EA008180B1 - ГЕТЕРОАРИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, КОТОРЫЕ ИНГИБИРУЮТ ОПОСРЕДОВАННУЮ α-ИНТЕГРИНАМИ АДГЕЗИЮ ЛЕЙКОЦИТОВ - Google Patents

Abstract

Раскрываются соединения, которые связывают α-интегрины, где α-интегрином преимущественно является VLA-4. Некоторые из этих соединений ингибируют также адгезию лейкоцитов и, в частности, адгезию лейкоцитов, опосредованную α-интегринами, где α-интегрином преимущественно является VLA-4. Указанные соединения полезны при лечении воспалительных заболеваний у пациентов млекопитающих, например у человека, таких как астма, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, вызванная СПИД деменция, диабет, воспаление кишечника, ревматоидный артрит, трансплантация тканей, метастаз опухоли и ишемия миокарда. Соединения могут также вводиться при лечении воспалительных заболеваний головного мозга, таких как рассеянный склероз.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые ингибируют адгезию лейкоцитов, и в частности адгезию лейкоцитов, опосредованную а₄-интегринами, где а₄-интегрином предпочтительно является УЪА-4.

Следующие публикации, патенты и патентные заявки цитируются в данном описании в виде надстрочных цифр:

¹ Нет1ег апб Такаба, Еигореап Ра!еп! АррНсаНоп РиЬйсайоп Νο. 330,506, риЬйкйеб Аидик! 30, 1989.

² Ейсек, е! а1., Се11, 60:577-584 (1990).

³ 8ргтдег, №Ш.1ге. 346:425-434 (1990).

⁴ ОкЬот, Се11, 62:3-6 (1990).

⁵ Уеббег, е! а1., 8игдегу, 106:509 (1989).

⁶ Рге1о1ап1, е! а1., 1. Ехр. Меб., 180:795 (1994).

⁷ АЬгайат, е! а1., 1. Сйп. 1пуек!., 93:776 (1994).

⁸ МиШдап, е! а1., 1. 1ттипо1оду, 150:2407 (1993).

⁹ СуЬи1кку, е! а1., 8с1епсе, 251:788 (1991).

¹⁰ Ъ1, е! а1., Айегюкс1ег. ТйготЬ., 13:197 (1993).

¹¹ 8аккеуШе, е! а1., Ат. 1. Ра!й., 144:27 (1994).

¹² Уапд, е! а1., Ргос. Ν!. Асаб. 8с1епсе (И8А), 90:10494 (1993).

¹³ Вшк1у, е! а1., П1аЬе!ек, 43:529 (1994).

¹⁴ Вагоп, е! а1., 1. Сйп. 1пуек!., 93:1700 (1994).

¹⁵ Натапп, е! а1., 1. 1ттипо1оду, 152:3238 (1994).

¹⁶ Уебпоск, е! а1., №!иге, 356:63 (1992).

¹⁷ Вагоп, е! а1., 1. Ехр. Меб., 177:57 (1993).

¹⁸ уап Пш1йег-1апккеп, е! а1., 1. 1ттипо1оду, 147:4207 (1991).

¹⁹ уап Пт1йег-1апккеп, е! а1., Аппа1к. Кйеитайс Όίκ., 52:672 (1993).

²⁰ Ейсек, е! а1., 1. Сйп. 1пуек!., 93:405 (1994).

²¹ Рокйдо, е! а1., 1. Сйп. 1пуек!., 89:1445 (1991).

²² Раи1, е! а1., Тгапкр1. Ргосееб., 25:813 (1993).

²³ Окагйага, е! а1., Сап. Кек., 54:3233 (1994).

²⁴ Раауопеп, е! а1., 1п!. 1. Сап., 58:298 (1994).

²⁵ 8сйабепбог£, е! а1., 1. Ра!й., 170:429 (1993).

²⁶ Вао, е! а1., Όίί£., 52:239 (1993).

²⁷ Ьашт, е! а1., Вййкй 1. Сапсег, 68:862 (1993).

²⁸ КатадисЫ, е! а1., 1арапеке 1. Сапсег Кек., 83:1304 (1992).

²⁹ Копгаб1, е! а1., РСТ/и800/01686, Й1еб, 1апиагу 21, 2000.

Все приведенные выше публикации целиком включены в настоящее описание во всей своей полноте ссылкой в такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была специально и индивидуально указана для включения в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте.

УЪА-4 (также относящейся как к а₄Р1-интегрину, так и к СО49б/СО29), впервые идентифицированный Нет1ег и Такаба¹, является членом семейства рецепторов βι-интегринов, располагающихся на поверхности клетки, каждый из которых включает две субъединицы - α-цепь и β-цепь. УЪА-4 содержит α₄цепь и βι-цепь. Существует, по крайней мере, девять βι-интегринов, которые имеют одинаковую βι-цепь и каждый из которых имеет индивидуальную α-цепь. Все эти девять рецепторов связывают различный комплемент разнообразных молекул клеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин и коллаген. Например, УЪА-4 связывается с фибронектином. УЪА-4 связывает также нематриксные молекулы, которые экспрессируются эндотелиальными и другими клетками. Указанные нематриксные молекулы включают УСАМ-1, который экспрессируется в культуре активированных цитокином эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Отдельные эпитопы УЪА-4 отвечают за активность при связывании фибронектина и УСАМ-1, и было показано, что каждая активность ингибируется независимо.²

Внеклеточная адгезия, опосредованная УЪА-4 и другими рецепторами, располагающимися на поверхности клетки, связана с рядом ответных реакций на воспаление. На месте поражения или другого воспалительного раздражителя активированные эндотелиальные клетки сосудов экспрессируют молекулы, которые обладают адгезией по отношению к лейкоцитам. Механизм адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам включает, частично, распознавание и связывание рецепторов, располагающихся на поверхности лейкоцитов, с соответствующими молекулами, находящимися на поверхности эндотелиальных клеток. Сразу после связывания лейкоциты мигрируют по стенке кровеносного сосуда, чтобы попасть к месту воспаления и высвободить химические посредники для борьбы с инфекцией. Обзоры по рецепторам адгезии в иммунной системе см., например, у Зрйпдег³ и ОкЬогп.⁴

Воспалительные заболевания мозга, такие как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ), рассеянный склероз (М8) и менингит, являются примерами заболеваний центральной нервной системы, при которых механизм адгезии эндотелий/лейкоцит приводит к разрушению здоровой ткани мозга. В связи с указанными воспалительными заболеваниями через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) мигрирует большое количество лейкоцитов. Лейкоциты высвобождают токсические посредники, которые

- 1 008180 вызывают экстенсивное повреждение тканей, приводящее к нарушению нервной проводимости и параличу.

В системе других органов повреждение тканей также происходит через механизм адгезии, приводящий к миграции или активации лейкоцитов. Так, было показано, что первичный инсульт сердечной ткани после ишемии миокарда может быть осложнен тем, что лейкоциты проникают в поврежденную ткань и вызывают еще больший инсульт (Уе44ег е! а1.).⁵ Другие воспалительные или медицинские состояния, которые протекают посредством механизма адгезии, включают, например, астму^6-8, болезнь Альцгеймера, атеросклероз^9-10, вызванную СПИД деменцию¹¹, диабет^12-14 (в том числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника¹⁵ (включая язвенный колит и болезнь Крона), рассеянный склероз^16-17, ревматоидный артрит^18-21, трансплантацию тканей²², метастаз опухоли^23-28, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит, атопический дерматит, псориаз, ишемию миокарда и опосредованное лейкоцитами острое поражение легкого, такое как поражение, наблюдаемое при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.

Замещенные аминопиримидины описаны как класс ингибиторов связывания УБА-4 к УСАМ-1, и, следовательно, они обладают противовоспалительными свойствами.²⁹ Поскольку указанные соединения обладают антагонистическими свойствами по отношению к такому связыванию, то увеличение биодоступности указанных соединений приведет к усилению их эффективности.

Настоящее изобретение направлено на открытие того, что определенные Х-[2-№,Х'-диэтиламино-5аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновые соединения неожиданно обладают повышенной биодоступностью, которая определяется как площадь под кривой (АИС), по сравнению с другими ранее раскрытыми замещенными аминопиримидиновыми соединениями.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к соединению формулы (I)

где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;

р равно 0 или целому числу от 1 до 3;

К¹ выбирают из группы, включающей метил и этил;

К² выбирают из группы, включающей низший алкил, низший алкенил и низший алкиленциклоалкил; и его фармацевтически приемлемым солям.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (II)

где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;

т равно целому числу 1 или 2;

К² выбирают из группы, включающей низший алкил, низший алкенил и низший алкиленциклоалкил; и их фармацевтически приемлемые соли.

Наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (III)

- 2 008180 где каждый X независимо означает фтор или хлор;

η равно 0 или 1;

К² означает -СН₂-К', где К' выбирают из группы, включающей водород, метил или -СН=СН₂; и их фармацевтически приемлемые соли.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (IV)

К¹ \

(IV) где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;

р равно 0 или целому числу от 1 до 3;

К¹ выбирают из группы, включающей метил и этил;

К² означает низший алкинил;

и их фармацевтически приемлемые соли.

Еще один наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (V)

где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор или хлор;

т равно целому числу 1 или 2;

К² означает низший алкинил;

и их фармацевтически приемлемые соли.

Наконец, еще один наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения

где каждый X независимо означает фтор или хлор;

η равно 0 или 1;

К² означает низший алкинил;

и их фармацевтически приемлемые соли.

В любой из формул (IV), (V) или (VI) заместитель К² предпочтительно означает пропаргил.

Х-[2-Х',№-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновые соединения, входящие в объем притязаний по настоящему изобретению, включают соединения, которые приведены далее в табл. 1.

- 3 008180

Таблица 1

Пример №	с? (Х)т	Н2
1	4-фторфенил	метил
2	4-хлорфенил	метил
3	3,4-дифторфенил	метил
4	3,4-дихлорфенил	метил
5	Фенил	метил
6	2-фторфенил	метил
7	. 3-фторфенил	метил
8	4-фторфенил	изопропил
9	4-фторфенил	этил
10	3,4-дифторфенил	изопропил
11	4-хлорфенил	изопропил
12	3,4-дихлорфенил	этил
13	4-хлорфенил	этил
14	4-фторфенил	циклопропилметил
15	3,5-дифторфенил	метил
16	3,5-дифторфенил	этил
17	2,4-дифторфенил	метил
18	2,4-дифторфенил	этил
19	3,5-дихлорфенил	метил
20	3,5-дихлорфенил	этил
21	4-фторфенил	н-пропил
22	4-фторфенил	аллил
23	4-фторфенил	изобутил
24	4-фторфенил	н-бутил
25	2,6-дифторфенил	метил
26	2.3-дифторфенил	метил
27	4-фторфенил	пропаргил
28	2,4-дифторфенил	пропаргил
29	• 4-фторфенил	2-трисфторэтил

Конкретные соединения, входящие в объем притязаний по настоящему изобретению, включают следующие. В настоящем описании эти соединения названы как производные пропионовой кислоты,

- 4 008180 однако, указанные соединение могли бы быть названы как производные М-[2-Ы',М'-диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбамоилоксифенилаланина.

2-{2-Диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,6-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2-трисфторэтил)амино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;

и их фармацевтически приемлемые соли.

Другим аспектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие

- 5 008180 фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество указанных в настоящем описании соединений.

Одним из аспектов настоящего изобретения, связанных со способами, является способ лечения у пациента заболевания, опосредованного, по крайней мере, частично а₄-интегрином, преимущественно УЪА-4, при этом способ включает введение пациенту композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению.

Соединения и фармацевтические композиции по настоящему изобретению полезны при лечении болезненных состояний, опосредованных, по крайней мере, частично а₄-интегринами, где а₄-интегрином преимущественно является УЬА-4, или адгезией лейкоцитов. Подобные болезненные состояния включают, например, астму, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, вызванную СПИД деменцию, диабет (в том числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника (включая язвенный колит и болезнь Крона), рассеянный склероз, ревматоидный артрит, трансплантацию тканей, метастаз опухоли, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит, атопический дерматит, псориаз, ишемию миокарда и опосредованное лейкоцитами острое поражение легкого, такое как поражение, наблюдаемое при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.

Другие болезненные состояния включают, однако, ими не ограничиваются, воспалительные состояния, такие как узловатая эритема, аллергический конъюнктивит, ретробульбарный неврит, увеит, аллергический ринит, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, васкулит, болезнь Рейтера, системная красная волчанка, прогрессирующий системный склероз, полимиозит, дерматомиозит, некротический неинфекционный гранулематоз, аортит, саркоидоз, лимфоцитопения, темпоральный артериит, перикардит, миокардит, застойная сердечная недостаточность, нодозный полиартериит, аллергический синдром, аллергия, гиперэозинофилия, системный легочный васкулит с преимущественным поражением сосудов малого круга кровообращения (синдром Сйцгд-§1гаи88), хроническая легочная непроходимость, аллергический пневмонит, хронический активный гепатит, интерстициальный цистит, аутоиммунное расстройство эндокринной системы, первичный билиарный цирроз печени, аутоиммунная гипопластическая анемия, хронический персистирующий гепатит и тиреоидит.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения опосредованным а₄-интегрином болезненным состоянием является воспалительное заболевание.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к ингибирующим адгезию лейкоцитов соединениям, в частности адгезию лейкоцитов, опосредованную, по крайней мере, частично а₄-интегринами, преимущественно УЬА-4. Тем не менее, перед более подробным описанием изобретения должен быть определен ряд терминов.

Если специально не оговаривается, следующие термины, используемые в описании изобретения и формуле изобретения, имеют указанное ниже значение.

По тексту настоящего описания низший алкил относится к одновалентным алкильным группам, содержащим от 1 до 5 атомов углерода, и включает алкильные группы как с прямой, так и разветвленной цепью. Этот термин поясняется примерами таких групп, как метил, этил, изопропил, н-пропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил и т.п. Низший алкил необязательно может содержать в качестве заместителя галоген, такой как хлор, фтор, бром и т. п.

Термин низший алкилен относится к двухвалентным алкиленовым группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, и включает алкиленовые группы, как с прямой, так и разветвленной цепью. Этот термин поясняется примерами таких групп, как метилен, этилен, н-пропилен, изопропилен (-СН₂СН(СН₃)- и -СН(СН₃)СН₂-) и т.п.

Термин низший алкинил относится к алкинильной группе, предпочтительно содержащей от 2 до 6 атомов углерода и имеющей по крайней мере одно место или предпочтительно единственное место алкинильной ненасыщенности (т.е. -С=С). Примерами для приведенных терминов являются такие группы, как ацетил (-С'.=СН). пропаргил (-СН₂-С=СН) , 3-бутинил (-СН₂СН₂С=СН) и т.п.

Термин низший циклоалкил относится к циклическим алкильным группам, содержащим от 3 до 6 атомов углерода и имеющим одно циклическое кольцо, включающее в качестве примера циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

Термин низший алкиленциклоалкил относится к группе, содержащей низший алкилен-низший циклоалкил, как определено в настоящем описании. Примерами подобных групп являются метиленциклопропил (-СН2-циклопропил), этиленциклопропил и т. п.

Фармацевтически приемлемый носитель означает носитель, который применим для получения фармацевтической композиции и обычно является безопасным, нетоксичным и не является ни биологически, ни каким-либо другим образом нежелательным, и включает носитель, который приемлем для ветеринарии, а также для фармацевтического применения при лечении людей. Фармацевтически приемлемый носитель, используемый в настоящем описании и формуле изобретения, включает как один, так и несколько подобных носителей.

Лечение заболевания включает следующее:

(1) профилактика заболевания, т. е. действие, направленное на то, чтобы у млекопитающего, которое может быть подвержено заболеванию или предрасположено к заболеванию, но которое еще не испытывает симптомы

- 6 008180 заболевания или у которого не проявляются симптомы заболевания, не развились симптомы этого заболевания, (2) подавление заболевания, т.е. прекращение заболевания или ослабление развития заболевания или его клинических симптомов, или (3) ослабление заболевания, т.е. действие, направленное на то, чтобы вызвать регресс заболевания или его клинических симптомов.

Терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которое после введения млекопитающему с целью лечения заболевания является достаточным для оказания подобного лечения заболевания. Терапевтически эффективное количество варьирует в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести, а также возраста, массы и т.д. млекопитающего, подвергаемого лечению.

Фармацевтически приемлемая соль относится к фармацевтически приемлемым солям соединения формулы (I), при этом указанные соли получают из различных органических и неорганических противоионов, хорошо известных в данной области и содержащих, лишь в качестве примера, ионы натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.п.; и в том случае, когда молекула содержит основную функцию, они включают соли органических и неорганических кислот, такие как хлорид, бромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.п.

Интегрины представляют собой семейство гомологичных трансмембранных связующих белков, которые являются основными рецепторами на клетках животных при связывании большинства белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген, фибронектин и ламинин. Интегрины представляют собой гетеродимеры, состоящие из α-цепи и β-цепи. В настоящее время идентифицировано 20 различных интегринов, составленных из 9 различных α-субъединиц и 14 различных β-субъединиц. Термин а₄-интегрины относится к классу гетеродимерных, связанных с ферментом рецепторов на поверхности клетки, которые содержат а₄-субъединицу в паре с одной из β-субъединиц. УЪЛ-4 является примером а₄-интегрина и представляет собой гетеродимер а₄-субъединицы и βι-субъединицы, и его также обозначают как а.Д-интегрин.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены из легкодоступных исходных веществ с помощью способов и методик, которые приведены ниже в примерах. Эти способы и методики приводят конкретное описание проведения реакций для получения М-[2-Ы',М'-диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновых соединений. Соединения, входящие в объем притязаний по настоящему изобретению, но не приведенные в представленных примерах и способах, легко получают путем соответствующего замещения исходных веществ, которые либо коммерчески доступны, либо хорошо известны в данной области.

Другие методики и условия проведения реакций при получении соединений по настоящему изобретению описаны в приведенных ниже примерах. Кроме того, другие методики получения соединений, полезных в определенных аспектах настоящего изобретения, указаны в патенте США 6492372, описание которого включено в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.

При использовании в фармации соединения по настоящему изобретению обычно вводят в форме фармацевтических композиций. Указанные композиции могут вводиться различным путем, в том числе перорально, ректально, трансдермально, подкожно, внутривенно, внутримышечно и интраназально. Указанные соединения эффективны как при введении в виде инъекции, так и перорально. Такие композиции получают по способам, хорошо известным из области фармации, и они содержат по крайней мере одно активное соединение.

Настоящее изобретение включает также фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента одно или несколько указанных выше соединений формул (1)-(У1) вместе с фармацевтически приемлемыми носителями. При составлении композиций по настоящему изобретению активные ингредиенты обычно смешивают с эксципиентом, разводят эксципиентом или заключают внутрь такого носителя, который может иметь форму капсулы, саше, пакетика или другого контейнера. Применяемый эксципиент, как правило, является эксципиентом, подходящим для введения человеку или млекопитающим. Если эксципиентом служит разбавитель, то он может быть твердым, полутвердым или жидким веществом, которое играет роль средства доставки, носителя или среды для активного ингредиента. Так, композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, саше, крахмальных облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердой или жидкой среды), мазей, содержащих, например, вплоть до 10 мас.% активного ингредиента, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных растворов для инъекции и стерильно упакованных порошков.

При приготовлении составов может потребоваться измельчить активное соединение, с целью получения соответствующего размера частиц активного соединения, перед его объединением с другими ингредиентами. Если активное соединение является практически нерастворимым, то его обычно измельчают до частиц размером менее 200 меш США. Если активное соединение хорошо растворяется в воде, то размер частиц путем измельчения доводят до размера приблизительно 40 меш США, обеспечивающего однородное распределение соединения в композиции.

Некоторые примеры подходящих эксципиентов включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, камедь, фосфат кальция, альгинаты, смолу трагаканта, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп и метилцеллюлозу.

- 7 008180

Составы могут дополнительно включать лубриканты, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгирующие и суспендирующие агенты; консерванты, такие как метили пропилгидроксибензоаты; подслащиватели и отдушки. С помощью методик, известных из данной области, композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для получения быстрого, пролонгированного или отложенного высвобождения активных ингредиентов после введения пациенту.

Композиции преимущественно готовят в виде единичной дозировочной формы, при этом каждая доза содержит приблизительно от 5 до приблизительно 100 мг, обычно приблизительно от 10 до приблизительно 30 мг, активного ингредиента. Термин единичные дозировочные формы относится к физически дискретным единицам, которые могут применяться в качестве однократной дозы для людей и млекопитающих, при этом каждая единица содержит определенное количество активного вещества, рассчитанного таким образом, чтобы получить требуемый терапевтический эффект, вместе с подходящим фармацевтическим эксципиентом.

Активное соединение эффективно в широком диапазоне доз и обычно вводится в терапевтически эффективном количестве. Следует, однако, понимать, что вводимое количество соединения обычно определяет врач в зависимости от соответствующих обстоятельств, в том числе состояния, лечение которого проводят, выбранного пути введения, конкретного вводимого соединения, возраста, массы и реакции индивидуального пациента, тяжести симптомов у пациента и т.п.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим эксципиентом с образованием твердой предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению. Когда указанные предварительные композиции называют гомогенными, то это означает, что активный ингредиент равномерно распределен в композиции, так что композицию можно легко разделить на одинаково эффективные дозированные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Твердые составы затем делят на единичные дозированные формы, тип которых указан выше, содержащие, например, от 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению.

Таблетки или пилюли по настоящему изобретению могут иметь покрытие или же быть сформованы каким-либо другим способом с тем, чтобы можно было получить дозированную форму, которая предоставляет преимущества пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний дозированный и внешний дозированный компонент, при этом последний может играть роль конверта для внутреннего слоя. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным компонентом, который служит для того, чтобы обеспечить устойчивость внутреннего компонента к разрушению в желудке и позволить внутреннему компоненту в целости и сохранности попасть в двенадцатиперстную кишку или отсрочить его высвобождение. Для формирования указанных энтеросолюбильных слоев могут применяться различные вещества, и подобные вещества включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Жидкие формы, в которые новые соединения по настоящему изобретению могут добавляться для введения перорально или в виде инъекции, включают водные растворы, соответствующим образом ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии, ароматизированные эмульсии с пригодными в пищу маслами, такими как хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а также эликсиры и подобные фармацевтические носители.

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях и их смесях или порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать указанные выше подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты. Композиции предпочтительно вводят респираторно через рот или нос с целью достижения местного или системного эффекта. Композиции в предпочтительно фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с помощью инертных газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из пульверизатора, или же пульверизатор может быть присоединен к тампону на маске для лица или к дыхательному аппарату, создающему пульсирующее положительное давление. Композиции в форме растворов, суспензий или порошков могут вводиться, предпочтительно через рот или через нос, из устройств, которые подают композицию подходящим образом.

Следующие примеры составов иллюстрируют фармацевтические композиции по настоящему изобретению.

Пример состава 1.

Получают твердую желатиновую капсулу, содержащую следующие ингредиенты.

Ингредиент Количество, мг/капсула

Активный ингредиент30,0

Крахмал305,0

Стеарат магния5,0

Указанные выше ингредиенты смешивают и заполняют ими твердую желатиновую капсулу в количестве 340 мг.

Пример состава 2.

Получают формулу таблетки, используя следующие ингредиенты.

- 8 008180

Ингредиент

Активный ингредиент Микрокристаллическая целлюлоза Коллоидный диоксид кремния Стеариновая кислота

Количество, мг/таблетка

25,0

200,0

10,0

5,0

Компоненты смешивают и спрессовывают в форме таблеток, каждая из которых имеет массу 240 мг. Пример состава 3.

Получают сухую композицию для ингаляции в виде порошка, содержащую следующие компоненты. Ингредиент Масса, %

Активный ингредиент 5

Лактоза 95

Активную смесь смешивают с лактозой и полученную смесь добавляют к сухому порошку для ингалятора. Пример состава 4.

Таблетки, каждая из которых содержит 30 мг активного ингредиента, получают следующим образом.

Ингредиент	Количество, мг/таблетка
Активный ингредиент	30,0 мг
Крахмал	45,0 мг
Микрокристаллическая целлюлоза	35,0 мг
Поливинилпирролидон (в виде 10%-ного раствора в воде)	4,0 мг
Натрийкарбоксиметилкрахмал	4,5 мг
Стеарат магния	0,5 мг
Тальк	1,0 мг
Общая масса	120,0 мг

Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сита 20 меш США и тщательно смешивают. Полученные порошки смешивают с раствором поливинилпирролидона и пропускают через сита 16 меш США. Получаемые гранулы сушат при температуре в интервале от 50 до 60°С и вновь пропускают через сита 16 меш США. Затем к гранулам добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сита 30 меш США, и после смешения спрессовывают в машине для таблетирования, получая таблетки, каждая из которых весит 120 мг.

Пример состава 5.

Капсулы, каждая из которых содержит 40 мг лекарственного средства, получают следующим образом.

Ингредиент	Количество, мг/капсула
Активный ингредиент	40,0 мг
Крахмал	109,0 мг
Стеарат магния	1,0 мг
Общая масса	150,0 мг

Активный ингредиент, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сита 20 меш США и полученной смесью в количестве 150 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.

Пример состава 6.

Суппозитории, каждый из которых содержит 25 мг активного ингредиента, получают следующим образом. Ингредиент Количество

Активный ингредиент 25 мг

Глицериды насыщенной жирной кислоты до 2000 мг

Активный ингредиент пропускают через сита 60 меш США и суспендируют в глицеридах насыщенной жирной кислоты, предварительно расплавленных при минимальном нагреве. Затем смесь выливают в пресс-форму для изготовления суппозиториев с номинальной массой 2,0 г и дают остыть.

Пример состава 7.

Суспензии, каждая из которых содержит 50 мг лекарственного средства в дозе объемом 5,0 мл, получают следующим образом.

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	50,0 мг
Смола ксантана	4,0 мг
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза (11%)
Микрокристаллическая целлюлоза (89%)	50,0 мг
Сахароза	1,75 г
Бензоат натрия	10,0 мг
Отдушка и краситель	ς.ν.
Очищенная вода	5,0 мл

- 9 008180

Лекарственное средство, сахарозу и смолу ксантана смешивают, пропускают через сита 10 меш США и затем смешивают с предварительно приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и натрийкарбоксиметилцеллюлозы в воде. Бензоат натрия, отдушку и краситель разводят в некотором количестве воды и добавляют к смеси при перемешивании. Добавляют достаточное количество воды, чтобы получить требуемый объем.

Пример состава 8.

Ингредиент

Активный ингредиент

Крахмал

Стеарат магния

Общая масса

Количество, мг/капсула мг мг мг мг

15,0

407,0

3,0

425,0

Активный ингредиент, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сита 20 меш США и полученной смесью в количестве 425 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.

Пример состава 9.

Состав для внутривенного назначения может быть получен следующим образом.

Ингредиент Количество

Активный ингредиент 250,0 мг

Изотонический физиологический раствор 1000 мл

Пример состава 10.

Состав для местного введения может быть получен следующим образом.

Ингредиент Количество

Активный ингредиент 1-10г

Эмульгирующийся воск 30г

Жидкий парафин 20г

Белый мягкий парафин от 2 до 100 г

Белый мягкий парафин нагревают до расплавления. Добавляют жидкий парафин и эмульгирующийся воск и перемешивают до полного растворения. Добавляют активный ингредиент и перемешивают до получения однородной дисперсии. Смесь охлаждают до затвердевания.

Другими предпочтительными составами, применяемыми в способах по настоящему изобретению, являются приспособления для чрескожной доставки (пэтчи). Подобные чрескожные пэтчи могут применяться для обеспечения непрерывной или периодической инфузии соединений по настоящему изобретению в контролируемых количествах. Приготовление и применение чрескожных пэтчей для доставки фармацевтических средств хорошо известно в данной области. См, в частности, патент США 5023252, опубликованный 11 июня 1991г., включенный в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки. Подобные пэтчи могут быть приготовлены для непрерывной или пульсирующей доставки фармацевтических средств или доставки по требованию.

В тех случаях, когда необходимо ввести фармацевтические композиции в мозг, могут применяться методики прямого или непрямого размещения устройств. Прямые методики обычно включают размещение катетера для доставки лекарства в желудочковую систему реципиента в обход гематоэнцефалического барьера. Одна из таких имплантируемых систем доставки, которые применяют для транспортирования биологических факторов в конкретные анатомические участки организма, описана в патенте США 5011472, включенном в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.

Непрямые методики, которые, в общем случае, являются предпочтительными, обычно включают приготовление композиции таким образом, чтобы лекарственное средство временно было латентным за счет превращения гидрофильных лекарственных средств в растворимые в липидах лекарства. Превращение лекарственного средства в латентное обычно достигается путем блокирования гидроксильных, карбонильных, сульфатных групп и первичных аминогрупп лекарственного средства, при этом лекарственное средство становится более растворимым в липидах и легче поддается транспортировке через гематоэнцефалический барьер. Альтернативно, доставку гидрофильных лекарствнных средств можно облегчить внутриартериальной инфузией гипертонических растворов, которые способны временно открыть гематоэнцефалический барьер.

Соединения по настоящему изобретению ίη νίνο ингибируют опосредованную, по крайней мере, частично а₄-интегринами адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, при этом а₄-интегрином предпочтительно является УЬА-4. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут применяться при лечении болезней млекопитающих, опосредованные а₄-интегринами, при этом а₄-интегрином предпочтительно является УЬА-4, или адгезией лейкоцитов. Подобные болезни включают воспалительные заболевания млекопитающих пациентов, такие как астма, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, вызванная СПИД деменция, диабет (в том числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника (включая язвенный колит и болезнь Крона), рассеянный склероз, ревматоидный артрит, трансплантация тка

- 10 008180 ней, метастаз опухоли, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит, атопический дерматит, псориаз, ишемия миокарда и опосредованное лейкоцитами острое поражение легкого, такое как поражение, наблюдаемое при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.

Количество лекарственного средства, вводимое млекопитающему пациенту, будет варьировать в зависимости от того, какое лекарственное средство вводят, цели введения, например для профилактики или для терапии, состояния пациента, пути введения и т.п. При терапевтических применениях композиции вводят пациенту, который уже страдает от заболевания, в количестве, достаточном для излечивания или, по крайней мере, частичного сдерживания симптомов болезни и ее осложнений. Адекватное для достижения этой цели количество называют терапевтически эффективной дозой. Эффективное при данном применении количество лекарственного средства будет зависеть от состояния болезни, лечение которой проводят, а также от решения, принимаемого лечащим врачом в зависимости от таких факторов, как тяжесть воспаления, возраст, масса и общее состояние пациента и т.п.

Композиции, которые вводят пациенту, имеют форму описанных выше фармацевтических композиций. Указанные композиции можно стерилизовать с применением обычных методов стерилизации или же их можно стерилизовать фильтрацией. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования как таковые или же их предварительно лиофилизуют, при этом лиофилизованный препарат перед введением смешивают со стерильным водным носителем. рН препаратов соединений обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 и наиболее предпочтительно от 7 до 8. Следует понимать, что применение конкретных указанных выше эксципиентов, носителей или стабилизаторов приводит к образованию фармацевтических солей.

Терапевтическая дозировка соединений по настоящему изобретению будет варьировать в зависимости, например, от конкретного применения в процессе лечения, способа введения лекарственного средства, здоровья и состояния пациента и от решения врача, который назначает лечение. Например, при внутривенном введении доза обычно составляет приблизительно от 20 до приблизительно 500 мкг на килограмм массы тела, предпочтительно приблизительно от 100 мкг до приблизительно 300 мкг на килограмм массы тела. Подходящие диапазоны доз для интраназального введения обычно составляют приблизительно от 0,1 пг до 1 мг на килограмм массы тела. Величину эффективной дозы можно экстраполировать из кривых зависимости от дозы, полученных ίη νίίτο для тестовых систем на основе животных моделей.

Приведенные далее синтетические и биологические примеры предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения, и их ни в коем случае не следует рассматривать как ограничивающие объем притязаний по настоящему изобретению. Если специально не оговаривается, то температуры приведены в градусах Цельсия.

Примеры

В приведенных ниже примерах следующие сокращения имеют указанное значение. Если сокращение не определено, то оно имеет общепринятое значение.

Аис	Площадь под кривой
В8А	Бычий сывороточный альбумин
ΌΜΑΡ	4-Ν,Ν-Диметиламинопиридин
ДМСО	Диметилсульфоксид
ЕЭС	Гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида
ΕΌΤΑ	Этилендиаминтетрауксусная кислота
ЕЮАс	Этилацетат
Е1ОН	Этанол
уш.д	Уширенный дублет
уш.с	Уширенный синглет
Д	Дублет
м	Мультиплет
т	Триплет
с	Синглет
ЕАС8	Активируемый флюоресценцией анализатор клеток
Е1ТС	Изотиоцианат флюоресцеина
Етос	№(9-Флуоренилметоксикарбонил)
ЕтосОЫ8и	Сукцинимид №(9-флуоренилметоксикарбонила)
НВ88	Сбалансированный физиологический раствор Ханка
Нерек	4-(2-Гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота
НОВТ	Гидрат 1-гидроксибензотриазола
1дС Ес	Связующий домен иммуноглобулина
ЖХМС	Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
Μ	Молярный
Нс1	Хематокрит или измерение компактных красных кровяных клеток, полученных центрифугированием в объеме образца крови
НВ	Гемоглобин

- 11 008180

МСН МСНС МСУ	Среднее содержание корпускулярного гемоглобина; НЬ/КВС Среднее содержание корпускулярного гемоглобина, выраженное в процентах; НЬ/Нс1 Средний корпускулярный объем, средний объем эритроцитов, обычно выражаемый в кубических микронах на одну красную клетку
ВВС МеОН н №ОЕ1 NΜΜ О®ц РВ8++ Р1е Рго Ц.8. ВТ 1-ВцОН ТЕА ТГФ ТСХ ТУК V, АВС	Эритроциты Метанол Нормальная концентрация Этоксид натрия Ν-Метилморфолин трет-Бутокси Забуференный фосфатом физиологический раствор Ь-Фенилаланин Ь-Пролин Довести до объема Время удерживания трет-Бутанол Трифторуксусная кислота Тетрагидрофуран Тонкослойная хроматография Тирозин Общий объем Лейкоциты

Пример 1. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Общая часть.

Флэш-хроматографию проводят на приборе Вю1аде Иакй 75Ь, используя патроны оксида кремния КР-811 массой 800 г (32-63 мкМ, 60 А, 500-550 м²/г). Величины К_Т указаны для аналитической тонкослойной хроматографии, которую проводят с использованием толстых пластинок ЕМ 8с1епсе 8Шса Ое1 Е(254) 250 мкМ для нормальной фазы и толстых пластинок \Уа1шап МКС18Е 200 мкМ для обращенной фазы.

Стадия 1. Получение 2,4-дихлор-5-нитропиримидина.

5-Нитроурацил обрабатывают оксихлоридом фосфора и Ν,Ν-диметиланилином в соответствии с методикой, приведенной (\У1Ш1акег. 1. С1ет. 8ос. 1951, 1565), и получают указанное в заголовке соединение, которое также можно получить от компании Сйу Сйеш1са1 (Уэст-Хейвен, Коннектикут).

Стадия 2. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4гидроксифенил)пропионовой кислоты.

К раствору 2-амино-3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислоты (30,6 г, 0,129 моль) в ТГФ (250 мл) при температуре -10°С добавляют 2,4-дихлор-5-нитропиримидин (25 г, 0,129 моль), поддерживая в процессе добавления температуру не выше 5°С. По завершении добавления по каплям добавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (33,7 мл, 0,194 моль). Перемешивают 1 ч при температуре -10°С, медленно добавляют диэтиламин (66,73 мл, 0,645 моль) и затем реакционной смеси в течение ночи дают нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляют диэтиловым эфиром (500 мл) и органический слой промывают 0,2н раствором лимонной кислоты (3x150 мл), водой (1x150 мл) и 10%-ным раствором карбоната калия (3x150 мл). Органическую фазу сушат (над №₂8О₄), фильтруют и концентрируют в вакууме, получая остаток желтого цвета. Остаток очищают флэш-хроматографией (20% ЕЮАс/гексан на силикагеле) и получают 37,39 г (67%) указанного в заголовке соединения в виде желтой пены. К{=0,21 (25% ЕЮАс/гексан на силикагеле).

Стадия 3. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

К раствору трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислоты (31,80 г, 0,074 моль) в СН₂С1₂ (600 мл) добавляют ΌΜΑΡ (9,00 г, 0,074 моль). Через 5 мин по каплям добавляют триэтиламин (10,23 мл, 0,074 моль). По каплям добавляют Ν,Ν-диметилкарбамоилхлорид (13,83 мл, 0,110 моль) и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток забирают в ЕЮАс (1 л). Органическую фазу промывают 0,5М раствором лимонной кислоты (3x250 мл), насыщенным раствором NаΗСОз (3x250 мл), насыщенным раствором соли (1x250 мл), сушат (над Мд8О₄), фильтруют, концентрируют в вакууме и получают 37,0 г (99%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

Стадия 4. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-аминопиримидин-4-иламино)-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Смесь трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (37,0 г, 0,073 моль) и 10%-ного Ρά/С (3,8 г, 10 мас.% Ρά) в ЕЮН (250 мл) встряхивают в атмосфере водорода при давлении 60 фунт/дюйм² до тех пор, пока ТСХ (50%

- 12 008180

ЕЮЛС/гексан на силикагеле) не покажет 100%-ную конверсию в продукт (48 ч). Затем реакционную смесь фильтруют через слой целита и концентрируют в вакууме, получая 32,0 г (92%) указанного в заголовке соединения в виде пены фиолетового цвета.

Стадия 5. Получение трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)амино] пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Раствор трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-аминопиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (32,0 г, 0,067 моль) в пиридине (120 мл) охлаждают до -20°С на бане сухой лед/ацетонитрил. Смесь перемешивают в течение 30 мин и затем медленно добавляют парафторбензолсульфохлорид (13,18 г, 0,067 моль). Реакционную смесь перемешивают при температуре -20°С в течение 4,5 ч и затем добавляют 3-диметиламинопропиламин (8,52 мл, 0,067 моль) и смесь оставляют на ночь нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЕЮЛс (1 л) и органическую фазу промывают 0,5М раствором лимонной кислоты (3x900 мл), водой (1x900 мл), насыщенным раствором ЫаНСО₃ (3x900 мл), насыщенным раствором соли (1x900 мл), сушат (над МдЗО₄), фильтруют, концентрируют в вакууме с получением коричневого остатка. Остаток очищают флэш-хроматографией (50% Е1ОЛс/гексан на силикагеле) и получают 33,04 г (77%) указанного в заголовке соединения в виде желтой пены. К(=0,54 (3:2 Е1ОЛс/гексан на силикагеле).

Стадия 6. Получение трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

К раствору трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)амино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (33,04 г, 0,052 моль) в ацетоне (510 мл) добавляют К2СО3 (8,69 г, 0,063 моль) и смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре. Медленно добавляют диметилсульфат (5,95 мл, 0,063 моль) и реакционную смесь оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток забирают в ЕЮЛс (600 мл). Органическую фазу промывают водой (2x400 мл), насыщенным раствором соли (2x400 мл), сушат над МдЗО₄, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают флэш-хроматографией (2:1 гексан/Е1ОАс на силикагеле) и получают 28,69 г (85%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

Стадия 7. Получение гидрохлорида 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Раствор трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (28,69 г, 0,044 моль) в муравьиной кислоте (500 мл) нагревают до 70°С в течение 2 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток вновь растворяют в муравьиной кислоте (500 мл), вновь нагревают до 70°С в течение 2 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток вновь растворяют в муравьиной кислоте (500 мл) и вновь нагревают до 70°С в течение 1 ч. Объем раствора снижают до 90% и добавляют 1,0М раствор НС1 (44 мл, 0,044 моль) и дистиллированной воды (490 мл). Полученный гомогенный раствор концентрируют в вакууме, затем добавляют дистиллированную воду (100 мл) и полученный гомогенный раствор лиофилизуют в течение 14 дней, получая 26,76 г (96%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 7,96-7,92 (м, 2Н), 7,45-7,25 (м, 4Н), 7,06-6,95 (м, 3Н), 5,00-4,93 (м, 1Н), 3,55-3,40 (м, 5Н), 3,34-3,20 (м, 2Н), 3,15-3,05 (м, 5Н), 3,07-3,00 (м, 3Н), 1,22 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 171,6, 168,3, 154,5, 144,4, 137,9, 135,1, 135,0, 134,1, 125,5, 120,6, 120,3, 39,6, 39,2, 39,1, 15,2.

Масс-спектр т/ζ 589 (МН⁺).

Пример 2. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (С1);О1)) δ 7,88-7,85 (м, 2Н), 7,72-7,69 (м, 2Н), 7,39-7,25 (м, 2Н), 7,14-6,92 (м, 3Н), 5,00-4,85 (м, 1Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 3,37-3,28 (м, 6Н), 3,15-3,07 (м, 6Н), 3,01 (уш.с, 3Н), 1,22 (уш.с, 6Н);

Спектр ¹³С ЯМР (С1);О1)) δ 208,6, 145,3, 134,9, 128,8, 124,9, 124,5, 124,4, 116,3, 50,2, 30,4, 30,0, 6,0; Масс-спектр т/ζ 605 (МН⁺).

Пример 3. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (С1);О1)) δ 7,84-7,77 (м, 1Н), 7,67 (уш.с, 1Н), 7,58-7,53 (м, 1Н), 7,37-7,34 (м, 1Н), 7,22-7,18 (м, 1Н), 7,08-7,02 (м, 3Н), 4,83-4,76 (м, 1Н), 3,55-3,54 (м, 4Н), 3,35-3,33 (м, 1Н), 3,23-3,12 (м, 6Н), 3,03-2,99 (м, 3Н), 1,19 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 178,3, 177,8, 163,2, 162,6, 159,3, 159,1, 155,9, 155,7, 154,3, 153,0, 152,5,

152,4, 138,4, 138,1, 134,0, 129,5, 125,3, 122,4, 122,2, 121,7, 121,4, 115,3, 59,3, 46,0, 42,4, 41,9, 40,4, 39,9,

39,2, 39,1, 15,76.

- 13 008180

Масс-спектр т/ζ 607,2 (МН⁺).

Пример 4. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино }-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дихлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр ¹Н ЯМР (СП₃ОП) δ 8,00-7,98 (м, 1Н), 7,83-7,74 (м, 2Н), 7,37-7,34 (м, 1Н), 7,21-7,20 (м, 1Н),

7.10- 7,02 (м, 3Н), 4,85-4,83 (м, 1Н), 3,55-3,53 (м, 2Н), 3,35-3,33 (м, 1Н), 3,21-3,12 (м, 6Н), 3,04-2,99 (м, 6Н), 1,19 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 176,4, 166,2, 161,7, 161,2, 158,0, 157,8, 152,8, 151,5, 150,5, 140,2, 139,8, 139,5,

136,8, 135,8, 133,9, 132,6, 132,0, 129,8, 123,8, 113,7, 113,4, 57,8, 44,6, 40,8, 40,4, 38,7, 38,3, 37,7, 37,5, 14,1.

Масс-спектр т/ζ 639,1 (МН⁺).

Пример 5. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-

3- (4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием бензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (СП₃ОП) δ 8,14 (уш.с, 1Н), (7,85-7,84 (м, 1Н), 7,8-7,78 (м, 1Н), 7,69-7,66 (м, 2Н), 7,40-7,37 (м, 1Н), 7,21-7,195 (м, 1Н), 7,04-7,03 (м, 2Н), 7,95-7,90 (м, 1Н), 5,52 (уш.с, 1Н), 3,54-3,53 (м, 2Н), 3,36-3,33 (м, 6Н), 3,13-3,12 (м, 3Н), 3,01-3,00 (м, 3Н), 1,20-1,17 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 165,9, 152,8, 136,7, 135,8, 132,6, 131,6, 130,2, 123,8, 44,7, 37,5, 14,0.

Масс-спектр т/ζ 571,2 (МН⁺).

Пример 6. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2фторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (СП₃ОП) δ 8,31 (уш.с, 1Н), 7,94-7,85 (м, 2Н), 7,57-7,44 (м, 3Н), 7,34-7,30 (м, 1Н), 7,15-7,12 (м, 2Н), 5,00-4,85 (1Н), 3,63-3,62 (м, 4Н), 3,50-3,42 (м, 1Н), 3,34-3,30 (м, 4Н), 3,29-3,22 (м, 4Н),

3.11- 3,10 (м, 2Н), 1,28 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 176,5, 166,4, 163,1, 160,4, 159,7, 157,7, 152,8, 151,5, 150,7, 138,5, 138,3, 136,7, 133,7, 132,5, 132,2, 127,1, 123,7, 119,9, 119,6, 113,4, 57,8, 44,6, 40,6, 39,0, 38,4, 37,7, 37,5, 14,1.

Пример 7. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3фторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (СП₃ОП) δ 8,15-8,12 (уш.с, 1Н), 7,72-7,68 (м, 1Н), 7,63-7,60 (м, 1Н), 7,53-7,52 (м, 1Н), 7,38-7,35 (м, 1Н), 7,21-7,20 (м, 1Н), 7,10-6,99 (м, 3Н), 4,87-4,86 (м, 1Н), 3,54-3,53 (м, 4Н), 3,35-3,34 (м, 3Н), 3,15-3,12 (м, 4Н), 3,05-3,00 (м, 4Н), 1,20 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 166,1, 153,1, 136,9, 134,1, 132,8, 126,5, 124,1, 123,2, 122,9, 117,7, 117,4,

103,4, 45,0, 38,0, 14,3.

Масс-спектр т/ζ 589,2 (МН⁺).

Пример 8. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-

4- иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2 и 3 проводят так же, как в примере 1. Стадии 4 и 6 осуществляют в один прием в соответствии с приведенной ниже методикой. Далее, стадии 5 и 7 проводят так же, как в примере 1.

Спектр '11 ЯМР (СП₃ОП) δ 8,20-8,16 (м, 1Н), 7,95-7,84 (м, 2Н), 7,36-7,25 (м, 3Н), 7,24-7,15 (м, 3Н), 7,07-6,98 (м, 3Н), 5,07-5,05 (м, 1Н), 4,90-4,86 (м, 1Н), 4,65-4,62 (м, 1Н), 4,49-4,41 (м, 1Н), 3,63-3,56 (м, 3Н), 3,38-3,31 (м, 2Н), 3,27-3,11 (м, 2Н), 3,00-2,99 (м, 3Н), 1,27-1,21 (м, 6Н), 1,05-0,99 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 175,8, 175,5, 169,6, 166,3, 165,9, 163,5, 163,4, 157,7, 153,0, 152,9, 152,3, 138,1, 136,4, 136,1, 133,1, 133,0, 133,0, 132,9, 132,7, 132,3, 123,8, 118,8, 118,7, 118,5, 118,4, 107,5, 57,6,

57,2, 54,7, 44,7, 38,7, 38,1, 37,6, 37,5, 23,0, 22,9, 22,2, 22,0, 14,1, 14,0.

Альтернативная одностадийная методика получения трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5изопропиламинопиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Смесь трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (5,0 г, 0,010 моль), ледяной уксусной кислоты (10 капель), ацетона (2,19 мл, 0,030 моль) и оксида платины (0,250 г, 5 мас.%) в ЕЮН (15 мл) гидрируют в атмосфере водорода при давлении 45 фунт/дюйм² до тех пор, пока ТСХ (50% ЕЮАС/гексан) не покажет 100%-ное превращение в продукт (20 ч). Затем реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют в вакууме, получая остаток коричневого цвета. Остаток очищают флэш-хроматографией (4:1 Е1ОАс/гексан) и получают 3,54 г (70%) продукта в виде розового пены.

Пример 9. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя этилиодид

- 14 008180 вместо диметилсульфата.

Спектр Ή ЯМР (СБС1₃) δ 0,89 (т, 1=7,2, 1,8Н), 1,06 (т, 1=7,1, 1,2Н), 1,10-1,30 (м, 6Н), 2,97 (с, 3Н), 3,05 (с, 3Н), 3,10-3,90 (м, 8Н), 4,82 (кв, 1=5,4, 0,6Н), 4,91 (кв, 1=6,1, 0,4Н), 6,80-7,45 (м, 8Н), 7,77 (м, 2Н), 12,44 (уш.с, 1Н).

Масс-спектр т/ζ 603,3 (МН⁺).

Пример 10. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 8. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр Ή ЯМР (СВзОО) δ 8,20-8,19 (м, 1Н), 7,84-7,78 (м, 1Н), 7,70-7,64 (м, 1Н), 7,54-7,48 (м, 1Н), 7,39-7,31 (м, 1Н), 7,20-7,17 (м, 1Н), 7,05-6,96 (м, 2Н), 4,91-4,89 (м, 1Н), 4,70-4,68 (м, 1Н), 4,48-4,41 (м, 2Н), 3,60-3,58 (м, 3Н), 3,34-3,33 (м, 1Н), 3,27-3,20 (м, 1Н), 3,09-3,08 (м, 2Н), 2,98-2,97 (м, 2Н), 1,28-1,19 (м, 6Н), 1,06-0,98 (м, 6Н), 0,83-0,81 (м, 1Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 177,6, 177,2, 167,9, 164,9, 164,8, 159,2, 159,1, 155,7, 154,5, 154,4, 152,4,

152.3, 140,4, 140,3, 137,8, 134,3, 133,9, 129,3, 129,2, 125,4, 122,6, 122,5, 122,4, 122,2, 121,5, 121,2, 109,1,

59.5, 59,1, 56,7, 56,6, 46,4, 46,3, 39,6, 39,3, 39,2, 24,7, 24,5, 23,9, 23,6, 15,7, 15,6.

Пример 11. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 8. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (СП₃ОП) δ 8,18-8,17 (м, 1Н), 7,85-7,78 (м, 1Н), 7,62-7,58 (м, 1Н), 7,38-7,35 (м, 1Н), 7,34-7,24 (м, 1Н), 7,17-7,16 (м, 1Н), 7,10-7,05 (м, 2Н), 7,04-6,98 (м, 2Н), 4,98-4,87 (м, 1Н), 4,73-4,68 (м, 1Н), 4,55-4,38 (м, 2Н), 3,70-3,52 (м, 3Н), 3,40-3,30 (м, 1Н), 3,28-3,18 (м, 1Н), 3,17-3,08 (м, 2Н), 3,05-2,98 (м, 2Н), 1,25-1,20 (м, 6Н), 1,04-0,96 (м, 6Н), 0,80-0,77 (м, 1Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 175,7, 175,5, 166,2, 165,8, 169,6, 163,5, 163,4, 157,6, 152,9, 152,8, 138,0,

136.3, 136,1, 133,1, 133,0, 132,9, 132,7, 132,2, 123,8, 118,8, 118,6, 118,5, 118,5, 118,3, 107,5, 57,6, 57,2, 54,7,

44.6, 38,6, 38,1, 37,6, 37,5, 22,9, 22,8, 22,2, 21,9, 14,1, 13,9.

Пример 12. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 9. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр Ή ЯМР (СП₃ОП) δ 8,15-8,14 (м, 1Н), 7,80-7,75 (м, 1Н), 7,73-7,62 (м, 1Н), 7,60-7,49 (м, 1Н), 7,30-7,18 (м, 1Н), 7,16-7,00 (м, 2Н), 5,58-5,50 (м, 1Н), 4,90-4,83 (м, 1Н), 5,78-5,70 (м, 1Н), 3,85-3,75 (м, 1Н), 3,65-3,54 (м, 3Н), 3,40-3,23 (м, 5Н), 3,18-3,10 (м, 3Н), 3,05-2,98 (м, 3Н), 1,25-1,15 (м, 3Н), 1,18-1,05 (т, 1,5Н), 1,02-1,00 (т, 1,5Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 165,8, 152,7, 145,7, 136,4, 136,3, 132,5, 132,2, 127,5, 123,6, 120,7, 120,4,

81,4, 57,0, 44,3, 38,5, 38,1, 37,4, 14,9, 14,6, 14,1, 14,0;

Масс-спектр т/ζ 621,5 (МН⁺).

Пример 13. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 9. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр Ή ЯМР (СП₃ОП) δ 8,15-8,14 (м, 1Н), 7,84-7,79 (м, 1Н), 7,67-7,61 (м, 1Н), 7,37-7,33 (м, 1Н), 7,22-7,18 (м, 1Н), 7,14-7,13 (м, 1Н), 7,06-7,00 (м, 3Н), 4,80-4,75 (м, 1Н), 4,18-4,10 (м, 1Н), 3,65-3,30 (м, 3Н), 3,28-3,20 (м, 3Н), 3,18-3,08 (м, 2Н), 3,03-2,98 (м, 2Н), 2,05-2,04 (м, 1Н), 1,30-1,16 (м, 9Н), 1,10-1,08 (т, 1,5Н), 0,99-0,95 (т, 1,5Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СП₃ОП) δ 176,2, 176,1, 166,7, 162,7, 162,3, 157,6, 152,9, 142,0, 138,8, 136,5, 132,8,

132,5, 132,0, 131,8, 123,8, 111,7, 111,4, 57,9, 57,8, 44,9, 38,9, 38,3, 37,8, 37,7, 15,1, 14,9, 14,3, 14,2.

Масс-спектр т/ζ 619,4 (МН⁺).

Пример 14. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя бромметилциклопропан и карбонат цезия вместо диметилсульфата и карбоната калия.

Спектр Ή ЯМР (СОС1₃) δ -0,2-0,2 (м, 2,4Н), 0,2-0,45 (м, 1,6Н), 0,54 (м, 0,6Н), 0,85 (м, 0,4Н), 1,001,40 (м, 6Н), 2,80-3,80 (м, 14Н), 4,79 (кв, 1=5,5, 0,6Н), 4,91 (кв, 1=6,3, 0,4Н), 6,70-7,40 (м, 8Н), 7,77 (м, 2Н), 10,26 (уш.с, 1Н).

Масс-спектр т/ζ 629,2 (МН⁺).

Пример 15. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,5дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

- 15 008180

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 7,68-7,67 (м, 1Н), 7,67-7,56 (м, 2Н), 7,42-7,40 (м, 2Н), 7,31-7,30 (м, 1Н),

7.26- 7,23 (м, 2Н), 5,20-4,90 (м, 1Н), 4,35-4,33 (м, 1Н), 3,78-3,74 (м, 4Н), 3,57-3,54 (2Н), 3,38-3,33 (м, 2Н),

3.26- 3,21 (м, 2Н), 2,41-2,39 (м, 2Н), 2,26-2,25 (м, 2Н), 1,50-1,38 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 162,5, 162,3, 159,2, 159,0, 148,0, 146,1, 132,2, 127,8, 127,7, 127,6, 118,9, 109,1, 109,0, 108,7, 108,6, 106,2, 105,8, 52,5, 39,6, 34,1, 32,9, 9,5.

Пример 16. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 15. Стадию 6 проводят, используя этилиодид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 7,45-7,43 (м, 1Н), 7,42-7,18 (м, 2Н), 7,21-7,16 (м, 2Н), 7,07-7,06 (м, 1Н), 7,04-6,97 (м, 2Н), 5,51 (уш.с, 1Н), 4,86-4,82 (м, 1Н), 4,72-4,66 (м, 1Н), 3,84-3,77 (м, 1Н), 3,59-3,50 (м, 3Н), 3,34-3,31 (м, 2Н), 3,12-3,10 (м, 3Н), 2,99-2,96 (м, 3Н), 1,22-1,14 (м, 9Н), 1,10-1,05 (т, 1,5Н), 0,97-0,95 (т, 1,5Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 159,9, 150,9, 150,1, 134,0, 130,0, 129,7, 121,2, 107,9, 86,7, 42,0, 41,9, 36,3,

35.2, 35,1, 12,8, 12,5, 11,9, 11,8.

Пример 17. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 8,16-8,11 (м, 1Н), 7,59-7,56 (м, 2Н), 7,48-7,45 (м, 2Н), 7,26-7,24 (м, 3Н), 5,21-5,16 (м, 1Н), 3,79-3,77 (м, 4Н), 3,57-3,54 (м, 3Н), 3,48-3,46 (м, 2Н), 3,44-3,34 (м, 3Н), 3,22-3,21 (м, 3Н), 1,45-1,44 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (СПС1₃) δ 5 180,2, 170,3, 166,6, 150,3, 129,0, 128,9, 128,7, 125,9, 125,4, 117,5, 117,4,

116,5, 114,8, 107,7, 107,4, 95,5, 90,8, 68,0, 65,1, 55,7, 50,8, 37,6, 36,4, 31,9, 31,7, 31,6, 13,2, 9,4, 8,3, 7,8.

Пример 18. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 17. Стадию 6 проводят, используя этилиодид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 8,15 (уш.с, 1Н), 7,91-7,76 (м, 1Н), 7,32-7,30 (м, 2Н), 7,20-7,19 (м, 2Н), 7,04-7,00 (м, 2Н), 4,84-4,83 (м, 1Н), 4,74-4,67 (м, 1Н), 4,14-4,07 (м, 1Н), 3,92-3,82 (м, 1Н), 3,51-3,49 (м, 3Н), 3,34-3,31 (м, 3Н), 3,12-2,99 (м, 2Н), 2,98-2,97 (м, 2Н), 2,03-2,02 (м, 1Н), 1,26-1,17 (м, 6Н), 1,10-1,06 (т,

I, 5Н), 1,03-0,98 (т, 1,5Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 173,6, 173,3, 171,4, 167,7, 164,3, 161,2, 159,9, 159,3, 157,1, 156,7, 155,2,

152.4, 151,0, 150,3, 134,0, 133,3, 133,1, 132,9, 130,0, 123,2, 122,9, 122,8, 121,3, 121,2, 112,0, 111,8, 111,6,

111.5, 107,7, 107,2, 106,0, 105,9, 105,6, 105,2, 60,0, 54,8, 42,0, 36,5, 35,9, 35,3, 35,1, 19,3, 13,0, 12,9, 12,7,

II, 9, 11,8.

Пример 19. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,5дихлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 7,84-7,82 (м, 1Н), 7,76-7,75 (м, 3Н), 7,34-7,32 (м, 1Н), 7,19-7,10 (м, 1Н), 7,03-7,00 (м, 2Н), 5,50 (уш.с, 1Н), 4,83-4,82 (м, 1Н), 4,74-7,73 (м, 1Н), 3,55-3,38 (м, 4Н), 3,34-3,32 (м, 2Н), 3,15-3,11 (м, 4Н), 3,02-2,99 (м, 3Н), 1,18-1,15 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 157,1, 155,2, 150,1, 149,7, 140,1, 135,9, 134,3, 132,9, 130,0, 129,9, 126,0,

121.2, 110,7, 55,2, 54,8, 42,0, 38,5, 38,1, 36,5, 35,9, 35,2, 35,1, 11,9.

Масс-спектр т/ζ 639,1 (МН⁺).

Пример 20. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 19. Стадию 6 проводят, используя этилиодид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (С1)_;О1)) δ 8,15 (уш.с, 1Н), 7,84-7,84-7,79 (м, 1Н), 7,76-7,74 (м, 2Н), 7,33-7,30 (м, 1Н), 7,22-7,11 (м, 2Н), 7,04-6,98 (м, 1Н), 5,51 (уш.с, 1Н), 4,86-4,82 (м, 1Н), 4,72-4,67 (м, 1Н), 3,77-3,75 (м, 1Н), 3,60-3,50 (м, 3Н), 3,34-3,29 (м, 2Н), 3,27-3,22 (м, 2Н), 3,12-3,11 (м, 2Н), 2,99-2,98 (м, 2Н), 1,23-1,14 (м, 6Н), 1,10-1,05 (т, 1,5Н), 0,99-0,94 (т, 1,5Н).

Спектр ¹³С ЯМР (С1)_;О1)) δ 173,6, 173,4, 163,7, 159,9, 159,3, 157,3, 156,8, 155,2, 155,1, 152,1, 150,8,

150.2, 141,4, 141,2, 135,9, 134,0, 132,7, 130,0, 129,7, 125,8, 125,7, 121,3, 121,2, 107,9, 107,4, 54,8, 54,7, 42,0, 36,4, 35,8, 35,3, 35,1, 12,8, 12,5, 11,9, 11,8.

Масс-спектр т/ζ 653,2 (МН⁺).

Пример 21. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 1-пропилиодид вместо диметилсульфата.

- 16 008180

Спектр '11 ЯМР (СПС1₃) δ 0,75 (м, 3Н), 1,00-1,50 (м, 8Н), 3,00 (с, 3Н), 3,08 (с, 3Н), 3,20-3,70 (м, 8Н), 4,79 (кв, 1=6,3, 0,6Н), 4,91 (кв, 1=6,6, 0,4Н), 5,73 (уш.с, 0,6Н), 5,92 (уш.с, 0,4Н), 6,90-7,45 (м, 7Н), 7,76 (м, 2Н).

Масс-спектр т/ζ 617,2 (МН⁺).

Пример 22. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1.

Стадию 6 проводят, используя аллилбромид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (СПС1₃) δ 1,20 (м, 6Н), 2,98 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-4,30 (м, 8Н), 4,75- 4,95 (м, 1Н), 5,07 (м, 2Н), 5,48 (м, 0,6Н), 5,67 (м, 0,4Н), 6,90-7,45 (м, 8Н), 7,76 (м, 2Н), 11,07 (уш.с, 1Н).

Масс-спектр т/ζ 615,2 (МН⁺).

Пример 23. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя изобутилиодид вместо диметилсульфата.

Масс-спектр т/ζ 631,2 (МН⁺).

Пример 24. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 1-бутилиодид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (СПС1₃) δ 0,82 (кв, 1=7,1, 3Н), 1,05-1,40 (м, 10Н), 3,01 (с, 3Н), 3,10 (с, 3Н), 3,15-3,80 (м, 8Н), 4,75 (кв, 1=6,3, 0,6Н), 4,91 (кв, 1=5,9, 0,4Н), 5,79 (д, 1=5,4, 0,6Н), 5,91 (д, 1=6,6, 0,4Н), 7,00-7,40 (м, 7Н), 7,77 (м, 2Н).

Пример 25. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1.

Стадию 5 проводят с использованием 2,6-дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.

Спектр '11 ЯМР ((1)1)1)) δ 8,38-8,37 (м, 1Н), 7,99-7,95 (м, 1Н), 7,55-7,54 (м, 2Н), 7,50-7,42 (м, 2Н),

7,27-7,22 (м, 2Н), 5,08-5,06 (м, 1Н), 3,76-3,74 (м, 4Н), 3,59-3,54 (м, 3Н), 3,49-3,42 (м, 4Н), 3,36-3,34 (м, 2Н), 3,23-3,21 (м, 2Н), 1,40 (уш.с, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР ((1)1)1)) δ 161,4, 159,2, 155,8, 153,1, 148,1, 147,1, 133,6, 132,0, 127,8, 119,0, 111,1,

110.8, 110,7, 108,5, 105,8, 94,8, 86,4, 66,7, 54,0, 52,8, 39,7, 35,8, 34,2, 33,7, 32,9, 32,8, 9,4.

Пример 26. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2,3дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида. 2,3-Дифторбензолсульфохлорид получают по приведенной ниже методике.

Спектр '11 ЯМР ((1)1)1)) δ 8,32 (уш.с, 1Н), 7,90-7,80 (м, 2Н), 7,59-7,48 (м, 3Н), 7,27-7,23 (м, 2Н), 5,09-5,08 (м, 1Н), 3,77-3,70 (м, 4Н), 3,60-3,51 (м, 3Н), 3,50-3,42 (м, 2Н), 3,39-3,31п (м, 3Н), 3,32-3,18 (м, 2Н), 1,43-1,41 (м, 6Н).

Спектр ¹³С ЯМР ((1)1)1)) δ 170,4, 160,8, 158,1, 156,1, 153,0, 151,6, 150,5, 148,9, 148,2, 147,3, 147,2,

143.9, 143,5, 142,6, 141,1, 140,9, 131,8, 127,7, 125,1, 123,8, 120,8, 120,6, 119,2, 40,5, 35,7, 33,4, 32,9, 32,7, 9,0.

Получение 2,3-дифторбензолсульфохлорида.

Следующую методику осуществляют в двух колбах. В первой колбе 2,3-дифторанилин (2,0 г, 0,015 моль) растворяют в концентрированной НС1 (15,9 мл) и полученный раствор охлаждают до -5°С на бане лед/№С1. Порциями при перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (1,18 г, 0,017 моль) в дистиллированной воде (13,6 мл), поддерживая температуру ниже 0°С, и затем смесь перемешивают в течение 10 мин. Во второй колбе тионилхлорид (5,08 мл, 0,069 моль) по каплям добавляют к дистиллированной воде (30,6 мл), которую предварительно охлаждают до -5°С на бане лед/ЫаС1. Полученному раствору дают нагреться до комнатной температуры, затем добавляют СиС1 (0,08 г, 0,77 ммоль) и реакционную смесь вновь охлаждают до -5°С. При продолжении охлаждения и при перемешивании содержимое первой колбы добавляют порциями в 2 мл к содержимому второй колбы и полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, при этом образуется осадок. Осадок отделяют фильтрованием, промывают холодной водой и выдерживают в вакууме, получая 3,25 г (98%) продукта в виде белого твердого вещества.

Пример 27. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя пропаргилбромид вместо диметилсульфата.

Спектр '11 ЯМР (СПС1₃) δ 1,15 (м, 6Н), 2,27 (д, 1=2,1, 1Н), 2,97 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-3,70 (м, 6Н), 3,75 (дд, 1=17,7, 2,0, 0,6Н), 3,95 (дд, 1=18,1, 2,0, 0,4Н), 4,51 (дд, 1=19,5, 2,2, 0,6Н), 4,54 (дд, 1=18,1, 2,2, 0,4Н), 4,79 (кв, 1=5,9, 0,6Н), 4,88 (кв, 1=6,6, 0,4Н), 6,42 (уш.д, 0,4Н), 6,65 (уш.с, 0,6Н), 6,85-7,30 (м, 6Н),

- 17 008180

7,52 (с, 0,6Н), 7,56 (с, 0,4Н), 7,85 (м, 2Н), 8,20 (уш.с, 1Н).

Масс-спектр т/ζ 613,2 (МН⁺).

Пример 28. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 17. Стадию 6 проводят, используя пропаргилбромид вместо диметилсульфата.

Спектр ¹Н ЯМР (СПС1₃) δ 1,16 (кв, 1=7,5, 6Н), 2,27 (м, 1Н), 2,99 (с, 3Н), 3,09 (с, 3Н), 3,10-3,70 (м, 6Н), 4,04 (дд, 1=17,7, 2,4, 0,6Н), 4,24 (дд, 1=17,9, 2,2, 0,4Н), 4,47 (м, 1Н), 4,81 (кв, 1=5,9, 0,6Н), 4,89 (кв, 1=6,3, 0,4Н), 6,27 (д, 1=7,5, 0,4Н), 6,41 (д, 1=5,7, 0,6Н), 6,90-7,10 (м, 4Н), 7,16 (д, 1=8,3, 1Н), 7,28 (д, 1=8,3, 1Н), 7,55 (уш.с, 1Н), 7,66 (с, 0,6Н), 7,67 (с, 0,4Н), 7,81 (м, 1Н).

Пример 29. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2,2,2-трифторэтил)амино] пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.

Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 2,2,2-трифторэтилтрифлат и карбонат цезия вместо диметилсульфата и карбоната калия.

Спектр '11 ЯМР (СПС1₃) δ 1,14 (м, 6Н), 2,98 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-4,20 (м, 8Н), 4,80 (кв, 1=5,9, 0,6Н), 4,87 (кв, 1=6,2, 0,4Н), 6,09 (д, 1=5,9, 0,4Н), 6,18 (уш.д, 0,6Н), 6,80-7,50 (м, 7Н), 7,55 (уш.с, 1Н), 7,77 (м, 2Н).

Масс-спектр т/ζ 657,2 (МН⁺).

Пример А. Анализ адгезии α₄βι: адгезия клеток 1игка1™ к фибронектину плазмы человека. Методика.

96-луночные планшеты (планшеты Сок1ат 3590 ΕΙΑ) в течение ночи при температуре 4°С покрывают фибронектином человека (С1Ьсо/ВКЕ, номер по каталогу 33016-023) с концентрацией 10 мкг/мл. Затем лунки блокируют с помощью раствора бычьего сывороточного альбумина (В8А; 0,3%) в физиологическом растворе. Клетки 1итка1™ (поддерживают в логарифмической фазе роста) метят кальцеином АМ в соответствии с рекомендациями производителя и суспендируют в концентрации 2х10⁶ клеток/мл в смеси Нерек/физиологический раствор/В8А. Затем на клетки в течение 30 мин воздействуют испытуемыми и контрольными соединениями и затем переносят в индивидуальные лунки покрытого фибронектином планшета. Дают им возможность прилипнуть в течение 35 мин при температуре 37°С. Затем лунки промывают осторожным отсасыванием и внесением свежего физиологического раствора с помощью пипетки. Флюоресценцию, вызываемую оставшимися прилипшими клетками, количественно оценивают с помощью флюоресцентного планшет-ридера ΕΧ 485/ЕМ 530.

Клеточную культуру получают, разделяя сначала стационарную фазу клеток 1итка1™ в соотношении 1:10 в первый день и в соотношении 1:2 на второй день, с целью проведения анализа на третий день. Клетки, которые разделяли в соотношении 1:10 в первый день, разделяют в соотношении 1:4 на третий день, с целью проведения анализа на четвертый день.

Исследуемые планшеты получают путем приготовления сначала рабочего раствора фибронектина человека от компании С1Ьсо/ВКЕ (номер по каталогу 33016-023) в РВ8++ с концентрацией 10 мкг/мл.

Далее планшеты Сок!ат 3590 ΕΙΑ покрывают количеством 50 мкл на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре (можно также оставить на ночь при температуре 4°С). Наконец, планшеты отсасывают и блокируют буферным раствором Нерек/физиологический раствор, 100 мкл/лунка, в течение 1 ч при комнатной температуре, и затем трижды промывают 150 мкл РВ8++.

Разведенные растворы соединений получают путем проведения последовательных разведений растворов соединений в соотношении 1:3 по следующей методике. Для каждого планшета (4 соединения на планшет) 600 мкл вносят в 4 пробирки для титрования Вю-Еаб, которые установлены в держателе. В каждую соответствующую трубку добавляют достаточное количество соединения, чтобы получить 2Х концентрацию с помощью методов, хорошо известных в данной области. Используя гибкие планшеты Еа1соп, в ряды с В по С добавляют 100 мкл буферного раствора Нерек/физиологический раствор или сыворотки человека. Используют пипетки объемом 180 мкл для одновременного пипетирования, имеющих четыре насадки, которые установлены на одинаковом расстоянии друг от друга. Каждый набор пробирок смешивают 5 раз и для каждого разведения 180 мкл 2Х раствора соединения помещают в первую колонку в ряду В, оставляя ряд А пустым. 180 мкл добавляют в другие лунки в ряду А. Серию разведений на планшете проводят путем переноса 50 мкл в следующее разведение и смешивают 5 раз, сменяя насадки после каждого разведения. Разведения останавливаются на ряду Е. В ряде С соединение отсутствует.

Раствор 21/6 антитела с концентрацией 20 мкг/мл в буферном растворе Нерек/физиологический раствор или сыворотке человека служит в качестве позитивного контроля, и его сохраняют в кювете для реагентов, чтобы добавлять в суспензию клеток на планшете.

Окрашивание клеток осуществляют, отбирая вначале логарифмическую фазу клеток 1итка1™ центрифугированием в пробирках емкостью 50 мл (1100 об./мин в течение 5 мин). Клетки вновь суспендируют в 50 мл РВ8++, центрифугируют и снова суспендируют в 20 мл РВ8++. Клетки окрашивают, добавляя 20 мкл кальцеина АМ в течение 30 мин при комнатной температуре. Объем доводят до 50 мл с помощью буфера Нерек/физиологический раствор, клетки подсчитывают, центрифугируют и вновь суспендируют в

- 18 008180 количестве 2х10⁶ клеток/мл в буфере Нерез/физиологический раствор или в сыворотке человека.

Соединения инкубируют, используя следующую методику. На новом гибком планшете в ряды с В до Н добавляют 65 мкл окрашенных клеток. После подготовки планшета в соответствующие ряды добавляют 65 мкл соединений 2Х и смешивают 3Х. В ряд Н добавляют 65 мкл антитело 2Х-21/6 и смешивают 3Х. Наконец, планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Адгезию фибронектина после приведенной ниже процедуры обработки измеряют с использованием флюоресцентного планшет-ридера ЕХ 485/ЕМ 530. После инкубирования клетки смешивают 3Х и 100 мкл переносят на покрытые фибронектином планшеты и инкубируют при температуре 37°С в течение 35 мин. Каждый планшет промывают ряд за рядом, при комнатной температуре осторожно добавляя пипеткой по 100 мкл РВ8++ по стенке лунки и поворачивая планшеты на 90° для проведения отсоса. Процедуру повторяют в общей сложности для трех промывок. После промывки в каждую лунку по стенке с помощью пипетки помещают по 100 мкл.

Значение 1С₅₀ рассчитывают для каждого соединения, как в присутствии сыворотки человека, так и в отсутствие сыворотки человека. 1С₅₀ означает концентрацию, при которой рост и активность ингибируется на 50%. Полученные данные приведены в следующих таблицах.

Адгезия клеток к фибронектину плазмы человека (без сыворотки человека)

- 19 008180

Адгезия клеток к фибронектину плазмы человека (с сывороткой человека)

Пример №	1С5о (мкг/мл)
1.	0,318
2.	0,317
3.	0,152
4 .	0,4
5.	1,851378
6.	0,313768
7 .	0,586901
8 .	0,16269
9.	0,106
10.	0,256177
11.	0,22931
12.	0,06
13.	0,075
14.	0,04
15.	0,124287
16.	0,067069
17.	0,024
18 .	0,025
19.	0,085347
О г\ & V .	г\ г\п п с; п с. / V / / чЭ ν и
21.	0,39998
22.	0,025293
23.	0,074
24.	0, 027
25.	6, 72
26.	0,018482
27.	0,065
28.	0, 046
29.	0,034782

Пример В. Анализ насыщения ίη νίΐτο для определения связывания соединений-кандидатов с СсД-интегрином.

Ниже приводится ίη νίΐτο анализ для определения уровней в плазме, необходимых для того, чтобы соединение было активным на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), который описан в следующем примере, или на других ίη νίνο моделях.

Клетки линии 1итка1 в логарифмической фазе роста промывают и вновь суспендируют в нормальной животной плазме, содержащей 20 мкг/мл антитела 15/7 (Уейпоск еΐ а1., I. ΒίοΙ. СИет. (1995), 270 (48): 28740).

Клетки линии 1итка1: разводят вдвое либо образцами нормальной плазмы, содержащими известное количество соединения-кандидата в различных интервалах концентраций от 66 до 0,01 мкМ, используя стандартное последовательное разведение по 12 точкам для стандартной кривой, либо образцами плазмы, полученными из периферической крови животных, которым вводили соединения-кандидаты.

Затем клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, дважды промывают забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 2% сыворотки плода коровы и по 1 мМ каждого хлорида кальция и хлорида мания (среда для анализа), с целью удаления антитела 15/7.

Затем клетки подвергают воздействию связанным фикоэритрином 1§О Ес козла Р(аЬ')₂ против мыши (Iттиηοΐесй, Уэстбрук, МЕ), который был адсорбирован для устранения любого неспецифического

- 20 008180 перекрестного взаимодействия путем совместной инкубации с 5%-ной сывороткой, полученной от испытуемых животных, в соотношении 1:200 и инкубируют в темноте при температуре 4°С в течение 30 мин.

Клетки дважды промывают средой для анализа и вновь суспендируют в той же среде. Их исследуют по стандартному аналитическому методу с помощью активируемого флюоресценцией анализатора клеток, который описан Уейгюск с1 а1., 1. ΒίοΙ. СНсш. 1995, 270: 28740.

Полученные данные затем наносят на график зависимости флюоресценции от дозы, т. е. в виде нормальной ответной реакции на дозы. Уровни дозы, которые приводят к образованию плато на кривой, соответствуют уровням, необходимым для достижения эффективности на ίη νίνο модели.

Этот анализ также используют для определения уровней в плазме, необходимых для насыщения мест связывания других интегринов, таких как аДгинтегрин. который представляет собой интегрин, наиболее родственный а₄Р1-интегрину (Ра1тег с1 а1., 1993, 1. Се11 Βίο., 123: 1289). Такое связывание подтверждают ίη νίνο на пригодность для воспалительных состояний, опосредованных а₉в1-интегрином, включая, например, гиперчувствительность дыхательных путей и закупорку дыхательных путей, которая происходит при хронической астме, пролиферации клеток гладких мышц при атеросклерозе, закупорку сосудов после ангиопластики, фиброз и клубочковое рубцевание в результате заболевания почек, стеноз аорты, гипертрофию синовиальных мембран при ревматоидном артрите и воспаление и рубцевание, наблюдаемые в процессе развития язвенного колита и болезни Крона.

Соответственно, приведенный выше анализ, вместо клеток ЛикаР можно провести с клетками клеточной линии толстой кишки человека ЗА 480 (Американская коллекция типовых культур, № ССЬ228), трансфекцированных с помощью кДНК, кодирующей а₉-интегрин (Υοкο8ак^ с! а1., 1994, к Βίο1. Сйет., 269: 26691) вместо клеток ДикаР с целью определения связывания а-Д-интегрина. В качестве контроля можно использовать клетки ЗА 480, экспрессирующие другие субъединицы а и β₁.

Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения болезни у пациента млекопитающего, опосредованного α₉βι, при этом способ заключается в введении указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению. Указанные соединения преимущественно вводят в виде фармацевтической композиции, приведенной выше в настоящем описании. Эффективная дневная доза будет зависеть от возраста, массы и состояния пациента, и эти факторы легко могут быть установлены лечащим врачом. Тем не менее, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединения вводят в количестве приблизительно от 20 до 500 мкг/кг в день.

Пример С. Кассетная дозировка и анализ сыворотки для определения биодоступности.

Пероральную биодоступность устанавливают путем введения крысам кассетной дозы, т. е. смеси 6 соединений на дозировочный раствор. Кассета содержит 5 тестируемых образцов и стандартное соединение, при этом общая доза составляет 10 мг/кг. Каждое соединение/тестируемый образец превращают с натриевую соль с помощью эквимолярного количества 1н раствора ЫаОН и растворяют в воде в количестве 2 мг/мл. Кассету готовят, смешивая равные объемы каждого из 6 растворов. Кассетный дозировочный раствор хорошо смешивают и затем доводят рН до 7,5-9. Дозировочный раствор получают за день до проведения исследования и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.

Для проведения этого анализа используют самцов крыс Зргадие Оа\\!еу (ЗЭ) в возрасте 6-8 недель, полученных от С.'11аг1е5 Р|уег Ρπόοπ-ιΙο^δ. Крыс выдерживают на карантине, по крайней мере, в течение 1 дня и постоянно снабжают пищей и водой. В ночь перед введением кассеты крысам не дают пищу в течение приблизительно 16 ч.

Для каждой кассеты выбирают четырех 3Ό крыс. Каждой крысе перорально вводят однократную дозу дозировочного раствора. Регистрируют дозировочный объем (5 мл/кг) и время и крыс кормят в течение 2 ч после введения дозы.

Отбирают образцы крови с помощью сердечной пункции через следующие временные интервалы: 4 ч, 8 ч и 12 ч. Непосредственно перед отбором проб крови крыс анестезируют в течение 10-20 с с помощью газообразного углекислого газа. Через 12 ч отбирают образцы, крыс безболезненно умерщвляют асфиксией углекислым газом и затем проводят шейное смещение.

Образцы крови перед использованием хранят в покрытых гепарином пробирках при температуре ниже комнатной (4°С). Образцы крови центрифугируют (10000 об./мин в течение 5 мин), плазму отделяют и хранят в холодильнике при температуре -20°С, пока не потребуется проведение анализа на содержание лекарства. Уровни лекарства в плазме анализируют с использованием следующего протокола для прямого осаждения плазмы.

Образцы плазмы ίη νίνο готовят на 96-луночном планшете емкостью 1,5 мл путем последовательного добавления 100 мкл исследуемой плазмы и 150 мкл метанола и затем перемешивают при встряхивании в течение 10-20 с. Добавляют 150 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле с концентрацией 0,05 нг/мкл и перемешивают при встряхивании в течение 30 с.

Образцы для получения стандартной кривой готовят на 96-луночном планшете емкостью 1,5 мл путем последовательного добавления 100 мкл контрольной плазмы мыши, 150 мкл метанола и перемешивания при встряхивании в течение 10-20 с. Добавляют 150 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле с концентрацией 0,05 нг/мкл и перемешивают при встряхивании в течение 30 с. В образцы вносят небольшие количества 0-200 нг (10 концентраций) исследуемых соединений в 50%-ном метаноле и получают стандартную кривую в интервале концентраций 0,5-2000 нг/мл. Образцы снова перемешивают при встряхивании в течение 30 с.

- 21 008180

Далее образцы вращают в течение 20-30 мин со скоростью 3000 об./мин в микроцентрифуге Эппендорфа и затем 80-90% надосадочной жидкости переносят в чистый 96-луночный планшет.

Органический растворитель выпаривают до тех пор, пока образцы не станут сухими (в атмосфере азота при температуре 40°С/30-40 мин (2ушагкТигЪоуар)).

Затем остаток растворяют в 200-600 л подвижной фазы (50% СН₃ОН/0,1% ТТЛ). ЖХ/МС/МС проводят с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра РЕ-8с1ех ΑΡΙ-3000 (8Ν0749707) компании Регкш-Е1шег, снабженного автосамплером 8ег1е§200 и насосом 10А компании ΒΙιίιιΐίκ,Ιζιι. Сбор данных осуществляют с помощью программы РЕ-8с1ех Апа1уз1 (ν1.1) и анализ и количественную оценку проводят с помощью программы РЕ-8с1ех Апа1уз1 (ν1.1). Образец с объемом 5-50 мкл инжектируют в колонку ТйегшоНурег811 ΏΑ8Η-18 с обращенной фазой (КехМопе 2,0x20 мм, 5 мкм, Р№ 8823025-701) и используют подвижную фазу 25% СН₃ОН, 0,1% ТТА-100% СН₃ОН, 0,1% ТТА. Время проведения анализа составляет около 8 мин при скорости подачи подвижной фазы приблизительно 300 мкл/мин.

Площадь под кривой (АиС) рассчитывают по линейному методу трапеции от времени ΐ=0 до времени исследования последнего образца ΐ_χ (см. НапбЪоок о£ Ваз1с Рйагшасокшейсз, ’^оИдапд А. Кйзсйе1 апб Огедогу Е. Кеагпз, 5¹¹' еб, 1999).

АиС^{0 1х}=8((С_п+С_п+1)/2))-(1_п+1-1_п) [(мкг/мл)ч]

В случае примера кассетного дозирования, для образцов после 4, 8 и 12 ч дозировки площадь под кривой рассчитывают от значения 1=0 до значения ΐ=12 ч.

Значения АиС⁰^^{12 ч} рассчитывают для каждого индивидуального животного, и средние значения АиС⁰^^{12 ч} представлены ниже в таблице.

- 22 008180

Пример Ό. Модели астмы.

Воспалительные состояния, опосредованные а.Д-интегринами. включают, например, приток эозинофилов, гиперчувствительность дыхательных путей и закупорку дыхательных путей, которая наблюдается при хронической астме. Далее описываются модели астмы у животных, которые используют для изучения ίη νίνο воздействия соединений по настоящему изобретению, с целью применения при лечении астмы.

Модель астмы у крыс.

В соответствии с методикой, приведенной в документах Сйартап е! а1., Ат. I. Кезр. Сгб. Саге Меб., 153: 4, А219 (1996) и Сйартап е! а1., Ат. I. Кезр. Сгб. Саге Меб., 155: 4, А881 (1997), оба из которых включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки, овальбумин (ОА, 10 мкг/мл) смешивают с гидроксидом алюминия (10 мкг/мл) и вводят в виде подкожной инъекции крысам Вго\уп ΝθΓ\ν;·ιν в день 0. Инъекции овальбумина вместе со вспомогательным соединением повторяют на 7-й и 14-й день. На 21-й день сенсибилизированных животных размещают в пластиковых трубках и подвергают (в течение 60 мин) воздействию аэрозоля овальбумина (10 мкг/кг) с помощью системы, обеспечивающей попадание препарата только через нос. Через 72 ч животных умерщвляют, используя пентобарбитал (250 мг/кг, внутривенно). Легкие промывают через трахеальную канюлю, используя 3 аликвоты (4 мл) раствора Ханка (НВ88х10, 100 мл; 100 мМ ЕЭТА, 100 мл; НЕРЕ8 1М, 25 мл; доводят до объема 1 л водой); извлеченные клетки объединяют и общий объем выделенной жидкости доводят до 12 мл добавлением раствора Ханка. Подсчитывают общее количество клеток (клеточный микросчетчик 8узтех Е-500, ТОА Меб1са1 Е1ес1гошсз О!б., Япония) и берут мазки путем разведения выделенной жидкости (приблизительно 10⁶ клеток/мл) и отбора аликвоты пипеткой (100 мкл) в центрифугу (Су!озрш, Шендон, Великобритания). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют в течение 5 с с помощью раствора малахитового зеленого в метаноле (2 мг/мл) и, с целью дифференцировать эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, окрашивают эозином С (5 с) (ПТТ-Цшск, Вго\упе Ь!б., Великобритания). Общее количество, рассчитанное по данным оптической микроскопии (х100) при погружении в масло, составляет 500 клеток на мазок. Соединения по настоящему изобретению готовят в виде суспензии с 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 2% Т\гееп 80 и вводят перорально крысам, которых сенсибилизируют аллергеном, овальбумином. В данной модели считаются активными те соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют индуцированное аллергеном накопление лейкоцитов в дыхательных путях у активно сенсибилизированных крыс Вго\уп №г\гау.

Модель астмы у мышей.

Соединения по настоящему изобретению оценивают также на модели острого воспаления легких у мышей в соответствии с методикой, приведенной Кцпд е! а1., Ат. I. Кезрп. Се11 Мо1. Βίο1. 13: 360-365 (1995) и 8сйпе1бег е! а1., Ат. I. Кезрп. Се11 Мо1. Βίο1. 20: 448-457 (1999), каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Женские особи мышей В1аск/6 (в возрасте 8-12 недель) сенсибилизируют в первый день внутрибрюшинной инъекцией 0,2 мл смеси овальбумина/квасцы, содержащей 20 мкг овальбумина (Сгабе 4, 81дша) и 2 мг квасцов для инъекций (Р1егсе). На 14-й день вводят усиленную дозу. На 28-й и 29-й день мышам в течение 20 мин вводят провокационную пробу 1% овальбумина в виде аэрозоля (0,9% в физиологическом растворе). Мышей безболезненно умерщвляют и собирают образцы бронхоальвеолярных смывов (3 мл) на 30-й день, через 48 ч после введения первой пробы. Количество эозинофилов оценивают по методу окрашивания с помощью ЕАС/Р1ТС. Соединения по настоящему изобретению готовят в виде суспензии с 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 2% Т\гееп 80 и вводят перорально мышам, которых сенсибилизируют аллергеном, овальбумином. На данной модели считаются активными те соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют индуцированное аллергеном накопление лейкоцитов в дыхательных путях у активно сенсибилизированных мышей С57ВБ/6.

Модель астмы у овец.

На этой модели используют методику, приведенную АЬгайат е! а1., I. С1ш. Икез!., 93: 776-787 (1994) и АЬгайат е! а1., Ат. I. Кезрп. Сгб. Саге Меб., 156: 696-703 (1997), каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Соединения по настоящему изобретению оценивают с помощью внутривенного (водный раствор соли), перорального (2% Т\гееп 80, 0,5% карбоксиметилцеллюлозы) и аэрозольного введения овцам, которые обладают повышенной восприимчивостью к антигену Азсапз зиит. Активными в этой модели считаются те соединения, которые снижают раннюю индуцированную антигеном бронхиальную ответную реакцию и/или блокируют ответную реакцию дыхательных путей в поздней фазе, например обладают защитным действием против индуцированной антигеном поздней ответной реакции и повышенной восприимчивости дыхательных путей.

Для изучения воздействия на дыхательные пути соединений-кандидатов используют аллергических овец, у которых выявлена возможность развития как ранних, так и поздних бронхиальных ответных реакций на ингаляции антигена Азсапз зиит. После местной анестезии носовых проходов 2%-ным лидокаином через одну ноздрю в нижней части пищевода размещают баллонный катетер. Затем животным через вторую ноздрю, используя в качестве направляющего волоконооптический бронхоскоп, вводят снабженную манжетой эндотрахеальную трубку и животных инкубируют.

Плевральное давление оценивают по методике Абрахама (1994). Аэрозоли (см. составы, приведен

- 23 008180 ные ниже) генерируют с помощью сменного медицинского пульверизатора, создающего аэрозоль со средним массовым аэродинамическим диаметром частиц, равным 3,2 мкм, который определяют каскадным импактором Андерсена. Пульверизатор подсоединяют к дозиметрической системе, содержащей электромагнитный клапан и источник сжатого воздуха (20 фунт/дюйм²). Выход пульверизатора направляют в пластмассовый Т-образный образец для испытаний, один из концов которого подсоединен к дыхательному каналу поршневого респиратора. Электромагнитный клапан открывают на 1 с в начале дыхательного цикла респиратора. Аэрозоли поступают в количестве ν_τ 500 мл со скоростью 20 вдохов в минуту. В качестве контроля применяют лишь 0,5%-ный раствор бикарбоната натрия.

Для исследования бронхиальной ответной реакции используют кумулятивные кривые зависимости ответной реакции от концентрации карбахола, которые строят по методу Абрахама (1994). Биопсии из бронхов берут перед и в процессе проведения лечения и через 24 ч после введения антигена. Биопсии берут, используя методику Абрахама (1994).

Ιη νίίΓΟ изучение адгезии альвеолярных макрофагов также проводят по методике Абрахама (1994) и определяют процент прилипших клеток.

Получение аэрозоля.

Раствор соединения-кандидата в растворе 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор (мас./об.) с концентрацией 30,0 мг/мл готовят, используя следующую методику.

А. Приготовление маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор: 100,0 мл.

Ингредиент	Граммы на 100,0 мл	Конечная концентрация
Бикарбонат натрия	0,5 г	0,5%
Физиологический	Достаточное	Достаточное количество
раствор	количество до 100 мл	до 100%

Методика.

1. Помещают 0,5 г бикарбоната натрия в мерную колбу емкостью 100 мл.

2. Добавляют приблизительно 90,0 мл физиологического раствора и подвергают ультразвуковой обработке до полного растворения соли.

3. Добавляют необходимое количество физиологического раствора до объема 100,0 мл и тщательно перемешивают.

В. Приготовление раствора соединения-кандидата с концентрацией 30,0 мг/мл: 10,0 мл.

Ингредиент	Граммы на 10,0 мл	Конечная концентрация
Соединение-кандидат	0,300 г	30,0 мг/мл
Маточный раствор 0,5% бикарбонат	Достаточное	Достаточное
натрия/физиологический раствор	количество	количество до
	до 10,0 мл	100 %

Методика.

1. Помещают 0,300 г соединения-кандидата в мерную колбу емкостью 10,0 мл.

2. Добавляют приблизительно 9,7 мл маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор.

3. Обрабатывают ультразвуком до полного растворения.

4. Добавляют необходимое количество маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор до объема 10,0 мл и тщательно перемешивают.

Пример Е. 10-дневные исследования на токсичность на мышах С57В6.

10-дневные исследования проводят с целью изучения токсичности соединений по настоящему изобретению по отношению к самкам мышей С57В6. Соединения вводят через желудочный зонд с пятью уровнями дозировки, 0 (контрольный образец с носителем), 10, 30, 100, 300 и 1000 мг/кг, при этом для каждого уровня дозировки берут 5 мышей. Объем дозы для всех уровней дозировки составляет 10 мл/кг. Растворы или суспензии доз готовят в 2%-ном Т\\ееп 80 и 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе, при этом новые растворы или суспензии доз готовят каждые 2-3 дня. Наблюдения за животными включают измерение массы тела (на 1, 2, 3, 5, 7, 8 и 11 дни изучения), ежедневные клинические наблюдения за животными в клетке (1-2/день) и проведение набора периодических (-1, 2 и 9 дни изучения) функциональных исследований.

- 24 008180

По завершении берут образцы крови сердечной пункцией с целью изучения клинической патологии (гематологии и клинической химии) и определения уровней лекарства. Образцы крови с ЕЭТА анализируют для определение общего содержания лейкоцитов, содержания эритроцитов, содержания гемоглобина, гематокритного числа, индексов эритроцитов (МСУ, МСН, МСНС), содержания тромбоцитов и дифференциального подсчета лейкоцитов с разделением на пять субпопуляций (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы). Образцы плазмы с гепарином анализируют на содержание аланин-трансминазы, аспартат-трансминазы, алкалинфосфатазы, на общее содержание билирубина, альбумина, белка, кальция, глюкозы, мочевого азота, креатинина, холестерина и триглицеридов.

После отбора крови тельца животных вскрывают и взвешивают органы (печень, селезенку, почки, сердце и вилочковую железу). Берут образцы тканей слюнных желез, вилочковой железы, сердца, легкого, печени, почки, надпочечников, желудка, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки, толстой кишки и маточника/яичников и фиксируют их формалином. Из тканей, полученных от контрольных животных, которым вводили носитель, и животных, которым назначали дозы 300 и 1000 мг/кг, готовят образцы для окрашенных пластинок Н&Е и оценивают на наличие гистопатологических повреждений.

Данные по изменению массы тела, абсолютные и относительные массы органов и результаты клинической патологии, с целью получения статистически значимых различий в сравнении с контрольными образцами, взятыми от животных, получавших носитель, анализируют с помощью множественной сравнительной пробы Даннета, используя программное обеспечение фирмы Рпзт. Результаты набора функциональных тестов, с целью определения различий, анализируют, используя пробу Даннета, точную пробу Фишера, и изменение эффекта в зависимости от дозы анализируют с помощью корреляционного теста Кохрана-Мантеля-Хенсцеля и программного обеспечения фирмы ЗАЗ.

В указанной модели активны соединения по настоящему изобретению, которые готовят в виде обычных составов для перорального введения.

Пример Е. Модель адъювант-индуцированного артрита у крыс.

Адъювант-индуцированный артрит на животных моделях используют при изучении ревматоидного артрита, который индуцируют путем инъекции М. 1иЬегси1о818 крысам 1,е'\\18 в основание хвоста. В интервале между 10 и 15 днями после инъекции у животных развивается острый прогрессирующий артрит.

В общем случае, соединения испытывают на их способность изменять распухание задней лапы и повреждения костей, вызванные адъювант-индуцированным отеком у крыс. Для количественной оценки подавления распухания задней лапы, возникающего в результате адъювант-индуцированного артрита, определяют две фазы воспаления: (1) первичное и вторичное воспаление лапы, в которую делают инъекцию, и (2) вторичное воспаление лапы, в которую не делают инъекцию, обычно начинающее развиваться приблизительно на 11-й день после индуцирования воспаления лапы, в которую делают инъекцию. Снижение последнего типа воспаления является указанием иммуносупрессивной активности. Например, СЬапд, АЛЬ. КЬеит., 20, 1135-1141 (1977).

Использование животной модели ревматоидного артрита, такой как адъювант-индуцированный артрит, помогает изучить процессы в клетках, протекающие на ранних стадиях болезни. Экспрессия СО44 макрофагами и лимфоцитами усиливается в начале развития адъювантного артрита, в то время как экспрессия ЬЕА-1 усиливается позднее по мере развития болезни. Понимание взаимодействий между адгезией молекул и эндотелием на первых стадиях адъювантного артрита может привести к значительным успехам в развитии методов, применяемых при лечении ревматоидного артрита.

Claims (17)

1. Ν- [2-Ν',Ν'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбамоилок- сифенилаланиновое соединение формулы (I) н¹

0) где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;

р равно 0 или целому числу от 1 до 3;

К¹ выбирают из группы, включающей метил и этил;

К² выбирают из группы, включающей С₁-С₅алкил, аллил и (С₁-С₄)алкилен-(Сз-С₆)циклоалкил; и его фармацевтически приемлемые соли.

2. №[2-№,№-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилала- 25 008180 ниновое соединение формулы (II) где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;

т равно целому числу 1 или 2;

К² выбирают из группы, включающей С1-С₅алкил, аллил и (С1-С₄)алкилен-(С₃-С₆)циклоалкил; и его фармацевтически приемлемые соли.

3. К-[2-К',К'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (III) где каждый X независимо означает фтор или хлор;

η равно 0 или 1;

К² означает -СН₂-К', где К' выбирают из группы, включающей водород, метил или -СН=СН₂;

и его фармацевтически приемлемые соли.

4. Соединение по любому из пп.1, 2 или 3, где К² означает СН₃.

5. Соединение по п.3, где X означает Р или С1 и η равно 0.

6. Соединение, выбранное из группы, включающей

2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

- 26 008180

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3(4 - диметилкарбамоилоксифенил )пр опионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил )пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2-трисфторэтил)амино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

и их фармацевтически приемлемые соли.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительным действием, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения по любому из пп.1-3, 5 или 6.

8. Способ ингибирования клеточной адгезии, опосредованной α-интегринами, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3, 5 или 6.

9. Х-[2-Х',ЖДиэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (IV) где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;

р равно 0 или целому числу от 1 до 3;

К¹ выбирают из группы, включающей метил и этил;

К² означает С2-С6алкинил;

и его фармацевтически приемлемые соли.

10. Х-[2-Х',ЖДиэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенил- аланиновое соединение формулы (V)

- 27 008180 (V) где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;

т равно целому числу 1 или 2;

К² означает С₂-С₆алкинил;

и его фармацевтически приемлемые соли.

11. Х-[2-№,Х'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенил- аланиновое соединение формулы (VI) где каждый X независимо означает фтор или хлор;

η равно 0 или 1;

К² означает С₂-С₆алкинил;

и его фармацевтически приемлемые соли.

12. Соединение по любому одному из пп.9, 10 или 11, где К² означает пропаргил.

13. Соединение по п.11, где X означает Е или С1 и η равно 0.

14. Соединение, выбранное из группы, включающей 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4- диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;

и их фармацевтически приемлемые соли.

15. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительным действием, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения по любому из пп.9-11, 13 или 14.

16. Способ ингибирования клеточной адгезии, опосредованной α-интегринами, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.9-11, 13 или 14.

17. Способ по п.16, где клеточная адгезия, опосредованная α-интегринами, вызвана ревматоидным артритом.