TWI478715B - 新穎乙醯柳酸鹽 - Google Patents

Description

新穎乙醯柳酸鹽

本發明大致上係關於乙醯柳酸鹽，特別是關於新穎且有用的水溶性乙醯柳酸鹽及其製造方法。乙醯柳酸係一最廣為使用之藥，主要知名於其鎮痛特性。其應用之範圍因為其低水溶性(約0.3%)而大幅降低。除了鋰鹽、鈉鹽、鎂鹽和鈣鹽外，尚有許多具鹼性胺基酸之鹽類已被揭露(美國專利US 4,265,888)。這些鹽類都具有某些優點和缺點，因此，有可得之潛在具更多優點特性之新穎的乙醯柳酸之鹽類會是有利的。

因為新穎之乙醯柳酸鹽類含有的甜菜鹼類化合物本身具有多樣的醫藥活性，該新穎之乙醯柳酸鹽類可具有乙醯柳酸或甜菜鹼之特性外更多有益之特性，包括新穎的醫藥活性。

乙醯柳酸係一最廣為使用之藥，主要知名於其抗發炎、鎮痛、退熱和抗風濕特性。其亦以小量日劑被用於心血管疾病高危患者作為抗血小板製劑(Eidelman RS等人著，內科學文獻 。2003年；163期：頁2006-2010)。在冠狀動脈心臟病期間，血小板在動脈粥狀硬化症和致命的血栓形成之發展中，扮演了關鍵性的角色。抗血小板製劑已成為預防及管理多種與心血管、腦血管、和周邊動脈系統相關之疾病之首選(Meadows TA等人著，循環研究 2007年；100(9)期：頁1261-75)。雖然多年來已知ASA用作抗血小板製劑，現今在心臟病學，ASA因其抗發炎特性而更為人所知(Ridker PM等人著，新英格蘭醫學期刊 1997年；336期：頁973-979)。據此，作為C-反應蛋白(CRP)的此發炎標記的臨床測量可部分反映動脈粥狀硬化症之指數(Buckley DI等人著，內科學年鑑 2009年；151期：頁483-495)。現今的證據指向，降低CRP之濃度預防CHD事件(Ridker PM等人著，柳葉刀 2009年；373期：頁1175-82)。Ross假設，動脈粥狀硬化症係一發炎疾病(Ross R，新英格蘭醫學期刊 1999年；340期：頁115-126)。ASA不僅可處理動脈粥狀硬化症的發炎方面，還可直接有助於誘導低脂血症(Kourounakis AP等人著，實驗與分子病理學 2002年，73期：頁135-138)。

NA係一有效的改變脂質劑，其可預防動脈粥狀硬化症並減少心血管事件。NA具有多種的脂蛋白與抗動脈粥樣血栓症效果，其改善內皮功能，減少發炎，增加斑塊穩定性，並降低血栓症(Rosenson RS著，動脈粥狀硬化症 2003年；171期：頁87-96)。

NA幾乎完全預防由凝血酶和腦垂腺後葉素誘發之血管內凝血，顯示了其具有溶解血栓之效果(Baluda VP著，心臟病學 1974年；14(11)期：頁105-7(俄文))。數名作者說明了NA之抗血栓之特性(Shestakov VA著，Probl Gematol Pereliv Krovi ，1977年；22(8)期：頁29-35。Chekalina SI，Sov Med 1982年5期：頁105-8)。菸鹼酸減少了血液凝塊的風險(Chesney CM等人著，美國心臟期刊 ，2000年；140期：頁631-36)。

NA抑制了血小板聚集(Lakin KM著，Farmakol Toksikol，1980年；43(5)期：頁581-5)。NA在活體外藉由溫和地抑制血小板聚集而影響血小板之活性，並刺激顯著的前列腺素釋放，及大部分完整的主要血小板受體表現。NA之效力之獨特的，不同於其他已知的抗血小板製劑，且提供了就醫藥組合物之潛在機會(Serebruany VL等人著，血栓症與止血 ，2010年(印刷中))。

NA係一有效的改變脂質劑，其可預防動脈粥狀硬化症並減少心血管事件。(Drexel H著，歐洲心臟期刊增刊 2006年；8期，補充F：頁F23-F29。Savel’ev AA與Shershevskii MG著，外科醫學(俄文) 1996年；74期：頁48-52)。

NA可有3種配方(立即釋放、延長釋放和長效作用)。立即釋放型NA與不良潮紅及血糖濃度升高有關。長效作用型NA與減少潮紅有關，但亦有肝毒性影響的危險。延長釋放型與較少的潮紅及低肝毒性危險有關(McKenney J著，內科學文獻 2004年；164(7)期：頁697-705)。

NA之臨床使用已受限於皮膚的潮紅。延長釋放菸鹼酸可助於控制潮紅事件(Guyton JR等人著，J Clin Lipidol ，2009年；3期：頁101-108)。已有人提出，ASA及其他NSAIDs可與不同的醫藥組合物控制潮紅，確認在NA給劑之前NSAIDs之有利應用(專利WO9632942、WO9906052、WO2009142731)。

日前，有人提出前列腺素D25之特異性拮抗劑(Parhofer KG著，血管健康與風險管理 2009年；5期：頁901-908)受體第1亞型，拉羅匹侖(laropiprant)，作為用於降低由NA誘發之潮紅的藥劑(Lai E等人著，臨床藥物和治療期刊 2007年；81期：頁849-857. Davidson MH，美國心臟病學期刊 2008年；101期[補充]：頁14B-19B)。雖然添加拉羅匹侖將降低潮紅的頻率，其並不完全消除此副作用。拉羅匹侖並不改變菸鹼酸對脂質之影響或其他的菸鹼酸之副作用。因此菸鹼酸與拉羅匹侖之組合可使菸鹼酸的高劑量使用，因此開發了此藥物的全部潛能(Parhofer KG著，血管健康與風險管理 2009年；5期：頁901-908，Olsson AG，藥理治療專家意見 2010年；11(10)期：頁1715-1726)。

MD係一具有某些對心臟與血管有益影響之藥物。某些可取的MS活性已在動脈粥狀硬化症之動物模型中發現(Veveris M、Smilsaraja B著，波羅的海動物科學實驗室 2000年；10期，頁194-199。Veveris M等人著，波羅的海動物科學實驗室 2002年；12期：頁116-122。Okunevich IV、Ryzhenkov VE著，Patol Fiziol Eksp Ter 2002年；(2)期：頁24-7)，以及在臨床上被觀察到(Karpov RS等人著，Ter Arkh 1991年；63(4)期：頁90-3)。已被注意的是，MD抑制血小板聚集(TsirkinVI，Ros Kardiol Zh 2002年；1期：頁45-52)。於實驗的動脈血栓症後經口施用於兔與犬兩週之MD醫療使用，顯示了溶解血栓之效果(Logunova L等人著，Experim Clin Pharmacoter 1991年；19期：頁91-9(俄文))。MD在控制或預防血栓症之預防效果方面並無已知的數據。

本發明之目標係發現具有某些甜菜鹼類化合物之新穎類型乙醯柳酸鹽。無法預期且出人意外的發現係，具某些甜菜鹼(其本身係吸濕的物質)之乙醯柳酸鹽產生穩定的水溶性結晶鹽類。

據此，本發明之一目標係提供乙醯柳酸鹽，其具高水溶性且具優異之穩定性和保存期。

本發明之進一步目標係提供用於製造該鹽類之方法。

本發明之另一目標係提供用作於藥劑之米曲肼乙醯柳酸鹽(3-(三甲基肼)丙酸鹽乙醯柳酸加成鹽)。

本發明之一目標係提供一藥品，亦即3-(三甲基肼)丙酸鹽乙醯柳酸加成鹽(米曲肼乙醯柳酸鹽)，其具有抗發炎、鎮痛、退熱、抗風濕、抗高脂血、抗動脈粥樣硬化、抗聚集和抗血栓特性。本發明之另一目標係一方法，其治療需要抗發炎、鎮痛、退熱、抗風濕、抗高脂血、抗動脈粥樣硬化、抗聚集和抗血栓治療之主體。本發明之另一目標係提供一醫藥組合物，其包含如上述目的之MASA。本發明進一步之目標將在下文中更為明顯，且其他的目標對於本領域中熟習此藝者將顯而易見。

較佳具體實施例之說明

下列為本發明不同之鹽類及方法及其等之特性之實例。

實例1. 4-三甲銨基丁酸乙醯柳酸加成鹽

溶解γ-丁醯甜菜鹼二水合物(1.81公克，10毫莫耳)以及乙醯柳酸(1.80公克，10毫莫耳)於乙醇(20毫升)中。在真空中於約40℃濃縮該溶液，直至會在冷卻時形成結晶的糖漿濃度。以丙酮(50毫升)研磨該結晶團塊、過濾之、以丙酮清洗之，並在真空中室溫下乾燥之。具熔點120-122℃之無色結晶之產量為3.04公克(產率93.5%)。此物質為水溶性，在環境條件下穩定。

¹ H NMR光譜(D₂ O，TMS)化學位移δ：1.93-2.12(2H，多重峰，CH₂ CH ₂ CH₂ )；2.33(3H，單峰，COCH₃ )；2.40(2H，三重峰，J值=7.0赫茲，CH₂ COO^- )；3.09(9H，單峰，Me₃ N)；3.24-3.37(2H，多重峰，CH₂ N)；7.16(1H，二雙重峰，J值=1.1和8.1赫茲，H-3)；7.38(1H，三雙重峰，J值=1.1，7.6和7.6赫茲，H-5)；7.56(1H，三雙重峰，J值=1.8，7.6和8.1赫茲，H-4)；7.79百萬分之一(1H，二雙重峰，J值=1.8和7.6赫茲，H-6)。

C₁₆ H₂₃ NO₆ 。經計算%：C 59.07；H 7.13；N 4.30。

經發現%：C 59.17；H 7.20；N 4.23。

此新穎鹽之特徵在於，X光粉末圖譜(Cu K_α -放射線)具有峰2Θ角5.10、13.58、13.83、15.02、15.17、17.89、19.33、19.87、21.85、22.05、23.32、23.56、23.92、24.75、25.55、25.80、27.05、27.91、30.25±0.2°。

該新穎鹽類之結構係藉由X光單晶結構分析所確認(圖1)。結晶係單斜晶體的，細胞參數於實驗溫度T=-85℃係：a=13.2154(6)，b=7.5092(3)，c=17.6451(9)，β=104.728(2)，細胞體積V=1693.5(1)，晶架群P2₁ /a。

實例2. L -肉鹼乙醯柳酸加成鹽

溶解L -肉鹼(1.61公克，10毫莫耳)以及乙醯柳酸(1.80公克，10毫莫耳)於乙醇(20毫升)中。在真空中於約40℃濃縮該溶液，直至會在冷卻時形成結晶的糖漿濃度。以丙酮(50毫升)研磨該結晶團塊、過濾之、以丙酮清洗之，並在真空中室溫下乾燥之。具熔點90-94℃之無色結晶之產量為3.17公克(產率93%)。此物質為水溶性，在環境條件下穩定。

¹ H NMR光譜(D₂ O，TMS)化學位移δ：2.32(3H，單峰，COCH₃ )；2.53(2H，雙重峰，J值=6.6赫茲，CH₂ COO^- )；3.18(9H，單峰，Me₃ N)；3.38-3.45(2H，多重峰，CH₂ N)；4.59(1H，五重峰，J值=6.1赫茲，CH OH)；7.15(1H，二雙重峰，J值=1.1和8.1赫茲，H-3)；7.37(1H，三雙重峰，J值=1.1，7.6和7.6赫茲，H-5)；7.56(1H，三雙重峰，J值=1.8，7.8和7.8赫茲，H-4)；7.79百萬分之一(1H，二雙重峰，J值=1.8和7.8赫茲，H-6)。

C₁₆ H₂₃ NO₇ 。經計算，%：C 56.30；H 6.79；N 4.10。

經發現：%：C 55.67；H 6.85；N 4.12。

此新穎鹽之特徵在於，X光粉末圖譜(Cu K_α -放射線)具有峰2Θ角5.09、12.62、13.48、13.84、15.04、17.82、19.15、19.77、21.84、22.56、23.33、23.92、24.40、25.17、25.43、26.14、27.24、29.50、30.36±0.2°。

該新穎鹽類之結構係藉由X光單晶結構分析所確認(圖2)。結晶係單斜晶體的，細胞參數於實驗溫度T=-85℃係：a=13.1342(6)，b=7.6396(3)，c=17.737(1)，β=104.535(2)，細胞體積V=1722.8(2)，晶架群P2₁ 。

實例3. 3-(三甲基肼)丙酸鹽乙醯柳酸加成鹽(米曲肼乙醯柳酸鹽)

溶解3-(三甲基肼)丙酸鹽二水合物(INN-米曲肼)(3.64公克，20毫莫耳)以及乙醯柳酸(3.60公克，20毫莫耳)於熱丙醇-2(30毫升)中，並於50-55℃加熱20分鐘。停止加熱，並在室溫下攪拌該溶液3小時。進一步將漿液於0℃攪拌另外3小時，過濾掉沉澱物並以冷丙醇-2(2x15毫升)清洗之。所欲之鹽類從丙醇-2再結晶出。獲得具熔點104-106℃之無色結晶。產量為4.12公克(產率63%)。

¹ H NMR光譜(D₂ O，TMS)化學位移δ：2.34(3H，單峰，COCH₃ )；2.51(2H，三重峰，J值=6.4赫茲，CH₂ COO^- )；3.26(2H，三重峰，J=6.4赫茲，CH₂ N)；3.33(9H，單峰，Me₃ N)；7.17(1H，二雙重峰，J值=1.1和7.8赫茲，H-3)；7.39(1H，三雙重峰，J值=1.1，7.6和7.6赫茲，H-5)；7.58(1H，三雙重峰，J值=1.7，7.6和7.8赫茲，H-4)；7.81百萬分之一(1H，二雙重峰，J值=1.7和7.6赫茲，H-6)。

C₁₅ H₂₂ N₂ O₆ 。經計算，%：C 55.21；H 6.79；N 8.58。

經發現，%：C 55.25；H 6.79；N 8.53。

此新穎鹽之特徵在於，X光粉末圖譜(Cu K_α -放射線)具有峰2Θ角5.19,13.22,13.82、14.20、14.95、15.36、15.93、18.11,18.97,19.74、21.02、22.15、23.15、23.65、24.31、25.28、26.18、26.58、27.73、28.36±0.2°。

該新穎鹽類之結構係藉由X光單晶結構分析所確認(圖3)。結晶係單斜晶體的，細胞參數於實驗溫度T=-85℃係：a=19.3399(8)，b=7.2400(3)，c=35.237(2)，β=90.758(2)，細胞體積V=4933.5(4)，晶架群P2₁ /n。

X光單晶繞射數據明確地顯示，在3,3,3-三甲基銨丁酸、L-肉鹼和3-(三甲基肼)-丙酸結晶結構中之羧基係質子化的，因此顯示了自乙醯柳酸之質子移轉及鹽類形成。就3,3,3-三甲基銨丁酸乙醯柳酸加成鹽之結晶結構，羧基中鍵結長度值C=O和C-O係分別為1.215和1.305，就L-肉鹼酸乙醯柳酸加成鹽之結晶結構，則為1.194和1.308，以及就3-(三甲銨基胺)丙酸乙醯柳酸加成鹽之結晶結構，則為1.219和1.321。相應地，就乙醯柳酸片段之三個結晶結構之羧基C=O和C-O鍵結，係全相同且具有約1.26之值。

3-(三甲基肼)丙酸鹽乙醯柳酸加成鹽(米曲肼乙醯柳酸鹽)之藥理學特性

所設想的是，本申請案所揭露之新穎物質可呈現多種之多形體結晶形式和溶劑合物，較佳地為水合物，其具有相似生物特性，因此被含蓋於本申請案中作為所述之化合物的變化例。

我們首先已建立了米曲肼乙醯柳酸鹽延遲，並顯著地降低由菸鹼酸所導致之皮膚血管擴張。進一步之實驗證明了米曲肼乙醯柳酸鹽之出人意外地改良之藥理學活性。

所使用之縮寫

為了簡便，在本說明中進一步使用下列縮寫：

AdA-佐劑性關節炎

ASA-乙醯柳酸

C-膽固醇

CHD-冠狀動脈心臟病

CIC-循環免疫複合物

CL-氯吡格雷

CRP-C-反應蛋白

DI-雙吡大莫

HDL-高密度脂蛋白-膽固醇

LA-拉羅匹侖(laropiprant)

LDL-低密度脂蛋白-膽固醇

MASA-米曲肼乙醯柳酸鹽(化學表示：3-(三甲銨基胺)-丙酸乙醯柳酸加成鹽)

MD-米曲肼(INN)

NA-菸鹼酸(nicotinic acid)，菸鹼酸(niacin)

RA-類風濕性關節炎

TG-三酸甘油酯

TR-四丁酚醛(Triton) WR1339

WBC-白血球細胞

物質- NA(阿庫羅斯福岡化學品Acros Chemicals)，MD(格林德斯Grindex)，ASA(阿庫羅斯福岡化學品)，LA(MK 0524，開曼化學品Cayman Chemicals)，保栓通(Plavix^TM )用於活體內 測試之CL(賽諾菲安萬特Sanofi-Aventis)，DI(西克瑪艾爾迪西西格馬Sigma-Aldrich)。

實例4-測定之MASA急毒性

藉由經口導入法(p .o . introduction)在韋斯大鼠和ICR小鼠身上測定MASA之急毒性。

方法- 使用體重20-22公克之雄性IRC小鼠和體重200-230公克之韋斯大鼠。為了測定急毒性，各給予6隻動物一劑量，各下一劑皆增加500毫克/公斤之量。在寇氏法(Karber)之後，藉由由文獻Akhila JS等人著，當代科學 2007年；93期：頁917-920之方法計算LD₅₀ ，並有所修飾以測定信賴區間(Turner R著，藥理學篩選方法 ，學術出版社，紐約市，1965年，頁61-63)。

LD₅₀ 之計算如下：

LD₅₀ =對群組中所有成員的最小致死劑量-Σ(a x b)/N

N-每一群組中之動物數量

a-劑量變異

b-平均死亡率(2鄰接群組之死亡數/2)

將MASA即時(ex tempore )溶解於0.2%瓊脂中並以導管經口導入胃中。導入之液體量對小鼠言不超過0.5毫升，對大鼠言不超過2毫升。觀察動物直到導入第10天後。結果- MASA對小鼠之急毒性之結果表示於表1和表2中。

LD₅₀ =3000-(5000/6)=2167

此實驗之係數f 於P=0.05為1.32，因此LD₅₀ 之信賴區間為1642-2860(毫克/公斤)。

在導入MASA後，在最初的幾個小時內顯現毒性效果，且一部分之動物在最初2天內死亡。存活下來的動物的毒性症狀逐漸消退，且在5-8天後這些動物與同年齡的控制組動物並無不同。因此發現經口導入MASA對於小鼠之LD₅₀ 為2167(1642÷2860)毫克/公斤。

經口導入MASA對大鼠之急毒性之結果表示於表2和表3中。

LD₅₀ =3000-(4500/6)=2250

此實驗之係數f 於P=0.05為1.308，因此LD₅₀ 之信賴區間為1720÷2944(毫克/公斤)。

經口導入劑量1500毫克/公斤之MASA至大鼠導致飲食習慣與運動短暫的干擾，但所有動物皆存活。在導入3天後毒性症狀開始消失。因此發現經口導入MASA對於大鼠之LD₅₀ 為2250(1720÷2944)毫克/公斤。

概要- 該急毒性研究指出，MASA係一低毒性之物質(經口導入小鼠和大鼠之LD₅₀ >2000毫克/公斤)。就ASA之急毒性，取自於勃林格殷格翰製藥公司(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals,Inc.)，阿庫羅斯福岡化學品(Acros Chemicals)和西克瑪艾爾迪西(西格馬Sigma-Aldrich)，經口導入對小鼠言係250毫克/公斤，對大鼠言係200毫克/公斤，而拜耳公司(Bayer AG)所給之LD₅₀ ，經口導入對大鼠言係>1100毫克/公斤，因此MASA比ASA毒性低。

實例5-MASA之鎮痛、退熱和抗發炎活性之研究，與ASA和MD比較實驗

MASA之鎮痛、抗發炎和退熱效果之研究，係使用廣泛使用之評估NSAIDs之方法。實驗使用雜種白色實驗室小鼠和韋斯大鼠。在22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中將動物以7-8隻一組置於適當的籠中，給予12/12-小時光照/黑夜循環，及可自由取用食物與水。

為了比較MASA與ASA和MD經口導入之效果，形成下列群組：

即時(ex tempore )準備待測物質之水狀溶液。在每一實驗系列中，使用一控制組，其接受經口導入相同量的水。

統計- 藉由軟體Microsoft Excel 2007分析數據，結果以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。根據ANOVA使用單因子分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同群組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

5.1.鎮痛活性之研究 5.1.1.以小鼠扭體試驗評估鎮痛活性

方法- 評估痛覺反應以化學刺激方法-扭體試驗(Charaborty A等人著，印度藥學期刊 2004年；36(3)期：頁148-150)。經腹腔注射(i.p. )，動物獲得0.25毫升之0.75%水狀醋酸溶液。在注射之後，動物被分開置於特別的箱子內並觀察10分鐘。記錄腹部收縮之數目。以10分鐘週期內減少之腹部收縮數目顯現鎮痛活性。在刺激劑30分鐘之前導入待測物質。止痛作用之程度以下式算出的鎮痛指數表示：

A=(Cc-Ct)/Cc‧100%，其中

A-鎮痛指數

Cc-控制組中收縮之數目，

Ct-實驗組中收縮之數目。

結果顯示於表4。

MASA顯示了依劑量而定的陽性效果。於ASA50和MASA300(P<0.0005)組觀察到最佳結果，而MD係無作用的。MASA300組之鎮痛指數係7.3(8隻動物中僅有5隻有疼痛反應)。

5.1.2.藉由小鼠熱板試驗評估鎮痛活性

方法- 實施熱板試驗於52隻體重17-26公克之小鼠，如文獻所述(Belyakov VA和Solov’ev IK.麻醉鎮痛 ，Nizhny Novgorod城市，2001年(俄文))。使用熱板試驗來篩選中樞作用型鎮痛(Osterberg A等人著，藥理與治療實驗期刊 1958年；122期：頁59)。在試驗之前30或60分鐘經口導入待測物質之水溶液。記錄從開始直到舔腳爪的時間。鎮痛活性之標準為對熱刺激回應的遲延。

結果顯示於表5。

實驗數據指出，在30和60分鐘後MASA150和MASA300以及MD組顯現了明顯的鎮痛效果。ASA僅在60分鐘後顯著地增加疼痛閾值，此指出其效果較慢開始(表5)。

5.2.　待測物質之退熱活性的比較評估 5.2.1.以注射致熱源評估大鼠之預防性退熱活性

方法- 對48隻體重為165-182公克之韋斯大鼠進行實驗，肌肉注射致熱源(Gamalei國家研究機構 ，莫斯科市，俄羅斯)，劑量為100微克(Shwarz GY和Syubaev RD著，Vedomosti NCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000年；1期：頁44-50(俄文))。在致熱源注射前一小時經口給予待測物質。在注射致熱源前(基準)及注射後3小時間以電子體溫計TERMO測量直腸溫度。注射致熱源後2小時高溫反應之降低來評估退熱活性，其關於反應峰值對發表的數據(10)有良好的相關性(表6)。環境溫度被維持在20-21℃。

如數據所得，控制組動物之體溫逐漸地增加，在2小時內到達最高值，並在下一小時繼續高於正常範圍。

待測物質並無實質上影響動物之正常體溫，但實質上降低了致熱源誘發之過高熱(表7)。

控制組

^## P<0.005vs 基準-^$ P<0.05vs MD

在過高熱模型中，注射致熱源誘發之體溫增高在ASA50組和MASA300組中完全地被預防(表7)。在MD100組、MASA75組和MASA150組中退熱效果較不明顯。

5.2.2.以注射致熱源評估大鼠之預防性退熱活性(治療模式)

方法- 對48隻體重為182-205公克之韋斯大鼠研究待測物質在醫療(治療)模式之退熱效果，以注射100微克劑量(Shwarz GY和Syubaev RD著，Vedomosti NCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000年；1期：頁44-50(俄文))致熱源誘發過高熱(Gamalei國家研究機構 ，莫斯科市，俄羅斯)。在致熱源注射後2小時、記錄到體溫升高後立即經口給予待測物質。在肌肉注射致熱源前(基準溫度)、過高熱峰(致熱源控制)及以待測處理物質30分鐘後(及注射致熱源2小時後)以電子體溫計TERMO測量直腸溫度。實驗室環境溫度被維持在20-22℃。

結果顯示於表8中。

對實驗中所有動物，致熱源誘發明顯及相似的體溫增高(比較致熱源控制vs.基準，表8)。以待測物質處理，除MD外，導致了體溫降低，相對於基準和致熱源控制。在MASA300組和ASA50組中觀察到相對較多的低溫，其中體溫降低係明顯的，相較於控制組和MD100組。值得注意的是，在MASA300組中，與ASA50相反，對致熱源控制的體溫降低亦為明顯的。這指出MASA的相當迅速退熱效果，其可能在臨床上有價值。

5.3.待測物質之抗發炎活性的比較評估 5.3.1.急性發炎的水腫模型之研究

方法- 使用紅藻膠試驗(Winter C等人著，實驗生物學與醫學之社會公報 1962年；III(3)期：頁544-547。Wei Jia等人著，民族藥理學期刊 2003年(89期)：頁139-141；Sutharson Lingadurai等人著，傳統、補充與替代藥物非洲期刊 ，2007年，4(4)期：頁411-416)於42隻體重為226-274公克之大鼠身上來進行實驗。單一注射於鹽水(0.1毫升)中之紅藻膠(西格馬Sigma)溶液(1%)導入大鼠後肢腳掌。在注射紅藻膠30分鐘後，經口導入待測物質(經由導管送至胃)。以器官體積測量器在基準時和注射紅藻膠後4小時測量腳掌之體積。

根據下式計算預防的比率(水腫之抑制)：

P(%)=(1-Vo/Vc)x 100，其中

P-預防的百分比(水腫之抑制)

Vo-基準與實驗條件下之間腳掌體積之差異；

Vc-在控制組中之類比差異。

結果顯示於表9。

在急性發炎的水腫模型中，控制組中患肢體積增加大約1.6倍。在MASA150組觀察到對發炎過程顯最著的效果，其中預防性指數為93%相對於控制組。在MASA300組中，活性稍為較低-水腫被降了91%。在MD100組和ASA50組亦觀察到水腫之降低。

5.3.2.　在預防性模型中待測物質對紅藻膠水腫之抗發炎活性研究

方法- 藉由已建立之方法(Okunevich IV和Ryzhenkov VE著，Patol Fiziol Eksp Ter ，2002年(2期)：頁24-7(俄文))於42隻體重為178-220公克之大鼠來研究紅藻膠水腫。在5天的期間內經口導入待測物質。於第6天，在導入待測物質至大鼠後，立即在後腳掌給予0.1毫升1%紅藻膠溶液注射。在基準時和注射紅藻膠4小時後測量腳掌體積。以如前節所述來計算預防指數。待測物質之預防性導入6次造成水腫之減少，相較於未被處理的動物(表10)。

此發炎的模型中，在MASA150組和MASA300組中，觀察到一明顯的預防性活性(94%)，其較高於MD100組(34%)和ASA50組(70%)(表10)。

為評估發炎過程之強度，在實驗最後(注射紅藻膠後5小時)，藉由標準方法在一分析器_<< INTEGRA 400+_>> 上測定CRP濃度。

血中CRP測定之結果表示於表11中。

如數據所得出，紅藻膠導至大鼠血中CRP增加。在ASA100組中，CRP濃度減少了50%之增加(表11)。意想不到地，在MASA150組中，明顯地增加之CRC濃度較不顯著(相對控制組僅33%)。其支持了MASA在臨床上對發炎過程可具有正面效用之理論。

實例6-MASA對照ASA和MD之抗風濕活性之研究

臨床的證據顯示，具類風濕性關節炎(RA)之病人，先前即患有動脈粥狀硬化症和心血管疾病(Nasonov EL著，Vestn Ross Akad Nauk 2003年(7期)：頁6-10)。具長期RA之患者，比起同年齡之更近期患病之患者，具更多的動脈粥狀硬化症。系統發炎可增大與年齡相關之心血管疾病的風險(Del Rincon I等人著，動脈粥狀硬化症 2007年；196(2)期：頁354-360)。

在類風濕性病症中，類風濕性關節炎排名第一。對人類類風濕性關節炎最適用的實驗性動物模型為佐劑性關節炎模型，其藉由注射弗氏佐劑至大鼠後腳掌誘發。其被廣泛用於篩選抗關節炎藥劑(Wei Jia等人著，民族藥理學期刊 2003年(89期)：頁139-141；Sutharson Lingadurai等人著，傳統、補充與替代藥物非洲期刊 ，2007年，4(4)期：頁411-416)。

方法- 我們安排之實驗，是為了測試MASA對佐劑性關節炎過程之影響，對照MD和ASA。於起始體重153-185公克之韋斯大鼠進行實驗。將大鼠置於22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中，給予12/12-小時光照/黑夜循環。每一標準籠放置7隻大鼠，給予無限取用之飲水與顆粒狀標準餵食。所有實驗皆依據1986年11月24日歐洲共同體議會指令(86/609/EEC)有關實驗動物照護的規定而實施。所有的努力皆為將動物的痛苦減到最小並減少動物的使用量而做。

使用一種經修飾之標整程序，用以引導與評估慢性佐劑性關節炎之過程(Bellavite P、Ortolani R和Conforti A著，免疫學和順勢療法3動物模型實驗研究，Advance Access Publication 2.05，2006年，頁171-186)。注射完全弗氏佐劑溶液0.1毫升至大鼠之後腳掌及0.05毫升至大鼠之腹腔。

當場製備待測物質之溶液。使用之量為ASA 0.1%和1%，MD 1%，以及MASA 0.25%、1%和2%水溶液。待測溶液藉導管經口導入動物之胃中。

形成下列動物群組(N=7)：

控制組之動物和AdA組之動物，不接受待測物質，而是以與試驗組同樣計畫表經口接受水。

統計- 藉由軟體Microsoft Excel 2007分析數據，結果以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。根據ANOVA使用單因子分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同群組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

結果- 研究第14天和第28天關節炎之臨床顯現的動力學。

使用下列判斷標準評估待測物質之效果：

1.區域顯現關節炎之評估-腳掌體積和踝關節圍。

2.血球計數(WBC)之評估。

3.生化測試(CRP)之評估。

4.免疫指數(CIC濃度)之評估。

以器官體積測量器測量水腫，亦即後腳掌之體積。根據下式計算預防(抑制水腫)的百分比：

P(%)=(Vc-Vt)/Vc x 100，其中

Vc-控制組中腳掌體積

Vt-試驗組中腳掌體積

P-預防(抑制水腫)的百分比。

以標準方法在血液分析器PENTRA120上測定血液指數，在INTEGRA400+上測定CRP。以光譜測定血清中CIC濃度，使用乙二醇。

在注射弗氏佐劑後，試驗組的所有動物皆發展慢性發炎，大鼠係疲勞的、具攻擊性的，毛髮蓬亂的。然而餵食習慣在所有群組中皆無與控制組不同。所有群組中體重的增加與控制組並無實質上不同。

表12和13表示了第14天和第28天關節炎區域顯現之數據：腳掌體積(特色為軟組織之水腫)和踝關節之圍/體積(特色為關節組織之關節炎型器官損害)。

如表12所得，在第14天時試驗組所有的動物發展了軟組織的顯著的水腫。14天期間的處理相對的對水腫之發展極小的影響。然而，MASA100組和MASA200組之動物，相較於ASA10組之動物，明顯具有較不顯著的水腫。在第14天時MD和ASA10組不僅並無預防水腫之發展，比起AdA組反而具有更大體積(負面保護-7%)。在第28天MASA之所有劑量以及ASA100顯著地避免水腫發展(保護%，各為41、45、24和32%)。值得注意的是，MASA100相較於ASA10、ASA100和MD，展現了顯著較佳得保護。

踝關節數據之分析(表13)顯示了，在第14天時，僅有MASA200顯著地阻止關節炎損傷的進程。在第28天時，MASA25、MASA100和ASA100顯示了明顯的保護。在此實驗設定中，MASA100表現了相對最佳的保護。我們已建立了，在第28天時，水腫的程度(表12)和踝關節之關節炎變化(表13)都被減弱了。比起ASA或MD，MASA100顯著地更有效。WBC之評估顯示了在弗氏佐劑影響下係增加的(白血球增多症)(表14)。白血球增多症是發炎過程之一特性。

相較於AdA組，待測物質之使用造成WBC之降低，這表示了抗發炎活性。雖然在待測物質對白血球濃度之增加的效果間沒有統計上明顯的不同，第14天時，MASA100顯示了相對較高的活性，但在第28天時則為MASA200(表14)。為了評估發炎過程的發展，在第14天和第28天測定CRP濃度。已知CRP濃度在發炎過程期間會增加。

如表15中數據所得，在第14天時所有的試驗組顯示了CRP濃度之增加，表示發炎的過程。在我們的實驗設定中，在第14天時僅有MASA200展現了明顯的防止CRP增加的保護。應注意的是，MASA200在第14天時具有實質上較MASA100佳之效果。在第28天時，MASA25和MASA100展現了顯著地較ASA10佳的保護(表15)。

由標準分光光度方法(Baranovskii PV和Rudyk B1著，化驗工作 1982年；12期：頁35-39(俄文))測定CIC濃度。以動力學研究在第14天及第28天之免疫因子。濃度之改變顯示於表16中。

在第14天和第28天，試驗組之CIC濃度係較控制組高。在第14天，僅有ASA10和MASA25組之CIC濃度較AdA組低。在第28天，接受待測物質群組中之CIC係接近控制組，但ASA100組除外。

於實驗期間，在第14天時，觀察到ASA100、MASA100和MASA200組中CIC濃度之增加。在第28天時，MASA100和MASA200組中CIC濃度已正常化。可在多種免疫病理症狀中觀察到血清中CIC濃度之增加。在發炎的過程中(包括系統的症狀)可觀察到CIC之實質增加，CIC濃度指出病理過程之強度(Bier O等人著，基礎免疫學 ，紐約，海德堡，柏林，頁442)。以不同劑量之MASA做長期治療降低CIC濃度至正常範圍。在充分的主動免疫下，CIC的主要部分被柯弗氏細胞移除，且CIC濃度之降低被理解為具正面效益。第28天時，在MASA100和MASA200組中，使用MASA展示了使CIC濃度正常化的效益，此事實指出，不同劑量之MASA之長期使用，可在臨床上治療關節炎，較提高ASA劑量更有希望。

實例7.抗高脂血特性之研究

動脈粥狀硬化症係一多因素過程(Berliner JA等人著，血液循環 1995年；91期：頁2488-2495)，具有伴隨著增加的冠狀動脈心臟病症狀之增加的臨床上巨大影響。發炎及有機組織對其之反應，在動脈粥樣硬化過程中扮演一實質上的角色(Ross R，美國心臟期刊 1999年；138期；頁S419-S420)。臨床的觀察指出，抗發炎之治療降低了動脈粥狀硬化症之出現(Stoller DK等人著，外科研究期刊 1993年；54期：頁7-11)。實驗數據確認了抗發炎活動與降血脂活動之間相當的關聯，至少在COX-1抑制劑間(Kourounakis AP等人著，實驗和分子病理學 2002年；73期：頁135-138)。我們比較了ASA和MASA在相同劑量下之降血之活性。

7.1.大鼠急性高血脂症模型中待測物質對脂質濃度之比較效果

方法- 使用體重為250-270公克之雄性韋斯大鼠。在22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中將動物以6-8隻一組置於適當的籠中，給予12/12-小時光照/黑夜循環，及可自由取用食物與水。以四丁酚醛(Triton) WR1339(TR)誘發急性實驗性高血脂症/高膽固醇血症，如由Kourounakis AP等人著，實驗和分子病理學 2002年；73期：頁135-138所述者。大鼠在隔夜禁食後，以劑量250毫克/公斤之溶於等滲鹽水之經口處理。在導入TR前1小時及後20小時，經口導入待測物質之溶液或水至控制組和TR組動物中，如下所述。

在隔天(注射TR後24小時)藉由在乙醚麻醉下心臟穿刺以蒐集用於生化分析的血液。以離心分離出血清，並以商業可得之套件分析總膽固醇、HDL、LDL和TG濃度。

進行三個系列的實驗。

統計- 藉由軟體Microsoft Excel分析數據，結果以平均數+/-平均標準差表示。根據ANOVA及學生t檢驗使用單因子分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同群組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

系列I-比較ASA，MD和MASA

結果- 接受TR之大鼠發展了顯著的高膽固醇血症和高血脂症，其之總膽固醇、LDL和TG濃度顯著地不同於控制組之大鼠(總C增加6-7倍，TG 30倍-更多見表17)。ASA治療，尤其是劑量90毫克/公斤，限制了總C、LDL和TG之增加，但並不顯著地改變HDL濃度。MD在我們的實驗設定中並無顯著地阻止由TR導致之脂質濃度之改變。使用MASA之治療造成劑量依賴性地阻止TR誘發之高血脂症/高膽固醇血症。劑量75毫克/公斤MASA與ASA45並無不同，但在阻止TR之效果上，MASA150比起ASA45和MD150更加有效。在降低總C、LDL和TG方面，MASA300遠勝於ASA45和ASA90。這指出MASA可實用於預防和/或治療高膽固醇血症和高脂血狀況，及思及其抗發炎活性可實用於預防和/或治療動脈粥狀硬化症和由脂質代謝失調和發炎促進的其他病症。

系列II-比較ASA、MASA、NA以及ASA+NA、MASA+NA組合物

結果- 在我們的實驗設定中，NA提供了明顯的由TR誘發之脂質(C、LDL和TG)濃度改變的對抗保護(見表18)。ASA和NA之組合物並不顯著地改變對脂質濃度之影響。出人意外地，MASA和NA之組合物相當增強了NA50之效果，並勝於MASA對由TR誘發之TG濃度增加之保護效果(表18)。MASA和NA之組合使用，比起ASA45+NA50對LDL和TG濃度之正常化效果，亦顯著地更有效。

系列Ⅲ-比較SI、MD、MASA和SI+MD、SI+MASA組合物

結果- 在我們的實驗設定中，SI在劑量5毫克/公斤時提供了明顯的由TR誘發之脂質(C、LDL和TG)濃度改變的對抗保護(見表19)。SI與待測物質之組合物增加了對脂質濃度正常化之效果。MASA與SI之組合物對於抗衡由TR誘發之LDL和TG濃度之增加，顯著地較MD+SI更有效(表19)。MD與施德丁之組合物已被專利WO2006099244所提出，其不具任何數據。施德丁和ASA之結合使用須要別的醫藥組合物，因為該等物質在藥理學上和化學上皆不相容的(專利US 6,235,311)，因此不可能有協同作用。

概要- 結果指出MASA於預防和/或治療高膽固醇血症和高血脂症之潛力。思及MASA之抗發炎活性，其可較ASA或MD於預防和/或治療動脈粥狀硬化症和其他由發炎促進之病症更有效。MASA和NA之結合使用增強了單獨物質對於在實驗上增加脂質濃度之正面效果，優於ASA加上NA。MASA與SI之組合物不僅較SI單獨更有效，而且亦對於抗衡由TR誘發之LDL和TG濃度之增加，顯著地較MD+SI更有效。

7.2. NA和MASA在大鼠慢性高血脂症模型之脂質方面分別的以及組合物的影響

方法- 使用雄性韋斯大鼠。在22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中將動物以7-8隻一組置於適當的籠中，給予12/12-小時光照/黑夜循環，及可自由取用水與食物。動物之初始體重為220-240公克。使用Levine和Saltzman所述之方法(Levine S和Saltzman A著，藥理和毒理方法期刊 2007年；55期：頁224-226)以TR誘導實驗性慢性(亞慢性)高血脂症/高膽固醇血症。動物經由尾靜脈接受250毫克/公斤TR溶液，一週三次共三週。每天一次在注射TR溶液或採血樣品前一小時經口導入用於實驗組之待測物質之溶液或用於控制組之水，根據下列計畫：

在1、2、3週後(在TR注射後隔天起算)在乙醚麻醉下藉由心臟穿刺獲得用於生化分析之血液。以離心分離出血清，並以商業可得之套件分析總C、HDL、LDL和TG濃度。

統計- 藉由軟體Microsoft Excel分析數據，結果以平均數+/-平均標準差表示。根據ANOVA和學生t檢驗使用單因子分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同群組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

結果- 重複注射TR發展了明顯且穩定的高膽固醇血症和高血脂症，其特徵在於相較於控制組，顯著的總C、LDL和TG濃度之增加(總C增加6-7倍，TG至30及更多，見表21)。NA療法，特別顯著地在第一週，限制了總C、LDL和TG之增加，但僅在2和3週時顯著地增加HDL濃度。MASA幾乎與NA同樣地降低了總C和LDL濃度並增加了HDL濃度，但就阻止由TR導致的TG增加方面，則少於NA(見表20)。出人意外地，NA+MASA之組合使用在3週之後，相較於NA或MASA個別，在降低總C、LDL和TG濃度方面和增加HDL濃度方面，實質上更佳。因此，預期NA+MASA之組合物於預防和/或治療高膽固醇血症和高血脂症方面係有用的。

^& P<0.05vs MASA

MASA和NA之組合使用顯著地較物質單獨作用更有效。

實例8.待測物質對血小板聚集和血栓形成之影響 10.1.血小板聚集

ASA是最被廣泛使用的預防用抗血小板製劑之一(Miner J等人著，得克薩斯心臟研究所期刊 2007年；34(2)期：頁179-186)。ASA已與NA結合作為抗發炎劑(專利US 3,312,593)和抗血小板製劑(專利WO 9632942)。許多其他藥劑及其等之結合物係已知的。已被建立的是，MD正常化血管緊張性，抑制血小板聚集和脂肪酸氧化，並在心肌缺血期間優化耗氧量(Tsirkin VI著，Ros Kardiol Zh 2002年；1期：頁45-52)。NA亦稍為抑制血小板聚集(Lakin KM等人著，Farmakol Toksikol ，1980年，43(5)期：頁581-5(俄文))。典型的抗血小板製劑氯吡格雷係被單獨使用的(專利US 4,529,596、US 4,847,265、US 5,576328)或與施德丁組合(專利WO9804259)或與ASA組合(專利WO9729753)。抗血小板製劑雙吡大莫亦可與ASA結合(Halkes PH等人著，柳葉刀 2006年，367(9523)期：頁1665-73)。臨床經驗指出多種藥劑組合物的更高通用性。

方法- 在多板(Multiplate)上使用全血阻抗凝集來研究血小板聚集(多種血小板功能分析儀，Dynabyte Medical公司，德國)(Toth O等人著，血栓形成與止血法期刊 2006年；96期：頁781-788。Velik-Salchner C等人著，麻醉與止痛期刊 2008年；107期：頁1798-1806)。從未曾使用過ASA或任何其他抗血小板製劑之健康捐贈者B.(37歲)採集用於在活體外實驗之血液樣本至以水蛭素覆蓋之塑膠管中(Dynabyte Medical公司，德國)，以用於在採集後30分鐘到4小時之間測量。在間接體內(ex vivo)實驗中，採集從被麻醉之已經口處理待測物質3天的大鼠之血液至以水蛭素覆蓋之塑膠管中(Dynabyte Medical公司，德國)。根據經修飾之Dynabyte Medical公司之科學實驗計畫來進行測量。等滲氯化鈉溶液(0.3毫升，或具欲研究之化合物之鹽水(每一種皆至最終濃度10^-4 毫莫耳/毫升))被預加熱至37℃並用移液管移至測試細胞中，再加入0.3毫升以水蛭素抗凝之全血樣本。經5分鐘培養後，在37℃攪拌之，以添加適當的促效劑溶液(取得自Dynabyte Medical公司，德國)來開始測量：

1)　二磷酸腺甘酸(ADP)-ADP-測試。ADP藉由ADP受體(P2Y12及其他)刺激血小板活化。

2)二十碳四烯酸(AA)-ASPI-測試：藉AA活化-環加氧酶之基質形成凝血脂素A2(TXA2)，其為一強效的血小板促效劑。

3) ADP HS測試(前列腺素E₁ 與ADP之組合)。添加內源性抑制劑PGE₁ ，使得ADP HS測試對氯吡格雷和相關藥物之效果相較於ADP測試更加敏感。

記錄聚集曲線6分鐘，並使用Dynabyte Medical公司之軟體分析。我們計算了下列血小板聚集之參數：

1)Amax，以任意單位(AU)之聚集的血小板聚集表現之最大值；

2)AUC，在聚集曲線下之總面積(AU*min)。此會被聚集曲線之總高度以及其斜度所影響，且最適合於表現整體的血小板活性。

統計- 結果以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。為了評估差異的顯著性，使用單向ANOVA分析。虛無假設被排除，則使用事後比較學生紐曼寇爾檢定。

結果- 如表21所示，MASA在濃度10^-4 莫耳時提供明顯的對ADP，特別是對由AA和ADP+PGE₁ 誘發之血小板聚集之防禦(AUC和Amax明顯的降低，表21)。NA(在10^-4 毫莫耳/毫升組)亦降低由ADP導致的聚集(見Amax，表21)。兩種物質之結合活性提供了顯著較多且顯著的由ADP或ADP+PGE₁ 導致之血小板聚集之降低，此顯示於AUC和Amax兩者數據中(表21)。

MASA相較於ASA或MD，顯著地在避免由AA誘發之血小板聚集方面更佳(表21)。MASA+NA之組合展現了對由AA誘發之聚集方面顯著較高的活性，優於個別單獨物質，以及ASA+NA和MD+NA(表21)。

以雙吡大莫(DI)和DI與ASA或MASA之組合，對於ADP或AA導致之血小板聚集進行平行實驗(表22)。DI展現抗血栓及抗聚集之活性(Mammen EF著，血栓症研究補充 1990年第XII冊，頁1-3)。雙吡大莫加上阿司匹靈，相較於阿司匹靈本身，對動脈起源的腦缺血更有效(Halkes PH等人著，柳葉刀 2006年，367(9523)期：頁1665-73)。

在此系列中，MASA+DI展現了最高的活性，其顯著地高於ASA+DI之活性(表22)。

8.2.血栓症

於實驗的動脈血栓症後經口施用於兔與犬兩週之MD醫療使用，顯示了溶解血栓之效果(Logunova L等人著，Experim Clin Pharmacoter 1991年；19期：頁91-9(俄文))。MD在控制或預防血栓症之預防效果方面並無已知的數據。NA經由多種的機制降低血栓症(Rosenson RS等人著，動脈粥狀硬化症 1998年；140期：頁271-80)。

方法- 我們選擇一種基於由三氯化鐵(FeCl₃ )所誘發之大鼠動脈血栓症的實驗性血栓症模型(Kurz K等人著，血栓形成研究 1990年，60期：頁269-280。Wang X和Xu L著，血栓形成研究 2005年，115期：頁95-100)。由鐵仲介之化學氧化作用起始的組織損傷使易於誘發血小板黏附和聚集之受傷部位，接著凝血活化及纖維蛋白沉積。在實驗中使用體重350-420公克為之雄性韋斯大鼠。在22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中將動物以7-8隻一組置於適當的籠中，給予12/12-小時光照/黑夜循環，及可自由取用食物與水。所有實驗皆依據1986年11月24日歐洲共同體議會指令(86/609/EEC)有關實驗動物照護的規定而實施。所有的努力皆為將動物的痛苦減到最小並減少動物的使用量而做。隨機將大鼠分為多個實驗組，每組由不少於7隻動物所構成。在血栓症起始前2小時藉由口路徑施用媒介物或測試化學物MD(25毫克/公斤)、NA(25毫克/公斤)、MASA(10毫克/公斤)、ASA(5毫克/公斤)及組合物MD+NA(25+25毫克/公斤)、MASA+NA(10+25毫克/公斤)和ASA+NA(5+25毫克/公斤)。進行平行實驗，以比較單一劑量之測試物質(在血栓症起始前2小時給予)和重複劑量(每日一次共三日)之效果。7-8隻動物之群組接受下列物質：MASA(10毫克/公斤)、氯吡格雷(CL)(5毫克/公斤)、ASA(5毫克/公斤)和組合物MASA+CL(10+5毫克/公斤)或ASA+CL(5+5毫克/公斤)。將大鼠以戊巴比妥鈉麻醉(腹腔注射50毫克/公斤，及10毫克/公斤/小時)並置於熱控手術台上，在整個實驗期間保持37℃之體溫。藉由頸切口將頸動脈之一暴露出，自黏附的組織、迷走神經分離，且一流探針(電磁血流量計MFV 1200，Nicon Kohden公司，日本)被放置在總頸動脈之露出部位，以記錄血流量。在15分鐘的穩定期間過後，藉由局部施用(接觸血管外膜表面)兩片(2x1毫米)浸於三氯化鐵(FeCl₃ )之15%溶液之惠特曼濾紙，來誘發血栓症。頸動脈血栓形成的時間是以造成血流完全停止所需之時間為記錄，在此則以直到阻塞之時間(TTO)記述之。在主動處理組中，若血流未在90分鐘內停止，則記錄TTO為>90分鐘。

此外，在血栓症實驗期間，測量大鼠尾巴流血時間。以解剖刀從尾端5毫米處橫切尾巴，並將尾巴立即浸入37℃溫暖等滲鹽水中，直到注意到流血停止。流血完全停止且在接下來30秒無再流血的時間點，定義為流血停止。

在血栓症實驗後，該等接受3天待測物質之被麻醉動物，被用來進行間接體內(ex vivo )血小板聚集測試。打開腹腔，從下腔靜脈蒐集血液至以水蛭素(Dynabyte Medical公司，德國)覆蓋之塑膠管中。

使用血液樣本用於在採集後30分鐘到4小時之間之測量。根據經修飾之Dynabyte Medical公司之科學實驗計畫來進行測量(見上述關於血小板聚集以下)。

統計- 藉由軟體Microsoft Excel 2007分析數據。數據以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。使用ANOVA單向分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同實驗組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

結果- 在控制組中，三氯化鐵(FeCl₃ )導致之血管血栓症及其結果之動脈流停止的平均時間為24.4分鐘(表23)。

以MASA之預防用處理提供了明顯的TTO之延長(P<0.005vs 控制組)，但與ASA相反的是，其在流血試驗中較無效果(136對155%)。MASA+NA(10+25毫克/公斤)導致相對較長的血栓症遲延，優於MD+NA或ASA+NA(表23)。應注意的是，使用ASA和ASA+NA，TTO之增加平行於流血時間，而使用MASA或MASA+NA時TTO之增加相當高於流血時間(表23)。

在具一般控制的平行實驗中，研究了ASA、MASA和CL及其等之組合物對血栓症之影響。以單一劑量施用待測物質(測試前2小時)或給予每日一次共三日。血栓症測試前2小時導入之ASA或CL，相對於接受水之控制組，顯著地延長TTO(表24)。

相較於CL，單一劑量之MASA提供更明顯的TTO之增加。同時給予MASA與CL顯著地增加TTO，但僅稍微改變流血時間(表24)。應注意的是，MASA+CL之組合物導致明顯的TTO之增加，相對於分離物質及ASA+CL之組合。以待測物質重複處理導致進一步增加TTO和流血時間(表25)。

以MASA或CL重複處理產生對TTO顯著較高的影響，比起ASA(相應地，191和194%比上162%)，但MASA，與CL或ASA相反，並無增加流血時間(表25)。以MASA+CL或ASA+CL重複處理產生相當大且相當類似的TTO之增加，但在影響尾巴流血時間方面MASA+CL相對較少於ASA+CL(241%vs 319%)(表25)。

間接體內(ex vivo) 之實驗

在血栓症實驗之後，蒐集動物血液並測量聚集參數。以劑量10毫克/公斤之MASA處理三天，導致明顯的由所有被測試之聚集誘發劑引起的血小板聚集之減少(表26)。

以劑量5毫克/公斤/天之CL處理三天導致對於由ADP和PGE₁ +ADP誘發之聚集相當的防禦效果，但並無阻止由AA誘發之聚集。ASA提供對由AA誘發之聚集明顯的防禦，但對ADP和PGE₁ +ADP並不有效(表26)。MASA和CL(10+5毫克/公斤/天x3)之組合提供相對最高的避免由多種藥劑誘發之聚集的效果，明顯地優於由ASA+CL在ADP和PGE₁ +ADP測試中提供者(表26)。

概要

MASA在對抗由AA誘發之血小板聚集方面，遠優於相似莫耳濃度之MD或ASA。MASA+NA對於所有誘發劑引起之聚集之保護顯著地勝於MD、NA和ASA，以及組合物，對於由AA誘發之聚集亦勝於MD+NA。

思及MASA和MASA+NA之組合物對抗血小板聚集以及活體內TTO之延長的正面效益，MASA或MASA+NA組合物可應用於降低患顯著的動脈粥狀硬化症、潛在的心肌梗塞和損傷以及周邊血液循環失調之病人的血小板聚集和血栓症風險。MASA和MASA+NA組合物不延長尾巴流血時間，此事實指出，此組合物在用於具在手術前及手術後期間增加流血風險之病患之可能用途。

MASA+DI在防止由ADP和AA誘發之聚集方面，遠優於ASA+DI。

MASA+CL。在血栓症實驗中，單一劑量之MASA+CL相較於ASA+CL對三氯化鐵(FeCl₃ )誘發之血栓症提供了較佳的防禦。就延長尾巴流血時間方面，MASA+CL相對較ASA+CL少。在間接體內(ex vivo )實驗中，MASA+CL提供了遠多於CL、ASA或MASA之顯著的對血小板聚集之防禦。對由ADP和PGE₁ +ADP誘發之血小板聚集之防禦，MASA+CL較ASA+CL更佳。

這些事實指出，MASA+CL可在臨床上應用於立即防禦增加血小板聚集之風險、即將發生的或正在發生的血栓症。

實例9. MASA/NA、MD/NA和LA/NA結合應用於降低NA誘發之潮紅之比較研究

菸鹼酸(nicotinic acid)(菸鹼酸(niacin)，NA)有效地降低血清膽固醇、LDL和三酸甘油酯，且提高HDL。然而對接受立即或持續釋放菸鹼酸之病人，一項限制性不利影響為，明顯的皮膚溫暖和血管擴張的迅速發展，稱為「潮紅」，其嚴重地導致停藥(Gupta EK和Ito MK著，心臟疾病 2002年；4期：頁124-137)。拉羅匹侖(laropiprant)(MK-0524)(LA)已被提出做為降低NA潮紅最有活性及前瞻性之藥劑之一(Cheng K等人著，美國國家科學院院刊 2006年；103期：頁6682-6687)。

9.1.對由菸鹼酸導致的皮膚血管擴張的拮抗作用

模型- 以戊巴比妥鈉(50毫克/公斤，腹腔注射)麻醉雄性韋斯大鼠並以每小時額外的劑量(10毫克/公斤)使處於麻醉狀態下。測量左頸動脈之血壓，以標準II導聯紀錄ECG。以雷射都卜勒流量計(OXYFLOW 2000，美國)測量右耳動脈之血流。以AD儀器PowerLab系統記錄血流、ECG和動脈壓，並儲存在電腦中以待進一步處理。在10分鐘長之基準記錄後，以皮下注射將待測物質注射入鬐甲區域並繼續記錄30分鐘。考慮到平均血壓，計算每隻動物之平均血流數據，並與起始值以及控制組比較。從5至8個分別實驗計算結果，並以百分比表示作為對基準而言最大的血流(Carballo-Jane E等人著，藥理學與毒理學方法期刊 2007年；56(3)期：頁308-316)。

統計- 各群組的結果以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。群組內的統計分析以學生t檢驗進行。使用ANOVA單向分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同實驗組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

結果- 在此動物模型中，劑量15毫克/公斤之菸鹼酸(NA)導致耳動脈明顯的血流增加(表27)。MASA，相似於控制組(緩衝的0.9% NaCl溶液)，導致不明顯的血流變化。NA與MASA一起，比起NA單獨，導致遲延(緩慢增加)且明顯的統計上較不顯著的血流的絕對增加(表27)。因此我們已意想不到地發現，MASA顯著地降低由NA導致的周邊血管擴張。MASA可拮抗由NA導致之周邊血管擴張，此潛力可具有臨床上用於減弱菸鹼酸對皮膚的影響(潮紅)的有益效果，並進一步詳細研究，如下所述。

9.2.由菸鹼酸造成之皮膚溫度升高的拮抗作用

我們的研究目標係比較在實驗中MASA、MD和LA對由NA造成之潮紅(皮膚溫度的改變)之影響。

方法- 使用雄性韋斯大鼠(280-330公克)。在22±1℃、相對濕度60±5%之氣候調節室中將動物以7-8隻一組置於適當的籠中，給予12/12-小時光照/黑夜循環，及可自由取用水與食物(R3-Lactamin AB，Sweden)。為了記錄整隻大鼠皮膚溫度的變化，使用非接觸式溫度記錄方法(Papaliodis D等人著，英國藥理學期刊 2008年；153期：頁1382-1387)。以一手持式紅外線測溫儀(Model Proscan 510，TFA-Dostman公司)進行溫度測量。於使用前三日，使動物習慣於被處理及該紅外線探針。在無麻醉下，記錄開始及整個實驗期間從每一耳背側讀到的溫度。在一長至60分鐘的期間，每5分鐘測量耳溫。在測量之間，放置動物回牠們的籠內。在使用前刻將NA、MD和MASA溶解於鹽水中，並校正pH。在實驗的每一天，首先將LA(MK 0524，開曼化學品Cayman Chemicals)溶解於DMSO中，接著才以0.9% NaCl稀釋。NA和LA組合物之比率係基於TredaptiveTM(菸鹼酸/拉羅匹侖(laropiprant)) 1000毫克/20毫克修改緩釋片之產品特性概要。

統計- 將六個耳溫測量(每耳三個)在每個時間點平均之。藉由軟體Microsoft Excel分析數據，結果以平均數±標準差(Mean±SEM)表示。根據ANOVA和學生t檢驗使用單因子分析及重複比較(塔基檢定)來比較不同群組之平均結果。P<0.05被認為是顯著的。

9.2.1.測試時間與溶劑對皮膚溫度之影響

9.2.2.在同時[0]或30分鐘前[30]施用皮下注射，單獨的待測物質對皮膚溫度之研究

檢驗LA、MD或MASA單獨對皮膚溫度之影響。以皮下注射導入每個所研究之化合物，與NA同時，如LA+NA[0]，或在NA的30分鐘之前，如LA+NA[30]。

9.2.3.在同時[0]或45分鐘前[45]施用皮下注射，MASA/Na和MD/NA組合物對皮膚溫度之研究

結果 R9.2.1測試時間與溶劑對皮膚溫度之影響

從早上10點至下午2點，所記錄的基準平均耳溫係28.4-30.6℃。對NA(15毫克/公斤，皮下注射)的時間反應研究顯示了，在10分鐘時，從基準算的最高溫度增加了2.32±0.37℃，與溶劑組比較最高溫度增加了2.57±0.43(P<0.005)(圖4)。被建立的是，LA溶劑對耳溫之影響僅有在注射後的起初5分鐘實質上不同於NA、MASA和MD溶劑，因此僅使用一個控制組來計算10分鐘時的溫度。

R9.2.2.在同時[0]或30分鐘前[30]施用皮下注射，單獨的待測物質對皮膚溫度之研究

皮下注射MASA、MD或LA並不對大鼠耳朵皮膚溫度造成明顯的改變(表28)。在MD+NA[0](當MD與NA一起被加入)和MD+NA[30](當MD在NA的30分鐘前被給予)之間，沒有溫度的變化。

同時施用NA和MASA(NA+MASA[0]組；提前時間=0)造成了NA潮紅之降低，其係相似於同時施用NA和LA或NA和MD。由NA造成的溫度增加被降低，相應地自100%(NA之效果)至62%、67和69%(表28)。在我們的實驗中，施用MASA+NA和LA+NA(當提前NA 30分鐘，皮下注射)，造成明顯及相似的防禦由NA造成的皮膚溫度增加(表28)。

R 9.2.3.口服NA/MASA和NA/MD組合物皮膚溫度影響之研究

以劑量40毫克/公斤口服(經口導入) NA造成實質上和遲延的(直至60分鐘)大鼠耳朵皮膚溫度之增加，最高值在15和45分鐘之間(表29)。

經口導入MASA或MD並無造成皮膚溫度實質上的改變。以劑量75毫克/公斤同時經口導入MASA和NA[0]造成小的改變，但以劑量150毫克/公斤則實質上阻止了由NA誘發之皮膚溫度增加(表29)。同時導入MD(100毫克/公斤)和NA阻止了溫度增加15分鐘，但並不明顯的阻止由NA誘發之皮膚溫度的最大增加(見30分鐘、45分鐘之溫度，表28)。分析結果顯示，劑量150毫克/公斤之MASA與NA同時導入增加了皮膚溫度至70%，其實質上較佳於由NA+MD造成之降低(96%)。由NA獨自增加者被視為100%。以預防性模式導入物質-在NA45分鐘前，溫度降低的活動於MASA150+NA[45]增加且顯著地較佳於MD+NA[45]或MASA75+NA[45](表28)。

以經口導入或皮下注射MASA降低了由NA誘發之皮膚溫度增加。當以皮下注射導入MASA，相似於拉羅匹侖(laropiprant)，降低了由NA誘發之皮膚溫度增加，在同時施用或預防性使用皆是。當同時與NA經口導入或以預防性模式，MASA之實質抗潮紅活性指出了MASA用於降低NA不良的皮膚效應(潮紅)的使用潛力。

概要結論

因為MASA具有抗發炎、抗高脂血和抗血小板的效果，其可被認為一種新穎的用於治療血栓症疾病的治療用藥劑。

實施本發明之模式

本發明提供一種藥品，其包含MASA，用於抗發炎、鎮痛、退熱、抗風濕、抗高脂血、抗動脈粥樣硬化、抗聚集和抗血栓劑。本發明之藥品可以醫藥組合物之形式被施用。根據本發明此態樣，提供一種醫藥組合物，其包含MASA混合醫藥上可接受之稀釋液或載劑。

因為抗發炎、鎮痛、退熱、抗風濕、抗高脂血、抗動脈粥樣硬化、抗聚集和抗血栓之藥品用途，其假定長時間使用，最佳的實施本發明的模式為提供適用於口服的形式，例如藥片或膠囊。

根據本發明進一步的態樣，提供如前述定義之藥品或如前述定義之醫藥組合物，用於製造一種用於治療發炎、疼痛、發燒、風濕狀況、高脂血狀況、動脈粥樣硬化狀況、血小板聚集或血栓形成之藥劑的用途。

本發明之另一態樣涉及組合物藥品，其包含MASA及另一選自由NA、施德丁、CL和DI所構成之群組的藥劑。這些產物可基於為MASA本身開發之醫藥組合物。

圖1為4-三甲銨基丁酸乙醯柳酸加成鹽晶體結構之片段。

圖2為L -肉鹼乙醯柳酸加成鹽晶體結構之片段。

圖3為3-(三甲基肼)丙酸鹽乙醯柳酸加成鹽晶體結構之片段。

圖4為NA、用於NA之溶劑(SolvNA)和用於LA之溶劑(SolvLA)對大鼠耳朵皮膚溫度之影響。

Claims (14)

1. 4-三甲銨基丁酸乙醯柳酸加成鹽，其鹽類特徵在於具有X光圖峰2Θ值5.10、13.58、13.83、15.02、15.17、17.89、19.33、19.87、21.85、22.05、23.32、23.56、23.92、24.75、25.55、25.80、27.05、27.91、30.25±0.2°。
2. L-肉鹼乙醯柳酸加成鹽，其鹽類特徵在於具有X光圖峰2Θ值5.09、12.62、13.48、13.84、1.1504、17.82、19.15、19.77、21.84、22.56、23.33、23.92、2.24.40、25.17、25.43、26.14、27.24、29.50、30.36±0.2°。
3. 3-(三甲基肼)丙酸鹽(米曲肼)乙醯柳酸加成鹽，其鹽類特徵在於具有X光圖峰2Θ值5.19、13.22、13.82、14.20、14.95、15.36、15.93、18.11、18.97、19.74、21.02、22.15、23.15、23.65、24.31、25.28、26.18、26.58、27.73、28.36±0.2°。
4. 如申請專利範圍第3項之3-(三甲基肼)丙酸鹽(米曲肼)乙醯柳酸加成鹽，其作為藥劑用之溶劑合物或多形體。
5. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第3項之3-(三甲基肼)丙酸鹽(米曲肼)乙醯柳酸加成鹽，及一醫藥上可接受之載體。
6. 如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其適於口服。
7. 一種如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，用於預防及/或治療發炎、疼痛、發燒、風濕狀況、高脂血狀況、動脈粥樣硬化狀況、由血小板聚集或血栓形成所誘發的病狀。
8. 一種如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該由血小板聚集所誘發的病狀包括心肌梗塞或中風之缺血事件、或血栓症和血栓性栓塞症。
9. 一種組合藥品，其包含有效量之如申請專利範圍第3項之米曲肼乙醯柳酸加成鹽(1)與一有效量之雙吡大莫之組成藥品能用於預防及/或治療由血小板聚集所誘發的病狀包含中風；(2)又或是與一有效量之氯吡格雷或是與其醫藥上可接受之鹽類之組成藥品能用於預防及/或治療由血小板聚集所誘發的病狀，特別是由血小板聚集所誘發的病狀包括心肌梗塞或中風之缺血事件、或血栓症、或血栓性栓塞症、或急性冠狀動脈綜合症、或心源性猝死、或冠狀動脈成形術或冠狀動脈繞道術後之併發症，以及(3)又或是與一選自於由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀之施德丁，能用以預防及/或治療選自於包含有異常血脂症、高血脂症和動脈粥狀硬化症所構成之群組之疾病。
10. 一種組合藥品，其包含有效量之如申請專利範圍第3項之米曲肼乙醯柳酸加成鹽以及一有效量之菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽類。
11. 如申請專利範圍第10項之組合藥品，其中(1)該米曲肼乙醯柳酸加成鹽，以及(2)該菸鹼酸或其醫藥上可接受之鹽類 其中之一或兩者係以立即釋放、持續釋放或延長釋放配方之形式。
12. 一種如申請專利範圍第10項之組合藥品之用途，其係用於製備預防及/或治療由血小板聚集所誘發的病狀之藥物。
13. 一種如申請專利範圍第12項之組合藥品之用途，其係用於製備預防及/或治療由血小板聚集所誘發的病狀包括心肌梗塞或中風之缺血事件、或血栓症和血栓性栓塞症之藥物。
14. 一種如申請專利範圍第10項之組合藥品之用途，其係用於製備預防及/或治療選自於由異常血脂症、高血脂症和動脈粥狀硬化症所構成之群組之疾病之藥物。