이 180 mg/dL 미만인 마우스는 사용하지 않았다. 나머지 동물을 임의 추출하여 처리군 (N= 1군당 6-7마리)으로 나누었고, 각 군의 평균 혈당 수준은 유사하였다. 주사할 때까지 마우스는 먹이에 접근할 수 있었다. 같은날 4 PM에 비히클 또는 7.5 nmole/kg OXM 펩티드 유사체를 동물에 주사하였다. 주사시에 먹이를 제거하였다. 펩티드 주사 후 16시간이 경과하였을 때, OGTT (표 7) 또는 IPGTT (표 8)를 수행하였다. 0 시점에서, 경구 위관 영양 (표 7) 또는 복강내 주사 (표 8)에 의해 2 g/kg 덱스트로스를 동물에게 투여하였다. 당부하 후 0, 15, 30, 60 및 120분째 꼬리 정맥 출혈에 의해 채혈하였다. 혈당측정기에 의해 글루코스 농도를 측정하였다.

ob/ob 마우스에서 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체를 단일 주사하여 혈당을 정규화시켰다. 당부하 이후 측정된 모든 시점에서 혈당 수준은 비히클 대조군에서의 것보다 유의하게 더 낮았다.

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 ob/ob 마우스에서 경구 내당능 검사 후 혈당 변동을 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

상기 데이터를 통해, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체가 ob/ob 마우스에서 복강내 (ip) 내당능 검사 후 혈당 변동을 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다. 통계학적 유의성은 던넷 검정 (* p<0.05 대 비히클)에 의해 평가되었다.

실시예 11: 수컷, 식이-유도성 비만 C57BL /6 마우스에서 혈장 FGF21 , 트리글리세리드 수준, 및 간 유전자 발현에 미치는 급성 효과

체중 감소와는 독립적으로, 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 처리에 조절되는 대사 경로를 조사하기 위해, 3개월된 수컷, 식이-유도성 비만 (DIO) 마우스에게 상기 OXM 펩티드 유사체 및 양성 대조군 (장기 작용 GLP-1R 효능제)을 피하 주사에 의해 투여하였다. 연구 전날, 마우스를 임의 추출하여 처리군 (N= 1군당 7마리)으로 나누었고, 각 군의 평균 체중은 유사하였다. 그날 밤 (대략 10 PM경), 동물을 깨끗한 케이지안에 넣고, 피하 주사에 의해 비히클 또는 OXM 펩티드 유사체를 투여하였다. OXM 펩티드 유사체 및 대조군을 22.5 nmole/kg으로 투여하였다. 펩티드 또는 비히클 주사시에 먹이를 제거하였다. 다음날 아침 (대략 10 AM경), 동물을 희생시키고, 혈장 및 간 조직을 수집하였다. 히타치(Hitachi) 혈액 화학 분석기를 사용하여 글루코스 및 트리글리세리드 농도를 측정하였다. RT-PCR에 의해 유전자 발현을 측정하였다. HPLC에 의해 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA 수준을 측정하였다.

단일 주사 후, 혈장 글루코스는 모든 처리군에서 비히클 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 장기 작용 GLP-1R 효능제 처리군이 아닌, 오직 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체로 처리된 마우스에서만 혈장 트리글리세리드 수준이 비히클 대조군에 비해 감소하였다. 간 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA 농도는 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체 처리 후, 비히클 대조군에 비해 각각 63% 및 39%만큼 유의하게 감소하였다. 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체로 처리한 결과, 수개의 간 유전자의 발현이 변경되었는데, pgc-1α 유전자 발현의 경우, 7배 증가하였고, ChREBP 및 PCSK9 유전자 발현의 경우, 각각 52% 및 61%만큼 감소하였다. 추가로, 간 FGF21 유전자 발현은 17배 유도되었는데, 이는 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체의 급성 처리 후 순환 FGF21이 6배 증가한 것에 상응하였다. 이러한 모든 변화는 39번 위치의 Cys (PEG20k)가 아미드화된 것인 서열 3의 OXM 펩티드 유사체로 처리된 마우스에 특이적이었다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> OXYNTOMODULIN PEPTIDE ANALOGUE <130> X18946 <150> 61/288,888 <151> 2009-12-22 <150> 61/352,576 <151> 2010-06-08 <150> PCT/US2010/060390 <151> 2010-12-15 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Aib <400> 1 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Xaa Gly Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Aib <400> 2 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Xaa Gly Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala Cys Cys 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is Cys <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is modified by 20kDa PEG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is Cys <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is modified by 20kDa PEG <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 may be amidated <400> 3 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Xaa Gly Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala Xaa Xaa 35 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is Cys or is absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 may be modified by 20kDa PEG or 40kDa PEG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is Cys or is absent <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 may be modified by 20kDa PEG or 40kDa PEG <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 may be amidated <400> 5 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Xaa Gly Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala Xaa Xaa 35

Claims

하기 아미노산 서열:

을 포함하고,
상기 서열에서, Xaa₃₈이 Cys, Cys-PEG이거나, 또는 존재하지 않고, Xaa₃₉가 Cys, Cys-PEG이거나, 또는 존재하지 않으며, C-말단 아미노산이 임의로 아미드화되는 것인, 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열:

을 포함하고,
상기 서열에서, 38번 위치의 Cys 잔기가 임의로 PEG화되고, 39번 위치의 Cys 잔기가 임의로 PEG화되며, 39번 위치의 Cys의 카르복실 기가 임의로 아미드화되는 것인, 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제2항에 있어서, 유사체가 38번 위치 또는 39번 위치 중 어느 한 위치에서 Cys 잔기의 티올 기에 부착된 대략 40 kDa의 PEG 분자로 PEG화되는 것인 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유사체가 38번 위치 및 39번 위치의 Cys 잔기 둘 모두의 티올 상에서 각각의 경우에 대략 20 kDa의 PEG 분자로 PEG화되고, 하기 아미노산 서열:

을 포함하고, 상기 서열에서, 39번 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기가 임의로 아미드화되는 것인, 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 분자가 선형인 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 39번 위치의 Cys 잔기의 카르복실 기가 아미드화되는 것인 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항에 있어서, 39번 위치의 Cys 잔기가 존재하지 않고, 38번 위치의 Cys 잔기가 대략 40 kDa의 PEG 분자로 PEG화되고, 임의로 아미드화되는 것인 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 옥신토모듈린 펩티드 유사체, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물.
비-인슐린 의존성 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비-인슐린 의존성 당뇨병을 치료하는 방법.
비만의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비만을 치료하는 방법.
비-인슐린 의존성 당뇨병 또는 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 옥신토모듈린 펩티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비-인슐린 의존성 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인슐린 의존성 당뇨병의 치료에서 사용하기 위한 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비만의 치료에서 사용하기 위한 옥신토모듈린 펩티드 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인슐린 의존성 당뇨병 또는 비만의 치료에서 사용하기 위한 옥신토모듈린 펩티드 유사체.