EA021344B1

EA021344B1 - Терапевтические комбинации никотиновой кислоты и мелдония

Info

Publication number: EA021344B1
Application number: EA201200037A
Authority: EA
Inventors: Иварс Калвиньш; Анатолий Бирман; Марис Веверис; Антон Лебедев; Анатолий Миснов
Original assignee: Тетра Сиа
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2015-05-29
Also published as: WO2010151096A1; CN102802618A; CN102802618B; EA201200037A1

Abstract

Настоящее изобретение содержит синергетическую комбинацию никотиновой кислоты и мелдония, отличающуюся повышенной эффективностью при лечении заболеваний, которые включают агрегацию тромбоцитов, дислипидемию, гиперлипидемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, выбранную из группы: стенокардия и инфаркт миокарда, преходящее и постоянное нарушение мозгового кровообращения, включая цереброваскулярное расстройство и инсульт и периферическое окклюзионное поражение артерии, и отличающуюся пониженным эффектом прилива крови и/или увеличения содержания глюкозы в крови, которая содержит в качестве активных компонентов никотиновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и мелдоний или его фармацевтически приемлемую соль, обладающие эффективностью для указанного назначения.

Description

Настоящее изобретение относится к комбинации лекарственного продукта и способа предупреждения и/или лечения метаболически связанных заболеваний, включая дислипидемию, гиперлипидемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, выбранную из группы стенокардия и инфаркт миокарда, преходящее и постоянное нарушение мозгового кровообращения, включая цереброваскулярное расстройство и инсульт, и периферическое окклюзионное поражение артерии, предупреждения агрегации тромбоцитов и тромбоз.

Более конкретно изобретение относится к комбинации лекарственного продукта, содержащего никотиновую кислоту (ниацин) и мелдоний, который синергетически усиливает лечащее действие никотиновой кислоты и в некоторой степени улучшает нежелательные побочные эффекты никотиновой кислоты, в особенности расширение периферических сосудов (прилив крови) и повышение содержания глюкозы в крови. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой комбинированный лекарственный продукт и к его использованию в производстве лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения метаболически связанных заболеваний.

Использованные сокращения

Для краткости в описании будут использоваться следующие сокращения:

АТР - аденозинтрифосфат

С - холестерин

СЬ - глюкоза

НЭБ-С- липопротеин-холестерин высокой плотности

Ι/К - ишемия/реперфузия

БЭБ-С - липопротеин-холестерин низкой плотности

ΜΌ - мелдоний (ΙΝΝ)

ΝΑ - никотиновая кислота

ΝΛΜτ - магниевая соль никотиновой кислоты

ΡΙ - пирацетам

ΚΡΡ - произведение интенсивности давления = среднее кровяное давление х частота сердечных сокращений х 1000^-18Ι - симвастатин

ТС - триглицериды

ТК - Тритон ^К1339 (Ту1охаро1)

УЬ - фибрилляция желудочков

УТ - желудочковая тахикардия

Предпосылки создания изобретения

Никотиновая кислота является важным средством для лечения дислипидемии и в настоящее время является единственным доступным препаратом, который оказывает благоприятное влияние на все компоненты липидного профиля: снижает содержание общего холестерина, ТС и БЭБ-С в крови и обладает наиболее выраженной активностью, повышения НОБ-С тащшд атопд среди средств, изменяющих содержание липидов (Р1ерет ТА., Ат. 1. Мапад. Саге. 2002; 8(12 8ирр1.): 8308-14).

Об использовании ΝΑ при лечении дислипидемии было известно уже в 1955 (А11кЬи1 К., НоГГег А., 81ерЬеп ΤΌ., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук. 1955; 54:558-559) и 1959 (Раткопк 1т. \ν.Β.. Ρ1ίηη ТН., АМА АгсЬ. 1п1етп. Меб. 1959; 103:783-790).

Поскольку NΑ эффективно повышает содержание НЭБ-С (МсКеппеу 1., АгсЬ. 1п1егп. Меб. 2004; 164(7):697-705. Саг1коп Ь.А., 1. 1п1егп. Меб. 2005; 258:94-114), в настоящее время NΑ сочетается с другими средствами, модифицирующими липиды, которые, главным образом, действуют на содержание БПБС, для того чтобы повысить уровень НЭБ-С (Кокепкоп К.С., Ат. 1. Меб. 2005; 118(10): 1067-77).

NΑ является эффективным агентом, изменяющим содержание липидов, что предупреждает развитие атеросклероза и ослабляет сердечно-сосудистые явления (8аееГеу А.А., 8ЬеткЬеуккЬ М.С., Клин. Мед. (рус.) 1996; 74:48-52. Эгехе1 Н., Еигореап Неай 1оитпа1 8ирр1етеп1к 2006; уо1. 8, 8ирр1. Ρ: Р23-Р29. Вго\уп В.С., 2Ьао Х.ф., Ат. 1. Сагбю1. 2008; 101 (8А): 58В-62В) за счет повышения содержания НЭБ-С. Никотиновая кислота снижает уровни заболеваемости и смертности у пациентов с гиперлипидемией (Саппег Р.Ь. и др., 1. Ат. Со11. Сагбю1. 1986;8:1245-55). NΑ является наиболее эффективным препаратом для повышения уровня НОБ-С при лечении случаев гиперлипидемического заболевания (ЕШпдетойЬ Ό.Κ. и др., АгсЬ. 1п1егп. Меб. 1994; 154:1586-95. 8сЬес1тап С. и др., Ат. 1. Сагбю1. 1993; 71:758-65). NΑ уменьшает вероятность тромбоза, снижает вязкость крови и оказывает кардиозащитное действие, что может ограничить ишемически реперфузионное повреждение. (Ьатршд К.А. и др., РЬагт. Ехр. ТЬег. 1984; 231(3):532-538.ТгиеЬ1ооб КА. и др., Ат. 1. РЬузю1. Неай Оге. РЬукюк 2000; 279(2), Н764-Н771. Кокепкоп К.8. А1Ьегокс1егок1К 2003; 171(1): 87-96).

Поскольку низкое содержание НОБ-С является фактором риска инсульта (^аппатебюе 8.С., 8Ьарег А.С., ЕЬтаШт С, 81токе 2000; 31:1882. 8ассо К.Б., Вепкоп К.Т., Кагдтап Ό.Ε. 1АМА 2001; 285: 2729-2735. Ρί/ок Е., М1кЬаШб1к ЭР., Сатбюуакс. Кек. 2001; 52(2), 199-207. 8апокк1ап Ν., Тат1оу Ν.Ε., Сигг. ТгеаРШ.

- 1 021344

Θρΐ. Сатйюу. Мей. 2008; 10(3), 195-206.), ΝΑ в качестве средства повышения содержания ННЬ-С (Саг1коп Ь.А., Сигг. Ορίη. Сагй1о1. 2006; 21(4)336-344) является полезным для предупреждения инсульта и состояний после инсульта (Кошикоу δ.Ο., ЫЬег/οη 8.Р., Клин. мед. (Москва) 1975; 53(9): 38-41). Было установлено, что содержание ННЬ-С снижается во время острого ишемического инсульта (Рикктап Α.Ν. и др., 1. №ито1. δα. 2009; 279(1-2):53-56). Было показано, что ΝΑ улучшает функциональное восстановление после инсульта (СНеп 1. и др., Αηη. №иго1. 2007; 62(1):49-58). Для лечения инсульта и других ишемических состояний был предложен собственно ННЬ-С (Кариг Ν.Κ. и др., Уакс. Неа1кН Рйк Мапад. 2008; 4(1): 3957. ЕР 1425031).

Доступны три рецептуры ΝΑ (с непосредственным выделением, с продленным выделением и длительного действия). Непосредственно выделяющийся ΝΑ ассоциирован с неблагоприятным приливом крови и повышением содержания глюкозы в крови. ΝΑ длительного действия ассоциирован с пониженным приливом крови, но также с риском гепатотоксических эффектов. Продленное выделение сопряжено с меньшим приливом крови и низким гепатотоксическим риском (Р1ерет Ι.Α., Αт. 1. Неа1кН. δνκί. РНагт. 2003; 60(13 δυρρ1.2): δ9-14. МсКеппеу 1., ΑιόΙι. 1пкегп. Мей. 2004; 164(7): 697-705. Кпорр Р.Н., Αт. 1. Сагйю1. 2008; 86(δυρρ1.); 51Ь-56Ь). Также описано применение натриевых, калиевых и магниевых солей ΝΑ.

Главным недостатком ΝΑ является необходимость введения больших доз для того, чтобы существенно изменить содержание липидов в крови. Почти 100% пациентов, обработанных ΝΑ, испытывают неприятный побочный эффект прилива крови, что во многих случаях предупреждает лечение с помощью ΝΑ. Было установлено, что резкое выделение простагландина Ό2 является непосредственной причиной ΝΑ-индуцированного прилива крови (Моттов Ι.Ό. и др., 1. 1пуекк. Неттако1. 1992; 98:812-5). Поскольку вызванный ΝΑ прилив крови является результатом активности простагландина, ацетилсалициловая кислота, как широко известный ингибитор синтеза простагландина, была предложена и применялась для контроля прилива крови. Кроме ацетилсалициловой кислоты, также активны другие нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΑΣΌδ) (ОЪетМк11ет Н., Вассата-Ншек М., Ιπί. 1. С1ш. Ргаск. 2006; 60(6):707-715). Однако этим ΝδΑΙΌδ присущи собственные побочные эффекты, причем они могут вызвать желудочно-кишечные раздражения и изъязвление.

Недавно был предложен специфический антагонист для простагландина Ό2 (РагНоГег К.О., Уакси1аг Неа1кН апй Рщк Мападетепк 2009; 5:901-908) рецепторный подтип 1, ларопипрант, в качестве средства для снижения прилива крови, вызванного ΝΑ (Ьа1 Е. и др., Сйп. РНагт. ТНег. 2007; 81:849-857. Оа\айкоп М.Н., Αт. 1. Сагйю1. 2008; 101 [κυρρ1.]: 14В-19В). Хотя добавление ларопипранта будет снижать частоту прилива крови, ΕΑ не может полностью исключить указанный побочный эффект. Ларопипрант не изменяет действие ниацина на липиды или другие побочные эффекты никотиновой кислоты. Следовательно, комбинация никотиновой кислоты с ларопипрантом может обеспечить использование более высоких доз никотиновой кислоты, и поэтому раскрывается полный потенциал лекарственного препарата (РагНоГег К.О., Уакси1аг Неа1кН апй ΡίκΗ Мападетепк 2009; 5:901-908, О1ккоп Α.Ο., Еxρе^к Ορω^ оп РНагтасокНегаρу 2010; 11 (10): 1715-1726).

У пациентов с диабетом типа 2 часто наблюдаются дислипидемические изменения, характеризующиеся увеличением содержания ТО, а также снижением содержания ННЬ-С. При рассмотрении фармакологического действия ΝΑ на метаболизм липидов, ΝΑ должен противодействовать дислипидемическим изменениям у пациентов с диабетом типа. Однако в некоторых публикациях указано, что ΝΑ увеличивает резистентность к инсулину (Оагд Α., Огипйу δΜ., ^ΑМΑ 1990; 264: 723-6. КаНп δ.Ε. и др., Н1аЪекек 1989;38:562-8) и повышает содержание глюкозы (Е1ат, М.В. и др., ^ΑМΑ 2000; 284(10):1263-1270). Поэтому для пациентов с диабетом рекомендуются только ограниченные дозы ΝΑ (<2 г/день) (δ^ρ^τ 1., Веккепйде 1., Уап Оаа1 Ь., Сигг. Мей. Рек. Ορ. 2005; 21(5): 665-682). Очевидно, что для улчшения гликемического контроля пациентов с диабетом, использующих ΝΑ, необходимы новые препараты. В клинике была зарегистрирована гипогликемическая способность мелдония (Ъ1а1кепко М.Е. и др., Клин. Мед. (рус) 2007; 85(7): 39-42), следовательно, можно было ожидать, что указанный препарат можно комбинировать с ΝΑ для получения дополнительных клинических преимуществ.

Тромбоциты играют главнейшую роль в развитии атеросклероза и неизбежного образования тромба в ходе ишемической болезни сердца. Антитромбоцитарные средства становятся первостепенными для предупреждения и терапии различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, цереброваскулярных и периферических артериальных систем (Меайо\тк Τ.Α. и др., Сис. Рек. 2007; 100(9): 1261-75). ΝΑ является эффективным агентом, изменяющим содержание липидов, что предупреждает появление атеросклероза и ослабляет сердечно-сосудистые явления. ΝΑ оказывает разнообразное действие на липопротеин и дает эффект против тромбоза артерий, что улучшает эндотелиальную функцию, ослабляет воспаление, увеличивает стабильность тромбоцитов, и уменьшает тромбоз (Рокепкоп Р.С., ΑкНе^οκс1е^οκ^κ, 2003; 171: 87-96).

Никотиновая кислота ингибирует агрегацию тромбоцитов (Ьакт К.М., Фармакол. Токсикология, 1980; 43(5): 581-5). Вне организма ΝΑ влияет на активность тромбоцитов, умеренно ингибируя агрегирование, и стимулируя значительное выделение простагландина, главным образом, с интактной экспрессией главного рецептора тромбоцитов. Влияние ΝΑ является уникальным, отличаясь от известного эффек- 2 021344 та антитромбоцитарных средств, и позволяет предположить возможность терапевтических комбинаций (8егеЬгиапу У.Ь. и др., ТйготЬоз15 апй Наетоз1а51с, 2010 (в печати).

Никотиновая кислота почти полностью предупреждает внутрисосудистое свертывание крови, индуцированное тромбопластином и питуитрином, что демонстрирует тромболитический эффект ниацина (Ва1ийа У.Р., Кардиология 1974; 14(11): 105-7 (рус). Антитромболитические свойства ΝΑ описаны несколькими авторами (§Ье81акоу У.А., Пробл. Гематол. Перелив. Крови, 1977; 22(8):29-35. Сйекайпа δ.Ι., δον. Мей. 1982(5): 105-8). Никотиновая кислота снижает риск свертывания крови (СНезпеу С.М. и др., Ат. Неай 1., 2000; 140:631-36).

Мелдоний представляет собой лекарственный препарат с определенным полезным воздействием на сердце и сосуды. Некоторая желательная активность МО была обнаружена на животных моделях атеросклероза (Уемепз М., διηίΐ5;·ιπφι В., Ва1йс 1. ЬаЬ. Атт. 8с1. 2000; 10,194-199. Уемепз М. и др., ВаНгс 1. ЬаЬ. Атт. 8с1. 2002; 12:116-122. ОкипемюН 1.У., ^ζ^η^ν У.Е., Патол. Физиол. Эксп. Тер. 2002; (2):247), и наблюдалась в клиниках (Κ^ν Κδ. и др., Тер. Арх. 1991; 63(4):90-3), поэтому ожидалось, что этот препарат может сочетаться с ΝΑ для получения дополнительных клинических преимуществ.

Кроме того, было отмечено, что МО ингибирует агрегацию тромбоцитов (Тзйкш У.1., Рос. Кардиол. ж. 2002; 1:45-52). При двухнедельном терапевтическом применении перорального введения МО кроликам и собакам, после экспериментального артериального тромбоза, наблюдался тромболитический эффект (йодипоуа Ь. и др., Эксперим. клин, фармакотер. 1991; 19:91-98 (рус). Данные о профилактическом эффекте МО для ограничения или предупреждения тромбоза не известны.

Уровень техники

Существующая тенденция к разработке комбинированных лекарственных препаратов для лечения метаболически связанных заболеваний может повысить эффективность клинического ухода (В1аск Э.М.. Сигг. ТНег. Вер. 2003; 5:39-32). Вследствие фибратов (амфипатические карбоновые кислоты), ΝΑ и статины каждый регулируют сывороточные липиды по различным механизмам, причем комбинированная терапия может предоставить пациентам особенно желательные преимущества, по сравнению с монотерапией. Поскольку прогресс в разработке новых препаратов для снижения содержания ЬПЬ-С замедлился, исследования были направлены на разработку улучшенных препаратов, повышающих содержание НИЬ-С. Для лечения метаболически связанных заболеваний наблюдается повышенное использования комбинированной терапии, включающей ΝΑ, фибраты, статины и веществ, усиливающих экскрецию желчных кислот, благодаря дополнительным профилям комбинированных продуктов (МШег М., Мауо Сйп. Ргос. 2003; 78(6):735-42. Васкез !М. и др., Уазе Неайй В1зк Мапад. 2005; 1(4):317-331. Ве1зеу Ь. и др., Сигг. Мей. Вез. Орш. 2008; 24(9),2703-9. Возепзоп В.С., РШ В., №к Сйп. Ргаек Сагйюуазе Мей. 2009; 6(2): 98-100). Наблюдается повышенное использования комбинированной терапии, включающей ΝΑ и другие препараты, например, ацетилсалициловую кислоту и другие ΝδΑΙΌδ, в качестве тромбоцитных ингибиторов (ТОР 5981555). Однако указанные комбинации не увеличивают активность ΝΑ, то есть, синергетический эффект не наблюдается. Следовательно, любые препараты, которые могли бы усилить лечебное действие ΝΑ в метаболически связанных заболеваниях, без усиления нежелательных побочных эффектов ΝΑ, могут давать положительный результат в клиниках.

Краткое описание изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в разработке комбинированного лекарственного продукта для предупреждения и/или лечения метаболически связанных заболеваний и способа предупреждения и/или лечения метаболически связанных заболеваний для нуждающегося пациента, с использованием ΝΑ в комбинации с МО, что дает дополнительный положительный результат облегчения нежелательных побочных действий ΝΑ. Ожидается, что комбинированный лекарственный продукт настоящего изобретения будет давать синергетический эффект в способе лечения и/или предупреждения метаболически связанных заболеваний, которые включают дислипидемию, гиперлипидемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, выбранную из группы стенокардии и инфаркта миокарда, преходящее и постоянное нарушение мозгового кровообращения, включающее цереброваскулярное расстройство и инсульт, и периферическое окклюзионное поражение артерии, предупреждая агрегацию тромбоцитов и тромбоз.

Согласно настоящему изобретению, комбинированный лекарственный продукт определяется как обладающий синергетическим действием, если терапевтический эффект выше эффекта ΝΑ или МО, взятых отдельно. Понятно, что используемый в изобретении комбинированный фармацевтический продукт означает одновременное, последовательное или раздельное назначение препаратов комбинации. Кроме этого цель изобретения заключается в получении фармацевтической композиции, которая содержит ΝΑ, а также МО для указанной выше цели. Другие цели изобретения станут очевидными в дальнейшем для специалиста в этой области техники.

Подробное описание изобретения

Изобретение включает в себя комбинацию ΝΑ и МО, в результате которой получается эффективная синергетическая комбинация для лечения метаболически связанных заболеваний, предпочтительно в форме однократной дозировки. Альтернативно, указанные два компонента могут быть введены отдельно, одновременно или последовательно в любом порядке. Точная форма, в которой вводятся указанные активные компоненты, не имеет значения при условии, что получается желательный эффект изобретения.

- 3 021344

Активные компоненты могут быть использованы в форме капсул, суспензий, дисперсий, эликсиров, сиропов, или тому подобного, независимо от назначения: отдельного или в единой композиции.

В настоящее время авторы изобретения неожиданно обнаружили, что ΝΑ и ΜΌ обладают синергетическим действием на метаболически связанные заболевания и другими положительными эффектами. Неожиданно было установлено, что ΜΌ является первым препаратом, который усиливает положительные эффекты ΝΑ, а именно, снижает содержание ТС и БЭБ-С и увеличивает содержание ИОБ-С, повышает антиагрегирующее действие ΝΑ и исключает нежелательные побочные эффекты ΝΑ, в особенности прилив крови и повышение содержания глюкозы в крови.

Следовательно, можно ожидать, что указанная комбинация будет предпочтительным препаратом для лечения дислипидемии у пациентов, болеющих диабетом. Кроме того, авторы неожиданно обнаружили, что комбинация настоящего изобретения исключает последействие экспериментального инфаркта и инсульта.

Авторы изобретения также обнаружили, что ΝΑ и ΜΌ обладают синергетическим действием на агрегацию тромбоцитов. Неожиданно было установлено, что ΜΌ является первым препаратом, который усиливает антитромбоцитное действие ΝΑ.

Комбинация согласно изобретению может находиться в форме, подходящей для орального использования (например, в виде таблеток, капсул, водных суспензий или диспергируемых порошков или гранул), для парэнтерального назначения (например, в виде стерильного водного раствора для внутривенного, подкожного или внутримышечного дозирования) или в качестве суппозитория для ректального дозирования. Предпочтительно композиция изобретение находится в форме, подходящей для орального использования, например, в виде таблеток или капсул.

Кроме того, комбинированный продукт согласно настоящему изобретению включает комбинацию отдельных фармацевтических композиций для активных препаратов, содержащих первую композицию ΝΑ или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель, и вторую композицию, содержащую ΜΌ или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель. Указанная комбинация фармацевтических композиций позволяет получить комбинированный лекарственный продукт согласно изобретению для одновременного или последовательного использования. Преимуществом указанной комбинации является возможность для лечащего врача регулировать соотношение активных препаратов для индивидуальных пациентов. Можно ожидать, что комбинированный лекарственный продукт настоящего изобретения также включает в себя рецептуры замедленного выделения и продленного выделения ΝΑ, а также фармацевтически приемлемые соли ΝΑ (натрия, калия или магния) и ΜΌ, и его соли.

Кроме этого, комбинированный лекарственный продукт настоящего изобретения может включать в себя другие лекарственные продукты, обладающие известной активностью в метаболически связанных заболеваниях, а именно, статины, в частности симвастатин.

Комбинированный лекарственный продукт настоящего изобретения также может включать в себя другие лекарственные продукты, обладающие известной активностью в метаболически связанных заболеваниях, а именно, ингибиторы агрегации тромбоцитов, в частности клопидогрел или дипиридамол.

Фармацевтическая композиция изобретения может быть получена с помощью традиционных методик, с использованием традиционных фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей и приемов.

Следующие примеры предусмотрены для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения.

Примеры

Испытания: Фармакологическую активность испытуемых веществ исследовали стандартными методами, применяемыми в уровне техники. Животных содержали в группах по 6 особей в соответствующих клетках, в камерах искусственного климата, при 22±1°С, относительной влажности 60±5% и 12/12 часовых циклах чередования света и темноты, при свободном доступе к пище и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с Директивой Совета ЕЭС от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС), относящейся к содержанию экспериментальных животных. Были приняты все меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и снизить количество использованных животных.

Вещества: Холестерин (фирма Αοτοδ Огдашск), мелдоний (Огшбех), корм для животных (К 70 Бас1аш1и), масло (имеющееся в продаже), холат Να (Лсгок Огдашск), ΝΑ (Лсго5 Огдашск), Ларопипрант (ΜΚ 0524, Саутаи СйетюаН). Все другие химикалии получали из промышленных источников.

Пример 1. Определение активности против атеросклероза

Методика. Была использована модель атеросклероза на мышах С57ВЬ161, генетически восприимчивых к атеросклерозу, которая описана в литературе (διηίΐΐι ΕΌ., Вгек1о№ ЕБ., 1. 1и1еги. Μеά. 1997; 242:99109). Контрольная группа животных получала стандартный корм для лабораторных животных. Экспериментальный атеросклероз был индуцирован путем добавления к стандартному питанию 1,15% холестерина, 15% сливочного масла и 0,5% холата №ι (Νίκΐιίηη Р. и др., 1. ЕтртН Кек. 1993; 34: 1413-1422). Экспериментальные группы получали испытуемые вещества отдельно и в комбинации в дозах, которые являются активными, как установлено из пилотных экспериментов. На 22-й неделе уровень атеросклеротических изменений оценивают морфологически, биохимически и гистологически с использованием стан- 4 021344 дартных методов и критериев (Ра1деп В. и др., Л1йего8с1его818. 1987; 68:231-240). Содержание общего холестерина, НБЬ-С, ЬБЬ-С и ТС в сыворотке определяли с помощью стандартных комплектов для испытаний. Отношение ЬБЬ-С/НБЕ-С принимали в качестве стандартного критерия для оценки риска сердечно-сосудистого заболевания (Тегпапбе/ М.Ь., \УеЬЬ Б., 1. Ат. Со11. ΝιιΙγ. 2008;27(1):1-5).

Показатель атеросклероза (отражает коронарный атеросклероз и является детектором периферического атеросклероза) рассчитывали следующим образом: Показатель = ЬБЕ-С/НБЬ-С.

Коэффициент атеросклероза (отражающий коронарный атеросклероз) рассчитывали следующим образом:

Коэффициент = Общий холестерин/НБЬ-С.

Статистика.

Данные представляли как среднее значение ±стандартная ошибка измерения (СОИ) из 7-10 измерений для отдельных животных. Различия между экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'з). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Первая серия экспериментов была спланирована с целью определения действия различных соотношений и доз препаратов в комбинации. Как показано в табл. 1, через 22 недели у контрольных животных группы С, получавших питание, обогащенное липидами и холестерином, развиваются атеросклеротические изменения в аорте, особенно в дуге аорты. При раздельном применении для ΝΑ и МБ наблюдается тенденция к уменьшению области поражения. Неожиданно, что комбинация ΝΑ и МБ дает значительно более высокий и статистически значимое защитное действие против атеросклеротического повреждения, чем каждое вещество в отдельности, то есть наблюдается синергетический эффект.

Таблица 1. Влияние ΝΑ и МБ на атеросклеротическое повреждение аорты; п=7-10;

Среднее значение ±СОИ

Г руппа	Площадь повреждения в дуге аорты, мкм²	Площадь повреждения аорты, %
Контрольная	44 ±25,8“	0,02±0,01“
С контрольная	6076±1282	5,44±1.12
ΝΑ 50 мг/кг	5867±975	5,21±1,07
ΝΑ200 мг/кг	4153±742	3,39±0,69
МО 50 мг/кг	4741±786	3,87±0,64
МО 150 мг/кг	3801±573	3, ЗОЮ,49
МО 200 мг/кг	3098±547	2,74±0,47*

ΝΑ50+Μ050	3106±368	2,58±0,31**
ΝΑ50+Μ0150	223И390¹⁴	1,9310,40^
4А200+М0200	1602±404“	1,1910,38^-14

NΑ50+М^50 = ΝΑ 50 мг/кг+ МБ 50 мг/кг NΑ50+М^ 150 = ΝΑ 50 мг/кг+ МБ 150 мг/кг NΑ200+М^200 = ΝΑ 200 мг/кг+ МБ 200 мг/кг *Р<0,05 относительно С контроля **Р<0,005 относительно С контроля $Р<0,05 относительно ΝΑ в такой же дозе &Р<0,05 относительно МБ в такой же дозе

Как показано ниже в табл. 2, комбинация ΝΑ и МБ дает статистически значимый эффект снижения содержания ЕБЬ-С и ТС и повышения содержания НБЬ-С. Для комбинированной дозы NΑ50+М^150, где ΝΑ вводился в такой дозе, которая не оказывает значительного действия на содержание липидов, суммарный эффект неожиданно оказался выше эффекта от каждого вещества в отдельности. Это особенно заметно по атеросклеротическому показателю и отношению общий холестерин/НБЬ-С, где наблюдался синергизм действия ΝΑ и МБ.

- 5 021344

Таблица 2. Влияние испытуемых веществ на липиды в сыворотке п=7-10, среднее значение ±СОИ

Группа	Общий С, мг/дл	НОЮ, мг/дл	юь-с, мг/дл	Показатель, иХ-С/НОЬС	Отношение общий С/НйЬ-С	те, мг/дл
Контрольная	66,514,5	5713,4	9,712,1	0,17±0,04	1,1710,04	22,1 12.19
С контрольная	161110,4	5015,0	11019,9	2,12Ю,25	3,1310,23	48,814,93
ΝΑ5Ο мг/кг	15619,4	5615,2	10016,9	1,7810,19	2,7710,18	37,814,56
ΝΑ200	153111,1	5914,7	93±8,3	1,6310,15*	2,6010,2*	31,714,21
1УЮ50 мг/кг	15719,5	5415,0	10217,5	1,9710,20	2,9410,2	44,314,84
Μϋ 150 мг/кг	153111,8	59±5,0	9419,1	1,6510,18*	2,6310,18*	42,914,62
Μϋ200 мг/кг	151111,1	5613,9	95110,0	1,7210,20	2.70Ю.2	42,113,35
ΝΑ50+ΜΡ50	156110,2	58±5,5	9717,9	1,7110,23	2.72Ю.23	40,113,75
ΝΑ50+Μ0150	14818,9	6515,7	8314,4^	1,3110,09**	2,ЗОЮ,08*”	36,112,23
ΝΑ200+Μϋ200	15217,1	6715,2*	8515,1*	1,2910,11**	2,31Ю,12*	33,612,45⁴

ΝΑ50+ΜΌ50 = ΝΑ 50 мг/кг+ ΜΌ 50 мг/кг ΝΑ50+ΜΌ150 = ΝΑ 50 мг/кг+ ΜΌ 150 мг/кг ΝΑ200+ΜΌ200 = ΝΑ 200 мг/кг+ ΜΌ 200 мг/кг *Р<0,05 относительно С контроля **Р<0,005 относительно С контроля Р<0,0005 относительно С контроля $Р<0,05 относительно ΝΑ в такой же дозе &Р<0,05 относительно ΜΌ в такой же дозе

В другой серии экспериментов активность против атеросклероза комбинации настоящего изобретения оценивали более подробно, и кроме того, в комбинацию также добавляли известный антилипидемический препарат, §1. При отдельном использовании ΝΑ и ΜΌ, проявлялась тенденция к уменьшению площади повреждения (табл. 3). Неожиданно, что комбинация ΝΑ+ΜΌ дает значительно более высокое и статистически значимое защитное действие против атеросклеротического повреждения, чем каждое вещество в отдельности. Добавление комбинации настоящего изобретения к §1 дополнительно увеличивает активность защитного действия против атеросклеротического повреждения.

Таблица 3. Влияние испытуемых веществ на атеросклеротическое повреждение аорты п=7-9; среднее значение ±СОИ

Группа	Площадь повреждения в дуге аорты, мкм²	Площадь повреждения аорты, %
Контрольная	29,4114,8**	0,0110,01’
С контрольная	64161860	5,97Ю,89
ΝΑ 50 мг/кг	50011726	4,5210,64
Μϋ 150 мг/кг	41891628	3,5810,67*
3110 мг/кг	28191447**	2,67Ю,36**
ΝΑ50+Μϋ150	24131442*®	2,2810,40***
ΝΑ50+Μϋ50+5Ι10	22631314**”	2,1910,30**”

ΝΑ50+ΜΌ150 = ΝΑ 50 мг/кг +ΜΌ 150 мг/кг.

ΝΑ50+ΜΌ50+§Ι10 = ΝΑ 50 мг/кг + ΜΌ 50 мг/кг + §1 10 мг/кг *Р<0,05 относительно С контроля.

**Р<0,005 относительно С контроля.

#Р <0,0005 относительно С контроля.

$Р<0,05 относительно ΝΑ.

&Р<0,05 относительно ΜΌ

- 6 021344

В такой же экспериментальной серии определяли общий холестерин, НЭЬ-С, ЬОЬ-С и ТО в сыворотке. Как показано ниже в табл. 4, при отдельном использовании ΝΑ и ΜΌ только незначительно улучшают отношение холестериновых фракций и показатель атеросклероза без статистической значимости. Неожиданно, что комбинация ΝΑ и ΜΌ значительно улучшает отношение холестериновых фракций и статистически значимо снижает показатель атеросклероза и отношение общийС/ННЬ-С. Кроме того, указанная комбинация предупреждает увеличение ЬОЬ-С и ТО в сыворотке. Таким образом, комбинация согласно изобретению оказывает значительно более высокое защитное действие против изменений в метаболизме липидов, чем компоненты комбинации, взятые отдельно. Выраженное защитное действие сохраняется также в тройной комбинации с 81.

Таблица 4. Влияние испытуемых веществ на липиды в сыворотке п=7 - 9, среднее значение ±СОИ

Группа	Общий С, мг/дл	НОЬ-С, мг/дл	иэь-с, мг/дл	Показатель, их-с/ною	Отношение общий С/НОЮ	тс, мг/дл
Контрольная	66,8*3,7’	58±3,4	8,7*1,94'	0,15*0,03’	1,150,03	'22,81,82
С контрольная	167*8,64	54±4,7	113±8,4	2,24*0,25	3,23*0,24	52,2*3,98
ΝΑ 50 мг/кг	158*9,9	57±5,2	100*7,6	1,76*0,21	2,75*0,19	41,0*4,62
Мй 150 мг/кг	159*7,8	62±4,1	95±8,2	1,58*0,21	2,60*0,21	44,2*4,05
5Ι 10 мг/кг	132±9,9‘	55±5,0	776,7	1,40,08	2,40,08	47,7*3,73
ΝΑ50+Μ0150	1397,5	60±6,1	79±6,2‘	1,320,20*	2,300,20	39,53,96
ΝΑ50+ΜΟ50+3Π0	1417,3	61±5,5	80±5,7‘	1,310,16*	2,300,16*	42,2*3,65

ΝΑ50+ΜΌ150 = ΝΑ 50 мг/кг+ΜΌ 150 мг/кг

ΝΑ50+ΜΌ50+8Ι10 = ΝΑ 50 мг/кг+ΜΌ 50 мг/кг + 81 10 мг/кг) *Р<0,05 относительно С контроля.

#Р <0,0005 относительно С контроля.

$Р<0,05 относительно ΝΑ

В еще одной серии экспериментов, в сравнительную оценку были включены комбинации ΝΑΜτ и ΝΑ+8Ι (табл. 5). Комбинация ΝΑΜ была сопоставлена с ΝΑ на петушках (ВшьГеш 1., Те1кка Α., Лба Ра1Ьо1. ΜίοΓοόίαΙ 8сапб. 1962; 56:261-265). Комбинация ΝΑ (50 мг/кг) и ΜΌ (150 мг/кг) показала наиболее выраженное положительное действие в отношении аорты, лучше чем ΝΑ и ΝΑΜτ^-, а также превосходит эффект от комбинации 8Ι и ΝΑ, использованной в дозе, основанной на клиническом опыте (РапШап А. и др., Уакс. НеаЙЬ Кгкк Уапад. 2008; 4(5):1001-1009).

Таблица 5. Влияние испытуемых веществ на атеросклеротическое повреждение аорты п=7-9; среднее значение ±СОИ

Группа	Площадь повреждения в дуге аорты, мкм²	Площадь повреждения аорты, %
Контрольная	3519,8“	0,020,01“
С контрольная	6216*839	5,75*0.82
ΝΑ 50 мг/кг	4978*688	4,23*0,67
ΝΑΜγ 60 мг/кг	4053518	3,390,44
МЭ 150 мг/кг	3904489	3,470,45
ΝΑ50+Μ0150	2105*215“’®”	1,95*0,30“’®”
ΝΑ50+3Ι2	3068297	2,670,48
ΝΑ50+ΜΌ150	= ΝΑ 50 мг/кг + ΜΌ 150 мг/кг

ΝΑ50+8Ι2 = ΝΑ 50 мг/кг +8Ι 2 мг/кг *Р<0,05 относительно С контроля.

**Р <0,005 относительно С контроля. ***Р <0,0005 относительно С контроля. $Р<0,05 относительно ΝΑ.

@Р<0,05 относительно ΝΑΜκ &Р<0,05 относительно ΜΌ.

#Р<0,05 относительно ΝΑ50+8Ι2

- 7 021344

Подобно морфометрическим данным биохимические испытания подтвердили, что комбинация ΝΑ+ΜΌ значительно лучше, чем ΝΑ или ΝΑΜ§ нормализует содержание липидов (табл. 6).

Таблица 6. Влияние испытуемых веществ на липиды в сыворотке п=7-9, среднее значение ±СОИ

Г руппа	Общий С, мг/дп	НбБ-С, мг/дл	БбБ-С, мг/дл	Показатель, БбБ-С/НбБ-С	Отношение общий С/НбЕ-С	тс, мг/дл
Контрольная	67±3,9 '	56±3,0	7,811,83'	0,1410,03”	1,19±0,04	26,512,13”
С контрольная	164±9,2	50±3,8	10717,4	2,2110,18	3,3310,19	54,815,56
ΝΑ 50 мг/кг	158±8,7	57±4,7	96±6,2	1,7410,15	2,82±0,16	40,813,46'
ИАМд 60 мг/кг	151 ±9,6	55±4,0	9117,7	1,6710,12	2,7310,14	41,411,06'
Мб 150 мг/кг	15418,1	55±3,3	9515,5	1,7510,14	2,74±0,11	43,211,25
ΝΑ50+Μ6150	148±7,4	63±3,9	81 ±4,1'	1,31±0,1 Т*®⁴	2,3510,1ο”*®⁴	37,5±0,97'®⁴
ΝΑ50+3Ι2	14414,7	5814,4	82±4,8'	1,4910,12	2,5210,12”	42,411,74

ΝΆ50+ΜΌ150 = ΝΑ 50 мг/кг + ΜΌ 150 мг/кг.

ΝΑ50+8Ι2 = ΝΑ 50 мг/кг +81 2 мг/кг *Р<0,05 относительно С контроля.

**Р<0,005 относительно С контроля.

***Р <0,0005 относительно С контроля.

$Р<0,05 относительно ΝΑ.

@Р<0,05 относительно ΝΑΜτ.

&Р<0,05 относительно ΜΌ

Комбинация ΝΑ+ΜΌ подобна комбинации ΝΑ+8Ι при понижении содержания общего холестерина и БЭБ-С. но существенно превосходит ее по положительному влиянию на содержание НЭБ-С и ТС, а также оказывает более выраженное влияние на атеросклеротический показатель и отношение общий холестерин/НЭБ-С.

Указанная серия испытаний подтверждает, что комбинация ΝΑ и ΜΌ дает значительно улучшенный положительный результат в отношении экспериментального атеросклероза, чем ΝΑ или NΑΜг и лучше, чем применяемая клинически комбинация ΝΑ и 8Ι.

Пример 2. Влияние ΝΑ и ΜΌ, взятых отдельно и в комбинации, на липиды в крысиной модели гиперлипидемии

Методика.

Экспериментальную хроническую гиперлипидемию/гиперхолестеринемию индуцировали с помощью ТК, используя метод, описанный Ьеуше и 8аН/тап (Ьеуше 8., 8аЙ/тап Α., 1. Рйагтаео1. Τοχίοοί. Μοίΐι. 2007; 55:224-226). Животные получали раствор 250 мг/кг ТК через хвостовую вену три раза в неделю, в течение 3 недель. Растворы испытуемых веществ для экспериментальных групп или воду для Контрольной группы вводили л/о, один раз в день, за час до инъекции раствора ТК или взятия пробы крови. Самцы крыс ХУйГаг весом 220-240 г были распределены в следующих 8 группах:

Группа	Число животных, η
1. Контрольная	10
2. ТВ (ТВ 250 мг/кг)	14
3. ΝΑ (ТВ 250 мг/кг+ ΝΑ 50 мг/кг/д)	14
4. Мб (ТВ 250 мг/кг+ Мб 150 мг/кг/д)	14
5. ΝΑ+Мб (ΤπΙοη 250 мг/кг+ ΝΑ 50+Мб 150 мг/кг/д)	14
6. 8110 (ТВ 250 мг/кг+ 3110 мг/кг/д)	12
7. ΝΑ+3Ι2 (ТВ 250 мг/кг+ 5Ι 2 + ΝΑ 50 мг/кг/д)	12
8. ΝΑ+3Ι2+Μ6 (ТВ 250 мг/кг+ 8Ι 2 + ΝΑ 50 + Мб 150 мг/кг/д)	12

Биохимический анализ крови проводили через 1, 2 и 3 недели (на следующий день после инъекции ТК) путем пункции сердца под эфирным наркозом. Сыворотку отделяли путем центрифугирования и анализировали на содержание общего холестерина, НЭБ-С. БЭБ-С и ТС с помощью наборов, имеющихся в продаже.

- 8 021344

Статистика.

Полученные данные математически обрабатывали с использованием программы Μίοτοκοή Ехсе1 и результаты выражали как среднее значение ±СОИ. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного анализа ΑΝΟνΑ и критерия Стьюдента.

Различие результатов считалось значимым при Р<0,05.

Результаты. Повторные инъекции ТК приводили к развитию выраженной и стабильной гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, характеризующейся значительным увеличением общего содержания холестерина, БОБ и ТС по сравнению с контрольной группой. Терапевтическая обработка ΝΑ, более значительно в первую неделю, ограничивала увеличение общего холестерина, БОБ-С и ТС, но значительно повышала содержание НОЬ-С только через 2 и 3 недели. Мелдоний (ΜΌ) был немного менее активным для снижения содержания общего холестерина, ΕΌΕ-С и повышения уровня НОЬ-С, однако он не предупреждал повышение содержания ТС. Неожиданно, что комбинированное использование ΝΑ+ΜΌ более эффективно, чем отдельные компоненты, снижало содержание БОБ-С и ТС и, кроме того, увеличивало содержание НОЬ-С. Более того, при продолжительном использовании ΝΑ+ΜΌ (2 или 3 недели в указанном эксперименте) было продемонстрировано гораздо более выраженное снижение содержания БОБ-С и ТС и увеличение уровня НОЬ-С, чем при использовании ΝΑ +81 (смотрите ниже). Таким образом, можно ожидать, что комбинация ΝΑ+ΜΟ будет применяться в клинике для предупреждения и/или лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии.

Применение 81 в дозе 10 мг/кг значительно снижает увеличение общего холестерина и БОБ-С, индуцированного ТК, но только незначительно влияет на содержание НОЬ-С и ТС. Комбинированное использование 81 и ΝΑ в клинически приемлемом соотношении продемонстрировало значительную защиту от увеличения общего холестерина, БОБ-С и ТС в сыворотке и повышение содержания НОЬ-С. Неожиданно, что комбинированное использование ΝΑ, 81 и ΜΌ продемонстрировало еще лучшую защиту против изменений, индуцированных ТК, то есть, лучше чем эффект от каждого отдельного компонента, и значительно лучше, чем ΝΑ+8Ι для снижения содержания ТС и БОБ-С. Особенно важным наблюдением для клинической практики является то, что комбинация ΝΑ, 8Ι и ΜΌ увеличивает содержание НОЬ-С значительно лучше, чем 8Ι или ΝΑ в отдельности. Таким образом, можно ожидать, что комбинации ΝΑ+ΜΌ и ΝΑ+8Ι+ΜΌ будут применяться в клинике для предупреждения и/или лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии.

Таблица 7. Влияние ΝΑ, 8Ι и ΜΌ, взятых отдельно и в комбинации, на липиды в крысиной модели гиперлипидемии п=9-14: среднее значение ±СОИ

Группа	Общий холестерин через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
С1	С2	СЗ
Контрольная	77,614,9”'	75,1 ±5,1	72,712,5”
ТК	487,6125,4	501116,7	513141,1
ΝΑ	345115,7***	401,1125,1**	405,5125,9*
Μϋ	412124,7	414,7123,2*	401 ±22,8*
ΝΑ+Μϋ	340,5119,5“*®	360121,7***	346,4132,8**
81	314129,6***	329,5136,2**	335,7131,6**
ΝΑ+31	345,9127,5**	388,7132,3*	384,5133,9*
ΝΑ+31+Μϋ	333,5126,2***®	376,4123,1***	ЗЗЗДИЭ.З****®

Таблица 7 (продолжение)

Группа	НОЬ-С через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
Н0Ь-С1	НООС2	НОЬ-СЗ
Контрольная	54,611,9*	54,111,3	53,711,0*
ТК	76,316,9	76,2±11,4	77110,2
ΝΑ	111,319,1*	144,7113,5”	127,3110,9“
МО	107,318,4*	118,6110,3*	115,9±9,6*
ΝΑ+Μϋ	126,2111,1“	150,4111,2*“®’	136,9118,1*
31	84,5112,5	98,5120,5	94,4110,2
ΝΑ+5Ι	99±12,9	116,2±11,7*	114,9111,9*
ΝΑ+51+Μϋ	124,8118,2*	Ϊ5731Ϊ5⁷®	143,219,7*“

- 9 021344

Группа	ЮЮ через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
1.0001	ЮОС2	ίΟί-СЗ
Контрольная	18,713,8”	19,714,4	16,312,0“
ТР	388,7126,7	402,1119,2	405,1141,7
ΝΑ	216,3114,0*“	250,3120,6'	265,1118,4*
Μϋ	290,8121*	275122,3	270116,9*
ΝΑ+Μϋ	209,6116,7****	197,6115,4******	203,3120,3“*”
51	212124,1***	228,9120,6***	232,7±22,8“
ΝΑ+51	227,2126,1“*	272,5121,3“	268123,2*
ΝΑ+51+Μϋ	193,2116,5****	216,6117“**”	197,1116,6“’**
Г руппа	ТС через 1, 2 и 3 недели, мг/дл
ТО1	ΤΘ2	тез
Контрольная	3812,9'	3713,2'	3814,4”
ТР	1240180,1	1297178,3	12341114,1
ΝΑ	734181,6'	860173,8“	828144,7*
МО	1040191	1081163,2	1010172,5
ΝΑ+Μϋ	785162,9“	792173,8“	774139,2“**
31	849196,8*	879172,1“	8911129,1
ΝΑ+51	769169,2*“	868136,1“*	879131*
ΝΑ+51+Μϋ	734,4±95,7«	763136**’⁴	692145***”

*Р<0,05 относительно ТР.

**Р <0,005 относительно ТР.

***Р<0,0005 относительно ТР $Р<0,05 относительно ΝΑ. &Р<0,05 относительно ΜΌ.

#Р<0,05 относительно ΝΑ+8Ι

Пример 3. Определение кардиозащитных характеристик

Методика.

Самцов крыс ХУМаг распределяли по 6 группам (от 12 до 16 животных в группе):

1) Контрольная группа получала п/о 0,9%й солевой раствор;

2) группа ΝΑ50 получала п/о 50 мг/кг/день ΝΑ;

3) группа ΜΌ50 получала п/о 50 мг/кг/д ΜΌ;

4) группа ΝΑ50+ΜΌ50 получала п/о 50 мг/кг/д ΝΑ плюс 50 мг/кг ΜΌ;

5) группа ΜΌ150 получала п/о 150 мг/кг/д ΜΌ;

6) группа ΝΑ50+ΜΌ150 получала п/о 50 мг/кг/д ΝΑ плюс 150 мг/кг/д ΜΌ.

Животные испытуемых групп получали экспериментальные вещества в виде водных растворов через канюлю в желудок за 48, 24 и 1 ч до эксперимента. Животные контрольной группы получали такой же объем солевого раствора. Животных анестезировали (пентобарбиталом натрия 60 мг/кг, в/б) и при механическом газообмене в легких подготавливали к блокированию левой коронарной артерии. Экспериментальный инфаркт был вызван за счет закупорки коронарной артерии в течение 45 мин, с последующей реперфузией в течение 2 часов. Регистрировались следующие данные: количество животных с вентрикулярной тахикардией (УТ), вентрикулярной фибрилляцией (УР), летальность, среднее артериальное давление, произведение интенсивности давления (РРР), которое характеризует функциональное состояние сердечной мышцы, отражает получение аденозинтрифосфата (АТФ) в сердечной мышце и является широко применяемым показателем при анализе клинических и экспериментальных данных (Вгобспск Т.Ь., Эгидх Р Ό 2008; 9(2):83-91). После эксперимента определяли ишемическую и некротическую области с использованием метода перфузионного окрашивания синим красителем Эванса (трифенилдиазолиевый краситель). Левый желудочек разрезали, взвешивали и рассчитывали морфологические критерии: процент ишемической зоны левого желудочка, процент некротической зоны левого желудочка, и отношение некротической зоны к ишемической зоне (показатель некроза).

Статистика.

Результаты представляли как среднее значение ±СОИ для каждой группы. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Данные, полученные при регистрации кро- 10 021344 вяного давления и частоты сердечных сокращений, рассчитывали для животных, выживших в ишемически-реперфузионном эксперименте. Количество случаев аритмии (УТ и УР) и летальность рассчитывали для всех животных. Различия между экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'8). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты. Сердечная ишемия с последующей реперфузией вызывает серьезные нарушения сердечного ритма в контрольной группе с 7 летальными исходами в группе из 16 животных. Группа ΝΑ незначительно отличалась от контрольной группы относительно нарушений ритма. В группах ΜΌ и ΝΑ +ΜΌ наблюдались менее выраженные опасные для жизни нарушения ритма (УР и УТ) относительно контроля, однако летальность была значительно ниже только в группах ΝΑ50+ΜΌ50 и ΝΑ50+ΜΌ150 (табл. 8).

Таблица 8. Влияние испытуемых веществ на нарушения сердечного ритма и летальность в ходе закупорки и реперфузии коронарной артерии

Группа	η	Вентрикулярная тахикардия	Вентрикулярная фибрилляция	Летальность
η	%	η	%	η	%
1/К контроль	16	16	100	13	81,3	7	43,8
ΝΑ50	12	12	100	8	66,7	3	25
Μϋ50	12	11	91,7	7	58,3	3	25
Μϋ150	12	10	83	7	58,3	2	17
ΝΑ50+Μϋ50	12	10	83	6	50	1*	8,3

ΝΑ50+Μ0150	12	9	75	5	42	0*	0

*Р<0,05 относительно 1/К контроля

Среднее артериальное давление и частота сердечных сокращений были подобны во всех экспериментальных группах, однако падение КРР, отмеченное в контрольной группе, было статистически значимо предупреждено только в группах ΝΑ50+ΜΌ50 и ΝΑ50+ΜΌ150 во время реперфузии (табл. 9). Это указывает на существенную защиту от инфаркта, вызванного функциональным кровопусканием, уже после краткой (в течение 3 суток) предварительной обработки комбинированным лекарственным препаратом изобретения.

Таблица 9. Влияние испытуемых веществ на произведение интенсивности давления (КРР) в ходе закупорки коронарной артерии и реперфузии п=9-12; среднее значение ±СОИ

Группа	Исходное значение	Закупорка 45 мин.	Реперфузия 120 мин.
Ι/Р контроль	44,2±3,0	39,7±2,3*	34,2±2,1”
ΝΑ	43,1 ±2,8	40,4±2,7	36,0±1,3⁵
Μϋ50	44,8±1,7	41,5±2,9	37,611,9*
М6150	44,3±1,8	40,3±2,5	37,9±1,8
ΝΑ50+Μϋ50	42,7±3,1	40,5±1,9	38,6±1,8*
ΝΑ50+ΜΡ150	43,9±2,7	41,2±1,8	40,1±1,6‘*

*Р<0,05 относительно 1/К контроля.

**Р<0,005 относительно 1/К контроля &Р<0,05 относительно исходного значения.

#Р<0,01 относительно исходного значения

Указанное также подтверждается статистической значимостью уменьшения процента некротической зоны в левом желудочке и в ишемической зоне (табл. 10) для комбинированных лекарственных препаратов, содержащих ΝΑ+ΜΌ в обеих комбинациях дозировки.

- 11 021344

Таблица 10. Влияние испытуемых веществ на морфологию сердца крыс, претерпевших закупорку коронарной артерии и реперфузию п=9-12; среднее значение ±СОИ

Группа	Левый желудочек, мг	Ишемическая зона/левый желудочек, %	Некротическая зона/левый желудочек, %	Показатель некроза,%
1/(7 контроль	872.9125,1	48,412,4	34,412,8	70,913,7

ΝΑ	880,4125,2	47,011,4	29,812,4	63,013,9
Μϋ50	878,9148,1	48,411,5	28,413,1	58,414,3
Μϋ150	873,2141,8	48,111,9	28,111,8*	58,212,9*
ΝΑ50+Μϋ50	887,6122,3	46,811,6	22,8±1,9***	49,112,1**»
ΝΑ50+Μϋ150	867,0±31,5	47,712,1	21,511,3**»	45,612,6*»

*Р<0,05 относительно Ι/Р контроля **Р<0,005 относительно Ι/Р контроля Р<0,0005 относительно Ι/Р контроля &Р<0,05 относительно ΜΌ при той же дозе $Р<0,05 относительно ΝΑ.

Показатель некроза = (некротическая зона/ишемическая зона) х 100

Таким образом, неожиданно установлен высокий уровень защиты от развития инфаркта миокарда путем синергетического действия комбинированного лекарственного препарата ΝΑ и ΜΌ. Комбинация (ΝΑ+ΜΌ) в значительной степени сохраняет функции сердечной мышцы, повышая степень выживаемости животных (табл. 8, 9), причем более значительно, чем ΝΑ и ΜΌ в отдельности, защищает сердечную мышцу от некроза, вызванного ишемией и реперфузией (табл. 10).

Пример 4. Определение антигипоксических и антиишемических эффектов в мозгу

Были проведены дополнительные эксперименты с целью определения действия комбинированного лекарственного препарата ΝΑ и ΜΌ в экспериментальных моделях ишемии центральной нервной системы (ЦНС), гипоксии и инсульта по сравнению с эффектами отдельных компонентов.

4.1. Мышиная модель гипоксической недостаточности мозгового кровообращения

Методика.

Экспериментальная гипоксическая недостаточность кровообращения была индуцирована введением Μβί',Τ (2% Μ§01₂, доза 200 мг/кг) в течение 3 с, в хвостовую вену (Вегда Р. и др., Лг/псипШсИогесНипд 1986; 36(9): 1314-1320) самцов мышей 1СР. Животные получали испытуемое вещество или в виде отдельной дозы, или такую же дозу один раз в день в течение 7 суток. Испытуемые вещества вводили через внутрижелудочный катетер. Животных случайно распределяли в 7 группах (по 6 -10 животных в каждой): Контрольная группа получала воду 0,01 мл/г

Группа ΡΙ500 (активный контроль) получала дозу 500 мг/кг пирацетама

Группа ΝΑ50 получала дозу 50 мг/кг ΝΑ Группа ΜΌ50 получала дозу 50 мг/кг ΜΌ

Группа ΜΌ150 получала дозу 150 мг/кг ΜΌ

Группа ΝΑ50+ΜΌ50 получала дозу 50 мг/кг ΝΑ плюс 50 мг/кг ΜΌ

Группа ΝΑ50+ΜΌ 150 получала дозу 50 мг/кг ΝΑ плюс 150 мг/кг ΜΌ

Последнюю дозу испытуемого вещества давали за 1 ч до испытания. Период между концом инъекции Μ§Ο₂ и прекращением последнего респираторного движения регистрируют как время выживания.

Статистика.

Результаты представляли как среднее значение ±СОИ для каждой группы. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Различия между разными экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'8). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Результаты суммированы в табл. 11. При повторном введении был продемонстрирован защитный антигипоксический за счет клинического использования препарата ΡΙ, а также ΜΌ (табл. 11). Неожиданно, что комбинация ΝΑ+ΜΌ продемонстрировала значительную защиту уже после одноразового применения, особенно в дозировке ΝΑ50 + ΜΌ150, где эффект был лучше, чем от каждого вещества в отдельности. Повторное применение указанной комбинации дает еще более выраженный эффект. Полученные в этом испытании результаты указывают на возможное применение комбинации ΝΑ+ΜΌ для лечения

- 12 021344 гипоксических состояний в клинике.

Таблица 11. Влияние испытуемых веществ на гипоксическую недостаточность мозгового кровообращения в мышиной модели п=6-10; среднее значение ±СОИ

Испытуемая группа	Время выживания, с
Отдельная доза	7-дневная обработка
Контроль	25,75±1,01	25,4± 1,07
ΡΙ500	28,541,04	29,841,32*
ΝΑ50	27,340,68	27,840,86
МЭ50	26,541,07	28,941,20*
Μϋ150	27,040,93	29,841,19*
ΝΑ50+Μ050	30,8±1,44*’	32,641,18'**
ΝΑ50+Μϋ150	31,141,33***	34,441,50®*»

*Р<0,05 относительно контроля.

#Р <0,005 относительно контроля.

@Р <0,0005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно ΜΌ при такой же дозе.

&Р<0,05 относительно ΝΑ.

§Р <0,005 относительно ΝΑ

4.2. Модель закупорки средней артерии большого мозга

Методика.

Использовали самцов мышей 1СК с массой тела от 21 до 25 г. Начало средней артерии большого мозга (МСА) было закупорено с помощью методики нити, находящейся в просвете, по известному методу (Бонда Ε.Ζ. и др., §1токе 1989; 20: 84-91), приспособленному для мышей согласно публикации Ζΐκπίβ О. и др. (Вейауюита1 Вташ РезеагсН 2006; 169:66-74). Были использованы протоколы лечения в профилактическом (один раз в день в течение 7 суток, для модели постоянной закупорки МСА) и терапевтическом (начало обработки через 1 ч после временной закупорки МСА) режиме.

Контрольные животные получали только солевой раствор. Это испытание является хорошей моделью реального кровоизлияния в мозг и клинической ситуации инсульта, когда часто встречается закупорка средней артерии большого мозга. Затем эксперимент продолжался в соответствии с двумя протоколами. В первом - закупорка была постоянной. Во втором - закупорка с помощью нити, находящейся в просвете, была временной, причем нить удаляли через 2 ч и осуществляли реперфузию. Неврологическое состояние всех животных оценивали через 24 ч после закупорки. Оценку проводили с использованием балльной оценки, в которой 0 баллов получают животные без патологии, 4 балла - животные, неспособные к самопроизвольному движению (Бонда Ε.Ζ. и др., §1токе 1989; 20:84-91). После оценки неврологического дефицита животные получали слишком большую дозу пентобарбитала натрия, головной мозг изолировали и нарезали 6 слоев толщиной около 1,5 мм. Указанные слои окрашивали с помощью 2% натрий-трифенилтетразолия при 37°С в течение 30 мин и фотографировали. В качестве наиболее представительного участка для расчета ишемического повреждения мозга выбирали третий слой от краниальной стороны, на перекресте зрительных нервов, поскольку он полностью снабжается кровью из средней артерии большого мозга.

Статистика.

Данные представляли как среднее значение ±СОИ для 7-9 отдельных животных. Различия между экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'з). Различия неврологических оценок между группами анализировали с помощью критерия Стьюдента. Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Через 24 ч после закупорки у всех 8 контрольных животных проявлялись неврологические нарушения в среднем в 2,63 балла (табл. 12).

- 13 021344

Таблица 12. Влияние испытуемых веществ на неврологическое состояние в группе животных с постоянной закупоркой п=7-9; среднее значение ±СОИ

Испытуемая группа	Неврологическое состояние, баллы
Контрольная	2,63±0,38
Симуляционная	~ 0,14±0,14'
ΝΑ50 х 7	2,25±0,25
Μϋ150 х 7	1,63±0,29
ΝΑ50+Μ0150 х 7	1,38±0,26*⁸

*Р<0,05 относительно контроля.

#Р <0,0005 относительно контроля.

&Р<0,05 относительно ΝΑ

В симуляционной группе только у одного животного наблюдалось незначительное нарушение. Повторное применение ΜΌ в течение 7 суток частично предупреждало ухудшение неврологического состояния, вызванного действием закупорки МСА. Неожиданно, комбинация ΝΑ+ΜΌ обеспечивала значительную защиту от неврологических нарушений, которая превышала эффект ΝΑ (табл. 12).

Закупорка средней артерии большого мозга вызывала в контрольной группе животных ишемическое поражение, охватывающее 22,1% области мозговой ткани, на перекресте зрительных нервов (табл. 13). Применение комбинации ΝΑ+ΜΌ в течение 7 суток обеспечивало значительную защиту от поражения мозговой ткани, которая превышала эффект индивидуального ΝΑ.

Таблица 13. Влияние применения испытуемых веществ в течение 7 дней на размер зоны поражения мозга ишемическим инфарктом при постоянной закупорке в группе животных п=7-9; среднее значение ±СОИ

Испытуемая группа	Зона ишемического поражения, %
Контроль	22,2±2,21
ΝΑ	19,0±1,75
Μϋ	16,9±1,82
ΝΑ50+Μϋ150	12,9±1,54‘^к

*Р <0,005 относительно контроля.

&Р<0,05 относительно ΝΑ

В следующем эксперименте временная закупорка средней артерии большого мозга в течение 2 ч с последующей реперфузией привела к серьезным нарушениям функций мозга в контрольной группе животных, испытанных через 24 ч (табл. 14). Введение испытуемых веществ через 1, 3 и 6 ч после закупорки не обеспечивает значительной защиты ни в группе ΝΑ25 (25 мг/кгх3), ни в группе ΜΌ75 (75 мг/кгх3). Неожиданно, что только в группе ΝΑ25+ΜΌ75 (25 мг/кг + 75 мг/кг) с испытуемой комбинацией, введенной 3 раза после закупорки, получена значительная защита функций мозга, значительно превышающая эффект от индивидуальных ΝΑ и ΜΌ (табл. 14).

Таблица 14. Терапевтический эффект испытуемых веществ на неврологические функции после временной закупорки п=7-9; среднее значение ±СОИ

Испытуемая группа	Неврологическое состояние, баллы
Контроль	2,75±0,31
Симуляционная группа	0,29±0,18’
ΝΑ25	2,25±0,16
Μϋ75	2,13±0,23
ΝΑ25+ΜΟ75	1,44±0,18‘“*

*Р<0,005 относительно контроля. #Р <0,0005 относительно контроля $Р<0,05 относительно ΜΌ. &Р<0,05 относительно ΝΑ

- 14 021344

Морфометрический анализ показал, что индивидуальные ΝΑ или МБ не дают значительной защиты от поражения мозговой ткани, вызванного временной закупоркой и реперфузией МСА (табл. 15). Неожиданно, что комбинация ΝΑ+МБ (25 мг/кг+75 мг/кг), введенная сразу после закупорки, обеспечивает существенную защиту от поражения мозговой ткани, значительно превышающую эффект от индивидуальных ΝΑ и МБ (табл. 15).

Таблица 15. Терапевтический эффект испытуемых веществ на размер зоны ишемического поражения от временной закупорки в группе животных п=7-9; среднее значение ±СОИ

Испытуемая группа	Зона ишемического поражения, %
Контроль	22,3±1,3
ΝΑ25	18,9±1,8

1УЮ75	18,211,3
ΝΑ25+ΜΟ75	13,311,7**¹

#Р <0,005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно МБ.

&Р<0,05 относительно ΝΑ

Таким образом, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что комбинация ΝΑ плюс МБ обеспечивает значительно лучшую защиту функциональных и морфологических повреждений мозговой ткани, чем отдельные компоненты, при терапевтическом использовании или до, или после закупорки МСА. Эти результаты указывают, что комбинированный лекарственный продукт может быть полезен при лечении и/или предупреждении ишемически-гипоксических состояний ЦНС, включая инсульт, также благодаря собственной ингибирующей активности в испытаниях агрегации тромбоцитов и тромбоза, которые описаны ниже.

Активность против агрегации тромбоцитов и антитромботическая активность

Испытания: Агрегация тромбоцитов ίη νίΐτο; модель тромбоза у крыс ίη νίνο; регистрация изменений температуры кожи ίη νίνο.

Пример 5. Влияние МБ и ΝΑ на агрегацию тромбоцитов

Методика. Агрегацию тромбоцитов исследовали в цельной крови, полученной от здорового донора В. (возраст 37 лет), который не принимал Α8Α или какие-либо другие антитромбоцитные средства, с использованием прибора Ми1йр1а1е (Многофункциональный анализатор тромбоцитов, фирма БупаЬу1е Мебюа1, Германия) по методу, разработанному Τοίΐι О. и др. (ТЬтотЬ. Наето51. 2006; 96:781-788) и Vе1^к8а1сЬпег С. и др. (ΑηοδΐΕ Αη;·ι1§. 2008; 107: 1798-1806). Пробы крови собирали в пластиковые пробирки, покрытые антикоагулянтом - гирудин (БупаЬу1е Мебюа1, Сегтапу), и использовали для измерений между 30 мин и 4 ч после отбора крови. Измерения проводили согласно модифицированному протоколу фирмы БупаЬу1е Мебюа1. Подогревали до 37°С изотонический раствор хлорида натрия (0,3 мл, или физиологический раствор исследуемых веществ (в окончательной концентрации от 10^-6 до 10^-4 ммоль/мл), и добавляли из пипетки в испытуемые клетки и вводят пробу 0,3 мл цельной крови, содержащей антикоагулянт - гирудин. Измерения начинают через 5 мин после инкубации и перемешивания при 37°С, путем добавления раствора соответствующего агониста (получены от фирмы БупаЬу1е Мебюа1, Сегтапу):

1) аденозиндифосфат (ΑΌΡ) - ΑΌΡ-тест. ΑΌΡ стимулирует активацию тромбоцитов под действием ΑΌΡ рецепторов (Ρ2Υ12 и другие).

2) тест ΑΌΡ Н8 (простагландин Е₁ в комбинации с ΑΌΡ). Добавка эндогенного ингибитора ΡСΕ1 делает тест ΑΌΡ Н8 более чувствительным по сравнению с тестом ΑΌΡ.

Кривые агрегирования регистрировали в течение 6 мин и анализировали с использованием программного обеспечения БупаЬу1е Мебюа1. Были рассчитаны следующие параметры агрегации тромбоцитов:

1) Αтаx, максимальное значение агрегации тромбоцитов, выраженное в условных единицах (Αυ) агрегирования;

2) Αυϋ, общая площадь под кривой агрегирования ^^мин). На величину площади влияет общая высота кривой агрегирования, а также наклон кривой, причем ΑυС наилучшим образом выражает суммарную активность тромбоцитов.

Статистика. Результаты выражали как среднее значение ±СОИ. Для оценки значимости отклонений использовали однофакторный анализ ΑΝΟνΑ. Если недействительная гипотеза отклонена, то после этого используют тест 81ибеп1-№\утап-1<еи15.

Результаты.

Первая серия испытаний была спланирована с целью определения влияния различных концентра- 15 021344 ций препаратов. Как показано в табл. 16, ΜΌ в широком диапазоне концентраций обеспечивает значительную защиту от агрегации тромбоцитов, вызванной действием Л^Ρ+ΡСЕ1. Величина Αтаx снижается от 100% в контрольной группе до 55-58% в группах ΜΌ 10^-5 и 10^-4. Никотиновая кислота (в группах 10^-4и 10^-3 ммоль/мл) также уменьшает агрегирование, вызванное действием ΑΌΡ. Комбинированное действие обоих веществ обеспечивает более высокое и выраженное снижение агрегации тромбоцитов, вызванное действием ΑΌΡ или ΑΌΡ+РСЕ!, что проявляется в величинах ΑΌΟ, а также Αтаx.

Таблица 16. Индивидуальное и комбинированное действие ΜΌ и ΝΑ на индуцированную ΑΌΡ и ΡСЕ₁+Л^Ρ агрегацию тромбоцитов; среднее значение ±СОИ; Ν=5-8

**Р <0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

***Р<0,00005 относительно контроля.

#Р <0,005 относительно ΜΌ 10^-4.

^##Р <0,0005 относительно ΜΌ 10^-4.

$Р<0,005 относительно ΝΑ 10^-4.

$$Р <0,0005 относительно ΝΑ 10^-4

Пример 6. Влияние ΜΌ и ΝΑ на тромбоз

Методика. Авторы изобретения выбрали экспериментальную модель тромбоза на основе артериального тромбоза крыс, индуцированного действием РеС1₃ (Киг/ Κ. и др., ТЬготЬ. Кек. 1990, 60:269-280, Уаид X., Хи Ь, ТЬготЬ. Кек. 2005, 115:95-100). Повреждение ткани, инициированное химическим окислением при опосредствованном действии железа, вызывает прилипание поврежденной области и агрегирование тромбоцитов с последующей активацией коагуляции и осаждением фибрина. В экспериментах использовали самцов крыс ХУМаг с массой тела 350-420 г. Крыс статистически разделяли по различным экспериментальным группам, в каждой из которых содержалось не менее семи животных. Носитель или испытуемое соединение ΜΌ (25 мг/кг), ΝΑ (25 мг/кг) и комбинация ΜΌ+ΝΑ (25+25 мг/кг) были введены через рот, за 2 ч до инициирования тромбоза.

Крыс анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, в/б) и в течение эксперимента держали на терморегулируемом столе, для поддержания температуры тела, равной 37°С. Одну из каротидных артерий подвергали разрезанию на шее, отделяли от примыкающей ткани, блуждающего нерва, и помещали датчик потока (электромагнитный измеритель кровотока ΜΡν 1200, №сои КоМеи, .Гараи) на обнаженном сегменте обычной каротидной артерии, чтобы регистрировать кровоток. Через 15 мин периода стабилизации индуцировали тромбоз путем местного наложения (в контакте с адвентициальной поверхностью сосуда) двух кусков (2x1 мм) фильтровальной бумаги УЬаГтаи, пропитанной 15% раствором РеС1₃. Время тромбоза каротидной артерии регистрировали как время, необходимое для полного прекращения кровотока, и записывали как время до закупорки (ТТО).

Кроме того, в ходе экспериментального тромбоза измеряли время кровотечения из хвоста крыс. На хвосте делали поперечный надрез скальпелем (на расстоянии 5 мм от конца), и хвост погружали непосредственно в теплый (37°С) изотонический физиологический раствор до момента прекращения кровотечения. Прекращение кровотечения определяли как время полной остановки кровотечения, без возобновления кровотечения в течение следующих 30 с.

Статистика.

Результаты обрабатывали с использованием программы Μ^с^οкοй Ехсе1 2007. Данные выражали как среднее значение ±СОИ из измерений на 7 -8 отдельных животных. Различия между эксперименталь- 16 021344 ными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'з). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты. Среднее время для индуцированного РеС1₃ тромбоза артерии, с результирующей остановкой артериального кровотока, в контрольной группе составляет 24,4 мин (табл. 17).

Таблица 17. Влияние ΜΌ, ΝΑ и их комбинации на индуцированный РеС1₃ тромбоз среднее значение ±СОИ; Ν= 7-8

Группа	Время до закупорки	Время кровотечения хвоста
МИН.	%	МИК.	%
Контрольная	2Л,4±1,45	100	8,9±1,28	100
Μϋ 25 мг/кг	29,8±2,29	122	10,5±1,01	118
ΝΑ 25 мг/кг	30,3±3,12	124	11,5*1,39	129
Μϋ+ΝΑ (25+25 мг/кг)	34,0±2,78*	139	11.4*1,42	128

*Р<0,05 относительно контроля

Мелдоний в дозе 25 мг/кг не обеспечивает значительное увеличение времени ТТО. Никотиновая кислота вызывает небольшое увеличение ТТО, которое не является значимым. Влияние ΝΑ на время кровотечения хвоста является аналогичным. Комбинированное использование ΜΌ и ΝΑ неожиданно вызывает весьма значительное увеличение ТТО (39%), без существенного увеличения времени кровотечения хвоста.

Учитывая положительный эффект для комбинации ΜΌ и ΝΑ против агрегации тромбоцитов ίη νίίΓΟ и продление времени ТТО ίη νίνο, указанная комбинация может найти применение для уменьшения риска тромбоза у пациентов с выраженным атеросклерозом, потенциальным инфарктом миокарда и инсультом, а также в послеоперационный период. Тот факт, что комбинация ΜΌ и ΝΑ не пролонгирует время кровотечения хвоста, указывает на возможное применение этой комбинации для пациентов с увеличенным риском кровотечения в период до и после операции.

Пример 7. Сравнительное исследование комбинированного применения ΜΌ/ΝΑ и ΡΑ/ΝΑ для уменьшения прилива крови

Никотиновая кислота (ниацин, ΝΑ) эффективно снижает уровень сывороточного холестерина, ЬВЬ и триглицеридов при увеличении ΗΩΡ Однако ограничивающим неблагоприятным эффектом у пациентов, получающих никотиновую кислоту непосредственно или в виде длительного выделения, является быстрое развитие значительного кожного тепла и расширения сосудов, называемое приливом, что приводит к болезненному прекращению (Сир1а Е.К., Ιΐο Μ.Κ., НеаК Όίδ. 2002,4:124-137). В качестве одного из наиболее активных и перспективных препаратов для снижения прилива крови под действием ниацина был предложен Ларопипрант (МК-0524) (СКепд К. и др., ΡΝΑ§ 2006; 103:6682-6687). Целью настоящего исследования было сопоставление влияния ΜΌ и на прилив крови (изменения температуры кожи и кровоток), вызванный действием ΝΑ в эксперименте.

7.1.1. Определение расширения кожных сосудов

Модель.

Самцов крыс \νίδΙ;·ΐΓ анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, в/б) и держали под наркозом, вводя дополнительные дозы (10 мг/кг) каждый час. Кровяное давление измеряли в левой каротидной артерии, электрокардиограмму (ЕСС) записывали с помощью стандартного проводника II. Кровоток в правой ушной артерии определяли с помощью лазерного допплеровского измерителя расхода (ОХУРЬОХУ 2000, υ§Α). Кровоток, ЕСС и артериальное давление регистрировали с помощью системы ΑΌ 1п51гитеп(5 РотегЬаЪ, и данные хранили в компьютере для последующей обработки. После регистрации базового уровня в течение 10 мин испытуемые вещества вводили подкожно (п/к) в область загривка, и продолжали регистрацию в течение 30 мин. Данные среднего кровотока для каждого животного вычисляли, принимая во внимание среднее давление крови, и сопоставляли с начальным и контрольным значением. Результаты вычисляли для 5-8 отдельных экспериментов и выражали в %, как максимальное изменение кровотока относительно базового уровня (СагЪа11о-1апе Е. и др., ί. РКагтасо1. Тохюо1. ΜеΐЬοάδ 2007; 56(3): 308-316).

Статистика.

Результаты для каждой группы выражали как среднее значение ±СОИ. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента для непарных данных и критерия хиквадрат. Различия между каждой экспериментальной группой сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с повторными сравнениями (теста Тикеу'з). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

- 17 021344

Результаты.

Как можно увидеть ниже из табл. 18, никотиновая кислота в дозе 15 мг/кг вызывает значительное увеличение кровотока в ушной артерии для этой животной модели. МО подобно контролю вызывает незначительное варьирование кровотока. NΑ вместе с МО вызывает заторможенное (медленно возрастающее) и статистически значительно менее выраженное абсолютное увеличение кровотока по сравнению с одним NΑ (табл. 18). Потенциал МО для противодействия расширению периферических сосудов, вызванному действием NΑ, может иметь положительный результат в клинике для уменьшения кожных эффектов (прилив крови) от никотиновой кислоты, следовательно, это будет дополнительно подробно исследовано, как описано ниже.

Таблица 18. Влияние экспериментальных веществ на расширение кожных сосудов; среднее значение ±СОИ, Ν=5-8

Группа	Изменения кровотока, %
Контроль/растворитель	2,15±4,29
ΝΑ(15 мг/кг)	46,117,52’
Μϋ (45 мг/кг)	7,1513,72
ΝΑ+Μϋ (15+45 мг/кг)	19,3316,44*

*Р<0,01 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно NΑ

7.1.2. Определение расширения кожных сосудов Материалы и методики. См. раздел 7.1.

Программа эксперимента

ГРУППА ОБРАБОТКА

Количество животных

Растворитель для ΝΑ и Μϋ	5
ΝΑ	ΝΑ 15 мг/кг	7
Растворитель для ДА		5
ЬА	ЬА 0,3 мг/кг	6
ЬА+ΝΑ [0]	ЬА 0,3 μγ/κγ+ΝΑ 15 мг/кг	6
ЬА+ΝΑ [30]	ЬА 0,3 μγ/κγ+ΝΑ 15 мг/кг	7
МО	Μϋ 45 мг/кг	6
ΝΑ+Μϋ [0]	ΝΑ 15 мг/кг+Μϋ 45 мг/кг	6
ΝΑ+Μϋ [30]	ΝΑ 15 мг/кг+Μϋ 45 мг/кг	6

Статистика.

Результаты для каждой группы выражали как среднее значение ±СОИ. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Различия между каждой экспериментальной группой сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с повторными сравнениями (тест Тикеу'к). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

При индивидуальном введении МО подобно ЬА вызывал лишь незначительные изменения кровотока. Когда NΑ давали одновременно с МО (время упреждения = 0), подъем кровотока был медленнее и выражен слабее, чем в случае одновременного назначения NΑ и ЬА (ЬА +NΑ [0], см табл. 19). Отсутствовали значительные различия ушного кровотока между МЭ+КА [0] (когда МО добавляли вместе с NΑ) и МЭ+КА [30] (предварительная обработка мелдонием 45 мг/кг за 30 мин до NΑ). В эксперименте изобретения только при предварительной обработке ЬА, за 30 мин до NΑ (NΑ+^Α [30]) значительно снижался индуцированный NΑ подъем кровотока в ушных сосудах крысы (табл. 19).

Таблица 19. Влияние МО и ЬА на индуцированное NΑ расширение кожных сосудов;

Ν=5-7, среднее значение ±СОИ

Группа	Изменения кровотока, %
Растворитель для ΝΑ и Μϋ	2,1211,66”
ΝΑ	52,2718,5“

- 18 021344

**Р<0,005 относительно растворителя.

$Р<0,05 относительно ΝΑ.

^$$Р<0,005 относительно ΝΑ

Потенциал МО в отношении противодействия расширению периферических сосудов, вызванному действием ΝΑ, может иметь положительный результат в клинике для уменьшения кожных эффектов ΝΑ (прилив крови). В экспериментах изобретения невозможно оценить все преимущества одновременного приема комбинации ΝΑ и ΕΑ по сравнению с одновременным приемом ΝΑ и МО.

7.2. Оценка изменений температуры кожи, индуцированных никотиновой кислотой

Материалы и методики.

Для регистрации изменений температуры кожи интактных крыс использовали бесконтактный метод регистрации температуры (РараИоФз Ό. и др., Вг. 1. РНагтасо1. 2008; 153: 1382-1387). Измерения температуры проводили с использованием портативного инфракрасного термометра (Мойе1 Ргозсап 510, ΤΡΑЭоз1тап). Животных приучали к манипулированию и к инфракрасному датчику в течение 3 суток до исследования. Показания температуры на тыльной стороне каждого уха регистрировали три раза без обезболивания непосредственно до п/к инъекции или ΝΑ (в область загривка) или растворитель/испытуемое соединение (в область хвоста). Затем температуру уха замеряли каждые 5 мин в течение периода 60 мин. Между измерениями животных возвращали в клетки. Для каждого момента времени усредняли данные шести измерений температуры уха (по три для каждого уха). Ларопипрант [МК 0524, фирма Саутап СНет1са1з| (ΕΑ) сначала растворяли в диметилсульфоксиде, и затем свежий раствор разбавляли 0,9% раствором №С1, в каждый день эксперимента. Пропорция в комбинации ΝΑ и ΕΑ основана на Сводке характеристик продукта для таблеток модифицированного выделения Тгейарйуе™ 1000 мг/20 мг (никотиновая кислота/ларопипрант).

Программа эксперимента

I. Испытание влияния времени и растворителя на температуру кожи

ГРУППА	ОБРАБОТКА	Количество животных
Раств.ЬА	Растворитель для ίΑ	6
РаствИА	Растворитель для ΝΑ, МАЗА и Μϋ	6
ΝΑ	ΝΑ 15 мг/кг подкожно	6

II. Исследование влияния комбинаций ΝΑ/ΕΑ и ΝΑ/МО на температуру кожи

Ларопипрант вводили одновременно с ΝΑ в виде ΝΑ+ΕΑ [0] или за 30 мин до ΝΑ в виде ΝΑ+ΕΑ [30], МО вводили одновременно с ΝΑ в виде ΝΑ+МО [0] или за 30 мин до ΝΑ в виде ΝΑ+МО [30]; кроме того, регистрировали влияние индивидуальных ΕΑ и МО на температуру кожи.

ГРУППА ОБРАБОТКА Количество животных

Контрольная/растворитель 6

ΝΑ ίΑ

ΝΑ+ ЬА МЭ

ΝΑ+Μϋ

ΝΑ 15 мг/кг

ЬА 0,3 мг/кг

ΝΑ 15 мг/кг +ЬА 0,3 мг/кг Μϋ 45 мг/кг

ΝΑ 15 мг/кг + Μϋ 45 мг/кг е

6*

6*в каждой временной группе

Статистика.

Данные обрабатывали с использованием программы Мюгозой Ехсе1 и результаты выражали как среднее значение ±стандартная ошибка среднего. Средние результаты для различных групп сопоставляли с использованием однофакторного анализа ΑNОУΑ и критерия Стьюдента. Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

На базовом уровне средняя температура уха, регистрируемая с 10 до 14 ч, составляла 28,1-30,2°С. Исследование времени отклика на введение ΝΑ (15 мг/кг, п/к) показало максимальное увеличение температуры на 10-й мин, равное 2,32±0,37°С от базового уровня и 2,57±0,43°С по сравнению с группой Растворителя (Р <0,005) на 10-й мин (см. ниже). Установлено, что влияние ΕΑ/растворитель на темпера- 19 021344 туру уха существенно отличается от влияния ΝΑ и ΜΌ/растворитель только в первые 5 мин после инъекции, поэтому использовалась только одна контрольная группа.

Влияние ΝΑ, растворитель/ΝΑ и растворитель/ΌΑ на температуру уха крыс

Подкожная инъекция ΜΌ или ΌΑ не вызывает значительных изменений температуры уха крыс (табл. 21). Одновременный прием ΝΑ и ΜΌ (группа ΝΑ+ΜΌ [0]; время упреждения = 0) вызывает уменьшение прилива крови от ΝΑ, что подобно эффекту, который вызван одновременным введением ΝΑ и ΌΑ. Повышение температуры, вызванное действием ΝΑ, снижается соответственно на 69% и 67 % (табл. 21). Отсутствует значительное отличие температуры между группами ΜΌ+ΝΑ [0] (когда ΜΌ добавляется вместе с ΝΑ) и ΜΌ+ΝΑ [30] (предварительная обработка мелдонием 45 мг/кг за 30 мин до ΝΑ). В эксперименте изобретения только предварительная обработка ларопипрантом, который вводится п/к в дозе 0,3 мг/кг за 30 мин до инъекции ΝΑ, обеспечивает существенную защиту от повышения температуры кожи, индуцированного ΝΑ (табл. 21).

Таблица 21. Влияние ΌΑ и ΜΌ на повышение температуры кожи, вызванное действием ΝΑ;

Ν=6, среднее значение ±СОИ

Группа	Начальная температура ,°с	Максимальная температура, °С	Увеличение, %
Контрол ьная/растворитель	29,5±0,29	29,62±0,25***	-
ΝΑ	29,61 ±0,4	32,210,42’	100
ЬА	29,4310,27	29,510,35’**	-

ΝΑ+ΙΑ [0]	29,7210,31	31,4510,4	67
ΝΑ+ΙΑ [30]	29,5110,32	30,7310,34'* ^{ *}	47
Μϋ	29,4210,38	29,710,31***	-
ΝΑ+Μϋ [0]	29,5310,29	31,3310,48'	69
ΝΑ+Μϋ [30]	29,6810,26	31,4010,39'	65

*Р<0,05 относительно контроля.

**Р <0,005 относительно контроля.

***Р<0,0005 относительно контроля.

$Р<0,05 относительно ΝΑ.

$$$Р<0,0005 относительно ΝΑ

Таким образом, в изобретении установлено, что комбинация ΝΑ с ΜΌ не только обладает неочевидной синергетической антитромбоцитной активностью, но также подавляет побочный эффект - прилив крови.

Пример 8. Определение влияния на содержание сахара в крови

Хорошо известно, что даже единственная большая оральная доза ΝΑ увеличивает содержание глюкозы в крови животных (ТДогШоп ТН., 8с1ш11/ Ь.Н. I. Ό;ηγυ 8с1. 1980; 63, 262-268), причем для использования ΝΑ при лечении пациентов с диабетом требуется мониторинг содержания сахара (СоИЬегд К.В., 1асоЬ§оп Т.А, Μауο С1ш. Ргос. 2008; 83(4): 470-8).

Методика.

В экспериментах использовали взрослых самцов крыс \νίδΙ;·ΐΓ. Животных подвергали ночному голоданию до эксперимента для того, чтобы стабилизировать содержание сахара в крови. Содержание глюкозы в венозной крови определяли до эксперимента и через 45 мин после орального введения контрольной

- 20 021344 пробы или испытуемого вещества. Содержание глюкозы определяли с помощью стандартного набора (фирма Орбит, ΑЬЬой Э|аЬе1е5 Саге Ыб., υδΑ/ Использовали большую дозу ΝΑ (300 мг/кг, п/о), которая, как известно, вызывает стабильный и длительный рост содержания ОЬ в крови. Применяли такую же дозу ΜΌ (300 мг/кг).

Животных распределяли по 4 группам (п=8):

1) Контрольная группа получала 1% раствор №С1, доза 2 мл/кг)

2) группа ΝΑ получала ΝΑ, доза 300 мг/кг

3) группа ΜΌ получала ΜΌ, доза 300 мг/кг

4) группа ΝΑ+ΜΌ получала 300 мг/кг ΝΑ и 300 мг/кг ΜΌ.

Статистика.

Результаты представляли как среднее значение ±СОИ для каждой группы. Статистический анализ внутри групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Различия между любыми экспериментальными группами сопоставляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) с повторным сопоставлением (тест Тикеу'з). Вероятность Р<0,05 считалась значимой.

Результаты.

Никотиновая кислота вызывает статистически значимый рост содержания ОЬ относительно базового и контрольного уровня (табл. 22). ΜΌ вызывает незначительное снижение содержания ОЬ, которое не отличается от контроля. Комбинация ΝΑ и ΜΌ вызывает значительно менее выраженный рост содержания ОЬ (изменение относительно базового уровня 27,5%, по сравнению с 61,1%, вызванное действием ΝΑ). Этот положительный эффект указывает, что комбинированный лекарственный продукт ΝΑ+ΜΌ может вызывать менее выраженные побочные эффекты у пациентов с нестабильным или нарушенным глицемическим контролем.

Таблица 22. Влияние испытуемых веществ на содержание глюкозы в крови крыс; п=8, среднее значение ±СОИ

Г руппа	Базовый уровень	Эксперимент	Изменение от базового уровня, %	% от контроля
Контрольная (солевой раствор)	3,8440,51	3,940,53	+1,6	0
ΝΑ	3,840,344	6,1240,42”'	+61,1	+56,9
Μϋ	3,9240,34	3,7240,31	-5,1	-4,6
ΝΑ+МЭ	4,03±0,349	5,1440,56	+27,5	+31,8

*Р<0,05 относительно контроля.

Р<0,01 относительно базового уровня

Краткие выводы

Неожиданно обнаружено, что комбинация ΝΑ и ΜΌ усиливает лечебное действие ΝΑ в отношении расстройств, включающих дислипидемию, гиперлипидемию, атеросклероз, ишемические болезни сердца, выбранные из группы: стенокардия и инфаркт миокарда, преходящее и постоянное нарушение мозгового кровообращения, в том числе цереброваскулярное расстройство и инсульт, и периферическое окклюзионное поражение артерии, улучшая состояние сердца и мозга в ишемически-гипоксических состояниях. Кроме того, указанная комбинация улучшает расширение периферических сосудов, вызванное действием ΝΑ. Поэтому можно ожидать, что новый комбинированный лекарственный продукт проявляет повышенную активность по сравнению с ΝΑ при лечении метаболически связанных нарушений, что позволяет снизить ежедневные дозы ΝΑ, и обладает менее выраженными нежелательными побочными эффектами.

Варианты воплощения изобретения

Термин комбинированный лекарственный продукт, используемый в изобретении, предполагает одновременное, последовательное или отдельное назначение компонентов указанной комбинации. Таким образом, настоящим изобретением является комбинированный лекарственный продукт, который содержит ΝΑ и ΜΌ или их фармацевтически приемлемые соли для одновременного, последовательного или раздельного применения для предупреждения агрегации тромбоцитов. Комбинированный лекарственный продукт, согласно изобретению, может назначаться в форме фармацевтической композиции. В соответствии с этим аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит ΝΑ или ее фармацевтически приемлемую соль и ΜΌ или его фармацевтически приемлемую соль в смеси с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также включает в себя отдельные композиции, содержащие первую композицию ΝΑ или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, и вторую композицию, содержащую ΜΌ или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Та- 21 021344 кая композиция предназначается для последовательного или раздельного применения. Поскольку лечение или предупреждение метаболически связанных заболеваний предполагает продолжительное использование лекарственного продукта, в наиболее предпочтительном способе осуществления изобретения предусматривается форма, подходящая для орального применения, например, в виде таблеток или капсул. Количество каждого активного компонента настоящего комбинированного лекарственного продукта в фармацевтической композиции может меняться в зависимости от состояния пациента. Специалисты в области лечения метаболически связанных заболеваний пациентов смогут легко выбрать соответствующее количество каждого активного компонента и подходящий режим дозирования. Предпочтительное соотношение активных компонентов ΝΑ и ΜΌ или их солей находится в диапазоне от 3:1 до 1:3.

Другим объектом данного изобретения является применение комбинированного лекарственного продукта, который описан выше, или его фармацевтической композиции, которая описана выше, для производства лекарственного препарата для одновременного, последовательного или раздельного назначения для предупреждения агрегации тромбоцитов/тромбоза.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Терапевтическая комбинация для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией и/или агрегацией тромбоцитов, содержащая эффективное количество никотиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и эффективное количество мелдония или его фармацевтически приемлемой соли.
2. Комбинация по п.1 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией, которые выбирают из группы, состоящей из гиперлипидемии, атеросклероза, окклюзионного поражения периферических артерий, стенокардии, инфаркта миокарда, цереброваскулярного расстройства и инсульта, индуцированных преходящим или постоянным ишемическим нарушением.
3. Комбинация по п.1 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных агрегацией тромбоцитов и включающих тромбоз и тромбоэмболию.
4. Применение комбинации по п.1 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией и/или агрегацией тромбоцитов, содержащей эффективное количество никотиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и эффективное количество мелдония или его фармацевтически приемлемой соли.
5. Применение комбинации по п.4 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией, которые выбирают из группы, состоящей из гиперлипидемии, атеросклероза, окклюзионного поражения периферических артерий, стенокардии, инфаркта миокарда, цереброваскулярного расстройства и инсульта, индуцированных преходящим или постоянным ишемическим нарушением.
6. Применение комбинации по п.4 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных агрегацией тромбоцитов, включающих тромбоз и тромбоэмболию.
7. Фармацевтическая композиция для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией, которые выбирают из группы, состоящей из гиперлипидемии, атеросклероза, окклюзионного поражения периферических артерий, стенокардии, инфаркта миокарда, цереброваскулярного расстройства и инсульта, индуцированных преходящим или постоянным ишемическим нарушением, которая содержит эффективное количество никотиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемую соль и эффективное количество мелдония или его фармацевтически приемлемой соли в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.
8. Композиция по п.7, которая дополнительно содержит статин, выбранный из группы аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, питавастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.
9. Композиция по п.7, которая содержит от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг никотиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг мелдония или его фармацевтически приемлемой соли.
10. Применение композиции по п.8 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией, которые выбирают из группы, состоящей из гиперлипидемии и атеросклероза.
11. Применение композиции по п.7 для предупреждения и/или лечения заболеваний, индуцированных дислипидемией, которые выбирают из группы, состоящей из гиперлипидемии, атеросклероза, окклюзионного поражения периферических артерий, стенокардии, инфаркта миокарда, цереброваскулярного расстройства и инсульта, индуцированных преходящим или постоянным ишемическим нарушением.