BR112012017348B1

BR112012017348B1 - análogo de peptídeo de oxintomodulina, seu uso, bem como composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112012017348B1
Application number: BR112012017348A
Authority: BR
Inventors: Alsina-Fernandez Jorge; David Kohn Wayne
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2019-11-05
Also published as: WO2011087672A1; SG181430A1; MY160773A; CN102740873B; AU2010341651B2; ES2486675T3; PE20121393A1; MA33825B1; EP2515928B1; US8367607B2; TW201143793A; MX2012007438A; CA2784671A1; KR101399671B1; JP2013515057A; HN2012001321A; EA022820B1; AR079345A1; JP5717759B2; CR20120338A

Abstract

patente de invenção: "análogo de peptídeo de oxintomodulina". a presente invenção refere-se a um análogo de peptídeo de oxintomodulina últil no tratamento de diabetes e/ou obsidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANÁLOGO DE PEPTÍDEO DE OXINTOMODULINA, SEU USO, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.

A presente invenção refere-se a análogos de peptídeo de Oxintomodulina e a seus derivados PEguilados para uso no tratamento de diabetes e/ou obesidade.

A oxintomodulina (OXM) é um hormônio peptídíco com 37 aminoácidos que é liberado junto com o Peptídeo Similar ao Glucagon (GLP-1) pelas células L do intestino delgado proporcionalmente a ingestão de nutrientes. Ela é composta da sequência completa de 29 resíduos do glucagon (Gcg) com uma extensão de octapeptídeo na terminação C como resultado de um processamento alternativo específico do tecido do preproglucagon. OXM endógena é rapidamente degradada in vivo pela dipeptidil peptidase IV e outras peptidases.

Receptores distintos de OXM ainda não foram identificados. OXM se liga e ativa completamente o receptor de GLP-1 (GLP-1 R) e o receptor de glucagon (GcgR) in vitro com potências similares nos dois receptores.

A OXM está envolvida na regulação da ingestão de alimentos e peso corporal. A administração aguda de OXM a indivíduos humanos com peso normal reduz a fome e diminui o tamanho da refeição em 19%. Em um estudo de 4 semanas com indivíduos com sobrepeso e obesos, a administração subcutânea pré-prandial três vezes por dia de OXM produziu uma perda de peso de 2,3 kg comparada com 0,5 kg no grupo placebo. Nesse teste, a náusea, o efeito colateral mais comum associado com a terapia baseada em GLP-1 (tal como exenatide e liraglutide), foi significativamente menos prevalente. OXM aumentou a utilização de energia através da promoção de atividade física aumentada em humanos com sobrepeso e obesos, embora o mecanismo do efeito não seja claro.

OXM apresenta vários desafios para o desenvolvimento de um agente terapêutico comercialmente viável. Como mencionado acima, ela é rapidamente degradada in vivo assim como é submetida a uma depuração renal rápida devido ao seu pequeno tamanho. Portanto, é desejável identifi2/34 car análogos do peptídeo de OXM com estabilidade metabólica aperfeiçoada e taxa de depuração reduzida. Adicionalmente, a atividade de agonista de GcgR inerente a OXM apresenta um risco de impactar negativamente o controle da glicemia. Portanto, também é desejável otimizar a potência de um ¹ 5 peptídeo análogo a OXM designado para uso terapêutico enquanto se mantém um equilíbrio apropriado entre as atividades de GLP-1R e GcgR. A atii vação de GLP-1R é responsável por um efeito insulinotrópico, enquanto que ! a ativação de GLP-1R e GcgR pode desempenhar um papel nos efeitos sobre a perda de peso. Portanto, é desejável produzir um análogo de peptídeo ' θ 10 de OXM que tenha atividade insulinotrópica potente e promova perda de peso tal que ele possa ser usado para o tratamento de diabetes não dependente de insulina e/ou obesidade.

I Peptídeos de OXM com substituições de aminoácidos para aperfeiçoar a estabilidade e com modificações adicionais para retardar a depura15 ção, tal como a PEGuilação ou a lipidação estão descritos em WO 2008101017, WO 2006134340, W02007100535 e Pocai et al., Diabetes i

58:2258-2266, 2009. Embora esses peptídeos derivados de OXM possam representar um aperfeiçoamento potencial sobre o peptídeo de tipo selvagem, as doses necessárias para obter uma redução de peso mensurável em 20 um modelo de camundongo com obesidade induzida pela dieta (DIO) são Q tipicamente maiores do que poderíam ser consideradas praticáveis para a comercialização farmacêutica. Por exemplo, Pocai et al. (2009) relataram uma perda de peso de 11 g (-25%) em média depois de 13 dias de administração de 1900 nmol/kg (~8 mg/kg) em dias alternados (QOD).

Apesar da disponibilidade de vários peptídeos de OXM e seus i

I análogos, ainda há uma necessidade de análogos de peptídeo de OXM mais potentes, estáveis, de longa duração e bem tolerados, que possuam uma proporção de atividade de GcgR/GLP-1R que tenha sido otimizada tal que a potência e a atividade insulinotrópica dos peptídeos forneçam tratamentos 30 eficazes para o diabetes, preferivelmente diabetes tipo 2 e distúrbios relacionados. Também é desejável fornecer análogos de peptídeo de OXM que forneçam tratamentos eficazes para reduzir o peso corporal. Consequente3/34 mente, a presente invenção procura fornecer tratamentos eficazes para o diabetes e/ou a obesidade.

A presente invenção compreende um análogo de peptídeo de OXM com substituições de aminoácidos introduzidas para otimizar a estabi5 lidade metabólica e modular as atividades relativas de GcgR/GLP-1R enquanto otimizam a potência global. Em adição, o análogo de peptídeo de OXM da presente invenção é PEGuilado em posições selecionadas para intensificar o tempo de ação permitindo, dessa maneira uma dosagem menos frequente.

A presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina que compreende a sequência de aminoácidos:

510

His- (Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr15 2025

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn3035 (Aib) -Gly-Arg~Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa₃9 (SEQ ID NO: 5) em que Xaa₃₈ é Cys, Cys-PEG ou está ausente, Xaa₃₉ é Cys, Cys-PEG ou está ausente e em que o aminoácido C terminal é opcionalmente amidado.

A presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxin15 tomodulina que compreende a sequência de aminoácidos:

510

His- (Aib) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr15 2025

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn3035 (Aib) -Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO: 1).

Adicionalmente, a presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina que compreende a sequência de aminoácidos:

510

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr15 2025

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn3035 (Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys (SEQ ID NO:2)

I

4/34 em que o resíduo de Cys na posição 38 é opcionalmente PEGuilado e em que o resíduo de Cys na posição 39 é opcionalmente PEGuilado e o grupo carboxila da Cys na posição 39 é opcionalmente amidado.

Preferivelmente, o análogo de peptídeo de Oxintomodulina de

SEQ ID N°:2 é PEGuilado no resíduo de Cys na posição 38 ou n Cys da po¹ sição 39 ou em ambas com uma molécula de PEG 40 kDa, covalentemente ligada ao grupo tiol de cada resíduo de Cys nessas posições. Mais preferivelmente, o análogo de peptídeo de Oxintomodulina é PEGuilado em cada resíduo de Cys na posição 38 e na posição 39 com uma molécula de PEG θ 10 20 kDa, covalentemente ligada ao grupo tiol de cada resíduo de Cys nessas posições. Opcionalmente, o resíduo de Cys na posição 39 pode estar ausente da SEQ ID N°:2, deixando um sítio único para PEGuilação na posição 38.

, O análogo de peptídeo de Oxintomodulina mais preferido com¹ preende a sequência de aminoácidos:

510

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr15 2025

Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn3035 (Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(20kDa PEG)-Cys (20 kDa PEG) (SEQ ID NO: 3) em que o grupo carboxila da Cys PEGuilada na posição 39 é opcionalmente amidada.

O análogo de peptídeo de Oxintomodulina mais preferido compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:3, em que o grupo carboxila da Cys PEGuilada na posição 39 é amidada.

A molécula de PEG usada na presente invenção pode ser linear ou ramificada e é preferivelmente uma molécula de PEG linear.

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Adicio25 nalmente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima

5/34 junto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos.

Adícionalmente, a presente invenção fornece um método para tratar diabetes não ínsulinodependente (tipo 2) em um indivíduo necessitado, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para tratar diabetes Ínsulinodependente (tipo 1) em um indivíduo necessitado, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima.

A presente invenção inclui um método de tratar a obesidade em um indivíduo necessitado, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima.

Adicionalmente, a presente invenção inclui um método para tratar diabetes não ínsulinodependente e obesidade em um indivíduo necessitado, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima.

A presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima para uso como um medicamento.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima para uso no tratamento de diabetes não ínsulinodependente.

Além disso, a presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima para uso no tratamento de diabetes ínsulinodependente.

Além disso, a presente invenção fornece um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima para uso no tratamento de obesidade.

A presente invenção inclui um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima para uso no tratamento de diabetes não insulinodependente e obesidade.

6/34

A presente invenção fornece o uso de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes não insulinodependente.

Adicionalmente, a presente invenção inclui o uso de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes insulinodependente.

Além disso, a presente invenção fornece o uso de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de obesidade.

Adicionalmente, a presente invenção fornece o uso de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina como definido acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes não insulinodependente e obesidade.

Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção se ligam efetivamente e ativam ambos, o receptor de GLP-1 (GLP-1R) e o receptor de glucagon (GcgR).

Também foi descoberto que os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção são mais resistentes à degradação pelas peptidases, em particular a dipeptidil peptidase IV, do que OXM humana nativa. Como resultado, os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção possuem estabilidade aperfeiçoada in vivo versus OXM humana nativa.

Várias modalidades de acordo com a presente invenção são capazes de causar uma redução na ingestão de alimento em indivíduos com sobrepeso e obesos.

Uma vantagem particular da presente invenção é que a frequência dos efeitos colaterais, tais como náuseas, que estão comumente associados com a terapia baseada em GLP-1, tal exenatide e liraglutide, é reduzida ou eliminada. Portanto, a presente invenção tem efeitos colaterais reduzidos comparada com a terapia baseada em GLP-1.

Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção proporcionam efeito de perda de peso superior versus OXM humana de tipo selvagem.

7/34

De acordo com uma modalidade da presente invenção, o análogo de peptídeo de Oxintomodulina fornece tolerância à glicose e perfil lipídico aperfeiçoados em indivíduos com diabetes tipo 2 e/ou distúrbios metabólicos relacionados e o faz mais efetivamente do que OXM humana de tipo selvagem.

A oxintomodulina (OXM) é um coagonista fraco com eficácia completa e potência balanceada em hGLP-1R e hGcgR, com valores de EC₅₀ de 6,7 + 2,7 nM e 4,1 + 1,7 nM, respectivamente, em células HEK293 que super-expressam estavelmente os respectivos receptores. A sequência de OXM nativa humana é dada abaixo:

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-AspSer-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-AsnArg-Asn-Asn-lle-Ala (SEQ ID N°: 4).

O análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3, em que Cys (PEG20k) na posição 39 é amidada, é um análogo de peptídeo de Oxintomodulina totalmente eficaz e potente com uma EC₅o de 59,9 + 4,14 nM e 2,75 + 0,55 nM contra hGcgR e hGLP-1R, respectivamente. Portanto, o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3, em que a Cys(Peg20k) na posição 39 é amidada, tem um equilíbrio de atividades funcionais in vitro que é ~ 22 vezes mais seletiva para hGLP-1R quando comparado com hGcgR. Resultados comparáveis são observados para a afinidade de ligação, Ki, onde o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3, em que a Cys(Peg20k) na posição 39 é amidada, é 28 vezes mais seletivo para hGLP-1R quando comparado com hGcgR, com valores de Ki de 73 + 23 nM e 2050 + 70 nM, respectivamente.

O acoplamento covalente de uma ou mais moléculas de PEG a resíduos particulares do análogo de peptídeo de OXM resulta em um análogo de peptídeo de OXM PEGuilado com uma meia-vida prolongada e taxa de depuração reduzida, quando comparado com aquelas do análogo de peptídeo de OXM não PEGuilado e a potência in vitro em GLP-1R similar aquela de OXM humana nativa. Devido ao pequeno tamanho do análogo de peptídeo de OXM e ao tamanho relatívamente grande da(s) molécula(s) de

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PEG, poderia ser esperado que o análogo de peptídeo de OXM, uma vez PEGuilado, perdesse atividade como resultado de impedimento estérico. Entretanto, foi descoberto que se colocada no final do análogo de peptídeo de Oxintomodulina ao invés do meio, a atividade do análogo de peptídeo é mantida em uma extensão maior. Várias substituições na sequência intensificam a potência, compensando dessa maneira a perda de potência devida a PEGuilação enquanto mantém uma taxa apropriada de atividades em GLP1R e GcgR. Além disso, foi descoberto que a presença de duas moléculas de PEG na extremidade C terminal do análogo de peptídeo de Oxintomodulina é preferível a uma molécula única de PEG.

As sequências da presente invenção contêm os códigos padronizados de letra única ou de três letras para os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os outros códigos usados são como definidos a seguir:

Aib = ácido alfa amino isobutírico

PEG = polietileno glicol

PEG20k = molécula de PEG com peso molecular médio de 20.000 Da

A expressão PEG como usada aqui significa uma molécula de polietileno glicol. Em sua forma típica, PEG é um polímero linear com grupos hidroxila terminais e tem a fórmula HO-CH2CH₂-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, em que n está entre cerca de 8 a cerca de 4000. Tipicamente, n não é um valor descontínuo, mas constituí uma faixa com aproximadamente a distribuição Gaussiana em torno de um valor médio. O hidrogênio terminal pode ser substituído por um grupo de revestimento tal como um grupo alquila ou alcanol. Preferencialmente, PEG tem pelo menos um grupo hidroxil, mais preferivelmente um grupo hidroxil terminal. Esse grupo hidróxi é acoplado, preferivelmente, a uma porção ligante que pode reagir com o peptídeo para formar uma ligação covalente. Existem numerosos derivados de PEG na técnica. (Veja, por exemplo, as Patentes U.S. N^oS: 5.445.090; 5.900.461; 5.932.462; 6.436.386; 6.448.369; 6.437.025; 6.448.369; 6.495.659; 6.515.100 e 6.514.491 e Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). A molécula de PEG covalentemente acoplada ao peptídeo de OXM da preI

9/34 sente invenção pode ter aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 ou 40.000 daltons de peso molecular médio. A molécula de PEG tem preferivelmente 18.000 a 22.000 daltons. Mais preferivelmente, ela tem 19.000 a 21.000 daltons. Mais preferivelmente, ela tem 20.000 a 21.000 daltons. Ela tem, mais preferivelmente, aproximadamente 20.000 daltons. Os reagentes de PEGuilação podem ser moléculas lineares ou ramificadas e podem estar presentes isoladamente ou em tandem. O análogo de peptídeo de OXM PEGuilado da presente invenção possui preferivelmente moléculas de PEG acopladas à terminação C do peptídeo. As moléculas de PEG estão preferivelmente acopladas a dois resíduos de cisteína da extremidade C terminal do peptídeo por um mPEG-20kDa maleimida (Figura 1) ou mPEG-20kDa iodoacetamida (Figura 2). Na Figura 1 e na Figura 2, n é 10 a 2500. Preferivelmente, n é 350 a 600. Mais preferivelmente, n é 425 a 475.

o 7^ o O ^CH3

Figura 1 Figura 2

Em particular, as moléculas de PEG são mPEG-20kDa maleimida (CH3O(CH2CH₂O)n“(CH2)3NHCO(CH2)2-maleimida) (NOF Sunbright ME200MA) e estão acopladas aos dois resíduos de cisteína na terminação C do peptídeo. O análogo de peptídeo de Oxintomodulina mais preferido compreende a sequência de amínoácidos de SEQ ID N°:3, em que as moléculas de PEG são mPEG-20kDa maleimida (ΟΗ₃0(ΟΗ2θΗ₂0)η-(ΟΗ₂)3ΝΗΟΟ(ΟΗ2)2maleimida) (NOF Sunbright ME-200MA) e em que o grupo carboxila da Cys PEGuilada na posição 39 é amidada (Figura 3). A Figura 3 contém o código de aminoácido padronizado de letra única com exceção das áreas enquadradas onde as estruturas para esses resíduos de aminoácidos tenham sido expandidas.

10/34

n= 425-475

Figura 3

A expressão PEGuilação como usada aqui significa o acoplamento covalente de uma ou mais moléculas de PEG, como descritas acima, a uma molécula tal como os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção.

Atividade insulinotrópica refere-se à habilidade de estimular a secreção de insulina em resposta a níveis elevados de glicose, induzindo dessa maneira a absorção de glicose pelas células e a diminuição dos níveis de glicose no plasma. A atividade insulinotrópica pode ser avaliada por métodos conhecidos na técnica, incluindo experimentos in vitro que medem a secreção de insulina pelas linhagens celulares de insulinoma ou ilhotas ou experimentos in vivo tais como o teste de tolerância a glicose intravenosa (IVGTT), teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) e o teste de tolerância à glicose oral (OGTT). A atividade insulinotrópica é medida rotineiramente em humanos pela medição dos níveis de insulina ou níveis de peptídeo C. Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção possuem atividade insulinotrópica robusta.

Potência in vitro como usado aqui é a medida da habilidade do análogo de peptídeo de OXM em ativar GLP-1R ou GcgR em um ensaio baseado em célula. A potência in vitro é expressa como a EC₅o que é a concentração eficaz de um composto que resulta na metade do aumento máximo na resposta medida (nesse caso, produção de AMP cíclico) em um experimento de resposta-dose.

A expressão meia-vida plasmática refere-se ao tempo necessário para que metade das moléculas relevantes sejam depuradas do plasma. Uma expressão usada alternativamente é meia-vida de eliminação. A expressão estendida ou prolongada usada no contexto de meia-vida

11/34 plasmática ou meia-vida de eliminação indica que há um aumento significativo na meia-vida de um análogo de peptídeo de OXM PEGuilado em relação aquela da molécula de referencia (por exemplo, a forma não PEGuilado do peptídeo ou o peptídeo nativo) como determinada sob condições comparáveis. A meia-vida de OXM nativa em macacos, por exemplo, é esperada ser menor do que 1 h. Os análogos de peptídeo de OXM PEGuilados da presente invenção podem ter uma meia-vida de eliminação de pelo menos 24 h no macaco e mais preferivelmente pelo menos de 48 h. A meia-vida relatada aqui é a meia-vida de eliminação, que corresponde a taxa de eliminação loglinear terminal. A pessoa versada na técnica avalia que a meia-vida é um parâmetro derivado que varia como uma função da depuração e do volume de distribuição.

A expressão agonista de GLP-1R de ação prolongada como usada aqui, refere-se a um análogo de peptídeo de GLP-1 covalentemente acoplado a uma ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG). Compostos de GLP-1 PEGuilados estão descritos na Patente U.S. 7.557.183.

A depuração é a medida da habilidade do corpo de eliminar um fármaco da circulação. Conforme a depuração diminui, por exemplo, devido a modificações de um fármaco, a meia-vida pode ser esperada aumentar. Entretanto, esse relacionamento recíproco é exato apenas onde não houver alteração do volume de distribuição. Um relacionamento aproximado útil entre a meia-vida log-linear terminal (ty₂), depuração (C) e volume de distribuição (V) é dada pela equação: ty₂ » 0,693 (V/C). A depuração não indica quanto do fármaco está sendo removido, mas de preferência o volume de fluido biológico, tal como sangue ou plasma que está sendo completamente liberado do fármaco por conta da eliminação. A depuração é expressa como volume por unidade de tempo. Os análogos de peptídeo de OXM PEGuilados da presente invenção preferivelmente possuem um valor de depuração de 200 ml/h/kg ou menos em macacos, mais preferivelmente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg ou menos e o mais preferivelmente 50, 40 ou 20 mí/h/kg ou menos.

Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção tipíca12/34 mente serão administrados parenteralmente. A administração parenteral inclui, por exemplo, a administração sistêmica, tal como por injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intraperitoneal. O análogo de peptídeo de OXM é administrado a um indivíduo em conjunto com um veícu5 Io, diluente ou excipiente farmacêutico aceitável como parte de uma composição farmacêutica para tratar diabetes mellitus não insulino dependente (tipo 2), NIDDM ou os distúrbios discutidos abaixo. A composição farmacêutica pode ser uma solução ou uma suspensão tal como aquela na qual o análogo de peptídeo de OXM é complexado com um cátion de metal divalente tal 10 como zinco. O análogo de peptídeo também pode ser formulado em uma formulação sólida tal como pela liofilização ou secagem por pulverização, que é reconstituído depois em uma solução diluente adequada antes da administração. Veículos farmacêuticos adequados podem conter ingredientes inertes que não interagem com o peptídeo ou derivado de peptídeo. Veículos 15 farmacêuticos adequados para administração parenteral incluem, por exemplo, água estéril, salina fisiológica, salina bacteriostática (salina contendo cerca de 0,9% mg/ml de álcool benzílico), salina tamponada com fosfato, solução de Hank, Ringer-lactato e similars. Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose, dextrose, sucrose, trealose, sorbitol e manitol e 20 conservantes tais como fenol e m-cresoL

Técnicas de formulação farmacêutica padronizadas, tais como aquelas descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, PA) podem ser empregadas. Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção podem ser alternativamente formulados 25 para administração através das vias bucal, oral, transdérmica, nasal ou pulmonar. Os análogos de peptídeo de OXM da invenção podem ser formulados para liberação prolongada tal que os níveis plasmáticos são mantidos na faixa de eficácia por períodos de tempo prolongados depois da administração.

Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção podem ser empregados para tratar diabetes, especificamente diabetes tipo 2 (diabetes mellitus não insulinodependente, NIDDM). Indivíduos adicionais que po13/34 dem se beneficiar do tratamento com os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção, incluem aqueles com tolerância a glicose prejudicada ou glicose de jejum prejudicada, indivíduos cujo peso corporal está cerca de 25% ou mais acima do peso corporal normal para a altura e constituição 5 corporal do indivíduo, indivíduos que possuem um ou mais parentes com

NIDDM, indivíduos que possuem diabetes gestacional e indivíduos com distúrbios metabólicos tais como aqueles que resultam da secreção de insulina endógena diminuída. O análogo de peptídeo de OXM pode ser usado para evitar que indivíduos com tolerância a glicose prejudicada progridam até de10 senvolver o diabetes tipo 2, evitar a deterioração da célula β pancreática, induzir a proliferação de célula β, ativar células β inativas, promover a diferenciação de células em células β, estimular a replicação de célula β e inibir a apoptose de célula β. Outras doenças e condições que podem ser tratadas ou evitadas usando os compostos da invenção nos métodos da invenção 15 incluem: Maturity-Onset Diabetes of the Young (MODY) (Herman, et al., Diabetes 43:40, 1994); Diabetes Autoimune Latente do Adulto (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11:299, 1994); tolerância a glicose prejudicada (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999); glicose de jejum prejudicada (IFG) (Charles, et al., Dia20 betes 40:796, 1991); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197,

1991); síndrome X metabólica, dislipidemia, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, e resistência a insulina.

Os análogos de peptídeo de OXM da invenção também podem ser usados em métodos da invenção para tratar causas secundárias de dia25 betes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp.1):S5, 1999). Tais causas secundárias incluem o excesso de glicorticóides, excesso de hormônio do crescimento, feocromocitoma e diabetes induzido por fármaco. Os fámnacos que podem induzir diabetes incluem, mas não são limitados a piriminila, ácido nicotínico, glicocorticoides, fe30 nitoína, hormônio da tireoide, agentes β-adrenérgicos, interferon α e fármacos usados para tratar infecção por HIV.

Os análogos de peptídeo de OXM da presente invenção podem

14/34 ser eficazes na supressão da ingestão de alimentos e no tratamento da obesidade.

Uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de OXM é a quantidade que resulta em um efeito terapêutico e/ou profilático desejado 5 sem causar efeitos colaterais indesejáveis quando administrado a um indivíduo. Um efeito terapêutico desejado inclui um ou mais dos seguintes: 1) melhora do(s) sintoma(s) associado(s) com a doença ou condição; 2) retardo no aparecimento dos sintomas associados com a doença ou condição; 3) aumento da longevidade comparada com a ausência de tratamento; e 4) 0 10 melhor qualidade de vida comparada com a ausência de tratamento. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de OXM para o tratamento de NIDDM é a quantidade que resultará em um maior controle da concentração de glicose no sangue do que na ausência de tratamento, resultando dessa maneira no retardo do aparecimento das complicações do 15 diabetes tais como a retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de OXM para a prevenção de NIDDM, por exemplo, em indivíduos com tolerância a glicose prejudicada ou glicose de jejum prejudicada, é a quantidade que poderá retardar, comparada com a ausência de tratamento, o aparecimento de níveis de glicose san20 guinea elevados que requeiram tratamento com fármacos antiO híperglicêmicos tais como as sulfoniluréias, tiazolidinodionas, insulina e/ou bisguanidinas.

Uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de OXM administrada a um indivíduo também dependerá do tipo e da severidade da 25 doença e das características do indivíduo, tais como a saúde em geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância aos fármacos. A dose de um análogo de peptídeo de OXM eficaz para normalizar a glicose sanguínea do indivíduo dependerá de vários fatores, entre os quais estão incluídos, sem limitação, o sexo, peso e idade do indivíduo, a severidade da inabilidade de regular a 30 glicose sanguínea, a via de administração e a biodisponibilidade, o perfil farmacocinético do peptídeo, a potência e a formulação.

Uma dose típica de uma vez por semana dos análogos de peptí

15/34 deo de OXM PEGuilado da presente invenção preferivelmente variará entre cerca de 0,1 mg a cerca de 1000 mg (peso total do conjugado). Mais preferivelmente, a dose de uma vez por semana variará entre cerca de 1 mg a cerca de 100 mg ou cerca de 1 mg a cerca de 30 mg. O mais preferivelmente, a 5 dose de uma vez por semana variará entre cerca de 5 mg a cerca de 30 mg ou cerca de 1 mg a cerca de 5 mg.

Um indivíduo é um mamífero, preferivelmente um humano, mas também pode ser um animal, incluindo animais domésticos (por exemplo, cães, gatos e similares), animais de fazenda (por exemplo, vacas, car10 neiros, porcos, cavalos e similares, e animais de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porcos da guiné e similares).

Vários aspectos e modalidades preferidas da presente invenção serão descritas agora apenas por meio de exemplos.

Exemplo 1: Síntese de Peptídeo

O análogo de peptídeo de acordo com a SEQ ID N°:1 e SEQ ID

N°:2 da presente invenção é gerado pela síntese de peptídeo em fase sólida em um sintetizador de peptídeo automatizado Protein Technologies Inc. Symphony ou Applied Biosystems 433A. A síntese é realizada em uma resina de poliestireno Fmoc-Rínk amida (Rapp Polymere Tubingen, Alemanha) 20 com substituição de aproximadamente 0,7 mmol/g. A síntese é realizada usando a estratégia de grupo protetor da cadeia principal Fmoc. Os derivados da cadeia lateral de aminoácidos usados são: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc), e Tyr(OtBu). O acoplamento é realizado com aproxi25 madamente 10 equivalentes de aminoácidos ativados com diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (proporção molar 1:1:1) em dimetilformamida (DMF) ou N-metil pirrolidinona (NMP). O acoplamento é realizado por 45 a 90 minutos em temperatura ambiente.

A divagem concomitante da resina e a remoção do grupo prote30 tor da cadeia lateral são realizadas em uma solução que conte, ácido trifluoroacético (TFA): tri-isopropilsilano:3,6-dioxa-1,8-octano-ditiol: metanoLanisol 90:4:2:2:2 (v/v) por 1,5 h a 2 h em temperatura ambiente. A solução é filtra

16/34 da e concentrada para < 2 mLeos peptídeos são precipitados com éter dietílico gelado, re-dissolvida em 30 a 40 mL de acetonitrila 10% e purificada por cromatografia líquida de aito desempenho com fase reversa em uma coluna C₁₈ (HPLC) (tipicamente uma coluna Waters SymmetryPrep 7 urn, 19 5 x 300 mm) em uma taxa de fluxo de 12 a 15 mL/min. As amostras são eluídas com um gradiente AB linear de dois estágios de 0 a 25% de B durante minutos, seguido por 25 a 75% de B durante 100 minutos onde A = TFA 0,05%/água e B = TFA 0,05%/acetonitrila. O produto geralmente elui em 30 a 35% de acetonitrila. A pureza do peptídeo e o peso molecular são confir10 mados em um sistema de espectrometrias de massa-cromatografia líquida (LC/MS) Agilent 1100 Series com um único detector quadripolar MS. A separação analítica por HPLC é feita em uma coluna Zorbax Eclipse XDB-C8, 5 micra, 4,6 mm i.d. x 15 cm com um gradiente liear de AB de 6 para 60% de B durante 15 minutos em que A = TFA 0,05%/H2O e B = TFA 0,05%/acetonitrila e a taxa de fluxo é de 1 ml/min. O análogo de peptídeo é purificado para >

95% de pureza e é confirmado ter o peso molecular que corresponde ao valor calculado dentre de 1 unidade de massa atômica (amu).

Exemplo 2: PEGuilação de peptídeo que contenha dois resíduos de Cys com mPEG-MAL-20 kPa

O análogo de peptídeo liofilizado (SEQ ID N°:2) gerado de acordo com o Exemplo 1 é pesado (tipicamente 30 a 50 mg). Um equivalente molar de 2,1 vezes de mPEG-20kDa maleimida (CH3O(CH₂CH2O)_n(CH₂)3NHCO(CH₂)2-maleimida) (NOF Sunbright ME-200MA) é pesado e combinado com o peptídeo. Os reagentes são dissolvidos em uma mistura 25 50/50 (v/v) de água/acetonitrila até uma concentração de peptídeo de aproximadamente 20 mg/ml. A solução de análogo de peptídeo é diluída duas vezes com acetato de amônia 100 mM, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA), pH 7. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente.

A mistura de reação é monitorada por HPLC analítica de fase reversa (a se30 paração analítica por HPLC é feita em uma coluna Waters SymmetryShield

C18, 3,5 micra, 4,6 mm i.d. x 10 cm a 50°C com um gradiente AB linear de dois estágios de 0 a 30% de B durante 5 minutos, seguido por 30 a 90% de

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B durante os 30 minutos subsequentes onde A = TFA 0,05%/Η2θ e B = TFA 0,05%/acetonitrila e a taxa de fluxo é de 1ml/min) e tipicamente depois de 1 a 2 horas de tempo de reação, mostra o desaparecimento quase completo do pico do peptídeo. Dois picos devidos ao peptídeo mono e di-PEGuilado aparecem com o peptídeo PEGuilado, constituindo tipicamente 90 a 95% da área total de pico. A amostra é diluída para cerca de 20 mL com água e purificada como no Exemplo 1 com um gradiente AB linear de dois estágios de 0 a 30% de B durante 20 minutos, seguido por 30 a 80% de B durante 100 i min. O produto geralmente elui a 35-40% de acetonitrila. O peptídeo purífiθ 10 cado é quantificado pela absorbância de ultravioleta (UV) a 280 nm usando um coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência do peptídeo. O rendimento depois da purificação está na faixa entre 70 a 80% com base na quantidade do peptídeo de partida.

Exemplo 3: Ensaio de Ligação ao Receptor de Glucagon (hGcgR)

O ensaio de ligação ao receptor de glucagon utiliza o receptor de glucagon humano clonado (hGcgR) (Lok S, Kuijper JL, Jelinek LJ, Kramer JM, Whitmore TE, Sprecher CA, Mathewes S, Grant FJ, Biggs SH, Rosenberg GB, et a/.Gene 140 (2), 203-209 (1994)) isolado das membranas de HEK293. O cDNA de hGcgR é subclonado no plasmídeo de expressão phD (expressão transativada da proteína C humana recombinante completamenO te gama-carboxilada, um fator antitrombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T.,

Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Esse plasmiI deo de DNA é transfectado em células 293HEK e selecionado com 200 | pg/ml de Higromicina.

i 25 As membranas plasmáticas brutas são preparadas usando célu¹ Ias de uma cultura em suspensão. As células são lisadas sobre gelo em tampão hipotônico contendo Tris HCI 25 mM, pH 7.5, MgCh 1 mM, DNAsel ug/ml e Roche Complete Inhibitors sem EDTA. A suspensão celular é homogeneizada com um homogeneizador de vidro Dounce usando um pilão de Teflon por 25 golpes. O homogenato é centrifugado a 4°C a 1800 x g por min. O sobrenadante é coletado e o pélete é resuspenso em tampão hipotônico e homogeneizado novamente. A mistura é centrifugada a 1800 x g

18/34 por 15 min. O segundo sobrenadante é combinado com o primeiro sobrenadante. Os sobrenadantes combinados são centrifugados a 1800 x g por 15 min para clarificar. O sobrenadante clarificado é transferido para tubos de alta velocidade e centrifugado a 25000 x g por 30 min a 4°C. O pélete de membrana é resuspenso no tampão de homogeneização e armazenado como alíquotas congeladas a -80°C até o uso.

O glucagon é radio-iodado pelo procedimento com ¹²⁵llactoperoxidase e purificado por HPLC de fase reversa em um PerkinElmer/NEN (NEX207). A atividade específica é de cerca de 2200 Ci/mmoL A determinação da K_D é realizada pela competição homóloga ao invés de ligação de saturação devido ao alto conteúdo de propanol no material de glucagon marcado com ¹²⁵1. A Kd é avaliada ser 2,62 nM e é usada para calcular os valores de Ki para todos os compostos testados.

O ensaio de ligação ao receptor é realizado usando o Ensaio de Cintilação por Proximidade (SPA) com esferas de aglutinina de germe de trigo (WGA) previamente bloqueadas com albumina sérica bovina 1 % (BSA) sem ácido graxo. O tampão de ligação contém ácido 4-(2-hidroxietil)-1 piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, pH 7.4, CaCh, 2,5 mM, MgCE 1 mM, BSA 1% sem ácido graxo, Tween20 0,003 %, e Roche Complete Inhibitors sem EDTA. Glucagon é dissolvido em HCI 0,01 a 1 mg/ml e imediatamente congelado a -80 °C em alíquotas de 30 μΙ. A alíquota de Glucagon é diluída e usada no ensaio de ligação dentro de 1 h. O análogo de peptídeo de OXM é dissolvido em salina tamponada com fosfato (PBS) e diluído seriadamente em tampão de ligação. Depois, 10 μι de compostos diluídos ou de PBS são transferidos para placas de ensaio de fundo claro Corning 3632 contendo tampão de ensaio de ligação 40 μ! ou glucagon gelado (ligação não específica (NSB) a 1 μΜ no final). Depois, 90 μΙ de membranas (3 pg/poço), 50 μΙ de Glucagon marcado com ¹²⁵l (concentração final de 0,15 nM na reação), e 50 μΙ de esferas de WGA (150 pg/poço) são adicionadas. As placas são lacradas, misturadas, extremidade sobre extremidade e lidas com um contador de cintilação MicroBeta depois de 1 h de tempo de estabilização em temperatura ambiente.

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Os resultados são calculados como um percentual da ligação específica de glucagon marcado com ¹²⁵l na presença do composto. A concentração absoluta IC₅₀ do composto é derivada da regressão não linear do percentual de ligação específica de glucagon marcado com ¹²⁵l vs. a concen5 tração do composto adicionado. A dose de IC50 é convertida para Ki usando a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). A Ki do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3, em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada foi de 2050 + 70 nM para a ligação de hGcgR.

10 Exemplo 4: Ensaio de Ligação ao Receptor de Peptídeo 1 Similar a Glucagon (hGLP-1-R)

O ensaio de ligação ao receptor de GLP-1 utiliza o receptor 1 similar ao glucagon (hGLP-1R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15; 196(1): 141 -6) 15 isolado de membranas de 293HEK. O cDNA de hGLP-1 R é subclonado no plasmídeo de expressão phD (expressão transativada da proteína C humana recombinante completamente gama-carboxilada, um fator antitrombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 11891192 (1987)). Esse plasmídeo de DNA é transfectado em células 293HEK e 20 selecionado com 200 pg/mi de Higromicina.

O As membranas plasmáticas brutas são preparadas usando células de uma cultura em suspensão. As células são lisadas sobre gelo em tampão hipotônico contendo Tris HCI 25 mM, pH 7.5, MgCE 1 mM, DNAsel 20 ug/ml e Roche Complete Inhibitors sem EDTA. A suspensão celular é 25 homogeneizada com um homogeneizador de vidro Dounce usando um pilão de Teflon por 25 golpes. O homogenato é centrifugado a 4°C a 1800 x g por 15 min. O sobrenadante é coletado e o pélete é resuspenso em tampão hipotônico e homogeneizado novamente. A mistura é centrifugada a 1800 x g por 15 min. O segundo sobrenadante é combinado com 0 primeiro sobrena30 dante. Os sobrenadantes combinados são centrifugados a 1800 x g por 15 min para clarificar. O sobrenadante clarificado é transferido para tubos de alta velocidade e centrifugado a 25000 x g por 30 min a 4°C. O pélete de

20/34 membrana é resuspenso no tampão de homogeneização e armazenado como alíquotas congeladas a -80°C até o uso.

O peptídeo 1 similar ao glucagon (GLP-1) é radio-iodado pelo procedimento com ¹²⁵l-lactoperoxidase e purificado por HPLC de fase reversa em um Perkin-Elmer/NEN (NEX308). A atividade específica é de cerca de 2200 Ci/mmol. A determinação da Kd é realizada pela competição homóloga ao invés de ligação de saturação devido ao alto conteúdo de propanol no material de GLP-1 marcado com ¹²⁵l. A K_D é avaliada ser 0,96 nM e é usada para calcular os valores de Ki para todos os compostos testados.

O ensaio de ligação ao receptor é realizado usando o Ensaio de Cintilação por Proximidade (SPA) com esferas de aglutinina de germe de trigo (WGA) previamente bloqueadas com BSA 1% sem ácido graxo (ICN). O tampão de ligação contém ácido 4-(2-hidroxietil)-1piperazinoetanesulfônico (HEPES) 25 mM, pH 7.4, CaCI₂, 2,5 mM, MgCI₂ 1 mM, BSA 1% sem ácido graxo, Tween20 0,003 %, e Roche Complete Inhibitors sem EDTA. GLP-1 é dissolvido em PBS a 1 mg/ml e imediatamente congelado a -80 °C em alíquotas de 30 μΙ. As alíquotas de GLP-1 são descongeladas, diluídas e usadas no ensaio de ligação dentro de 1 h. O análogo de peptídeo de OXM é dissolvido em PBS e diluído seriadamente em tampão de ligação. Depois, 10 μΙ de compostos diluídos ou de PBS são transferidos para placas de ensaio de fundo claro Corning 3632 contendo tampão de ensaio de ligação 40 μΙ ou GLP-1 gelado (NSB a 1 μΜ no final). Depois, 90 μΙ de membranas (1pg/poço), 50 μΙ de GLP-1 marcado com ¹²⁵l (concentração final de 0,15 nM na reação), e 50 μΙ de esferas de WGA (150 pg/poço) são adicionadas. As placas são lacradas, misturadas , extremidade sobre extremidade e lidas com um contador de cintilação MicroBeta depois de 12 h de tempo de estabilização em temperatura ambiente.

Os resultados são calculados como um percentual da ligação específica de GLP-1 marcado com ¹²⁵1 na presença do composto. A concentração absoluta lC5o do composto é derivada da regressão não linear do percentual de ligação específica de GLP-1 marcado com ¹²⁵l vs. a concentração do composto adicionado. A concentração de IC5o é convertida para Ki usan

21/34 do a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). A Ki do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3, em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada foi de 73 + 23 nM para a ligação de hGLP-1R.

Exemplo 5: Ensaio Funcional de cAMP estimulado pelo receptor de glucagon (hGcgR)

O ensaio funcional de cAMP estimulado pelo glucagon usa a mesma linhagem celular clonada que expressa hGcgR como usada no ensaio de ligação a hGlucR descrito acima no Exemplo 3. As células são esti10 muladas com o análogo de peptídeo de OXM e o cAMP gerado dentro da célula é quantificado usando o Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (Alpha Screen) da Perkin Elmer (6760625R). Resumidamente, o cAMP induzido dentro da célula compete pela ligação do cAMP biotinilado do kit para uma esfera Aceptora revestida por um anticorpo anti-cAMP e 15 uma esfera Doadora revestida com estreptavidina. Como o nível de cAMP dentro da célula aumenta, ocorre uma ruptura do complexo esfera AceptoracAMP biotinilado-esfera Doadora e o sinal que é observado diminui.

As células hGcgR-HEK293 são coletadas a partir de discos de cultura de tecido sub-confluentes com Solução de Dissociação de Célula 20 sem Enzima (Specialty Media 5-004-B). As células são peletizadas em baixa velocidade e lavadas 3 vezes com tampão de ensaio [HEPES 25 mM em solução salina tamponada de Hank (HBSS) com Mg e Ca (GIBCO, 14025092) com BSA 0,1% sem ácido graxo] depois diluídas até uma concentração final de 125.000 células/ml. O cAMP biotinilado do kit Alpha Screen é adicio25 nado às células diluídas em uma concentração final de 1 unidade/0,04 ml.

Um inibidor da fosfodiesterase, IBMX (250 mM em dimetil sulfóxido (DMSO)), também é adicionado às células diluídas até uma concentração final de 500 uM. O glucagon é inicialmente dissolvido em HCI 0,01 N a 1 mg/ml e imediatamente congelado a -80°C. Depois do descongelamento, o glucagon 30 deve ser usado dentro de 1 h. O glucagon, cAMP de modelo e o análogo de peptídeo de OXM são diluídos em tampão de ensaio até uma concentração final de 6X. O ensaio funcional é realizado em Placas Costar (3688) de 96

I

22/34 poços, pouco volume, brancas, de poliestireno. A reação começa pela adição de 0,01 ml dos peptídeos, glucagon ou cAMP diluídos em 0,04 ml da mistura de célula. Depois de uma hora em temperatura ambiente, a reação é paralisada pela adição de 0,03 ml de Tampão de Lise [HEPES 10 mM, pH

7.4, NP40 1% e BSA 0,01% sem ácido graxo contendo 1 unidade de cada/0,03 ml de esferas Aceptora e Doadora do Kit Alpha Screen]. A adição do tampão de lise é realizada no escuro para evitar o branqueamento das esferas de detecção. As placas são envolvidas em folha de alumínio, cuidadosamente agitadas por 1 min depois deixadas equilibrar por uma noite em θ 10 temperatura ambiente. As placas são lidas em um instrumento Perkin-Elmer

Envision. As unidades Alpha Screen são convertidas em pmoles de cAMP gerados por poço com base na curva de cAMP padronizado. Os pmoles de cAMP gerados em cada poço são convertidos em um percentual de resposta máxima observada com o controle de glucagon. Um valor de EC50 é deriva15 do pela análise de regressão não linear usando o percentual de resposta máxima vs. a concentração do peptídeo adicionado. O análogo de peptideo de OXM de SEQ ID N°:3, em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada, como OXM do tipo selvagem, foi totalmente eficaz e potente em hGcgR com EC50 de 59,9 ± 4,14 nM.

Exemplo 6: Ensaio Funcional de cAMP estimulado pelo receptor do peptídeo similar ao glucagon (hGLP-1R)

O ensaio funcional de cAMP estimulado por GLP-1 usa a mesma linhagem celular clonada que expressa hGLP-1R como usada no ensaio de ligação descrito acima no Exemplo 4. As células são estimuladas com o aná25 logo de peptídeo de OXM e o cAMP gerado dentro da célula é quantificado usando o Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (Alpha Screen) da Perkin Elmer (6760625R). Resumidamente, o cAMP induzido dentro da célula compete pela ligação do cAMP biotinilado do kit para uma esfera Aceptora revestida por um anticorpo anti-cAMP e uma esfera Doadora revestida com estreptavidina. Como o nível de cAMP dentro da célula aumenta, ocorre uma ruptura do complexo esfera Aceptora-cAMP biotin iladoesfera Doadora e o sinal que é observado diminui.

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As células hGLP-1 R-HEK293 são coletadas a partir de discos de cultura de tecido sub-conf I uentes com Solução de Dissociação de Célula sem Enzima (Specialty Media 5-004-B). As células são peletizadas em baixa velocidade e lavadas 3 vezes com tampão de ensaio [HEPES 25 mM em 5 HBSS com Mg e Ca (GIBCO, 14025-092) com BSA 0,1% sem ácido graxo] depois diluídas até uma concentração final de 125.000 células/mL O cAMP biotinilado do kit Alpha Screen é adicionado às células diluídas em uma concentração final de 1 unidade/0,04 ml. Um inibidor da fosfodiesterase, IBMX (250 mM em DMSO), também é adicionado às células diluídas até uma con10 centração final de 500 uM. GLP-1 é armazenado a 1 mg/ml em PBS como alíquotas congeladas a -80°C. GLP-1, cAMP de modelo e o análogo de peptídeo de OXM são diluídos em tampão de ensaio até uma concentração final de 6X. O ensaio funcional é realizado em Placas Costar (3688) de 96 poços, pouco volume, brancas, de poliestireno. A reação começa pela adição de 15 0,01 ml do análogo de peptídeo de OXM, GLP-1 ou cAMP diluídos em 0,04 ml da mistura de célula. Depois de uma hora em temperatura ambiente, a reação é paralisada pela adição de 0,03 ml de Tampão de Lise [HEPES 10 mM, pH 7.4, NP40 1% e BSA 0,01% sem ácido graxo contendo 1 unidade de cada/0,03 ml de esferas Aceptora e Doadora do Kit Alpha Screen]. A adição 20 do tampão de iise é realizada no escuro para evitar o branqueamento das esferas de detecção. As placas são envolvidas em folha de alumínio, cuidadosamente agitadas por 1 min, depois deixadas equilibrar por uma noite em temperatura ambiente. As placas são lidas em um instrumento Perkin-Elmer Envision. As unidades Alpha Screen são convertidas em pmoles de cAMP 25 gerados por poço com base na curva de cAMP padronizado. Os pmoles de cAMP gerados em cada poço são convertidos em um percentual de resposta máxima observada com o controle de GLP-1. Um valor de EC₅₀ é derivado pela análise de regressão não linear usando o percentual de resposta máxima vs. a concentração do peptídeo adicionado. O análogo de peptideo de 30 OXM de SEQ ID N°:3, em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada, como OXM do tipo selvagem, foi totalmente eficaz e potente em hGLP-1 R com EC₅₀ de 2,75 ±0,55 nM.

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Exemplo 7: Efeitos sobre a ingestão de alimentos, peso corporal e composição corporal em camundongos com obesidade induzida pela dieta (PIO)

São usados camundongos C57BL/6 com três a quatro meses de idade machos com obesidade induzida pela dieta (DIO). Os animais são abrigados individualmente em uma instalação com temperatura controlada (24°C) com um ciclo de 12 horas de claro/escuro (luzes acesas 2200 horas) e com acesso livre ao alimento e água. Depois de duas semanas de aclimatação na instalação, os camundongos são randomizados em grupos de tratamento (n=8 - 10/grupo), cada grupo possuindo peso corporal médio e massa gorda similares. Antes do experimento, os camundongos são injetados por via subcutânea (sc) com uma solução de veículo e pesados por 2 dias para aclimatá-los aos procedimentos.

Veículo ou análogo de peptídeo de OXM (faixa de dose 6,7 a 20 nmoles/kg) dissolvidos em veículo são administrados por injeção sc a camundongos DIO alimentados ad libitum 30 a 90 minutos antes do início do ciclo de escuro a cada 3 dias por 2 a 4 semanas. O peso corporal e o peso do alimento mais o depósito alimentador são medidos ao mesmo tempo. O alimento consumido nas 24 horas precedentes é calculado pela subtração do peso atual mais o peso do depósito alimentador daquele do dia anterior. Alterações absolutas no peso corporal são calculadas pela subtração do peso corporal do animal antes da primeira injeção. Nos dias 1, 14 e 28 a massa gorda total é medida por ressonância nuclear magnética (RMN) usando um instrumento Echo Medical System (Houston, TX). A massa sem gordura é calculada pela subtração da massa gorda do peso corporal total.

Estudo 1: Tratamento de duas semanas

O análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada in vivo, é administrado por injeção subcutânea a C57BL/6 com 4 meses de idade machos com obesidade induzida pela dieta (DIO). O análogo de peptídeo de OXM é injetado uma vez a cada 3 dias por 2 semanas em doses de 7,5 e 15 nmoles/kg e comparado com os camundongos tratados com veículo e animais tratados como controles positivos (7,5 nmoles/kg de um agonista de GLP-1R de longa duração

25/34 injetado a cada 3 dias).

O tratamento com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada produziu uma redução dependente da dose na ingestão de alimento e no peso corporal. No final do período de estudo de 2 semanas, a ingestão de alimentos acumulativa no grupo com 15 nmoles/kg estava reduzida em 27% quando comparado com o grupo com veículo. A perda de peso acumulada no grupo tratado com 7,5 moles/kg foi similar aquela observada com o controle positivo, que era uma redução de cerca de 9% quando comparada com o grupo com veículo. A perda de peso acumulada do controle com veículo do grupo tratado com 15 nmoles/kg foi de 18%. A análise da composição corporal mostrou que a perda de peso era devido primariamente a perda de massa gorda (Tabela 1). Tabela 1

Perda de peso em camundongos DIO durante um período de tratamento de 14 dias (média ± SEM; n = 8)

Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°: 3 em que Cys(PEG20k) na posição 3d é amidada (nmole/kg)	Perda de peso global (g de alteração de peso por 14 dias)	Ingestão total de alimento (total em g por 14 dias)	Perda de massa gorda (g de alteração de peso de gordura por 14 dias)
0 (Veículo)	1,0 ±0,5	40,7 ± 1,3	0,3 ±0,3
7,5	-3,1 ±0,4*	35,0 ± 0,8*	-2,2 ± 0,3*
15	-6,1 ±0,9*	29,8 ± 1,5*	-3,9 ± 0,7*

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada diminuiu a ingestão acumulada de alimento e o peso corporal nos estudos com camundongos DIO por 14 dias, comparados com os camundongos tratados com veículo. O peso corporal reduzido foi devido primariamente a redução da massa gorda. *p <0,05 versus veículo (teste de Dunnett).

Estudo 2: Tratamento por quatro semanas

O análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que i

26/34

Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (6,7 ou 20 nmoles/kg) e o controle positivo (7,5 ou 22,5 nmoles/kg de um agonista de GLP-1R de ação prolongada) são administrados a cada 3 dias por injeção subcutânea a camundongos C57BL/6 machos com 4 meses de idade com obesidade induzida pela 5 dieta (DIO) por 4 semanas.

O tratamento com altas doses do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada diminuiu significativamente a ingestão acumulada de alimento. Em doses menores, o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na po10 sição 39 é amidada diminuiu o peso corporal em um grau similar ao visto no grupo de controle positivo. Na dose de 20 nmoles/kg, o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada causou uma perda de peso significativamente maior quando comparada com a dose 22,5 nmoles/kg do controle positivo. A redução máxima de peso (cer15 ca de 25% do peso corporal inicial) foi obtida depois de 15 dias de tratamento. A análise da composição corporal confirmou que a perda de peso associada com o análogo de peptídeo de OXM e o controle positivo foi devido primariamente a perda de massa gorda (Tabela 2).

O efeito do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em 20 que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada é avaliado posteriormente com a calorimetria indireta nos dias 21 a 23. Os animais trados com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (20 nmoles/kg) tiveram um gasto de energia significativamente maior do que os controles tratados com veículo (o gasto de energia médio 25 em 24 horas no dia 21 estava aumentado em 18%). O análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada não resultou em uma alteração significativa no nível da atividade motora em relação ao controle com veículo.

Na finalização do estudo, os níveis de insulina e colesterol no 30 plasma estavam significativamente mais baixos em todos os grupos tratados do que nos controles tratados com veículo enquanto que apenas o grupo tratado com uma dose alta de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3

27/34 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada teve os níveis de leptina significativamente reduzidos. Todos os grupos tratados tiveram níveis plasmáticos de adíponectina maiores do que os controles tratados com veículo, mas apena o grupo tratado com uma dose alta de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada teve uma diferença significativamente estatística.

Tabela 2

Alteração de peso em camundongos DIO durante um período de tratamento de 28 dias (média ± SEM; n = 9) .

Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°: 3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmole/kg)	Perda de peso global (g de alteração de peso por 28 dias)	Ingestão total de alimento (total em g para os primeiros 14 dias)	Perda de massa gorda (g de alteração de peso de gordura por 28 dias)
0 (Veículo)	0,8 ±0,2	39,2 ± 0,8	0,5 ±0,1
6,7	-2,0 ±0,4*	36,0 ± 1,1	-0,7 ± 0,2*
20,0	-11,1 ±0,9*	26,1 ± 1,4*	-7,5 ± 0,7*

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada diminuiu a ingestão acumulada de alimento e o peso corporal nos estudos com camundongos DIO por 28 dias, comparados com os camundongos tratados com veículo. O peso corporal reduzido foi devido primariamente a redução da massa gordurosa. *p <0,05 versus veículo (teste de Dunnett).

Exemplo 8: Efeito sobre a elevação rápida da glicose sanguínea durante um teste de tolerância a glicose oral ou um teste de tolerância a glicose intraperitoneal depois de duas semanas ou 4 semanas de tratamento em camundongos DIO, respectívamente

Cinquenta e seis horas depois da última injeção como descrito no Exemplo 7 (Estudo 1) em camundongos DIO, os camundongos são deixados em jejum por 16 horas antes do início do teste de tolerância à glicose. No tempo 0, são administrados aos animais 2g/kg de dextrose por gavagem

28/34 oral ou injeção intraperitoneal (IP). O sangue é coletado pelo sangramento da veia da cauda em 0, 15, 30, 60 e 120 minutos depois da administração da glicose. A concentração da glicose é medida pelo glicosímetro. Todas as doses do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada, assim como o controle positivo, reduziram significativamente a glicose sanguínea em todos os pontos de tempo medidos antes e depois da administração oral de glicose quando comparados com os controles tratados com veículo (Tabela 3).

Um teste de tolerância à glicose intraperitoneal é realizado nos dia 29, 3 dias depois da última injeção como descrito no Exemplo 7 (Estudo 2) em camundongos DIO. A dose baixa de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada diminui a glicose sanguínea de jejum em relação aquela dos controles tratados com veículo, mas teve pouco efeito sobre os níveis de glicose depois da injeção IP de glicose. O dose alta de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada e ambas as doses do controle positivo diminuíram significativamente a glicose sanguínea em todos os pontos de tempo, medida antes e depois da injeção IP de glicose quando comparada com os controles tratados com veículo (Tabela 4).

Tabela 3

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre a elevação rápida da glicose sanguínea depois da administração de uma carga oral de glicose

Dados fornecidos como área sob a curva de glicose

(= valores integrados de	t + 0 a 120 min) (n = 8)
Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Glicose AUC (mg*min/dL)
MÉDIA	SEM
0 (Veículo)	27771	1434
7,5	17722*	1009
15	17518*	1686

29/34

Esses dados mostram que depois de um tratamento de 2 semanas em camundongos DIO com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada houve uma redução significativa na elevação rápida da glicose sanguínea depois de uma carga oral de glicose. Significância estatística avaliada pelo teste de Dunnett (8p<0,05 vs. veículo).

Tabela 4

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre a elevação rápida da glicose sanguínea depois da administração de uma carga intraperitoneal (ip) de glicose

Dados fornecidos como área sob a curva de glicose (- valores integrados de t+ 0 a 120 min) (n = 6)

Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Glicose AUC (mg*min/dl)
MÉDIA	SEM
0 (Veículo)	35518	1969
6,7	30073	3389
20,0	19264*	1894

Esses dados mostram que depois de um tratamento de 4 semanas em camundongos DIO com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada houve uma redução significativa na elevação rápida da glicose sanguínea depois de uma carga intraperitoneal (ip) de glicose. Significância estatística avaliada pelo teste de Dunnett (*p<0,05 vs. veículo).

Exemplo 9: Efeitos sobre a elevação rápida da glicose sanguínea durante um teste de tolerância a glicose intraperitoneal em camundongos magros

São usados no estudo camundongos C57BL/6 machos com nove semanas de idade. Os animais são randomizados em grupos com base no peso corporal, os animais são injetados com veículo ou análogo de peptí

30/34 deo de OXM (dose de 5,1 a 15,0 nmoles/kg) 16 h antes do início do teste. O alimento é retirado no momento da injeção do peptídeo ou veículo. No momento 0, os animais são injetados com 2 g/kg de dextrose por injeção IP. O sangue é coletado pela punção da veia da cauda com 0, 3, 6, 12 e 30 minu5 tos depois da inoculação de glicose. A concentração de glicose é medida pelo glicosímetro. A insulina é medida por Mesoscale.

A dose alta de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada diminuiu significativamente a elevação rápida da glicose sanguínea quando comparada com os controles 10 tratados com veículo (Tabela 5). Ambas as doses do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada aumentaram significativamente a insulina plasmática quando comparada com os controles tratados com veículo (Tabela 6).

Tabela 5

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que

Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre a elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip) em camundongos magros

Dados fornecidos como área sob a curva de glicose (= valores integrados de t + 0 a 30 min) (n = 6)________________

Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Glicose AUC (mg*mín/dL)
MÉDIA	SEM
Veículo	8718	496
5	7059	476
15	6103*	530

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de

SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada reduziu significativamente a elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip) em camundongos magros. Significân25 cia estatística avaliada pelo teste de Dunnett (*p<0,05 vs. veículo).

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Tabela 6

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre o nível de insulina plasmática depois de um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip) em camundongos magros

Dados fornecidos como área sob a curva de insulina (= valores integrados de insulina no plasma de t + 0 a 30 min) (n = 6)

Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Insulina AUC (ng*min/ml)
MÉDIA	SEM
0 (Veículo)	8,14	1,13
5	30,67*	4,76
15	45,26*	6,78

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada aumentou significativamente a AUC da insulina no plasma depois de um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip) em camundongos magros. Significância estatística avaliada pelo teste de Dunnett (*p<0,05 vs. veículo).

Exemplo 10: Efeitos sobre a elevação rápida da glicose durante um teste de tolerância a glicose oral (OGTT) ou um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip) (IPGTT) em camundongos ob/ob

Camundongos ob/ob machos com dois a três meses de idade são abrigados individualmente em uma instalação com temperatura controlada (24°C) com ciclo de 12 horas de claro/escuro (luzes acesas 2200 horas) e com acesso livre a ração padronizada e água. Depois de 2 semanas de aclimatação na instalação, a glicose sanguínea de jejum de 3 horas é medida pela sangria da veia da cauda às 9 AM. Os camundongos com glicose sanguínea abaixo de 180 mg/dL não são usados. Os animais restantes são randomizados em grupos de tratamento (N= 6-7/grupo), cada grupo possu

32/34 indo um nível médio similar de glicose sanguínea. Os camundongos têm livre acesso ao alimento até o momento da injeção. Os animais são injetados com veículo ou com 7,5 nmoles/kg de análogo de peptídeo de OXM às 4 PM do mesmo dia. O alimento é retirado no momento da injeção. Um OGTT (Tabela 7) ou IPGTT (Tabela 8) é realizado 16 horas depois da injeção do peptídeo. No tempo 0, os animais são administrados com 2 g/kg de dextrose por gavagem oral (Tabela 7) ou injeção intraperitoneal (Tabela 8). O sangue é coletado pela sangria da veia da cauda em 0, 15, 30, 60 ou 120 minutos depois da injeção da glicose. A concentração da glicose é medida por glicosímetro.

Uma única injeção do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada normalizou a glicose sanguínea em camundongos ob/ob. Os níveis de glicose sanguínea em todos os pontos de tempo medidos depois da injeção de glicose eram significativamente menores do que no grupo de controle com veículo.

Tabela 7

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre a elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de tolerância a glicose oral em camundongos ob/ob

Dados fornecidos como área sob a curva de glicose

(= valores integrados de t+	3 a 120 min) (n = 7)
Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Glicose A	UC (mg*min/dl)
MÉDIA	SEM
0 (Veículo)	23938	1629
7,5	12266*	1215

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de

SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada reduziu significativamente elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de

33/34 tolerância glicose oral em camundongos ob/ob. Significância estatística avaliada pelo teste de Dunnett (*p<0,05 vs. veículo).

Tabela 8

Efeitos do análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada sobre a elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de tolerância a glicose intraperitoneal (ip/ip) em camundongos ob/ob

Dados fornecidos como área sob a curva de glicose

(= valores integrados de t+	3 a 120 min) (n = 6)
Dose de análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada (nmoles/kg)	Glicose AUG (mg*min/dL)
MÉDIA	SEM
0 (Veículo)	37894	1482
7,5	18878*	3224

Esses dados mostram que o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada reduziu significativamente elevação rápida da glicose sanguínea depois de um teste de tolerância glicose intraperitoneal (íp) em camundongos ob/ob. Significância estatística avaliada pelo teste de Dunnett (*p<0,05 vs. veículo).

Exemplo 11: Efeitos agudos sobre FGF21 plasmático, níveis de triglicerídeos e expressão de gene hepático em camundongos C57BL/6 machos com obesidade induzida pela dieta

A fim de investigar as vias metabólicas que são moduladas pelo tratamento com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada independente da perda de peso, o análogo de peptídeo de OXM e um controle positivo (um agonista de GLP1R de ação prolongada) são administrados por injeção subcutânea a camundongos machos com três meses de idade com obesidade induzida pela dieta (DIO). No dia anterior ao estudo, os camundongos são randomizados em grupos de tratamento (N = 7/grupo), cada grupo possuindo peso corporal

34/34 médio similar. Nessa mesma noite (aproximadamente 10 PM), os animais são colocados em gaiolas limpas e tratados com veículo ou análogo de peptídeo de OXM por injeção subcutânea. O análogo de peptídeo de OXM e os controles são tratados com 22,5 nmoles/kg. O alimento é removido no mo5 mento da injeção de veículo ou peptídeo. Na manhã seguinte (aproximadamente 10 AM), os animais são sacrificados para coletar plasma e tecido do fígado. As concentrações de glicose e triglicerídeos são medidas usando um analisador de química sanguínea Hitachi. A expressão de gene é determinada por RT-PCR. Os níveis de malonil-CoA e acetíl-CoA são medidos por 10 HPLC.

Depois de uma única injeção, a glicose plasmática estava significativamente diminuída em relação ao controle com veículo em todos os grupos de tratamento. O nível de triglicerídeos plasmáticos estava diminuído em relação ao controle com veículo apenas nos camundongos tratados com 15 o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada, mas não naqueles tratados com o agonista de GLP1R de ação prolongada. As concentrações hepáticas de malonil-CoA e acetil-coA estavam significativamente diminuídas em 63% e 39%, respectivamente versus o controle com veículo, depois do tratamento com o análogo 20 de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada. O tratamento com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada alterou a expressão de vários genes hepáticos incluindo um aumento na expressão do gene pgc-1o em 7 vezes e uma diminuição na expressão do gene de ChREBP e PCSK9 25 em 52% e 61%, respectivamente. Em adição, a expressão do gene de FGF21 foi induzida em 17 vezes, correspondendo a um aumento de 6 vezes no FGF21 circulante depois do tratamento agudo com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada. Todas essas alterações foram específicas para os camundongos tratados 30 com o análogo de peptídeo de OXM de SEQ ID N°:3 em que Cys(PEG20k) na posição 39 é amidada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos:

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-LeuAsp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-ArgAsn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala- Xaa38-Xaa39 (SEQ ID N°: 5), sendo que Xaa38 é Cys, Cys-PEG, ou está ausente; Xaa39 é Cys, Cys-PEG, ou está ausente; e sendo que o aminoácido C-terminal é opcionalmente amidado.
2. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos:

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-LeuAsp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-ArgAsn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys (SEQ ID N°: 2), sendo que o resíduo de Cys na posição 38 é opcionalmente PEGuilado; e sendo que o resíduo de Cys na posição 39 é opcionalmente PEGuilado; e o grupo carboxila da Cys na posição 39 é opcionalmente amidado.
3. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o análogo é PEGuilado com uma molécula de PEG com aproximadamente 40 kDa acoplada ao grupo tiol do resíduo de Cys na posição 38 ou na posição 39.
4. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o análogo é PEGuilado sobre o tiol de ambos os resíduos de Cys nas posições 38 e 39 com uma molécula de PEG com aproximadamente 20 kDa em cada caso e compreende a sequência de aminoácidos:

His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-LeuAsp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-ArgAsn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K) (SEQ ID N°: 3),

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2/3 sendo que o grupo carboxila da Cys PEGuilada na posição 39 é opcionalmente amidado.
5. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de PEG é linear.
6. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o grupo carboxila do resíduo de Cys na posição 39 é opcionalmente amidado.
7. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de Cys na posição 39 está ausente e o resíduo de Cys na posição 38 é PEGuilado com uma molécula de PEG de aproximadamente 40 kDa e é opcionalmente amidado.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um análogo de peptídeo de Oxintomodulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um análogo de peptídeo de Oxintomodulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, junto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos.
10. Uso de uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento utilizável no tratamento de diabetes não insulinodependente em um indivíduo necessitado.
11. Uso de uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento utilizável no tratamento de obesidade em um indivíduo necessitado.
12. Uso de uma quantidade eficaz de um análogo de peptídeo de Oxintomodulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

Petição 870190076187, de 07/08/2019, pág. 9/21

3/3

7, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento utilizável no tratamento de diabetes não insulinodependente ou obesidade em um indivíduo necessitado.
13. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com 5 qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
14. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de diabetes não insulinodependente.

10
15. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de obesidade.
16. Análogo de peptídeo de Oxintomodulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para 15 uso no tratamento de diabetes não insulinodependente ou obesidade.