EA004300B1

EA004300B1 - Клеточная везикула, называемая "текзосома", ее получение и применение для стимуляции иммунного ответа

Info

Publication number: EA004300B1
Application number: EA200200517A
Authority: EA
Inventors: Лоранс Зитвожель; Граса Рапосо; Армелль Реньо; Себасьян Амигорена
Original assignee: Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль; Энститю Гюстав Руссис; Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик; Энститю Кюри
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2004-02-26
Also published as: WO1999003499A1; FR2774697A1; IL134043A0; FR2774697B1; EP1001806A1; ATE442160T1; DE69826288T2; CA2296750C; JP2003125762A; US20040028692A1; JP2000512161A; EA200200517A1; DE69841146D1; EA002827B1; AU8446498A; JP3484201B2; CA2296750A1; ATE275969T1; ES2331838T3; EP1523990B1

Abstract

Предметом изобретения является новый способ сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, новые средства для осуществления способа и новые мембранные везикулы, обладающие иммуногенной способностью. Изобретение относится, в частности, к текзосомам (везикулам, происходящим от опухолевых клеток) и декзосомам (везикулам, происходящим от дендритных клеток, содержащих или нет антигены) и их применению для векторизации и представления антигена in vitro или in vivo, а также к методам и композициям для лечения онкологических заболеваний, инфекционных, паразитарных или, в частности, аутоиммунных заболеваний.

Description

Предметом изобретения является новый способ сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, новые средства для осуществления способа и новые мембранные везикулы, обладающие иммуногенными свойствами.

С момента доказательства существования цитотоксических Т-лимфоцитов 0Ό8+. специфических к опухолевым антигенам, имеющихся в рамках молекул класса I (КозеиЬегд и др., 1996; Вооп, 1992), несколько лабораторий смогли показать, что противоопухолевая иммунотерапия представляет собой эффективную стратегию лечения в случае используемых в качестве моделей животных (Рагбо11, 1995). Принципом иммунотерапии является стимуляция эффективного иммунного ответа против специфических опухолевых антигенов. В настоящее время это может быть осуществлено различными способами. Прежде всего, опухолевые клетки, экспрессирующие рекомбинантные костимулирующие молекулы, и/или иммуномодуляторные цитокины, способны стимулировать противоопухолевые ответы, которые могут уничтожать ίη у1уо твердые опухоли (2йуоде1 и др., 1996 [а]). Точно так же происходящие от опухолевых антигенов (или экзогенных антигенов, экспрессия которых осуществляется в опухолевых клетках) пептиды, инъецируемые в различных химических формах, включая использование липосом или вирусов (как, например, аденовирус или поксвирус) в качестве векторов, способны вызывать регрессию опухолей. Наконец, антигенпредставляющие специализированные клетки, как дендритные клетки, сенсибилизированные с помощью пептидов, происходящих от опухолевых антигенов, реинъецированные ίη У1уо, индуцируют эффективные противоопухолевые ответы, а также регрессию твердых опухолей, как установлено в случае мыши (Мауогбото и др., 1995).

Иммунотерапия, основанная на использовании дендритных клеток, оказалась эффективной при исследованиях, проводимых на мыши. В связи с этим, эту терапию недавно перенесли для применения в клинике. В США в настоящее время проводятся испытания, чтобы показать, что дендритные клетки, содержащие опухолевые пептиды, значительно увеличивают частоту специфических цитотоксических Т-клеток (СТЬ).

Первым ограничением этого подхода является сенсибилизация дендритных клеток пептидами, происходящими от опухолевых антигенов. В самом деле, в случае большинства опухолей, специфические антигены не идентифицированы. Специфические опухолевые антигены известны только в «случаях опухолей, индуцированных вирусами (рак шейки матки), в случаях меланомы (антигены сами по себе, мутированные антигены, дифференцировочные антигены) или в небольшом проценте опухолей молочной железы (онкогены, или продукты ген супрессоров опухоли, которые были подвергнуты мутациям). Однако остается показать прямое вовлечение этих пептидов или опухолевых антигенов в процесс удаления опухолей у человека. Следовательно, оказываются необходимыми новые методы сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки. Целью этих методов является индуцирование специфических противоопухолевых ответов в отношении молекул класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН).

В случае большинства методов сенсибилизации дендритных клеток, применяемых в настоящее время, используют пептиды, соответствующие эпигонам, находящимся в ассоциации с молекулами класса I, и идентифицированные в опухолевых клетках благодаря клонам специфических клеток СТЬ опухоли. Однако эти методы, очевидно, не являются оптимальными, так как они не учитывают эпитопов, известных в рамках молекул класса II, которые являются определяющими для пролиферации вспомогательных Т-лимфоцитов, необходимых для получения оптимальных цитотоксических ответов.

Более того, представляемые опухолевыми клетками эпитопы и представляемые антигенпредставляющими клетками (как, например, дендритные клетки) эпитопы, вероятно, не являются одними и теми же. Наконец, опухолевые пептиды, распознаваемые специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, имеются только у небольшого процента пациентов, обладающих молекулами класса I соответствующего гаплотипа.

Идеальный метод сенсибилизации, который может быть применен к любой опухоли с минимальным риском иммуноселекции, не должен быть ограничен небольшим количеством идентифицированных опухолевых антигенов. Также в таком методе должны использоваться скорее интактные протеиновые антигены, чем пептиды, чтобы дендритная клетка могла их продуцировать и представлять адекватную комбинацию пептидов в ассоциации с молекулами класса I и класса II, и это для любого индивидуума.

Недавно ОПЬоа и др. (Вос/ко\\ъку и др., 1996) смогли показать, что информационные РНК, полученные из биопсий опухолей, помещенные в дендритные клетки, могут оказывать противоопухолевое действие ίη у1уо. Однако РНК очень нестабильны и потенциально представляющее интерес количество РНК, по сравнению с полной РНК, очевидно, очень незначительное. 2йуоде1 и др. (2йуоде1 и др., 1996 [Ь]) показали, что опухолевые пептиды, полученные из кислотного элюата опухолей (кислотный пептидный элюат: ЕРА), могут быть использованы для введения в дендритные клетки. Эти таким образом нагруженные клетки, инъецированные 1 раз, обладают способностью вызывать регрессию опухолей. Однако в случае опухолей, не экспрессирующих молекулы класса I (которые представляют собой большинство метастатических опухолей у человека), или в случае опухолей, которые не могут быть диссоциированы в виде клеточной суспензии, подход, при котором используют кислотные элюаты, не очень эффективен и не воспроизводим.

Второе ограничение иммунотерапии, основанной на использовании дендритных клеток, связано с фенотипическими изменениями, которые могут происходить, когда эти клетки сохраняются в виде культуры или подвергаются различным обработкам. В самом деле, это может приводить к мало однородным и недостаточно охарактеризованным для терапевтического использования клеточным популяциям.

Следовательно, существует реальная необходимость усовершенствования методов сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, чтобы повышать эффективность этих подходов и расширять сферу их применения, так же, как разработки новых способов векторизации антигенов или других молекул.

Настоящее изобретение относится к решениям этих проблем. В самом деле, предметом изобретения является разработка новых методов сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, в частности, дендритных клеток, а также идентификация, выделение и характеризация новых мембранных везикул, обладающих замечательными иммуногенными свойствами.

Один из аспектов изобретения более конкретно относится к новому воспроизводимому способу сенсибилизации антигенпредставляющих клеток с помощью опухолевых антигенов.

Один из других аспектов изобретения относится к новому воспроизводимому способу сенсибилизации антигенпредставляющих клеток с помощью опухолевых антигенов, в случае которого нет необходимости в том, чтобы опухолевые антигены были известны.

Следующий из других аспектов изобретения относится к средствам, позволяющим составлять банк опухолевых антигенов.

Другой аспект изобретения относится к липидным мембранным везикулам, продуцируемым опухолевыми клетками или дендритными клетками и обладающим иммуногенными свойствами, а также к их применению для получения банков антигенов, сенсибилизации антигенпредставляющих клеток или векторизации антигенов, в частности, в рамках иммунотерапевтических подходов.

В этом отношении, первый предмет изобретения относится к везикуле, происходящей от опухолевых клеток и обладающей следующими характеристиками:

она освобождена от своего естественного окружения;

она включает двойной липидный слой (называемый поверхность), который окружает цитозольную часть;

и, в известных случаях, она имеет на своей поверхности молекулы класса I главного комплекса гистосовместимости (СМН) и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), в известных случаях, содержащие антигенные пептиды и/или адгезивные молекулы, и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции, и/или она содержит в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы и/или иммуномодуляторы, и/или хемоатрактанты, и/или гормоны, и/или нуклеиновые кислоты.

Секреция везикул клетками представляет собой явление, описанное в уровне техники (ретикулоциты, В-лимфоциты, макрофаги). Эти везикулы обычно обозначают родовым понятием экзосома, которое отражает механизм их продуцирования путем экзоцитоза внутренних везикул. Однако физиологическая роль этих везикул реально не установлена. Более того, структурные характеристики, свойства и функции этих везикул находятся в зависимости от типа клеток, от которых они происходят.

В настоящее время изобретатели неожиданно выявили, что опухолевые клетки способны секретировать везикулы, обладающие особенно интересными иммуногенными свойствами. Эти везикулы обычно соответствуют внутренней везикуле, содержащейся в эндосоме опухолевой клетки и выделяемой вышеуказанной опухолевой клеткой вследствие слияния наружной мембраны вышеуказанной эндосомы с цитоплазматической мембраной вышеуказанной опухолевой клетки. В соответствии с этим механизмом образования, их клеточным происхождением и их характеристиками и оригинальными функциональными свойствами, эти везикулы в дальнейшем обозначаются термином текзосома.

Выражение освобожденная от своего естественного окружения означает, что везикула физически отделена от клетки, из которой она происходит, или еще, что она частично выделена или очищена. Следовательно, везикула продуцируется клеткой за счет экзоцитоза, затем ее частично выделяют или очищают, чтобы получить обогащенную композицию. Это выражение также может означать, что везикула не только выделяется клеткой во время слияния мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной, но и то, что она более не окружена растворимыми компонентами, которые находятся в просвете эндосомы, или что она лишена интактных клеток. Выражение происходящая от опухолевой клетки означает, что везикула обладает структурными элементами опухолевой клетки. Эта везикула обычно является производным (происходящей от) опухолевой клетки в том смысле, что она продуцируется, по крайней мере частично, затем высвобождается опухолевой клеткой на данной стадии ее развития.

Согласно предпочтительному варианту осуществления текзосомы согласно изобретению включают молекулы СМН, содержащие антигенные пептиды, и/или экспрессируют адгезивные молекулы и/или экспрессируют молекулы лимфоцитарной костимуляции, но лишены в своей цитозольной части антигенных опухолевых молекул и иммуномодуляторов и нуклеиновых кислот.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления текзосомы согласно изобретению являются такими, что молекулы СМН являются порожними, т.е. не содержащими антигенных пептидов, и текзосомы включают в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы, иммуномодуляторы и/или нуклеиновые кислоты. Текзосомы, содержащие порожние молекулы СМН, могут быть получены либо из опухолевых клеток, в которых наблюдается, например, дефицит переносчика пептидов (ТАР), либо путем промывки текзосом или опухолевых клеток, чтобы элюировать пептиды, связанные с молекулами СМН.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения текзосомы согласно изобретению являются такими, что молекулы СМН содержат антигенные пептиды и/или экспрессируют адгезивные молекулы и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции, и текзосомы содержат в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы, иммуномодуляторы и/или нуклеиновые кислоты.

Термин опухолевые клетки включает вообще любую клетку, происходящую от опухоли, например, твердой или жидкой опухоли, а также клетки, трансформированные или иммортализованные ίη νίίτο. Речь идет предпочтительно о твердой, асцитной или гематопоэтической опухоли.

В качестве примера можно назвать клетки рака типа злокачественной меланомы (происходящие от первичных линий, полученных ех νίνο, или же от диссоциированных клеток, происходящих из операционного препарата), которые экспрессируют на своей поверхности пептиды, такие как МАКТ-1/Ме1ап-А, в рамках СМИ-класс 1/НЬА-А 02-01 и содержат протеиновый антиген МАРТ-1.

Можно также назвать клетки, происходящие от рака почки (аденокарцинома с прозрачными клетками) или лейкемии, клетки которых экспрессируют специфические продукты транслокации.

Таким образом, антигенные пептиды, способные связываться с молекулами СМН, происходят, например, от следующих антигенов:

антигены, происходящие от меланом, такие как МАРТ-1, тирозиназа, МАСЕ-1/2/3, Р53 (в различных опухолях) или Нег2/Ыеи, Р8А,

СЕА или Р8МА. Другие опухолевые антигены указаны, например, в статье КокепЬегд (1шшипо1оду Тобау, 18, 175 [1997]), включенной в настоящее описание в виде ссылки.

Вообще можно назвать продукты слияния/транслокации онкогенов или антионкогенов или же дифференцировочные антигены или пептиды сами по себе или мутантные пептиды.

Молекулами лимфоцитарной костимуляции называют, например, молекулы, которые придают Т-лимфоцитам сигналы, комплементарные сигналам, вызываемым во время взаимодействия комплексов молекула класса I и II пептид с рецептором Т-клеток.

В качестве примера можно назвать СО 80, СО86, 1САМ, ЬЕА, СО40, некоторые члены семейства ΤΝΕ К и адгезивные или хемоатрактантные молекулы (позволяющие осуществлять контакт между специализированной антигенпредставляющей клеткой и эффекторными лимфоцитами, или специфическую внутриклеточную транспортировку/локализацию (направленную миграцию/хоминг) других клеток в место прививки или воспаления).

Антигенные опухолевые молекулы, содержащиеся в цитозоле или представляемые текзосомами, происходят от протеинов, экспрессируемых селективно и/или массово опухолевыми клетками.

Иммуномодуляторы, которые могут присутствовать в цитозоле текзосом, представляют собой, например, следующие:

α-фактор некроза опухоли (ΤΝΕ-α), или интерлейкин 1, или интерлейкин 15, или

С-СК (хемокины).

Нуклеиновые кислоты, которые могут находиться в цитозоле текзосом, происходят от той же самой опухолевой клетки. Эти нуклеиновые кислоты находятся в цитозоле текзосом в прямом соответствии с их механизмом образования. Это могут также быть гетерологичные нуклеиновые кислоты.

Более конкретными характеристиками текзосом согласно изобретению являются следующие:

они представляют собой маленькие мембранные везикулы диаметром около 60-100 нм, чаще всего около 60-90 нм, в частности 60-80 нм, выделяемые опухолевыми клетками;

они содержат молекулы, обычно присутствующие в эндосомах;

они содержат опухолевые антигены, как, например, МАКТ-1, в случае клеток меланомы;

они лишены погибших клеток и/или клеточных остатков;

они лишены загрязнений, таких как мембранные загрязнения, эндоплазматический ретикулюм, аппарат Гольджи, митохондрии или составляющие ядер;

в своей мембране они содержат функциональные молекулы класса Ι/ΙΙ, связанные с антигенными опухолевыми пептидами;

Ί они могут стимулировать ίη νίίτο пролиферацию специфических Т-лимфоцитов;

они могут сенсибилизировать ίη νίνο и ίη νίίτο дендритные клетки, способные затем активировать специфические к опухоли Т-клетки;

они обладают способностью, когда они инокулированы ίη νίνο, в частности, внутрикожно, вызывать регрессию развившихся твердых опухолей;

они содержат молекулы лимфоцитарной костимуляции, такие как СЭ40 и СЭ80, и/или они содержат протеин (^ί-δΗοεν) Н8Р70;

они лишены протеина др96;

они содержат интерлейкины или хемоатрактанты или иммуномодуляторы.

Другой интересной характеристикой текзосом является то, что они содержат фосфатидилсерин в своем наружном слое. Фосфатидилсерин (Р8) представляет собой один из основных компонентов клеточных мембран, обычно присутствующий в очень большом количестве во внутреннем слое двойных липидных слоев. В некоторых условиях, как ранние этапы апоптоза, фосфатидилсерин перераспределяется по направлению к наружному слою. Наличие фосфатидилсерина в наружном слое цитоплазматической мембраны апоптотических клеток создает сигнал распознавания макрофагами. Для того чтобы определить, имеется ли фосфатидилсерин на поверхности текзосом, очищенные препараты экзосом из супернатантов клеток меланомы человека ΕΘΝ были проанализированы методом, описанным Лире1х и др. (ί. С1ш. ΙηνοδΙ., 99, 1546-1554 [1997]). Содержание фосфатидилсерина в наружном слое образцов ΕΘΝ (содержащих 390 мкг/мл протеинов), составляет 460 нмоль фосфатидилсерина. Экзосомы содержат, следовательно, значительные количества фосфатидилсерина в своем наружном слое.

Тесты, позволяющие подтвердить, что текзосомы согласно изобретению содержат молекулы, обычно присутствующие в эндосомах, состоят в электронной микроскопии и иммуноимпритинге (вестерн-блоттинге). Эти тесты позволяют показать, что текзосомы согласно изобретению экспрессируют рецептор трансферина, молекулы ЬЛМР ('Ίίζοδοιικ а88οс^аίеά тетЬгаое р^οίе^η: мембранный протеин, ассоциированный с лизосомой), молекулы класса Ι/ΙΙ, опухолевые антигены.

Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы согласно изобретению лишены загрязнений, представляет собой электронную микроскопию и иммуноимпритинг с антителами к кальнексину, который находится в эндоплазматическом ретикулюме.

Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы содержат в своей мембране функциональные молекулы класса Ι/ΙΙ, связанные антигенными опухолевыми пептидами, состоит в антигенной презентации Т-лимфоцитам, специфическим к антигенам соответствующей опухоли (тесты пролиферции Т-специфических клонов антигенов и молекул СМН класса I).

Можно также использовать тест на секрецию цитокинов СЖу/СМ-СМ, ΤΝΡβ) вышеуказанными Т-клонами.

Тест, позволяющий подтвердить, что имеет место сенсибилизация ίη νίνο и ίη νίίτο дендритных клеток, способных активировать специфические к опухоли Т-клетки, представлен на фиг. 7 (тест пролиферации и/или выделения цитокинов Т-специфическими клонами антигенов по методу перекрестной сенсибилизации (сго88-рптшд): текзосомы опухоли МЛКТ-1+, НЬЛ-Л2-, связанные с дендритной клеткой МЛКТ-1-, НЬЛ-Л2+).

Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы обладают способностью, когда они инокулированы, в частности, внутрикожно, вызывать регрессию развившихся твердых опухолей, представлен на фиг. 6.

В качестве примера осуществляют инъекцию 10-40 мкг текзосом опухоли внутрикожно с гомолатеральной стороны развившейся опухоли, начиная с 3-10 дней; наблюдают животное, являющееся носителем опухоли, и постепенное исчезновение развившейся опухоли за 7-10 дней (у грызунов типа мышей).

Предпочтительная текзосома согласно изобретению представляет собой текзосому, такую как описанная выше, и имеющую на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II СМН, в известных случаях связанную с антигенными пептидами и содержащую в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы. Более конкретно предпочтительная текзосома включает также одну или несколько молекул лимфоцитарной костимуляции и/или протеин Н8Р70. В особом варианте осуществления текзосома лишена протеина др96.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к текзосоме, такой как описанная выше, экспрессирующей на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН) и/или характерные опухолевые антигены, и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции/адгезивные молекулы, и/или иммуномодуляторы, и/или хемоатрактанты, экзогенные по отношению к опухолевой клетке, от которой происходит экзосома, или содержащей опухолевые антигены, и/или иммуномодуляторы, и/или нуклеиновые кислоты или цитотоксические агенты, или гормоны, экзогенные по отношению к опухолевой клетке, от которой происходит экзосома.

Изобретение также относится к способу получения текзосом, таких как указанные выше. Этот способ предпочтительно включает стадию получения биологического образца и стадию выделения текзосом из вышеуказанного образца.

Биологически образец предпочтительно образован мембранными фракциями, культуральными супернатантами или лизатами опухолевых клеток или же свежеприготовленными опухолевыми суспензиями.

Биологический образец может происходить из операционных опухолевых препаратов после хирургической эксцизии (первый случай) или же из органов, несущих опухоль (удаленный хирургическим путем орган) (второй случай), которые подвергают обработке путем механического диссоциирования (первый случай) или путем замедленной перфузии (второй случай).

Конечную клеточную суспензию обрабатывают таким же образом, как культуральные супернатанты.

Речь может также идти о клетках, обработанных путем нескольких последовательных циклов замораживание/размораживание.

Согласно предпочтительному варианту осуществления используемым в способе согласно изобретению биологическим образцом является образец эфферентной крови из вены изолированного опухолевого органа, или образец сыворотки или плазмы крови, циркулирующей в организме пациента, или продукт дренажа (физиологическая сыворотка, содержащая, в случае необходимости, дексаметазон, или цитотоксический агент, стимулирующий экзоцитоз текзосом) удаленного хирургическим путем органа и обработанный ех νίνο путем цикла выделе ние/перфузия для дренажа опухоли, которая его содержит, или супернатант диссоциированного ίη νίΐτο опухолевого эксплантата.

Образец эфферентной крови из изолированного опухолевого органа соответствует 20-50 мл эфферентной крови из главной вены опухолевого органа, отобранной до хирургического вмешательства.

Продукт дренажа удаленного хирургическим путем органа и обработанный ех νίνο путем цикла выделение/перфузия получают следующим образом.

В случае органа, имеющего приносящую (афферентную) артерию и выносящую (эфферентную) вену, артерию катетеризуют с помощью пластмассовой трубки, соединенной с наклоненным вперед резервуаром, содержащим физиологическую сыворотку, в случае необходимости, с другими агентами. Орган подвергают дренажу и жидкость выводят по другой наклонной трубке, катетеризующей вену (например, в случае рака почки или церебральной глиобластомы).

Целью дексаметазона, содержащегося в известных случаях в продукте дренажа, является повышение клеточного стресса и экзоцитоза текзосом вне опухолевой клетки.

Супернатант диссоциированного ίη νίίτο опухолевого эксплантата получают следующим образом: осуществляют механическую диссоциацию опухоли, приводящую к образованию одноклеточной суспензии, содержащей опухолевые клетки, клетки опухолевой стромы и клетки иммунной системы, где эта суспензия может быть облучена и рекуперирована путем дифференциальных центрифугирований.

Как указано выше, в особом варианте осуществления способа согласно изобретению биологический образец может быть обработан с помощью одного или нескольких агентов, стимулирующих продукцию текзосом. Эта обработка может включать добавление стероидных агентов (как, например, дексаметазон), фармакологических агентов (как, например, цитотоксические агенты, такие как таксаны, цисплатин и т.д.), агентов, способных увеличивать количество мультивезикулярных эндосом, и/или быть осуществлена путем облучения образца.

Что касается облучения, оно должно быть достаточным, чтобы спровоцировать цитостатическую активность в отношении опухолевых клеток. Облучение опухолевых клеток может быть проведено до культивирования клеток или во время или после культивирования опухолевых клеток. Кроме того, облучать следует тогда, когда опухолевые клетки являются живыми, т.е. либо в случае удаленного органа, являющегося носителем опухоли, до перфузии, либо в случае культуры клеток, либо в случае механически диссоциированной клеточной суспензии; но во всех случаях до нарушения состояния (страдания) опухолевых клеток вследствие гипоксии и/или некроза сосудов и/или дегидратации.

Что касается обработки с помощью стероидов, она позволяет провоцировать клеточную активацию, приводящую к экзоцитозу текзосом.

Что касается обработки с помощью фармакологических агентов, она позволяет модифицировать цитоскелет и реаранжировать внутриклеточные пространства для дерегуляции процессов интернализации и экзоцитоза; деполимеризовать микротрубочки.

Что касается обработки с помощью агента, способного повышать количество мультивезикулярных эндосом, ее осуществляют во время культивирования клеток; в качестве агента можно назвать нокодазол (средство, позволяющее деполимеризовать микротрубочки), бафилюмицин (средство, ингибирующее вакуолярные аденозинтрифосфатазы) (Β;·ιΓί1οιηναηκ: А с1акк οΓ ίηΠίόίΙοΓκ οΓ шешЬгане АТРакек Ггот ш1ΟΓοοΓβαηίδΐηδ. ашта1 се 11 к, апб ρΐαηΐ се11к, Ргос. Ыаб. Асаб. 8ά. И8А, 85, 7972-7976 [1988]).

Предпочтительный способ получения текзосом согласно изобретению осуществляют

а) либо исходя из культур опухолевых клеток, и он включает

- облучение с интенсивностью, достаточной, чтобы спровоцировать цитостатическую активность в отношении опухолевых клеток, и не превышающей 15000 рад, предпочтительно примерно 1000 рад, опухолевых клеток до, во время или после их культивирования; или

- обработку во время культивирования, опухолевых клеток с помощью стероидов, как, например, дексаметазон, или цитотоксических агентов, как, например, 5-фторурацил (5-Еи) или цисплатин, доцетаксел, антрациклин, митотический яд, антипиримидин, или с помощью интерлейкина, как, например, 1Б-10, 1Ь-2, 1Ь-15, СМС8Е, или

- обработку с помощью агента, способного повышать количество мультивезикулярных эндосом, как, например, нокодазол, (1. Сгиепйегд и др. Сйагас1епха1юп οί 1йе Еаг1у Епбокоше апб РиЕШуе Епбосубс Сатег Уеыс1е ίη νίνο апб \\йй ап Лккау οί Уещс1е Ешюп ίη νίίτο, Тйе 1ошпа1 οί Се11 Вюкду, 108, 1301-1316 [1989]) и, следовательно, увеличивать продукцию текзосом;

б) либо исходя из образца физиологической сыворотки, отобранного путем дренажа удаленного хирургическим путем органа и обработки ех νίνο с помощью цикла выделение/перфузия для дренажа опухоли, которая ее содержит;

в) либо исходя из супернатанта опухолевого эксплантата, диссоциированного ш νίίτο, и он включает обработку с помощью стероидов, как, например, дексаметазон, или цитотоксических агентов, как, например, 5-фторурацил (5-Еи), цисплатин, таксаны, или интерлейкина, как, например, 1Б-10, 1Ь-2, СМ-С8Е.

Стадия выделения текзосом может быть реализована различными способами, такими как центрифугирование, хроматография, электрофорез, нанофильграция, и т.д. Это может быть, например, дифференциальное центрифугирование мембранных фракций культуральных супернатантов или лизатов опухолевых клеток или свежеприготовленных опухолевых суспензий с рекуперацией фракции или фракций, содержащих вышеуказанные экзосомы (Ρηροδο и др., 1. Ехр. Меб., 183, 1161-1172 [1996]). В этом особом варианте осуществления мембранная фракция супернатантов представляет собой таковую, получаемую после центрифугирования при ускорении 100000 д. Речь может идти предпочтительно об электрофорезе в жидкой фазе, который позволяет осуществлять разделение биологических материалов по их заряду. В нижеследующих примерах показано, что этот способ предпочтительно может быть использован для выделения текзосом с хорошими выходами. Этот способ, кроме того, особенно предпочтителен в промышленном плане.

Предметом изобретения также является способ получения текзосом, таких как указанные выше, кроме того, включающий либо генетическую модификацию опухолевых клеток с помощью экзогенных генов, кодирующих молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), и/или генов, кодирующих характерные опухолевые антигены, и/или генов, кодирующих костимулирующие и/или адгезивные молекулы или хемокины-атрактанты, причем продукты этих экзогенных генов могут быть экспрессированы на поверхности текзосом и/или могут быть секвестрированы внутри текзосом;

либо модификацию ш νίίτο текзосом, продуцированных опухолевыми клетками, такую как введение (путем электропорации, путем слияния с синтетической липосомой, с помощью рекомбинантного вируса или химическим методом) протеинов или нуклеиновых кислот или фармацевтически определенных лекарственных средств в текзосомы и/или с текзосомами.

Изобретение также относится к текзосомам, которые могут быть получены согласно вышеуказанному способу.

Текзосомы опухолевых клеток, трансфицированные, как указано выше, получают и используют в качестве опухолевых вакцин.

Текзосомы, модифицированные ш νίίτο, как указано выше, предназначены для доставки экзогенного материала в клетку-мишень ш νίίτο и ш νίνο.

Что касается слияния с синтетической липосомой, этот способ осуществляют, например, как указано у №1Ье1 и др. (1996) или у ЭДа1кег и др. (ЫаШге, 387, с. 61 и последующие [1997]).

Изобретение относится также к антигенпредставляющим клеткам, в частности Влимфоцитам, макрофагам, моноцитам или дендритным клеткам, нагруженным вышеуказанными текзосомами. Предпочтительно это дендритные клетки.

Дендритные клетки согласно изобретению имеют, в частности, следующие характеристики: в случае моделей опухолей, которые не экспрессируют молекулы класса I и которые, следовательно, не обладают способностью стимулировать Т-клетки СЭ8+. дендритные клетки, связанные с текзосомами опухолевых клеток, могут представлять эти опухолевые пептиды цитотоксическим Т-клеткам в рамках молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (характеристика № 1); связанные с текзосомами опухолевых клеток дендритные клетки, инъецированные внутривенно или подкожно, также являются очень эффективными (характеристика № 2).

Тест, позволяющий выявить характеристику № 1, является следующим.

В системе организма человека негативная текзосома класса I, инкубированная в присутствии позитивной дендритной клетки класса I, может вызывать стимуляцию антигенспецифических клонов СЭ8+Т, содержащихся в текзосоме (см. фиг. 7).

Тест, позволяющий выявить характеристику № 2, является следующим.

В системе организма мыши, где опухоль классифицирована как негативная I и где текзо13 сомы сами также лишены молекул класса I, эти текзосомы, когда они инкубированы и связаны с дендритными клетками, могут медиировать противоопухолевый иммунный ответ, тогда как сами по себе одни, при внутрикожной инъекции, они не способны это делать.

Изобретение также относится к способу получения антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше, включающему стадии инкубации антигенпредставляющих клеток в присутствии текзосом, таких как указанные выше, и стадию рекуперации вышеуказанных антигенпредставляющих клеток, связанных с вышеуказанными текзосомами.

Изобретение также относится к представляющим клеткам, связанным с текзосомами и которые могут быть получены согласно вышеуказанному способу.

Предметом изобретения является также применение текзосом, таких как указанные выше, для сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, в частности, В-лимфоцитов, макрофагов, моноцитов или дендритных клеток, или для стимуляции специфических Тлимфоцитов.

Использование методов хроматографии и/или электрофореза и/или нанофильтрации составляет другой важный аспект настоящего изобретения, так как по сравнению с обычными методами можно достигать получения продукта улучшенного качества в количествах, адаптированных для промышленного (в частности, фармакологического) использования.

В этом отношении изобретение также относится к способу получения мембранных везикул, включающему, по крайней мере, стадию разделения путем электрофореза, хроматографии или нанофильтрации. Более конкретно, этот способ адаптирован к получению мембранных везикул экзосомного типа, таких как текзосомы. В этом способе стадия разделения путем электрофореза или хроматографии может быть реализована непосредственно при использовании культурального супернатанта, клеточного лизата или предварительно очищенного препарата. Электрофорез более предпочтительно представляет собой электрофорез в жидкой фазе. Предметом изобретения также является применение текзосом, таких как указанные выше, или антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше.

Для стимуляции и, в случае необходимости, амплификации ίη νίίτο антигенспецифических Т-лимфоцитов, содержащихся в вышеуказанных текзосомах или антигенпредставляющих клетках или В-лимфоцитов, и, в частности, для стимуляции и амплификации ίη νίίτο Тлимфоцитов.

Изобретение относится также к применению текзосом, таких как указанные выше, или антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше, для отбора ех νίνο набора Тлимфоцитов, способных распознавать специфические антигены, содержащиеся в вышеуказанных текзосомах или антигенпредставляющих клетках.

Предметом изобретения также является лекарственное средство, содержащее в качестве действующего начала по крайней мере одну текзосому, такую как указанная выше, и/или антигенпредставляющую клетку, такую как указанная выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение предпочтительно относится к лекарственному средству, такому как указанное выше, для использования при лечении онкологических заболеваний, инфекционных заболеваний или паразитарных заболеваний.

Более предпочтительно лекарственное средство включает текзосомы, такие как указанные выше.

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к лекарственному средству, такому как указанное выше, для применения: в целях лечения патологии типа аллергии, астмы или аутоиммунного заболевания.

В качестве соответствующей галеновой формы, текзосомы или декзосомы могут содержаться в физиологической сыворотке, в ампуле или любом другом соответствующем средстве (шприц, резервуар и т.д.). Они могут быть приготовлены экстемпорально или храниться, например, в замороженном состоянии при температуре -80°С. Используемые растворы могут представлять собой солевые растворы, в случае необходимости, дополненные стабилизаторами и/или добавками. Стабилизаторами могут быть, в частности, протеины или молекулы с высокой молекулярной массой. Более конкретно можно назвать протеины, такие, как человеческий сывороточный альбумин, или молекулы, такие как, например, декстран или полоксамер.

Композиции согласно изобретению могут также включать или быть использованными в ассоциации с одной или несколькими добавками. Более конкретно, добавка может представлять собой любой фармакологический иммуностимулирующий агент, такой как, например, цитокин (в частности, интерлейкин-12). Такие агенты обычно используют согласно клиническим протоколам лечения или в составах вакцин. Кроме того, добавка согласно изобретению также может представлять собой агент, способный стимулировать продукцию ίη νίνο дендритных клеток. В качестве примера можно назвать соединение Ε1ί13. Комбинированное использование этого типа агента позволяет повышать количество дендритных клеток и, следовательно, потенциально увеличивать эффективность композиций согласно изобретению.

Другой предмет изобретения, следовательно, относится к ассоциации текзосом и добавки с целью одновременного, отдельного или разделенного во времени использования.

Соответствующий способ введения лекарственных средств согласно изобретению представляет собой способ введения путем инъекций и в частности внутрикожных или подкожных инъекций. Этот способ введения особенно адаптирован к случаям, когда действующее начало лекарственного средства представляет собой дендритные клетки, нагруженные текзосомами.

Соответствующие дозировки составляют 0,01-10 мкг/кг и в частности 0,10-5 мкг/кг и еще более предпочтительно 0,15-2 мкг/кг массы тела и 10 мкг для внутрикожных реакционных тестов.

Лекарственные средства согласно изобретению могут быть также использованы в количестве по 100 мкг для профилактических вакцинаций.

Цели использования лекарственных средств согласно изобретению, являются следующими:

замедленная гиперчувствительность (тесты в случае больных раком), или профилактическая терапия, или использование в рамках определения частоты специфических лимфоцитарных цитотоксических предшественников или секретеров интерферона по методу ограниченного разведения.

Речь идет об использовании аутологичных или аллогеничных дендритных клеток, предварительно инкубированных с текзосомами согласно изобретению, в качестве мишеней периферических лимфоцитов у носителей опухоли до, во время или после противоопухолевой обработки (как классическая обработка или активная специфическая иммунизация).

Изобретение также относится к применению текзосомы, такой как указанная выше, или антигенпредставляющей клетки, такой как указанная выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для обработки опухолей, в особенности твердых, асцитных и гематопоэтических опухолей.

В качестве твердых опухолей можно назвать рак почки, молочной железы, ободочной кишки, легкого, желудка, печени; меланомы, саркомы и т.д.

В качестве гематопоэтических опухолей можно назвать лейкозы, злокачественные лимфомы по Ходжкину и не по Ходжкину.

Настоящее изобретение описывается далее более подробно с помощью нижеследующих примеров, которые нужно рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие объема охраны изобретения.

Описание чертежей

Таблица. Клетки опухолевых линий инкубировали в течение 24 ч при плотности 1 млн клеток на миллилитр. Текзосомы затем получали (см. пример) из культуральных сред путем дифференциального ультрацентрифугирования.

Концентрацию текзосомальных протеинов определяли с помощью теста ВгабГогб (ΒίοΚαά

Рго1ет Аккау [ВюРаб]).

ΜΖ-2 описан Тгауегкап и др. (1992).

Знак * означает, что различные первичные линии установлены и охарактеризованы в клинической биологической лаборатории Института Снк1ауе Роикку и доступны по требованию.

Фиг. 1А и 1В. Морфология мультивезикулярных эндосом и текзосом, происходящих от клеток Т8/А.

A. Ультратонкие срезы клеток Т8/А, проанализированные с помощью электронного микроскопа. Часть цитоплазмы, показывающая эндосомальное пространство, содержащее везикулы диаметром 60-80 нм.

B. Препарат текзосом клеток Т8/А, проанализированных с помощью электронного микроскопа методом с использованием интактной везикулы (Рароко и др., 1966). Препараты текзосом содержат мажоритарную популяцию везикул диаметром 60-80 нм, по размеру и морфологии подобных внутренним везикулам мультивезикулярных эндосом, показанных в п. А.

Фиг. 2. Наличие различных маркеров в текзосомах опухолевых клеток.

A. 2 мкг текзосомальных протеинов (Ехок) или 2х10⁵ опухолевых клеток анализировали методом вестерн-блоттинга с помощью моноклональных антител, специфических к молекулам класса I СМН (Масбо1б Робей Р. и др., Рерббе Iηί1иеηсек 1йе Ео1бтд аиб !п1гасе11и1аг Тгапкрой оГ Ргее Март Н181осотрабЫ1бу Сотр1ех С1акк I Неауу Сбатк, 1. Ехр. Меб., 181, 1111-1122 [1995]); рецептору трансферина.

(ТГР) (антитело, соответствующее Н68.4, описанное в ВюсЫтюа е1 Вюрбукюа Ас1а. 1136(1), 28-34 [1992]); Ьатр 1 и 2 (моноклональные антитела крысы против мыши; Рбагттдеп) и кальнексину (Небей Оаше1 N. и др., С1исоке Тптттд апб Яед1исоку1абоп беГегтте С1усоргоГете Аккос1абоп \νί11ι Са1пехт ίη 1йе Епбор1актю Ребси1ит Се11, 81, 425-433 [1995]).

B. 10 мкг текзосомальных протеинов линии клеток меланомы (ΕΟΝ) или 10 мкг полных протеинов тех же клеток анализировали путем вестерн-блоттинга с помощью антитела антиМАРТ-1 (Маппсо1а Е. и др., Апа1ук1к оГ ехргеккюп оГ 1бе те1апота аккоааГеб апбдепк МАРТ-1 апб др100 ш те!акГабс те1апота се11 1тек апб ш т κίΐυ 1екюпк, 1оита1 оГ [ттипо1Негару, 19, 192-205 [1996]).

C. Текзосомальные протеины линии клеток меланомы (ΕΟΝ) или полные протеины тех же клеток анализировали методом вестернблоттинга с помощью антитела анти-Н8Р70.

Ό. Текзосомальные протеины линии клеток меланомы (ΕΟΝ) или линии М^-2 анализировали методом вестерн-блоттинга с помощью антитела анти-др96.

Фиг. 3. Текзосомы, происходящие от позитивной опухолевой линии МАКТ-1 (ΡΟΝ), стимулируют специфический к МАКТ-1 Т-клон.

20000 клеток Т-клона БТ8 (или БТ12, результаты не представлены) инкубировали с текзосомами, происходящими от ΡΘΝ (линии клеток МЛК.Т-1 и НБА-А2+) или О1ЛМ (клетки линии нефромы, МАКТ-1-) в качестве отрицательного контроля, в течение 48 ч. Продукцию Т№р клетками Т-клона определяли путем биологического теста с клетками \УЕН1 (ΈφηνίΕ и др.). Текзосомы индуцируют продукцию ΙΡΝγ Т-клоном, раскрывая таким образом присутствие комплексов НЕА-А2/пептид, происходящие от МАКТ-1, на поверхности текзосом.

БТ8+ТехО1АМ соответствует Т-клонам ЬТ8, инкубированным в присутствии текзосом, происходящих от опухолевых клеток С1АМ;

ЬТ8+ТехРО№' соответствует Т-клонам ЬТ8, инкубированным в присутствии текзосом, происходящих от опухолевых клеток ΡΟΝ;

ЬТ8+ТитРО№' соответствует Т-клонам ЬТ8, инкубированным в присутствии текзосом, происходящих от опухолевых клеток ΡΟΝ.

На оси абсцисс представлены определенные клетки, а на оси ординат указано продуцированное количество ТЫр (пг/мл).

Фиг. 4. Текзосомы клеток Р815, экспрессирующих рСа1, стимулируют спленоциты мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами рСа1.

Спленоциты (10⁵) мышей ВАБВ/с, иммунизированных за 2 месяца до этого с помощью 10⁶ рГи (бляшкообразующих единиц) рекомбинантного аденовируса рСа1, способствующие отторжению опухоли, экспрессирующей рСа1, инкубировали с текзосомами, происходящими от клеток Р815 (незаполненные четырехугольники ◊), или клетками Р815-рСа1 (заполненные квадраты ). Не подвергнутые инкубации с текзосомами спленоциты создают фоновый шум, обозначенный закрашенными точками (•). После культивирования в течение 5 дней добавляли 1 микроКи тритиированного тимидина на лунку культуры. Включение трития в клеточную ДНК определяли спустя 18 ч. Результаты, значительно отличные от полученных по точному методу Фишера, маркированы знаком *.

На оси абсцисс представлено количество текзосом (Тех), происходящих от опухолевых клеток Р815 (мкг/мл), а на оси ординат указано число импульсов в минуту (СРМ).

Фиг. 5. Опухолевый антиген МАКТ-1, содержащийся в текзосомах, может быть представлен Т-лимфоцитам дендритными клетками.

Текзосомы в возрастающих дозах, происходящие от линий опухолевых клеток ΡΟΝ (МАКТ-1+, НБА-А2+, А1-) и М22 (МАКТ-1+,

НБА-А2-, А1+), инкубировали с Т-клонами (20000 клеток на лунку 96-луночных микроплашек) ЬТ12 (специфический к НБАА2/пептид МАКТ-1) в присутствии дендритных клеток НБА-А2+, происходящих от циркулирующих макрофагов (БСА2) (Р. 8а11иЧо и А. БапхауессЫа. ЕГйс1еи1 ргекейабои оГ 8о1иЬ1е аийдеи Ьу сийигеб Ьишаи беибййс се 118 18 шаш1ашеб Ьу ОМ-С8Р е! 1Ь-4 аиб 6ο\νπ геди1а!еб Ьу ΊΝΡα, 1. Ехр. Меб., 179, 1109-1118 [1994]). Выделение ΙΡΝγ, представленное на оси ординат (пг/мл), определяли в культуральных супернатантах спустя 2 дня. Текзосомы, происходящие от ΡΟΝ, так же, как текзосомы, происходящие от М22, индуцировали выделение ΙΡΝγ клетками ЬТ12 и ЬТ8 (результаты не представлены). Клетки ΡΟΝ также индуцировали сильное выделение ΙΡΝγ Т-клонами, тогда как клетки М22, которые не выражают адекватный гаплотип молекулы НБА (НБА-А2), не индуцировали продукцию ΙΡΝγ.

БТ12+БСА2 соответствует Т-клонам ЬТ12, инкубированным в присутствии дендритных клеток НБА-А2+;

ЕТ12+БСА2+ТехЕОН' соответствует Тклонам ЬТ12, инкубированным в присутствии дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток ΡΟΝ;

БТ12+БСА2+ТехМ22 соответствует Тклонам ЬТ12, инкубированным в присутствии дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток М22.

Фиг. 6А и 6В. Противоопухолевые эффекты текзосом ш νίνο.

100000 опухолевых клеток Т8/А инъецировали мышам ВАБВ/с (А) или Шбе (В). Спустя 3 дня каждая мышь получала две последовательные инъекции, с интервалом 24 ч (представленные на фигуре как 13 и 14), 20-30 мкг текзосом внутрикожно. Размер опухоли затем определяли 2 раза в неделю. Были проведены статистические анализы точным методом Фишера (показатель 95% указан знаком *).

A. Две группы по 5 мышей получали текзосомы, происходящие от Т8/А (заполненные треугольники) или МСА38 (незаполненные треугольники Δ) (линия клеток аденокарциномы ободочной кишки, происходящая от мыши С57ВБ/6), в качестве отрицательного контроля. Сами текзосомы, происходящие от Т8/А, обладают противоопухолевым эффектом ш νίνο.

B. Две группы мышей №1бе параллельно получали такие же дозы тех же препаратов текзосом (: экзосомы Т8/А; □: экзосомы МС38).

Никакого противоопухолевого эффекта не наблюдали в случае мышей Шбе. Тлимфоциты, следовательно, необходимы для противоопухолевых эффектов текзосом ш νίνο.

На оси абсцисс указаны дни, а на оси ординат указан средний размер опухоли (мм²).

Фиг. 7. Дендритные клетки, происходящие от костного мозга, сенсибилизированные текзосомами, происходящими от опухолевых клеток, вызывают полное удаление ίη у1уо развившихся твердых опухолей.

500000 опухолевых клеток Р815 инъецировали в правый бок мышей ΌΒΑ/2 за 10 дней до обработки. Обработка состояла в разовой инъекции текзосом (10 мкг/мышь) в тот же бок, но на расстоянии от опухоли. Другой группе инъецировали внутривенно дендритные клетки (происходящие от костного мозга путем обработки в течение 5 дней с помощью 6М-С8Р + !Ш-4 (Мауогбото и др., 1995), инкубированные предварительно в течение 3 ч с текзосомами Р815. Опухоли измеряли и результаты анализировали, как показано на фиг. 6. Текзосомы Р815 сенсибилизировали дендритные клетки для индуцирования отторжения развившихся опухолей. Микросомы не оказали значительного воздействия на рост опухоли. На вставке показан процент мышей без опухоли (по оси ординат); заштрихованный прямоугольник в виде бруска соответствует только группам животных типа, обозначенного заполненными квадратами; по оси абсцисс отложены дни. У этих мышей не происходило развития опухоли после повторной инъекции дубликата минимальной опухолевой дозы, показывающее, что у них выработался противоопухолевый иммунитет. Используемые на фигуре символы являются следующими:

о: дендритные клетки, инкубированные с контрольными текзосомами;

• : дендритные клетки, инкубированные с текзосомами Р815;

заполненные треугольники: текзосомы Р815, введенные внутрикожно;

X: необработанные животные.

На оси абсцисс указаны дни, а на оси ординат указан средний объем опухоли.

Фиг. 8А, 8В и 8С. Химиотерапевтические/цитотоксические агенты и облучение могут стимулировать экзоцитоз опухолевых текзосом.

Использовали мышиную лейкемию Ь1210 и линию раковых клеток почки человека ШАМ (фиг. 8С). 2 млн опухолевых клеток инкубировали в присутствии возрастающих количеств 5Ри (для Ь1210) или цисплатина (СЭЭР) (для ШАМ) на мл в течение 16 ч.

Супернатант рекуперировали, затем подвергали дифференциальным ультрацентрифугированиям, как указано в таблице.

ШАМ также инкубировали с IШ-2 в количестве 1000 МЕ/мл или с дексаметазоном (10^-6моль) или облучали с помощью 10000 рад.

Сильные дозы химиотерапевтических агентов и облучение являются хорошими примерами положительной регуляции экзоцитоза текзосом в случае этих животных, служащих в качестве моделей. Результаты воспроизводились также в случае других опухолей (фиг. 8А и 8В); в частности, оказалось, что облучение стимулирует экзоцитоз сильнее всего.

Фиг. 8А соответствует вышеописанной меланоме ΡΟΝ, а фиг. 8В соответствует мышиной лимфоме, обозначаемой ЕЬ4 (I. ΝηΙ. Сапсег Шз., 48, 265-271 [1972]).

На фиг. 8А представлены клетки ΡΟΝ, инкубированные в различных условиях:

1) СМ: базальная среда для культуры (ЕРМЕ содержащая 10% фетальной телячьей сыворотки);

2) ЭХМ = в присутствии дексаметазона;

3) облучение: облучено с помощью 10000 рад;

4) без сыворотки;

5) ГЬ-10: в присутствии ГЬ-10, по 10 нг/мл. Вышеуказанные облучения действительны, также для клеток ЕЬ4, Ь1210 и 6IΑМ.

Фиг. 9А, 9В и 9С. Мембранные везикулы (декзосомы), продуцируемые дендритными клетками, сенсибилизированными опухолевыми антигенами меланом, эффективны для стимуляции специфических к этим меланомам Тлимфоцитов и их продукция регулируется цитокинами.

ЬТ8 (СМ) соответствует Т-клонам ЬТ8, инкубированным в базальной среде для культуры, как указано на фиг. 8А;

ПехТех№И№ соответствует декзосоме, происходящей от дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток ΝυΝ;

ОехТехЕО№ соответствует декзосоме, происходящей от дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток ΕΟΝ;

ТитЕО№ соответствует опухолевым клеткам ΕΟΝ.

А. Тесты пролиферации: текзосомы Роп (использованные согласно фиг. 3) инкубировали с дендритными клетками НЕА-А2 в течение 3 ч, затем промывали 9%-ным солевым раствором после чего инкубировали в кислой среде с рН 6,3 в течение 18 ч. Мембранные везикулы дендритных клеток (декзосомы), таким образом, рекуперировали из супернатанта культуры вышеуказанных дендритных клеток НЬА-2.

Мембранные везикулы, происходящие от дендритных клеток, содержащих текзосомы (ЭехТех), затем инкубировали со специфическими к МАЕТ-1 клонами ЬТ8, представленными в рамках НЬА-А2 (текзосомы Роп содержат антиген МАКТ-1). В качестве отрицательного контроля использовали текзосомы Νιιπ (линия раковых клеток почки НБА-А2-; МАКТ-1-). В качестве положительного контроля использовали облученную опухолевую линию ΡΟΝ (ТитΡΟΝ) или антитело анти-СОЗ, предварительно адсорбированное на пластике (анти-СЭЗЛЬ). Инкубацию ЭехТех с клонами ЬТ8 продолжали 48 ч, затем в лунки объемом по 200 мкл добавляли 1 микроКи тритиированного тимидина. Лимфоцитарные пролиферации ЬТ8 определяли спустя 18 ч.

На оси ординат указано число импульсов в минуту.

B. Следовали той же методике, но ΙΡΝγ определяли в супернатанте 48-часовой культуры с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На оси ординат указано содержание ΙΡΝγ (пг/мл).

C. Декзосомы выделяли из супернатантов дендритных клеток после инкубации в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие ЬР8 (20 мкг/мл), ΙΡΝγ (100 МЕ/мл) или 1Б-10 (10 мкг/мл).

Фиг. 10. Вид декзосом в иммуноэлектронной микроскопии. Декзосомы имеют сходный диаметр, составляющий от 50 до 90 нм, и интенсивно маркированы антителами анти-СО63 (фиг. 10 А). Большая часть этих декзосом также маркирована антителами анти-МНС-Ι (с. 15, фиг. 10В) и анти-МНС-ΙΙ (с. 15, фиг. 10С). Черточки: 250 нм.

Фиг. 11. Определение количеств гаммаинтерферона, выделенных Т-лимфоцитами, которые инкубировали в присутствии декзосом, содержащих пептиды, или контрольных декзосом. Дендритные клетки (2х10⁶ /мл) инкубировали в течение 3-12 ч либо в присутствии 10 мкг/мл антигенного пептида МАВТ-1/Ме1аи А(27-з5), либо в присутствии 10 мкг/мл пептида ёр100(_280-288) (контроль) в виде суспензии в растворе лимонной кислоты с рН 3,7, после чего выделяли декзосомы. Клетки клона ЬТ12 (клон клеток СТЬ, ограниченный НБА-А2, специфический к МАКТ-1(_27-35) инкубировали (по 100000 СТЬ на лунку) с возрастающими количествами декзосом или пептидов др100 (контроль) на 96луночных плашках в течение 5 дней. Выделение гамма-интерферона клетками затем определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (Сепхуше).

Фиг. 12. Анализ путем вестерн-блоттинга маркеров, присутствующих в декзосомах (1,4 и 10 мкг), продуцированных дендритными клетками, происходящими от костного мозга: Н-2К (МНС-Ι), 1-Аа (МНС-ΙΙ), СО86, СО63, ТЕИ (рецептор трансферрина), С1х (кальнексин), Ιί р31 (неизменяющаяся цепь).

Фиг. 13. Противоопухолевое воздействие ίη νίνο декзосом на модель опухоли мастоцитомы (Р815). Оех-Н2б-АЕР-Р815: декзосомы, происходящие от дендритных клеток костного мозга, содержащие кислотный пептидный элюат опухоли Р815. Оех-Н2б-АЕР селезенок: декзосомы, происходящие от дендритных клеток костного мозга, содержащие кислотный, пептидный элюат селезенки.

Фиг. 14. Противоопухолевое воздействие ίη νίνο декзосом, происходящих от дендритных клеток костного мозга, содержащих кислотный пептидный элюат опухоли на модели опухоли груди (Т8/А). Легенда: см. фиг. 13. (А): Эксперимент, осуществляемый на иммунокомпетентных мышах. (В): Эксперимент, осуществляемый на мышах №бе.

Фиг. 15. Тест высвобождения радиоактивного хрома (⁵¹Сг). Этот тест позволяет показать, что декзосомы согласно изобретению вызывают ίη νίνο специфический ответ СТЬ. Клеткимишени: Р815, лейкозная линия Б1210. линия УАС, нечувствительная к клеткам ΝΚ.

Фиг. 16. Сравнительная эффективность декзосом и дендритных клеток. Эта фигура показывает, что декзосомы являются более эффективными, чем незрелые дендритные клетки, от которых они происходят, для удаления ίη νίνο развившихся опухолей. 5000000 дендритных клеток, содержащих кислотный пептидный элюат селезенки (незаполненные квадраты) или опухоли Р815 (незаполненные треугольники), вводили внутривенно или внутрикожно мышам, имеющим развившиеся опухоли Р815 в день 810. Параллельно, супернатант этих клеток, после инкубации в течение 18 ч, объединяли с пептидами селезенки (незаполненные квадраты) или опухоли Р815 (заполненные треугольники), ультрацентрифугировали и характеризовали в отношении содержания в нем декзосом. 5000000 дендритных клеток позволили получить 5-10 мкг декзосом, которые позволили иммунизировать 5 мышей путем внутрикожного введения в ίρά-латеральную сторону. Единственное введение декзосом осуществляли в день 8-10. Размер опухолей определяли два раза в неделю, и он представлен на фигуре. Знаки (*) представляют собой результаты, означающие 95%, согласно точному методу Фишера, по сравнению с инъекциями солевого (физиологического) раствора (незаполненные квадраты) или пульсирующих дендритных клеток. На вставке представлены проценты мышей, иммунизированных против Р815, показывающие полное отсутствие (исчезновение) опухоли в течение (день 21) и по окончании (день 60) эксперимента в различных группах по 5 мышей.

Фиг. 17. Очистка декзосом путем электрофореза в жидкой фазе.

Примеры

1. Продукция текзосом, осуществляемая линиями опухолевых клеток человека и мыши.

Этот пример иллюстрирует способность опухолевых клеток продуцировать липидные везикулы.

Мышиные или человеческие опухолевые клетки, происходящие от лейкемий или твердых опухолей (почки или меланомы ободочной кишки) (см. таблицу), инкубировали в течение 24 ч при плотности 1 млн клеток на миллилитр. Культуральную среду (среда ИРМЕ содержащая 10% зародышевой телячьей сыворотки) затем освобождали от клеток путем центрифугирования при ускорении 300д в течение 10 мин. Клеточные остатки затем удаляли путем двух последовательных центрифугирований в течение 15 мин, каждое при ускорении 800д (и путем возможного центрифугирования в течение 30 мин при ускорении 10000д). Наконец, текзосо23 мы получали путем центрифугирования в течение 60 мин при ускорении 100000д, затем промывали 1 раз с помощью РВ8 в тех же условиях. Концентрацию протеинов в препаратах текзосом определяли по методу ВгабТогб (ВюКаб Рго(еш Аккау [ВюКаб]).

Все испытуемые, человеческие и мышиные, опухолевые линии (твердые или гематопоэтические, первичные или установленные в культуре или происходящие от свежих диссоциированных опухолей) продуцируют текзосомы (таблица). Однако эффективность продукции различна в различных линиях. Линии мышиных опухолевых клеток продуцируют 100200 мкг протеинов текзосом на 50 миллионов клеток за 24 ч. Человеческие линии меланомы и нефромы продуцируют 10-100 мкг протеинов текзосом на 20 млн клеток за 24 ч.

2. Везикулы, продуцируемые опухолевыми клетками, имеют эндоцитическое происхождение.

Для того чтобы определить, имеют ли очищенные везикулы из супернатантов линий опухолевых клеток эндоцитическое происхождение, авторы осуществляли морфологическое исследование под электронным микроскопом одной из этих опухолевых линий, Т8/А (линия карциномы молочной железы мыши) (Νηηηί Р. и др. Т8/А: а пе\у те1ак1ак1/тд се11 1ше опдикИе £гот а ВАЬВ/с кроп(епеоик таттагу абепосагапота, С1т. Ехр. Ма(ак(ак1к, 1, 373-380 [1983]). Опухолевые клетки фиксировали и подготавливали для электронной микроскопии как описано выше. Текзосомы прямо помещали на сетку и анализировали.

На фиг. 1А представлены примеры внутриклеточных компартментов мультивезикулярного характера, наблюдаемые в опухолевых клетках. Эти эндоцитические компартменты имеют диаметр 200-300 нм (черточка внизу фиг. А и В означает 200 нм) и образованы наружной мембраной, окружающей многочисленные внутренние везикулы диаметром 68-80 нм. Препараты текзосом содержат мажорную популяцию везикул диаметром 60-80 нм (фиг. 1В), в некоторых случаях агрегированных, и имеют морфологию, подобную внутренним везикулам мультивезикулярных эндосом, наблюдаемых внутри клеток (фиг. А). Эти результаты наводят на мысль, что текзосомы секретировались во внеклеточную среду после слияния наружной мембраны эндосом с цитоплазматической мембраной. В самом деле, такие профили экзоцитоза наблюдали в этих клетках (данные не представлены).

Для того чтобы определить, имеют ли текзосомы действительно эндоцитическое происхождение, затем осуществляли анализ путем вестерн-блоттинга маркеров, находящихся, как определено ниже, в текзосомах, происходящих от опухолевых линий, Т8/А и Р815 (мастоцитома; согласно данным Т. Вооп, Ьибтад 1пкШи(е,

Брюссель, Бельгия) (мышиная мастоцитома). Для этого 2 мкг протеинов текзосом или клеточный лизат из 200000 клеток Т8/А разделяли на полиакриламидном геле, затем переносили на мембрану из нейлона (Атегкйат). Возможное наличие различных маркеров затем определяли с помощью специфических антител. Текзосомы Т8/А и Р815 содержат молекулы класса I главного комплекса гистосовместимости, а также различные маркеры эндоцитического пути (рецептор трансферрина, лизосомные протеины Ьатр 1 и 2) (фиг. 1А). Напротив, характерный маркер эндоплазматического ретикулюма (ЭР), кальнексин, не присутствует в препаратах текзосом, что говорит о том, что мембраны ЭР не включаются в состав текзосом.

3. Текзосомы, продуцируемые линией меланомы, содержат опухолевый цитозольный антиген.

Эти результаты показывают, что секретируемые опухолевыми клетками текзосомы соответствуют внутренним мембранам мультивезикулярных эндосом. Однако эти внутриэндосомальные везикулы образуются путем инвагинации, затем отпочковывания от наружной мембраны эндосом вторичных мембран во внутреннюю часть эндосомы. Эти внутриэндосомные везикулы и, следовательно, текзосомы, должны содержать цитозольную часть. Это особенно важно в рамках противоопухолевой иммунотерапии, так как некоторое количество опухолевых антигенов, включая МАКТ-1 (один из наиболее изученных), представляет собой цитозольные протеины. Следовательно, тестировали наличие МАКТ-1 в текзосомах.

Для этого 10 мкг протеинов текзосом или клеточного лизата из 200000 клеток линии меланомы человека (М10) (Т. Вооп, ЬибЮд !пк111и(е, Брюссель, Бельгия) анализировали путем вестерн-блоттинга, как указано выше. Возможное присутствие МАКТ-1 затем обнаруживали с помощью специфического антитела антиМАКТ-1 (8. КокепЬегд, ΝΟ, ВеШекба, ИЗА). Текзосомы, секретируемые опухолевой линией ΡΟΝ (клетки меланомы пациента ΡΟΝ, предоставленные Р. Раите, Институт Пастера, Париж, Франция), содержат опухолевый антиген МАКТ-1. Эксперименты по защите в отношении протеиназы К (81дта) показали, что эпитоп МАКТ-1, распознаваемый этим моноклональным антителом, находится внутри текзосом (результаты не представлены).

Эта первая часть работы показывает, что

- опухолевые клетки продуцируют и секретируют везикулы;

- эти везикулы представляют собой везикулы эндосомного происхождения, включающие наружную мембрану, где находятся различные мембранные молекулы (класса I СМН, различные маркеры эндосом);

- эти везикулы содержат цитозольную часть, включающую цитозольные опухолевые антигены, такие как МАКТ-1.

Эти результаты привели к подтверждению следующих видов биологической активности везикул, называемых текзосомами.

4. Текзосомы могут стимулировать Тлимфоциты СИ8 ίη νίΐτο.

Так как текзосомы содержат молекулы класса I на своей поверхности, тестировали их способность к стимуляции Т-лимфоцитов СИ8. Использовали два Т-клона, ЬТ8 и ЬТ12, предоставленные Раите Р., Институт Пастера, Париж, Франция, распознающие пептид, происходящий от МАК.Т-1, в ассоциации с НБА-А2 (ИиГоиг и др., 1997). С этой целью, так как опухолевые клетки ΡΟΝ представляют собой НБА-А2, клетки Т-клонов ЬТ8 и ЬТ12 инкубировали с текзосомами, полученными из супернатантов ΡΟΝ, или, в качестве положительного контроля, с интактными клетками ΡΟΝ. Активацию Тлимфоцитов определяли по выделению ΕΝΕβ. Текзосомы ΡΟΝ индуцировали дозозависимое выделение ТИРв клетками ЬТ8 и ЬТ12 (фиг. 3). Клетки ΡΟΝ также индуцировали секрецию ТИРв, тогда как текзосомы, происходящие от опухолевых клеток, не экспрессирующих МАКТ-1, не индуцировали секрецию ТИРв (фиг. 3).

Следовательно, комплексы НКА-А2/ пептид МАК.Т-1 находятся на поверхности текзосом.

Подобные результаты получали на мыши с Т-лимфоцитами селезенки мыши, иммунизированной β-галактозидазой (β-да!).

Текзосомы получали из супернатантов клеток мастоцитомы Р815 или клеток Р815, экспрессирующих в-да1 (линии А. А1Ьша, Ιΐ'ΐκΙίΙιιΙ СиЕгое Коикку, УП1с)шГ. Ргапсе), или клеток другой опухоли (Б1210.) (мышиный лейкоз Н2а), не экспрессирующих β-даЕ Ь210. Возрастающие концентрации (от 0,3 до 20 мкг/мл) этих различных препаратов текзосом затем инкубировали в течение 4 дней с клетками селезенки мышей, иммунизированных в-да1, экспрессируемой рекомбинантным аденовирусом. Сами текзосомы клеток Р815 (при наиболее высокой концентрации 20 мкг/мл), экспрессирующих βда1, индуцировали значительную пролиферацию (см. фиг. 4) (определяемую за счет включения тритиированного тимидина), хотя мало интенсивную, клеток селезенки. Эти результаты показывают, что текзосомы, продуцируемые клетками Р815, экспрессирующими β-даЕ содержат на своей поверхности комплексы Н2“/пептиды, происходящие от в-да1, и способны активировать мышиные Т-лимфоциты.

5. Текзосомы могут высвобождать цитозольные антигены, которые они содержат в антигенпредставляющих клетках, для представления Т-лимфоцитам.

Для этой цели использовали Т-клоны ЬТ8 и ЬТ12, специфически распознающие пептид, происходящий от МАКТ-1 (МАКТ-1_27-25 = ААС1С1ЬТУ, ИиГоиг Е. и др., Игуегкйу оГ (Не су1о1ох1с ше1апоша-крес1Г1с 1шшипе гекропке, I. 1ттипо1, 158, 3787-3795 [1997]), в ассоциации с НЕА-А2. Показано, что текзосомы, продуцируемые линией меланомы человека ΡΟΝ (которая представляет собой НЬА-А2), содержат опухолевый антиген МАКТ-1 (см. фиг. 2) и способны непосредственно активировать клоны ЬТ8 и ЬТ12. Для того чтобы иметь в распоряжении текзосомы, содержащие также МАКТ-1, но неспособные непосредственно стимулировать клоны ЬТ12 и ЬТ8, использовали линию меланомы М22 (Т. Вооп, Ьиб\\щ 1пкй1и1е, Брюссель, Бельгия), положительный МАКТ-1, но выражающую другой элемент рестрикции, чем НЬАА2 (в данном случае НБА-А1). В самом деле, клетки М22, также как текзосомы, происходящие от этих клеток, не активируют клоны ЬТ8 и ЬТ12 (результаты не представлены), в противоположность клеткам ΡΟΝ и текзосомам, происходящим от этих клеток (фиг. 3). Напротив, когда эти же самые текзосомы, происходящие от М22, инкубировали в присутствии дендритных клеток, экспрессирующих НБА-А2, наблюдали стимуляцию Т-клонов ЬТ12 и ЬТ8, как в случае текзосом, происходящих от ΡΟΝ (фиг. 5).

В случае текзосом, происходящих от М22, не может происходить активация Т-клонов, возникающая за счет комплексов НЬА-А2/пептид, происходящих от предварительно существующих МАКТ-1, так как они не экспрессируют адекватный элемент рестрикции (НБА-А2). Следовательно, речь может идти только об антигене, содержащемся в текзосомах, который продуцирован антигенпредставляющими клетками, разложен на пептиды, которые затем ассоциировались с молекулами НБА-А2 представляющей клетки. Текзосомы, следовательно, позволяют осуществлять перенос антигена между опухолевой клеткой и клеткой, представляющей антигены. Следовательно, текзосомы обладают функцией, подобной таковой природных липосом.

6. Текзосомы индуцируют регрессию развившихся твердых опухолей ш νί\Ό.

Наконец, так как текзосомы способны стимулировать Т-лимфоциты ш νίΙΐΌ и сенсибилизировать дендритные клетки для активации специфических к опухолям Т-лимфоцитов, тестировали противоопухолевую активность текзосом ш νί\Ό.

Для анализа такой противоопухолевой активности, мышам инъецировали в бок два раза (10⁵) минимальную дозу онкогена опухолевых клеток опухоли молочной железы (клетки Т8/А гаплотипа Н2^а, сингенные клеткам ВАЕВ/с). Спустя 3 или 4 дня животным, имеющим развившиеся опухоли, инъецировали 2 раза (день 3 и 4) текзосомы, полученные из супернатантов клеток Т8/А, или, в качестве отрицательного контроля, текзосомы клеток МС38 (8. КокепЬсгд. N01. ВеШекба, И8А) (опухолевая клетка гаплотипа Н2^Ь) или подобный объем РВ8. Средний размер опухолей в группе мышей, инокулированных препаратами текзосом Т8/А, сильно сократился по сравнению с группами контрольных мышей. Этот противоопухолевый эффект зависит от Т-клеток, так как мыши №1бе (мутантные мыши, лишенные Т-лимфоцитов), несущие опухоль и инокулированные подобным образом препаратами текзосом, не показывают уменьшения опухолевой массы (фиг. 6В).

В этой же самой серии экспериментов наблюдали противоопухолевый эффект текзосом, полученных из клеток мастоцитомы Р815 гаплотипа Н2^б, который позволяет полагать, что эти две опухоли выражают общие антигены. Подобные результаты получали с другой, очень иммуногенной моделью опухоли мастоцитомы Р815 (сингенная мыши ЭВА/2 и гаплотипа Н2^б). На этой модели показано, что текзосомы, инъецируемые внутрикожно в бок мыши, несущей опухоли, установленные на 10-й день (опухоль размером 80-100 мм²), обладают способностью приводить к удалению опухоли в более чем 60% случаев. Более того, эти мыши длительное время обладают противоопухолевым иммунитетом (результаты не представлены). В этой серии экспериментов наблюдали противоопухолевые эффекты текзосом, полученных из лимфоцитов Б1210, выделенных из клеток лейкемии мышей гаплотипа Н2'¹ и клеток Т8/А, что указывает на то, что общие эпитопы существуют также между этими тремя опухолями (между Р815 и Т8/А, мутированный р53 является общим для обеих опухолей).

Могут существовать два механизма противоопухолевого эффекта текзосом.

Прежде всего, инъецированные один раз текзосомы могут активировать непосредственно Т-лимфоциты хозяина, специфические к опухоли. Таким образом, может иметь место клональная экспансия Т-лимфоцитов, специфических к опухоли, или рпшшд Т-клеток. Вторая гипотеза предполагает прямое взаимодействие инъецированных текзосом с дендритными клетками хозяина. В этом случае возможна стимуляция противоопухолевого ответа. Для тестирования этой второй гипотезы наблюдали за ростом опухолей у мышей, инъецированных внутривенно с помощью дендритных клеток, происходящих от костного мозга, содержащих текзосомы опухолевых клеток. Мышам ЭВА/2 (1РРА СКЕЭО, Орлеан, Франция) также вводили путем инъекции два раза (50х10⁵) минимальную дозу онкогена клеток мастоцитомы Р815. Спустя десять дней каждому животному инъецировали 5х10⁵дендритных клеток, содержащих и тем самым сенсибилизованных 9 мкг текзосом. Средний размер опухолей в этих условиях значительно уменьшается по сравнению с группами мышей, инъецированных с помощью РВ8 или с помощью дендритных клеток, содержащих текзосомы клеток контрольной опухоли МС38. В самом деле, более 60% обработанных животных в конце эксперимента больше не имеют опухоли. Более того, в течение длительного периода времени не наблюдали рецидивов (в 80-100% случаев). Представляет интерес констатация того, что такая субоптимальная доза текзосом, инъецированная внутрикожно, не оказывает действия, что наводит на мысль о том, что дендритные клетки могут продуцировать декзосомы, содержащие опухолевые антигены, намного более эффективно, чем дендритные клетки дермы или клетки Лангерганса. Подобные результаты получили с моделью клеток опухоли молочной железы Т8/А.

Результаты, полученные в рамках изобретения, показывают, что текзосомы эффективно сенсибилизируют дендритные клетки. Эти клетки, сенсибилизованные таким образом, обладают способностью индуцировать интенсивные противоопухолевые ответы ίη νίνο в случае различных опухолей. Эти результаты наводят на мысль о том, что противоопухолевые эффекты, наблюдаемые после прямой инокуляции текзосом ίη νίνο, возникают вследствие сенсибилизации дендритных клеток хозяина. Примечательно, что эффект наблюдали после одноразовой инъекции сенсибилизированных дендритных клеток. Большинство обработанных мышей показывают полную регрессию опухоли или пролонгированное выживание (60 дней против 20 дней в случае контроля) вследствие регрессии опухоли.

Метод сенсибилизации представляющих клеток согласно изобретению обладает различными преимуществами по отношению к методам уровня техники:

ί) он не требует предварительного распознавания опухолевых антигенов: это особенно важно, так как опухолевые антигены в огромном большинстве опухолей не известны;

и) способ согласно изобретению может быть применен к любой опухоли, продуцирующей текзосомы; на более чем 15 линий опухолевых клеток, тестированных на сегодняшний день, только одна не продуцирует текзосомы (одна из шести тестированных линий меланомы);

ш) этот метод не зависит от гаплотипа СМН пациента и опухолевых клеток, так как опухолевые антигены, присутствующие в текзосомах, снова продуцируются и представляются Т-лимфоцитам молекулами СМН антигенпредставляющих клеток пациента;

ίν) способ согласно изобретению в принципе может быть эффективно использован в случае опухолей различного происхождения, так как существуют общие опухолевые антигены не только в особом типе опухоли (например, МАКТ-А в меланоме), но и также общие анти29 гены в совершенно различных опухолях (как молекулы, принимающие участие в онкогенезе, например, р53);

ν) использование текзосом также может оказаться эффективным при лечении опухолей, экспрессирующих незначительные количества молекул класса I СМН или совсем их не экспрессирующих (эти опухоли представляют 4050% метастазирующих онкологических заболеваний человека). В самом деле, текзосомы позволяют осуществлять перенос интактных антигенов между опухолевыми клетками и дендритными клетками, причем эти антигены затем представляются Т-лимфоцитам молекулами СМН дендритной клетки. Предварительные результаты показывают, что текзосомы позволяют индуцировать удаление опухолей мыши, экспрессирующих незначительные количества молекул класса I СМН (как МСА101; δ.Κο^η^Γ^, N01, Ве!11екба, И8А). Это, вероятно, происходит вследствие того, что степени экспрессии молекул СМН, необходимые для индуцирования эффективного иммунного ответа, намного более высокие, чем таковые, требующиеся во время эффекторной фазы (клеточная цитотоксичность);

νί) взятые индивидуально текзосомы за счет своей иммуногенной способности сами по себе представляют собой новую и эффективную форму профилактической или терапевтической вакцинации.

7. Характеризация мембранных везикул, продуцируемых дендритными клетками.

Способность дендритных клеток продуцировать мембранные везикулы прежде всего была подтверждена при использовании дендритных клеток, получаемых из человеческих предшественников - моноцитов, и линии мышиных дендритных клеток Ό1.

Клеточная линия Ό1 и условия созревания этой линии описаны \Утх1ег и др. (1. Ехр. Меб., 185, 317 [1997]).

Дендритные клетки, происходящие от человеческих предшественников - моноцитов, получали из адгезивной фракции мононуклеарных клеток, выделяемых от здоровых людей, инкубировали в течение 7-8 дней в среде А1МУ, содержащей Б-С1и, антибиотики, 1000 МЕ/мл Г11СМ-С8Е и гЫЬ-4 (8сбебпд РйидН, ^ηί^οήΗ, N1, И8А). После культивирования в течение 8 дней слабоадгезивные клетки и суспендированные клетки имеют типичную морфологию дендритных клеток, экспрессирующих большие количества молекул СМН класса I и II, так же как ΟΩ40 и СЭ86. Большая часть этих клеток положительна для ΟΩ1α и СЭ11Ь и отрицательна для СЭ2, СО3, СО14, СО19 и СП83.

Анализы, сделанные с помощью микроскопии, этих клеток показали присутствие мембранных везикул, обогащенных молекулами

СМН классов I и II. Эти везикулы выделяли путем центрифугирований и анализировали с помощью иммуноэлектронной микроскопии. Более конкретно, супернатанты культур дендритных клеток объединяли, центрифугировали при ускорении 300д в течение 20 мин, затем при ускорении 10000д в течение 30 мин при температуре 4°С для удаления клеток и клеточных остатков. Декзосомы затем выделяли путем центрифугирования при ускорении 100000д в течение 1 ч при температуре 4°С, затем путем промывки в забуференном фосфатом физиологическом растворе в тех же условиях (центрифугирование при ускорении 100000д в течение 1 ч при температуре 4°С). Концентрацию протеинов в препаратах декзосом определяли по методу Βγ;·ι6Γογ6 (ВюЯаб Рго!ет Аккау [ВюЯаб]).

Полученные результаты показывают (фиг. 10) однородную популяцию везикул, имеющих диаметр около 60-90 нм. Кроме того, более 95% декзосом маркированы антителами к ί.Ό63, СО82, МНС-Σ и МНС-П.

Эти результаты подтверждают, что дендритные клетки продуцируют мембранные везикулы, содержащие антигенпредставляющие молекулы, а также молекулы лимфоцитарной костимуляции.

Список литературы (ссылки)

Ат^гет, 8., Огаке, Σ.Κ., ХУеЬбег, Р., апб Ме11тап, I. (1994). Тгапкйп! ассити1а!юп οΓ пете с1акк II тο1еси1ек ίη а пονе1 еπбοсу!^с ^πηρ-ιΗтеп! ίη В 1утρЬοсу!ек [кее сοттепΐк]. №1!иге 369, 113-120.

Βοсζкοтекк^, Ό., Ναι г, 8.К., 8пубег, Ό., апб Ο№οη, Е. (1996). Оепбпбс се11к ри1кеб \νί!1ι 6ΝΛ аге ρο!еπ! апбдеп-ргекепбпд се11к ίη νίίτο апб ίη νίνο. ΣοιΐΓηα1 οΓ Ехрептеп!а1 Мебйте 184, 46572.

Βοοη, Т. (1992). Το^πγ6 а депебс апа1ук1к οΓ ишюг ге]ес!юп апбдепк. Абνапсек ίη Сапсег 6екеагсб 58, 177-210.

Е8реу1к, Т. & Жккеп-Меуег, Σ. (1986) Σ. Епπυηο1. Ме!1юбк 95:99-103.

Те1бег, 8., МШег, К., МοеЬ^еπ, С., БИпсН, А., 8сЫекктдег, Σ., апб Нсрктз, С.Я. (1990). К1паке асбхйу тойгок !бе ^Лтд οΓ !бе ер1бегта1 дго\\!11 ΓηαοΓ гесерЮг тебЫп !бе ти1!йекйи1аг Ьοбу. Се11 61, 623-634.

Мауο^бοтο, Σ.Σ., Ζοπηη, Т., 8йгки8, ν.Τ, Ζ^!νοде1. Ь., ОеПихх! С., Εη1ο, БЭ., МеНеЕ С.Т, Пбк!аб, 8.Т., Как!, \У.М., □еЖ, А.В., апб е! а1. (1995). Βοικ та^^οте-бе^^νеб бепбпбс се11к ри1кеб тебб куп!бебс итюиг рерббек ебсб рго!ес!йе апб Шегареибс αη!ί!ι.ηηοιη' 1ттиш!у. №1!иге Мебйте 1, 1297-302.

№Ье1, Ο.Σ., Οογ6οπ, Ό., ВЫгор, О.К., Νκ1ιο1οΓΓ, Β.Σ., Уапд, Ζ.Υ., Ауида, А., Сатегоп, Мб., №Ье1, Е.С., Сбапд, А.Е. (1996) Iттипе га^пке ίπ битап те1апοта а Пег бипбег οΓ ап а^дешс с1акк I тайг Ь^к!οсοтρа!^Ь^1^!у тотрйх депе \νί!1ι ^NА-1^ροкοте тотрйхек. Ргос. Νη!1. Асаб. 8сБ И8А 93:15388-18393.

Рагбо11, Ό.Μ. (1995). Ра гас п пе су!окше абщуагИк ίη сапсег Нппшпо1Негару. Аппиа1 Реу1е\у ой Iттиηо1оду 13, 399-415.

Яароко, 6., Ыцтап, Н.У., 8!оогуоде1, V., Ьеуепбеккег. Я., Нагбшд. С.У., Мебей, С.1.М., апб Сеихе. Нб. (1996) В-1утрНосу!ек кесге!е апбдеп-ргекепбпд уек1с1ек. 1. Ехр. Меб. 183, 11611172.

ЯокепЬегд. 8.А., Катеакатц Υ., ЯоЬЬшк, Р.Е., апб Уапд, Я. (1996). Иепббсабоп ой (Не де пек епсобшд сапсег апбдепк: трбсабопк йог сапсег Нптшю(Негару. Абуапсек ш Сапсег ЯекеагсН 70, 145-77.

Тгасегкакг С., Уап бег Вгиддеп, Р., ЬеиксНег, Ι.Ε., Ьигдшп, С., Скате/. Р., Уап Эек А., Эе Р1асек, Е., Атаг-Сок1екес, А. апб Вооп, Т. (1992) А попарерббе епсобеб Ьу Ьитап депе МАЯТ-1 1к гесодшхеб оп НБА-А1 Ьу су!о!охю Т1утрНосу(ек ббес(еб ада1пк! 1итог апбдеп ΜΖ2Е. 1. Ехр. Меб. 176:1453-1457.

ХУа1кег 8.А. е! а1. (1997). Ыа1иге, уо1. 387, рр. 61 е! кшуап1ек.

Ζ^(νоде1. Ь., ЯоЬЬшк, Р.О., 81огкик, Уб., С1агке, М.Я., Маеигег, Мб., СатрЬе11, Я.Ь., Оау1к, С.С., ТаНага, Н., 8сЬге1Ьег, Я.О., апб Боке, М.Т. (1996). 1п1ег1еикш-12 апб В7.1 сокбти1абоп соорега(е ш (Не шбисбоп ой еййесбуе апбШтог 1ттипйу апб (Негару ой ек(аЬНкНеб !итогк. Еигореап 1оигпа1 ой 1ттипо1оду 26, 133541 [а].

Ζ^(νоде1. Ь., Мауогбото, II., Т)апбгатеап, Т., ОеЬео, А.В., С1агке, М.Я., БоБе, М,Т., апб 81огкик, XV.! (1996). ТНегару ой тшапе !итогк \\1(Н (итог рерббе-ри1кеб бепбпбс се11к: берепбепсе оп Т се11к, В7 сокбти1абоп, апб Т Не1рег се11

1-аккос1а!еб су!окшек [кее соттеп!к]. 1оигпа1 ой Ехрептеп!а1 Мебюше 183, 87-97 [Ь].

Таблица

Продукция текзосом человеческими и мышиными линиями опухолевых клеток

Линии опухолевых клеток	Текзосомы, мкг/2х10⁷ клеток/18 ч
Мышиные
МСА 101	172
Р815	163
МС38	120
Б1210	150
Т8/А	160
Человеческие (меланомы)
УЮ*	80
ΕΟΝ	90
ΜΖ2-2	18
Человеческие (нефромы)
ЯСС ΝυΝ*	120
ЯСС гоиА*	18
ЯСС МЕС*	10
ЯСС С!АМ*	100

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Везикула, называемая текзосомой, освобожденная от своего естественного окружения, отличающаяся тем, что она происходит от опухолевой клетки, тем, что она включает липидный бислой, окружающий цитозольную фракцию, содержащую опухолевые антигенные молекулы и/или иммуномодуляторы, и/или хемоаттрактанты, и/или гормоны, и/или нуклеиновые кислоты, тем, что она имеет на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), тем, что она содержит протеин «Неа! 8Носк» Н8Р 70, и тем, что она имеет диаметр приблизительно от 60 до 100 нм.
2. Везикула по п.1, имеющая на своей поверхности молекулы класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости.
3. Везикула по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что, кроме того, она имеет на своей поверхности адгезивные молекулы и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции.
4. Везикула по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что, кроме того, она имеет на своей поверхности антигенные пептиды.
5. Везикула по п.4, отличающаяся тем, что антигенные пептиды ассоциированы с молекулами класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости.
6. Везикула по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она секретирована эндоцитными везикулярными компартментами опухолевых клеток, причем указанные эндоцитные везикулярные компартменты имеют диаметр от 200 до 300 нм.
7. Везикула, называемая текзосомой, освобожденная от своего естественного окружения, отличающаяся тем, что (ί) она происходит от опухолевой клетки, (б) она включает липидный бислой, окружающий цитозольную фракцию, (ίίί) она имеет на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), (ίν) она содержит антигенные пептиды, происходящие из опухолевой клетки, (ν) она содержит молекулы СБ40 или СБ80, (νί) она содержит протеин «Неа! 8Носк» Н8Р70, (νίί) она содержит фосфатидилсерин и (νίίί) она имеет диаметр приблизительно от 60 до 100 нм.
8. Везикула по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что она лишена протеина др96.
9. Способ получения везикул, называемых текзосомами, по любому из пп.1-8, включающий следующие стадии:

получение биологической пробы, содержащей опухолевые клетки, причем указанную пробу выбирают из пробы крови, плазмы, опухолевой клетки, культуры опухолевых клеток, биопсии опухоли или производного препарата, содержащего опухолевые клетки, и выделение везикул из указанной пробы способом, включающим по меньшей мере одну стадию центрифугирования, электрофореза, хроматографии и/или нанофильтрации.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой мембранные фракции, супернатанты культур или лизаты опухолевых клеток, или свежеприготовленные суспензии опухолевых клеток.
11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что биологический образец подвергают одной или нескольким стимулирующим обработкам, выбираемым среди обработок с помощью стероидных агентов, фармакологических агентов, агентов, способных увеличивать количество мультивезикулярных эндосом и/или путем облучения.
12. Применение текзосом по любому из пп.1-8 для сенсибилизации антигенпредставляющих клеток.
13. Способ сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, включающий инкубацию антигенпредставляющих клеток в присутствии одной или нескольких текзосом по любому из пп.1-8 в условиях, позволяющих сенсибилизировать антигенпредставляющие клетки, и отбор полученных сенсибилизированных антигенпредставляющих клеток.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что он включает стадию отбора везикул, секретируемых сенсибилизированными антигенпредставляющими клетками.
15. Применение текзосом по любому из пп.1-8 для стимуляции и, в случае необходимо сти, амплификации ίη νίίτο антигенспецифических Т-лимфоцитов, содержащихся в вышеуказанных текзосомах, или В-лимфоцитов, и, в частности, для стимуляции и амплификации ίη νίίτο Т-лимфоцитов.
16. Применение антигенпредставляющих клеток, полученных способом по пп.13 и 14, для стимуляции и, в случае необходимости, амплификации ίη νίίτο антигенспецифических Тлимфоцитов, содержащихся в вышеуказанных антигенпредставляющих клетках, или Влимфоцитов, и, в частности, для стимуляции и амплификации ίη νίίτο Т-лимфоцитов.
17. Лекарственное средство, включающее в качестве действующего начала одну или несколько текзосом по любому из пп.1-8 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
18. Лекарственное средство, включающее в качестве действующего начала одну или несколько антигенпредставляющих клеток, полученных способом по п.13 или 14, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
19. Лекарственное средство по п.17 или 18 для лечения раковых, инфекционных и паразитарных заболеваний.
20. Лекарственное средство по п.17 или 18, отличающееся тем, что оно дополнительно включает стабилизатор.
21. Композиция, включающая текзосомы по любому из пп.1-8 и иммуностимулирующую добавку, для одновременного, раздельного или разнесенного во времени применения.