LV14468B

LV14468B - Pretiekaisuma līdzeklis

Info

Publication number: LV14468B
Application number: LVP-10-95A
Authority: LV
Inventors: Ivars KALVIŅŠ; Anatolijs Birmans; Māris VĒVERIS; Antons ĻEBEDEVS; Anatolijs MIŠŅOVS
Original assignee: Tetra, Sia
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2012-07-20
Also published as: LV14468A

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

IZGUDROJUMA NOZARE

Aprakstītais izgudrojums attiecas uz jaunu medicīnisko produktu ar pretiekaisuma, sāpes remdinošām, pretdrudža, antireimātiskām, antihiperlipidēmiskām, antiaterosklerotiskām, trombocītu pretsalipšanas un prettrombu īpašībām.

Precīzāk, izgudrojums attiecas uz jaunu medicīnisko produktu, kas satur meldonija acetilsalicilātu. Izgudrojums attiecas arī uz farmaceitisko kompozīciju, kas satur meldonija acetilsalicilātu.

Meldonija acetilsalicilāts tika aprakstīts mūsu patenta pieteikumā P-09-117. kas attiecas uz jaunām acetilsalicilskābes sālīm. Ir paredzēts, ka jaunajai vielai, kas aprakstīta minētajā pieteikumā, var būt dažādi polimorfi kristālu veidi un solvāti, vislabāk hidrāti, kuriem ir līdzīgas bioloģiskās īpašības un tāpēc tie tiek iekļauti šajā pieteikumā kā aprakstītā savienojuma varianti.

Tā kā betaīna tipa savienojumiem, kas ir iekļauti jaunajās acetilsalicilskābes sālīs, pašiem piemīt dažādas farmakoloģiskās aktivitātes, jaunajām acetilsalicilskābes sālīm var būt labvēlīgas aktivitātes papildu tām, kas piemīt acetilsalicilskābei vai betaīniem, tostarp jaunas farmakoloģiskas aktivitātes. Mēs jau konstatējām, ka meldonija acetilsalicilāts palēnina un nozīmīgi samazina nikotīnskābes izsaukto ādas asinsvadu paplašināšanos. Papildu eksperimenti parādīja meldonija acetilsalicilāta pārsteidzoši izteiktas farmakoloģiskās aktivitātes.

LIETOTIE SAĪSINĀJUMI

Aprakstā īsuma dēļ turpmāk tiks lietoti šādi saīsinājumi:

AdA - adjuvanta artrīts

ASS - acetilsalicilskābe

H - holesterins

KSS - koronārā sirds slimība

CIK - cirkulējošie imūnkompleksi

KL - klopidogrels

CRP - C-reaktīvais proteīns

Dī - dipiridamols

ABL - augsta blīvuma lipoproteīni

LA - laropiprants

ZBL - zema blīvuma lipoproteīni

MDAS - meldonija acetilsalicilāts (ķīmiski: 3-(trimetilamonioamino)propanoāta acetilsalicilāts

MD - meldonijs (SNN)

NS - nikotīnskābe RA - reimatoīdais artrīts TG - trigliceridi TR - Triton WR1339 SI - simvastatīns

TEHNIKAS LĪMENIS

Trombocītiem ir būtiska loma aterosklerozes attīstībā un fatālu trombu veidošanā koronārās sirds slimības norisē. Līdzekļi, kas novērš trombocītu salipšanu, ir kļuvuši par ļoti būtiskiem dažādu slimību profilaksē un ārstēšanā, ieskaitot dažādas kardiovaskulāras, cerebrovaskulāras un perifero artēriju sistēmas saslimšanas (Meadows TA et al, Circ Res 2007;100(9):1261-75). Acetilsalicilskābe ir ļoti plaši lietotas zāles, kas pazīstama galvenokārt ar tās pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža un pretreimatisma īpašībām. Tā tiek arī lietota nelielās ikdienas devās kā trombocītu pretsalipšanas līdzeklis kardiovaskulāra riska pacientiem (Eidelman RS et al, Arch Intern Med. 2003;163:2006-2010). Kaut arī kā trombocītu pretsalipšanas līdzeklis ASS ir pazīstama daudzus gadus, tikai nesen sākts pievērst lielāku uzmanību ASS pretiekaisuma īpašībām kardioloģijā (Ridker PM et al, N Engl J Med 1997;336:973979). Līdz ar to tādu iekaisuma marķieru kā C-reaktīvā proteīna (CRP) mērījumi klīnikā var daļēji atspoguļot aterosklerozes rādītājus (Buckley DI et al, Ann Intern Med 2009;151:483-495). Pašreizējā pieredze norāda, ka CRP līmeņa pazemināšana novērš KSS notikumus (Ridker PM et al, Lancet 2009;373:1175-82). Ross ierosināja uzskatīt aterosklerozi par iekaisuma slimību (Ross R, N Engl J Med 1999;340:115-126). Aspirīns var ne tikai ietekmēt aterosklerozes iekaisuma aspektu, bet arī iedarboties tieši, izsaucot hipolipidēmiju (Kourounakis AP et al, Experimental and Molecular Pathology 2002, 73:135-138).

NS ir efektīvs lipīdus ietekmējošs līdzeklis, kas novērš aterosklerozi un samazina kardiovaskulāro notikumu iespējamību. NS ir daudzveidīga ietekme uz lipoproteīniem un artēriju trombozi, uzlabojot endotēlija funkciju, samazinot iekaisumu, palielinot pangu stabilitāti un samazinot trombu veidošanos (Rosenson RS, Atherosclerosis 2003; 171:87-96).

NS gandrīz pilnībā novērš recekļu veidošanos asinsvados, ko izraisa tromboplastīns un pituitrins, kas liecina par tās trombolītisko aktivitāti (Baluda VP, Kardiologija 1974; 14(11):105-7 (Rus). NS prettrombu īpašības ir aprakstījuši vairāki autori (Shestakov VA, Probl Gematol Pereliv Krovi, 1977;22(8):29-35. Chekalina SI, Sov Med 1982(5):105-8). NS samazina asins recekļu veidošanos (Chesney CM et al, Am Heart J, 2000;140:631-36).

NS kavē trombocītu salipšanu (Lakin KM, Farmakol Toksikol, 1980; 43(5):581-5). NS in vitro ietekmē trombocītu aktivitāti, nedaudz kavējot salipšanu un veicinot nozīmīgu prostaglandīnu atbrīvošanu, pamatā neietekmējot galveno trombocītu receptoru ekspresiju. NS ietekme ir unikāla, tā atšķiras no citiem pretsalipšanas līdzekļiem, kas norāda un potenciālām iespējām to izmantot kombinētā terapijā (Serebruany VL et al, Thrombosis and Haemostasis, 2010 (in press).

NS ir efektīvs lipīdus ietekmējošs līdzeklis, kas novērš aterosklerozi un samazina kardiovaskulāro notikumu varbūtību (Drexel H, European Heart Journal Supplements 2006;Vol 8, Suppl F: F23-F29. Savel’ev AA, Shershevskii MG, Klin Med (Rus) 1996;74:48-52).

NS ir pieejama 3 ārstnieciskās formās (ātras atbrīvošanas, palēninātas atbrīvošanas un ilgstošas darbības). Ātrās atbrīvošanas NS ir saistīta ar sasarkuma blakusparādību un glikozes līmeņa paaugstināšanos asinīs. Palēninātas atbrīvošanas NS ir saistīta ar samazinātu sasarkumu, bet ar iespējamu hepatotoksisku efektu risku. Ilgstošas darbības NS ir saistīta ar samazinātu sasarkumu un zemu hepatotoksicitātes risku (McKenney J, Arch Intern Med 2004; 164(7):697-705).

NS klīnisko pielietojumu ierobežoja ādas sasarkums. Palēninātas atbrīvošanas nikotīnskābe var palīdzēt sasarkuma ierobežošanā (Guyton JR et al, J Clin Lipidol, 2009;3:101-108).

ASS un citi NSPL ir piedāvāti ādas sasarkuma ierobežošanai dažādās farmaceitiskās kompozīcijās, kas nodrošina NSPL ievadīšanu pirms NS devas (WO9632942, W09906052, W02009142731).

Nesen NS izraisītā sasarkuma ierobežošanai (Lai E et al, Clin Pharm Ther 2007;81:849-857. Davidson MH, AmJCardiol 2008;101 [suppl]: 14B-19B) ir piedāvāts specifisks prostaglandīna D2 receptora I subtipa antagonists laropiprants (Parhofer KG, Vascular Health and Risk Management 2009;5:901-908). Kaut ari laropipranta pielietošana samazina sasarkuma biežumu, tā nespēj pilnībā novērst šo blakusparādību. Laropiprants nemaina nikotīnskābes ietekmi uz lipīdiem, nedz ari citas nikotīnskābes blakusparādības. Tāpēc nikotīnskābes kombinācija ar laropiprantu var ļaut pielietot nikotīnskābi augstākās devās un pilnībā izmantot šī līdzekļa potenciālu (Parhofer KG, Vascular Health and Risk Management 2009;5:901-908, Olsson AG, Expert Opinion on Pharmacotherapy 2010; 11(10):1715-1726).

MD ir zāles ar zināmiem labvēlīgiem efektiem uz sirdi un asinsvadiem. Zināma derīga MD aktivitāte tika konstatēta dzīvnieku aterosklerozes modeļos (Veveris M, Smilsaraja B, Baltie JLabAnimSci 2000;10:194-199. Veveris M et al, Baltie JLabAnimSci 2002;12:116-122. Okunevich IV, Ryzhenkov VE, Patol Fiziol Eksp Ter (Rus) 2002;(2)24-7). Ir novērots arī, ka MD kavē trombocītu salipšanu (TsirkinVI, Ros Kardiol Zh 2002;1:45-52). Divas nedēļas ilga MD perorāla izmantošana eksperimentālas artēriju trombozes terapijā trušiem un suņiem parādīja trombolītisku iedarbību (Logunova L et al, Experim Clin Pharmacoter 1991;19:91-98 (Rus). Nav zināmi dati par MD profilaktisko iedarbību trombozes ierobežošanā vai novēršanā.

PROTOTIPI

ASS pielietošanas diapazonu lielā mērā ierobežo zemā šķīdība ūdenī (aptuveni 0,3%). Bez Li, Na, Mg un Ca sālīm ir aprakstītas ari vairākas salis ar bāziskām aminoskābēm [US -4,625,888]. Neviena no šīm sālīm nav atradusi plašu pielietojumu medicīnas praksē. Tāpēc ir nepieciešami jaunu ASS sāļu ar uzlabotu šķīdību, zemāku toksicitāti un jaunu farmakoloģisko profilu pētījumi.

IZGUDROJUMA PRIEKŠMETI

Šī izgudrojuma priekšmets ir medicīnisks produkts, proti, MDAS ar pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža, pretreimatisma, antihiperlipidēmisku, antiaterosklerotisku, trombocītu pretsalipšanas un prettrombu īpašībām. Cits šī izgudrojuma priekšmets ir paņēmiens personas ārstēšanai, kurai vajadzīga pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža, pretreimatisma, antihiperlipidēmiska, antiaterosklerotiska, trombocītu pretsalipšanas un prettrombu terapija. Šī izgudrojuma papildu priekšmets ir farmaceitiskā kompozīcija, kas ietver MDAS augstāk minētajam nolūkam. Vēlāk kļūs redzami arī citi šī izgudrojuma mērķi un vēl citi būs, acīmredzami speciālistam.

IZGUDROJUMA APRAKSTS

Izgudrojums ietver medicīnisku produktu, kas satur MDAS, vēlams vienas devas zāļu formā. Konkrētā forma, kādā aktīvā sastāvdaļa tiek ievadīta nav svarīga, ja vien tiek panākts vēlamais izgudrojuma efekts. Aktīvā sastāvdaļa var būt kapsulu, suspensiju, dispersiju, eliksīru, sīrupu un līdzīgās formās.

Mēs negaidīti atradām, ka MDAS piemīt izcilas pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža, pretreimatisma, antihiperlipidēmiskas, antiaterosklerotiskas, trombocītu pretsalipšanas un prettrombu īpašības.

Tāpēc var paredzēt, ka minētā viela būs vēlams līdzeklis, lai ārstētu iekaisumu, sāpes, drudzi, reimatisku stāvokli, hiperlipidēmijas un aterosklerozes stāvokļus, novērstu trombocītu salipšanu un trombu veidošanos riska grupas pacientiem.

Šī izgudrojuma medicīniskā produkta forma var būt iekšķīgai lietošanai piemērotā, piemēram, tabletes vai kapsulas.

Tiek paredzēts, ka šī izgudrojuma medicīniskais produkts var ietvert arī dažādus MDAS polimorfus un solvātus ar tādu pašu rezultātu.

Ir paredzēts, ka šī izgudrojuma medicīniskais produkts ietver ari palēninātas izdalīšanas un ilgstošas darbības zāļu formas.

Izgudrojuma farmaceitisko kompozīciju var pagatavot ar parastajām procedūrām, izmantojot parastās fannaceitiski pieņemamās palīgvielas vai nesējus un tehnoloģijas.

Turpmākie piemēri ilustrē, bet neierobežo izgudrojumu.

PIEMĒRI

Vielas. NS (Acros Chemicals), MD (Grindex), ASS (Acros Chemicals), LA (MK 0524, Cayman Chemicals), KL bisulfats in vitro testiem (Molcan Corporation), KL in vivo testiem kā Plavix™ (Sanofī-Aventis), DI (Sigma-Aldrich).

1. piemērs. MDAS akūtās toksicitātes noteikšana

MDAS akūtā toksicitāte tika noteikta Wistar žurkām un ICR pelēm, ievadot

p.o.

Metodes. Tika izmantoti IRC peļu tēviņi ar ķermeņa masu 20-22 g un Wistar žurkas ar ķermeņa masu 200-230 g. Akūtās toksicitātes noteikšanai katra deva tika ievadīta 6 dzīvniekiem, palielinot katru nākamo devu par 500 mg/kg. LD50 tika aprēķināta pēc Karber, izmantojot Akhila JS et al, Current Sci 2007;93:917-920 metodes aprakstu, kas modificēta devu ticamības intervāla noteikšanai (Tumer R In Screening Methods in Pharmacology, Acad. Press, New York, 1965, 61-63).

LD₅o tika aprēķināta šādi:

LD₅o=Mazākā deva, kas letāla visai grupai - £(a x b)/N N - dzīvnieku skaits katrā grupā a - devu atšķirība b - vidējā mortalitāte (letalitāte 2 blakus grupās/2)

MDAS tika šķīdināts ex tempore 0,2% agara šķīdumā un ievadīts per os pa katetru kuņģī. Tādā veidā ievadītā šķidruma daudzums nepārsniedza 0,5 ml pelēm un 2 ml žurkām. Dzīvnieki tika novēroti līdz 10. dienai pēc ievadīšanas.

Rezultāti. MDAS akūtās toksicitātes noteikšanas rezultāti parādīti 1.-3. tabulā.

1.tabula

MDAS akūta toksicitāte pelēm p.o.

Grupa	Deva mg/kg p.o.	Dzīvnieku skaits grupā (N)	Letalitate (n)	Vidējā mortalitāte (b)	Probiti (a x b)
1	1000	6	0
2	1500	6	1	0.5	250
3	2000	6	2	1.5	750
4	2500	6	4	3	1500
5	3000	6	6	5	2500

LD₅₀ = 3000 - (5000/6) = 2167

Koeficients f pie P=0,05 šim eksperimentam ir 1,32, tāpēc LD₅o ticamības intervāls ir 1642 - 2860 (mg/kg).

Pēc MDAS ievadīšanas toksiskie efekti parādījās dažu pirmo stundu laikā un daļa dzīvnieku nobeidzās pirmo 2 dienu laikā. Izdzīvojušajiem dzīvniekiem toksicitātes simptomi pakāpeniski izzuda un pēc 5-8 dienām šie dzīvnieki neatšķīrās no tāda paša vecuma kontroles grupas dzīvniekiem. Tātad atrastā MDSA LD50 pelēm p.o. ir 2167 (1642-2860) mg/kg.

MDAS akūtas toksicitātes noteikšanas rezultāti žurkāmp.o. ir paradīti 2. tabula.

2. tabula

MDAS akūtā toksicitāte žurkām p.o.

Grupa	Deva mg/kg	Dzīvnieku skaits grupā(N)	Letalitāte (n)	Vidēja mortalitāte (b)	Probiti (axb)
1	1500	6	0
2	2000	6	2	1	500
3	2500	6	4	3	1500
4	3000	6	6	5	2500

LD₅₀ = 3000 - (4500/6) = 2250

Koeficients f pie P=0,05 šim eksperimentam ir 1,308, tāpēc LD₅₀ ticamības intervāls ir 1720-^ 2944 (mg/kg).

MDAS ievadīšana žurkām p.o. devā 1500 mg/kg izsauca pārejošus barības uzņemšanas paradumu un kustību traucējumus, bet visi dzīvnieki izdzīvoja. Toksiskie simptomi sāka izzust 3. dienā pēc ievadīšanas. Tātad atrastā MDSA LD50 žurkām p.o. ir 2250 (1720-2944) mg/kg.

Kopsavilkums. Akūtās toksicitātes pētījumi parādīja, ka MDAS ir viela ar zemu toksicitāti (LD50 > 2000 mg/kg p.o. pelēm un žurkām). ASS akūtā toksicitāte pēc Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., Acros Chemicals un Sigma-Aldrich datiem ir 250 mg/kg pelēm un 200 mg/kg žurkām p.o., kamēr Bayer AG dod LD50 žurkām p.o. kā >1100 mg/kg, tādējādi MDAS ir mazāk toksisks nekā ASS.

3. tabula

MDAS akūta toksicitāte pelem un žurkām; N=6.

Dzīvnieki	LD₅₀ mg/kg p.o.(ticamības intervāls)
Peles	2167(1642-2860)
Žurkas	2250 (1720-2944)

2. piemērs. MDAS, ASS un MD pretsāpju, pretdrudža un pretiekaisuma aktivitāšu salīdzinājums eksperimentos

MDAS pretsāpju, pretiekaisuma un pretdrudža efektu pētījumos tika izmantotas metodes, kuras plaši lieto NSPL novērtēšanā. Eksperimentos tika izmantotas bezšķimes laboratorijas peles un Wistar žurkas. Dzīvnieki tika turēti grupās pa 7-8 piemērotos būros klimatizētās telpās pie 22±1 °C, relatīvā mitruma 60±5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas cikla ar brīvu pieeju barībai un ūdenim.

MDAS, ASS un MD efektu salīdzināšanai, ievadot perorāli, tika veidotas šādas grupas:

GRUPA PROCEDŪRA

ASS50 saņēma ASS 50 mg/kg

ASS 100 saņēma ASS 100 mg/kg

MD 100 saņēma MD 100 mg/kg

MDAS75 saņēma MDAS 75 mg/kg

MDAS 15 0 saņēma MDAS 150 mg/kg

MDAS300 saņēma MDAS 300 mg/kg

Pārbaudāmo vielu ūdens šķīdumi tika gatavoti ex tempore. Katrā eksperimentu sērijā tika izmantota kontroles grupa, kura saņēma identisku tilpumu ūdens p.o.

Statistika. Dati tika analizēti ar Microsoft Excel 2007 programmatūru un rezultāti izteikti kā Vidējais±Standarta vidējā kļūda (Mean±SEM). Dažādu grupu vidējie rezultāti tika salīdzināti, izmantojot vienfaktora analīzi pēc ANOVA ar atkārtotu salīdzināšanu (Tukeja tests). Par nozīmīgu tika uzskatīts P<0,05.

2.1. Pretsāpju aktivitātes pētīšana

2.1.1. Pretsāpju aktivitātes novērtēšana ar peļu ..locīšanās” testu

Metode, Sāpju reakcija tika novērtēta ar ķīmiskā kairinājuma metodi - ..locīšanās” testu (Charaborty A et al, Indian J of Pharmacology 2004;36(3): 148-150). Dzīvnieki saņēma i.p. 0,25 ml 0,75% etiķskābes ūdens šķīduma. Pēc injekcijas dzīvnieki tika ievietoti atsevišķi īpašos boksos un novēroti 10 minūtes. Tika reģistrēts vēdera saraušanās gadījumu skaits. Pretsāpju aktivitāte izpaudās kā vēdera saraušanās gadījumu skaita samazināšanās 10 minūšu periodā. Pētāmās vielas tika ievadītas 30 min. pirms kairinošā līdzekļa. Pretsāpju iedarbība tika izteikta kā pretsāpju indekss, kuru aprēķināja šādi:

A = (Cc-Ct)/Cc · 100%, kur

A - analgēzijas indekss

Cc - saraušanās gadījumu skaits kontroles grupā,

Ct - saraušanās gadījumu skaits testa grupā.

Rezultāti doti 4. tabulā.

4. tabula

Pētāmo vielu pretsāpju efekts „locišanās” testa modelī; N=8; Mean+SEM

Grupa	Dzīvnieki ar pozitīvu reakciju/kopskaits	Saraušanas skaits	Analgēzijas indekss
Kontrole	8/8	22.00+ 1.60	-
MD100	8/8	22,10+1,47	-0,4
ASS50	6/8	5,75 + 1,32***“	7,1
MDAS75	8/8	12,13 + 0,61**“	4,5
MDAS 150	7/8	10,63 ± 1,10**“	5,2
MDAS300	5/8	6,00+ 1,39***“	7,3

**P<0,005 pret kontroli ***P<0,0005 pret kontroli ”P<0,005 pret MD ^I$SP<0,0005 pret MD

MDAS uzrādīja no devas atkarīgu pozitīvu efektu. Vislabākie rezultāti tika novēroti ASS50 un MDAS300 (P<0,0005) grupās, kamēr MD bija neaktīvs. Analgēzijas indekss MDAS300 grupā bija 7,3 (tikai 5 dzīvniekiem no 8 bija sāpju reakcija).

2.1.2. Pretsāpju aktivitātes novērtēšana pelēm ar karstās plāksnītes testu

Metode. Karstās plāksnītes tests tika veikts ar 52 pelēm, kuru ķermeņa masa bija 1726 g, atbilstoši literatūrai (Belyakov VA, Solov’ev IK. Narcotic analgesics, Nizhny Novgorod, 2001 (in Russian). Karstās plāksnītes testu lieto centrālās darbības pretsāpju līdzekļu skriningam (Osterberg A et al, J Pharmacol Exper Ther 1958;122:59). Pētāmo vielu ūdens šķīdumi tika ievadīti p.o. 30 vai 60 min. pirms testēšanas. Tika reģistrēts laiks līdz ķepu aplaizīšanai. Pretsāpju aktivitātes rādītājs bija reakcijas aizkavēšanās uz termisko kairinātāju.

Rezultāti doti 5. tabulā.

5. tabula

Reakcijas laiks pelēm karstas plāksnītes testa; N = 8-10; Mean+SEM

Grupa	Latentais periods, s
30 min pēc pētāmās vielas ievadīšanas	60 min pēc pētāmās vielas ievadīšanas
Kontrole	4,5±0,42	5,0±0,27
MD100	9,5±0,68***^&&	8,3±0,53***
ASS50	5,4±0,46	9,7±l,05**
MDAS75	5,4±0,38	4,6±0,26
MDAS150	9,5±0,53***^&ti	7,l±0,55**
MDAS300	9,6±l,12**ⁱ	8,6±0,60***

**P<0,005 pret kontroli ***P<0,0005 pret kontroli ^&P<0,05 pret ASS (30 min) “P<0,005 pret ASS (30 min) ^&&&P<0,0005 pret ASS (30 min)

Eksperimenta dati liecina, ka MDAS150 un MDAS300, kā arī MD grupai novēro nozīmīgu pretsāpju efektu pēc 30 un 60 minūtēm. ASS nozīmīgi paaugstināja sāpju slieksni tikai pēc 60 minūtēm, kas norāda uz lēnāku efekta iestāšanos (5. tabula).

3. Pētāmo vielu salīdzinoša novērtēšana pretdrudža testā

3.1. Preventīvās pretdrudža aktivitātes novērtēšana žurkām ar pirogenāla injekciju

Metode. Eksperimenti tika veikti ar 48 Wistar žurkām, kuru ķermeņa masa bija 165182 g, ievadot muskulī pirogenālu (Gamalei State Research Institūtiem, Moscow, Russia) devā 100 pg (Shwarz GY, Syubaev RD, Vedomosti NCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000;1:44-50 (Rus). Pētāmās vielas tika ievadītas p.o. vienu stundu pirms pirogenāla injekcijas. Rektālā temperatūra tika mērita ar elektrisko termometru TERMO pirms pirogenāla injekcijas (bāzlīnija) un 3 stundas pēc injekcijas. Pretdrudža aktivitāte tika novērtēta pēc hipertermiskās reakcijas vājināšanas 2 stundas pēc pirogenāla injekcijas, kas labi korelē ar publicētajiem datiem par reakcijas pīķi (6. tabula). Telpas temperatūra tika uzturēta 20-21 °C robežās.

Kā izriet no datiem, kontroles grupas dzīvnieku ķermeņa temperatūra pakāpeniski paaugstinājās, sasniedzot maksimumu pēc 2 stundām un pārsniedzot normālo vēl 1 stundu.

6. tabula

Kontroles grupas rektālās temperatūras izmaiņas pirogenāla ietekmē; N=8; Mean±SEM

Grupa	Bazhnija (°C)	Rektala temperatūra (°C)
pēc 30 min.	pēc 60 min.	pec 120 min.	pec 180 min.
Kontrole M-zv -	36,16±0,16	36,25±0,21	36,75±0,12**	36,90±0,10#*^#	36,70±0,17^#

*P<0,05 pret bāzlīniju ##P<0,005 pret bāzlīniju ^WP<0,0005 pret bāzlīniju

Petamas vielas būtiski neietekmeja dzīvnieku normālo ķermeņa temperatūru, bet būtiski samazināja pirogenāla izraisīto hipertermiju (7. tabula).

7. tabula

Pētāmo savienojumu ietekme uz hipertermiju, kas ierosinātā ar intramuskulāru pirogenāla injekciju, N=8; Mean+SEM

Grupa	Bazlinijas rektālā temperatūra (°C)	Rektala temperatūra (°C) 120 minūtes pēc injekcijas
Kontrole	36,2+0,12	36,9+0,16^
MD100	35,9+0,18	36,2+0,16*
ASS50	35,8+0,17	35,6+0,19***^s
MDAS75	36,1+0,18	36,3+0,20*
MDAS150	35,8+0,15	36+0,21**
MDAS300	35,9+0,14	35,8+0,16***’

*P<0,05 pret kontroli **P<0,005 pret kontroli ***p<0,0005 pret kontroli **P<0,005 pret bāzlīniju ^sP<0,05 pret MD

Hipertermijas modelī ķermeņa temperatūras paaugstināšanās, kuru ierosināja pirogenāla injekcija, tika pilnībā novērsta ASS50 un MDAS300 grupās (7. tabula). MD100, MDAS75 un MDAS150 grupās antipirētiskais efekts bija mazāk izteikts.

3.2. Preventīvās pretdrudža aktivitātes novērtēšana žurkām ar pirogenāla injekciju (ārstēšanas režīms)

Metode. Pētāmo vielu pretdrudža efekts terapeitiskajā (ārstēšanas) režīmā tika pētīts ar 48 žurkām, kuru ķermeņa masa bija 182-205 g, ierosinot hipertermiju ar pirogenāla injekciju 100 pg devā (Shwarz GY, Syubaev RD, Vedomosti NCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000;1:44-50 (Rus). Pētāmās vielas tika ievadītas p.o. 2 stundas pēc pirogenāla ievadīšanas, tūlīt pēc paaugstinātās ķermeņa temperatūras izmērīšanas. Rektālā temperatūra tika mērīta ar elektrisko termometru TERMO pirms pirogenāla

i.m. injekcijas (bāzlīnijas temperatūra), hipertermijas pīķī (pirogenāla kontrole) un 30 min. pēc pētāmās vielas ievadīšanas, t.i., 2½ stundas pēc pirogenāla ievadīšanas. Temperatūra laboratorijā tika uzturēta 20-22 °C robežās.

Rezultāti doti 8. tabulā.

8. tabula

Pētāmo vielu ietekme uz hipertermiju, kas ierosinātā ar intramuskulāru pirogenāla injekciju (ārstēšanas režīms); N=8; Mean+SEM

Grupa	Bāzlīnijas rektālā temperatūra (°C)	Rektālā temperatūra (°C) pēc pirogenāla injekcijas (pirogenāla kontrole)	Rektālā temperatūra (°C) 30 minūtes pēc procedūras
Kontrole	36,10+0,15	36,90+0,20**	37,00+0,18**
MD100	36,41+0,14	37,06+0,13**	37,10+0,14**
ASS50	36,39+0,13	37,04+0,25*	36,51±0,15*^s
MDAS75	36,23+0,12	37,01+0,11**	36,90+0,07^
MDAS150	36,25+0,20	36,96+0,15*	36,75+0(09^
MDAS300	36,11+0,14	36,76+0,11**	36,40+0,11 *“^%

*P<0,05 pret kontroli *P<0,05 pret bāzlīniju ^wP<0,005 pret bāzlīniju ^%P<0,05 pret pirogenāla kontroli ^sP<0,05 pret MD ^KP<0,005 pret MD

Pirogenāls izraisīja nozīmīgu un līdzīgu ķermeņa temperatūras paaugstināšanos visiem eksperimentā izmantotajiem dzīvniekiem (salīdz, pirogenāla kontroli pret bāzlīniju, 8. tabula). Pētāmo vielu, izņemot MD, ievadīšana izsauca ķermeņa temperatūras pazemināšanos pret bāzlīniju un pirogenāla kontroli. Salīdzinoši augstāka hipotermija tika novērota MDAS300 un ASS50 grupās, kur ķermeņa temperatūras pazemināšanās bija nozīmīga pret kontroli un MD100. Jāatzīmē, ka MDAS300 grupā, pretstatā ASS50, ķermeņa temperatūras pazemināšanas bija nozīmīga ari pret pirogenāla kontroli. Tas norada uz ievērojamu un strauju MDSA antipirētisko efektu, kas var būt vērtīgs klīnikā.

4. Pētāmo vielu salīdzinošā pretiekaisuma aktivitāte

4.1. Akūtas iekaisuma tūskas modelis

Metode. Eksperimenti tika veikti, izmantojot karagenīna testu (Winter C et al, Proc Soc Exptl Biol and Med 1962;IIĪ(3):544-547. Wei Jia et al, Journal of Ethnopharmacology 2003(89): 139-141; Sutharson Lingadurai et al, African Journal of traditional, complementary and alternative medicines, 2007, 4(4):411-416) ar 42 žurkām, kuru ķermeņa masa bija 226-274 g robežās. Tika izdarīta viena (1%) karagenīna (Sigma) šķīduma fizioloģiskā šķīdumā (0,1 ml) injekcija pakaļkājas ķepā. Pētāmās vielas tika ievadītas p.o. (pa katetru žurkas kuņģī) 30 min. pēc karagenīna injekcijas. Ķepas tilpums tika mērīts ar onkometru bāzlīnijā un 4 stundas pēc karagenīna injekcijas.

Aizsardzības indekss procentos (tūskas nomākšana) tika aprēķināts pēc formulas:

Aizsardzības indekss (%) = (1 - Vo/Vc ) x 100, kur

I - Aizsardzības indekss % (tūskas nomākšana)

Vo - starpība starp ķepas tilpumu bāzlīnijā un eksperimenta apstākļos;

Vc - analoģiska starpība kontroles grupā.

Rezultāti doti 9. tabulā.

9. tabula

Pētāmo vielu prettuskas aktivitāte karagenīna iekaisuma modelī; N=7, Mean±SEM

Grupa	Ķepas tilpums (ml) bāzlīnijā	Ķepas tilpums (ml) pec karagenīna injekcijas
ml	Indekss, %
Kontrole	l,6±0,30	2,70±0,13	0
MD100	l,5±0,34	2,13±0,12*	43
ASAI 00	l,6±0,32	l,97±0,10**	66
MDAS75	l,6±0,44	2,51±0,l 1	18
MDAS150	l,6±0,31	l,54±0,15***^s&	93
MDAS300	l,7±0,25	l,79±0,15**	91

*P<0,05 pret kontroli **P<0,005 pret kontroli ***P<0,0005 pret kontroli ^&P<0,05 pret ASS 100 ^sP<0,05 pret MD

Akūtās iekaisuma tūskas modelī skartās ekstremitātes tilpums pieaug apmēram

1,6 reizes. Visizteiktākais iekaisuma procesa efekts tika novērsts MDAS150 grupā, kur profilakses indekss bija 93% pret kontroles grupu. MDAS300 grupā aktivitāte bija nedaudz zemāka - tūska tika samazināta par 91%. Tūskas samazināšanās tika novērota ari MD100 un ASS50 grupās.

4.2. Pētāmo vielu pretiekaisuma aktivitāte pret karagenīna tūsku profilakses režīmā

Metode. Karegenīna tūska tika pētīta, izmantojot zināmu metodi (Okunevich IV, Ryzhenkov VE, Patol Fiziol Eksp Ter, 2002(2):24-7 (Rus) ar 42 žurkām, kuru ķermeņa masa bija 178-220 g robežās. Pētāmās vielas tika ievadītas p.o. 5 dienu laikā. Tūlīt pēc pētāmo vielu ievadīšanas 6. dienā žurkām pakaļkājas ķepā tika ievadīts 0,1 ml 1% karagenīna šķīduma. Ķepas tilpums tika mērīts ar onkometru bāzlīnijā un 4 stundas pēc karagenīna injekcijas. Aizsardzības indekss tika aprēķināts kā norādīts iepriekšēja sadaļa. Pētāmo vielu profilaktiska ievadīšana 6 reizes izraisīja tūskas samazināšanos, salīdzinot ar neārstētiem dzīvniekiem (10. tabula).

10. tabula

Pētāmo vielu profilaktiskā prettūskas iedarbība pret karagenīna tusku; N=7, Mean±SEM

Grupa	Ķepas tilpums (ml) bāzlīnijā	Ķepas tilpums (ml) pēc karagenīna injekcijas
ml	Samazināšanas %
Kontrole	l,43±0,12	l,93±0,l 1	0
MD100	l,33±0,09	l,66±0,10	34
ASS50	l,40±0,06	l,55±0,04*	70
MDAS 150	l,37±0,ll	l,40±0,09**^J	94
MDAS300	l,34±0,07	l,41±0,04**^s	86

*P<0,05 pret kontroli **P<0,005 pret kontroli ⁵Ρ<0,05 pret MD

Šajā iekaisuma modelī MDAS 150 un MDAS300 grupās tika novērota nozīmīga aizsargājoša aktivitāte (94%), kas bija augstāka nekā MD100 (34%) un ASS50 (70%) grupās (10. tabula).

Lai novērtētu iekaisuma procesa intensitāti, ar standarta metodi uz analizatora «INTEGRA 400+” eksperimenta beigās (5 stundas pēc karagenīna injekcijas) tika noteikts CRP līmenis.

CRP noteikšanas rezultāti asinīs doti 11. tabulā.

11. tabula

CRP līmenis žurku asinīs karagenīna iekaisuma modelī žurkām; N=7, Mean±SEM

Grupa	CRP mg/l	CRP pieaugums %
Kontrole	0,17±0,015	0
Karagenīna kontrole	0,23±0,016**	100
MD100	0,22±0,014*	83
ASS100	0,20±0,018	50
MDAS 150	0,19±0,009^#$	33
MDAS300	0,21±0,014*	67

*P<0,05 pret kontroli **P<0,005 pret kontroli *P<0,05 pret karagenīna kontroli ^sP<0,05 pret MD

Kā izriet no šiem datiem, karagenīns izraisa CRP līmeņa pieaugumu asinīs. ASS 100 grupā CRP līmeņa pieaugums tika samazināts par 50% (11. tabula). Negaidīti MDAS150 grupā CRC līmeņa pieaugums bija nozīmīgi mazāk izteikts (tikai 33% pret kontroli). Tas atbalsta slēdzienu, ka MDAS var būt ar pozitīvu efektu uz iekaisuma procesu klīnikā.

5. piemērs. MDAS pretreimatiskās aktivitātes pētījums salīdzinājumā ar ASS un MD

Klīniskā pieredze rāda, ka reimatoīdā artrīta (RA) pacienti ir predisponēti aterosklerozei un kardiovaskulārai slimībai (Nasonov EL, Vestn Ross Akad Nauk 2003(7):6-10). Pacientiem ar ilgstošu RA ateroskleroze ir biežāk nekā tāda paša vecuma pacientiem ar nesenāku slimības sākumu. Sistēmisks iekaisums var pastiprināt ar vecumu saistīto kardiovaskulārās slimības risku (Del Rincon I et al, Atherosclerosis 2007; 196(2):3 54-360).

Reimatoīdam artrītam ir pirmā vieta starp reimatoīdajiem veselības traucējumiem. Visadekvātākais cilvēka reimatoīdā artrīta eksperimentālais dzīvnieku modelis ir adjuvanta artrīta modelis, kuru izsauc ar Freinda adjuvanta injekcija žurkas pakaļkājas pēdā. Tas tiek plaši izmantots pretartrīta vielu atlasē (Wei Jia et al, Journal of Ethnopharmacology 2003(89): 139-141; Sutharson Lingadurai et al, African Journal of traditiona.1, complementary and alternative medicines, 2007;, 4(4):411416).

Metodes. Mūsu eksperimenti tika plānoti, lai pārbaudītu MDAS ietekmi uz adjuvanta artrita attīstību salīdzinājumā ar MD un ASS. Eksperimenti tika veikti ar Wistar žurkām, kuru sākotnējā ķermeņa masa bija 153-185 g. Žurkas tika turētas klimatizētās telpās 22±1 °C temperatūrā, ar relatīvo mitrumu 60 ±5% un 12/12 gaismas/tumsas ciklu. Katrā standarta būri tika turētas 7 žurkas ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim un granulētai standarta barībai. Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar Eiropas Kopienas Padomes 1986. gada 24. novembra direktīvu (86/609/EK) par dzīvnieku izmantošanu zinātniskiem mērķiem. Tika pieliktas visas pūles, lai līdz minimumam samazinātu dzīvnieku ciešanas un samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu.

Tika izmantota modificēta standarta procedūra hroniskā adjuvanta artrita izraisīšanai un tā progresa novērtēšanai (Bellavite P, Ortolani R, Conforti A, Immunology and Homeopaty. 3. Experimental Studies on Animal Modeh, Advance Access Publication 2.05,2006, 171-186). Žurkām tika injicēts pilnais Freinda adjuvants pakaļkājas pēdā 0,1 ml un intraperitoneāli 0,05 ml.

Pārbaudāmo vielu šķīdumi tika gatavoti ex tempore. ASS lietoja kā 0,1% un 1%, MD kā 1% un MDAS kā 0,25%, 1% un 2% ūdens šķīdumu. Pētāmos šķīdumus dzīvniekiem ievadījap.o. ar katetru kuņģī.

Tika izveidotas šādas dzīvnieku grupas (N=7):

-GRUPA PROCEDŪRA

1. grupa intakti dzīvnieki, izmantoti kā kontrole (Kontrole);

2. grupa dzīvnieki ar ierosinātu adjuvanta artrītu (AdA);

3. grupa dzīvnieki, kas saņēma ASS devā 10 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (ASS 10);

4. grupa dzīvnieki, kas saņēma ASS devā 100 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (ASS 100);

5. grupa dzīvnieki, kas saņēma MD devā 100 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (MD100);

6. grupa dzīvnieki, kas saņēma MDAS devā 25 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (MDAS25);

7. grupa dzīvnieki, kas saņēma MDAS devā 100 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (MDAS 100);

8. grupa dzīvnieki, kas saņēma MDAS devā 200 mg/kg dienā 28 dienas pēc adjuvanta artrita ierosināšanas (MDAS200);

Dzīvnieki Kontroles grupā un AdA grupā pētāmo vielu vietā saņēma ūdeni p.o. pēc tāda paša plāna kā pētījuma grupas.

Rezultāti. Artrīta klīnisko izpausmju dinamiku pētīja 14. dienā un 28. dienā. Pētāmo vielu efektus novērtēja, izmantojot šādus kritērijus:

1. Artrita lokālo izpausmju novērtējums - ķepas un potītes locītavas apjoms.

2. Asins ainas novērtējums (WBC).

3. Bioķīmisko testu novērtējums (CRP).

4. Imunoloģisko rādītāju novērtējums (CIC līmenis).

Tūsku, t.i., pakaļkājas ķepas apjomu, mērija ar onkometru. Aizsardzības procents (tūskas nomākšana) tika aprēķināts pēc formulas:

A (%) = (Vc - Vt)/Vc x 100, kur

Vc - ķepas apjoms kontroles grupā.

Vt - ķepas apjoms testa grupā

A - Aizsardzības % (tūskas nomākšana).

Hematoloģiskos rādītājus noteica ar standarta metodēm, izmantojot hematoloģisko analizatoru «PENTRA 120», CRP noteica ar «INTEGRA 400+».

CIC līmeni asins serumā noteica spektrometriski, izmantojot etilēnglikolu.

Pēc Freinda adjuvanta injekcijas visiem testa grupu dzīvniekiem izveidojās lokāls iekaisums, žurkas kļuva sagurušas, agresīvas pret aizskaršanu, izspūrušas. Tomēr barības uzņemšanas paradumi visās grupās neatšķīrās no kontroles. Ķermeņa masas pieaugums visās grupās būtiski neatšķīrās no kontroles grupas.

Dati par artrīta lokālajām izpausmēm parādīti 12. un 13. tabulā: ķepas apjoms (raksturo mīksto audu tūsku) un potītes locītavas apjoms/izmērs (raksturo artrīta tipa organiskos bojājumus saistaudos) 14. dienā un 28. dienā.

12. tabula

Pētāmo vielu ietekme uz ķepas apjomu (ml) 14. un 28. diena pēc Freinda adjuvanta injekcijas; N~7; Mean±SEM

Grupa	Ķepas apjoms 14. diena	Ķepas apjoms 28. diena
ml	Aizsardzība %	ml	Aizsardzība %
Kontrole	1,03±0,Ι2**	-	l,08±0,17*”	-
AdA	2,42±0,17	0	2,23±0,24	0
ASS10	2,53±0,10	-7	2,08±0,12	7
ASS100	2,35±0,14	3	l,52±0,07*	32
MD100	2,60±0,21	-7	l,93±0,13	13
MDAS25	2,20±0,21	9	l,32±0,12	41
MDAS 100	2,07±0,17^&	15	1,22±0_;08^&&&<s!I	45
MDAS200	2,13±0,ll^&	12	l,7±0,09^#&®	24

^eP<0,05 pret AdA ***P<0,0005 pret AdA ^&P<0.05 pret ASS 10 ^<0,005 pret ASS 10 ^&&ΛΡ<0,0005 pret ASS 10 @P<0,05 pret ASS 100 ^JP<0,05 pret MD

Kā izriet no 12. tabulas datiem, 14. dienā visiem pētījuma grupas dzīvniekiem bija izveidojusies izteikta mīksto audu tūska. Ārstēšana 14. dienu garumā relatīvi maz ietekmēja tūskas attīstību. Tomēr dzīvniekiem grupās MDAS100 un MDAS200 bija nozīmīgi mazāk izteikta tūska nekā dzīvniekiem grupā ASS 10 grupā. MD un ASS 10 uz 14. dienu nenovērsa tūskas attīstību, bet pat palielināja apjomu, salīdzinot ar AdA grupu (negatīva aizsardzība -7%). MDAS visās devās un ASS 100 pēc 28. dienām nozīmīgi aizsargāja pret tūskas attīstību (aizsardzība %, attiecīgi, 41, 45, 24 un 32 %). Jāatzīmē, ka MDAS 100 parādīja nozīmīgi labāku aizsardzību nekā ASS 10, ASS 100 un MD.

13. tabula

Pētāmo vielu efekts uz izmaiņām potītes locītava 14. un 28. dienā pēc Freinda adjuvanta injekcijas. N=7; Mean*SEM

Grupa	Potītes locītavas izmēri 14. dienā, mm	Potītes locītavas izmēri 28. dienā, mm
Kontrole	5,60,09*	5,8±0,12**
AdA	7,2*0,14	7,3±0,16
ASS 10	7,2±0,12	6,80,14
ASS 100	6,9*0,15	7,I±0,16
MD100	7,0±0,13	7,0*0,13
MDAS25	7,0±0,14	6,70,15
MDAS100	7,0±0,13	6,60,16®*
MDAS200	6,8*0,10	6,9*0,11

*P<0,05 pret AdA **P<0,005 pret AdA ^&P<0,05 pret ASS 10 ®P<0,05 pret ASS 100 ^sP<0,05 pret MD

Potītes locītavas datu analīze (13. tabula) rāda, ka 14. dienā tikai MDAS200 nozīmīgi aizsargāja pret artrīta bojājumiem. 28. dienā nozīmīgu aizsardzību uzrādīja MDAS25, MDAS100 un ASS 100. Salīdzinoši labāku aizsardzību šajā eksperimentā parādīja MDAS100. Mēs konstatējām, ka 28. dienā tūskas līmenis (12. tabula) un artrīta izmaiņas potītes locītavā (13. tabula) bija samazinājušās. MDAS100 bija nozīmīgi lielāks efekts nekā ASS vai MD.

Asins ainas (WBC) novērtējums parādīja leikocītu skaita pieaugumu Freinda adjuvanta ietekmē (14. tabula). Leikocitoze ir raksturīga iekaisuma procesa pazīme.

14. tabula

Pētāmo vielu izraisītās izmaiņas asins ainā 14. un 28. dienā pēc Freinda adjuvanta injekcijas. N=7; Mean±SEM

Grupa	Leikocīti 10³/mm³
14. diena	28. diena
Kontrole	15,170,76*	16,500,52*
AdA	21,481,47*	20,320,90*
ASS10	15,831,23	16,681,22
ASS10	17,07*1,43	16,911,17
MD100	14,421,41	15,551,26
MDAS25 ,	14,721,63	16,77*1,78
MDAS100	14,130,53*	15,520,57*
MDAS200	15,421,40	14,350,84*

**P<0,005 pret Kontroli *P<0,05 pret AdA *P<0,005 pret AdA

Pētāmo vielu izmantošana izsauca leikocītu skaita samazināšanos, salīdzinot ar AdA grupu, kas norāda uz pretiekaisuma aktivitāti. Lai gan starp pētāmajām vielām nebija statistiski nozīmīga atšķirība ietekmē uz leikocītu skaita palielināšanos, 14. dienā salīdzinoši augstāka aktivitāte bija novērojama MDAS100, bet 28. dienā MDAS200 grupā (14. tabula).

Lai novērtētu iekaisuma procesa attīstību, tika noteikts CRP līmenis 14. un 28. dienā. Ir zināms, ka iekaisuma procesa laikā paaugstinās CRP līmenis.

15. tabula

CRP līmeņa izmaiņas žurku asinīs pētāmo vielu ietekmē 14 un 28. dienā

pēc Freinda ad	uvanta injekcijas. N=7, MeaniSEM
Grupa	CRP, mg/I
14. diena	28. diena
Kontrole	0,19±0,01^e“”	0,16±0,02^##
AdA	0,30±0,02***	0,24±0,02**
ASS 10	0,26±0,01**	0,19±0,01#
ASS 100	0,29±0,01***	0,18±0,02#
MD100	0,26±0,02**	0,17±0,02*
MDAS25	0,29±0,02**	0,15±0,02
MDAS100	0,29±0,02**	0,I6±0,01
MDAS200	0,25±0,01*#^fe	0,19±0,0l“

*P<0,05 pret Kontroli **P<0,005 pret Kontroli ***p<0,0005 pret Kontroli *P<0,05 pret AdA **P<0,005 pret AdA **P<0,0005 pret AdA ^&P<0,05 pret ASS 10 @P<0,05 pret ASS 100

Kā izriet no 15. tabulas datiem, 14. dienā visās pētījuma grupās bija novērojams CRP līmeņa pieaugums, kas liecina par iekaisuma procesu. Mūsu eksperimentā tikai MDAS200 uzrādīja nozīmīgu aizsardzību pret CRP pieaugumu 14. dienā. Jāatzīmē, ka 14. dienā MDAS200 uzrādīja būtiski labāku rezultātu nekā ASS 100. 28. dienā nozīmīgi labāku aizsardzību uzrādīja MDAS25 un MDAS100, kas bija labāki nekā ASS 10 (15. tabula).

CIC līmenis tika noteikts ar standarta spektrofotometrisku metodi (Baranovskii PV, Rudyk Bl, Laboratornoe delo 1982;12:35-39 (Rus). Imunoloģisko faktoru dinamiku novērtēja 14. un 28. dienā. Izmaiņas CIC līmenī ir parādītas 16. tabulā.

16. tabula

CIC daudzums (vienībās) 14. un 28. diena pēc Freinda adjuvanta injekcijas. N=7; Mean±SEM

Grupa	CIC vienības, 14. diena	CIC vienības, 28. diena
Kontrole	9,4±l,05*	7,8±0,49^##
AdA	17,4±1,29**	13,4±1,25**
ASS 10	10,8±0,74^##	8,2±0,53*
ASS 100	15,0±l,23*	14,4±1,66*
MD100	11,8±2,22	8,6±0,93#
MDAS25	12,6±0,68*	11,8±1,53
MDAS100	20,8±2,99*	5,8±0,74^®'⁵'⁵
MDAS200	21,6±3,26*	6,2±l,02**®

*P<0,05 pret Kontroli **P<0,005 pret Kontroli *P<0,05 pret AdA *#P<0,005 pret AdA ^sP<0,05 pret MD ^&P<0,05 pret ASS 10 @P<0,05 pret ASS 100 @@P<0,005 pret ASS 100

14. un 28. dienā CIC līmenis pētījuma grupās bija augstāks nekā Kontroles grupā. 14. dienā tikai ASS10 un MDAS25 grupās CIC līmenis bija zemāks nekā AdA grupā. 28. dienā grupās, kas saņēma pētāmās vielas, izņemot ASS 100 grupu, CIC līmenis bija tuvu Kontrolei.

Eksperimenta laikā CIC līmeņa pieaugums 14. dienā tika novērots ASS 100, MDAS100 un MDAS200 grupās. 28. dienā CIC līmenis MDAS100 un MDAS200 grupās bija normalizējies. CIC līmeņa paaugstināšanos asins serumā var novērot dažādos patoloģiskas imunitātes stāvokļos. Būtisks CIC pieaugums ir novērojams iekaisuma procesos, ieskaitot sistēmiskus stāvokļus, kad CIC līmenis raksturo patoloģiskā procesa intensitāti (Bier 0 et al, Fundamentāls of immunology, New York, Heidelberg, Berlin, p. 442). Ilgāka ārstēšana ar MDAS dažādās devās pazemināja CIC līmeni līdz normai. Pietiekami augstas imunitātes gadījumā galveno CIC daļu aizvāc Kupfera šūnas un CIC līmeņa pazemināšanos uztver kā pozitīvu efektu. Fakts, ka MDAS lietošana MDAS 100 un MDAS200 grupās uzrādīja normalizējošu efektu uz CIC līmeni 28. dienā, norāda, ka artrīta ārstēšanā ilgāka MDAS lietošana dažādās devās var būt klīniski perspektīvāka nekā paaugstinātas ASS devas.

6. piemērs. Antihiperlipidēmisko īpašību izpēte

Ateroskleroze ir multifunkcionāls process (Berliner JA et al, Circulation 1995;91: 2488-2495), kuras klīniskā ietekme pieaug līdz ar pieaugošiem sirds koronārās slimības simptomiem. Būtiska loma aterosklerozes procesos ir iekaisumam un organisma atbildei uz to (Ross R, Am Heart J 1999;138:S419-S420). Klīniskie novērojumi norāda, ka pretiekaisuma terapija mazina aterosklerozes izpausmes (Stoller DK et al, J Surg Res 1993;54:7-11). Eksperimentālie dati vismaz COX-1 inhibitoriem apstiprina ievērojamu korelāciju starp pretiekaisuma aktivitāti un hipolipidēmisko aktivitāti (Kourounakis AP et al, Exper Mol Pathol 2002;73:135138). Mēs salīdzinājām ASS un MDAS hipolipidēmisko aktivitāti ekvivalentās devās.

6.1. Pētāmo vielu salīdzinošā aktivitāte uz lipīdu līmeni žurku akūtās hiperlipidēmiias modelī

Metodes. Tika izmantoti Wistar žurku tēviņi ar ķermeņa masu 250-270 g. Dzīvnieki tika turēti grupās pa 6-8 piemērotos būros klimatizētās telpās pie 22±1 °C, relatīvā mitruma 60±5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas cikla ar brīvu pieeju barībai un ūdenim. Akūta eksperimentāla hiperlipidēmija/hiperholesterinēmija tika inducēta ar Triton WR1339, kā aprakstīts darbā: Kourounakis AP et al, Exper Mol Pathol 2002;73:135-138). Žurkām pēc nakts bez barības tika i.p. ievadīts Triton WR1339 (TR), izšķīdināts izotoniskā fizioloģiskā šķīdumā devā 250 mg/kg. Pētāmo vielu šķīdums vai ūdens tika ievadīts TR un kontroles grupas dzīvniekiemp.o. vienu stundu pirms un 20 stundas pēc TR ievadīšanas, kā aprakstīts tālāk.

Asinis bioķīmiskām analīzēm tika paņemtas nākamajā dienā (24 stundas pēc TR injekcijas) ar sirds punkciju ētera narkozē. Serumu atdalīja centrifugējot un noteica kopējā H, ABL, ZBL un TG līmeni ar komerciāliem analīžu komplektiem.

Tika veiktas trīs eksperimentu sērijas.

Statistika. Dati tika analizēti ar Microsoft Excel programmatūru un rezultāti izteikti kā vidējais +/- vidējā standarta kļūda (Mean±SEM ). Dažādu grupu vidējie rezultāti tika salīdzināti, izmantojot vienfaktora analīzi pēc ANOVA un t-Stjūdenta testiem. Par nozīmīgu tika uzskatīts P<0,05.

I sērija - ASS, MD un MDAS salīdzinājums

GRUPA PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits

Kontrole 6

TR TR 250 mg/kg 8

ASS45 TR 250 mg/kg+ASS 45 mg/mg 6

ASS90 TR 250 mg/kg+ASS 90 mg/mg 8

MD150 TR 250 mg/kg+MD 150 mg/kg 8

MDAS75 TR 250 mg/kg+MDAS 75 mg/kg 6

MDAS 150 TR 250 mg/kg+MDAS 150 mg/kg 8

MDAS300 TR 250 mg/kg+MDAS 300 mg/kg 8

Rezultāti. Žurkām, kuras saņēma TR, veidojās izteikta hiperholesteiīnēmija un hiperlipidēmija ar kopējā holesterīna, ZBL un TG līmeņiem nozīmīgi atšķirīgiem no kontroles grupas (kopējā H pieaugums 6-7 reizes, TG 30 reizes un vairāk, skat. 17. tabulu). ASS terapija, īpaši devā 90 mg/kg, ierobežoja kopējā H, ZBL un TG pieaugumu, bet nozīmīgi nemainīja ABL līmeni. MD mūsu eksperimentā nozīmīgi neaizsargāja no TR izraisītajām izmaiņām lipīdu līmeņos. Terapija ar MDAS nodrošināja no devas atkarīgu aizsardzību no TR inducētas hiperlipidēmijas/hiperholesterinēmijas. MDAS devā 75 mg/kg neatšķiras no ASS45, bet MDAS150 ir ievērojami efektīvāks nekā ASS45 un MD150 aizsargājot no TR efektiem. MDAS300 ievērojami labāk nekā ASS45 un ASS90 pazemināja kopējā H, ZBL un TG līmeņus. Tas norāda, ka MDAS var būt noderīgs hiperholesterēmisku un hiperlipidēmisku stāvokļu profilaksei un/vai ārstēšanai, un, ievērojot tā pretiekaisuma aktivitāti, var būt noderīgs, lai novērstu un/vai ārstētu aterosklerozi un citus veselības stāvokļus, kurus veicina traucējumi lipīdu metabolismā un iekaisums.

17. tabula

MD, ASS un MDAS salīdzinošā ietekme uz lipīdu līmeni žurku hiperlipidēmijas modelī; n=6-8; Mean±SEM

Grupa	Hmg/dl	ABL mg/dl	ZBL mg/dl	TG mg/dl
Kontrole	80.7±4.7***	56.5±2.8	21.1±2.6***	44.0±6.9***
TR	453.6±40.0	60.3±9.6	386.0±36.5	1399±129.7
ASS45	381.0±30.3	62.8±10.9	307.4±37.8	973±82.7*
ASS90	288.1±23.5*	60.0±7.4	219.1±23.9*	791±73.9**
MD150	345.6±34.1	63.8±9.3	273.9±31.6*	1022±80.7*
MDAS75	341.9±16.3*	68.1±8.7	270.1±12.8*	861±105.7*
MDAS 150	249.6±22.2**'^a	58.2±8.1	182.4±19.6**¹⁴·	“668ĪĪ04Ā**⁵®
MDAS300	219.0±16.7**^Wi	56.3±8.6	158.6±19.4**^lsi	548±73.2***^&w

*P<0,05 pret TR **P<0,005 pret TR ***P<0,0005 pret TR ^sP<0,05 pret ASS45 *P<0,05 pret ASS90 ^&P<0,05 pret MD150

ĪT sērija - ASS. MDAS. NS un kombināciju ASS+NS, MDAS+NS salīdzinājums

GRUPA	PROCEDŪRA	Dzīvnieku skaits
Kontrole		6
TR	TR 250 mg/kg	8
ASS45	TR 250 mg/kg+ASS 45 mg/mg	6
MDAS	TR 250 mg/kg+MDAS 150 mg/kg	6

NS TR 250 mg/kg+NS 50 mg/kg 7

ASS+NS TR 250 mg/kg+ASS 45 mg/mg+NS 50 mg/kg 7

MDAS+NS TR 250 mg/kg+MDAS 150 mg/mg+NS 50 mg/kg 7

Rezultāti. Mūsu eksperimentā NS nodrošināja nozīmīgu aizsardzību pret izmaiņām lipīdu (H, ZBL un TG) līmenī, kuru inducēja TR (skat. 18. tabulu). ASS kombinācija ar NS nozīmīgi nemainīja NS ietekmi uz lipīdu līmeni. Pārsteidzoši MDAS un NS ievērojami pastiprināja NA50 efektu un pārsniedza MDAS aizsargājošo efektu uz TG līmeņa paaugstināšanos, kuru izraisīja TR (18. tabula). Kombinēta MDAS un NS lietošana bija ari nozīmīgi efektīvāka nekā ASS45+NS50, normalizējot ZBL un TG līmeņus.

18. tabula

MD, ASS un MDAS, atsevišķi un kombinācijā, ietekme uz lipīdu līmeni žurku hiperlipidēmijas modelī; n=6-8; Mean+SEM_

Grupa	H mg/dl	ABL mg/dl	ZBL mg/dl	TG mg/dl
Kontrole	80,7+4,7***	56,5+2,8	21,1+2,6***	44+6,9***
TR	453,6+40,0	60,3+9,6	386,0+36,5	1399+129.7
ASS45	381,0+30,3	62,8+10,9	307,4+37,8	973+82.7*
MDAS 150	249,6+22,2**$	58,2+8,1	182,4+19,6**$	668+70,9**$
NS50	327,5+38,4*	66,5+14,6	246,3+32,5*	591+43,3**
ASS45+NS50	316,0+43,1*	57,9+14,3	251,2+33,8*	618+42,8**
MDAS150+NS50	226,3+24,9***$	63,1+10,2	163,2+19,3** ^m	468+34,7* *$^#%®

*P<0,05 pret TR **P<0,005 pret TR ***P<0,0005 pret TR $P<0,05 pretASS45 ®P<0,05 pret MDAS 150 P<0,05 pretNS50 ^%P<0,05 pret ASS45+NS50

III sērija - ST MD, MDAS un kombināciju SI+MD. SI+MDAS salīdzinājums

GRUPA PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits

Kontrole 6

TR TR 250 mg/kg 8

Sl TR 250 mg/kg+SI 5 mg/kg 7

MD TR 250 mg/kg+MD 150 mg/kg 6

MDAS TR 250 mg/kg+MDAS 150 mg/kg 6

SI+MD TR 250 mg/kg+SI 5 mg/kg+MD 150 mg/kg 7

SI+MDAS TR 250 mg/kg+SI 5 mg/kg+MDAS 150 mg/kg 7

Rezultāti, Mūsu eksperimentā Sl devā 5 mg/kg nodrošināja nozīmīgu aizsardzību pret izmaiņām lipīdu (H, ZBL un TG) līmenī, kuru inducēja TR (skat. 19. tabulu). Sl kombinācija ar pētāmajām vielām palielināja normalizējošo efektu uz lipīdu līmeni. MDAS kombinācijā ar Sl bija nozīmīgi efektīvāks nekā MD+SI, novēršot TR izraisīto ZBL un TG līmeņu palielināšanos (19. tabula). MD kombinācija ar statiņiem ir aprakstīta W02006099244 bez konkrētiem datiem. Statīnu kombinētai lietošanai ar ASS nepieciešama īpaša farmaceitiskā kompozīcija, jo šīs vielas ir farmakoloģiski un ķīmiski nesaderīgas (ASV pat. 6,235,311), tāpēc sinerģija nav iespējama.

19. tabula

MD. MDAS un SI, atsevišķi un kombinācijā, efekti uz lipīdu līmeni žurku hiperlipidēmijas modelī, n=6-8, Mean±SEM

Grupa	H mg/dl	ABL mg/dl	ZBL mg/dl	TG mg/dl
Kontrole	80,7±4,7***	56,5±2,8	21,1+2,6***	44+6,9***
TR	453,6±40,0	60,3±9,6	386,0+36,5	1399+129,7
SI	321,3±32,3*	53,7±12,4	259,3+30,1*	826+44,1**
MD	345,6±34,1	63,8+9,3	273,9+31,6*	1022+80,7*
MDAS	249,6±22,2**^&	58,2+8,1	182,4+19,6***	668+70,9***
SI+MD	281,5±31,2**^&	59,5+14,9	217,1 ±26,2*	690+32,6**^&l
SI+MDAS	230,7±28,6**^&ī	62,8+14,6	153,4+28,0***^1#	512+40,2**

*P<0,05 pret TR * *P<0,005 pret TR ***P<0,0005 pret TR ^&P<0,05 pret MD ^sP<0,05 pret SI #P<0,05 pret MD+SI

Kopsavilkums. Šie rezultāti norāda uz MDAS potenciālu hiperholesterinēmijas un hiperlipidēmijas profilaksē un/vai ārstēšanā. Ņemot vērā MDAS pretiekaisuma aktivitāti, tas var būt efektīvāks nekā ASS vai MD aterosklerozes un citu stāvokļu, kursus veicina iekaisums, profilaksē un/vai ārstēšanā. Kombinēta MDAS un NS lietošana pastiprina atsevišķo vielu pozitīvos efektus uz eksperimentāli paaugstinātu lipīdu līmeni vairāk nekā ASS+NS. MDAS kombinācijā ar SI bija ne tikai efektīvāks kā SI atsevišķi, bet bija ari nozīmīgi efektīvāks nekā MD+SI, novēršot TR izraisīto ZBL un TG līmeņa paaugstināšanos.

6.2. NS un MDAS. atsevišķi un kombinācijā, ietekme uz lipīdu līmeni žurku hroniskā hiperlipidēmijas modelī

Metodes. Tika lietoti Wistar žurku tēviņi. Dzīvnieki tika turēti klimatizētās telpās pie 22±1 °C, relatīvā mitruma 60±5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas cikla ar brivu pieeju ūdenim un barībai. Sākotnējā dzīvnieku masa bija 220-240 g. Eksperimentālā hroniskā (subhroniskā) hiperlipidēmija/hiperholesterinēmija tika inducēta ar TR, izmantojot Levine un Saltzman aprakstīto metodi (Levine S. Saltzman A. J Pharmacol ToxicolMeth 2007;55:224-226). Dzīvnieki saņēma 250 mg/kg TR šķīdumu astes vēnā trīs reizes nedēļā 3 nedēļas. Pētāmo vielu šķīdumus eksperimentālajām grupām vai ūdeni Kontroles un TR grupai ievadīja p.o. vienreiz dienā vienu stundu pirms TR šķīduma injekcijas vai asins parauga ņemšanas saskaņā ar turpmāko shēmu:

GRUPA PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits

Kontrole		10
TR	TR 250 mg/kg	14
TR+NS	TR 250 mg/kg+NS 50 mg/kg/d	14
TR+MDAS	TR 250 mg/kg+MDAS 150 mg/kg/d	14
TR+NS+MDAS	TR 250 mg/kg+NS 50 mg/kg+MDAS 150 mg/kg/d	14

Asinis bioķīmiskām analīzēm tika ņemtas pēc 1, 2 un 3 nedēļām (nākošajā dienā pēc TR injekcijas) ar sirds punkciju ētera narkozē. Serumu atdalīja centrifugējot un noteica kopējā H, ABL, ZBL un TG līmeni ar komerciāliem analīžu komplektiem.

Statistika. Dati tika analizēti ar Microsoft Excel programmatūru un rezultāti izteikti kā vidējais +/- vidējā standarta kļūda (Mean±SEM). Dažādu grupu vidējie rezultāti tika salīdzināti, izmantojot vienfaktora analīzi pēc ANOVA un t-Stjūdenta testiem. Par nozīmīgu tika uzskatīts P<0,05.

Rezultāti. Atkārtotas TR injekcijas izraisīja izteiktu un stabilu hiperholesterinēmiju un hiperlipidēmiju, ko raksturoja nozīmīgs kopējā H, ZBL un TG līmeņa pieaugums, salīdzinot ar Kontroli (kopējais H pieauga 6-7 reizes, TG 30 un vairāk reizes, skat. 20. tabulu). NS terapija, nozīmīgāk pirmajā nedēļā, ierobežoja kopējā H, ZBL un TG pieaugumu, bet nozīmīgi paaugstināja ABL līmeni tikai 2. un 3. nedēļā. MDAS gandriz tikpat kā NS pazemināja kopējā H un ZBL līmeni un paaugstināja ABL līmeni, bet mazāk nekā NS novērsa TR izraisīto TG pieaugumu (skat. 20. tabulu).

Negaidīti izrādījās, ka kombinēta NS+MDAS lietošana pēc 3 nedēļām būtiski labāk nekā NS vai MDAS atsevišķi pazemināja kopējā H, ZBL un TG līmeni un paaugstināja ABL līmeni. Tādā veidā var sagaidīt, ka kombinācija NS+MDAS būs noderīga hiprholesterīnēmijas un hiperlipidēmijas profilaksei un/vai ārstēšanai.

20. tabula

NS un MDAS, atsevišķi un kombinācijā, ietekme uz lipīdu līmeni žurku hroniskas hiperlipidēmijas modelī; n=9-14; Mean+SEM

Grupa	Kopējais H pec 1, 2 un 3 nedeļam, mg/dl
Cl	C2	C3
Kontrole	77,6+4,9*	75,1+5,1*	72,7+2,5*
TR	487,6+25,4	501+16,7	513+41,1
TR+NS	345+15,7*	401,1+25,1**	405,5+25,9*
TR+MDAS	375,9+25,8*	406,7+19,8**	409+39,4
TR+NS+MDAS	331,7+28,4**	379,1+24,7**	375,8+31*

20. tabula (turp.)

Grupa	ABL pec 1,2 un 3 nedejām, mg/dl
ABL1	ABL2	ABL3
Kontrole	54,6+1,9*	54,1+1,3	53,7+1,0*
TR	76,3+6,9	76,2+11,4	77+10,2
TR+NS	111,3+9,1*	144,7+13,5*	127,3+10,9*
TR+MDAS	100,1+9,4	113,8+13,1	128,3+18,5*
TR+NS+MDAS	112,3+10,9*	129,2+13,1*	154,1+19*

20. tabula (turp.)

Grupa	ZBL pec 1, 2 un 3 nedēļām, mg/dl
ZBL1	ZBL2	ZBL3
Kontrole	18,7+3,8*	19,7+4,4*	16,3+2,0*
TR	388,7+26,7	402,1+19,2	405,1+41,7
TR+NS	216,3+14,0	250,3+20,6*	265,1+18,4*
TR+MDAS	263,3+19,4	287,6+18,5*	261,9+12,6**
TR+NS+MDAS	205,7+18,5**	222,4+16,5**	214,4+15,1“*

Grupa	TG pēc 1, 2 un 3 nedēļām, m	g/dl
TG1	TG2	TG3
Kontrole	38+2,9*	37+3,2*	38+4,4*
TR	1240+80,1	1297+78,3	1234+114,1
TR+NS	734+81,6*	860+73,8**	828+44.7*
TR+MDAS	964+94,9*	1079+84	982+72,7
TR+NS+MDAS	721,6+52,4**	807,6+80,1**	714+27,3***

*P<0,05 pret TR

20. tabula (turp.) **P<0,005 pret TR *<0,0005 pret TR ^sP<0,05 pretNS ^&P<0,05 pret MDAS

Kopsavilkums

Kombinēta MDAS un NS lietošana ir nozīmīgi efektīvāka nekā šo vielu atsevišķa lietošana.

7. piemērs. Pētāmo vielu ietekme uz trombocītu salipšanu un trombu veidošanos

7.1, Trombocītu salipšana

ASS ir viens no visplašāk lietotajiem profilaktiskajiem līdzekļiem pret trombocītu salipšanu (Miner J et al, Tex Heart Inst J 2007;34(2): 179-186). ASS ir kombinēta ar NS kā pretiekaisuma (US 3,312,593) un trombocītu pretsalipšanas līdzeklis (WO 9632942). Ir zināmi daudzi citi līdzekļi un to kombinācijas. Ir konstatēts, ka MD normalizē asinsvadu tonusu, inhibē trombocītu salipšanu un taukskābju oksidēšanu, kā arī optimizē skābekļa patēriņu miokarda išēmijas gadījumā (Tsirkin VI, Ros Kardiol Zh 2002; 1:45-52). NS ari nedaudz kavē trombocītu salipšanu (Lakin KM, Farmakol Toksikol, 1980,43; 43(5):581-5 (Rus). Tipiskais pretsalipšanas līdzeklis klopidogrels tiek lietots atsevišķi (US 4,529,596, US 4,847,265, US 5,576328) vai kombinācijā ar stariņu (WO9804259) vai ASS (WO9729753). Ar ASS var tikt kombinēts ari pretsalipšanas līdzeklis dipiridamols (Halkes PH et al, Lancet 2006,367(9523):1665-73). Klīniskā pieredze liecina, ka dažādu līdzekļu kombinācijām ir daudzpusīgāks pielietojums.

Metode. Trombocītu salipšana tika pētīta, izmantojot pilnasiņu impedances agregometriju ar Multiplate (Multiple Platelet Function Analyzer, Dynabyte Medical, Vācija) (Toth O et al, Thromb Haemost 2006;96:781-788. Velik-Salchner C et al, Anesth Analg 2008;107:1798-1806). Asins paraugi in vitro eksperimentam tika ņemti no vesela donora B. (37 g.v.), kas nebija lietojis ASS vai citus pretsalipšanas līdzekļus, plastmasas stobriņos ar hirudīna pārklājumu (Dynabyte Medical, Vācija) un izmantoti mērījumam laikā no 30 min. līdz 4 stundām pēc paņemšanas. Eksperimentam ex vivo asinis tika savāktas plastmasas stobriņos ar hirudīna pārklājumu (Dynabyte Medical, Vācija) no narkotizētām žurkām, kuras 3 iepriekšējās dienas bija saņēmušas pētāmās vielas p.o. Mērījumi tika veikti saskaņā ar modificētu Dynabyte Medical protokolu. Izotonisks nātrija hlorīda šķīdums (0,3 ml, vai sāls šķīdums ar pētāmo vielu galīgajā koncentrācijā 10⁴ mmol/ml katram) tika sasildīts līdz 37 °C un pipetēts mērījuma šūnās, pieliekot 0,3 ml no pilnasiņu parauga, kam kā antikoagulants pievienots hirudīns. Pēc 5 minūšu inkubācijas un maisīšanas pie 37 °C tika pievienots atbilstošā agonista (no Dynabyte Medical, Vācija) šķīdums un veikti mērījumi:

1) adenozīna difosfats (ADF) - ADF tests. ADF stimulē trombocītu aktivāciju ar ADF receptoriem (Ρ2Υ12 u.c.).

2) arahidonskābe (AS) - ASPI tests: aktivācija ar AS - vielu, no kuras ciklooksigenāze veido tromboksānu A2 (ΤΧΑ2), kas ir spēcīgs trombocītu agonists.

3) ADF HS tests (prostaglandīns Ej kopā ar ADF). Tāda endogēnā inhibitora kā PGEj pievienošana padara ADF HS testu jutīgāku pret klopidogrela un līdzīgu vielu efektiem, salīdzinot ar ADF testu.

Agregācijas līknes tika reģistrētas 6 minūtes un analizētas ar Dynabyte Medical programmatūru. Tika aprēķināti šādi trombocītu salipšanas parametri:

1) Amax, trombocītu salipšanas maksimālā vērtība nosacītās salipšanas vienībās (AU);

2) AUC, kopējais laukums zem agregacijas līknes (AU*min). To ietekmē kopējais agregācijas līknes augstums un tās slīpums un tas ir vislabāk piemērots kopējās trombocītu aktivitātes izteikšanai.

Statistika. Rezultāti tika izteikti kā vidējais lielums un vidējā standarta kļūda (Mean ± SEM). Lai novērtētu atšķirību ticamību, tika lietots vienvirziena ANOVA tests. Ja nulles hipotēze tika noraidīta, tika izmantots post-hoc Student-Newman-Keuls tests.

Rezultāti. Kā redzams 21. tabulā, MDAS koncentrācijā ΚΓ⁴ mol nozīmīgi aizsargāja pret ADF un īpaši pret trombocītu salipšanu AS un ADF+PGEi ietekmē (nozīmīgs AUC un Amax samazinājums, 21. tabula). NS (10⁴ mmol/ml grupā) ari samazināja ADF izraisīto salipšanu (skat. Amax, 21. tabula). Abu vielu kombinētā darbība deva nozīmīgi augstāku un izteiktāku trombocītu salipšanas samazinājumu ADF vai ADF+PGEi testā, kas parādās kā AUC, tā ari Amax datos (21. tabula).

21. tabula

MD, NS un to kombinācijas ietekme uz ADF, AS unADF+PGE, inducētu trombocītu salipšanu; N=5-8; Mean ± SEM.

Grupa	ADF
AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	942+43,7	169,3+6,4
MDAS 10’⁵	828+63,5	153,5+8,8
MDAS 10	798+38,9'	140,5+7,2'
MD 10	869 ±36,3	153,2+6,1
ASS ΙΟ⁴	883+50.3	151,7+9,3
NS 10-⁴	859+62,5	148,0+5.2'
MD 10+NS 10	474+ 34,9^34#SS3	81,0±5.7^444IIa
MDAS 10+NS IC⁴	403+	75,3+6.8²^^3552244
ASS+NS	805+47,3^lb	137+7,l'^b

21. tabula (turp.)

Grupa	AS
AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	1023+46,3	178,8+6,9
MDAS 10'⁵	832+54,1¹	148,4+5,7'
MDAS 10	298+25,3 ^34AS	66,1±6,8^34&I
MD 10	1050+37,6^&	179,5+7,3*
ASS 10	450+24,8^2i\|®	103,l±5.9-^e+
NS 10	1010+41,7	161,1+9,4
MD 10+NS 10	1106+55,4²	173,3+12,1’
MDAS 10+NS 10	216i 18	48 5±6
ASS+NS	463+35,2^2bS4	99,4+8,2²⁶⁵⁴

21. tabula (turp.)

Grupa	ADF+PGE,
AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	1005+46,5	175,3+8,9
MDAS 10	595+45,3'	99,3+4,8²
MDAS 10	533+20,3³	87,7+4,6³
MD 10-⁴	587+37,4²	101,4+2,2²
ASS ΙΟ^-4	-	-
NS 10-⁴	862+51,9	146,7+8,6
MD 10+NS 10	306+35,5^34Sa	54,5+5,8³⁴⁵³
MDAS 10+NS 10		50,2+7,3
ASS+NS	603+42,5^1Jb	98,0+7,2²¹⁶

'P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli ³P<0,0005 pret Kontroli ⁴P<0,00005 pret Kontroli ^&P<0,05 pret ASS *P<0,005 pret MD 10 **P<0,0005 pret MD 10 ^sP<0,005 pret NS 10 ^JIP<0,0005 pretNS 10 ®P<0,05 pret MDAS 10 ’P<0,05 pret ASS+NA Τ<0,05 pret MD+NS

MDAS nozīmīgi labāk nekā ASS vai MD aizsargaja trombocitus no AS inducētas salipšanas (21. tabula). Kombinācija MDAS+NS uzrādīja nozīmīgi augstāku aktivitāti pret trombocītu salipšanu AS ietekmē, pārsniedzot atsevišķu vielu aktivitāti, kā ari ASS+NS un MD+NS aktivitāti (21. tabula).

Tika veikti paralēli eksperimenti ar dipiridamolu (DI) un DI kombināciju ar ASS vai MDAS uz ADF vai AS izraisītu trombocītu salipšanu (22. tabula). DI uzrāda prettrombu un pretsalipšanas aktivitāti (Mammen EF, Thrombosis Research Supplement 1990 XII, 1-3). Dipiridamols kopā ar aspirīnu ir aktīvāks nekā aspirīns pēc arteriālas izcelsmes smadzeņu išēmijas (Halkes PH et al. Lancet 2006, 367(9523):1665-73).

22. tabula

Pētāmo vielu ietekme, atsevišķi un kombinācijas, uz ADF vai AS inducētu trombocītu salipšanu. Mean ± SEM; N= 5-8.

Grupa	ADF	AS
AUC (AU*min)	Amax (AU)	AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	942+43,7	169,3+6,4	1023+46,3	178,8+6,9
MDAS KD	798+38,9'	140,5+7,2'	298+25,3^3aa&	66,l±6,8^Jaa&
ASS lCfi	883+50,3	151,7+9,3	450+24.8³’®	103,l±5,9^Za®
DI 3Χ10-⁴	665+44,1“	111,1+6,9“	1104+45,5*®’®	173,9+5,
MDAS ĪOADI 3x1o-⁴	465+27.θ“^!ΐ“	69 7+3 2^J®^S“		38,5±3,6⁴®®'^ilaaS
ASS ĪOADI 3Χ10-⁴	667+39,4“	105,2x6,7“'-	207,9+27,5““	62,8+6,8““

P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli ³P<0,0005 pret Kontroli ⁴P<0,00005 pret Kontroli *P<0,05 pret ASS ®P<0,05 pret MDAS @@P<0,005 pret MDAS ^aP<0,05 pret DI “P<0,005 pret DI “+><0,0005 pret DI ^sP<0,05 pret ASS+DĪ ^siP<0,005 pret ASS+DI

Šaja sērija visaugstākā aktivitāte piemita MDAS+DI, kas bija nozīmīgi augstāka nekā ASS+DI aktivitāte (22. tabula).

7.2. Tromboze

Divas nedēļas ilga perorāla izmantošana eksperimentālas artēriju trombozes terapijā trušiem un suņiem parādīja MD trombolītisku iedarbību (Logunova L et al, Experim Clin Pharmacoter 1991;19:91-98 (Rus). Nav zināmi dati par MD profilaktisko iedarbību trombozes ierobežošanā vai novēršanā. NS samazina trombozi ar dažādiem mehānismiem (Rosenson RS et al, Atherosclerosis 1998;140:271-80).

Metode. Mēs izvēlējāmies eksperimentālās trombozes modeli, kas pamatojas uz FeCfi inducētu žurku artēriju trombozi (Kurz K et al, Thromb Res 1990,60:269-280. Wang X, Xu L, Thromb Res 2005,115:95-100). Audu oksidatīvs bojājums ar dzelzs līdzdalību veicina trombocītu pieķeršanos bojātajai virsmai un salipšanu, kam seko koagulācijas aktivēšana un fibrina izgulsnēšanās. Eksperimentos tika lietoti Wistar žurku tēviņi ar masu 350-420 g. Dzīvnieki tika turēti grupās pa 7-8 piemērotos būros klimatizētās telpās pie 22±1 °C, relatīvā mitruma 60±5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas cikla ar brivu pieeju barībai un ūdenim. Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar Eiropas Kopienas Padomes 1986. gada 24. novembra direktīvu (86/609/EK) par dzīvnieku izmantošanu zinātniskiem mērķiem. Tika pieliktas visas pūles, lai līdz minimumam samazinātu dzīvnieku ciešanas un samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu. Žurkas tika randomizētas vairākās pētījuma grupās, kurās katrā bija ne mazāk kā 7 dzīvnieki. Nesējs vai pētāmā viela MD (25 mg/kg), NS (25 mg/kg),

MDAS (10 mg/kg), ASS (5 mg/kg) un kombinācijas MD+NS (25+25 mg/kg), MDAS+NS (10+25 mg/kg) un ASS+NA (5+25 mg/kg) tika ievadītas perorāli 2 stundas pirms trombozes izraisīšanas. Tika veikti paralēli eksperimenti, lai salīdzinātu pētāmās vielas vienas devas (ievadot 2 stundas pirms trombozes izraisīšanas) un atkārtotu devu (reizi dienā 3 dienas) efektus. Dzīvnieku grupas (7-8) saņēma šādas vielas: MDAS (10 mg/kg), klopidogrels (CL) (5 mg/kg), ASS (5 mg/kg) un kombināciju MDAS+CL (10+5 mg/kg) vai ASS+CL (5+5 mg/kg). Žurkas tika anestezētas ar pentobarbitālnātriju (50 mg/kg, i.p. un 10 mg/kg/h) un eksperimenta laikā novietotas uz apsildāma operācijas galda, lai uzturētu ķermeņa temperatūru 37 °C. Viena no miega artērijām tika atklāta ar iegriezumu kaklā, atdalīta no apkārtējiem audiem, klejotājnerva un uz atklātā kopējās miega artērijas posma uzlikta plūsmas zonde (elektromagnētiskais asins plūsmas mērītājs MFV 1200, Nicon Kohden, Japāna) asins plūsmas reģistrēšanai. Pēc 15 min. ilga stabilizācijas perioda tika ierosināta tromboze, uzliekot uz artērijas, kontaktā ar asinsvadu aptverošajiem audiem, divus Whatman filtrpapīra gabaliņus (2x1 mm), kas samērcēti 15% FeCf šķīdumā. Miega artērijas trombozes laiks tika reģistrēts kā laiks, kurā asins plūsma apstājās pilnīgi un parādīts kā laiks līdz oklūzijai (LLO). Ja aktīvās ārstēšanas grupā 90 min. laikā asins plūsma neapstājās, LLO tika reģistrēts kā >90 min.

Trombozes eksperimenta laikā papildus tika mērīts žurkas astes asiņošanas ilgums. Aste tika pārgriezta ar skalpeli 5 mm no gala un aste tūlīt iemērkta 37 °C siltā izotoniskā sālsūdenī līdz tika konstatēta asiņošanas apstāšanās. Asiņošanas apstāšanās tika definēta kā laiks līdz pilnīgām asiņošanas beigām, kad asiņošana neatjaunojās nākamo 30 s laikā.

Pēc trombozes eksperimenta narkotizētie dzīvnieki, kuri saņēma pētāmās vielas 3 dienas, tika izmantoti trombocītu salipšanas testam ex vivo. Tika atvērts vēdera dobums un asinis no vēna cava inferior savāktas plastmasas stobriņos ar hirudīna pārklājumu (Dynabyte Medical, Vācija).

Asins paraugi tika izmantoti mērījumiem laikā no 30 min. līdz 4 stundas pēc savākšanas. Mērījumi tika veikti saskaņā ar modificētu Dynabyte Medical protokolu (skat. augstāk - Trombocītu salipšana).

Statistika. Rezultāti tika analizēti ar Microsoft Excel 2007 programmatūru. Dati tiek parādīti kā vidējais ± vidējā standarta kļūda (Mean±SEM). Atšķirības starp eksperimenta grupām tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena ANOVA ar atkārtotu salīdzināšanu (Tukeja tests). Par nozīmīgu tika uzskatīts P<0,05.

Rezultāti. Vidējais laiks līdz FeCf ierosinātajai asinsvada trombozei un tas izraisītas artērijas plūsmas apstāšanās brīdim kontroles grupā bija 24,4 min. (23. tabula).

23. tabula

Pētāmo vielu ietekme uz FeCl₃ ierosināto miega artērijas trombozi. Mean ± SEM;N= 7-8.

Grupa	Laiks līdz oklūzijai (LLO)	Astes asiņošanas ilgums
min.	%	min	%
Kontrole	24,4+1,45	100	8,9+1,28	100
NS (25 mg/kg)	30,3+3,12	124	11,5+1,39	129
MD (25 mg/kg)	29,8+2,29	122	10,5+1,01	118
MD+NS (25+25 mg/kg)	34,0+2,78'	139	11,4+1,42	128 ,
MDAS (10 mg/kg)	41,7±3,95²*	171	12,1+2,20	136
MDAS+NS (10+25 mg/kg)	53,l±4,12^2iabc#	218	13,5+4,19	152
ASS (5 mg/kg)	35,2+3,02'	144	13,8+3,27	155
ASS+NS (5 + 25 mg/kg)	42,5±4,24^2S#	174	15,2+2,12'	171

’P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli #P<0,05 pret MD ^sP<0,05 pretNS ³P<0,05 pret ASS ^bP<0,05 pret ASS+NS ^cP<0,05 pret MD+NS

Profilaktiska MDAS ievadīšana deva nozīmīgi ilgāku LLO pagarinājumu (P<0,005 pret Kontroli), bet, atšķirībā no ASS, ar mazāku ietekmi uz astes asiņošanas testu (136 pret 155%). MDAS+NS (10+25 mg/kg) izraisīja salīdzinoši ilgāku trombozes aizkavēšanu, pārsniedzot MD+NS vai ASS+NS izraisīto aizkavēšanu (23. tabula). Jāatzīmē, ka, lietojot ASS un ASS+NS, LLO pieaugums iet paralēli ar astes asiņošanas laika pieaugumu, kamēr MDAS vai MDAS+NS gadījumā LLO pieaugums ir ievērojami lielāks nekā astes asiņošanas laika pieaugums (23. tabula).

Paralēlos eksperimentos ar kopēju kontroli tika pētīta ASS, MDAS un CL un to kombināciju ietekme uz trombozi. Pētāmās vielas tika ievadītas ar vienu devu (2 stundas pirms testēšanas) vai ievadītas vienreiz dienā 3 dienas. ASS vai CL, ievadot 2 stundas pirms trombozes testa, nozīmīgi pagarināja LLO, salīdzinot ar kontroles grupu, kas saņēma ūdeni (24. tabula).

24. tabula

Vienas petamas vielas devas ietekme uz LLO un astes asiņošanas ilgumu FeCĻ inducētā miega artērijas trombozes eksperimentā. Mean ± SEM; N= 7-8.

Grupa	Laiks līdz oklūzijai (LLO)	Astes asiņošanas ilgums
min.	%	min	%
Kontrole	24,4+1,45	100	8,9+1,28	100
MDAS (10 mg/kg)	41,7±3,95^2b	171	12,1+2,20	136
ASS (5 mg/kg)	35,2+3,02'	144	13,8+3,27	155
CL(5 mg/kg)	31,7+2,40’	130	11,9+3,62	134
MDAS+CL (10+5 mg/kg)	61,5+4,3 l^3Sabc	252	15,7+3,16	176
ASS+CL (5+5 mg/kg)	45,4±4,80^2ab	186	16,3 ±2,25'	183

P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli ³P<0,0005 pret Kontroli ^sP<0,05 pret MDAS ^aP<0,05 pret ASS ^bP<0,05 pret CL ^cP<0,05 pret ASS+CL

Viena MDAS deva nodrošināja nozīmīgāku LLO pagarinājumu nekā CL. MDAS kopā ar CL nozīmīgi palielināja LLO, bet tikai nedaudz mainīja astes asiņošanas ilgumu (24. tabula). Jāatzīmē, ka kombinācija MDAS+CL izraisīja nozīmīgu LLO pieaugumu salīdzinājumā ar atsevišķām vielām un kombināciju ASS+CL.

Atkārtota pētāmo vielu ievadīšana izraisīja tālāku LLO un astes asiņošanas ilguma pagarināšanos (25. tabula).

25. tabula

Atkārtotās pētāmas vielas ievadīšanas ietekme uz LLO un astes asiņošanas ilgumu FeCl-ļ inducētā miega artērijas trombozes eksperimentā. Mean ± SEM; Ν= 7-8.

Grupa	Laiks līdz oklūzijai (LLO)	Astes asiņošanas ilgums
min.	%	min.	%
Kontrole	25,3+1,75	100	8,6+1,37	100
MDAS (10 mg/kg)	48,4+4,35²	191	13,1+2,63	152
ASS (5 mg/kg)	40,9+3,25'	162	17,8+3,17’	207
CL (5 mg/kg)	49,1+7,75’	194	18,3+3,78’	213
MDAS+CL (10+5 mg/kg)	64,6+8,01“	255	20,7+3,88’	241
ASS+CL (5+5 mg/kg)	61,0+10,32²³	241	27,4+4,98²¹³	319

’P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli *P<0,05 pret MDAS ^aP<0,05 pret ASS

Atkārtota MDAS vai CL ievadīšana izraisīja nozīmīgi lielāku ietekmi uz LLO nekā ASS (attiecīgi, 191 un 194 pret 162%), bet MDAS, pretstatā CL vai ASS nepagarināja astes asiņošanas ilgumu (25. tabula). Atkārtota MDAS+CL vai ASS+CL ievadīšana izraisīja ievērojamu un samērā līdzīgu LLO pieaugumu, bet MDAS+CL salīdzinoši mazāk nekā ASS+CL (241% pret 319%) ietekmēja astes asiņošanas ilgumu (25. tabula).

Eksperimenti ex vivo

Pēc trombozes eksperimenta tika savāktas dzīvnieka asinis un noteikti agregācijas parametri. Tris dienu ilga MDAS ievadīšana 10 mg/kg devā izraisīja nozīmīgu trombocītu salipšanas samazināšanos visu pārbaudīto salipšanas ierosinātāju gadījumā (26. tabula).

26. tabula

MDAS, ASS, CL un to kombināciju ietekme uz trombocītu salipšanu ex vivo', N=5-7; Mean ± SEM.

Grupa	ADF
AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	794+33,5	149,7+9,4
MDAS (10 mg/kg/d)	528+46,5’	75,5+12,8²
ASS (5mg/kg/d)	768+53,2	150,3+13,5
CL (5mg/kg/d)	423+39,4“	68,2+15,1“
MDAS+CL (10+5 mg/kg/d)	140+16,8 ³®^&ab	35,3+9,4
ASS+CL (5+5 mg/kg/d)	230+29,8“	53,3+11,5“

26. tabula (turp.)

Grupa	AS
AUC .(AU*inin)	Amax(AU) ,
Kontrole	935+62,3	167,8+11,6
MDAS (10 mg/kg/d)	232+44, l“	48,2+9,7“
ASS (5mg/kg/d)	550+31,3²	86,1+6,8²
CL (5mg/kg/d)	905+53,5^&	160,7+13,5^
MDAS+CL (10+5 mg/kg/d)	187+29,4“*	30,7±9,8^3&
ASS+CL (5+5 mg/kg/d)	239+32,7“	39,8+14,1“

26. tabula (turp.)

Grupa	ADF+PGE,
AUC (AU*min)	Amax (AU)
Kontrole	855+40,5	159,5+12,2
MDAS (10 mg/kg/d)	195+35,3³	41,4+14,8²
ASS (5 mg/kg/d)	-	-
CL (5 mg/kg/d)	259+49,3²	49,7+9,9³
MDAS+CL (10+5 mg/kg/d,	87+15,8³®^	15,5±4,8³®^
ASS+CL (5+5 mg/kg/d)	128+19.4²®	24,5±4,8³®^b

‘P<0,05 pret Kontroli ²P<0,005 pret Kontroli ³P<0,0005 pret Kontroli ®P<0,05 pret MDAS ^&P<0,05 pret ASS P<0,05 pret CL ^bP<0,05 pret ASS+CL

CL ievadīšana devā 5 mg/kg/d 3 dienas izraisīja ievērojamu aizsardzību pret salipšanu, ko ierosina ar ADF un ADF+PGEj, bet neaizsargāja no AS ierosinātas salipšanas. ASS izraisīja nozīmīgu aizsardzību pret AS ierosinātu salipšanu, bet nebija efektīva pret ADF (26. tabula). MASA un CL kombinācija (10+5 mg/kg/d x3) nodrošināja salīdzinoši labako aizsardzību pret dažadu vielu ierosināto salipšanu, kas bija nozīmīgi labāka nekā ASS+CL efekts ADF un ADF+PGE testos (26. tabula).

KOPSAVILKUMS

MDAS ievērojami labāk nekā MD vai ASS līdzīgās molārās koncentrācijas aizsargā pret AS ierosinātu trombocītu salipšanu. MDAS+NS nozīmīgi pārspēj MD, NS un ASS, kā ari kombinācijas ASS+NS aizsardzību pret visiem salipšanas ierosinātājiem, kā ari MD+NS aizsardzību pret AS ierosinātu salipšanu.

Ņemot vērā MDAS un MDAS+NS pozitīvo ietekmi uz trombocītu salipšanu un LLO pagarinājumu in vivo, MDAS vai MDAS+NS kombinācija var atrast pielietojumu trombocītu salipšanas un trombozes riska samazināšanai pacientiem ar izteiktu aterosklerozi, iespējamu miokarda infarktu un insultu, kā ari periferās asinsrites traucējumiem. Fakts, ka MDAS un MDAS+NS kombinācija nepagarina astes asiņošanas ilgumu, norāda uz iespējamu šīs kombinācijas pielietojumu pacientiem ar palielinātu asiņošanas risku pirms- un pēcoperācijas periodā.

MDAS+DI ievērojami labāk nekā ASS+DI aizsargā pret ADF un AS ierosinātu trombocītu salipšanu.

Trombozes eksperimentā viena MDAS+CL deva nodrošina labāku aizsardzību pret FeCķ ierosinātu trombozi nekā ASS+CL. MDAS+CL salīdzinoši mazāk nekā ASS+CL pagarina astes asiņošanas ilgumu. Eksperimentā ex vivo MDAS+CL nodrošina ievērojami labāku aizsardzību pret trombocītu salipšanu nekā CL, ASS vai MDAS. MDAS+CL labāk nekā ASS+CL aizsargā pret ADF un ADF+PGEj ierosinātu trombocītu salipšanu.

Šie fakti norāda, ka MDAS+CL var atrast pielietojumu klīnikā tūlītējai aizsardzībai pret paaugstinātu trombocītu salipšanas risku, draudošu vai sākušos trombozi.

8. piemērs. Salīdzinošs MDAS/NS, MD/NS un LA/NS kombinēta pielietojuma pētījums NS izraisīta sasarkuma samazināšanai

Nikotīnskābe (niacin, NS) efektīvi pazemina holesterīna, ZBL un trigliceridu līmeni asins serumā, paaugstinot ABL līmeni. Tomēr pacientiem, kas saņem tūlītējas vai palēninātas atbrīvošanas nikotīnskābes formu, novēro ierobežojošu blakusparādību: ātru, ievērojamu ādas sasilšanu un asinsvadu paplašināšanos, kas tiek apzīmēta ar terminu “flush” (sasarkums), kura smagos gadījumos noved pie lietošanas pārtraukšanas (Gupta EK, Ito MK, Heart Dis 2002;4:124-137). Laropiprants (MK0524) (LA) tika piedāvāts kā viens no visaktīvākajiem un perspektīvākajiem līdzekļiem NS izraisītā sasarkuma mazināšanai (Cheng K et al, PNAS 2006; 103:66826687).’

Mūsu pētījuma mērķis bija eksperimentāla MDAS, MD un LA ietekmes salīdzināšana uz NS izraisīto sasarkumu (ādas temperatūras izmaiņām).

Metodes. Tika lietoti Wistar žurku tēviņi ar masu 280-330 g. Dzīvnieki tika turēti grupās pa 6 klimatizētās telpās pie 22+1 °C, relatīvā mitruma 60+5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas cikla ar brīvu pieeju ūdenim un barībai (Lactamin AB, Zviedrija). Ādas temperatūras izmaiņu mērījumiem intaktām žurkām tika izmantota bezkontakta temperatūras mērīšanas metode (Papaliodis D et al, Br J Pharmacol 2008; 153:13821387). Temperatūras mērījumi tika veikti ar manuālu infrasarkano termometru (Modei Proscan 510, TFA-Dostman). Dzīvnieki tika pieradināti pie ņemšanas rokās un infrasarkanās zondes 3 dienas pirms tās lietošanas. Temperatūras nolasījumi no abu ausu dorsālās puses tika iegūti bez anestēzijas eksperimenta sākumā un tā gaitā. Ausu temperatūra tika mērīta ik pēc 5 minūtēm līdz 60 min. ilgā periodā. Starp mērījumiem dzīvnieki tika ievietoti atpakaļ būros. NS, MD un MDAS tika šķīdināti fizioloģiskā šķīdumā un pH tika koriģēts tieši pirms ievadīšanas. LA (MK 0524, Cayman Chemicals) vispirms tika šķīdināts DMSO un tad katru dienu pirms eksperimenta atšķaidīts ar 0,9% NaCl. NS un LA attiecība kombinācijā pamatota ar zāļu aprakstu Tredaptive™ (nikotīnskābe/laropiprants) 1000 mg/20 mg regulētas atbrīvošanas tabletēm.

Statistika. Katram laika brīdim reģistrēts vidējais no sešiem temperatūras mērījumiem (katrai ausij). Dati tika analizēti ar Microsoft Excel programmatūru un rezultāti izteikti kā vidējais +/- vidējā standarta kļūda (Mean±SEM). Dažādu grupu vidējie rezultāti tika salīdzināti, izmantojot vienfaktora analīzi pēc ANOVA un t-Stjūdenta tests. Par nozīmīgu tika uzskatīts P<0,05.

8.1. Laika un šķīdinātājā ietekmes uz adas temperatūru novērtējums

GRUPA	PROCEDŪRA	Dzīvnieku skaits
SolvLA	LA šķīdinātājs	6
SolvNS	NS, MDAS un MD šķīdinātājs	6
NS	NS 15 mg/kg s.c.	6

8.2. Atsevišķu pētāmo vielu ietekme uz ādas temperatūru pie vienlaicīgas Γ01 vai 30 min, apsteidzošas [301 s.c. ievadīšanas

Tika pārbaudīta LA, MD vai MDAS atsevišķas ievadīšanas ietekme uz ādas temperatūru. Katru pētāmo vielu ievadīja s.c. vienlaikus ar NS kā LA+NS [0] vai 30 min. pirms NS kā LA+NS [30],

GRUPA	PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits
Kontrole/Šķīdinātāj s		6
NS	NS 15 mg/kg	6
LA	LA 0,3 mg/kg	6
LA+NS	LA 0,3 mg/kg+NS 15 mg/kg	6
MD	MD 45 mg/kg	6
MD+NS	MD 45 mg/kg+NS 15 mg/kg	6
MDAS	MDAS 45 mg/kg	6
MDAS+NS	MDAS 45mg/kg+NS 15 mg/kg	6

8.3. MDAS/NS un MD/NS kombināciju ietekme uz ādas temperatūru pie vienlaicīgas [01 vai 45 min, apsteidzošas [45 ļ ievadīšanas p. o.

GRUPA PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits

Kontrole/Šķīdinātājs 6

NS	NS 40 mg/kg	8
MD	MD 100 mg/kg	6
MD+NS	MD 100 mg/kg+NS 40 mg/kg	6
MDAS 150	MDAS 150 mg/kg	6
MDAS75+NS	MDAS 75 mg/kg+NS 40 mg/kg	6
MDAS150+NS	MDAS 150 mg/kg+NS 40 mg/kg	6

REZULTĀTI.

R 8.1. Laika un šķīdinātāja ietekmes uz ādas temperatūru testēšana

Vidējā auss temperatūra bāzlīnijā bija 28,4-30,6 °C, reģistrēta laikā no 10:00 līdz 14:00. Pētījums par reakciju uz NS laikā (15 mg/kg s.c.) parādīja, ka maksimālais temperatūras pieaugums 2,32±0,37 °C pret bāzlīniju un 2,57±0,43 °C pret šķīdinātāja grupu (P<0,005) novērojams pēc 10 minūtēm (Attēls). Tika konstatēts, ka LA šķīdinātāja ietekme uz auss temperatūru būtiski atšķiras no NS, MDAS un MD šķīdinātāja ietekmes tikai pirmajās 5 minūtēs pēc injekcijas, tāpēc temperatūras aprēķinos pēc 10 minūtēm tika izmantota tikai viena kontroles grupa.

R 8.2. Atsevišķu pētāmo vielu ietekme uz ādas temperatūru pie vienlaicīgas [0] vai 30 min, apsteidzošas [301 s.c. ievadīšanas

MDAS, MD vai LA subkutāna injekcija neizsauca nozīmīgas izmaiņas žurku auss ādas temperatūrā (27. tabula). Nebija temperatūras atšķirības starp MD+NS [0], kad MD ievadīja kopā ar NS, un MD+NS [30], kad MD ievadīja par 30 min. apsteidzot NS.

27. tabula

MDAS, LA un MD ietekme uz NS izraisītam izmaiņām adas temperatūrā; N=6, Mean+SEM

Grupa	Sākotnējā temperatūra °C	Maksimāla temperatūra °C	Pieaugums, %
Kontrole/Šķīdināt ājs	29,5+0,29	29,62+0,25$“	-
NS	29,61+0,40	32,2+0,42***	100
MDAS	29,3+0,35	29,2+0,38¹¹¹	-
MDAS+NS Γ01	29,9+0,31	31,5 ±0,40**	62
MDAS+NS Γ301	29,6+0,32	30,9 ±0,32*$	50
LA	29,43+0,27	29,5+0,35$$$	-
LA+NSfO]	29,72+0,31	31,45+0,40**	67
LA+NS Γ301	29,51+0,32	30,73+0,34*$	47
MD45	29,42+0,38	29,6+0,31$$$	-
MD+NS roi	2953+0,29	31,33+0,48*	69
MD+NS 1301	29,68+0,26	31,40+0,39*	65

*P<0,05 pret Kontroli **P<0,005 pret Kontroli ***p<0,0005 pret Kontroli *P<0,05 pretNS *P<0,0005 pretNS

Vienlaicīga NS un MDAS (NS+MDAS [0] grupa; apsteidzošais laiks = 0) izraisīja NA sasarkuma samazinājumu, kas bija līdzīgs vienlaikus ievadītai NS un LA vai NS un MD, NS izraisītā temperatūras paaugstināšanās tika samazināta, attiecīgi, no 100% (NS efekts) līdz 62%, 67 un 69 % (27. tabula). Mūsu eksperimentā ar MDAS+NS un LA+NS, MDAS vai LA ievadīšana s.c. 30 min. pirms NS izraisīja nozīmīgu un līdzīgu aizsardzību pret NS izsaukto ādas temperatūras paaugstināšanos (27. tabula).

R 8.3. NS/MDAS un NS/MD kombinācijas ietekme uz ādas temperatūru, ievadot perorāli

Perorāla (p.o.) NS ievadīšana devā 40 mg/kg izraisīja būtisku un ilgstošu (līdz 60 min.) žurku auss ādas temperatūras paaugstināšanos ar maksimumu starp 15 un 45 minūtēm (28. tabula).

28. tabula

MDAS vai MD ietekme uz NS izraisītu ādas hipertermiju ar vienlaicīgu [0] vai apsteidzošu ievadīšanu [45]; N=6-8, Mean+SEM

Grupa	Sākotnēja temperatūra °C	Temperatūra, 15 min.	Temperatūra, 30 min.	Temperatūra, 45 min.	Maks. pieaugums, %
Kontrole/Šķīdinātājs	29,9+0,32	30,2+0,48**	30,0+0,33***	30,1+0,37**	9
NS	30,0+0,41	32,3+0,46**	33,1+0,41***	32,4+0,48**	100
MDAS 150	29,7+0,28	29,9+0,33**	29,5+0,35“	29,6+0,39**	6
MDAS75+NS [0]	29,7+0,33	31,9+0,51*	32,3+0,37***	32,1+0,46*	84
MDAS150+NS [0]	29,8+0,37	30,9+0,47*	32,0+0,42**	31,95+0,38*	70
MD	29,9+0,35	30,1+0,39**	29,8+0,38***	30,0+0,34**	6
MD+NS [0]	29,6 ±0,26	31,3 ±0,35**	32,5 ±0,42**	32,2 ±0,40*	96
MD100+NS [45]	29,3 ±0,35	31,2+0,33**	32,3+0,41**	32,1+0,44*	95
MDAS75+NS [451	29,4+0,30	31,3+0,53*	31,9+0,45*	31,5+0,42**	80
MDAS150+NS [45]	29,7+0,38	30,7+0,41*	31,2+0,44**	30,2+0,38****®	48

*P<0,05 pret Kontroli **P<0.005 pret Kontroli ***P<0,0005 pret Kontroli *P<0,05 pretNS **P<0,005 pretNS ***P<0,0005 pretNS ^&P<0,05 pret MDAS150+NS [0] ®P<0,05 pret MDAS 75+NS [45] *P<0,05 pret MD+NS [45]

MDAS vai MD perorāla ievadīšana neizraisīja būtiskas izmaiņas ādas temperatūrā. Vienlaicīga p.o. MDAS un NS [0] ievadīšana devā 75 mg/kg izraisīja nelielu, bet devā 150 mg/kg - būtisku aizsardzību no NS izraisīta ādas temperatūras pieauguma (22. tabula). MD (100 mg/kg), ievadot vienlaikus ar NS, pasargāja no temperatūras paaugstināšanās 15 minūtes, bet nenodrošināja nozīmīgu aizsardzību no maksimālā NS izraisītā ādas temperatūras pieauguma (skat. temperatūru pēc 30 min., 45 min., 28. tabula). Rezultātu analīze liecina, ka MDAS devā 150 mg/kg, ievadot vienlaikus ar NS, samazina ādas temperatūras pieaugumu līdz 70%, kas ir būtiski labāk nekā samazinājums no NS+MD (96%). Pieaugums, ko izraisa NS tiek uzskatīts par 100%. Ievadot vielas profilaktiski - 45 min. pirms NS, MDAS150+NS (45] temperatūru pazeminošā ietekme palielinājās un bija nozīmīgi labāka nekā MD+NS [45] vai MDAS75+NS [45] gadījumā (28. tabula).

MDAS, ievadot p.o. vai s.c., samazina NS izraisīto ādas temperatūras paaugstināšanos. Ievadot s.c., MDAS, līdzīgi laropiprantam, samazināja NS izraisīto ādas temperatūras paaugstināšanos, lietojot kā vienlaikus, tā arī profilaktiski. Ievērojamā MDAS aktivitāte pret sasarkumu, kad to ievada p.o. kopā ar NS vai profilaktiski, norāda uz potenciālu MDAS noderīgumu nevēlamo NS blakusparādību uz ādas (sasarkuma) mazināšanai.

KOPSAVILKUMS

Tā kā MDAS piemīt pretiekaisuma, antihiperlipidēmiska un trombocītu pretsalipšanas aktivitāte, to var uzskatīt par jaunu terapeitisku līdzekli dažādu patoloģiju ārstēšanai, kuras izraisa trombocītu salipšana. MDAS kombinācija ar NS, statiņiem, CL vai DI var ievērojami paplašināt potenciālās indikācijas.

IZGUDROJUMA REALIZĀCIJAS PAŅĒMIENI

Aprakstītais izgudrojums piedāvā medicīnisku produktu, kas ietver MDAS, kā pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža, pretreimatisma, antihiperlipidēmisku, antiaterosklerotisku, pretsalipšanas un prettrombu līdzekli. Izgudrojumā aprakstīto medicīnisko produktu var ievadīt farmaceitiskas kompozīcijas veidā. No šī viedokļa izgudrojumā tiek piedāvāta farmaceitiska kompozīcija, kas ietver MDAS maisījumā ar farmaceitiski pieņemamu atšķaidītāju vai nesēju.

Tā kā medicīniskā produkta izmantošana par pretiekaisuma, pretsāpju, pretdrudža, pretreimatisma, antihiperlipidēmisku, antiaterosklerotisku, pretsalipšanas un prettrombu līdzekli paredz medicīniskā produkta ilgstošu lietošanu, vislabākais izgudrojuma realizēšanas veids ir ar formu, kas piemērota iekšķīgai lietošanai, piemēram, tabletes vai kapsulas.

Saskaņā ar vēl vienu šī izgudrojuma aspektu tiek piedāvāta šeit aprakstītā medicīniskā produkta pielietojums medikamenta ražošanā, kas paredzēts iekaisuma, sāpju, drudža, reimatisma, hiperlipidēmisku stāvokļu, aterosklerotisku stāvokļu ārstēšanai, trombocītu salipšanas un trombu veidošanās novēršanai.

Vēl viens šī izgudrojuma aspekts attiecas uz kombinētiem medicīniskiem produktiem, kas ietver MDAS un citu līdzekli, kas izvēlēts no rindas: NS, statiņi, CL un DI. Šie produkti var balstīties uz farmaceitiskajām kompozīcijām, kas izveidotas uz MDAS bāzes.

Claims

Pretenzijas

1. 3-(Trimetilammonioamino)propanoāta (meldonija) acetilsalicilskabes aditīvais sāls, tā solvāti vai polimorfi izmantošanai par medikamentu.
2. Farmaceitiska kompozīcija, kas satur 3-(trimetilammonioamino)propanoāta (meldonija) acetilsalicilskābes aditīvo sāli saskaņā ar 1. pretenziju un farmaceitiski pieņemamu nesēju.
3. Farmaceitiskā kompozīcija saskaņā ar 2. pretenziju kā ātrās atbrīvošanas, palēninātas atbrīvošanas un ilgstošas atbrīvošanas zāļu forma.
4. Farmaceitiskā kompozīcija saskaņā ar 2. pretenziju, kas piemērota ievadīšanai orāli.
5. Meldonija acetilsalicilskābes aditīvais sāls saskaņā ar 1. pretenziju, kas ir paredzēts iekaisuma, sāpju, drudža, reimatisko stāvokļu, hiperlipidēmiska un aterosklerotiska stāvokļa, trombocītu salipšanas izraisītas patoloģijas vai trombu veidošanas profilaksei un/vai ārstēšanai, kur trombocītu salipšanas izraisītā patoloģija ietver išēmiskus notikumus, piemēram, miokarda infarktu vai trieku, vai trombozi un tromboemboliju.
6. Farmaceitiskā kompozīcija saskaņā ar 2. pretenziju, kas ir paredzēta iekaisuma, sāpju, drudža, reimatisko stāvokļu, hiperlipidēmiska un aterosklerotiska stāvokļa, trombocītu salipšanas izraisītas patoloģijas vai trombu veidošanas profilaksei un/vai ārstēšanai, kur trombocītu salipšanas izraisītā patoloģija ietver išēmiskus notikumus, piemēram, miokarda infarktu vai trieku, vai trombozi un tromboemboliju.
7. Kombinēts medicīniskais produkts, kas satur iedarbīgu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes aditīvā sāls saskaņā ar 1. pretenziju un iedarbīgu daudzumu dipiridamola, kas irparedzēts trombocītu salipšanas izraisītas patoloģijas, sevišķi triekas, profilaksei un/vai ārstēšanai.
8. Kombinēts medicīniskais produkts, kas satur iedarbīgu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes aditīvā sāls saskaņā ar 1. pretenziju un iedarbīgu daudzumu klopidogrela vai tā farmaceitiski pieņemama sāls, kas ir paredzēts trombocītu salipšanas izraisītas patoloģijas profilaksei un/vai ārstēšanai, kur trombocītu salipšanas izraisītā patoloģija ietver išēmiskus notikumus, piemēram, miokarda infarktu vai trieku, vai trombozi un tromboemboliju, akūtu koronāro sindromu, pēkšņu sirds nāvi un komplikācijas pēc koronārās angioplastijas vai koronārās šuntēšanas.
9. Kombinēts medicīniskais produkts, kas satur iedarbīgu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes aditīvā sāls saskaņā ar 1. pretenziju un iedarbīgu daudzumu nikotīnskābes vai tās farmaceitiski pieņemamas sāls, kās ir paredzēts trombocītu salipšanas izraisītas patoloģijas profilaksei un/var ārstēšanai, kur trombocītu salipšanas izraisītā patoloģija ietver išēmiskus notikumus, piemēram, miokarda infarktu vai trieku, vai trombozi un tromboemboliju.
10. Produkts saskaņā ar 9. pretenziju, kurā meldonija acetilsalicilskābes aditīvais sāls ir ātrās atbrīvošanas, palēninātas atbrīvošanas un ilgstošas atbrīvošanas zāļu formā.
11. Produkts saskaņā ar 9. pretenziju, kurā nikotīnskābe vai tās farmaceitiski pieņemamais sāls ir ātrās atbrīvošanas, palēninātas atbrīvošanas un ilgstošas atbrīvošanas zāļu formā.
12. Kombinētais medicīniskais produkts saskaņā ar 9. pretenziju, kas ir paredzēts dislipidēmijas, hiperlipidēmijas un aterosklerozes, profilaksei un/vai ārstēšanai.
13. Kombinēts medicīnisks produkts, kas satur iedarbīgu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes aditīvā sāls saskaņā ar 1. pretenziju un statīnu, kas atlasīts no grupas, kura sastāv no atorvastatīna, cerivastatīna, fluvastatīna, lovastatīna, mevastatīna, pitavastatīna, pravastatīna, rosuvastatīna un simvastatīna, kas ir paredzēts dislipidēmijas, hiperlipidēmijas un aterosklerozes, profilaksei un/vai ārstēšanai.