EA021588B1 - Бетаиновые соли ацетилсалициловой кислоты - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены бетаиновые соли ацетилсалициловой кислоты, а именно аддитивная соль 4-триметиламмонийбутаноата и ацетилсалициловой кислоты, аддитивная соль L-карнитина и ацетилсалициловой кислоты, аддитивная соль 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (мелдоний) и ацетилсалициловой кислоты. Применение аддитивной соли 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (мелдоний) и ацетилсалициловой кислоты в качестве антитромбоцитарного средства для лечения различных патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов, противовоспалительного и антигиперлипидемического средства.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение в основном относится к солям ацетилсалициловой кислоты и в особенности к новым и полезным водорастворимым солям ацетилсалициловой кислоты и к способу их получения.

Ацетилсалициловая кислота представляет собой широко употребляемый лекарственный препарат, главным образом известный своими аналитическими свойствами. Область применения ацетилсалициловой кислоты существенно ограничивается ее малой растворимостью в воде (приблизительно 0,3%). Кроме Ы, Ыа, Мд и кальциевых солей, раскрыт ряд солей с основными аминокислотами (И8 4625888). Каждой из указанных солей присущи определенные достоинства и недостатки, поэтому предпочтительно иметь в распоряжении новые соли ацетилсалициловой кислоты с потенциально более выгодными характеристиками.

Поскольку сами соединения типа бетаина, входящие в класс новых солей ацетилсалициловой кислоты, обладают различной фармакологической активностью, указанные новые соли ацетилсалициловой кислоты могут иметь полезные свойства в дополнение к свойствам ацетилсалициловой кислоты или бетаинов, в том числе новую фармакологическую активность.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является получение нового типа солей ацетилсалициловой кислоты с определенными соединениями типа бетаина. Неожиданно и непредсказуемо было обнаружено, что сами соли ацетилсалициловой кислоты с определенными бетаинами являются гигроскопическими веществами, которые образуют стабильные, водорастворимые кристаллические соли.

Следовательно, целью настоящего изобретения является получение солей ацетилсалициловой кислоты, которые имеют высокую растворимость в воде и в то же время обладают исключительной стабильностью и большим сроком хранения. Кроме этого целью настоящего изобретения является разработка способа получения указанной соли.

Другой целью настоящего изобретения является получение мелдониевой соли ацетилсалициловой кислоты (ацетилсалицилат З-(триметиламмонийамино)пропаноата) для применения в качестве лекарственного средства.

Целью настоящего изобретения является также получение лекарственного продукта, а именно ацетилсалицилат 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (ацетилсалицилат мелдония), обладающего противовоспалительными, аналгетическими, жаропонижающими, противоревматическими, антигиперлипемическими, антиатеросклеротическими, антиагрегационными и антитромботическими свойствами. Также целью настоящего изобретения является способ лечения субъекта, который нуждается в противовоспалительной, аналгетической, жаропонижающей, противоревматической, антигиперлипемической, антиатеросклеротической, антиагрегационной и антитромботической терапии. Дополнительной целью изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей ацетилсалицилат мелдония (МА8А) для указанной выше цели. Кроме этого, другие цели изобретения станут очевидными в дальнейшем для специалиста в этой области техники.

Описание предпочтительных вариантов изобретения

Далее следуют примеры различных солей и способов настоящего изобретения и их характеристики.

Пример 1. Ацетилсалицилат 4-триметиламмонийбутаноат.

Дигидрат гамма-бутиробетаина (1,81 г, 10 ммоль) и ацетилсалициловую кислоту (1,80 г, 10 ммоль) растворяют в этаноле (20 мл). Раствор концентрируют в вакууме приблизительно при 40°С до состояния сиропа, который кристаллизуется при охлаждении. Кристаллическую массу растирают с ацетоном (50 мл), фильтруют, промывают ацетоном и сушат в вакууме при комнатной температуре. Выход бесцветных кристаллов с температурой плавления 120-122°С составляет 3,04 г (93,5%). Полученное вещество растворимо в воде и стабильно в условиях окружающей среды.

Спектр 'ΐ I ЯМР (Ό₂Θ, стандарт - ТМС) δ: 1,93-2,12 (2Н, м, СН₂СН₂СН₂); 2,33 (3Н, с, СОСН₃); 2,40 (2Н, т, 1=7,0 Гц, СН₂СОО-); 3,09 (9Н, с, СН₃Ы); 3,14-3,37 (2Н, м, СН₂Ы); 7,16 (1Н, дд, 1=1,1 и 8,1 Гц, Н-3); 7,38 (1Н, ддд, 1=1,1, 7,6 и 7,6 Гц, Н-5); 7,56 (1Н, ддд, 1=1,8, 7,6 и 8,1 Гц, Н-4); 7,79 м.д. (1Н, дд, 1=1,8 и 7,6 Гц, Н-6). С1₆Н₂₃ЫО₆: Вычислено, %: С 59,07; Н 7,13; N 4,30, Найдено, %: С 59,17; Н 7,10; N 4,13.

Новая соль охарактеризована методом порошковой рентгенограммы (излучение Си Κ_α), в которой имеются пики при углах 2θ: 5,10, 13,58, 13,83, 15,02, 15,17, 17,89, 19,33, 19,87, 21,85, 22,05, 23,32, 23,56, 23,92, 24,75, 25,55, 25,80, 27,05, 27,91, 30,25±0,2°. Структура указанной новой соли подтверждена методом рентгеноструктурного анализа монокристалла (см. ниже). Кристаллы являются моноклинными, при температуре эксперимента Т=-85°С параметры ячейки имеют значения: а=13,1154(6) А, Ь=7,5092(3) А, с=17,6451 (9) А, β=104,728(2), объем ячейки У=1693,5(1) А3, пространственная группа Р21/а.

- 1 021588

Ниже указан фрагмент кристаллической структуры ацетилсалицилата 4-триметиламмонийбутаноата

Пример 2. Ацетилсалицилат Ь-карнитина.

Ь-Карнитин (1,61 г, 10 ммоль) и ацетилсалициловую кислоту (1,80 г, 10 ммоль) растворяют в этаноле (20 мл). Раствор концентрируют в вакууме приблизительно при 40°С до состояния сиропа, который кристаллизуется при охлаждении. Кристаллическую массу растирают с ацетоном (50 мл), фильтруют, промывают ацетоном и сушат в вакууме при комнатной температуре. Выход бесцветных кристаллов с температурой плавления 90-94°С составляет 3,17 г (93%). Вещество растворимо в воде и стабильно в условиях окружающей среды. Спектр 'Н ЯМР (Ό₂Ο, ТМС) δ: 2,32 (3Н, с, СОСН₃); 2,53 (2Н, ά, 1=6,6 Гц, СН₂СОО-; 3,18 (9Н, с, СН₃Ы); 3,38-3,45 (2Н, м, СН₂Ы); 4,59 (1Н, квинт., 1=6,1 Гц, СНОН); 7,15 (1Н, дд, 1=1,1 и 8,1 Гц, Н-3); 7,37 (1Н, ддд, 1=1,1, 7,6 и 7,6 Гц, Н-5); 7,56 (1Н, ддд, 1=1,8, 7,8 и 7,8 Гц, Н-4); 7,79 м.д. (1Н, дд, 1=1,8 и 7,8 Гц, Н-6). С₁₆Н₂₃ЫО₇. Вычислено, %: С 56,30; Н 6,79; N 4,10, Найдено, %: С 55,67; Н 6,85; N 4,12.

Новая соль охарактеризована методом порошковой рентгенограммы (излучение Си Κ_α), в которой имеются пики при углах 2θ: 5,09, 12,62, 13,48, 13,84, 15,04, 17,82, 19,15, 19,77, 21,84, 22,56, 23,33, 23,92, 24,40, 25,17, 25,43, 26,14, 27,14, 29,50, 30,36±0,2°. Структура указанной новой соли подтверждена методом рентгеноструктурного анализа монокристалла (см. ниже). Кристаллы являются моноклинными, при температуре эксперимента Т=-85°С параметры ячейки имеют значения: а=13,1342(6) А, Ь=7,6396(3) А, с=17,737(1) А, β=104,535(2), объем ячейки ν=1722,8(2) А3, пространственная группа Р21/а.

Ниже указан фрагмент кристаллической структуры ацетилсалицилата Ь-карнитина

Пример 3. Ацетилсалицилат 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (ацетилсалицилат мелдония).

Растворяют дигидрат 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (ΙΝΝ - Мелдоний) (3,64 г, 20 ммоль) и ацетилсалициловую кислоту (3,60 г, 20 ммоль) в горячем пропаноле-2 (30 мл) и нагревают при 50-55°С в течение 20 мин. Прекращают нагревание и раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Суспензию перемешивают дополнительно при 0°С еще 3 ч, отфильтровывают осадок и промывают его холодным пропанолом-2 (2 раза по 15 мл). Указанную соль подвергают перекристаллизации из пропанола-2. Получают бесцветные кристаллы с температурой плавления 104-106°С. Выход 4,12 г (63%). Спектр 'ΐ I ЯМР (Ό₂Ο, ТМС) δ: 2,34 (3Н, с, СОСН₃); 2,51 (2Н, т, 1=6,4 Гц, СН₂СОО-; 3,16 (2Н, т, 1=6,4 Гц, СН₂Ц); 3,33 (9Н, с, СН₃Ц); 7,17 (1Н, дд, 1=1,1 и 7,8 Гц, Н-3); 7,39 (1Н, ддд, 1=1,1, 7,6 и 7,6 Гц, Н-5); 7,58 (1Н, ддд, 1=1,7, 7,6 и 7,8 Гц, Н-4); 7,81 м.д. (1Н, дд, 1=1,7 и 7,6 Гц, Н-6). С 5 ЬЛО... Вычислено, %: С 55,11; Н 6,79; N 8,58. Найдено, %: С 55,15; Н 6,79; N 8,53.

Новая соль охарактеризована методом порошковой рентгенограммы (излучение Си Κ_α), в которой имеются пики при углах 2θ: 5,19, 13,12, 13,82, 14,10, 14,95, 15,36, 15,93, 18,11, 18,97, 19,74, 21,02, 22,15, 23,15, 23,65, 24,31, 25,18, 26,18, 26,58, 27,73, 28,36±0,2°.

Структура указанной новой соли подтверждена методом рентгеноструктурного анализа монокристалла (см. ниже). Кристаллы являются моноклинными, при температуре эксперимента Т=-85°С параметры ячейки имеют значения: а=19,3399(8) А, Ь=7,1400(3) А, с=35,137(2) А, β=90,758(2), объем ячейки ν=4933,5(4) А3, пространственная группа Р21/п.

- 2 021588

Ниже указан фрагмент кристаллической структуры ацетилсалицилата 3-(триметиламмонийамино)пропаноата

Фармакологические свойства ацетилсалицилата 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (ацетилсалицилат мелдония). Предусматривается, что новое вещество, раскрытое в указанном изобретении, может принимать различные полиморфные кристаллические формы и сольваты, предпочтительно гидраты, которые обладают подобными биологическими свойствами и поэтому включены в это изобретение в качестве вариантов описанного вещества.

Первоначально авторы установили, что ацетилсалицилат мелдония замедляет и существенно снижает расширение кожных кровеносных сосудов, вызванное никотиновой кислотой. Дальнейшие эксперименты продемонстрировали неожиданное улучшение фармакологической активности ацетилсалицилата мелдония.

Использованные сокращения.

Для краткости в описании будут использоваться следующие сокращения:

АбА - стимулятор артрита,

Ά8Ά - ацетилсалициловая кислота,

С - холестерин,

ΟΗΌ - ишемическая болезнь сердца,

С1С - циркулирующие иммунные комплексы,

СЬ - клопидогрел,

СКР - С-реактивный белок,

ΌΙ-дипиридамол,

НЭБ- липопротеин-холестерин высокой плотности,

ЬА - ларопипрант,

БГОБ - липопротеин-холестерин низкой плотности,

МА8А - ацетилсалицилат мелдония (химически: ацетилсалицилат 3-(триметиламмонийамино)пропаноата,

ΜΌ - мелдоний (ΙΝΝ),

ΝΑ - никотиновая кислота, ниацин,

КА - ревматоидный артрит,

ТО - триглицерид,

ТК - Тритон №К1339, \УВС - лейкоциты.

Вещества.

NΑ (фирма Асго8 СНсписаК). ΜΌ (Огшбех), А8А (Асгок СНсписаК). ЬА (МК 0524, Саутап СЬеш1са1с), гидросульфат клопидогрела для испытаний ίη νίίτο (Мо1еап Согрогабоп), СЬ для испытаний ίη νίνο в виде Р1ау1х™ (8апоП-Ауеп115), ΌΙ (§1дта-А1бпсЬ).

История вопроса.

Ацетилсалициловая кислота представляет собой наиболее широкоупотребляемый лекарственный препарат, хорошо известный своими противовоспалительными, аналгетическими, жаропонижающими и противоревматическими свойствами. В малых суточных дозах А8А также применяется в качестве антитромбоцитарного средства для пациентов с риском сердечно-сосудистого заболевания (ЕШейпап К.8. и др., Агсй. 1п1егп. Меб., 2003; 163: 2006-2010). Тромбоциты играют главнейшую роль в развитии атеросклероза и неизбежного образования тромба в ходе ишемической болезни сердца. Антитромбоцитарные средства становятся первостепенными для предупреждения и терапии различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, цереброваскулярных и периферических артериальных систем (Меабо\\ъ Т.А. и др., Скс. Ке8., 2007; 100(9): 1261-75).

Несмотря на многолетнюю известность в качестве антитромбоцитарного агента, теперь А8А приобретает большее признание в кардиологии благодаря своим противовоспалительным свойствам (Ыбкег Р.М. и др., Ν. Епд1. 1. Меб., 1997; 336:973-979). Следовательно, клинические измерения таких воспалительных маркеров, как С-реактивный белок (СКР), частично могут отражать показатели атеросклероза (Виск1еу Ό.Ι. и др., Апп. 1п1егп. Меб., 2009; 151:483-495).

Современные данные указывают, что уменьшение содержания СКР предупреждает явления ΟΗΌ (Шбкег Р.М. и др., БапсеГ 2009; 373:1175-82). Ко88 предположил, что атеросклероз является воспали- 3 021588 тельным заболеванием (Ко88 К., N. Епд1. 1. Меб., 1999; 340:115-126). Ацетилсалициловая кислота может не только влиять на воспалительный аспект атеросклероза, но также может давать непосредственный вклад, стимулируя понижение содержания липидов (Коигоипак18 А.Р. и др., Ехрептейа1 апб Мо1еси1аг Ра1Ьо1оду, 2002, 73:135-138).

Ниацин (ΝΑ) представляет собой эффективный агент, изменяющий содержание липидов, который предупреждает атеросклероз и ослабляет сердечно-сосудистые явления. ΝΑ оказывает разнообразные эффекты на липопротеин и противодействует тромбозу артерии, улучшая эндотелиальную функцию, ослабляет воспаление, повышает стабильность тромбоцитов и снижает вероятность тромбоза (Ко8еп8оп К.С., А1Ьего8с1его818, 2003; 171:87-96).

ΝΑ почти полностью предупреждает внутрисосудистое свертывание крови, вызванное тромбопластином и питуитрином, что демонстрирует тромболитический эффект ниацина (Ва1иба У.Р., Кардиология, 1974; 14(11): 105-7 (рус.). Противотромболитические свойства ΝΑ описаны несколькими авторами (8Ье81акоу ν.Α., Пробл. Гематол. Перелив. Крови, 1977; 22(8):29-35, СЬекаЬпа 8.Ι., 8оу. Меб. 1982(5): 105-8). Никотиновая кислота снижает риск свертывания крови (СЬе8пеу С.М. и др., Αт. Неай 1., 2000; 140:631-36).

Ниацин ингибирует агрегацию тромбоцитов (Ьакш К.М., Фармакол. Токсикология, 1980; 43(5):5815). Вне организма ΝΑ влияет на активность тромбоцитов, умеренно ингибируя агрегирование и стимулируя значительное выделение простагландина с главным образом интактной экспрессией главного рецептора тромбоцитов. Влияние ΝΑ является уникальным, отличаясь от известного эффекта антитромбоцитарных средств, и позволяет предположить возможность терапевтических комбинаций (8егеЬгиапу МЬ. и др., ТйготЬо818 апб Наето81а818, 2010 (в печати)).

ΝΑ является эффективным агентом, изменяющим содержание липидов, что предупреждает появление атеросклероза и ослабляет сердечно-сосудистые явления (Игехе1 Н., Еигореап Неай 1оигпа1 8ирр1етей8, 2006; ^1. 8, 8ирр1. Ρ: Р23-Р29, 8ауе1'еу Α.Α., 8Ьег8Йеу8ки М.О., Клин. Мед. (рус.), 1996; 74:48-52).

Доступны три рецептуры ΝΑ (с непосредственным выделением, с продленным выделением и длительного действия). Непосредственно выделяющийся ΝΑ ассоциирован с неблагоприятным приливом крови и повышением содержания глюкозы в крови. ΝΑ длительного действия ассоциирован с пониженным приливом крови, но также с риском гепатотоксических эффектов. Продленное выделение сопряжено с меньшим приливом крови и низким гепатотоксическим риском (МсКеппеу 1., ΑιόΙι. 1п1егп. Меб., 2004; 164(7):697-705).

Клиническое применение ΝΑ ограничивается кожным приливом крови. Продленное выделение никотиновой кислоты может способствовать регулированию явлений прилива крови (Оиу1оп ТК. и др., 1. С1ш. Ыр1бо1., 2009; 3: 101-108). Для регулирования прилива крови были предложены Α8Α и другие нестероидные противовоспалительные препараты (Ν8ΑΙΌ) с другими фармацевтическими композициями, чтобы обеспечить улучшение использования Ν8ΑΙΌ до дозировки ΝΑ (\УО9632942. \УО9906052. ^02009142731).

Недавно был предложен специфический антагонист для простагландина И2 (РагЬоГег К.О., Vа8си1а^ НеаЬЬ и К18к Мападетей, 2009;5:901-908) рецепторный подтип 1, ларопипрант, в качестве средства для снижения прилива крови, вызванного ΝΑ (Ьа1 Е. и др., С1ш. РЬагт. ТЬег., 2007; 81:849-857, Иау1б8оп М.Н., Α^ 1. Сагбю1., 2008; 101 [8ирр1]:14В-19В).

Хотя добавление ларопипранта будет снижать частоту прилива крови, ΕΑ не может полностью исключить указанный побочный эффект. Ларопипрант не изменяет действие никотиновой кислоты на липиды или другие побочные эффекты никотиновой кислоты. Следовательно, комбинация никотиновой кислоты с ларопипрантом может обеспечить использование более высоких доз никотиновой кислоты и поэтому раскрывается полный потенциал лекарственного препарата (РагЬоГег К.О., Vа8си1а^ НеаЬЬ апб К18к Мападетей, 2009; 5:901-908, О188оп Α.Ο., Ехрей Ор1йоп оп РЬагтасо(Ьегару, 2010; 11(10): 77751726).

Мелдоний представляет собой лекарственный препарат с определенным полезным воздействием на сердце и сосуды. Некоторая желательная активность МИ была обнаружена на животных моделях атеросклероза Шеуеп8 М., 8тЙ8ага.)а В., ВаШс 1. ЬаЬ. Απίπι. 8сг, 2000; 10,194-199, Vеνе^^8 М. и др., ВаЫс 1. ЬаЬ. Απίπι. 8сг, 2002; 12:116-122, ОкипеуюЬ Ι.ν., Ку/Ьепкоу МЕ., Патол. Физиол. Эксп. Тер., 2002; (2):24-7) и наблюдалась в клиниках (Кагроу К.8. и др., Тер. Арх., 1991; 63(4):90-3). Кроме того, было отмечено, что МИ ингибирует агрегацию тромбоцитов (Т81гк1п ν.Ι., Рос. Кардиол. ж., 2002; 1: 45-52). При двухнедельном терапевтическом применении перорального введения МИ кроликам и собакам, после экспериментального артериального тромбоза обнаружен тромболитический эффект (Ьодипоуа Ь. и др., Экспер. клин, фармакотер., 1991; 19:91-98 (рус.). Данные о профилактическом эффекте МИ для ограничения или предупреждения тромбоза не известны.

Пример 4. Определение острой токсичности МΑ8Α.

Острую токсичность МΑ8Α определяют на крысах \У181аг и мышах ЮК при пероральном введении.

Методика.

Используют самцов мышей ГКС с массой тела 20-22 г и крыс ^181аг, имеющих массу 200-230 г. Для определения острой токсичности каждую дозу дают 6 животным, при этом каждую следующую дозу

- 4 021588 увеличивают на 500 мг/кг. Значение ЬП₅₀ вычисляют по КагЬег с использованием метода Ак1й1а 1.8. и др. Сиггеп! 8οί. 2007; 93:917-920 с модификацией для определения доверительного интервала дозы (Тигпег К. В книге Методы тестирования в фармакологии 8сгеешп§ МеОюйв ίη РЬагтасо1о§у, Асай. Ргекк, №\ν Уогк, 1965, 61-63).

Значение ЬИ₅₀ рассчитывают следующим образом:

ЬП₅₀=наименьшая летальная доза для всех животных группы - Х(ахЬ)/Ы,

N - количество животных в каждой группе, а - разность доз,

Ь - средняя смертность (летальность в двух соседних группах/2).

МА8А растворяют немедленно в 0,2% агар-агаре и вводят перорально в желудок через катетер. Объем введенной таким образом жидкости не превышал 0,5 мл для мышей и 2 мл для крыс. Животных наблюдают в течение 10 суток после введения дозы.

Результаты.

Результаты относительно острой токсичности МА8А для мышей представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Острая токсичность МА8А для мышей (перорально п/о)

Группа	Доза, мг/кг (п/о)	Количество животных в группе (Ν)	Летальность (П)	Средняя смертность (Ь)	Пробит
1	1000	6	0
2	1500	6	1	0,5	250
3	2000	6	2	1,5	750
4	2500	6	4	3	1500
5	3000	б	б	5	2500

ГЮ.,, 3000 - (5000/6)=2167.

Коэффициент ί при Р=0,05 для указанного эксперимента равен 1,32, следовательно, доверительный интервал для ПК, составляет 1642-2860 (мг/кг).

После введения МА8А токсическое действие проявляется в течение первых часов, причем часть животных умирают в течение первых 2 суток. Симптомы токсичности у выживших животных постепенно ослабевают и спустя 5-8 суток эти животные не отличаются от контрольных особей такого же возраста. Таким образом, найдено, что значение ЬП₅₀ для МА8А (на мышах п/о) составляет 2167 (1642-2860) мг/кг.

Результаты.

Результаты острой токсичности МА8А для крыс п/о представлены в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Острая токсичность МА8А для крыс (п/о)

'руппа	Доза, мг/кг (п/о)	Количество животных в группе (Ν)	Летальность (п)	Средняя смертность (Ь)	Пробит
1	1500	е	0
2	2000	6	2	1	500
3	2500	6	4	3	1500
4	3000	6	6	5	2500

Ш0=3000 - (4500/6)=2250.

Ш0=3000 - (4500/6)=2250.

Коэффициент ί при Р=0,05 для указанного коэффициента равен 1,308, следовательно, доверительный интервал для ПК, составляет 1720-2944 (мг/кг).

Введение п/о дозы 1500 мг/кг МА8А крысам вызывает кратковременное нарушение особенностей питания и движения, но животные выживают. Токсические симптомы начинают исчезать на третьи сутки после введения. Таким образом, найдено, что значение ЬП₅₀ для МА8А (на крысах п/о) составляет 2250 (1720-2944) мг/кг.

Сводка.

Исследование острой токсичности продемонстрировало, что МА8А представляет собой вещество с низкой токсичностью (ΙΠ, > 2000 мг/кг для мышей и крыс, п/о). Острая токсичность для А8А по данным фирм Воекппдег 1п§е1Ье1т Ркагтасеийса1с, 1пс., Асгов СкеппсаЬ и 8щта-А1йпск составляет 250 мг/кг для мышей и 200 мг/кг для крыс п/о, хотя фирма Вауег АО приводит значение ЬП₅₀ для крыс п/о более 1100 мг/кг и, таким образом, МА8А является менее токсичным, чем А8А.

Таблица 3

Острая токсичность МА8А для мышей и крыс; N=6

Животные	Ю50 мг/кг, п/о (доверительный интервал)
Мыши	2167(1642-:-2860)
Крысы	2250 (1720-:-2944)

Пример 5. Исследование аналгетической жаропонижающей и противовоспалительной активности МА8А в сравнительных экспериментах с А8А и МИ.

При исследовании аналгетического, противовоспалительного и жаропонижающего действия МА8А использовались общепринятые методы для оценки Ν8ΛΙϋ. В экспериментах использовали белых лабораторных мышей Мопдге1 и крыс ХЧМаг. Животных содержали в группах по 7, 8 особей в соответствую- 5 021588 щих клетках, в камерах искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12-часовых циклах чередования света и темноты, при свободном доступе к пище и воде.

Были сформированы следующие группы для сравнения эффектов МАБА с АБА и МИ при оральном приеме:

ГРУППА	ОБРАБОТКА
АЗА50	получено АЗА 50 мг/кг
АЗА100	получено АЗА 100 мг/кг
Μϋ100	получено Μϋ 100 мг/кг
МАЗА75	получено МАЗА 75 мг/кг
МА5А150	получено МАЗА 150 мг/кг
МАЗАЗОО	получено МАЗА 300 мг/кг

Водные растворы испытуемых веществ были приготовлены немедленно. В каждой экспериментальной серии имелась контрольная группа животных, которые получали п/о идентичный объем воды.

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы МюгоюП Ехсе1 2007 и результаты выражали как среднее значение±стандартная ошибка измерения (СОИ).

Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'к). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

5.1. Исследование аналгетической активности.

5.1.1. Оценка аналгетической активности с помощью теста корчей, вызванных введением мыши уксусной кислоты.

Методика.

Восприятие боли оценивали методом химического раздражения - теста корчей от введения уксусной кислоты (СйагаЪойу А. и др., Ιηάίηη 1. οί Рйагшасо1оду, 2004; 36(3):148-150). Животные получали внутрибрюшинно (в/б) 0,25 мл 0,75% водного раствора уксусной кислоты. После инъекции животных размещали отдельно в специальных боксах и наблюдали в течение 10 мин. Регистрировали количество абдоминальных сокращений. Аналгетическая активность проявлялась путем уменьшения количества абдоминальных сокращений в течение 10 мин. Испытуемые вещества вводили за 30 мин до раздражающего вещества. Уровень обезболивания выражали как аналгетический коэффициент, рассчитываемый следующим образом:

А=(Сс-С1)/Сс-100%, где А - аналгетический коэффициент;

Сс - количество сокращений в контрольной группе;

О - количество сокращений в испытуемой группе.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Аналгетическое действие испытуемых веществ в тестовой модели корчей;

N=8; среднее значение±СОИ

Группа	Животные с положительной реакцией/общее количество	Число сокращений	Аналгетический коэффициент
Контрольная	8/8	22,00±1,60	-
мт оо	8/8	22,10±1,47	-0,4
А5А50	6/8	5,76±1,32'! ~	7,1
МАЗА75	8/8	12,13±0,61 ”·’	4,5
МАЗА150	7/8	10,63* **1,10	5,2
МАЗАЗОО	5/8	6,00±1,39'*	7,3

*Р<0,0005 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контрольной группы.

$1’ 0.0005 относительно МН.

$$Р<0,005 относительно МН.

Для МАБА наблюдается положительный эффект в зависимости от дозы. Наилучшие результаты продемонстрированы в группах А8А50 и МА8А300 (Р<0,0005), тогда как МИ не обладает активностью. Аналгетический коэффициент для группы МА8А300 составляет 7,3 (только у 5 животных из 8 наблюдалась болевая реакция).

5.1.2. Оценка аналгетической активности в тесте горячей пластинки с мышами.

Методика.

Тест горячей пластинки был проведен с 52 мышами, имеющими массу 17-26 г, как описано в литературе (Ве1уакоу ν.Α, Бо1оу'су Ι.Κ. Наркотические аналгетики, Нижний Новгород, 2001 (рус.)). Тест горячей пластинки использован для отбора аналгетиков центрального действия (ОПсгЪсгд А. и др., 1. Рйаг- 6 021588 тасо1. Ехрег. ТЬег., 1958; 122:59). Водные растворы испытуемых веществ вводились п/о за 30 или 60 мин до испытания. Регистрировали время до облизывания лап.

Показателем аналгетической активности является запаздывание отклика на термическое раздражение. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Время отклика в тесте горячей пластинки с мышами; N=8-10; среднее значение±СОИ

Группа	Латентный период, с
Через 30 мин после введения испытуемого вещества	Через 60 мин после введения испытуемого вещества
Контрольная	4,510,42	5,010,27
Μϋ100	9,510,68*“ '	8,ЗЮ,53***
А5А50	5,4±0,46	9,711,05**
МА5А75	5,410,38	4,610,26
МАЗА150	— 9,510,53***“®	7, НО,55**
ΜΑ3Α300	9,611,12**®	8,610,60***

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

&Р 0,005 относительно Л8Л (30 мин).

“Р<0,005 относительно Л8Л (30 мин).

&&&Р<0,0005 относительно А8А (30 мин).

Экспериментальные данные демонстрируют, что в группах МА8А150 и МА8А300, а также в группе ΜΌ проявляется значительный аналгетический эффект через 30 и 60 мин. А8А значительно повышает порог болевой чувствительности только через 60 мин, что указывает на более медленное возникновение эффекта (табл. 5).

Пример 6. Сравнительная оценка жаропонижающей активности испытуемых веществ.

6.1. Оценка предупреждающей жаропонижающей активности у крыс путем инъекции пирогенала.

Методика.

Эксперименты проводились на 48 крысах ХУМаг с массой тела 165-182 г путем внутримышечной инъекции пирогенала (Гос. учреждение НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, РФ) в дозах по 100 мкг (81ι\υ;·ιγζ Ο.Υ., 8уиЬаеу Ρ.Ό., Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств, МЗ РФ 2000; 1:44-50 (рус.). Испытуемые вещества вводили п/о за 1 ч до инъекции пирогенала. Ректальную температуру измеряли с помощью электрического термометра ТЕРМО до инъекции пирогенала (базовый уровень) и в течение 3 ч после инъекции. Жаропонижающую активность оценивают по уменьшению гипертермической реакции через 2 ч после инъекции пирогенала, что хорошо коррелирует с опубликованными данными (10) о пике реакции (табл. 6). Комнатную температуру поддерживают равной 20-21°С.

Как видно из приведенных данных, температура тела животных в контрольной группе постепенно повышается, достигает максимума через 2 ч и остается нормальной еще в течение 1 ч.

Таблица 6

Изменения ректальной температуры крыс в контрольной группе под действием пирогенала; N=8; среднее значение±СОИ

Группа	Базовый уровень (“С)	Ректальная температура (°С)
через 30 мин.	через 60 мин.	через 120 мин.	через 180 мин.
Контрольная	36,1610,16	36,2510,21	36,7510,12**	36,9010,10·	36,7010,17·

#---—--—

Р 0,05 относительно базового уровня.

*Р<0,005 относительно базового уровня, относительно ЬазеНпе. **Р<0,0005 относительно базового уровня.

Испытуемые вещества незначительно влияют на нормальную температуру тела животных, но значительно снижают перегревание организма, вызванное пирогеналом (табл. 7).

- 7 021588

Таблица 7

Влияние испытуемых веществ на перегревание организма, вызванное внутримышечной (в/м) инъекцией пирогенала; N=8; среднее значение±СОИ

Группа	Базовый уровень ректальной температуры (°С)	Ректальная температура (’С) через 120 минут после инъекции
Контрольная	36,210,12	~ 36,9±О,16
МОЮО	35,910,18	36,210,16*
АЗА50	35,8±0,17	35,6+0,19***1 '
МАЗА75	36,1 ±0,18	36,3±0,20*
МАЗА150	35,8±0,15	36±0,21‘*
МАЗАЗОО	35,9±0,14	35,8±0,16***1

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно базового уровня.

$1’ 0.05 относительно ΜΏ.

В модели перегревания организма увеличение температуры тела, вызванное инъекцией пирогенала, полностью предупреждается в группах ΑδΑ50 и ΜΑδΑ300 (табл. 7). В группах ΜΌ100, ΜΑδΑ75 и ΜΑδΑ150 жаропонижающее действие проявляется слабее.

6.2. Оценка предупредительного жаропонижающего действия на крысах путем инъекции пирогенала (лечебный режим).

Методика.

Жаропонижающее действие испытуемых веществ в терапевтическом (лечебном) режиме исследовали на 48 крысах с массой тела 182-205 г, у которых перегревание было вызвано путем инъекции дозы пирогенала 100 мкг (δΐηνατζ Ο.Υ., 8уиЬаеу Κ.Ό., Ведомости НЦЭГК лекарственных средств М3 РФ, 2000; 1:44-50 (рус.). Испытуемые вещества давали п/о через 2 ч после инъекции пирогенала непосредственно после регистрации повышенной температуры тела. Ректальную температуру измеряли электрическим термометром ΤΕΚΜΘ до в/м инъекции пирогенала (температура базового уровня), на пике перегревания организма (контроль пирогенала) и через 30 мин после обработки испытуемым веществом, т.е. через 2,5 ч после инъекции пирогенала. Комнатную температуру поддерживали равной 20-22°С. Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9

Влияние испытуемых веществ на перегревание, вызванное внутримышечной инъекцией (лечебный режим); N=8, среднее значение±СОИ

Группа	Базовый уровень ректальной температуры СС)	Ректальная температура (°С) после инъекции пирогенала (контроль пирогенала)	Ректальная температура (’С) через 30 минут после инъекции
Контрольная	36,10±0,15	36,9010,20“	37,0010,18“
Μϋ100	36,41 ±0,14	37,0610,13	37,1010,14
АЗА50	36,3910,13	37,0410,251	36,5110,15”·
МАЗА75	36,2310,12	37,01 ±0,11й	36,9010,07 '
МАЗА150	36,2510,20	36,9610,15	36,7510,09”
МАЗАЗОО	36,1110,14	36,76±0,11”	36,4010,11*ИА

*Р<0,05 относительно контроля.

#Р<0,05 относительно базового уровня.

**Р<0,005 относительно базового уровня.

^%Р<0,05 относительно контроля пирогенала.

$Р<0,05 относительно ΜΏ.

$$Р<0,005 относительно ΜΏ.

Пирогенал вызывает значительное и аналогичное повышение температуры у всех животных, использованных в эксперименте (сравните контроль пирогенала относительно базового уровня, табл. 9). За исключением ΜΌ, обработка испытуемыми веществами вызывает снижение температуры тела относительно базового уровня и контроля пирогенала. В группах ΜΑδΑ300 и ΑδΑ50 наблюдалась сравнительно высокая гипотермия, причем снижение температуры тела было значительным относительно контрольной и ΜΌ100 групп. Необходимо отметить, что в группе ΜΑδΑ300, в отличие от группы ΑδΑ50, снижение температуры тела также было значительным относительно контроля пирогенала. Это демонстрирует значительное и быстрое жаропонижающее действие ΜΑδΑ, что могло бы быть полезным в клинике.

- 8 021588

Пример 7. Сравнительная оценка противовоспалительной активности испытуемых веществ.

7.1. Исследование на модели острого воспалительного отека.

Методика.

Эксперименты были проведены с использованием теста карагенана (^М1п1сг С. и др., Ргос.Зос. Εχρΐΐ. ΒίοΙ. апй Мей., 1962; 111(3):544-547, \Уе1 Ла и др., 1оигиа1 оГ Е1Ьпорйагтасо1оду, 2003(89):139-141, §и1Ьагкоп Ьтдайшш и др., АГпсап 1оита1 оГ (гаййюпак сотр1етейагу апй аЛетаЛуе тейюшек, 2007, 4(4):411416) на 42 крысах с массой тела 226-274 г. Единственную инъекцию 1% раствора карагенана (фирма §1дта) в физиологическом растворе (0,1 мл) вводили крысам в заднюю лапу. Испытуемые вещества вводили п/о (через катетер в желудок крысы) через 30 мин после инъекции карагенана. Объем лапы измеряли с помощью онкометра на базовом уровне и через 4 ч после инъекции карагенана.

Процент предупреждения (ингибирования) отека рассчитывали по формуле Р(%)=(1-Уо/Ус)х100, где Р - предупреждение (ингибирование) отека, %;

Уо - разность между объемом лапы на базовом уровне и в условиях эксперимента;

Ус - аналогичная разность в контрольной группе.

Результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10

Антиэкссудативная активность испытуемых веществ в модели карагенанового воспаления; N=7, среднее значение±СОИ

Г руппа	Объем папы {мл) на базовом уровне	Объем лапы (мл) после инъекции карагенана
МЛ	Коэффициент, %
Соп1го1	1,6±0,30	2,70*0,13	0
М0100	1,5*0,34	2,13±0,12*	43
А5А100	1,6*0,32	1,97*0,10**	66
МАЗА75	1,6±0,44	2,51*0,11	18
МА5А150	1,6*0,31	1,54±0,15·*4	93
ΜΑ3Α300	1,7*0,25	1,70±О,15**	91

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

&Р<0,05 относительно А8А100.

$Р<0,05 относительно МП.

В модели острого воспалительного отека объем пораженной конечности в контрольной группе увеличивается приблизительно в 1,6 раза. Наиболее выраженное влияние на воспалительный процесс отмечено в группе МА8А150, где коэффициент предупреждения составляет 93% относительно контрольной группы. В группе МА8А300 наблюдалась немного меньшая активность - отек уменьшился на 91%. Уменьшение отека также наблюдалось в группах МИ 100 и А8А50.

7.2. Исследование противовоспалительной активности испытуемых веществ против карагенанового отека в профилактическом режиме.

Методика.

Карагенановый отек исследовали широко известным методом (Окипеуюй 1.У., Ру/кепкоу У.Е., Патол. Физиол. Экспер. Тер., 2002(2):24-7 (рус.) на 42 крысах с массой тела 178-220 г. Испытуемые вещества вводились п/о в течение 5 дней. На 6 день непосредственно после введения испытуемых веществ крысы получали инъекцию 0,1 мл 1% раствора карагенана в заднюю лапу. Объем лапы измеряли на базовом уровне и через 4 ч после инъекции карагенана. Коэффициент предупреждения рассчитывали, как указано в предыдущем параграфе. Профилактическое введение испытуемых веществ в течение 6 дней приводит к уменьшению отека по сравнению с необработанными животными (табл. 11).

Таблица 11

Предупреждающее антиэкссудативное действие испытуемых веществ против карагенанового отека; N=7, среднее значение±СОИ

Группа	Объем лапы (мл)	Объем лапы (мл) после инъекции карагенана
на базовом уровне	МЛ	Уменьшение в %
Контрольная	1,43*0,12	1,93*0,11	0
Μϋ-ΙΟΟ	1,33±0,09	1,66*0,10	34

- 9 021588

А8А50	1,40±0,06	1,55±0,04*	70
МА8А150	1,37±0,11	1,40±0,09·*’	94
МА8А300	1,34±0,07	1,41±0,04**’	86

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

$1’ 0.05 относительно ΜΏ.

В группах ΜΛ8Λ150 и МА8А300 отмечена значительная предупреждающая активность (94%) более высокая, чем активность в группах ΜΌ100 (34%) и А8А50 (70%) для указанной воспалительной модели (табл. 11).

Для оценки интенсивности воспалительного процесса определяли содержание СКР с использованием стандартного метода на анализаторе INΤЕΟКА 400+ в конце эксперимента (5 ч после инъекции карагенана). Результаты определения содержания СКР в крови представлены в табл. 12.

Таблица 12

Содержание СКР в крови крыс для карагенановой модели воспаления крыс; N=7, среднее значение±СОИ

Группа	СКР, мг/л	Увеличение СКР, %
Контрольная	0,17±0,015	0
Контрольная карагенана	0,23±0,016**	100
Μϋ-ιοο	0,22±0,014*	83
А8А100	0,20*0,018	50
МА8А150	0,19±0,009”	33
ΜΑ3Α300	0,21±0,014*	67

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

#Р<0,05 относительно контроля карагенана.

$Р<0,05 относительно МП.

Как следует из приведенных данных, карагенан вызывает увеличение содержания СКР в крови крыс. В группе А8А100 увеличение содержания СКР снижается на 50% (табл. 12). Неожиданно в группе МА8А150 увеличение содержания СКС выражено существенно слабее (только 33% от контроля). Это подтверждает вывод, что МА8А может оказывать положительный эффект на воспалительный процесс в клинике.

Пример 8. Исследование противоревматической активности МА8А по сравнению с А8А и ΜΌ.

Клинические данные показывают, что пациенты с ревматоидным артритом (КА) имеют предрасположенность к атеросклерозу и сердечно-сосудистым заболеваниям (№·ΐ5οηον Е.Ь., Вестн. Росс. Акад. Наук., 2003, (7):6-10). У пациентов с продолжительным КА чаще наблюдается атеросклероз, чем у пациентов такого же возраста с более поздним началом заболевания. Системное воспаление может усиливать опасность сердечно-сосудистого заболевания, связанного с возрастом (Эс1 Кшсоп I. и др., А1Дего8с1его818, 2007; 196(2):354-360).

Ревматоидный артрит занимает ведущее положение среди ревматоидных состояний. Наиболее подходящей экспериментальной животной моделью для ревматоидного артрита человека является модель адъювантного артрита, вызванного инъекцией адъюванта Фрейнда в заднюю лапу крысы. Указанная модель широко применяется при скрининге антиартритических средств (\Уе1 Да и др., 1оигпа1 оГ ЕШпорНагшасо1оду, 2003(89): 139-141; 8и!Ьаг80п Ьшдайигш и др., АГпсап 1оигпа1 оГ Даййюпа1, сотр1етеп1агу и а1(егпаДуе тейюше8, 2007, 4(4):411-416).

Методика.

Эксперименты этого изобретения были спланированы с целью тестирования влияния МА8А на развитие стимулятора артрита по сравнению с ΜΌ и А8А. Эксперименты были проведены с крысами ^181аг, имеющими исходную массу 153-185 г. Крыс выдерживали в камерах искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12-часовых циклах чередования света и темноты. В каждой стандартной клетке размещали по 7 крыс, имеющих неограниченный доступ к питьевой воде и гранулированному стандартному корму. Все эксперименты проводились в соответствии с Директивой Совета ЕЭС от 24 ноября 1986 г. (86/609/ЕЕС), относящейся к содержанию экспериментальных животных. Были приняты все меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и снизить количество использованных животных.

Была использована модифицированная стандартная методика возбуждения и оценки развития хронического стимулятора артрита (Ве11ауДе Р., Ог1о1аш К., СопГогД А., 1ттипо1оду апй Нотеора1у. 3. Ехрептеп1а1 §1иФе8 оп Атта1 Мойе18, Айуапсе Ассе88 РиЫюаДоп, 2.05, 2006, 171-186). Крысам вводили

- 10 021588 инъекцию раствора полного адъюванта Фрейнда: 0,1 мл в заднюю лапу и 0,05 мл внутрибрюшинно. Растворы испытуемых веществ готовили немедленно.

Использовали водные растворы: ΑδΑ 0,1 и 1%, ΜΌ 1% и ΜΑδΑ 0,25, 1 и 2% растворы. Испытуемые растворы вводились животным п/о с помощью катетера в желудок.

Были сформированы следующие группы животных (N=7).

ГРУППА ОБРАБОТКА группа 1 интактные животные, использованы в качестве контрольных (контроль);

Группа 2 животные с индуцированным стимулятором артрита (ΑΰΑ);

Группа 3 животные, получающие ежедневную дозу 10 мг/кг АЗА в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (АЗА 10);

Г руппа 4 животные, получающие ежедневную дозу 100 мг/кг АЗА в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (АЗА 100);

Группа 5 животные, получающие ежедневную дозу 100 мг/кг МР в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (МР 100);

Группа 6 животные, получающие ежедневную дозу 25 мг/кг МАЗА в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (МАЗА 25);

Группа 7 животные, получающие ежедневную дозу 100 мг/кг МАЗА в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (МАЗА 100);

Группа 8 животные, получающие ежедневную дозу 200 мг/кг МАЗА в течение 28 суток после возбуждения стимулятора артрита (МАЗА 200),

Животные контрольной группы и животные групп ЛйЛ вместо испытуемых веществ получали п/о воду по той же схеме, как в испытуемых группах.

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы Мюгокой Ехсе1 2007 и результаты выражали как среднее значение±СОИ. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'8). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Динамику клинических проявлений артрита исследовали на 14 и 28 дни. Действие испытуемых веществ оценивают с использованием следующих критериев:

1) оценка локальных проявлений артрита - объем лапы и контур голеностопного сустава;

2) оценка анализа крови (^ВС),

3) оценка биохимических тестов (СКР),

4) оценка иммунологических показателей (содержание С1С).

Отек, то есть увеличение объема задней лапы, измеряют онкометром. Предупреждение (ингибирование отека) в процентах рассчитывают по формуле

Ρ(%)=(ν^νΐ)№χ100, где V - объем лапы в контрольной группе;

VI - объем лапы в тестовой группе;

Р - предупреждение, % (ингибирование отека).

Гематологические показатели определяют стандартными методами с помощью гематологического анализатора ΡΕΝΤΚΑ 120, СКР определяют на приборе ΙΝΤΕΟΚΑ 400+. Содержание С1С в сыворотке крови определяют спектрометрически с использованием этиленгликоля.

После инъекции адъюванта Фрейнда у всех животных испытуемых групп развивалось хроническое воспаление, крысы были утомленными, агрессивными при манипулировании, взъерошенными. Однако особенности питания во всех группах не отличались от контрольных групп. Увеличение массы тела во всех группах практически не отличалось от контрольной группы.

В табл. 13 и 14 приведены данные локальных проявлений артрита: объем лапы (характеризует отек мягких тканей) и контур/объем голеностопного сустава (характеризует органические повреждения тканей сустава артритического типа) на 14 и 28 дни.

- 11 021588

Таблица 13

Действие испытуемых веществ на объем лапы (мл) на 14 и 28 дни после инъекции адъюванта Фрейнда; N=7; среднее значение±СОИ

Г руппа	Объем лапы на 14й день	Объем лапы на 28й день
МЛ	Предупреждение, %	МЛ	Предупреждение, %
Контрольная	1,03*0,12**	-	1,08*0,17**	-
ΑάΑ	2,42*0,17	0	2,23*0,24	0
АЗА10	2,53*0,10	-7	2,08*0,12	7
АЗА100	2,35*0,14	3	1,52*0,07’	32
Μϋ100	2,60*0,21	-7	1,93*0,13	13
МАЗА25	2,20*0,21	9	1,32*0,12’®“	41
МАЗА100	2,07*0,17®	15	1,22*0,08**“®’	45
МАЗА200	2,13*0,11*	12	1,7*0,09**°	24

Р 0,05 относительно ΑάΑ.

^###Р<0,0005 относительно ΑάΑ.

&Р 0,05 относительно Α8Α10.

“Р<0,005 относительно Α8Α10.

&&&Р 0,0005 относительно Α8Α10.

“Р<0,05 относительно Α8Α100.

$1’ 0.05 относительно ΜΏ.

Как видно из данных табл. 13, на 14 день у всех животных испытуемых групп развивается выраженный отек мягких тканей. Обработка в течение 14 суток сравнительно мало влияет на развитие отека. Однако у животных в группах ΜΑ8Α100 и ΜΑ8Α200 имеется существенно менее выраженный отек, чем у животных в группе Α8Α10. На 14 день ΜΌ и Α8Α10 не предупреждают развитие отека, но дают даже больший объем отеков по сравнению с группой ΑάΑ (отрицательная защита -7%). На 28 день любые дозы ΜΑ8Α и Α8Α100 значительно предупреждают развитие отека (соответствующий процент защиты: 41, 45, 24 и 32%). Необходимо отметить, что ΜΑ8Α100 обеспечивает значительно лучшую защиту, чем Α8Α10, Α8Α100 и ΜΟ.

Таблица 14

Влияние испытуемых веществ на изменения голеностопного сустава крыс на 14 и на 28 дни после инъекции адъюванта Фрейнда; N=7; среднее значение±СОИ

Г руппа	Размеры голеностопного сустава на 14й день, мм	Размеры голеностопного сустава на 28й день, мм
Контрольная	5,6*0,09	5,8*0,12*
ΑάΑ	7,2*0,14	7,3*0,16
АЗА10	7,2*0,12	6,8*0,14’
АЗА100	6,9*0,15	7,1*0,16
Μϋ100	7,0*0,13	7,0*0,13
МАЗА25	7,0*0,14	6,7*0,15’
МАЗА100	7,0*0,13	6,6*0,16’®’
МА5А200	6,8*0,10“	6,9*0,11

#Р<0,05 относительно ΑάΑ.

Р 0,005 относительно ΑάΑ.

&Р 0,05 относительно Α8Α10.

“Р<0,05 относительно Α8Α100.

$Р<0,05 относительно ΜΏ.

Анализы данных голеностопного сустава (табл. 14) показывают, что на 14 день только ΜΑ8Α200 обеспечивает существенную защиту от развития артритического повреждения. На 28 день существенную защиту дают ΜΑ8Α25, ΜΑ8Α100 и Α8Α100. В указанном экспериментальном ряду сравнительно лучшую защиту обеспечивает ΜΑ8Α100. Авторы установили, что на 28 день уровень отека (табл. 13) и артритических изменений голеностопного сустава (табл. 14) уменьшаются. ΜΑ8Α100 обладает значительно большей эффективностью, чем Α8Α или ΜΌ. Оценка \УВС указывает увеличение (лейкоцитоз) под действием адъюванта Фрейнда (табл. 15). Лейкоцитоз является характерным признаком воспалительного процесса.

- 12 021588

Таблица 15

Изменения \УВС в крови крыс под действием испытуемых веществ на 14 и на 28 дни после инъекции адъюванта Фрейнда; N=7; среднее значение±СОИ

Г руппа	Лейкоциты 10э/мма
на 14й день	на 28й день
Контрольная	15.1710,76”	16,5010,52“
АйА	21,4811,47** ***	20,3210,90**
АЗА10	15,8311,23*	16,6811,22’
А5А10	17,0711,43	16,9111,17’
МЭ100	Н42И,41’	15,5511,26*
МАЗА25	14,7211,63*	16,7711,78
МАЗА100	14,1310,53“	15,5210,57**
МАЗА200	15,4211,40*	14,3510,84’**

**Р<0,005 относительно контроля. Р 0,05 относительно Л4Л.

##Р<0,005 относительно Л4Л.

Использование испытуемых веществ вызывает уменьшение \УВС по сравнению с группой АйА, что указывает на противовоспалительную активность. Хотя отсутствует статистически значимое различие между действием испытуемых веществ на увеличение содержания лейкоцитов, на 14 день сравнительно более высокую активность проявляет ΜΆ8Ά 100, однако на 28 день наиболее активна ΜΆ8Ά200 (табл. 15).

Для оценки развития воспалительного процесса определяли содержание СВР на 14 и на 28 дни. Известно, что содержание СВР увеличивается в ходе воспалительного процесса.

Таблица 16

Изменения содержания СВР в крови крыс под действием испытуемых веществ на 14 и 28 дни после инъекции адъюванта Фрейнда; N=7; среднее значение±СОИ

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

#Р<0,05 относительно Л4Л.

##Р<0,005 относительно Л4Л.

###Р<0,0005 относительно Л4Л.

&Р 0.05 относительно Л8Л10.

@Р<0,05 относительно Л8Л100.

Как следует из данных в табл. 16, на 14 день во всех испытуемых группах наблюдается увеличение содержания СВР, что указывает на воспалительный процесс. В серии экспериментов согласно изобретению только для ΜΆ8Ά200 наблюдается значительная защита от увеличения СВР на 14 день. Необходимо отметить, что ΜΆ8Ά200 на 14 день оказывает значительно лучшее действие, чем ΜΆ8Ά100. На 28 день существенно лучшая защита наблюдается в группах ΜΆ8Ά25 и ΜΆ8Ά100 по сравнению с группой Ά8Ά10 (табл. 16). Содержание С1С определяют с помощью стандартного спектрофотометрического метода (Вагапоуккл Р.У., Вийук В.1., Лабораторное дело, 1982; 12:35-39 (рус.). Иммунологические коэффи- 13 021588 циенты были исследованы в динамике на 14 и на 28 дни. Изменения содержания С1С представлены в табл. 17.

Таблица 17

Количество С1С (в единицах) на 14 и на 28 дни после инъекции адъюванта Фрейнда; N=7; среднее значение±СОИ

Группа	Единицы С1С на 14й день	Единицы С1С на 28й день
Контрольная	9,4*1,05”	7,8*0,49”
ΑάΑ	17,4*1,29	13,4*1,25
АЗА10	10,8*0,74”	8,2*0,53*
АЗА100	15,0*1,23'	14,4*1,66'
Μϋ-ΙΟΟ	11,8*2,22	“8,6*093*
МАЗА25	12,6*0,68’	11,8*1,53
МАЗА100	20,8*2,99*	5,8*0,74”“*®®*
МАЗА200	21,6*3,26'	6,2*1,02”®

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

Р 0.05 относительно ΑάΑ.

##Р<0,005 относительно.

$1’ 0.05 относительно ΜΏ.

&Р 0.05 относительно Л8Л10.

@Р<0.05 относительно Α8Α100.

@@Р<0,005 относительно Л8Л100.

На 14 и на 28 дни содержание С1С в испытуемых группах было выше, чем в контрольной группе. Содержание С1С на 14 день было ниже, чем в ΑάΑ группе, только в группах А8А10 и ΜΑ8Α25. На 28 день уровень С1С в группах, получающих испытуемые вещества, был близок к контрольному уровню, за исключением группы Α8Α100. В ходе эксперимента увеличение содержания С1С на 14 день наблюдалось в группах Α8Α100, ΜΑ8Α100 и ΜΑ8Α200. На 28 день содержание С1С в группах ΜΑ8Α100 и ΜΑ8Α200 нормализовалось. Увеличение содержания С1С в сыворотке крови может наблюдаться при различных патологических состояниях иммунитета. Значительное увеличение С1С наблюдается при воспалительных процессах, в том числе в соматических состояниях, причем содержание С1С указывает на интенсивность патологического процесса (Βίβτ О. и др., Риийатейак οί 1ттипо1оду, Νον Уогк, Не1йе1Ьег§, Ветки, р. 442). Продолжительная обработка различными дозами ΜΑ8Α снижает содержание С1С до нормы. При достаточно активном иммунитете основная часть С1С удаляется клетками Купфера, причем уменьшение содержания С1С воспринимается как положительный эффект. Тот факт, что при использовании ΜΑ8Α в группах ΜΑ8Α100 и ΜΑ8Α200 наблюдается нормализующий эффект для содержания С1С на 28 день, указывает, что продолжительное использование ΜΑ8Α в различных дозах клинически может быть более перспективным при лечении артрита, чем повышенные дозы Α8Α.

Пример 9. Исследование антигиперлипидемических характеристик.

Атеросклероз представляет собой многофакторный процесс (Вет1шет ΤΑ. и др., СйсиЩюи, 1995; 91:2488-2495), причем клиническое воздействие возрастает наряду с ростом симптомов коронарного заболевания сердца. Существенную роль в процессе атеросклероза играет воспаление и реакция организма на воспаление (Кокк К, Αт. Неай 1., 1999; 138; 8419-8420). Клинические наблюдения показывают, что противовоспалительная терапия ослабляет проявления атеросклероза (81о11ег Ό.Κ. и др., 1. 8игд. Кек., 1993; 54:7-11). Экспериментальные данные подтверждают существенную корреляцию противовоспалительной активности с гиполипидемической активностью, по меньшей мере, среди ингибиторов СОХ-1 (Коигоипак1к Α.Ρ. и др., Ехрег. Мо1. Ра1ко1., 2002; 73:135-138). В изобретении гиполипидемическая активность Α8Α и ΜΑ8Α сопоставляется при эквивалентных дозах.

9.1. Сравнительное действие испытуемых веществ на содержание липидов у крыс для модели острой гиперлипидемии.

Методика.

Использовали самцов крыс ΧνίκΙηΓ с массой тела 250-270 г. Животных в группах по 6-8 особей выдерживали в камерах искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12часовых циклах чередования света и темноты при свободном доступе к воде и пище. Состояние острой экспериментальной гиперлипидемии/гиперхолестеринемии индуцировали введением ТгПоп \УК1339 (ТК), как описано в работе Коигоипак1к А.Р. и др., Ехрег. Мо1. РаШок, 2002; 73:135-138). Крыс после ночного голодания обрабатывали в/б дозами 250 мг/кг ТК, растворенными в изотоническом физиологическом растворе. Раствор испытуемого вещества или воду вводили п/о контрольной и ТК группам животных за 1 ч до и через 20 ч после введения ТК, как описано ниже.

- 14 021588

Кровь для биохимического анализа отбирали на следующий день (через 24 ч после инъекции ТК) путем пункции сердца под эфирным наркозом. Сыворотку отделяли путем центрифугирования и анализировали на общее содержание холестерина, НЭБ, БЭБ и ТС с использованием стандартных наборов.

Были проведены три серии экспериментов.

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы Мтегохой Ехсе1 и результаты выражали как среднее значение±стандартная ошибка среднего. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного анализа ΑΝΟνΑ и критерия Стьюдента. Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Серия I. Сопоставление ΑδΑ, ΜΌ и ΜΑδΑ.

ГРУППА ОБРАБОТКА Количество животных

Контрольная
ТК	ТК 250 мг/кг
А5А45	ТК 250 мг/кг+АЗА 45 мг/мг
А5А90	ТК 250 мг/кг+АЗА 90 мг/мг
ΜΩ150	ТК 250 мг/кг+Μϋ 150 мг/кг
МА5А75	ТК 250 мг/кг+МАЗА 75 мг/кг
МАЗА150	ТК 250 мг/кг+МАЗА 150 мг/кг
МА5А300	ТК 250 мг/кг+МАЗА 300 мг/кг

Результаты.

У крыс, которые получали ТК, развивалась выраженная гиперхолестеринемия и гиперлипидемия, причем общее содержание холестерина, БЭЕ и ТС значительно отличалось от содержания в контрольной группе (общий С увеличился в 6-7 раз, ТС более чем в 30 раз (табл. 18)). Терапия ΑδΑ, особенно в дозе 90 мг/кг, ограничивает увеличение общего С, БЭБ и ТС, но незначительно изменяет содержание НЭБ. В экспериментальной серии авторов МО незначительно защищает от изменений содержания липидов, вызванного Тритоном (ТК).

Обработка ΜΑδΑ в зависимости от дозы обеспечивает защиту от индуцированной ТК гиперлипидемии/гиперхолестеринемии. ΜΑδΑ в дозе 75 мг/кг не отличается от ΑδΑ45, но в дозе 150 мг/кг ΜΑδΑ гораздо более эффективен, чем ΑδΑ45 и ΜΌ150, для защиты от действия ТК. ΜΑδΑ300 значительно лучше, чем ΑδΑ45 и ΑδΑ90 снижает содержание общего С, БЭБ и ТС. Это указывает, что ΜΑδΑ может быть полезным для предупреждения и/или лечения состояний гиперхолестеринемии и гиперлипидемии и с учетом противовоспалительной активности ΜΑδΑ может быть полезным для предупреждения и/или лечения атеросклероза и других состояний, вызванных нарушениями метаболизма липидов и воспалением.

Таблица 18

Сравнительное действие ΜΌ, ΑδΑ и ΜΑδΑ на содержание липидов в модели крысиной гиперлипидемии; п=6-8; среднее значение±СОИ

Группа	С мг/дп	ΗϋΙ мг/дл	ЮЬ мг/дл	ΤΘ мг/дл
Контрольная	80,7+4,7***	56,5±2,8	21,1+2,6™	44,0±6,9”*
ТК	453,6+40,0	60,3+9,6	386,0+36,5	1399+129,7

АЗА45	381,0+30,3	62,8+10,9	307,4+37,8	973+82,7*
А5А90	288,1+23,5*	60,0+7,4	219,1+23,9*	791+73,9**
М0150	345,6+34,1	63,8+9,3	273,9+31,6*	1022+80,7*
МАЗА75	341,9+16,3*	68,1+8,7	270,1+12,8*	861+105,7*
МАЗА150	249,6+22,2**“	58,2+8,1	182,4+19,6**“	668+104,4**“
ΜΑ3Α300	219,0+16,ΐ**5”	56,3+8,6	158,6+19,4*”“	548+73,2***™

*Р<0,05 относительно ТК.

**Р<0,005 относительно ТК. ***Р<0,0005 относительно ТК. $1’ 0.05 относительно Α8Α45. “Р 0.05 относительно Α8Α90. &Р 0,05 относительно ΜΏ150.

- 15 021588

Серия II. Сопоставление ΑδΑ, ΜΑδΑ, ΝΑ и комбинаций ΑδΑ+ΝΑ, ΜΑδΑ+ΝΑ.

ГРУППА ОБРАБОТКА Количество животных

Контрольная
ТК	ТК 250 мг/кг
А5А45	ТК 250 мг/кг+АЗА 45 мг/мг
ΜΑδΑ	ТК 250 мг/кг+МАЗА 150 мг/кг
ΝΑ	ТК 250 μγ/κγ+ΝΑ 50 мг/кг
Α3Α+ΝΑ	ТК 250 мг/кг+АЗА 45 μγ/κγ+ΝΑ 50 мг/мг
ΜΑ5Α+ΝΑ	ТК 250 мг/кг+МАЗА 150 μγ/κγ+ΝΑ 50 мг/кг

Результаты.

В экспериментальной серии авторов изобретения ΝΑ обеспечивает значительную защиту от изменений содержания липидов (С, ЬОЬ и ТО), индуцированных ТК (табл. 19). Комбинация ΑδΑ и ΝΑ незначительно изменяет действие ΝΑ на содержание липидов. Неожиданно, что комбинация ΜΑδΑ и ΝΑ существенно усиливает действие ΝΑ50 и превосходит защитное действие ΜΑδΑ на увеличение содержания ТО под действием ТК (табл. 19). Комбинированное применение ΜΑδΑ и ΝΑ также является существенно более эффективным, чем нормализующее действие ΑδΑ45+ΝΑ50 на содержание ЬОЬ и ТО.

Таблица 19

Раздельное и комбинированное действие ΜΌ, ΑδΑ и ΜΑδΑ на содержание липидов у крыс в модели гиперлипидемии; п=6-8; среднее значение±СОИ

Г руппа	С мг/дл	НВЬ мг/дл	ЮЬ мг/дл	ТО мг/дл
Контрольная	80,714,7***	56,512,8	21,1 ±2,6***	44ι6,9***
ТК		60,319,6	386,0136,5	13991129,7
АЗА45	381,0±30,3	62,8110,9	307,4137,8	973182,7*

МАЗА150	249,6122,2*	58,218,1	182,4119,6***	668170,9**'
ΝΑ50	327,5138,4*	66,5114,6	246,3132,5*	591143,3**
Α5Α45+ΝΑ50	316,0143,1*	57,9114,3	251,2133,8*	618142,8**
ΜΑ3Α150+ΝΑ50	226,3124,9**”	63,1110,2	163,2119,3**”*	468±34,7**®#% ’

*Р<0,05 относительно ТК.

**Р<0,005 относительно ТК.

***Р<0,0005 относительно ТК.

$Р<0,05 относительно А8А45.

@Р<0,05 относительно ΜΑ8Α150.

#Р<0,05 относительно ΝΑ50.

%Р<0,05 относительно Α8Α45+ΝΑ50.

Серия III. Сопоставление δΐ, ΜΌ, ΜΑδΑ и комбинации δΙ+ΜΌ, δΙ+ΜΑδΑ.

ГРУППА	ОБРАБОТКА Количество животных
Контрольная		6
ТК	ТК 250 мг/кг	8
31	ТК 250 мг/кг+51 5 мг/кг	7
МБ	ТК 250 мг/кг+МБ 150 мг/кг	6
МАЗА	ТК 250 мг/кг+МАЗА 150 мг/кг	6
51+МВ	ТК 250 мг/кг+51 5 мг/кг+МБ 150 мг/кг	7
5Ι+ΜΑ5Α	ТК 250 мг/кг+51 5 мг/кг+МА5А 150 мг/кг	7

Результаты.

В экспериментальной серии авторов δI в дозе 5 мг/кг обеспечивает значительную защиту от изменений содержания липидов (С, ЬОЬ и ТО), индуцированных ТК (табл. 20). Комбинация δI с испытуемыми веществами увеличивает нормализующее действие на содержание липидов. ΜΑδΑ в комбинации с δI значительно более эффективен, чем ΜΌ+δφ для предотвращения увеличения содержания ЬОЬ и ТО под действием ТК (табл. 20). В документе \УО2006099244 предложена комбинация ΜΌ со статином без каких-либо данных. Для комбинированного использования статинов и ΑδΑ требуется специальная фармацевтическая композиция, поскольку эти вещества фармакологически и химически несовместимы (патент υδ 6235311), поэтому синергетический эффект невозможен.

- 16 021588

Таблица 20

Раздельное и комбинированное действие МО, МА8А и 8Ι на содержание липидов у крыс в модели гиперлипидемии; п=6-8; среднее значение±СОИ

Группа	С мг/дл	Ηϋί. мг/дл	ШЪ мг/дл	ТО мг/дл
Контрольная	80,744,7***	56,542,8	21,142,6**’	4446,9***
ТК	453,6440,0	60,349,6	386,0436,5	13994129,7
51	321,3432,3*	53,7412,4	259,3430,1*	826444,1**
Μϋ	345,6434,1	63,849,3	273,9431,6*	1022480,7*
МАЗА	249,6422,2**“	58,248,1	182,4419,6’*“	668470,9**“
51+МО	281,5431,2**“	59,5414,9	217,1426,2*	690432,6**“’
8Ι+ΜΑ8Α	230,7428,6**“’	62,8414,6	153,4428,0**“·*	512440,2**“”

*Р<0,05 относительно ТК. **Р<0,005 относительно ТК. ***Р<0,0005 относительно ТК. &Р 0,05 относительно МО. $Р<0,05 относительно 8Ι. #Р<0,05 относительно МП-8Г

Сводка.

Результаты указывают на потенциал МА8А для предупреждения и/или лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии. С учетом противовоспалительной активности МА8А может быть более эффективным, чем А8А или МО для предупреждения и/или лечения атеросклероза и других состояний, развивающихся под действием воспаления. Комбинированное использование МА8А и NΑ эффективнее усиливает положительное действие отдельных веществ на экспериментальное увеличение содержания липидов, чем А8А плюс NΑ. В комбинации с 8Ι МА8А не только более эффективен, чем индивидуальный 8Ι, но также обладает гораздо большей эффективностью, чем МО+ΧΙ при противодействии увеличению содержания ЬОЬ и ТО под действием ТК.

9.2. Раздельное и комбинированное влияние NΑ и МА8А на содержание липидов у крыс в модели гиперлипидемии.

Методики.

Использовали самцов крыс \УМаг с 250-270 г. Животных выдерживали в камерах искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12-часовых циклах чередования света и темноты при свободном доступе к воде и пище. Начальная масса животных составляла 220-240 г. Состояие хронической (субхронической) экспериментальной гиперлипидемии/гиперхолестеринемии индуцировали введением ТК с использованием метода, описанного Бетте и 8а11/тап (Беуше 8., 8а11/тап А., ί. РЬагтасо1. Тохюо1. Ме1й., 2007; 55:224-226). Животные получали 250 мг/кг раствора ТК через хвостовую вену, три раза в неделю, в течение 3 недель. Растворы испытуемых веществ или воды для контрольной и ТК групп вводили п/о один раз в день, за 1 ч до инъекции раствора ТК или отбирали пробу крови по следующей схеме:

ГРУППА	ОБРАБОТКА	Количество животных
Контрольная			10
ТК	ТК 250 мг/кг		14
ΤΚ+ΝΑ	ТК 250 μγ/κγ+ΝΑ 50 мг/кг/день		14
ТК+МАЗА	ΤήΙοη 250 мг/кг+150 мг/кг/день		14
ΤΚ+ΝΑ+ΜΑ3Α	ΤπΙοη 250 μγ/κγ+ΝΑ 50 мг/кг+МАЗА 150 м г/кг/д	14

Кровь для биохимических анализов отбирали через 1, 2 и 3 недели (на следующий день после инъекции ТК) путем пункции сердца под эфирным наркозом. Сыворотку отделяли путем центрифугирования и анализировали, определяя содержание общего С, НОБ, БОБ и ТО с помощью стандартных наборов.

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы Мюгокой Ехсе1, и результаты выражали как среднее значение±стандартная ошибка среднего. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного анализа ΑNΟVΑ и критерия Стьюдента. Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

При повторных инъекциях ТК развивается выраженная и стабильная гиперхолестеринемия и гиперлипидемия, характеризующиеся значительным увеличением содержания общего С, БОБ и ТО по сравнению с контрольной группой (общий С увеличивается в 6-7 раз, ТО - в 30 раз и более, см. табл. 21). Терапия NΑ, особенно значительно в первую неделю, ограничивает увеличение общего С, БОБ и ТО, но содержание НОБ значительно увеличивается только через 2 и 3 недели. МА8А почти так же, как NΑ сни- 17 021588 жает содержание общего С и ЬОЬ и увеличивает содержание ИЛЬ, но слабее, чем ΝΑ предупреждает увеличение ТС, вызванное инъекцией ТК (табл. 21). Неожиданно, что комбинированное использование ΝΑ+ΜΑ8Α через 3 недели значительно лучше, чем индивидуальные ΝΑ или ΜΑ8Α, снижает содержание общего С, ЬНЬ и ТС и увеличивает содержание ΗΌΤ. Таким образом, можно ожидать, что комбинация ΝΑ+ΜΑ8Α будет полезной для предупреждения и/или лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии.

Таблица 21

Раздельное и комбинированное действие ΝΑ и ΜΑ8Α на содержание липидов у крыс в модели гиперлипидемии; п=9-14; среднее значение±СОИ

Группа	Общий С через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
С1	С2	СЗ
Контрольная	77,6±4,9*	75,1 ±5,1*	72,7±2.5*
ТК	487,6125,4	501116,7	513141,1
ΤΚ+ΝΑ	345И5.7*	401,1125,1“	405,5125,9*
ТК+МАЗА	375,9±25,8‘	406,7119,8“	409139,4
ΤΚ+ΝΑ+ΜΑ5Α	331,7128,4“	379,1124,7“	375,8131*
Г руппа	НОЬ через 1, 2 и 3 недели, мг/дл Ηϋί1 Ηϋί2 ΗΟΙ.3
Контрольная	54,6±1,9*	54,1±1,3	53,711,0*
ТК	76,316,9	76,2±11,4	77110,2
ΤΚ+ΝΑ	111,3±9,1*	144,7113,5'	127,3110,9*
ТК+МАЗА	100,1 ±9,4	113,8113,1	128,3118,5*
ΤΚ+ΝΑ+ΜΑ5Α	112,3110,9*	129,2113,1*	154,1119’
Группа	ЮЬ через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
1.01.1	1.О1.2	Ι.Ο1.3
Контрольная	18,7±3,8“	19,7±4,4*	16,312,0*
ТК	388.7126,7	402,1±19,2	405,1141,7
ΤΚ+ΝΑ	216,3±14,0	250,3±20,6*	265,1118,4*
ТК+МАЗА	263,3±19,4	287,6118,5’	261,9112,6**
ΤΚ+ΝΑ+ΜΑ3Α	205,7118,5*®	222,4116,5*®	214,4115,1’®*

Группа	ТО через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
ΤΘ1	ТО2	тез
Контрольная	3812,9’	- 3713,2* ~~	3814,4*
ТК	1240180,1	1297178,3	12341114,1

ΤΡ+ΝΑ	734181,6*	860173,8“	828144,7*
ТК+МАЗА	964194,9*	1079184	982172,7
ΤΚ+ΝΑ+ΜΑ3Α	721,6152,4®*	807,6180,1®’	714127,3®**

*Р<0,05 относительно ТК.

**<0,005 относительно ТК.

#<0,0005 относительно ТК.

Т 0.05 относительно ΝΑ.

&Р 0,05 относительно ΜΑ8Α.

Комбинированное использование ΜΑ8Α и ΝΑ является значительно более эффективным, чем индивидуальное действие веществ.

Пример 10. Влияние испытуемых веществ на агрегацию тромбоцитов и образование тромбов.

10.1. Агрегация тромбоцитов.

Α8Α является одним из широко употребляемых профилактических антитромбоцитарных средств

- 18 021588 (Мшег I. и др., Тех. Неай Ιπ5ΐ. I., 2007; 34(2):179-186). ΑδΑ в сочетании с ΝΑ используется как противовоспалительное средство (патент υδ 3312593) и антитромбоцитарное средство (^09632942). Известны многие другие агенты и комбинации ΑδΑ. Широко известно, что ΜΌ нормализует сосудистый тонус, ингибирует агрегацию тромбоцитов и окисление жирных кислот и оптимизирует потребление кислорода во время ишемии миокарда (ΤδίιΤίη ν.Ι., Рос. Кардиол. Ж., 2002; 1:45-52). Кроме того, ΝΑ немного ингибирует агрегацию тромбоцитов (Ьакьп Κ.Μ. и др., Фармакол. Токсикол., 1980, 43(5):581-5 (рус.). Традиционное антитромбоцитарное средство - клопидогрел используется индивидуально (патенты υδ 4529596, υδ 4847265, υδ 5576328) или в комбинации со статином (\УО9804259) или с ΑδΑ (^09729753). Кроме того, ΑδΑ может компоноваться с антитромбоцитарным средством - дипиридамолом (На1ке5 Р.Н. и др., ЬапсеТ 2006, 367(9523):1665-73). Клинический опыт указывает на повышенную гибкость в применении комбинаций различных средств.

Методика.

Агрегацию тромбоцитов исследовали с использованием импедансного измерителя агрегации цельной крови на приборе Μιι11ίρ1;·ιΚ (Многофункциональный Анализатор Тромбоцитов, фирма ЭупаЪуЮ Μеά^са1, Германия) (ΤοίΗ О. и др., ТЪтотЪ. Наето51. 2006; 96:781-788, Vе1^к-δа1сЪηе^ С. и др., Лпе51к Αηа1д., 2008; 107:1798-1806). Пробы крови для экспериментов ίη νίίτο собирали от здорового донора В. (возраст 37 лет), который не принимал ΑδΑ или какие-либо другие антитромбоцитные средства, в пластиковые пробирки, покрытые антикоагулянтом - гирудин (ЭупаЪуЗе Μей^са1. Оегтапу) и использовали для измерений между 30 мин и 4 ч после сбора крови. В экспериментах ех νίνο кровь собирали в пластиковые пробирки, покрытые гирудином (ЭупаЪу1е Μеά^са1, Оегтапу), от наркотизованных крыс, который получили предварительную трехсуточную п/о обработку испытуемыми веществами. Измерения проводили согласно модифицированному протоколу фирмы ЭупаЪуЮ Μеά^са1. Подогревают изотонический раствор хлорида натрия (0,3 мл, или физиологический раствор с исследуемым веществом в окончательной концентрации 10^-4 ммоль/мл каждого вещества) до 37°С и добавляют из пипетки в испытуемые клетки и вводят пробу 0,3 мл цельной крови, содержащей антикоагулянт - гирудин. Измерения начинают через 5 мин после инкубации и перемешивания при 37°С, путем добавления раствора соответствующего агониста (получены от фирмы ЭупаЪуЮ Μеά^са1, Оегтапу):

1) аденозиндифосфат (ΑΌΡ) - ΑΌΡ-тест. ΑΌΡ стимулирует активацию тромбоцитов под действием ΑΌΡ рецепторов (Ρ2Υ12 и другие);

2) арахидоновая кислота (АА) - ΑδΡΙ-тест: активация под действием АА - субстрат циклооксигеназы образует тромбоксан А2 (ТХА2), который является сильным агонистом тромбоцитов;

3) тест ΑΌΡ Ηδ (простагландин Е₁ в комбинации с ΑΌΡ). Добавка эндогенного ингибитора ΡΟΕι делает тест ΑΌΡ Ηδ более чувствительным к действию клопидогрела и родственных лекарственных препаратов по сравнению с тестом ΑΌΡ.

Кривые агрегирования регистрировали в течение 6 мин и анализировали с использованием программного обеспечения ЭупаЪуЮ Μеά^са1. Были рассчитаны следующие параметры агрегации тромбоцитов:

1) Α^, максимальное значение агрегации тромбоцитов, выраженное в условных единицах (Αυ) агрегирования;

2) Αυ0 общая площадь под кривой агрегирования ^Шмин). На величину площади влияет общая высота кривой агрегирования, а также наклон кривой, причем ΑυС наилучшим образом выражает суммарную активность тромбоцитов.

Статистика.

Результаты выражают как среднее значение±СОИ. Для оценки значимости отклонений используют однофакторный анализ ΑΝΟνΑ. Если недействительная гипотеза отклонена, то после этого используют критерий δίиάеηί-Nе№таη-Κеи15.

Результаты.

Как видно из данных табл. 22, ΜΑδΑ в концентрации 10^-4 моль обеспечивает значительную защиту от ΑΌΡ и особенно предотвращает агрегацию тромбоцитов, индуцированную действием АА и ΑΌΡ+ΡΟΕι (значительно снижаются ΑυС и Α^, табл. 22). ΝΑ (в группе 10^-4 ммоль/мл) также уменьшает агрегирование, вызванное действием ΑΌΡ (смотрите Α^ в табл. 22). Комбинированное действие обоих веществ обеспечивает более высокое и выраженное снижение агрегации тромбоцитов, вызванное действием ΑΌΡ или ΑΌΡ+ΡΟΕΙ, что проявляется в величинах ΑυС и Α^ (табл. 22).

- 19 021588

Таблица 22

Влияние МИ, NА и их комбинации на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АЭР, АА и ΡΟΕι+ΛΌΡ; N=5-8; среднее значение±СОИ

Группа	ΑϋΡ
АиС (А11*мин.)	Атах (ΑΓΙ)
Контрольная	942143,7	169,316,4
МА5А 10'*	828163,5	153,518,8
МАЗА 10	798138,91 “	140,517,2'
Μϋ 10	869 ±36,3	153,216,1
АЗА 10	883150,3	151,719,3
ΝΑ10 ~ ~	859162,5	148,015,2'
Μϋ10+ΝΑ10	4741 34 9зяга’а	81,015,7““*’
МАЗА 10+ΝΑ10	4031 37,53®’11™	75,316,8*®™“”
Α3Α+ΝΑ	805147,3”	13717,1111
Группа	АА
лис (Аи*мин.)	Атах (ΑΙΙ)
Контрольная	1023146,3	178,816,9
МАЗА 10’	832154,1’	148,415,7’
МАЗА 10	298125,3	66,116,8™*
Μϋ 10 ~	~~ 1050137,64	179,517,3“
АЗА 10	450124,8“®	103,115,9*”®
ΝΑ 10	1010141,7	161,119,4
Μϋ10+ΝΑ10	1106155,4’	173,3112,1’
МАЗА 10+ΝΑ10	216118,7*®”*”’“	48,5±6,94®‘и**’4 ~
Α3Α+ΝΑ	~ 463±35,22да	99,418,22ЬМ1
Группа	ΡΘΕ,+ΑϋΡ
АиС (Аи*мин.)	Атах (ΑΙΙ)
Контрольная	1005146,5	175,318,9
МАЗА 10'“	~ 595145,3'	99,314,8*
МАЗА 10	533120,33	87,714,63
Μϋ 10	587137,42	101,4±2,2г
АЗА 10 ’ ™~-	-	-
ΝΑ10	862151,9	146,718,6
Μϋ10+ΝΑ10	306135,5мка	54,515,8м”
МАЗА 10+ΝΑ10	296128,74®а” ~	- 50,2±7,33®””
Α3Α+ΝΑ	603142,5'*“	98,017,2*”

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

³Р<0,0005 относительно контроля.

⁴Р<0,00005 относительно контроля.

&Р 0,05 относительно А8А.

Р 0,005 относительно МО 10'⁴.

Р 0.0005 относительно МО 10'⁴.

$Р 0,005 относительно NА 10^-4.

$$Р 0,0005 относительно NА 10'⁴.

@Р<0,05 относительно МА8А 10'⁴. ^аР<0,05 относительно А8А+NА.

^ЬР<0,05 относительно

МА8А значительно лучше, чем А8А или МИ, предотвращает агрегирование тромбоцитов, индуцированное действием АА (табл. 22). Комбинация МА8А+NА проявляет значительно более высокую ак- 20 021588 тивность против агрегирования, индуцированного действием АА, причем превосходит активность каждого отдельного вещества, а также активность А8А+NА и ΜΌ+ΝΛ (табл. 22).

Были проведены параллельные эксперименты с дипиридамолом (ΌΙ) и комбинацией ΌΙ с А8А или МА8А на агрегацию тромбоцитов, вызванную действием АЭР или АА (табл. 23). ΌΙ проявляет антитромбическую и антиагрегационную активность (Маттеп Е.Р., ТЬготЬок1К РекеагсЬ 8ирр1етепГ, 1990 XII, 1-3). Дипиридамол плюс аспирин обладают более высокой эффективностью после церебральной ишемии артериального происхождения, чем один аспирин (На1кек Р.Н. и др. ЬапсеГ, 2006, 367(9523): 1665-73).

Таблица 23

Влияние испытуемых веществ отдельно и в комбинации на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АЭР или АА; N=5-8; среднее значение±СОИ

Г руппа	ΑϋΡ	АА
А11С (АГГмин.)	Атах (Аи)	АГ1С (А1Гмин.)	Атах (Аи)
Контрольная	942143,7	169,316,4	1023146,3	178,816,9
МАЗА104	793133,9’	140,517,2’	298125,33881	66,116,83881
АЗА 1 θ'4	883150,3	151,719,3	—4501Й,8И8Г	103,115,9м®
ϋΙ 3-104	665144,1м	111,116,954	1104145,5“®®	173,915,2“®®
МАЗА 104+ϋΙ 3-10 4	465127,03®*84	69,713, г4®’34	116±9 84®®5*ааа 1 &	33,5±3,64®®’5ω &
АЗА 104+ϋΙ 3-104	667139,4м	105,216,7м®	207,9127,53188	62,816,82188

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

³Р<0,0005 относительно контроля.

⁴Р<0,00005 относительно контроля.

&Р<0,05 относительно А8А.

@Р<0,05 относительно МА8А.

@@Р<0,005 относительно МА8А. ^аР<0,05 относительно ΏΙ. ^ааР<0,005 относительно ΏΙ. ^аааР<0,0005 относительно И.

$Р<0,05 относительно А8А+П1.

$$Р<0,005 относительно А8А+П1.

В этой серии наиболее высокую активность проявляют МА8А+О1, причем она значительно выше, чем активность А8А+О1 (табл. 23).

10.2. Тромбоз.

Терапевтическое использование МО в течение двух недель при пероральном назначении кроликам и собакам после экспериментального артериального тромбоза продемонстрировало тромболитический эффект (Ьодипоуа Ь. и др., Эксперим. клин. Фармакотер., 1991; 19:91-98 (рус.). Данные о профилактическом действии МО на ограничение или предупреждение тромбоза не известны. Благодаря разнообразным механизмам NА снижает вероятность тромбоза (Рокепкоп Р.8. и др., АгЬегокс1егок1К, 1998; 140:27180).

Методика.

Авторы изобретения выбрали экспериментальную модель тромбоза на основе артериального тромбоза крыс, индуцированного действием РеС1₃ (Кита К. и др., ТЬготЬ. Рек., 1990, 60:269-280, \Уапд X., Хи Ь., ТЬготЬ. Рек., 2005, 115:95-100). Повреждение ткани, инициированное химическим окислением при опосредствованном действии железа, склоняет поврежденную область к прилипанию и агрегированию тромбоцитов с последующей активацией коагуляции и осаждения фибрина. В экспериментах использовали самцов крыс ХУМаг с массой тела 350-420 г. Животных выдерживали в группах по 7, 8 особей в соответствующих клетках, в камере искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12-часовых циклах чередования света и темноты, при свободном доступе к корму и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с Директивой Совета ЕЭС от 24 ноября 1986 г. (86/609/ЕЕС), относящейся к содержанию экспериментальных животных. Были приняты все меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и снизить количество использованных животных. Крыс статистически разделяли на различные экспериментальные группы, в каждой из которых содержалось не менее семи животных. Носитель или испытуемое соединение МО (25 мг/кг), NА (25 мг/кг), МА8А (10 мг/кг), А8А (5 мг/кг) и комбинации МО+ХА (25+25 мг/кг), ΜА8А+NА (10+25 мг/кг) и А8А+NА (5+25 мг/кг) были введены через рот за 2 ч до инициирования тромбоза. Были проведены параллельные эксперименты с целью сопоставления действия отдельных доз испытуемых веществ (заданных за 2 ч до инициирования тромбоза) и повторных доз (один раз в день, трое суток). Группы из 7, 8 животных получали следующие вещества: МА8А (10 мг/кг), клопидогрел (СЬ) (5 мг/кг), А8А (5 мг/кг) и комбинации МА8А+СЬ (10+5 мг/кг) или А8А+СЬ (5+5 мг/кг). Крыс анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, в/б и 10 мг/кг/ч)

- 21 021588 и в течение эксперимента держали на терморегулируемом столе для поддержания температуры тела, равной 37°С. Одну из каротидных артерий подвергали разрезанию на шее, отделяли от примыкающей ткани, блуждающего нерва и помещали датчик потока (электромагнитный измеритель кровотока ΜРV 1200, Яюоп КоНйсп, 1арап) на обнаженном сегменте обычной каротидной артерии, чтобы регистрировать кровоток. Через 15 мин периода стабилизации индуцировали тромбоз путем местного наложения (в контакте с адвентициальной поверхностью сосуда) двух кусков (2x1 мм) фильтровальной бумаги ХУНаЦпап, пропитанной 15% раствором РеС1₃. Время тромбоза каротидной артерии регистрировали как время, необходимое для полного прекращения кровотока и записывали как время до закупорки (ТТО). Если кровоток не прекращался в течение 90 мин в группе активной обработки, записывали значение ТТО >90 мин.

Кроме того, в ходе экспериментального тромбоза измеряли время кровотечения из хвостовой вены крыс. На хвосте делали поперечный надрез скальпелем (на расстоянии 5 мм от конца) и хвост погружали непосредственно в теплый (37°С) изотонический физиологический раствор до момента прекращения кровотечения. Прекращение кровотечения определяли как время полной остановки кровотечения без возобновления кровотечения в течение следующих 30 с.

После экспериментального тромбоза животных под наркозом, которые получали испытуемые вещества в течение 3 суток, использовали в тесте агрегации тромбоцитов ех У1уо. Вскрывали брюшную полость и собирали кровь из нижней полой вены в пластиковые пробирки, покрытые гирудином (ЭупаЪу1е МеШса1, Сегтапу).

Для измерений использовали пробы крови, отобранные между 30 мин и 4 ч. Указанные измерения проводили в соответствии с модифицированным протоколом фирмы ЭупаЪу1е МеШса1 (см. выше в разделе Агрегация тромбоцитов).

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы Мюгокой Ехсе1 2007 и результаты выражали как среднее значение±СОИ. Различия между экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа ^ΝΟν^ с повторным сопоставлением (тест Тикеу'к). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Среднее время для индуцированного РеС1₃ тромбоза артерии и получающаяся остановка артериального кровотока в контрольной группе составляет 24,4 мин (табл. 24).

Таблица 24

Влияние испытуемых веществ на индуцированный РеС1₃ тромбоз каротидной артерии; N=7-8; среднее значение±СОИ

Г руппа	Время до закупорки	Время кровотечения хвоста
МИН.	%	МИН.	%
Контрольная	24,411,45	100	8,911,28	100
ΝΑ (25 мг/кг)	30,3±3,12	124	11,5*1.39	129
Μϋ (25 мг/кг)	29,8±2,29	122	10,511,01	118
Μϋ+ΝΑ (25+25 мг/кг)	34,012,78'	139	11,411,42	128
МАЗА (10 мг/кг)	41,7±3,95“	171	12,112,20	136
ΜΑ3Α+ΝΑ (10+25 мг/кг)	53,1±4,12азк*	218	13,514,19	152
АЗА (5 мг/кг)	35,213,02'	144	13,813,27	155
Α3Α+ΝΑ (5+25 мг/кг)	42,5±4,241 2”	174	15,212,12'	171

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

#Р<0,05 относительно МО.

$Р<0,05 относительно ЯА. ^аР<0,05 относительно А8А.

^ЪР<0,05 относительно А8А+ЯА. ^сР<0,05 относительно МЭ+ЯА.

Профилактическая обработка веществом МАБА обеспечивает значительное продление времени ТТО (Р<0,005 относительно контроля), но в отличие от АБА была существенно менее эффективной в тесте кровотечения (от 136 до 155%). МАБА+ЯА (10+25 мг/кг) вызывает сравнительно более длительную задержку тромбоза, превосходящую эффект от МО+ЯА или АБА+ЯА (табл. 24). Необходимо отметить, что при использовании АБА и АБА+ЯА увеличение ТТО, наряду с временем кровотечения, хотя увеличение ТТО при использовании МАБА или МАБА+ЯА значительно выше, чем рост времени кровотечения (табл. 24).

В параллельных экспериментах с обычной контрольной группой было исследовано влияние на тромбоз для АБА, МАБА и СЬ и их комбинаций. Испытуемые вещества вводили в виде отдельной дозы

- 22 021588 (2 ч до испытания) или давали 1 раз в день в течение 3 суток. Α8Α или СЬ, введенные за 2 ч до испытания тромбоза, значительно продлевали ТТО относительно контрольной группы, которая получала воду (табл. 25).

Таблица 25

Влияние отдельной дозы испытуемых веществ на ТТО и время кровотечения в индуцированном РеС1₃ экспериментальном тромбозе каротидной артерии; Ν=7-8; среднее значение±СОИ

Группа	Время до закупорки	Время кровотечения хвоста
МИН.	%	МИН.	%
Контрольная	24,411,45	100	8,911,28	100
МАЗА <10 мг/кг)	41,713,9521	171	12,112,20	136
АЗА (5 мг/кг)	35,213,02’	144	13,8±3,27	155
СЬ (5 мг/кг)	31,712,40’	130	11,9±3,62	134
МАЗА+СЬ (10+5 мг/кг)	51,514,31	252	15,7±3,16	176
АЗА+СЬ <5+5 мг/кг)	45,414,80288	186	16,312,25’	183

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

³Р<0,005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно МΑ8Α. ^аР<0,05 относительно Α8Α.

^ЬР<0,05 относительно СЬ. ^сР<0,05 относительно Α8Α·Ο

Отдельная доза МΑ8Α обеспечивает более значительное увеличение ТТО, чем СЬ. МΑ8Α, введенный вместе с СЬ, значительно увеличивает ТТО, но только незначительно изменяет время кровотечения (табл. 25). Следует отметить, что комбинация МΑ8Α+С^ вызывает значительное увеличение ТТО по сравнению с эффектом для отдельных веществ и действием комбинации ΑδΑ+СЬ. Повторная обработка испытуемыми веществами вызывает дополнительное увеличение ТТО и времени кровотечения (табл. 26).

Таблица 26

Влияние повторной обработки испытуемыми веществами на ТТО и время кровотечения в индуцированном РеС1₃ экспериментальном тромбозе каротидной артерии; Ν=7-8; среднее значение±СОИ

Группа	Время до закупорки	Время кровотечения хвоста
МИН.	%	МИН.	%
Контрольная	25,311,75	100	8,611,37	100
МАЗА <10 мг/кг/д)	48,4±4,352	191	13,112,63	152
АЗА (5 мг/кг/д)	40,913,251 2	162	Я7Д13Д71 ”	207
СЬ (5 мг/кг/д)	49,117,75’	194	18,313,78’	213
МАЗА+СЬ (10+5 мг/кг/д)	64,618,01231	255	20,713,88’	241
АЗА+СЬ (5+5 мг/кг/д)	”61 ,οϊϊ’όΐ^28-	241	17,414,9838	319

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно МΑ8Α. ^аР<0,05 относительно Α8Α.

Повторная обработка веществами МΑ8Α или СЬ оказывает значительно более высокое влияние на ТТО, чем Α8Α (соответственно 191 и 194% против 162%), но МΑ8Α, в отличие от СЬ или Α8Α, не увеличивает время кровотечения (табл. 26). Повторная обработка комбинациями МΑ8Α+С^ или Α8Α+ί'.Έ дает значительное и вполне аналогичное увеличение ТТО, но МΑ8Α+С^ сравнительно слабее влияет на время кровотечения хвоста, чем Α8Α+ί'.Έ (241% относительно 319%) (табл. 26).

Эксперименты ех νί\Ό.

После экспериментального тромбоза отбирают кровь животных и определяют параметры агрегирования. Обработка веществом МΑ8Α в дозе 10 мг/кг в течение трех дней вызывает значительное уменьшение агрегации тромбоцитов по всем испытанным индукторам агрегирования (табл. 27).

- 23 021588

Влияние ΜΆ8Ά, А8А, СЬ ех νίνο; N

Таблица 27 и их комбинаций на агрегацию тромбоцитов 4-7; среднее значение±СОИ

¹Р<0,05 относительно контроля.

²Р<0,005 относительно контроля.

³Р<0,0005 относительно контроля.

@Р<0,05 относительно ΜΆ8Ά.

&Р<0,05 относительно Л8Л. ^аР<0,05 относительно СЬ.

^ЬР<0,05 относительно Л8Л+СЬ.

Обработка веществом СЬ в дозе 5 мг/кг/д в течение 3 дней вызывает значительную защиту против агрегирования, индуцированного ЛОР и РСЕ1+АЭР, но не защищает от агрегирования, индуцированного АА. А8А обеспечивает значительную защиту от агрегирования, возбужденного АА, но не дает эффекта против АЭР (табл. 27). Комбинация ΜΑ8Α и СЬ (10+5 мг/кг/д х3) обеспечивает сравнительно лучший эффект предупреждения агрегирования, вызванного различными индукторами, значительно лучше, чем эффект, обеспечиваемый А8А+СЬ в испытаниях с АЭР и РОЕЦАЭР (табл. 27).

Сводка.

ΜΑ8Α значительно лучше, чем ΜΌ или А8А при аналогичных молярных концентрациях предотвращает агрегацию тромбоцитов, индуцированную АА. Защитный эффект ΜΑ8Α+NΑ значительно превосходит эффект для ΜΌ, NΑ и А8А, а также для комбинации Α8Α+NΑ против всех индукторов агрегирования, а также эффект для ΜΟ+НА против агрегирования, индуцированного АА.

Учитывая положительный эффект для ΜΑ8Α и комбинации ΜΑ8Α+NΑ против агрегации тромбоцитов и продление времени ТТО ίη νίνο, ΜΑ8Α или комбинация ΜΑ8Α+NΑ может найти применение для уменьшения агрегации тромбоцитов и риска тромбоза у пациентов с выраженным атеросклерозом, потенциальным инфарктом миокарда и инсультом, а также с нарушениями периферийного кровообра- 24 021588 щения. Тот факт, что ΜΑ8Α и комбинация ΜΑ8Α+ΝΑ не пролонгируют время кровотечения хвоста, указывает на возможное применение этой комбинации для пациентов с увеличенным риском кровотечения в период до и после операции.

Комбинация ΜΑ8Α+ΌΙ значительно лучше, чем Α8Α+ΌΙ защищает от агрегирования, индуцированного ΑΌΡ и АА.

МЛ8Л+С'.Ъ. В экспериментальном тромбозе отдельная доза МЛ8Л+С'.Ъ обеспечивает лучшую защиту от индуцированного РеС1₃ тромбоза, чем Α8Α+С^. ΜΑ8Α+С^ сравнительно слабее, чем Α8Α+С^ пролонгируют время кровотечения хвоста. В эксперименте ех νίνο ΜΑ8Α+ΟΕ обеспечивает значительно более выраженную защиту против агрегации тромбоцитов, чем СЬ, Α8Α или ΜΑ8Α. ΜΑ8Α+ΟΕ лучше, чем Α8Α+^ предотвращает агрегацию тромбоцитов, индуцированную ΑΌΡ и ΡΟΕι+ΑΌΡ.

Эти факты указывают, что ΜΑ8Α+С^ может найти применение в клинике для непосредственной защиты против увеличения риска агрегации тромбоцитов надвигающегося или текущего тромбоза.

Пример 11. Сравнительное исследование комбинированного применения ΜΑ8Α/ΝΑ, ΜΌ/ΝΑ и ΕΑ/ΝΑ для уменьшения прилива крови, индуцированного ΝΑ.

Никотиновая кислота (ниацин, ΝΑ) эффективно снижает уровень сывороточного холестерина, ЕЛЬ и триглицеридов при увеличении ИЛЬ. Однако ограничивающим неблагоприятным эффектом у пациентов, получающих никотиновую кислоту непосредственно или в виде длительного выделения, является быстрое развитие значительного кожного тепла и расширения сосудов, называемое приливом, что приводит к болезненному прекращению (Оир1а Ε.Κ., Ιΐο Μ.Κ., Неай Όίδ., 2002; 4:124-137). В качестве одного из наиболее активных и перспективных средств для снижения прилива крови под действием ΝΑ был предложен Ларопипрант (ΜΚ-0524) (ΕΑ) (СЬеид Κ. и др., ΡΝΑ8, 2006; 103:6682-6687).

11.1. Сопротивление расширению кожных сосудов, вызванному действием никотиновой кислоты.

Модель.

Самцов крыс ЩМаг анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, в/б) и держали под наркозом, вводя дополнительные дозы (10 мг/кг) каждый 1 ч. Кровяное давление измеряли в левой каротидной артерии, электрокардиограмму (ЕСО) записывали с помощью стандартного проводника II. Кровоток в правой ушной артерии определяли с помощью лаазерного допплеровского измерителя расхода (ΟΧΥΡΕΟν 2000, υ8Α). Кровоток, ЕСО и артериальное давление регистрировали с помощью системы ΑΌ 1и51гитеи15 Ρο\\νιΕα6 и данные хранили в компьютере для последующей обработки. После регистрации базового уровня в течение 10 мин испытуемые вещества вводили подкожно (п/к) в область загривка и продолжали регистрацию в течение 30 мин. Данные среднего кровотока для каждого животного вычисляли, принимая во внимание среднее давление крови, и сопоставляли с начальным и контрольным значением. Результаты вычисляли для 5-8 отдельных экспериментов и выражали в процентах как максимальное изменение кровотока относительно базовой линии (СагЬа11о-1аие Е. и др., ί. Ρΐιαηηααοΐ. Τοχίοοί. ΜοΊΐιοι® 2007; 56(3):308-316).

Статистика.

Результаты для каждой группы выражали как среднее значение ±СОИ. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Разности между каждой экспериментальной группой сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с повторными сравнениями (теста Тикеу'к). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Никотиновая кислота (ΝΑ) в дозе 15 мг/кг вызывает значительное увеличение кровотока в ушной артерии для этой животной модели (табл. 28). ΜΑ8Α, подобно контролю (буферный раствор 0,9% №С1), вызывает незначительное варьирование кровотока. ΝΑ вместе с ΜΑ8Α вызывает заторможенный (медленно возрастающий) и статистически значительно менее выраженное абсолютное увеличение кровотока по сравнению с одним ΝΑ (табл. 28). Потенциал ΜΑ8Α для противодействия расширению периферических сосудов, вызванному действием ΝΑ, может иметь положительный результат в клинике для уменьшения кожных эффектов (прилив крови) от никотиновой кислоты, что будет дополнительно подробно исследовано, как описано ниже.

Таблица 28

Влияние экспериментальных веществ на расширение кожных сосудов; Ν=5-8; среднее значение±СОИ

Группа	Изменения кровотока, %
Контрольная	2,92±2,76
ΝΑ (15 мг/кг)	55,75*11,5“
МАЗА (45 мг/кг)	8,04±2,02*
ΝΑ+ΜΑ3Α (15 мг/кг+45 мг/кг)	......... 25,'91±9,52·’

*Р<0,05 относительно контроля. **Р<0,005 относительно контроля. $Р<0,05 относительно ΝΑ.

- 25 021588

Заключение.

Авторы неожиданно обнаружили, что МАЗА значительно снижает расширение периферических сосудов, вызванное действием ΝΆ.

Целью настоящего экспериментального исследования было сопоставление действия МАЗА, МИ и ЬА на прилив крови (изменение температуры кожи), вызванный действием ЫА.

Методика.

Использовали самцов крыс \Уй1аг (280-330 г). Животных содержали в группах по 6 особей в камерах искусственного климата при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12-часовых циклах чередования света и темноты, при свободном доступе к питьевой воде и пище (Р3 - Ьас1аМНН АВ, З\\ейеп). Для регистрации изменений температуры кожи интактных крыс использовали бесконтактный метод регистрации температуры (РарайоЛк Ό. и др., Вг. Т РЬагтасоЦ 2008; 153:1382-1387). Измерения температуры проводили с использованием портативного инфракрасного термометра (Мойе1 Ргоксап 510, ТРАИок1тап). Животных приучали к манипулированию и к инфракрасному датчику в течение 3 суток до исследования. Показания температуры на тыльной стороне каждого уха регистрировали без обезболивания в начале и в ходе эксперимента. Температуру уха замеряли каждые 5 мин в течение периода 60 мин. Между измерениями животных возвращали в клетки. Вещества ЫА, МИ и МАЗА растворяли в физиологическом растворе с коррекцией рН непосредственно перед использованием. ЬА (МК 0524, Саутап СЛеписа1к) сначала растворяли в диметилсульфоксиде и затем свежий раствор разбавляли 0,9% раствором ЫаС1 в каждый день эксперимента. Пропорция в комбинации NΆ и ЬА основана на Сводке характеристик продукта для таблеток модифицированного выделения Тгейарйуе™ 1000 мг/20 мг (никотиновая кислота/ларопипрант).

Статистика.

Для каждого момента времени усредняли данные шести измерений температуры уха (по три для каждого уха). Данные обрабатывали с использованием программы МюгокоП Ехсе1 и результаты выражали как среднее значение±стандартная ошибка среднего. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного анализа ΆNОУΆ и критерия Стьюдента. Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

11.2. Испытание влияния времени и растворителя на температуру кожи.

ГРУППА ОБРАБОТКА Количество животных

РаствТА Растворитель для 1_А 6

Раств-ΝΑ Растворитель для ΝΑ, МАЗА и МО 6

ΝΑ ΝΑ15 мг/кг подкожно 6

11.3. Исследование влияния отдельных испытуемых веществ на температуру кожи при одновременном [0] введении и за 30 мин [30] до п/к введения.

Контролировали влияние действия индивидуальных ЬА, МИ или МАЗА на температуру кожи. Каждое исследуемое вещество вводили п/к, одновременно с ЫА, как ЬА+ЫА [0], или за 30 мин до ЫА, как ЬА+ЫА [30].

ГРУППА	ОБРАБОТКА	Количество животных
Контрольная	растворитель	6
ΝΑ	ΝΑ 15 мг/кг	6
ίΑ	!_А 0,3 мг/кг	б
ίΑ+ΝΑ	ίΑ 0,3 μγ/κγ+ΝΑ 15 мг/кг	6
Μϋ	Μϋ 45 мг/кг	6
Μϋ+ΝΑ	Μϋ 45 μγ/κγ+ΝΑ 15 мг/кг	6
МАЗА	МАЗА 45 мг/кг	6
ΜΑ3Α+ΝΑ	МАЗА 45μγ/κγ+ΝΑ 15 мг/кг	6

11.4. Исследование влияния комбинаций МАЗА/ЫА и МИ/ЫА на температуру кожи при одновременном введении [0] или за 45 мин [45] до п/о введения.

ГРУППА	ОБРАБОТКА	Количество животных
Контрольная	растворитель	6
ΝΑ	ΝΑ 40 мг/кг	8
ΜΩ	МО 100 мг/кг	6
Μϋ+ΝΑ	Μϋ 100 μγ/κγ+ΝΑ40 мг/кг	6
МАЗА150	МАЗА 150 мг/кг	6
ΜΑ3Α75+ΝΑ	МАЗА 75μγ/κγ+ΝΑ 40 мг/кг 6
ΜΑ3Α150+ΝΑ	МАЗА 150 μγ/κγ+ΝΑ 40 мг/кг	6

- 26 021588

Результаты.

К11.2. Испытание влияния времени и растворителя на температуру кожи.

На базовом уровне средняя температура уха, регистрируемая с 10 до 14 ч, составляет 28,4-30,6°С. Исследование времени отклика на введение ΝΑ (15 мг/кг, п/к) показывает максимальное увеличение температуры на 10 мин, равное 2,32±0,37°С от базового уровня и 2,57±0,43°С по сравнению с группой растворителя (Р<0,005) (см. ниже). Установлено, что влияние ЬЛ/растворитель на температуру уха существенно отличается от влияния ΝΑ, ΜΑδΑ и ΜΌ/растворитель только в первые 5 мин после инъекции, поэтому при расчете температуры на 10 мин использовалась только одна контрольная группа.

Влияние ΝΑ, растворитель/ΝΑ и растворитель/ΕΑ на температуру уха крыс

К11.3. Исследование влияния отдельных испытуемых веществ на температуру кожи при одновременном [0] введении или за 30 мин [30] до п/к введения.

Подкожная инъекция ΜΑδΑ, ΜΌ или ΕΑ не вызывает значительных изменений температуры уха крыс (табл. 29). Отсутствует отличие температуры между группами ΜΌ+ΝΑ [0], когда ΜΌ добавляется вместе с ΝΑ, и ΜΌ+ΝΑ [30], когда ΜΌ вводится за 30 мин до ΝΑ.

Таблица 29

Влияние ΜΑδΑ, ΕΑ и ΜΌ на повышение температуры кожи, вызванное действием ΝΑ; Ν=6, среднее значение±СОИ

Группа	Начальная температура, °С	Максимальная температура, °С	Увеличение, %
Контрольная/растворитель	29,510,29	29,6210,25”’	-
ΝΑ	29,6110,40	32,210,42***	100
МАЗА	29,3±0,35	29,210,38*“	-
ΜΑ5Α+ΝΑ [0]	29,9±0,31	31,5 ±0,40** ***	62
ΜΑ5Α+ΝΑ [30]	29,610,32	30,9±0?32й	50
ίΑ	29,43±0,27	29,510,35*“	-
ΙΑ+ΝΑ [0]	29,7210,31	31,4510,40**	67
ίΑ+ΝΑ [30]	29,5110,32	30,7310,34*’	47
МО 45	29,4210,38	29Ц±0,31’Я	-
ΜΟ+ΝΑ [0]	29,5310,29	31,3310,48*	69
Μϋ+ΝΑ [30]	29,6810,26	31,4010,39*	65

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно ΝΑ.

$^ЯР<0,0005 относительно ΝΑ.

Одновременно введение ΝΑ и ΜΑδΑ (группа ΝΑ+ΜΑδΑ [0]; время упреждения=0) вызывает уменьшение прилива крови от ΝΑ, которое подобно уменьшению, вызванному одновременным назначением ΝΑ и ΕΑ или ΝΑ и ΜΌ. Повышение температуры, вызванное действием ΝΑ, снижается соответственно от 100% (эффект от ΝΑ) до 62, 67 и 69% (табл. 27). В экспериментах изобретения введение ΜΑδΑ+ΝΑ и ΕΑ+ΝΑ (когда они вводятся п/к за 30 мин до ΝΑ) вызывает значительное и подобное защитное действие от повышения температуры кожи, индуцированного ΝΑ (табл. 28).

- 27 021588

К11.4. Исследование влияния комбинаций NА/ΜАЗА и NΛ/Μ^. введенных п/о, на температуру кожи.

Оральное (п/о) введение NА в дозе 40 мг/кг вызывает значительное и продолжительное (до 60 мин) повышение температуры уха крыс, причем максимум наблюдается между 15 и 45 мин (табл. 29).

Таблица 29

Влияние МАЗА или ΜΌ на перегревание кожи, индуцированное NА, при одновременной [0] или предварительной [45] обработке; N=6-8, среднее значение±СОИ

Группа	Исходная температура (°С)	Температура (°С) через	Максимальное повышение, %
15 мин.	30 мин.	45 мин.
Контрольная/ра створите ль	29,910,32	30,210,48”	30,010,33” $	30,110,37”	9
ΝΑ	30,0±0,41	32,3±0,46	33,110,41 “	32,410,48“	100
МА5А150	29,710,28	29,910,33”	29,510,35” »	29,610,39”	6
ΜΑ5Α75+ΝΑ [0]	29,710,33	31,010,51'	32,310,37*·’	32,110,46'	84
МА5А150+ΝΑ [0]	29,810,37	30,910,47*	32,010,42”	31,9510,38'	70
Μϋ	29,910,35	30,110,30я	29,810,38”	30,010,34”	6
Μϋ+ΝΑ [0]	29,6±0,26	31,ЗЮ,35*’	32,510,42'	32,210,40'	96
МОЮО+ΝΑ [45]	29,310.35	31,210,33*’	32,310,41 '	32,110.44'	95
ΜΑ5Α75+ΝΑ [45]	29,4±0,30	31,310,53'	31,910,45’	31,510,42*’	80
ΜΑ8Α150+ΝΑ[45]	29,710,38	30,7±0,41*	31,210,44”	30,2±0,38Т!В*8'	48

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р<0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно $$Р<0,005 относительно $$$Р<0,0005 относительно &Р 0,05 относительно ΜА8А150+NА [0].

“Р<0,05 относительно МА8А75+^ [45].

#Р<0,05 относительно Μ^+NА [45].

Оральное введение МАЗА или ΜΌ не вызывает существенных изменений температуры кожи. Одновременное п/о введение МАЗА и NА [0] в дозе 75 мг/кг дает небольшую защиту, но при дозе 150 мг/кг обеспечивает значительную защиту от повышения температуры кожи, индуцированного NА (табл. 29). Введение ΜΌ (100 мг/кг) одновременно с NА дает защиту от повышения температуры в течение 15 мин, но не обеспечивает значительной защиты от максимального повышения температуры кожи, индуцированного NА (см. температуру при 30 и 45 мин в табл. 29). Анализ результатов показывает, что МАЗА в дозе 150 мг/кг, введенной одновременно с NА, ослабляет повышение температуры кожи до 70%, то есть значительно лучше, чем действие комбинации NА+Μ^ (96%). Повышение температуры под действием одного NА принято за 100%. Введение веществ в профилактическом режиме, т.е. за 45 мин до NА, обеспечивает эффект снижения температуры, который для ΜΛЗА150+NА [45] значительно лучше, чем эффект от комбинаций Μ^+NА [45] или ΜАЗА75+NА [45] (табл. 29).

При введении МАЗА п/о или п/к повышение температуры кожи, индуцированное NА, уменьшается. При п/к введении МАЗА подобно ларопипранту уменьшает повышение температуры кожи, индуцированное NА как при одновременном, так и в профилактическом режиме. Значительная активность МАЗА против прилива крови при п/о введении вместе с NА или в профилактическом режиме указывает на потенциальную применимость МАЗА для ослабления нежелательных кожных эффектов NА (прилив крови).

Сводка.

Поскольку МАЗА обладает противовоспалительным, антигиперлипемическим и антитромбоцитным действием, МАЗА может рассматриваться как новое терапевтическое средство для лечения различных патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение представляет собой лекарственный продукт, который содержит МАЗА, для использования в качестве противовоспалительного, аналгетического, жаропонижающего, противоревматического, антигиперлипемического, антиатеросклеротического, антиагрегационного и антитромботического средства. Лекарственный продукт согласно изобретению может назначаться в виде фармацевтической композиции. Согласно данному изобретению предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит МАЗА в смеси с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

- 28 021588

Поскольку противовоспалительное, аналгетическое, жаропонижающее, противоревматическое, антигиперлипемическое, антиатеросклеротическое, антиагрегационное и антитромботическое использование лекарственного продукта предполагает продолжительное действие, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предусматривается форма, подходящая для орального применения, например, в виде таблеток или капсул.

Другим объектом данного изобретения является применение лекарственного продукта, который описан выше, или фармацевтической композиции, которая описана выше, для производства лекарственного препарата для лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, агрегации тромбоцитов или образования тромбов.

Еще одним объектом изобретения является комбинация лекарственных продуктов, содержащих ΜΑ8Α и другого вещества, выбранного из группы NΑ, статины, СЬ и ΌΙ. Эти продукты могут быть основаны на фармацевтических композициях, разработанных для самого ΜΑ8Α.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Аддитивная соль 4-триметиламмонийбутаноата и ацетилсалициловой кислоты, отличающаяся тем, что в рентгенограмме имеются пики при углах 2θ: 5.10, 13.58, 13.83, 15.02, 15.17, 17.89, 19.33, 19.87, 21.85, 22.05, 23.32, 23.56, 23.92, 24.75, 25.55, 25.80, 27.05, 27.91, 30.25±0,2°.
2. 2. Аддитивная соль Ь-карнитина и ацетилсалициловой кислоты, отличающаяся тем, что в рентгенограмме имеются пики при углах 2θ: 5.09, 12.62, 13.48, 13.84, 15.04, 17.82, 19.15, 19.77, 21.84, 22.56, 23.33, 23.92, 24.40, 25.17, 25.43, 26.14, 27.24, 29.50, 30.36±0,2°.
3. 3. Аддитивная соль 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (мелдоний) и ацетилсалициловой кислоты, отличающаяся тем, что в рентгенограмме имеются пики при углах 2θ: 5.19, 13.22, 13.82, 14.20, 14.95, 15.36, 15.93, 18.11, 18.97, 19.74, 21.02, 22.15, 23.15, 23.65, 24.31, 25.28, 26.18, 26.58, 27.73, 28.36±0,2°.
4. 4. Применение аддитивной соли 3-(триметиламмонийамино)пропаноата (мелдоний) и ацетилсалициловой кислоты по п.3 в качестве лекарственного средства для предупреждения и/или лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, инфаркта миокарда, инсульта, тромбоза и тромбоэмболии.
5. 5. Фармацевтическая композиция для предупреждения и/или лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов или образованием тромбов, содержащая аддитивную соль мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. 6. Композиция по п.5, где патология, индуцированная агрегацией тромбоцитов, включает ишемические явления, выбранные из инфаркта миокарда, инсульта, или тромбоз и тромбоэмболию.
7. 7. Способ предупреждения и/или лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов или образованием тромбов, который включает введение страдающему пациенту терапевтически эффективного количества аддитивной соли мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 или фармацевтической композиции по п.5.
8. 8. Применение аддитивной соли мелдония и ацетисалициловой кислоты по п.3 для предупреждения и/или лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов или образованием тромбов.
9. 9. Применение по п.8, где патология, индуцированная агрегацией тромбоцитов, включает ишемические явления, выбранные из инфаркта миокарда, инсульта, или тромбоз и тромбоэмболию.
10. 10. Применение фармацевтической композиции по п.5 для предупреждения и/или лечения воспаления, боли, лихорадки, ревматических состояний, гиперлипидемических состояний, атеросклеротических состояний, патологий, индуцированных агрегацией тромбоцитов или образованием тромбов.
11. 11. Применение по п.10, где патология, индуцированная агрегацией тромбоцитов, включает ишемические явления, выбранные из инфаркта миокарда, инсульта, или тромбоз и тромбоэмболию.
12. 12. Комбинированный лекарственный продукт для предупреждения и/или лечения патологии, индуцированной агрегацией тромбоцитов, представляющей собой инсульт, содержащий эффективное количество аддитивной соли мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 и эффективное количество дипиридамола.
13. 13. Комбинированный лекарственный продукт для предупреждения и/или лечения патологии, индуцированной агрегацией тромбоцитов, содержащий эффективное количество аддитивной соли мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 и эффективное количество клопидогрела.
14. 14. Применение комбинированного лекарственного продукта по п.13 для предупреждения и/или лечения патологии, индуцированной агрегацией тромбоцитов, при котором патология, индуцированная агрегацией тромбоцитов, включает ишемические явления, выбранные из инфаркта миокарда, инсульта, или тромбоз и тромбоэмболию, или острый коронарный синдром, внезапную сердечную смерть и ос- 29 021588 ложнения после коронарной пластической операции на сосудах или аортокоронарного шунтирования.
15. 15. Комбинированный лекарственный продукт для предупреждения и/или лечения патологии, индуцированной агрегацией тромбоцитов, содержащий эффективное количество аддитивной соли мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 и эффективное количество никотиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли.
16. 16. Применение комбинированного лекарственного продукта по п.5 для предупреждения и/или лечения патологии, индуцированной агрегацией тромбоцитов.
17. 17. Применение по п.16, в котором патология, индуцированная агрегацией тромбоцитов, включает ишемические явления, выбранные из инфаркта миокарда, инсульта, или тромбоз и тромбоэмболию.
18. 18. Применение комбинированного лекарственного продукта по п.15 для предупреждения и/или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из дислипидемии, гиперлипидемии и атеросклероза.
19. 19. Комбинированный лекарственный продукт для предупреждения и/или лечения заболевания, выбранного из группы дислипидемии, гиперлипидемии и атеросклероза, содержащий эффективное количество аддитивной соли мелдония и ацетилсалициловой кислоты по п.3 и статина, выбранного из группы аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, питавастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.
20. 20. Применение комбинированного лекарственного продукта по п.19 для предупреждения и/или лечения заболевания, выбранного из группы дислипидемии, гиперлипидемии и атеросклероза.