DK153025B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af cysteinderivat eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

i

DK 153025B

Opfindelsen angår en anal og i fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt cysteinderivat med formlen: m-co-o-ch2-<Q> 5 3r WH- OCCHCH^-S - (I)

Br / CH2-1-ch3 ό 15 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at et cystyldichlorid med formlen:

Cl - OC - CH - CHo - S - S - CH2 - CH -CO - Cl '20 1 i (II) NH-C0-0-CH2-^^ nh-co-o-ch2-^^ omsættes med 2,4-dibrom-6-(N-methy1-N-cyk1ohexy1 aminomethy1)-anilin, i det efterfølgende benævnt "bromhexin".

25 Fra Chemical Abstracts 66, 1415η (1967) og The Merck Index,

Tenth Edition, Merck & Co., Inc., Rahway. N, J. USA (1983), side 192, nr. 1361 kendes forbindelsen N-cyklohexyl-N-methy1 -(2-amino-3,5-dibrombenzyl)ammoniumchlorid, der har slimløsnende, hostehæmmende og viskositetsnedsættende virkning. Disse 30 virkninger er imidlertid ikke så udtalte som virkningen af den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse, og den kendte forbindelse har desuden flere og alvorlige bivirkninger end den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse.

Cystyldichloriderne med den almene formel II kan fremstilles ud fra de tilsvarende syrer efter kendte fremgangsmåder til omdannelse af en syre til dens chlorid, f.eks. ved behandling 35 2

DK 153025B

med phosphorpentachlorid i et egnet opløsningsmiddel, såsom chloroform eller di ethyl ether. Det er ikke nødvendigt at isolere eller rense dichloridet før anvendelsen i fremgangsmåden ifølge opfindelsen. En egnet fremgangsmåde er at udfælde dich-5 loridet fra reaktionsblandingen, f.eks. ved tilsætning af li-groin til diethyletheropløsninger eller diethylether til chlo-roformopløsninger, filtrere det fra og sætte det til en opløsning af bromhexin i et egnet opløsningsmiddel, såsom chloroform eller ethylacetat. Reaktionen med bromhexin forløber ved 10 stuetemperatur og kan, om ønsket, fuldføres under tilbagesvaling. Det ifølge opfindelsen fremstillede cysteinderivat kan isoleres og renses, og, om ønsket, omdannes til farmaceutisk acceptable syreadditionssalte efter almindeligt kendte fremgangsmåder, såsom behandling med den udvalgte syre i et opløs-15 ningsmiddel. Salte af saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, salpetersyre, perch 1orsyre, fumarsyre, maleinsyre, phosphorsy-re, glukolsyre, mælkesyre, salicylsyre, ravsyre, to 1uen-p-su1-fonsyre, vinsyre, eddikesyre, citronsyre, methansulfonsyre, myresyre, benzoesyre, malonsyre, benzensul fonsyre og naphtha-20 1en-2-sulfonsyre foretrækkes.

Cysteinderivatet, fremstillet efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og syreadditionssaltene deraf besidder en god slimløsnende, hostehæmmende og viskositetsnedsættende virkning på ~r åndedrætssystemets væsker, og har en lav toxicitet. LDcn-vær-dien bestemt på mus og rotter givet både i.p. og per os er større end 3000 mg/kg for alle de undersøgte forbindelser.

Den slimløsnende aktivitet (ED50} bestemt på kaniner efter Boyd-fremgangsmåden (Boyd og Sheppard, Arch. Int. Pharm. 1966, 163, 284) var 100 mg/kg.

Den samme ED50 bestemt på mus efter en forbedret Mavatari-fremgangsmåde (Graziani, Cazzulani, Il Farmaco, Ed. Prat., 1981, XXXVI, 3, 167) var 1,2 mg/kg.

3 5

Forbindelsen I viste sig at være aktiv i.p. som et hostened-sættende middel i en dosis på 30 mg/kg (Fremgangsmåden ifølge Charlier, Prost og medarbejdere, Arch. Int. Pharm., 1961, 134, 3

DK 153025 B

306) ved inhalering af en citronsyreaerosol hos marsvin. Aktiviteten blev bestemt ved undersøgelse af hæmningen af hoste.

Til vurdering af den hostehæmmende virkning gennemførte man en 5 anden fremgangsmåde, hvor Nervus vagus blev stimuleret og formindskelsen af hosten blev iagttaget efter injektionen af produktet fremstillet efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen (Pickering og Jones, Arzn. Forsch., 1979, 29, 287). ED50 for forbindelsen I var 88 mg/kg.

1 0 A Opfindelsen vil blive nærmere beskrevet i det efterfølgende eksempel.

EKSEMPEL

ΐς N,Nl-dibenzvloxvcarbonvl-cvstvl-bis-C2,4-dibrom-6-(N-methyl-N- cykl o hexyl - ami nomethvl )-am'lidl.

Til l0,l6 g N,N1-dibenzyloxycarbony1-L-cystein opløst i 56 ml vandfri chloroform sættes langsomt 10 g phosphorpentachlorid ved -10°C til -50C.

20

Reaktionsblandingen blev omrørt i 10 minutter, hvorefter der blev tilsat 60 ml diethylether og derefter afkølet i en time.

Det således dannede bundfald blev filtreret fra og hertil blev der ved 22°C tilsat en opløsning af 14,88 g bromhexin i 40 ml 25 ethylacetat. Blandingen blev omrørt ved 22°C i en dag og derefter opvarmet under tilbagesvaling i 4 timer.

Da reaktionen var tilendebragt, blev blandingen ekstraheret med ethylacetat, vasket med en natriumcarbonatopløsning, med vand og derefter tørret over vandfrit natriumsulfat. Opløs- O u ningsmidlet blev bortdampet, og den tilbageblivende rest behandlet med hexan. Produktet blev filtreret fra, opsamlet og omkrystalliseret i ethanol. Smeltepunkt 168°C.

Ved tilsætning af hydrogenchlorid i ethanol fik man det ti 1 - 3 5 svarende salt, smeltepunkt 195-197°C (under dekomponer ing). Elementæranalyse for C50H60Br4N6°6s2.2HC1 4

DK 153025B

C Η N Br Cl S

Beregnet (%): 46,28 4,81 6,47 24,63 5,46 4,94

Fundet (%): 45,94 4,79 6,27 24,97 5,13 4,82 δ Under anvendelse af den samme fremgangsmåde men ved at variere den anvendte syre til saltdannelsen fik man følgende salte:

Hydrobromid smeltepunkt 190-195°C

Formiat " 167-169°C

Mandelat ” 148-149°C

10 Acetat ” 169-171°C

Tartrat " 131-134°C

Sammen 1 ign i ngsforsøg ,c For nærmere at belyse den overraskende gunstige virkning af den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse i forhold til den kendte forbindelse N-cyklohexyl-N-me-thyl-(2-amino-3,5-dibrombenzyl)ammoniumchlor id, dvs. bromhe-xin, blev der udført sammenligningsforsøg mellem forbindelsen ifølge eksemplet, nemlig N,N'-dibenzyloxycarbony1-cysty1-bis-

L O

[2,4-d i brom-6-(N-methyl-N-cyklohexyl-ami nornethy1)-ani 1 id] og bromhexi n.

I den efterfølgende tabel 1 er vist de resultater med hensyn til slimløsnende aktivitet, der blev opnået ved behandling af •y c kaniner, mus og rotter med enten· forbindelsen ifølge eksemplet eller bromhexin.

30 3 5 5

DK 153025B

TABEL 1 - Siimløsnende aktivitet KANIN(®) p.R. MUS(b) P.R. ROTTE(b) P.R.

ED50 mg/kg ED50 mg/kg ED50 mg/kg P.O. P.O. P.O.

5

Forbindelse i følge eksemplet 87,52 1,29 0,54 (53,54-143,10) 100 (0,61-2,75) 100 (0,46-0,62) 100

Bromhexin 111,70 1,46 0,82 10 (64,38-193,00) 78 (0,57-3,72) 88 (0,69-0,97) 66 hvor: tallene i parenteser = konfidensgrænser for P = 0,05 (a) = Boyd's metode (E.M. Boyd, P. Sheppard, Arch. int. Phar- 1c macodyn., 163, 284, 1966)

i. O

(b) = Modificeret Matawari-metode (6. Graziani, P. Cazzulani,

Il Farmaco Ed. Pr., 36, 167, 1981)

P.R.= Styrkeforhold (Potency Ratio) ED50(2) # 1Q(J

ED 50(x) 2 0

Som det fremgår, viste forbindelsen ifølge eksemplet i alle dyrearter en højere slimløsnende aktivitet end bromhexin.

Den akutte toksicitet (se tabel 2) blev undersøgt i mus og rotter, der blev indgivet forskellige mængder af forbindelsen 25 ifølge eksemplet og bromhexin, begge ved oral og intraperito-neal indgift. Det skal bemærkes, at der ikke blev fundet nogle data for akut toksicitet i litteraturen for bromhexin i hunde.

30 35

DK 153025 B

6 TABEL 2 - Akut toksicitet, LD50 i mg/kg

Forbindelse ifølge Bromhexin Art Køn Vej eksemplet 5 Mus M-F p.o. >3000(a) 3000(b) i.p. >3000(a) 2312(a)

Rotte M-F p.o. >3000(3) >1000(b) i.p. 1938(3) >2300(3)

Hund M-F p.o. >1000(3) 10 hvor: (a) = Værdier, der blev påvist i Recordati's S.p.A. laborato- r i er (b) = Værdier, der blev rapporteret af R. Engelhorn, S. Pusch- mann, Arzneim.-Forsch. 13, 474, 1963.

Resultaterne i tabel 2 viser, at forbindelsen ifølge eksemplet udviser en meget lav toksicitet i alle dyrearterne, og at dens toksicitetsværdi i musen er lavere end toksicitetsværdien for 20 bromhexi n.

Hvad angår naturen af de observerede bivirkninger er intoksi-kati onssymptomerne i alle dyrearter meget alvorligere i dyr, der er behandlet med bromhexin end i dyr, der er behandlet med 25 forbindelsen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette fremgår ved en sammenligning, hvor man går ud fra resultater fra forsøg foretaget af ansøgeren eller resultater, der er rapporteret i litteraturen vedrørende bromhexin.

30 Med hensyn til kliniske symptomer iagttaget hos rotte efter intraperi toneal indgift (akutte toksicitetsundersøgelser) fremgår det af tabel 3, at forbindelsen ifølge eksemplet og bromhexin reducerer spontan aktivitet og fremkalder horripilation startende fra henholdsvis 1000-1700 mg/kg og 230 mg/kg.

Efter oral indgift af forbindelsen ifølge eksemplet hos rotte 3 5 ses ingen bivirkninger op til 3000 mg/kg, mens det i litteraturen er anført, at bromhexin fremkalder sedation ved 200 mg/kg (R. Engelhorn og S. Pushmann, Arzneim.-Forsch., 13, 474 7

DK 153025B

(1963)). Virkningen af forskellige orale doser af forbindelsen ifølge eksemplet og bromhexin på den undersøgende (eksplorato-riske) adfærd hos rotter er også undersøgt. Lægemidler blev indgivet 30 minutter før individuel anbringelse af dyrene i 5 aktivitetsbure og inden for de følgende 30 minutter blev den lokomotoriske aktivitet bestemt ved hjælp af lysstråler (ambulatorisk reaktion). Ud fra den procentielle inhibering af aktivitetstal sammenlignet mod bromhexin fremgår det af tabel 4, at forbindelsen ifølge eksemplet udviser en lavere inhiberende 10 virkning end bromhexin. En tilsvarende metode blev benyttet for at bestemme den lokomotoriske reaktion hos rotte ved anvendelse af standard aktivitetsbure med fotocelle efter gentaget behandling enten med forbindelsen ifølge eksemplet eller med bromhexin. Efter den anden indgiftsdag udviste kun bromhe-15 xin signifikant nedsættelse af den spontane motilitet (se tabel 5).

Det fremgår således ud fra disse resultater, at forbindelsen ifølge opfindelsen har lavere virkninger på centra 1nervesyste-20 met sammenlignet med bromhexin.

25 30 35 8

DK 153025B

TABEL 3

Akut toksicitet hos rotte efter i.p. indgift Fremkomst af kemiske symptomer 5 Lægemiddel Dosis Nedsat aktivitet* Horripilation* mg/kg i.p.

Forbindelse ifølge 10 eksemplet 300 0/10 0/10 540 0/10 0/10 1000 10/10 0/10 1700 10/10 10/10 3000 10/10 10/10 15 -------------------------------------------------------------

Bromhexin 230 10/10 10/10 400 10/10 10/10 750 10/10 10/10 1300 10/10 10/10 20 2300 10/10 10/10 * = Forhold mellem antal dyr, der udviser symptomerne og det samlede antal behandlede dyr.

25 30 35 9

DK 153025B

TABEL 4

Undersøgende adfærd hos rotte

Behandling Dosis Ambulatorisk reaktion Inhibering 5 mg/kg p.o. M ± SE * %

Kontrol - 71,9 ± 8,9

Forbi ndel sen ifølge eksemplet 300 64,7 ± 17,1 10,0 10 Bromhexin 300 52,2 ± 10,2 27,4

Kontrol - 87,5 ± 9,7

Forbindelsen ifølge eksemplet 500 70,1 ± 9,7 19,9 „c Bromhexin 500 49,6 ± 8,3 ** 43,3

1 O

* a Middelværdi + standardfejl.

** = P <0,01 i forhold til kontrol (Student's t-test) 20 2 5 30 35

DK 153025B

ίο i

D) I

C I

r“ I

£_ I

0 1 li) 10 I

XJ å? Η Μ I

r- I

SZ 1

£ I

•i- I

ID I

-K tH CO r-l I

. O) CO i-l O) I

«3 (0 +1 +1 +1 I

73 *3- r-l CO I

LO C- O 1

LO »3 *3 I

U) I

C I

•i— I

1- I

0 I

jQ I t- CO !

•i- I

-C 1

C I

•r· I

CO CO I

* r-t O CM I

• O) O) r-t r-l I

CO (0 +1 +1 +1 I

• 0 o CO lO CO I

+) CM 00 CJ) I

4J l£) 'Si 'ί I

O i

C. I

U) I

tn c lø o-ι- -jc i tn SI S_ I — —> 0 I O "3 1 0 4-> LO +J rHsflO)« 0 -r- I *r- 0

_J +J -C 1 > 4J

UJ -i- C 14-1 £0 i- ·!- I (0 +> ^ ·γ- i Ό (-4-1 -fc CM si O I t_ tn o · σι c— oo cm i ro - E CM ffl +1 +1 +1 I 73+4

73 t-ι tf) CM I C +J

c t- i-i cm i ro ø to in m co i 4-1 c v t tn c C I 3

O O) I +1 Q

Q £ I w to T- i ·~> £_ I 0 r- 0 I O O) I > o jQ æ CM I £- t- ·[— I 3 4-> SI I -Si £

£ I O

•r- I t- Λ£ I 0 CO CO l Or- •5c co en «3 i £ t- . O) r-l CM ΓΗ 1 3 4-> i-· ro +i +1+11 73 »3 LO CO 1 r— 73 00 O ">3 I ro I—

»3 tO CO I 0 O

σ> it- s: tn ro i ro t- •i- 73 i * o tn \ o o i 4- o o> i o o i τα JS. CO CO I 73 ·>- \ I S- σ» i w i-·

E I > O

£ 1 r-

0 I 0 O

σι in i 73 £ I- 4-> C 1 73 v •1- 0 0 -r- I Τι— i— 73 r— X I Σ O.

73 o c ø α 0 I

£ £_ ·ι- O) S -C I li 11 ro 4-> xi i— ø e i sz £ t_ s tn o i 0 O O 4- J* S- I * ca s^u.-1-øoqi * *

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af terapeutisk aktivt cystinderivat med formlen: uh-co-o-ch2-^ \ Br \=y 25 - 0CCHCH2-S - (I) -S -CH3 30 35 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, kendetegnet ved, at et cystyldichlorid med den almene formel: DK 153025B Cl - OC - CH - CH2 - S - S - CH2 - CH -CO - Cl I I (ID nh-co-o-ch2-^^ nh-co-o-ch2-^^ 5 omsættes med 2,4-dibrom-6-(N-methyl-N-cyklohexy1 aminomethy1)-anilin, hvorefter en dannet forbindelse med formlen I om ønsket omdannes til et syreadditionssalt deraf. 10 ;c 15 20 25 30 35