DK149071B - Oxidoreduktase- og saccharoseinverterende enzym-holdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv - Google Patents

Description

i 149071

Den foreliggende opfindelse angår et oxidoredukta-se- og saccharoseinverterende enzym-holdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv til nærings-og nydelsesmidler, dyrefoder eller orale farmaceutiske 5 præparater, navnlig mund- og tandplejemidler.

Det er kendt, at der i mundhulen i nærværelse af mikroorganismer dannes såkaldt "plaques" forårsaget af nærings-, nydelses- og lægemidler med et højt indhold af sukker, og at der opstår sure affaldsprodukter, der an-10 griber tandemaljen stærkt. Denne indvirkning er kendt under navnet caries. Man forstår herved et i begyndelsen overfladisk angreb på tænderne, der derpå fortskridende ødelægges under dannelse af hulheder.

De mikroorganismer, der befinder sig i eller un-15 der de som plaques betegnede tandbelægninger, er i første række af betydning for opståelsen af tandcaries.

De i tandplaques tilstedeværende mikroorganismer lever, ligesom alle andre i mundhulen tilstedeværende kim, af de rester, der bliver tilbage i mundhulen efter nærings-20 eller nydelsesmiddelindtagelsen. Især lavmolekylære kulhydrater, frem for alt forskellige sukkerarter, er gunstige for bakterierne, da de udgør de bedste energikilder for bakteriernes intensive vækst- og stofskifteprocesser.

25 Cariesdannelsens mekanisme synes endnu ikke at være nøjagtigt opklaret i alle enkeltheder. De cario-gene mikrober, f.eks. Streptococcus mutans, danner fermentet dextransaccharase, der spalter rørsukkeret i an-hydroglucose og fructose. Anhydroglucosen kan derpå 30 sammenlejres til polymere molekyler, der betegnes dex-trangeler. Blandt disse viser især dextrangeler med en molekylvægt på 10.000 til 200.000 en særlig klæbekraft.

Disse dextrangeler tjener på en vis måde som "klæbe-midler", der fastholder de pågældende bakterier på tand-35 overfladerne, dvs. danner plaquen. De nævnte bakterier kan derpå under plaquen under luftudelukkelse danne syrer, f.eks. mælkesyre eller andre tandødelæggende syrer, 149071 2 f.eks. udfra inddiffunderet sukker, hvilket fører til dannelse af indledende emaljelæsioner (initial-caries), dvs. der sker en korrosion af dentinen med de kendte følgefænomener. Efter dannelse af plaquen vil der, ved 5 den herunder stedfindende cariøse demineralisering under indvirkning af syre, lidt efter lidt udtrækkes calcium og phosphat især fra tandens emaljeapatit.

Ved de hidtidige forsøg på at hæmme caries er man gået to veje. Disse består i princippet enten i en for-10 øgelse af modstanden af tandhårdstofferne overfor syre-angrebet eller i en svækkelse af syreangrebet på tanden.

Under den førstnævnte løsning falder forsøg på drikkevands-, salt- eller mælkefluoridering, der frem for alt i USA og Schweiz er blevet gennemført i vidt om-15 fang. Desuden kan nævnes lokalapplikation af fluorid-holdige tabletter eller anvendelsen af fluorerede for-findelser, såsom natriumfluorid, natriummonofluorphos-phat, tinfluorid-calciumpyrophosphat eller aminfluorid.

Selv om der er berettet om en aftagen af cariøse læsioner 20 gennem disse forholdsregler, kan de opnåede resultater ikke anses for tilfredsstillende. Dertil kommer, at der består væsentlige vanskeligheder også af fysiologisk art mod kemikalieindføringen især i drikkevand og næringsmidler, såsom mælk. Dertil kommer, at de kollektive og 25 individuelle flourideringsforholdsregler i forbindelse med ernæringen af civilbefolkningen ikke er tilstrækkelige til at modvirke den cariøse ødelæggelse af tænderne.

Man har imidlertid også søgt en cariesbekæmpelse ved kontrol af dextrandannelsen, især ved indvirkning af 30 kemikalier. Således er f.eks. i "Journal of Dental Health" bind 22 nr. 4, december 1972, beskrevet anvendelsen af natriumoleat og -linoleat til dette formål. Disses virkning på dannelsen af dextran kan ifølge DE-offentliggørelsesskrift nr.

2 442 825 forstærkes ved hjælp af vandopløselige sekun-35 dære phosphater i midler til tandhygiejnen. Desuden omhandles i DE-frenlæggelsesskrift nr. 1 467 809 anvendelsen af Ca-,

Na- eller Mg-salte af estere af phospihorsyre med saccharose, glucose eller lactose til fremstilling af i mundhulen 3 149071 cariostatisk aktive tandplejeprodukter. Disse forholds·^ regler til blokering af metabolismen af den mundmikroflora, der anvender dextran-saccharose-enzym-systemet til dannelse af "dentalplaque", har ganske vist medført en vis 5 forbedring af tandplejemidlerne, men ikke den ønskede dybtgående bekæmpelse af den cariøse tandødelæggelse.

Heller ikke kendte forsøg på at udnytte lyolyse-princippet, nemlig at forebygge caries enten ved ødelæggelse af de cariogene mikroorganismer ved opløsning 10 eller løsnen deraf eller ved opløsning eller løsnen af de klæbende dextrangeler, har hidtil vist sig tilfredsstillende. Således er der i DE-fremlæggelsesskrift nr. 2 011 935 beskrevet ødelæggelse af eller angreb på cariogene mikrober ved hjælp af enzymer, der er blevet isoleret af bestemte 15 streptococstammer. Til dette formål er angivet tre bestemte stammer og deres indføring i tandplejemidler. Desuden er lyolyse-princippet blevet anvendt på allerede dannet dextran ved hjælp af enzymet dextranase ifølge DE-offentliggørelsesskrift nr. 1 955 956. Ifølge OT-patentskrift nr.

20 318 815 kunne dextranasen imidlertid kun ødelægge opløselig dextran, da det uopløselige dextran har en mutan-andel, der ikke kan angribes af dextranase. Derfor er anvendelsen af "mutanase" blevet foreslået i dette østrigske trykskrift.

Heller ikke disse forsøg på at forbedre tand-25 plejemidler ved opløsning af de dextranfrembringende mikroorganismer eller selve dextranerne og inkorporering af sådanne systemer i taadplejemidler har imidlertid vist sig fuldstændig tilfredsstillende hidindtil.

Dette skyldes til dels, at en pleje af tænderne efter 30 hvert måltid, efter indtagelse af søde sager osv. ikke altid er mulig, og at den sædvanlige indvirkning af tandplej emidlerne ikke alene er tilstrækkelig til at standse de i mellemtiden indtrådte beskadigelser.

En anden vej til bekæmpelse af caries har man set 35 i delvis eller fuldstændig erstatning af rørsukker med andre ikke-cariogene sukkerarter eller sukkeralkoholer 149071 4 eller med syntetiske sødemidler.

En fuldstændig erstatning af saccharose med kun lidt cariogene eller ikke-cariogene sukkererstatningsstoffer, f.eks. med sukkeralkoholerne xylit og sorbit, 5 kommer ved mange anvendelser ikke i betragtning af teknologiske, økonomiske, organoleptiske eller medicinske grunde.

Blandt de syntetiske sødestoffer har saccharin, et af de kendteste og hyppigst anvendte sukkererstat-10 ningsstoffer, den ulempe, at det fremkalder en ubehagelig eftersmag hos brugeren. I forbindelse med andre stoffer, f.eks. cyclamaterne, er lægestanden yderst forbeholden, hvad angår deres skadelighed. De syntetiske sødestoffer har desuden den ulempe, at de små 15 mængder, der skal anvendes som følge af den høje søde-kraft, ikke er lette at dosere, f.eks. taler man i denne sammenhæng om en "tom smag", dvs. den ønskede "fylde" mangler. Også fysiologiske virkninger stiller sig hindrende i vejen for den almindelige udbredelse af de 2Q syntetiske sødestoffer.

Det er endvidere blevet anbefalet at anvende enzymer. Det er således i forvejen kendt at tilsætte in-vertase indenfor rarrmeme af fremstillingen af enkelte, specielle levnedsmidler. Således har invertase vundet indpas i kunsthon-25 ningfremstilling, likør-, iscreme- og konfitureindustrien, hvor den tjener til at frembringe stabile cremefyldninger eller til at holde marcipan blød. De herved opnåede produkter indeholder imidlertid ikke længere invertase eller indeholder i det mindste ikke betragte-30 lige andele deraf. Endvidere er det i DE-offentliggørelsesskrift nr.

1 927 411 foreslået at anvende α-glucosidaser og/eller β-fructosida- ser til forhindring af plaquedannelse. Endvidere er der i DE-offent- liggørelsesskrift nr. 1 948 298 beskrevet en polymer-enzym-forbindel- se til nedbrydning af i mundhulen tilbageværende spiserester, hvilken forbindelse indeholder neutrale, alkaliske og sure proteaser foruden amylase, lipase og dextranase.

35 5 149071

Fra DE fremlæggelsesskrift nr. 2.027.019 kendes tandplejemidler, der er vandfattige, sukkerholdige og tandskånende derved, at de indeholder oxidoreduktaser, såsom glucoseoxidase og lactatoxidase (det sidstnævnte 5 enzyms betegnelse er ifølge Enzyme Nomenclature,

Elsevier Scientific Publishing Comp., Amsterdam, 1973, side 108/109 blevet ændret til lactat-2-monooxygenase, nr. 1.13.12.4), samt sacchairoseinverterende enzymer.

Det afgørende ifølge dette tyske fremlæggelsesskrift er, 10 at oxidoreduktaserne med oxygen sønderdeler substratet under dannelse af hydrogenperoxid. Ved hjælp af dette enzymatisk dannede aggressive agens beskadiges eller ødelægges de mikroorganismer, der tager del i det cariogene angreb, oxidativt. Herved angribes imidlertid 15 mundfloraen som helhed af medier, der er fremmede for legemet, hvilket er uheldigt.

Trods disse talrige forsøg på at bekæmpe caries, der bygger på de mest forskellige principper, består der 20 stadig en tvingende nødvendighed for yderligere eller nye forholdsregler til forhindring af de skadelige følger af syreangrebene i nærværelse af cariogene mikroorganismer for at muliggøre en tilbagetrængning af caries i forbindelse med de traditionelle kostvaner.

25 Den til grund for opfindelsen liggende opgave er at modvirke de skadelige virkninger af caries såvel ved forbedring af traditionelle, vandfattige levnedsmidler, der er fremstillet under anvendelse af sukker, som, eventuelt, supplerende ved en samtidig forbedring af tand-30 plejemidler og farmaceutiske præparater. Forbedringen af levnedsmidlerne skal især tage hensyn til den omstændighed, at det cariogene angreb allerede sker i de tidsintervaller, der ligger mellem de sædvanlige tidspunkter for tandrensningen. Det tilsigtes især ifølge opfindel-35 sen at omdanne levnedsmidler til "tandskånende" levnedsmidler uden eller uden fuldstændig erstatning af det sædvanligvis anvendte sukker ved tilsætning af et fysiologisk uskadeligt stof.

149071 6

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved et oxido-reduktase- og saccharoseinverterende enzym-holdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv til nærings- og nydelsesmidler, dyrefoder eller orale farmaceu-5 tiske præparater, navnlig mund- og tandplejemidler, hvilket middel er ejendommeligt ved, at oxidoreduktasen er lactatdehydrogenase.

Der er tale om henholdsvis L-lactat- og D-lactat-dehydrogenase. Disse har Enzyme Nomenclature-numrene 10 henholdsvis 1.1.1.27 og 1.1.1.28. Som bekendt afspejler enzymnomenklaturens nummersystematik forskelligheder i enzymernes natur. Lactatoxidase overfører således lactat i acetat og kræver for sin enzymatiske reaktion tilstedeværelse af oxygen, og der dannes som yderligere reakti-15 onsprodukter C02 og · Lactatdehydrogenase overfører derimod på speciel måde lactat i pyruvat, og L-formen kræver for den enzymatiske reaktion tilstedeværelse af en hydrogenacceptor. En sådan hydrogenacceptor vil imidlertid som oftest være til stede i spyt eller i forelig-20 gende plaque-materiale, og en separat tilsætning af en hydrogenacceptor er derfor ikke absolut nødvendig. Det er imidlertid ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at det omhandlede middel yderligere indeholder en hydrogenacceptor. Som hydrogenacceptor kan for eksempel anvendes nico-25 tinamidadenin-dinucleotid.

Det har ved forsøg overraskende vist sig, at cariesangrebet aftager drastisk ved tilsætning af det omhandlede middel.

Det antages, at der ved tilsætningen af lactatde-30 hydrogenase i kombination med saccharoseinverterende enzym til vandfattige eller vandfrie levnedsmidler indbydes et hæmnings sys tern, der ved fortæring af levnedsmidlerne modvirker den skadelige indflydelse af de ved sukkernedbrydningen dannede produkter i nærværelse 35 af cariogene bakterier og omdanner levnedsmidlerne, især de stærkt sukkerholdige levnedsmidler, samt de farmaceutiske præparater til tandskånende, ikke-cariogene el-, ler anti-cariogene produkter.

7 14907 1 "Vandfri" levnedsmidler er sådanne levnedsmidler, hvis fugtighedsindhold er så ringe, at den enzymatiske reaktion ikke sættes i gang. Fortrinsvis skal der herved forstås levnedsmidler med en restfugtighed på 0,1 5 til 2%.

Ved "sukkerholdige" levnedsmidler skal forstås sådanne levnedsmidler, som indeholder en vis mængde naturligt forekommende sukker, såsom saccharose, glucose eller fructose, eller indeholder sukkeralkoholer som sukkerer-10 statning. Det omhandlede middel har især betydning i for·'· bindelse med levnedsmidler med et indhold af saccharose.

Det er kendt, at saccharose i forhold til andre sukkerarter frembyder betydelige teknologiske fordele i forhin^· delse med bestemte vandfattige levnedsmidler.

15 Det omhandlede middel er også anvendeligt til så danne levnedsmidler eller farmaceutiske præparater, der ikke indeholder sædvanlige sukkerarter eller er i det væsentlige sukkerfri. Dette kan være produkter, der er sødet på grundlag af sukkererstatningsstoffer, f.eks. med 20 saccharin, cyclamat, af tropiske planter ekstraherede proteinsødestoffer eller xylit. Der kan imidlertid også være tale om produkter, der fra naturen i det væsentlige ikke indeholder sukker, og som heller ikke behøver en væsentlig sødning. Også ved disse produkter er indarbejdel-25 sen af det omhandlede middel fordelagtig. Midlets enzymer kan nemlig ved fortæringen af levnedsmidlet blive tilbage i mundhulen med de på tænderne hæftende spiserester, og dér f.eks. gøre de fra kulhydratnedbrydelsen stammende cariogene produkter uskadelige.

30 Det omhandlede middel er endvidere af betydning for de såkaldte "vandfattige, sukkerholdige levnedsmidler", hvorved især forstås med meget sukker fremstillede nærings- og nydelsesmidler. Eksempler herpå eller på nærtstående produkter er bagværk, desserter og kunsthonning.

35 Produkter, hvortil det omhandlede middel er af særlig interesse, er såkaldte stimulanser, såsom forskellige arter slik, dvs. hårde og bløde karameller (bonbons), fondant, skumsukkerprodukter, gummisukkerprodukter, lakridsproduk- 8 14907 1 ter, drageer, frugtpastaer, krokant, brusepulver, marcipan, persipan, nougat, chokolade og cacaoprodukter, slik-kepinde, pastiller eller tyggegummi. Produkterne af tyggegummitype har særlig interesse, da sådanne produkter 5 er i berøring med spyttet i lang tid og har lang opholdstid i munden.

Ved langtidsberøring i forbindelse med lange opholdstider forstår man for produkter, der skal indtages oralt, tider på mindst nogle minutter.

10 Det omhandlede middel kan også sættes til farmaceu tiske præparater som et aktivt stof, der naturligvis også kan optræde supplerende ved siden af andre sædvanlige, aktive stoffer. Som sådanne farmaceutiske præparater kommer frem for alt tabletter og drageer i betragtning, der 15 foruden de farmakologisk virksomme stoffer indeholder sukkér. Blandt andre produkter, der kan nævnes, er forskellige arter af såkaldte quasi-medicinske produkter, som f.eks. hosteeliksirer eller -sirupper. Sådanne produkter tages ofte før man går i seng, dvs. efter at tæn-20 derne allerede er rensede, og har således en langtidsvirkning på tandbelægningen.

Særligt vigtige farmaceutiske præparater, hvortil det omhandlede middel kan anvendes, er mundhygiejnetab-letter i videste forstand, såsom tandhygiejne-drageer, 25 tyggetabletter eller tandrensende tyggegummi. Den fordelagtige virkning af midlet beror også her på, at der ved blandingen med spyt i mundhulen kan dannes en enzymatisk beskyttelseshinde over tænderne, hvilken hinde kan forhindre omdannelsen af eventuelt tilstedeværende sukker-30 rester til cariogene produkter.

De nævnte tandplejemidler kan f.eks. forligge i · form af en tandtablet, der indeholder de sædvanlige polerings-, binde-, fortykkelses- og befugtningsmidler.

Egnede poleringsmidler, der f.eks. er anvendelige 35 til tandplejemidler, er f.eks. de sædvanlige calcium-phosphater, såsom tricalciumphosphat, alkalimethaphos-phat, magnesiumcarbonat, pulverformige kunststoffer, så- 149071 9 som polymethylmethacrylat eller urinstof-formaldehyd-kondensationsprodukter eller blandinger af sådanne stoffer.

Derudover kan tandplejemidlerne også indeholde 5 konserveringsmidler, aromastoffer og andre hjælpestoffer.

I enkelte tilfælde kan det imidlertid også være ønskeligt at understøtte eller forstærke virkningen af andre aktive stoffer, der tjener til cariesbeskyttelse på grundlag af andre principper, ved hjælp af det omhandle-10 de middel. Af sådanne sædvanlige aktive stoffer kan især nævnes fluorforbindelser, såsom aminfluorider eller alkalifluorider, eller også dextranaser.

Det i det omhandlede middel indgående lactatdehy-drogenase (i det følgende betegnet LDH) er tilgængeligt 15 i handelen. Lactatdehydrogenase kan blandt andet fremstilles ud fra forskellige mikrober, f.eks. gær. Det af gær vundne LDH er forholdsvis stabilt, f.eks. forbliver et i glycerol opløst enzympræparat aktivt i et år ved +18°C. Desuden kan LDH lagres i længere tid uden nævne-20 værdigt aktivitetstab i pufferopløsninger i et defineret pH-område. Som forsøg i forbindelse med opfindelsen har vist, undergår det i vandfattige eller vandfri levnedsmidler eller farmaceutiske præparater indførte LDH kun et forholdsvis ringe aktivitetstab i løbet af sædvanlige 25 lagringstider, hvis der overhovedet indtræder et aktivitetstab.

Det i midlet ifølge opfindelsen indgående saccha-roseinverterende enzym er ligeledes tilgængeligt i handelen. Som saccharoseinverterende enzymer kommer inden for 30 opfindelsens rammer frem for alt saccharaserne i betragtning, af hvilke navnlig α-glucosidaserne og fortrinsvis β-fruetosidaserne, der spalter rørsukker i glucose og fructose, har vist sig velegnede. Det er kendt, at rørsukker spaltes af a-glueosidase, da det indeholder a-gly-35 cosidisk bundet glucose. Saccharosen kan imidlertid også angribes af et andet ferment, for hvis virkning molekylets fructosehalvdel er bestemmende, hvilken halvdel fo-rekaimer scrn β-fructofuranosid. Dette ferment er derfor en β-fruto- 149071 10 sidase, der også hyppigt kaldes (3-h-fructosidase (h skal betegne fructosens furanosestruktur). Disse enzymer er kendte, idet der i handelen som regel tilbydes tekniske præparater fremstillet udfra specielle gærstammer. Disse en-5 zymer viser god lagringsstabiliteti Således kan f.eks. rensede tørpræparater af garinvertase holde sig i mindst 1 år. Desuden vil lagring i pufferopløsninger i et defineret pH-område i et vist omfang heller ikke føre til aktivitetstab under længere lagringstider (jf. "Methoden 10 der Enzymatischen Analyse", H.U.Bergmeyer, 3. oplag, 1974, bind 1, Verlag Chemie, Weinheim, side 951-963).

Som det har vist sig ved forsøg udført i forbindelse med opfindelsen, lider saccharoseinverterende enzym, der er indført i vandfri eller vandfattige levnedsmidler el-15 ler farmaceutiske præparater, kun et meget ringe aktivitetstab i løbet af sædvanlige lagringstider. Således har man f.eks. konstateret, at lyophiliseret β-h-fructosida-se, der var blevet indført i sædvanlig i handelen gående chokolade ved Indrøring i den ved gradvis opvarmning til 20 45°C i termoplastisk tilstand overførte chokolademasse, kun led et aktivitetstab på ca, 8%, der ved 6 måneders lagring kun steg til ca. 15%.

Det foretrækkes at fastlægge den i det omhandlede middel indbragte mængde af enzymaktivitet i overensstem-25 melse med den anslåede lagringstid for materialet og i det mindste således, at indholdet på indtagelsestidspunktet i det store og hele er tilstrækkeligt til at fremkalde den ønskede virkning.

Den mængde af det omhandlede middel, der skal ind-30 føres i et levnedsmiddel eller farmaceutisk præparat, såsom tandrensetabletter, men især i tabletformede plejemidler for tandproteser, kan let bestemmes af fagmanden på grundlag af den specifikke enzymaktivitet, materialets omtrentlige sukkerindhold, såfremt et sådant forefindes, 35 samt på grundlag af det i bindematerialet eller ved dettes fremstilling foreliggende pH-område.

149071 11 I almindelighed er en LDH-mængde på 0,2 mg til 0,5 g/kg egnet. Fortrinsvis anvendes 0,5 mg - 0,05 g/kg, henført til en specifik aktivitet på ca. 300 U/mg.

Desuden bør også materialets temperatur og even-5 tuelt dets vandindhold ved tilsætningen af midlet eller dets sædvanlige lagringstemperatur tages i betragtning.

Den mængde af midlet , der hensigtsmæssigt bør tilsættes, kan også fastlægges ved hjælp af simple forsøgstilsætninger. Invertasemængden ligger fortrinsvis i om-10 rådet fra 0,05 g til 5,0 g/kg (henført til en specifik aktivitet på ca. 100 U/mg).

Ved fastlæggelsen af den enzymaktivitet, der skal indføres, er det f.eks. ikke i alle tilfælde nødvendigt at tage saccharose-andelen, eventuelt tilmed den latente 15 saccharose-andel, der kan opstå udfra forprodukter, såsom stivelse , fuldstændigt i betragtning. Erfaringsmæssigt synkes en forholdsvis stor del af levnedsmidlet, således at en stor del af saccharosen ikke længere kommer i berøring med tænderne. Det er imidlertid tilstræk-20 keligt, hvis den på tænderne aflejrede saccharose-andel tages i betragtning med hensyn til de tilsatte enzymmængder. Ved børstning af tænderne og skylning af munden med destilleret vand konstateredes det f.eks. som gennemsnit af 50 forsøg, at mindre end 1 g rørsukker kunne på-25 vises i skyllevæsken, når forsøgspersonerne forinden havde fået ca. 50 g i handelen gående chokolade. I sidste instans er det imidlertid kun den i mundhulen tilbageværende eller forventede restsukkermængde, der skal tages i betragtning, således at man, når enzymerne ikke 30 synkes med det tyggede levnedsmiddel i samme forholdsvise mængde, kan anvende enzymerne i underproportional aktivitetsmængde i forhold til udgangssukkermængden.

Også for farmaceutiske præparater og især tandpleje- eller mundhygiejnemidler, hvori det omhandlede 35 middel indføres, gælder, at den mængde af midlet, der skal tilsættes, fastlægges ved overslagsberegninger eller empiriske forsøg. I sådanne tandpleje- eller mund- 12 14907 1 hygiejnemidler forefindes sædvanligvis ikke noget sukkerindhold, som der må tages hensyn til ved beregningerne.

I dette tilfælde tjener indføringen af midlet det formål at frembringe en væskefilm i mundhulen og især på tænder-5 ne,. hvilken film er carieshæmmende, således at de eventuelt tilbageværende spiserester, der heller ikke fjernes ved børstning, ikke kan føre til caries, selv om der er cariogene bakterier til stede.

I det omhandlede middel kan forholdet mellem lac-10 tatdehydrogenasemængden og mængden af saccharoseinverte-rende enzym variere inden for et bredt område.

Mængden af saccharoseinverterende enzym skal være tilstrækkeligt til at foretage en invertering af saccha-roseindholdet. De ved beregning eller ved simple forsøgs-15 tilsætninger fastlagte mængder ligger i reglen betydeligt højere end de mængdeandele, der har vist sig fordelagtige ved den samtidige tilstedeværelse af LDH.

Indføringen af det omhandlede middel udføres hensigtsmæssigt således, at der fås en homogen fordeling i 20 f.eks. levnedsmidlet. På den anden side kan det undertiden være at foretrække, især når levnedsmidlet ikke selv viser isotrop sukkerfordeling, ligeledes at sørge for en ujævn fordeling af midlet. Således vil det f.eks. ved chokolade, hvori der er fordelt hele nødder, ikke være 25 nødvendigt også at fordele det enzymholdige middel homogent i nødderne.

Indføringen af det omhandlede middel sker sædvanligvis ved en pH-værdi, ved hvilken enzymerne er stabile, samt ved en temperatur, ved hvilken enzymernes aktivitet 30 ikke påvirkes skadeligt. Et foretrukket pH-område ligger mellem pH 4 og 7, særligt fordelagtigt er området fra 4,7 til 5,2. Det er især at foretrække at indføre midlet i f.eks. levnedsmidlet i det pH-område, der ligger mellem enzymernes stabilitets-optima. Egnede indføringstempera-35 turer ligger mellem 0 og 50°C, idet temperaturerne mellen 20 og 50°C må anses for særligt gunstige. Alt efter anvendelsesformålet kan temperaturområdet fra 20-40°C især være at foretrække.

149071 13

Alt efter arten af det produkt, hvortil det omhandlede middel skal sættes, kan det være ønskeligt enten at tilsætte midlet under fremstillingsprocessen eller efter færdigfremstillingen af f.eks. levnedsmidlet eller 5 det farmaceutiske præparat, når der f.eks. ikke længere forefindes en betragtelig mængde vand. I tilfælde af stærkt sukkerholdige varer, såsom pladechokolade eller praliner, foretrækkes det, at midlet først tilsættes på et forholdsvis sent tidspunkt, således at der ikke sker 10 aktivitetstab under fremstillingen af varerne.

I det følgende beskrives forsøg, der viser den anti-cariogene virkning ved tilsætning af det omhandlede middel:

Som cariogent substrat anvendtes et i handelen gå-15 ende fedt- og sukkerholdigt vandfattigt smørepålæg. Som forsøgsdyr anvendtes hvide, homozygote rotter af typen "Wistar". Nævnte smørepålæg blev i en mængde på 50% blandet med et standard-tørfoder bestående af en vitaminrig protein-fedt-diæt, der er udviklet under hensyntagen 20 til alle rottens stofskiftebehov.

Den lufttørre forsøgsdiæt blev proportioneret og doseret således, at dyrene under fodringsperioden på 280 dage stadig kunne tage på i vægt. Dyrene blev holdt i kunststofbure, der var forsynet med drikke- og fod-25 ringsautomater. Til drikkevandet blev der med interval- 3 ler på 30 dage sat 50 til 60 x 10 Streptoccocus-mu-tans kim pr. milliliter. Som indstrøningsmateriale anvendtes steriliseret træ-fingranulat, der blev udskiftet med intervaller på 36 timer. Rumluften var klimatiseret.

30 Der blev dannet forsøgsgrupper på hver 60 dyr.

Alle dyrene blev inspiceret dagligt og vejet hver 30. dag, hvorved der ikke kunne konstateres nogen bivirkninger som følge af indholdet af LDH og saccharoseinv.er-terende enzym.

35 Konstatering af tegn på caries, især cariøse læ sioner, skete ved hjælp af et stereomikroskop ved 12 ganges forstørrelse: 143071 14 Følgende trin blev noteret: 0 = ingen caries 1=1 til 5 læsioner 2 = 5 til 10 læsioner 5 3 = mere end 10 læsioner Følgende diætsammensætninger blev afprøvet: A = 50% tørfoder + 50% smørepålæg B = 50% tørfoder + 50% smørepålæg + lactatdehydrogenase og saccharoseinverterende enzym (i handelen gående β-h-10 fructosidase).

Lactatdehydrogenasemængden androg 0,5 mg/kg smørepålæg, og mængden af saccharoseinverterende enzym 0,3 g/kg smørepålæg.

Ved fodring med diæt A indtrådte talrige cariøse 15 læsioner: Af forsøgsdyrene var 30 (50%) angrebet. I nedenstående tabel er forsøgsresultaterne såvel med hensyn til antal af læsionerne som med hensyn til disses sværhedsgrad sammenfattet. Som resultaterne viser, blev der ved fodring med diæt A konstateret til dels meget 20 stærke cariesangreb (>10 læsioner) hos forsøgsdyrene.

Ved tilsætningen af LDH i kombination med saccha-ro seinverterende enzym ved diæt B formindskedes såvel antallet som sværhedsgraden af læsionerne drastisk.

Resultaterne viser tydeligt den tandskånende, ikke-car-25 iogene virkning af den med LDH og saccharose-inverter en— de enzym forsynede diæt.

Tabel.

Forsøgsgruppe Caries-læsioner 30 ____________(antal x grad)_ A (diæt A) 15 x 1, 9 x 2, 6 x 3 B (diæt B) 4x1

Nedenfor er anført yderligere eksempler på pro-35 dukter, der indeholder en tilsætning af lactatdehydrogenase og saccharoseinverterende enzym.

149071 15 1. Plade af mælkechokolade: indeholdende Cacaomasse 26 g

Saccharose 60 9 Mælkefedt 3,2 g 5 Fedtfri tørmasse, samt 9,5 g

Lactatdehydrogenase, ca. 5-10 mg og β-h-fructosidase, ca. 20-25 mg der før afkølingen af den færdige chokolade er ble-vet indrørt ved ca. 40-45°C i homogen fordeling.

2. Sødetabletter: indeholdende Xylit 5 g 15 Saccharin-natriumsalt 0,7 g

Natriumcyclamat 0,3 g

Lactatdehydrogenase 0,1-0,5 mg (handelsprodukt)

Invertase 30 mg 20 (frysetørret handelsprodukt)

Ovenstående tørblanding kan også ved brugen overføres i en kun lidt kalorieholdig, anti-cariogen sødeop-løsning ved vandtilsætning.

25 3. Tandrensningsdragee Vægt% indeholdende Magnesiumcarbonat 10,0

Siliciumdioxid 20,0

Dicalciumphosphat 55,0 30 Urinstof-formaldehyd- kondensat 5,50

Aromastoffer 2,0

Tragant 1,5

Natriumlaurylsulfoacetat 2,5 35 Langkædet aminfluorid 2,0

Lactatdehydrogenase 0,1 β-h-Fructosidase 0,3