CN102803199B - 乙酰水杨酸盐 - Google Patents

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Abstract

新颖的乙酰水杨酸的甜菜碱盐，亦即4-三甲铵基丁酸乙酰水杨酸加成盐(γ-丁酰甜菜碱乙酰水杨酸盐)、L-肉碱乙酰水杨酸加成盐以及3-(三甲基肼)丙酸盐(米曲肼)乙酰水杨酸加成盐。米曲肼乙酰水杨酸盐作为用于治疗由血小板聚集诱发的各种病理的抗血小板药、抗发炎和抗高血脂药的用途。

Description

乙酰水杨酸盐
发明领域
本发明总体涉及乙酰水杨酸盐，特别涉及新颖且有用的水溶性乙酰水杨酸盐以及其制备的方法。乙酰水杨酸是一种最为广泛使用的药物，主要知名于其止痛特性。其应用的范围因为其低水溶性(约0.3％)而大幅降低。除了锂盐、钠盐、镁盐和钙盐外，尚有许多具有碱性氨基酸的盐已被揭露(美国专利US 4,265,888)。这些盐中的每一个都具有某些优点和缺点，因此，有可得的潜在具更多优点特性的新颖的乙酰水杨酸盐是有利的。
因为在新颖的乙酰水杨酸盐中结合的甜菜碱类化合物本身具有各种的药理学活性，该新颖的乙酰水杨酸可具有乙酰水杨酸或甜菜碱特性外更多有益的特性，包括新的药理学活性。
发明目的
本发明的目的是发现具有某些甜菜碱类型化合物的新颖类型的乙酰水杨酸。无法预期且出人意外的发现，具有自身是吸湿性物质的某些甜菜碱的乙酰水杨酸产生稳定的水溶性结晶盐。
因此，本发明的目的是提供乙酰水杨酸盐，其具有高水溶性且具有优异的稳定性和保存期。
本发明的进一步目的是提供制备所述盐的方法。
本发明的另一个目的是提供用作为药品的米曲肼乙酰水杨酸盐(3-(三甲基肼)丙酸盐乙酰水杨酸加成盐)。
本发明的目的是提供药品，亦即(3-(三甲基肼)丙酸乙酰水杨酸加成盐)(米曲肼乙酰水杨酸盐)，其具有抗发炎、止痛、退热、抗风湿、抗高脂血、抗动脉粥样硬化、抗聚集和抗血栓特性。本发明的另一个目的是治疗需要抗发炎、止痛、退热、抗风湿、抗高脂血、抗动脉粥样硬化、抗聚集和抗血栓疗法的对象方法。本发明的另一目的是提供药物组合物，其包括用于上述目的的MASA。本发明的进一步目的将在下文中更为明显，且其他的目的将对于本领域技术人员将显而易见的。
具体实施方式
以下是本发明的各种盐和方法的实例以及它们性质。
实施例1.4-三甲铵基丁酸乙酰水杨酸加成盐
溶解γ-丁酰甜菜碱二水合物(1.81g,10mmol)以及乙酰水杨酸(1.80g,10mmol)于乙醇(20ml)中。在真空中在约40℃浓缩该溶液，直至会在冷却时形成结晶的於浆稠性。以丙酮(50毫升)研磨该结晶块，过滤，用丙酮洗涤，和在真空中室温干燥。具有熔点120-122℃的无色晶体的产量是3.04g(93.5％)。该物质是水溶性的，在环境条件下是稳定的。
1H NMR光谱(D2O,TMS):1.93-2.12(2H,m,CH2 CH 2CH2)；2.33(3H,s,COCH3)；2.40(2H,t,J＝7.0Hz,CH2COO–)；3.09(9H,s,Me3N)；3.24-3.37(2H,m,CH2N)；7.16(1H,dd,J＝1.1 and 8.1Hz,H-3)；7.38(1H,ddd,J＝1.1,7.6 and 7.6Hz,H-5)；7.56(1H,ddd,J＝1.8,7.6 and 8.1Hz,H-4)；7.79ppm(1H,dd,J＝1.8 and 7.6Hz,H-6)。
C16H23NO6.经计算，％:C 59.07；H 7.13；N 4.30。
经发现，％:C 59.17；H 7.20；N 4.23。
此新颖的盐特征在于，X射线粉末图谱(Cu Kα–放射线)具有在以下2Θ角的峰：5.10,13.58,13.83,15.02,15.17,17.89,19.33,19.87,21.85,22.05,23.32,23.56,23.92,24.75,25.55,25.80,27.05,27.91,30.25±0.2°。
新盐的结构通过X-射线单晶结构分析(以下)所确认。晶体是是单斜晶的，在试验温度T＝-85℃的晶胞参数是： β＝104.728(2)，晶胞体积空间群P21/a。
4-三甲铵基丁酸乙酰水杨酸加成盐晶体结构的片段：
实施例2.L-肉碱乙酰水杨酸加成盐
L-肉碱(1.61g,10mmol)和乙酰水杨酸(1.80g,10mmol)溶解于乙醇(20ml)中，并在真空中在约40℃浓缩该溶液，直至会在冷却时形成结晶的於浆稠性。用丙酮(50毫升)研磨该结晶块，过滤，用丙酮洗涤，和在真空中室温干燥。具有熔点90-94℃的无色晶体的产量是3.17g(93％)。该物质是水溶性的，在环境条件下是稳定的。
1H NMR光谱(D2O,TMS):2.32(3H,s,COCH3)；2.53(2H,d,J＝6.6Hz,CH2COO–)；3.18(9H,s,Me3N)；3.38-3.45(2H,m,CH2N)；4.59(1H,quint.,J＝6.1Hz,CHOH)；7.15(1H,dd,J＝1.1 and 8.1Hz,H-3)；7.37(1H,ddd,J＝1.1,7.6 and 7.6Hz,H-5)；7.56(1H,ddd,J＝1.8,7.8 and 7.8Hz,H-4)；7.79ppm(1H,dd,J＝1.8 and 7.8Hz,H-6)。
C16H23NO7.经计算，％:C 56.30；H 6.79；N 4.10。
经发现，％:C 55.67；H 6.85；N 4.12。
此新颖的盐特征在于，X射线粉末图谱(Cu Kα–放射线)具有在以下2Θ角的峰：5.09,12.62,13.48,13.84,15.04,17.82,19.15,19.77,21.84,22.56,23.33,23.92,24.40,25.17,25.43,26.14,27.24,29.50,30.36±0.2°。
新盐的结构通过X-射线单晶结构分析(以下)所确认。晶体是是单斜晶的，在试验温度T＝-85℃的晶胞参数是： β＝104.535(2)，晶胞体积空间群P21。
L-肉碱乙酰水杨酸加成盐晶体结构的片段：
实施例3.3-(三甲基肼)丙酸乙酰水杨酸加成盐(米曲肼乙酰水杨酸盐)
3-(三甲基肼)丙酸盐二水合物(INN–米曲肼)(3.64g,20mmol)和乙酰水杨酸(3.60g,20mmol)溶解于热丙醇-2(30ml)中，并在50-55℃加热20分钟。停止加热且溶液在室温搅拌3h。於浆在0℃搅拌另一个3h，滤出沉淀物，并用冷的丙醇-2(2x15ml)洗涤。期望的盐由丙醇-2重结晶。得到具有熔点104-106℃的无色晶体。收率4.12g(63％)。
1H NMR光谱(D2O,TMS):2.34(3H,s,COCH3)；2.51(2H,t,J＝6.4Hz,CH2COO–)；3.26(2H,t,J＝6.4Hz,CH2N)；3.33(9H,s,Me3N)；7.17(1H,dd,J＝1.1and 7.8Hz,H-3)；7.39(1H,ddd,J＝1.1,7.6 and 7.6Hz,H-5)；7.58(1H,ddd,J＝1.7,7.6 and 7.8Hz,H-4)；7.81ppm(1H,dd,J＝1.7 and 7.6Hz,H-6)。
C15H22N2O6.经计算，％:C 55.21；H 6.79；N 8.58。
经发现，％:C 55.25；H 6.79；N 8.53。
此新颖的盐特征在于，X射线粉末图谱(Cu Kα–放射线)具有在以下2Θ角的峰：5.19,13.22,13.82,14.20,14.95,15.36,15.93,18.11,18.97,19.74,21.02,22.15,23.15,23.65,24.31,25.28,26.18,26.58,27.73,28.36±0.2°。
新盐的结构通过X-射线单晶结构分析(以下)所确认。晶体是是单斜晶的，在试验温度T＝-85℃的晶胞参数是： β＝90.758(2)，晶胞体积空间群P21/n。
3-(三甲基肼)丙酸乙酰水杨酸加成盐晶体结构的片段：
3-(三甲基肼)丙酸盐乙酰水杨酸加成盐(米曲肼乙酰水杨酸)的药理学性质
所设想的是，本申请中公开的新颖物质可以以各种多晶型物和溶剂合物呈现，优选地为具有类似生物特性的水合物，且因此被包括在本申请中作为描述化合物的变体。
我们首先已建立了，米曲肼乙酰水杨酸盐延迟和显著降低由烟酸引起的皮肤血管扩张。进一步试验证明米曲肼乙酰水杨酸的出人意外的改良的药理学活性。
所使用的缩写
为了简便，在本说明书中进一步使用下列缩写：
AdA–佐剂性关节炎
ASA–乙酰水杨酸
C–胆固醇
CHD–冠状动脉心脏病
CIC–循环免疫复合物
CL-氯吡格雷
CRP–C-反应蛋白
DI-双嘧达莫
HDL–高密度脂蛋白-胆固醇
LA-拉罗匹仑(laropiprant)
LDL–低密度脂蛋白-胆固醇
MASA–米曲肼乙酰水杨酸盐(化学表示：3-(三甲肼)-丙酸盐乙酰水杨酸加成盐)
MD–米曲肼(INN)
NA–烟酸(nicotinic acid，niacin)
RA–类风湿性关节炎
TG–甘油三酯
TR–Triton WR1339
WBC–白细胞
物质.NA(Acros Chemicals)，MD(Grindex)，ASA(Acros Chemicals)，LA(MK 0524,Cayman Chemicals)，用于体内测试作为PlavixTM(Sanofi-Aventis)的CL，DI(Sigma-Aldrich)。
发明背景.乙酰水杨酸是一种最广泛使用的药物，最知名于其抗发炎、止痛、退热和抗风湿特性。其亦以小量日剂被用于心血管疾病高危患者作为抗血小板剂(EidelmanRS等人，Arch Intern Med.2003；163:2006–2010)。在冠状动脉心脏病期间，血小板在动脉粥样硬化和致命的血栓形成的发展中，扮演了关键性的角色。抗血小板剂已成为预防及管理多种与心血管、脑血管、和周边动脉系统相关的疾病的首选(Meadows TA等人，Circ Res 2007；100(9):1261-75)。虽然多年以来已知ASA用作抗血小板剂，现今在心脏病学，ASA因其抗发炎特性而更为人所知(Ridker PM等人，N Engl J Med 1997；336:973–979)。因此，作为C-反应蛋白(CRP)的这种发炎标记物的临床测量可部分反映动脉粥样硬化的指数(Buckley DI等人，Ann InternMed 2009；151:483-495)。现今的证据指向，降低CRP的浓度预防CHD事件(RidkerPM等人，Lancet 2009；373:1175-82)。Ross假设，动脉粥样硬化是发炎疾病(Ross R,N Engl J Med 1999；340:115-126)。ASA不仅可处理动脉粥样硬化的发炎方面，而且可直接有助于诱导低脂血症(Kourounakis AP等人，Experimental and MolecularPathology 2002,73:135-138)。
NA是一种有效的改变脂质剂，其预防动脉粥样硬化并减少心血管事件。NA具有多种的脂蛋白与抗动脉粥样血栓形成效果，其改善內皮功能，减少发炎，增加噬斑稳定性，并降低血栓形成(Rosenson RS,Atherosclerosis 2003；171:87-96)。
NA几乎完全预防由凝血酶和垂体激素诱发的血管內凝血，显示了其具有溶解血栓的效果(Baluda VP,Kardiologija 1974；14(11):105-7(Rus)。数名作者说明了NA的抗血栓的特性(Shestakov VA,Probl Gematol Pereliv Krovi,1977；22(8):29-35.Chekalina SI,Sov Med 1982(5):105-8)。烟酸减少了血液凝块的风险(Chesney CM等人，Am Heart J,2000；140:631-36)。
NA抑制了血小板聚集(Lakin KM,Farmakol Toksikol,1980；43(5):581-5)。NA在体外通过温和地抑制血小板聚集而影响血小板的活性，并刺激显著的前列腺素释放，及大部分完整的主要血小板受体表达。NA的效力是独特的，不同于其他已知的抗血小板剂，且暗示了就治疗组合的潜在的机会(Serebruany VL等人，Thrombosis and Haemostasis,2010(印刷中)。
NA是有效的改变脂质剂，其预防动脉粥样硬化并减少心血管事件。(Drexel H,European Heart Journal Supplements 2006；Vol 8,Suppl F:F23-F29.Savel’ev AA,Shershevskii MG,Klin Med(Rus)1996；74:48-52)。
NA可有3种制剂(立即释放、延长释放和长效作用)。立即释放型NA与不良潮红及血糖浓度升高有关。长效作用型NA与减少潮红有关，但亦有肝毒性影响的危险。延长释放型与较少的潮红及低肝毒性危险有关((McKenney J,Arch InternMed 2004；164(7):697-705)。
NA的临床使用已受限于皮肤的潮红。延长释放烟酸可有助于控制潮红事件((Guyton JR等人，J Clin Lipidol,2009；3:101-108)。已有人提出，ASA及其他NSAIDs可用于不同的药物组合物的潮红控制，确认在NA给药之前提前施加NSAIDs(WO9632942、WO9906052、WO2009142731)。
最近，有人提出前列腺素D25的特异性拮抗剂(Parhofer KG,Vascular Healthand Risk Management 2009；5:901-908)受体第1亚型，拉罗匹仑(laropiprant)，作为用于降低由NA诱发的潮红的药物(Lai E等人，Clin Pharm Ther 2007；81:849-857.Davidson MH,Am J Cardiol 2008；101[suppl]:14B-19B)。虽然添加拉罗匹仑将降低潮红的频率，但是其并不完全消除此副作用。拉罗匹仑并不改变烟酸对脂质的影响或其它的烟酸的副作用。因此烟酸与拉罗匹仑的组合可实现烟酸的高剂量使用，因此开发了此药物的全部潜能(Parhofer KG,Vascular Health and RiskManagement 2009；5:901-908,Olsson AG,Expert Opinion on Pharmacotherapy2010；11(10):1715-1726)。
MD是具有某些对心脏与血管有益影响的药物。某些期望的MD活性已在动脉粥样硬化的动物模型中发现(Veveris M,Smilsaraja B,Baltic J Lab Anim Sci2000；10,194-199.Veveris M等人，Baltic J Lab Anim Sci 2002；12:116-122.OkunevichIV,Ryzhenkov VE,Patol Fiziol Eksp Ter 2002；(2):24-7)，以及在临床上被观察到(Karpov RS等人，Ter Arkh 1991；63(4):90-3)。已被注意的是，MD抑制血小板聚集((TsirkinVI,Ros Kardiol Zh 2002；1:45-52)。在试验的动脉血栓形成后经口施用于兔与狗两周的MD的治疗使用，显示了溶解血栓的效果(Logunova L等人，ExperimClin Pharmacoter 1991；19:91-98(Rus)。MD在控制或预防血栓形成的预防效果方面并无已知的数据。
实施例4-测定的MASA急毒性
通过经口导入(p.o.introduction)在Wistar大鼠和ICR小鼠身上测定MASA的急毒性。
方法-使用体重20-22g的雄性IRC小鼠和体重200-230g的Wistar大鼠。为了测定急毒性，各给与6只动物每一个剂量，各下一剂量增加500mg/kg。在寇氏法(Karber)之后，通过由Akhila JS等人，Current Sci 2007；93:917-920的方法计算LD50，其中对测定置信区间进行修改(Turner R In Screening Methods inPharmacology,Acad.Press,New York,1965,61-63)。
LD50的计算如下：
LD50＝群组中所有成员的最小致死剂量-∑(a x b)/N
N–每一群组中的动物数量
a–剂量变异
b–平均死亡率(2邻近的群组的死亡数/2)
将MASA及时(ex tempore)溶解于0.2％琼脂-琼脂中，并通过导管经口导入胃中。导入的液体量对于小鼠不超过0.5毫升，对大鼠言不超过2毫升。观察动物直到导入第10天后。
结果-MASA对小鼠的急毒性的结果表示于表1和表2中。
表1MASA对小鼠的急毒性(经口导入)
LD50＝3000–(5000/6)＝2167
此试验的因子f，在P＝0.05为1.32，因此LD50的置信区间为1642-2860(mg/kg)。
在导入MASA后，在最初的数个小时内显现毒性效果，且一部分动物在最初2天内死亡。存活下来的动物的毒性症状逐渐消退，且在5-8天后这些动物与同年龄的对照组动物并无不同。因此发现经口导入MASA对于小鼠的LD50为2167(1642÷2860)毫克/公斤。
经口导入MASA对大鼠的急毒性的结果表示于表2和表3中。
表2MASA对大鼠的急毒性(经口导入)
LD50＝3000–(4500/6)＝2250
此试验的因子f，在P＝0.05为1.308，因此LD50的置信区间为1720÷2944(毫克/公斤)。
经口导入剂量1500毫克/公斤的MASA至大鼠导致饮食习惯和运动短暂的干扰，但所有动物都存活。在导入3天后，毒性症状开始消失。因此发现经口导入MASA对于大鼠的LD50为2250(1720÷2944)mg/kg。
总结-该急毒性研究指出，MASA是低毒性的物质(经口导入小鼠和大鼠的LD50>2000毫克/公斤)。就ASA的急毒性，取自Boehringer IngelheimPharmaceuticals,Inc.、Acros Chemicals和Sigma-Aldrich，经口导入对小鼠而言是250毫克/公斤，对大鼠而言是200毫克/公斤，而Bayer AG所给的LD50，经口导入对于大鼠而言>1100毫克/公斤，因此MASA比ASA毒性低。
表3MASA对小鼠和大鼠的急毒性；N＝6。
动物 LD50mg/kg p.o.(置信区间)
小鼠 2167(1642÷2860)
大鼠 2250(1720÷2944)
实施例5-MASA的止痛、退热和抗发炎活性的研究，与ASA和MD比较试验
MASA的止痛、抗发炎和退热效果的研究，使用广泛使用的评估NSAIDs的方法。试验使用杂种白色实验室小鼠和Wistar大鼠。在22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中将动物以7-8只一组置于适当的笼中，给与12/12小时-光照/黑夜循环，及可自由取用食物与水。
为了比较MASA与ASA和MD经口服途径的效果，形成下列群组：
即时(ex tempore)准备测试物质的水状溶液。在每一试验系列中，使用一对照组，其接受经口导入相同体积的水。
统计-通过Microsoft Excel 2007软件分析数据，结果以平均数±标准差表示。根据ANOVA使用单因子分析及重复比较(塔基检验)来比较不同群组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
5.1.止痛活性的研究
5.1.1.以小鼠扭体试验评估止痛活性
方法-通过化学刺激方法-扭体试验评估痛觉反应(Charaborty A等人，Indian J ofPharmacology 2004；36(3):148-150)。经腹腔注射(i.p.)，动物获得0.25毫升的0.75％水状醋酸溶液。在注射之后，动物被分开置于特别的箱并观察10分钟。记录腹部收缩的数目。以10分钟周期內减少的腹部收缩的数目显现止痛活性。在刺激剂30分钟之前导入测试物质。止痛作用的程度以下式算出的止痛指数表示：
A＝(Cc-Ct)/Cc·100％，其中
A–止痛指数
Cc–对照组中收缩的数目，
Ct–试验组中收缩的数目。
结果显示于表4中。
表4扭体试验的模型中测试物质的止痛效果；N＝8；平均数±标准差
群组 具阳性反应的动物/总数 收缩的数目 止痛指数
对照组 8/8 22.00±1.60 -
MD100 8/8 22.10±1.47 -0.4
ASA50 6/8 5.75±1.32***$$$ 7.1
MASA75 8/8 12.13±0.61**$$ 4.5
MASA150 7/8 10.63±1.10**$$ 5.2
MASA300 5/8 6.00±1.39***$$$ 7.3
**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组-$$P<0.005vs MD
$$$P<0.0005vs MD
MASA显示了剂量依赖性的阳性效果。在ASA50和MASA300(P<0.0005)组中观察到最佳结果，而MD是无作用的。MASA300组止痛指数是7.3(8只动物中仅有5只有疼痛反应)。
5.1.2.通过小鼠热板试验评估止痛活性
方法-热板试验在52只体重17–26g的小鼠上进行，如文献所述(Belyakov VA,Solov’ev IK.Narcotic analgesics,Nizhny Novgorod,2001(Rus)。使用热板试验来筛选来筛选中枢作用型止痛(Osterberg A等人，J Pharmacol Exper Ther1958；122:59)。在试验之前30或60分钟经口导入测试物质的水溶液。记录从开始直到舔脚爪的时间。止痛活性的标准为对热刺激反应的延迟。
结果显示于表5中。
表5小鼠在热板试验中的反应时间；N＝8-10；平均数±标准差
**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组-&P<0.05vs ASA(30分钟)
&&P<0.005vs ASA(30分钟)-&&&P<0.0005vs ASA(30分钟)
试验数据指出，在30和60分钟后MASA150和MASA300以及MD组显现了明显的止痛效果。ASA仅在60分钟后显著地增加疼痛阈值，此指出其效果较慢开始(表5)。
5.2.测试物质的退热活性的比较评估
5.2.1.通过注射致热源评估大鼠的预防性退热活性
方法-对48只体重为165-182克的Wistar大鼠进行试验，肌肉注射致热源(Gamalei State Research Institution,莫斯科市,俄罗斯)，剂量为100微克(Shwarz GY,Syubaev RD,Vedomosti NCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000；1:44-50(Rus)。在致热源注射前一小时经口给与测试物质。在注射致热源前(基线)及注射后3小时间以电子体温计TERMO测量直肠温度。注射致热源后2小时，高温反应的降低来评估退热活性，其关于反应峰值对公开的数据(10)有良好的相关性(表6)。环境温度被维持在20-21℃。
如数据所得，对照组动物的体温逐渐地增加，在2小时内到达最高值，并在下一小时继续高于正常范围。
表6对照组在致热源的影响下的直肠温度的改变；N＝8；平均数±标准差
#P<0.05vs基线-##P<0.005vs基线-###P<0.0005vs基线
测试物质并无实质上影响动物的正常体温，但实质上降低了致热源诱发的过高热(表7)。
表7测试物质对由肌肉注射致热源诱发的过高热的影响；N＝8；平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组
##P<0.005vs基线-$P<0.05vs MD
在过高热模型中，注射致热源诱发的体温增高在ASA50组和MASA300组中完全地被预防(表7)。在MD100组、MASA75组和MASA150组中退热效果较不明显。
5.2.2.通过注射致热源评估大鼠的预防性退热活性(治疗模式)
方法-对48只体重为182-205g的Wistar大鼠研究测试物质在治疗(治疗(curative))模式退热效果，以注射100微克剂量(Shwarz GY,Syubaev RD,VedomostiNCEG lekarstvennyh sredstv MZ RF 2000；1:44-50(Rus)致热源诱发高热。在致热源注射后2小时、记录到体温升高后立即经口给与测试物质。在肌肉注射致热源前(基线温度)、过高热峰(致热源对照)及用测试物质处理30分钟后(及注射致热源21/2小时后)以电子体温计TERMO测量直肠温度。实验室环境温度被维持在20-22℃。
结果显示于表8中。
表8测试物质对由肌肉注射导致热源诱发的过高热的影响(治疗模式)；N＝8；平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-#P<0.05vs基线-##P<0.005vs基线
％P<0.05vs致热源对照组-$P<0.05vs MD-$$P<0.005vs MD
对实验中使用的所有动物，致热源诱发明显和相似的体温升高(比较致热源对照vs.基线，表8)。用测试物质处理，除MD外，导致了体温降低，相对于基线和致热源对照。在MASA300组和ASA50组中观察到相对较多的低温，其中体温降低是明显的，与对照组和MD100组相比。值得注意的是，在MASA300组中，与ASA50相反，对致热源对照的体温降低也是明显的。这指出MASA的相当迅速退热效果，其可能在临床上有价值。
5.3.测试物质的抗发炎活性的比较评估
5.3.1.急性发炎的水肿模型的研究
方法-使用角叉藻聚糖试验(Winter C等人，Proc Soc Exptl Biol and Med1962；III(3):544-547.Wei Jia等人，Journal of Ethnopharmacology 2003(89):139-141；Sutharson Lingadurai等人，African Journal of traditional,complementary andalternative medicines,2007,4(4):411-416)在42只体重为226-274g的大鼠身上来进行试验。在盐水(0.1毫升)中的角叉藻聚糖(Sigma)溶液(1％)的单一注射导入大鼠后肢脚掌中。在注射角叉藻聚糖30分钟后，经口导入测试物质(经由导管送至胃)。由器官体积测量器在基线时和和注射角叉藻聚糖后4小时测量脚掌的体积。
根据下式计算预防的百分比(水肿的抑制)：
P(％)＝(1–Vo/Vc)х100，其中
P–预防的百分比(水肿的抑制)
Vo–基线和试验条件下之间脚掌体积的差异；
Vc–在对照组中的相似差异。
结果显示于表9中。
表9在角叉藻聚糖发炎模型中测试物质的抗渗出活性；N＝7，平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组-&P<0.05vs ASA100-$P<0.05vs MD
在急性发炎的水肿模型中，对照组中患肢体积增加大约1.6倍。在MASA150组中观察到对发炎过程最显著的效果，其中预防性指数为93％，相对于对照组。在MASA300组中，活性稍为较低–水肿被降了91％。在MD100组和ASA50组也观察到水肿的降低。
5.3.2.在预防性模型中测试物质对物质对角叉藻聚糖水肿的抗发炎活性研究
方法-通过已建立的方法(Okunevich IV,Ryzhenkov VE,Patol Fiziol Eksp Ter,2002(2):24-7(Rus)对42只体重为178-220g的大鼠来研究角叉藻聚糖水肿。在5天的期间內经口导入测试物质。在第6天，在导入测试物质至大鼠后，立即在后后脚掌给予0.1毫升1％角叉藻聚糖溶液注射。在基线时和注射角叉藻聚糖4小时后测量后脚掌体积。如以前所述来计算预防指数。测试物质的预防性导入6次造成水肿的减少，与未被处理的动物相比较(表10)。
表10测试物质对角叉藻聚糖水肿的预防性抗渗出活性；N＝7，平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-$P<0.05vs MD
此发炎的模型中，在MASA150组和MASA300组中，观察到明显的预防性活性(94％)，其高于MD100组(34％)和ASA50组(70％)(表10)。
为评估发炎过程的强度，在试验最后(注射角叉藻聚糖后5小时)，通过标准方法在分析器<<INTEGRA 400+>>上测定CRP浓度。
血中CRP测定的结果表示于表11中。
表11在大鼠角叉藻聚糖发炎模型，大鼠血中СRP浓度；N＝7，平均数±标准差
群组 СRP毫克/升 CRP增加％
对照组 0.17±0.015 0
角叉藻聚糖 对照组 0.23±0.016** 100
MD100 0.22±0.014* 83
ASA100 0.20±0.018 50
MASA150 0.19±0.009#$ 33
MASA300 0.21±0.014* 67
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-#P<0.05vs角叉藻聚糖对照组
$P<0.05vs MD
如数据所得出，角叉藻聚糖导致大鼠血中CRP增加。在ASA100组中，CRP浓度增加以50％减少(表11)。意想不到地，在MASA150组中，明显地，增加的CRC浓度较不显著(相对对照组仅33％)。其支持了MASA在临床上对发炎过程可具有正面效用的观点。
实施例6-MASA对照ASA和MD的抗风湿活性的研究
临床的证据显示，具类风湿性关节炎(RA)的病人，易于患有动脉粥样硬化和心血管疾病(Nasonov EL,Vestn Ross Akad Nauk 2003(7):6-10)。具长期RA的患者，比起同年龄的更近期患病的患者，具更多的动脉粥样硬化。系统发炎可增大与年龄相关的心血管疾病的风险(Del Rincon I等人，Atherosclerosis2007；196(2):354-360)。
在类风湿性状况症中，类风湿性关节炎排名第一。对人类类风湿性关节炎最适用的试验动物模型为佐剂性关节炎模型，其通过注射弗氏佐剂至大鼠后后脚掌诱发。其被广泛用于筛选抗关节炎药物(Wei Jia等人，Journal of Ethnopharmacology2003(89):139-141；Sutharson Lingadurai等人，African Journal of traditional,complementary and alternative medicines,2007,4(4):411-416)。
方法-安排我们的试验，以测试MASA对佐剂性关节炎进展的影响，与MD和ASA相比。在起始体重153-185克的Wistar大鼠上进行试验。将大鼠置于22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中，给予12/12-小时光照/黑夜循环。每一标准笼放置7只大鼠，给予无限取用的饮用水与颗粒状标准喂食。所有试验都根据1986年11月24日欧洲共同体议会指令(86/609/EEC)有关试验动物照料的规定而实施。所有的努力皆为将动物的痛苦减到最小并减少动物的使用量而做。
使用修正的标准程序，用于引导与评估慢性佐剂性关节炎的进展(Bellavite P,Ortolani R,Conforti A,Immunology and Homeopaty.3.Experimental Studies onAnimal Models,Advance Access Publication 2.05,2006,171-186)。注射完全弗氏佐剂溶液0.1毫升至大鼠的后脚掌及0.05毫升至大鼠的腹腔。
当场制备测试物质的溶液。使用的量为ASA 0.1％和1％，MD 1％，以及MASA0.25％、1％和2％水溶液。测试溶液通过导管经口导入动物的胃中。
形成下列动物群组(N＝7)：
对照组的动物和AdA组的动物，不接受测试物质，而是以与试验组同样相同安排经口接受水。
统计-通过Microsoft Excel 2007软件分析数据，结果以平均数±标准差表示。根据ANOVA使用单因子分析及重复比较(塔基检验)来比较不同群组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
结果-研究第14天和第28天关节炎的临床显现的动力学。使用下列判断标准评估测试物质的效果：
1.区域显现关节炎的评估–后脚掌体积和距小腿关节圈(circuit)。
2.血细胞计算(WBC)的评估。
3.生化测试(СRP)的评估。
4.免疫指数(CIC浓度)的评估。
以器官体积测量器测量水肿，亦即后后脚掌的体积。根据下式计算预防(抑制水肿)的百分比：
P(％)＝(Vс-Vt)/Vсх100，其中
Vc–对照组中后脚掌体积
Vt–试验组中后脚掌体积
P–预防(抑制水肿)的百分比。
以标准方法在血液分析器<<PENTRA 120>>上测定血液指数，在<<INTEGRA400+>>上测定СRP。
以光谱测定血清中CIC浓度，使用乙二醇。
在注射弗氏佐剂后，试验组的所有动物都发展慢性发炎，大鼠是疲劳的、具攻击性的，毛发蓬乱的。然而喂食习惯在所有群组中都无与对照组不同。所有群组中体重的增加与对照组并无实质上不同。
表12和13表示了第14天和第28天关节炎区域显现的数据：后脚掌体积(特征为软组织的水肿)和距小腿关节圈/体积(特征为关节组织的关节炎型器官损害)。表12在注射弗氏佐剂后第14天和第28天测试物质对后脚掌体积(ml)的影响；N＝7；平均数±标准差
#P<0.05vs AdA-###P<0.0005vs AdA-&P<0.05vs ASA10-&&P<0.005vs ASA10
&&&P<0.0005vs ASA10-P<0.05vs ASA100-$P<0.05vs MD
如表12所得，在第14天时试验组所有的动物发展了软组织的显著的水肿。14天期间的处理相对的对水肿的发展极小的影响。然而，MASA100组和MASA200组的动物，相较于ASA10组的动物，明显具有较不显著的水肿。在第14天时MD和ASA10组不仅并无预防水肿的发展，比起AdA组反而具有更大体积(负面保护-7％)。在第28天MASA的所有剂量以及ASA100显著地避免水肿发展(保护％，各为41、45、24和32％)。值得注意的是，MASA100相较于ASA10、ASA100和MD，展现了显著较佳地保护。
表13在注射弗氏佐剂后第14天和第28天测试物质对大鼠距小腿关节变化的影响。N＝7；平均数±标准差
群组 第14天距小腿关节圈，毫米 第28天距小腿关节圈，毫米
对照组 5.6±0.09## 5.8±0.12##
AdA 7.2±0.14 7.3±0.16
ASA10 7.2±0.12 6.8±0.14#
ASA100 6.9±0.15 7.1±0.16
MD100 7.0±0.13 7.0±0,13
MASA25 7.0±0.14 6.7±0.15#
MASA100 7.0±0.13 6.6±0.16#$
MASA200 6.8±0.10#& 6.9±0.11
#P<0.05vs AdA-##P<0.005vs AdA-&P<0.05vs ASA10-P<0.05vs ASA100
$P<0.05vs MD
距小腿关节数据的分析(表13)显示了，在第14天时，仅有MASA200显著地阻止关节炎损伤的进展。在第28天时，MASA25、MASA100和ASA100显示了明显的保护。在此试验情况中，MASA100表现了相对最佳的保护。我们已建立了，在第28天时，水肿的程度(表12)和距小腿关节的关节炎变化(表13)都被减弱了。比起ASA或MD，MASA100显著地更有效。WBC的评估显示了在弗氏佐剂影响下是增加的(白细胞增多症)(表14)。白细胞增多症是发炎过程的特征。
表14在注射弗氏佐剂后第14天和第28天，在测试物质影响下大鼠血液中WBC的变化。N＝7；平均数±标准差
**P<0.005vs对照组-#P<0.05vs AdA-##P<0.005vs AdA
相较于AdA组，测试物质的使用造成WBC的降低，这表示了抗发炎活性。虽然在测试物质对白细胞浓度的增加的效果间没有统计上明显的不同，第14天时，MASA100显示了相对较高的活性，但在第28天时则为MASA200(表14)。为了评估发炎过程的发展，在第14天和第28天测定CRP浓度。已知CRP浓度在发炎过程期间会增加。
表15在注射弗氏佐剂后第14天和第28天，在测试物质影响下大鼠血液中CRP浓度的变化。N＝7；平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组
#P<0.05vs AdA-##P<0.005vs AdA-###P<0.0005vs AdA-&P<0.05vs ASA10
P<0.05vs ASA100
如表15中数据所得，在第14天时所有的试验组显示了CRP浓度的增加，表示发炎的过程。在我们的试验情况中，在第14天时仅有MASA200展现了明显的防止CRP增加的保护。应注意的是，MASA200在第14天时具有显著较MASA100更好的效果。在第28天时，MASA25和MASA100展现了显著地比ASA10更好的保护(表15)。
由标准分光光度方法(Baranovskii PV,Rudyk BI,Laboratornoe delo1982；12:35-39(Rus)测定CIC浓度。以动力学研究在第14天及第28天的免疫因子。浓度的改变显示于表16中。
表16在注射弗氏佐剂后第14天和第28天，CIC的数量(单元)。N＝7；平均数±标准差
群组 CIC单元，第14天 CIC单元，第28天
对照组 9.4±1.05## 7.8±0.49##
AdA 17.4±1.29** 13.4±1.25**
ASA10 10.8±0.74## 8.2±0.53#
ASA100 15.0±1.23* 14.4±1.66*
MD100 11.8±2.22 8.6±0.93#
MASA25 12.6±0.68# 11.8±1.53
MASA100 20.8±2.99* 5.8±0.74##&$
MASA200 21.6±3.26* 6.2±1.02##
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-#P<0.05vs AdA-##P<0.005vs AdA
$P<0.05vs MD-&P>0.05vs ASA10-P<0.05vs ASA100-P<0.005vs ASA100
在第14天和第28天，试验组的CIC浓度比对照组高。在第14天，仅有ASA10和MASA25组的CIC浓度较AdA组低。在第28天，接受测试物质群组中的CIC接近于对照组，但ASA100组除外。
在试验期间，在第14天时，观察到ASA100、MASA100和MASA200组中CIC浓度的增加。在第28天时，MASA100和MASA200组中CIC浓度已正常。可在多种免疫病理症状中观察到血清中CIC浓度的增加。在发炎的过程中(包括系统的症状)可观察到CIC的显著增加，其中CIC浓度指出病理过程的强度(Bier O等人，Fundamentals of immunology,New York,Heidelberg,Berlin,p.442)。以不同剂量的MASA做长期治疗降低CIC浓度至正常范围。在充分的主动免疫下，CIC的主要部分被柯弗氏细胞移除，且CIC浓度的降低被理解为具正面效益。第28天时，在MASA100和MASA200组中，使用MASA展示了使CIC浓度正常化的效益，此事实指出，不同剂量的MASA的长期使用，可在临床上治疗关节炎，较提高ASA剂量更有希望。
实施例7.抗高脂血特性的研究
动脉粥样硬化是多因素过程(Berliner JA等人，Circulation1995；91:2488-2495)，具有伴随着增加的冠状动脉心脏病症状的增加的临床上巨大影响。发炎及组织对其的应答，在动脉粥样硬化过程中扮演实质上的作用(Ross R,Am Heart J 1999；138；S419-S420)。临床的观察指出，抗发炎的治疗降低了动脉粥样硬化的出现(Stoller DK等人,J Surg Res 1993；54:7-11)。试验数据确认了抗发炎活性与降血脂活性之间相当的关系，至少在COX-1抑制剂间(Kourounakis AP等人,Exper Mol Pathol 2002；73:135-138)。我们比较了ASA和MASA在相同剂量下的降血脂的活性。
7.1.大鼠急性高血脂症模型中测试物质对脂质浓度的比较效果
方法-使用体重为250-270克的雄性Wistar大鼠。在22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中将动物以6-8只一组置于适当的笼中，给予12/12小时光照/黑夜循环，及可自由取用食物与水。以Triton WR1339(TR)诱发急性试验性高血脂症/高胆固醇血症，如由Kourounakis AP等人,Exper Mol Pathol 2002；73:135-138所描述。大鼠在隔夜禁食后，通过250毫克/公斤剂量的等渗盐水中溶解的TR经口处理。在导入TR前1小时及后20小时，经口导入测试物质的溶液或水至对照组和TR组动物中，如下所述。
在隔天(注射TR后24小时)通过在乙醚麻醉下心脏穿刺以收集用于生化分析的血液。通过离心分离出血清，并以商业可得的试剂盒分析总胆固醇、HDL、LDL和TG浓度。
进行三个系列的试验。
统计-通过Microsoft Excel软件分析数据，结果以平均数+/-平均标准差表示。根据ANOVA及学生t检验使用单因子分析及重复比较(塔基检验)来比较不同群组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
系列I–比较ASA、MD和MASA
结果-接受TR的大鼠发展了显著的高胆固醇血症和高血脂症，其的总胆固醇、LDL和TG浓度显著地不同于对照组的大鼠(总C增加6-7倍，TG 30倍–更多见表17)。ASA治疗，尤其是剂量90毫克/公斤，限制了总C、LDL和TG的增加，但并不显著地改变HDL浓度。MD在我们的试验情况中并无显著地阻止由TR导致的脂质浓度的改变。使用MASA的治疗造成剂量依赖性地阻止TR诱发的高血脂症/高胆固醇血症。剂量75毫克/公斤MASA与ASA45并无不同，但在阻止TR的效果上，MASA150比起ASA45和MD150更加有效。在降低总C、LDL和TG方面，MASA300远胜于ASA45和ASA90。这指出MASA在用于预防和/或治疗高胆固醇血症和高脂血状况是有用的，及考虑其抗发炎活性在预防和/或治疗动脉粥样硬化和由脂质代谢失调和发炎促进的其他状况是有用的。
表17MD、ASA和MASA对大鼠高血脂症模型中脂质浓度的比较效果；n＝6-8；平均数±标准差
群组 C毫克/分升 HDL毫克/分升 LDL毫克/分升 TG毫克/分升
对照组 80.7±4.7*** 56.5±2.8 21.1±2.6*** 44.0±6.9***
TR 453.6±40.0 60.3±9.6 386.0±36.5 1399±129.7
ASA45 381.0±30.3 62.8±10.9 307.4±37.8 973±82.7*
ASA90 288.1±23.5* 60.0±7.4 219.1±23.9* 791±73.9**
MD150 345.6±34.1 63.8±9.3 273.9±31.6* 1022±80.7*
MASA75 341.9±16.3* 68.1±8.7 270.1±12.8* 861±105.7*
MASA150 249.6±22.2**$& 58.2±8.1 182.4±19.6**$& 668±104.4**$&
MASA300 219.0±16.7**$#& 56.3±8.6 158.6±19.4**$#& 548±73.2***&$#
*P<0.05vs TR-**P<0.005vs TR-***P<0.0005vs TR-$P<0.05vs ASA45
#P<0.05vs ASA90-&P<0.05vs MD150
系列II–比较ASA、MASA、NA以及ASA+NA、MASA+NA组合物
结果-在我们的试验情况中，NA提供了明显的由TR诱发的脂质(C、LDL和TG)浓度改变的对抗保护(见表18)。ASA和NA的组合并不显著地改变对脂质浓度的影响。出人意外地，MASA和NA的组合物相当增强了NA50的效果，并胜于MASA对由TR诱发的TG浓度增加的保护效果(表18)。MASA和NA的组合使用，比起ASA45+NA50对LDL和TG浓度的正常化效果，亦显著地更有效。
表18MD、ASA和MASA对大鼠高血脂症模型的脂质浓度分別以及组合地影响；n＝6-8；平均数±标准差
群组 C毫克/分升 HDL毫克/分升 LDL毫克/分升 TG毫克/分升
对照组 80.7±4.7*** 56.5±2.8 21.1±2.6*** 44±6.9***
TR 453.6±40.0 60.3±9.6 386.0±36.5 1399±129.7
ASA45 381.0±30.3 62.8±10.9 307.4±37.8 973±82.7*
MASA150 249.6±22.2**$ 58.2±8.1 182.4±19.6**$ 668±70.9**$
NA50 327.5±38.4* 66.5±14.6 246.3±32.5* 591±43.3**
ASA45+NA50 316.0±43.1* 57.9±14.3 251.2±33.8* 618±42.8**
MASA150+NA50 226.3±24.9**#$ 63.1±10.2 163.2±19.3**$#％ 468±34.7**$#％
*P<0.05vs TR-**<0.005vs TR-***P<0.0005vs TR-$P<0.05vs ASA45
P<0.05vs MASA150-#P<0.05vs NA50-％P<0.05vs ASA45+NA50
系列III–比较SI、MD、MASA和SI+MD、SI+MASA组合
结果-在我们的试验情况中，SI在剂量5毫克/公斤时提供了明显的由TR诱发的脂质(C、LDL和TG)浓度改变的对抗保护(见表19)。SI与测试物质的组合增加了对脂质浓度正常化的效果。MASA与SI的组合对于抗衡由TR诱发的LDL和TG浓度的增加，显著地较MD+SI更有效(表19)。MD与他汀类的组合物已被WO2006099244所提出，其不具任何数据。他汀类和ASA的结合使用须要具体的药物组合物，因为这些物质在药理学上和化学上都不相容的(US 6,235,311)，因此不可能有协同作用。
表19MD、MASA和SI在大鼠高血脂症模型中对脂质浓度分开以及组合地影响；n＝6-8；平均数±标准差
*P<0.05vs TR-**<0.005vs TR-***P<0.0005vs TR-&P<0.05vs MD-$P<0.05vs SI-#P<0.05vs MD+SI
总结-结果指出MASA对于预防和/或治疗高胆固醇血症和高血脂症的潜力。考虑到MASA的抗发炎活性，其可较ASA或MD对于预防和/或治疗动脉粥样硬化和其他由发炎促进的病症更有效。MASA和NA的结合使用增强了单独物质对于在试验上增加脂质浓度的正面效果，优于ASA加上NA。MASA与SI的组合不仅较SI单独更有效，而且也对于抗衡由TR诱发的LDL和TG浓度的增加，显著地较MD+SI更有效。
7.2.NA和MASA在大鼠慢性高血脂症模型中对脂质浓度分开以及组合地影响
方法-使用雄性Wistar大鼠。在22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中将动物以7-8只一组置于适当的笼中，给予12/12小时光照/黑夜循环，及可自由取用水与食物。动物的初始体重为220-240克。使用Levine和Saltzman所述的方法(Levine S,Saltzman A,J Pharmacol Toxicol Meth 2007；55:224-226)以TR诱导试验性慢性(亚慢性)高血脂症/高胆固醇血症。动物经由尾静脉接受250毫克/公斤TR溶液，一周三次共三周。每天一次在注射TR溶液或采血样品前一小时经口导入用于试验组的测试物质的溶液或用于对照组的水，根据下列方案：
在1、2、3周后(在TR注射后隔天起算)在乙醚麻醉下通过心脏穿刺获得用于生化分析的血液。通过离心分离出血清，并以商业可得的试剂盒分析总C、HDL、LDL和TG浓度。
统计-通过Microsoft Excel软件分析数据，结果以平均数+/-平均标准差表示。根据ANOVA和学生t检验使用单因子分析及重复比较(塔基检验)来比较不同群组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
结果-重复注射TR发展了明显且稳定的高胆固醇血症和高血脂症，其特征在于相较于对照组，显著的总C、LDL和TG浓度的增加(总C增加6-7倍，TG至30及更多，见表20)。NA疗法，特別显著地在第一周，限制了总C、LDL和TG的增加，但仅在2和3周时显著地增加HDL浓度。MASA几乎与NA同样地降低了总C和LDL浓度并增加了HDL浓度，但就阻止由TR导致的TG增加方面，则少于NA(见表21)。出人意外地，NA+MASA的组合使用在3周之后，相较于单独的NA或MASA，在降低总C、LDL和TG浓度方面和增加HDL浓度方面，实质上更佳。因此，预期NA+MASA的组合对于预防和/或治疗高胆固醇血症和高血脂症方面是有用的。
表20NA和MASA在大鼠慢性高血脂症模型中对脂质浓度分开及组合地影响；n＝9-14；平均数±标准差
表20续
表20续
表20续
*P<0.05vs TR-**<0.005vs TR-#<0.0005vs TR-$P<0.05vs NA
&P<0.05vs MASA
MASA和NA的组合使用显著地较物质单独作用更有效。
实施例8.测试物质对血小板聚集和血栓形成的影响
8.1.血小板聚集
ASA是最被广泛使用的预防用抗血小板药物之一(Miner J等人,Tex Heart InstJ 2007；34(2):179-186)。ASA已与NA结合作为抗发炎剂(US 3,312,593)和抗血小板药物(WO 9632942)。许多其他药物及其组合是已知的。已被建立的是，MD正常化血管紧张性(vascular tone)，抑制血小板聚集和脂肪酸氧化，并在心肌缺血期间优化耗氧量(Tsirkin VI,Ros Kardiol Zh 2002；1:45-52)。NA亦稍为抑制血小板聚集(Lakin KM等人,Farmakol Toksikol,1980,43(5):581-5(Rus)。典型的抗血小板药物氯吡格雷是被单独使用的(US 4,529,596、US 4,847,265、US 5,576328)或与他汀类组合(WO9804259)或与ASA组合(WO9729753)。抗血小板药双嘧达莫亦可与ASA结合(Halkes PH等人,Lancet 2006,367(9523):1665-73)。临床经验指出多种药物组合物的更高通用性。
方法-在多板(Multiplate)上使用全血阻抗凝集来研究血小板聚集(多种血小板功能分析仪，Dynabyte Medical公司，德国)(Toth O等人,Thromb Haemost2006；96:781-788.Velik-Salchner C等人,Anesth Analg 2008；107:1798-1806)。从未曾使用计ASA或任何其他抗血小板药物的健康捐赠者B.(37岁)采集用于在体外试验的血液样本至以水蛭素覆盖的塑料管中(Dynabyte Medical公司，德国)，以用于在采集后30分钟到4小时之间测量。在间接体內(ex vivo)试验中，采集从被麻醉之已经口处理测试物质3天的大鼠之血液至以水蛭素覆盖的塑料管中(DynabyteMedical公司，德国)。根据经修改的Dynabyte Medical公司的医学方案来进行测量。等渗氯化钠溶液(0.3毫升，或具欲研究的化合物的盐水(每一种皆至最终浓度10-4mmol/ml))被预加热至37℃并用移液管移至测试细胞中，再加入0.3毫升用水蛭素抗凝的全血样本。经5分钟培养后，在370C搅拌，通过添加适当的激动剂溶液(取得自Dynabyte Medical公司，德国)来开始测量：
1)腺甘二磷酸(ADP)-ADP-测试。ADP通过ADP受体(P2Y12及其他)刺激血小板活化。
2)二十碳四烯酸(AA)–ASPI-测试：通过AA活化–环加氧酶的底物形成凝血脂素(tromboxane)A2(TXA2)，其为强效的血小板激动剂。
3)ADP HS测试(前列腺素E1与ADP的组合)。添加內源性抑制剂PGE1，使得ADP HS测试对氯吡格雷和相关药物的效果相较于ADP测试更加敏感。
记录聚集曲线6分钟，并使用Dynabyte Medical公司的软件分析。我们计算了下列血小板聚集的参数：
1)Amax，以聚集的任意单位(AU)表达的血小板聚集的最大值；
2)AUC，在聚集曲线下的总面积(AU*min)。此会被聚集曲线的总高度以及其斜率所影响，且最适合于表达整体的血小板活性。
统计-结果以平均数±标准差表示。为了评估差异的显著性，使用单向ANOVA分析。虚无假設被排除，则使用事后比较学生纽曼科伊尔斯检验。
结果-如表21所示，MASA在浓度10-4摩尔时提供明显的对ADP，特別是对由AA和ADP+PGE1诱发的血小板聚集的防护(AUC和Amax明显的降低，表21)。NA(在10-4mmol/ml组)亦降低由ADP导致的聚集(见Amax，表21)。两种物质的结合活性提供了显著较多且显著的由ADP或ADP+PGE1导致的血小板聚集的降低，此显示于AUC和Amax两者数据中(表21)。
表21MD、NA及其组合对由ADP、AA和PGE1+ADP诱发之血小板聚集之影响；平均数±标准差；N＝5-8。
表21续
表21续
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-3P<0.0005vs对照组-4P<0.00005vs对照组&P<0.05vs ASA-&&P<0.005vs ASA-&&&P<0.0005vs ASA-&&P<0.005vs ASA-&&&P<0.0005vs ASA-#P<0.005vs MD 10-4
##P<0.0005vs MD 10-4-$P<0.005vs NA 10-4-$$P<0.0005vs NA 10-4
P<0.05vs MASA 10-4-aP<0.05vs ASA+NA-bP<0.05vs MD+NA
MASA相较于ASA或MD，显著地在避免由AA诱发的血小板聚集方面更佳(表21)。MASA+NA的组合展现了对由AA诱发的聚集方面显著较高的活性，优于每个分开的物质，以及ASA+NA和MD+NA(表21)。
以双嘧达莫(DI)和DI与ASA或MASA的组合，对于ADP或AA导致的血小板聚集进行平行试验(表22)。DI展现抗血栓及抗聚集的活性(Mammen EF,Thrombosis Research Supplement 1990XII,1-3)。双嘧达莫加上阿司匹林，相较于阿司匹林本身，对动脉源的脑缺血更有效(Halkes PH等人，Lancet 2006,367(9523):1665-73)。
表22测试物质对于由ADP或AA诱发的血小板聚集分开地以及组合地影响。平均数±标准差；N＝5-8。
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-3P<0.0005vs对照组
4P<0.00005vs对照组-&P<0.05vs ASA-P<0.05vs MASA
P<0.005vs MASA-aP<0.05vs DI-aaP<0.005vs DI-aaaP<0.0005vs DI
$P<0.05vs ASA+DI-$$P<0.005vs ASA+DI
在此系列中，MASA+DI展现了最高的活性，其显著地高于ASA+DI的活性(表22)。
8.2.血栓形成
在试验的动脉血栓形成后经口施用于兔与狗两周的MD治疗使用，显示了溶解血栓的效果(Logunova L等人,Experim Clin Pharmacoter 1991；19:91-98(Rus)。MD在控制或预防血栓形成的预防效果方面并无已知的数据。NA经由多种的机制降低血栓形成(Rosenson RS等人，Atherosclerosis 1998；140:271-80)。
方法-我们选择基于由三氯化铁(FeCl3)所诱发的大鼠动脉血栓形成的试验性血栓形成模型(Kurz K等人,Thromb Res 1990,60:269-280.Wang X,Xu L,Thromb Res2005,115:95-100)。由铁介导的化学氧化作用起始的组织损伤使受伤部位易于诱发血小板黏附和聚集，接着凝血活化及纤维蛋白沉积。在试验中使用体重350-420g的雄性Wistar大鼠。在22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中将动物以7-8只一组置于适当的笼中，给予12/12小时光照/黑夜循环，及可自由取用食物与水。所有试验都根据1986年11月24日欧洲共同体议会指令(86/609/EEC)有关试验动物照料的规定而实施。所有的努力都为将动物的痛苦减到最小并减少动物的使用量而做。随机将大鼠分为各个试验组，每组由不少于7只动物所组成。在血栓形成起始前2小时通过口服途径施用媒介物或测试化学物MD(25毫克/公斤)、NA(25毫克/公斤)、MASA(10毫克/公斤)、ASA(5毫克/公斤)及组合MD+NA(25+25毫克/公斤)、MASA+NA(10+25毫克/公斤)和ASA+NA(5+25毫克/公斤)。进行平行试验，以比单一剂量的测试物质(在血栓形成起始前2小时给予)和重复剂量(每日一次共三日)的效果。7-8只动物的群组接受下列物质：MASA(10毫克/公斤)、氯吡格雷(CL)(5毫克/公斤)、ASA(5毫克/公斤)和组合物MASA+CL(10+5毫克/公斤)或ASA+CL(5+5毫克/公斤)。将大鼠以戊巴比妥钠麻醉(腹腔注射50毫克/公斤，及10毫克/公斤/小时)并置于热控手术台上，在整个试验期间保持370C的体温。通过劲切口将劲动脉之一暴露出，与黏附的组织、迷走神经分离，且流量探针(电磁血流量计MFV 1200，Nicon Kohden公司，日本)被放置在总劲动脉的露出部位，以记录血流量。在15分钟的稳定期间过后，通过局部施用(接触血管外膜表面)两片(2x1毫米)浸于三氯化铁(FeCl3)的15％溶液的Whatman滤纸，来诱发血栓形成。记录劲动脉的血栓形成时间，其被报导为直到阻塞的时间(TTO)，即完全停止血流所需的时间。在主动处理组中，若血流未在90分钟內停止，则记录TTO为>90分钟。
此外，在血栓形成试验期间，测量大鼠尾巴流血时间。用解剖刀从尾端5毫米处橫切尾巴，并将尾巴立即浸入370C温暖等渗盐水中，直到注意到流血停止。流血完全停止且在接下来30秒无再流血的时间点，定义为流血停止。
在血栓形成试验后，接受3天测试物质的被麻醉动物，被用来进行间接体內(exvivo)血小板聚集测试。打开腹腔，从下腔静脉收集血液至以水蛭素(DynabyteMedical公司，德国)覆盖的塑料管中。
使用血液样本用于在采集后30分钟到4小时之间的测量。根据经修改的Dynabyte Medical方案来进行测量(见上述关于血小板聚集以下)。
统计-通过Microsoft Excel 2007软件分析数据。数据以平均数±标准差表示。使用ANOVA单向分析及重复比较(塔基检验)来比较不同试验组之平均结果。P<0.05被认为是显著的。
结果-在对照组中，三氯化铁(FeCl3)导致的血管血栓形成及其结果的动脉流停止的平均时间为24.4分钟(表23)。
表23测试物质对FeCl3诱发的劲动脉血栓形成的影响。平均数±标准差；N＝7-8
群组 直到闭塞之时间 尾巴流血时间
分钟 ％ 分钟 ％
对照组 24.4±1.45 100 8.9±1.28 100
NA(25毫克/公斤) 30.3±3.12 124 11.5±1.39 129
MD(25毫克/公斤) 29.8±2.29 122 10.5±1.01 118
MD+NA(25+25毫克/公斤) 34.0±2.781 139 11.4±1.42 128
MASA(10毫克/公斤) 41.7±3.952# 171 12.1±2.20 136
MASA+NA(10+25毫克/公斤) 53.1±4.122$abc# 218 13.5±4.19 152
ASA(5毫克/公斤) 35.2±3.021 144 13.8±3.27 155
ASA+NA(5+25毫克/公斤) 42.5±4.242$# 174 15.2±2.121 171
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-#P<0.05vs MD-$P<0.05vs NA
aP<0.05vs ASA-bP<0.05vs ASA+NA-cP<0.05vs MD+NA
用MASA的预防处理提供了明显的TTO的延长(P<0.005vs对照组)，但与ASA相反的是，其在流血试验中较无效果(136至155％)。MASA+NA(10+25毫克/公斤)导致相对较长的血栓形成延迟，优于MD+NA或ASA+NA(表23)。应注意的是，使用ASA和ASA+NA，TTO的增加平行于流血时间，而使用MASA或MASA+NA时TTO的增加相当高于流血时间(表23)。
在具有通常对照的平行试验中，研究了ASA、MASA和CL及其组合对血栓形成的影响。以单一剂量施用测试物质(测试前2小时)或给予每日一次共三日。血栓形成测试前2小时导入的ASA或CL，相对于接受水的对照组，显著地延长TTO(表24)。
表24在三氯化铁(FeCl3)诱发的劲动脉血栓形成试验中，单一剂量的测试物质对TTO和流血时间的影响。平均数±标准差；N＝7-8
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-3P<0.005vs对照组
$P<0.05vs MASA-aP<0.05vs ASA-bP<0.05vs CL-cP<0.05vs ASA+CL
相较于CL，单一剂量的MASA提供更明显的TTO的增加。同时给予MASA与CL显著地增加TTO，但仅稍微改变流血时间(表24)。应注意的是，MASA+CL的组合导致明显的TTO的增加，相对于分开物质及ASA+CL的组合。用测试物质重复处理导致进一步增加TTO和流血时间(表25)。
表25在三氯化铁(FeCl3)诱发的劲动脉血栓形成试验中，重复处理测试物质对TTO和流血时间的影响。平均数±标准差；N＝7-8
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-$P<0.05vs MASA-aP<0.05vs ASA
以MASA或CL重复处理产生对TTO显著较高的影响，比起ASA(相应地，191和194％比上162％)，但MASA，与CL或ASA相反，并无增加流血时间(表25)。以MASA+CL或ASA+CL重复处理产生相当大且相当类似的TTO的增加，但在影响尾巴流血时间方面MASA+CL相对较少于ASA+CL(241％vs 319％)(表25)。
间接体內(ex vivo)的试验
在血栓形成试验之后，收集动物血液并测量聚集参数。以10毫克/公斤的剂量用MASA处理三天，导致明显的由所有被测试的聚集诱发剂引起的血小板聚集的减少(表26)。
表26MASA、ASA、CL和其组合在间接体內(ex vivo)对血小板聚集的影响；平均数±标准差；N＝4-7。
表26续
表26续
1P<0.05vs对照组-2P<0.005vs对照组-3P<0.0005vs对照组-P<0.05vs MASA
&P<0.05vs ASA-&&P<0.005vs ASA-&&&P<0.0005vs ASA-aP<0.05vs CL-bP<0.05vsASA+CL
用5毫克/公斤/天的剂量的CL处理三天导致对于由ADP和PGE1+ADP诱发的聚集相当的保护效果，但并无阻止由AA诱发的聚集。ASA提供对由AA和PGE1+ADP诱发的聚集明显的保护，但对ADP并不有效(表26)。MASA和CL(10+5毫克/公斤/天x3)的组合提供相对最高的避免由多种药物诱发的聚集的效果，明显地优于由ASA+CL在ADP和PGE1+ADP测试中提供者(表26)。
总结
MASA在对抗由AA诱发的血小板聚集方面，远优于相似摩尔浓度的MD或ASA。MASA+NA对于所有诱发剂引起的聚集的保护显著地超过MD、NA和ASA，以及ASA+NA的组合，以及对于由AA诱发的聚集亦超过MD+NA。
考虑MASA和MASA+NA组合对抗血小板聚集以及体內TTO的延长的正面效益，MASA或MASA+NA组合可应用于降低患显著的动脉粥样硬化、潜在的心肌梗塞和损伤以及周边血液循环失调的病人的血小板聚集和血栓形成风险。MASA和MASA+NA组合的情况不延长尾巴流血时间，此事实指出，此组合物在用于在手术前及手术后期间增加流血风险的病患的可能用途。
MASA+DI在防止由ADP和AA诱发的聚集方面，远优于ASA+DI。
MASA+CL。在血栓形成试验中，单一剂量的MASA+CL相较于ASA+CL对三氯化铁(FeCl3)诱发的血栓形成提供了较佳的保护。就延长尾巴流血时间方面，MASA+CL相对较ASA+CL少。在间接体內(ex vivo)试验中，MASA+CL提供了远多于CL、ASA或MASA的显著的对血小板聚集的保护。对由ADP和PGE1+ADP诱发的血小板聚集的保护，MASA+CL较ASA+CL更佳。
这些事实指出，MASA+CL可在临床上应用于立即保护增加血小板聚集的风险、即将发生的或正在发生的血栓形成。
实施例9.MASA/NA、MD/NA和LA/NA结合应用于降低NA诱发的潮红的比较 研究
烟酸(nicotinic acid)(烟酸(niacin)，NA)有效地降低血清胆固醇、LDL和甘油三酯，同时提高HDL。然而对接受立即或持续释放烟酸的病人，限制性不利影响为，明显的皮肤温暖和血管扩张的迅速发展，称为“潮红”，其严重地导致停药(Gupta EK,Ito MK,Heart Dis 2002；4:124–137).Laropiprant(MK-0524)(LA)。拉罗匹仑(MK-0524)(LA)已被提出做为降低NA潮红最有活性及前瞻性的药物之一(ChengK等人,PNAS 2006；103:6682-6687)。
9.1.对由烟酸导致的皮肤血管扩张的拮抗作用
模型-由戊巴比妥钠(50毫克/公斤，腹腔注射)麻醉雄性Wistar大鼠并以每小时额外的剂量(10毫克/公斤)使处于麻醉状态下。测量左劲动脉的血压，以标准II导线记录ECG。以激光多普勒流量计(OXYFLOW 2000，美国)测量右耳动脉的血流。以AD仪器PowerLab系统记录血流、ECG和动脉压，并储存在电脑中以待进一步处理。在10分钟长的基线记录后，以皮下注射将测试物质注射入鬐甲区域并继续记录30分钟。考虑到平均血压，计算每只动物的平均血流数据，并与起始值以及对照组比较。从5至8个分开的试验计算结果，并以百分比表示作为对基线而言最大的血流(Carballo-Jane E等人,J Pharmacol Toxicol Methods2007；56(3):308-316)。
统计-各群组的结果以平均数±标准差表示。群组內的统计分析以学生t检验进行。使用ANOVA单向分析及重复比较(塔基检验)来比较不同试验组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
结果-在此动物模型中，15毫克/公斤剂量的烟酸(NA)导致耳动脉明显的血流增加(表27)。MASA，相似于对照组(缓冲的0.9％NaCl溶液)，导致不明显的血流变化。NA与MASA一起，比起NA单独，导致延迟(缓慢增加)且明显的统计上较不显著的血流的绝对增加(表27)。因此我们已意想不到地发现，MASA显著地降低由NA导致的周边血管扩张。MASA可拮抗由NA导致的周边血管扩张，此潜力可具有临床上用于减弱烟酸对皮肤的影响(潮红)的有益效果，并进一步详细研究，如下所述。
表27试验物质对皮肤的血管扩张的影响；平均数±标准差，N＝5-8
群组 血流之改变，％
对照组 2.92±2.76
NA(15毫克/公斤) 55.75±11.5**
MASA(45毫克/公斤) 8.04±2.02$
NA+MASA(15毫克/公斤+45毫克/公斤) 25.91±9.52*$
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-$P<0.05vs NA
9.2.由烟酸造成的皮肤温度升高的拮抗作用我们的研究的目的是比较在试验中MASA、MD和LA对由NA造成的潮红(皮肤温度的改变)的影响。
方法-使用雄性Wistar大鼠(280-330克)。在22±1℃、相对湿度60±5％的气候调节室中将动物以7-8只一组置于适当的笼中，给予12/12小时光照/黑夜循环，及可自由取用水与食物(R3–Lactamin AB，瑞典)。为了记录整只大鼠皮肤温度的变化，使用非接触式温度记录方法(Papaliodis D等人，Br J Pharmacol2008；153:1382-1387)。用手持式红外线测温仪(Model Proscan 510，TFA-Dostman公司)进行温度测量。于使用前三日，使动物习惯于被处理及该红外线探针。在无麻醉下，记录开始及整个试验期间从每一耳背侧读到的温度。在一长至60分钟的期间，每5分钟测量耳温。在测量之间，放置动物回它们的笼內。在使用前刻将NA、MD和MASA溶解于盐水中，并校正pH。在试验的每一天，首先将LA(MK0524,Cayman Chemicals)溶解于DMSO中，接着才以0.9％NaCl稀释。NA和LA组合的比率是基于TredaptiveTM(烟酸/拉罗匹仑(laropiprant))1000mg/20mg修饰缓释片的产品特性概要。
统计-将六个耳温测量(每耳三个)在每个时间点平均之。通过Microsoft Excel软件分析数据，结果以平均数±标准差表示。根据ANOVA和学生t检验使用单因子分析及重复比较(塔基检验)来比较不同群组的平均结果。P<0.05被认为是显著的。
9.2.1测试时间与溶剂对皮肤温度的影响
9.2.2.在同时[0]或30分钟前[30]施用皮下注射，分开的测试物质对皮肤温度的研 究
检验LA、MD或MASA单独对皮肤温度的影响。以皮下注射导入每个所研究的化合物，与NA同时，如LA+NA[0]，或在NA的30分钟之前，如LA+NA[30]。
9.2.3.在同时[0]或45分钟前[45]施用皮下注射，MASA/Na和MD/NA组合对皮 肤温度的研究
结果
R 9.2.1.测试时间与溶剂对皮肤温度的影响
从早上10点至下午2点，所记录的基线平均耳温是28.4–30.6℃。对NA(15毫克/公斤，皮下注射)的时间应答研究显示了，在10分钟时，从基线算的最高温度增加了2.32±0.37℃，与溶剂组比较最高温度增加了2.57±0.43(P<0.005)(以下)。被建立的是，LA溶剂对耳温的影响仅有在注射后的起初5分钟实质上不同于NA、MASA和MD溶剂，因此仅使用一个对照组来计算10分钟时的温度。
R 9.2.2.在同时[0]或30分钟前[30]施用皮下注射，单独的测试物质对皮肤温度的 研究
皮下注射MASA、MD或LA并不对大鼠耳朵皮肤温度造成明显的改变(表28)。在MD+NA[0]——当MD与NA一起被加入——和MD+NA[30]——当MD在NA的30分钟前被给予——之间，没有温度的变化。
表28MASA、LA和MD对由NA造成的皮肤温度增加的影响；N＝6，平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组
$P<0.05vs NA-$$$P<0.0005vs NA
同时施用NA和MASA(NA+MASA[0]组；提前时间＝0)造成了NA潮红的降低，其是相似于同时施用NA和LA或NA和MD。由NA造成的温度增加被降低，相应地自100％(NA的效果)至62％、67和69％(表28)。在我们的试验中，施用MASA+NA和LA+NA(当提前NA 30分钟，皮下注射)，造成明显及相似的防护由NA造成的皮肤温度增加(表28)。
R 9.2.3.口服NA/MASA和NA/MD组合对皮肤温度影响的研究
以40毫克/公斤剂量口服(经口导入)NA造成显著和延迟的(直至60分钟)大鼠耳朵皮肤温度的增加，最高值在15和45分钟之间(表29)。
表29MASA或MD对NA诱发的皮肤过高热在同时[0]或提前[45]处理的影响；N＝6-8，平均数±标准差
*P<0.05vs对照组-**P<0.005vs对照组-***P<0.0005vs对照组
$P<0.05vs NA-$$P<0.005vs NA-$$$P<0.0005vs NA
&P<0.05vs MASA150+NA[0]-P<0.05vs MASA75+NA[45]
#P<0.05vs MD+NA[45]
经口导入MASA或MD并无造成皮肤温度实质上的改变。以75毫克/公斤剂量同时经口导入MASA和NA[0]造成小的改变，但以150毫克/公斤剂量则实质上阻止了由NA诱发的皮肤温度增加(表29)。同时导入MD(100毫克/公斤)和NA阻止了温度增加15分钟，但并不明显的阻止由NA诱发的皮肤温度的最大增加(见30分钟、45分钟的温度，表28)。分析结果显示，150毫克/公斤剂量的MASA与NA同时导入增加了皮肤温度至70％，其实质上较佳于由NA+MD造成的降低(96％)。由NA单独增加者被视为100％。以预防性模式导入物质–在NA 45分钟前，温度降低的活动于MASA150+NA[45]增加且显著地较佳于MD+NA[45]或MASA75+NA[45](表28)。
以经口导入或皮下注射MASA降低了由NA诱发的皮肤温度增加。当以皮下注射导入MASA，相似于拉罗匹仑(laropiprant)，降低了由NA诱发的皮肤温度增加，在同时施用或预防性使用都是。当同时与NA经口导入或以预防性模式，MASA的实质抗潮红活性指出了MASA用于降低NA不良的皮肤效应(潮红)的使用潜力。
总结
因为MASA具有抗发炎、抗高脂血和抗血小板的效果，其可被认为新颖的用于治疗血栓形成病症的治疗用药物。
实施本发明的模式
本发明提供药品，其包含MASA，用于抗发炎、止痛、退热、抗风湿、抗高脂血、抗动脉粥样硬化、抗聚集和抗血栓剂。本发明的药品可以药物组合物的形式被施用。根据本发明此方面，提供药物组合物，其包含与药学上可接受的稀释剂或载体混合的MASA。
因为抗发炎、止痛、退热、抗风湿、抗高脂血、抗动脉粥样硬化、抗聚集和抗血栓的药品用途，其假定长时间使用，最佳的实施本发明的模式为提供适用于口服的形式，例如片剂或胶囊。
根据本发明进一步的方面，提供如本文定义的药品或如前述定义的药物组合物，用于制造用于治疗发炎、疼痛、发烧、风湿状况、高脂血状况、动脉粥样硬化状况、血小板聚集或血栓形成的药物的用途。
本发明的进一步方面涉及组合药品，其包含MASA及另一选自NA、他汀类、CL和DI的药物。这些产品可基于为MASA本身开发的药物组合物。

Claims (12)

1.4-三甲铵基丁酸乙酰水杨酸加成盐，具体地该盐其特征在于X射线图谱具有在以下2θ角的峰：5.10、13.58、13.83、15.02、15.17、17.89、19.33、19.87、21.85、22.05、23.32、23.56、23.92、24.75、25.55、25.80、27.05、27.91、30.25±0.2°。
2.L-肉碱乙酰水杨酸加成盐，具体地该盐其特征在于X射线图谱具有在以下2θ角的峰：5.09、12.62、13.48、13.84、15.04、17.82、19.15、19.77、21.84、22.56、23.33、23.92、24.40、25.17、25.43、26.14、27.24、29.50、30.36±0.2°。
3.米曲肼乙酰水杨酸加成盐，具体地该盐其特征在于X射线图谱具有在以下2θ角的峰：5.19、13.22、13.82、14.20、14.95、15.36、15.93、18.11、18.97、19.74、21.02、22.15、23.15、23.65、24.31、25.28、26.18、26.58、27.73、28.36±0.2°。
4.权利要求3所述的米曲肼乙酰水杨酸加成盐在用于预防及/或治疗发炎、疼痛、发烧、风湿状况、高脂血状况、动脉粥样硬化状况、心肌梗塞或中风、或血栓性栓塞症的药品的制备中的应用。
5.药物组合物，其包含权利要求3所述的米曲肼乙酰水杨酸加成盐以及药学上可接受的载体。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其适用于口服施用。
7.如权利要求5的药物组合物，其用于预防及/或治疗发炎、疼痛、发烧、风湿状况、高脂血状况、动脉粥样硬化状况、心肌梗塞或中风、或血栓性栓塞症。
8.组合药品，其包含有效量的权利要求3的米曲肼乙酰水杨酸加成盐及下述三种之一：
a)有效量的双嘧达莫，所述组合药品用于预防和/或治疗中风；
b)有效量的氯吡格雷或其药学上可接受的盐，所述组合药品用于预防和/或治疗心肌梗塞或中风、或血栓性栓塞症、急性冠状动脉综合症、心源性猝死、及冠状动脉成形术或冠状动脉分流术后的并发症；和
c)他汀类，所述他汀类选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀，所述组合药品用于预防和/或治疗选自血脂异常、动脉粥样硬化的病症。
9.组合药品，包含有效量的权利要求3的米曲肼乙酰水杨酸加成盐及有效量的烟酸或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求9的组合药品，其中
a)所述米曲肼乙酰水杨酸加成盐,和
b)所述烟酸或其药学上可接受的盐
的其中之一或二者均是立即释放、持续释放或延长释放制剂的形式。
11.如权利要求10的组合药品，用于预防和/或治疗心肌梗塞或中风、或血栓性栓塞症。
12.如权利要求9的组合药品，用于预防和/或治疗选自血脂异常和动脉粥样硬化的病症。
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