DK149118B - Oxidoreduktaseholdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv - Google Patents

Description

i 149118

Den foreliggende opfindelse angår et oxidoreduk-taseholdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv til nærings- og nydelsesmidler, dyrefoder eller orale farmaceutiske præparater, navnlig mund- og tand·^ 5 plejemidler.

Det er kendt, at der i mundhulen i nærværelse af mikroorganismer dannes såkaldt "plaques" forårsaget af nærings-, nydelses- og lægemidler med et højt indhold af sukker, og at der opstår sure affaldsprodukter, der an-10 griber tandemaljen stærkt. Denne indvirkning er kendt under navnet caries. Man forstår herved et i begyndelsen overfladisk angreb på tænderne, der derpå fortskridende ødelægges under dannelse af hulheder.

De mikroorganismer, der befinder sig i eller un-15 der de som plaques betegnede tandbelægninger, er i første række af betydning for opståelsen af tandcaries.

De i tandplaques tilstedeværende mikroorganismer lever, ligesom alle andre i mundhulen tilstedeværende kim, af de rester, der bliver tilbage i mundhulen efter nærings-20 eller nydelsesmiddelindtagelsen. Især lavmolekylære kulhydrater, frem for alt forskellige sukkerarter, er gunstige for bakterierne, da de udgør de bedste energikilder for bakteriernes intensive vækst- og stofskifteprocesser.

25 Cariesdannelsens mekanisme synes endnu ikke at være nøjagtigt opklaret i alle enkeltheder. De cario-gene mikrober, f.eks. streptococcus mutans, danner fermentet dextransaccharase, der spalter rørsukkeret i an-hydroglucose og fruktose. Anhydroglucosen kan derpå 30 sammenlejres til polymere molekyler, der betegnes dex-trangeler. Blandt disse viser især dextrangeler med en molekylvægt på 10.000 til 200.000 en særlig klæbekraft.

Disse dextrangeler tjener på en vis måde som "klæbemidler" , der fastholder de pågældende bakterier på tand-35 overfladerne, dvs. danner plaquen. De nævnte bakterier kan derpå under plaquen under luftudelukkelse danne syrer, f.eks. mælkesyre eller andre tandødelæggende syrer, 149118 2 f.eks. udfra inddiffunderet sukker, hvilket fører til dannelse af indledende emaljelæsioner (initial-caries), dvs. der sker en korrosion af dentinen med de kendte følgefænomener. Efter dannelse af plaquen vil der, ved 5 den herunder stedfindende cariøse demineralisering under indvirkning af syre, lidt efter lidt udtrækkes calcium og phosphat især fra tandens emaljeapatit.

Ved de hidtidige forsøg på at hæmme caries er man gået to veje. Disse består i princippet enten i en for-10 øgelse af modstanden af tandhårdstofferne overfor syreangrebet eller i en svækkelse af syreangrebet på tanden.

Under den førstnævnte løsning falder forsøg på drikkevands-, salt- eller mælkefluoridering, der frem for alt i USA og Schweiz er blevet gennemført i vidt om-15 fang. Desuden kan nævnes lokalapplikation af fluorid-holdige tabletter eller anvendelsen af fluorerede forbindelser, såsom natriumfluorid, natriummonofluorphos-phat, tinfluorid-calciumpyrophosphat eller aminfluorid.

Selv om der er berettet om en aftagen af cariøse læsioner 20 gennem disse forholdsregler, kan de opnåede resultater ikke anses for tilfredsstillende. Dertil kommer, at der består væsentlige vanskeligheder også af fysiologisk art mod kemikalieindføringen især i drikkevand og næringsmidler, såsom mælk. Dertil kommer, at de kollektive og 25 individuelle, fluorideringsforholdsregler i forbindelse med ernæringen af civilbefolkningen ikke er tilstrækkelige til at modvirke den cariøse ødelæggelse af tænderne.

Man har imidlertid også søgt en cariesbekæmpelse ved kontrol af dextrandannelsen, især ved indvirkning af 30 kemikalier. Således er f.eks.i"Journal of Dental Health" bind 22 nr. 4, december 1972,beskrevet anvendelsen af natriumoleat og -linoleat til dette formål. Disses virkning på dannelsen af dextran kan ifølge DE-offentliggørelsesslarift nr.

2 442 825 forstærkes ved hjælp af vandopløselige sekundære 35 phosphater i midler til tandhygiejnen. Desuden omhandles i DE-frent-læggelsesskrift nr. 1 467 809 anvendelsen af Ca-, Na- eller Mg-salte af estere af phosphorsyre med saccharose, glucose eller lactose til fremstilling af i mundhulen 3 149118 cariostatisk aktive tandplejeprodukter. Disse forholdsregler til blokering af metabolismen af den mundmikroflora, der anvender dextran-saccharose-enzym-systemet til dannelse af "dentalplaque", har ganske vist medført en 5 vis forbedring af tandplejemidlerne, men ikke den ønskede dybtgående bekæmpelse af den cariøse tandødelæggelse.

Heller ikke kendte forsøg på at udnytte lyolyse-princippet, nemlig at forebygge caries enten ved ødelæggelse af de cariogene mikroorganismer ved opløsning eller 10 løsnen deraf eller ved opløsning eller løsnen af de klagende dextrangeler, har hidtil vist sig tilfredsstillende. Således er-dp-r i DE-fraønlæggelsesskrift nr.2 011 935 beskrevet ødelæggelse af eller angreb på cariogene mikrober ved hjælp af enzymer, der er blevet isoleret af bestemte streptococstam-15 mer. Til dette formål er angivet tre bestemte stammer og deres indføring i tandplejemidler.Desuden er lyolyseprincip-pet blevet anvendt på allerede dannet dextran ved hjælp af enzymet dextranase ifølge DE- offentliggørelsesskrift nr. 1 955 956.Ifølge AT-patentskrift nr. 318 815 kunne dextranasen imidlertid · kun 20 ødelægge opløselig dextran, da det uopløselige dextran har en mutan-andel, der ikke kan angribes af dextranase.

Derfor er anvendelsen af "mutanase" blevet foreslået i dette østrigske trykskrift.

Heller ikke disse forsøg på at forbedre tand-25 plejemidler ved opløsning af de dextranfrembringende mikroorganismer eller selve dextranerne og inkorporering af sådanne systemer i tandplejemidler har imidlertid vist sig fuldstændig tilfredsstillende hidindtil.

Dette skyldes til dels, at en pleje af tænderne efter 30 hvert måltid,efter indtagelse af søde sager osv. ikke altid er mulig for at standse de i mellemtiden optrædende beskadigelser.

En anden vej til bekæmpelse af caries har man set i delvis eller fuldstændig erstatning af rørsukker med 35 andre ikke-cariogene sukkerarter eller sukkeralkoholer eller med syntetiske sødemidler.

En fuldstændig erstatning af saccharose med kun lidt cariogene eller ikke-cariogene sukkererstatnings- 4 14911 δ stoffer, f.eks. med sukkeralkoholerne xylit og sorbft kommer ved mange anvendelser ikke i betragtning af teknologiske,· økonomiske, organoleptiske eller medicinske grunde.

5 Blandt de syntetiske sødestoffer har saccharin, et af de kendteste og hyppigst anvendte sukkererstatningsstoffer, den ulempe, at det fremkalder en ubehagelig eftersmag hos brugeren. I forbindelse med andre stoffer, f.eks. cyclamaterne, er lægestanden yderst for-10 beholden, hvad angår deres skadelighed. De syntetiske sødestoffer har desuden den ulempe-, at de små -t mængder, der skal anvendes som følge af den høje søde-kraft, ikke er lette at dosere, f.eks. taler man i denne sammenhæng om en "tom smag", dvs. den ønskede "fylde" 15 mangler. Også fysiologiske virkninger stiller sig hindrende i vejen for den almindelige udbredelse af de syntetiske sødestoffer.

Det er endvidere blevet anbefalet at anvende enzymer for at fremskynde nedbrydningen af føderester og 20 derved forhindre dannelsen af plaque. Der er blevet foreslået α-glucosidaser og/eller β-fructosidaser (DE-offentliggø-relsesskrift nr. 1 927 411), samt en polyner-enzym-forbindelse, der indeholder neutrale, alkaliske og sure proteaser foruden amylase, lipase og dextranase (DE-offentliggørelsesskrift nr. 1 948 298).

25 Fra DE fremlæggelsesskrift pr, 2,027,019 kendes tandplejemidler, der er vandfattige, sukkerholdige og tandskånende derved, at de indeholder enzymer, såsom glucoseoxidase og lactatoxidase (det sidstnævnte enzyms betegnelse er ifølge Enzyme Nomenclature, Elsevier 30 Scientific Publishing Comp., Amsterdam, 1973, side 108/109 blevet ændret til lactat-2-monooxygenase, nr.

1.13.12.4). Det afgørende ifølge dette tyske fremlæggelsesskrift er, at disse oxidoreduktaser med oxygen sønderdeler substratet under dannelse af hydrogen-35 peroxid. Ved hjælp af dette enzymatisk dannede aggressive agens beskadiges eller ødelægges de mikroorganismer, der tager del i det cariogene angreb, oxidativt.

5 149118

Herved angribes imidlertid mundfloraen som helhed af medier, der er fremmede for legemet, hvilket er uheldigt.

Trods disse talrige forsøg på at bekæmpe caries, der bygger på de mest forskellige principper, består der 5 stadig en tvingende nødvendighed for yderligere eller nye forholdsregler til forhindring af de skadelige følger af syreangrebene i nærværelse af cariogene mikroorganismer for at muliggøre en tilbagetrængning af..caries i forbindelse med de traditionelle kostvaner.

10 Den til grund for opfindelsen liggende opgave er at modvirke de skadelige virkninger af caries såvel ved forbedring af traditionelle, vandfattige levnedsmidler, der er fremstillet under anvendelse af sukker, som, eventuelt, supplerende ved en samtidig forbedring af tand-15 plejemidler og farmaceutiske præparater. Forbedringen af levnedsmidlerne skal især tage hensyn til den omstændighed, at det cariogene angreb allerede sker i de tidsintervaller, der ligger mellem de sædvanlige tidspunkter for tandrensningen. Det tilsigtes især ifølge opfindel-20 sen at omdanne levnedsmidler til "tandskånende" levnedsmidler uden eller uden fuldstændig erstatning af det sædvanligvis anvendte sukker ved tilsætning af et fysiologisk uskadeligt stof.

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved et oxi-25 doreduktaseholdigt middel til anvendelse som cariesforebyggende additiv til nærings- og nydelsesmidler, dyrefoder eller orale farmaceutiske præparater, navnlig mund-og tandplejemidler, hvilket middel er ejendommeligt ved, at oxidoreduktasen er lactatdehydrogenase.

30 ·. Der er tale om henholdsvis L-lactat- og D-lactat- hydrogenase. Disse har Enzyme Nomenclature-numrene henholdsvis 1.1.1.27 og 1.1.1.28. Som bekendt afspejler enzymnomenklaturens nummersystematik forskelligheder i enzymernes natur. Lactatoxidase overfører således lactat 35 i acetat og kræver for sin enzymatiske reaktion tilstedeværelse af oxygen, og der dannes som yderligere reaktionsprodukter CC>2 og Η202· Lactatdehydrogenase overfører 149118 6 derimod på speciel måde lactat i pyruvat, og L-formen kræver for den enzymatiske reaktion tilstedeværelse af en hydrogenacceptor. En sådan hydrogenacceptor vil imidlertid som oftest være til stede i spyt eller i forelig-5 gende plaque-materiale, og en separat tilsætning af en hydrogenacceptor er derfor ikke absolut nødvendig. Det er imidlertid ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at det omhandlede middel'yderligere indeholder en hydrogenacceptor. Som hydrogenacceptor kan for eksempel anvendes ni-10 cotinamidadenin-dinucleotid.

Det har ved forsøg overraskende vist sig, at cariesangrebet aftager stærkt ved tilsætning af det omhandlede middel. Det antages, at der ved denne lactatdehydro-genasetilsætning til vandfattige eller vandfri levneds-15 midler indbygges et hæmningssystem, der ved fortæringen af levnedsmidlerne modvirker den skadelige indflydelse af de ved sukkernedbrydningen dannede produkter i nærværelse af cariogene bakterier.

"Vandfri" levnedsmidler er sådanne levnedsmidler, 20 hvis fugtighedsindhold er meget ringe. Fortrinsvis skal der herved forstås levnedsmidler med en restfugtighed på 0,1 til 2%.

Ved "sukkerholdige" levnedsmidler skal forstås sådanne levnedsmidler, som indeholder en vis mængde na-25 turligt forekommende sukker, såsom saccharose, glucose eller fructose, eller indeholder sukkeralkoholer som sukkererstatning. Det omhandlede middel har især betydning i forbindelse med levnedsmidler med et indhold af saccharose. Det er kendt, at saccharose i forhold til andre 30 sukkerarter frembyder betydelige teknologiske fordele i forbindelse med bestemte vandfattige levnedsmidler.

Det omhandlede middel er også anvendeligt til sådanne levnedsmidler eller farmaceutiske præparater, der ikke indeholder sædvanlige sukkerarter eller er i det 35 væsentlige sukkerfri. Dette kan være produkter, der er sødet på grundlag af sukkererstatningsstoffer, f.eks. med saccharin, cyclamat, af tropiske planter ekstrahere- 7 149118 de proteinsødestoffer eller xylit. Der kan imidlertid også være tale om produkter, der fra naturen i det væsentlige ikke indeholder sukker, og som heller ikke behøver en væsentlig sødning. Også ved disse produkter er 5 indarbejdelsen af det omhandlede middel fordelagtig. Lactatdehydrogenasen kan nemlig ved fortæring af levnedsmidlet blive tilbage i mundhulen med de på tænderne hæftende spiserester, og dér f.eks. gøre de fra kulhydratnedbrydelse stammende cariogene produkter uskadelige.

10 Det omhandlede middel er endvidere af betydning for de såkaldte "vandfattige, sukkerholdige levnedsmidler", hvorved især forstås med meget sukker fremstillede nærings- og nydelsesmidler. Eksempler herpå eller på nærstående produkter er bagværk, desserter og kunsthonning.

15 Produkter, hvortil det omhandlede middel er af særlig interesse, er såkaldte stimulanser, såsom forskellige arter slik, dvs. hårde og bløde karameller (bonbons)/ fondant, skumsukkerprodukter, gummisukkerprodukter, lakridsprodukter, drageer, frugtpastaer , krokant, 20 brusepulver, marcipan, persipan, nougat, chokolade og cacaoprodukter, slikkepinde, pastiller eller tyggegummi. Produkterne af tyggegummitype har særlig interesse, da sådanne produkter er i berøring med spyttet i .lang tid og har lang opholdstid i munden.

25 Ved langtidsberøring i forbindelse med lange op holdstider forstår man for produkter, der skal indtages oralt, tider på mindst nogle minutter.

Det omhandlede middel kan også sættes til farmaceutiske præparater som et aktivt stof, der naturligvis 30 også kan optræde supplerende ved siden af andre sædvanlige, aktive stoffer. Som sådanne farmaceutiske præparater kommer frem for alt tabletter og drageer i betragtning, der foruden de farmakologisk virksomme stoffer indeholder sukker. Blandt andre produkter, der kan nævnes, 35 er forskellige arter af såkaldte quasi-medicinske produkter, som f.eks. hosteeliksirer eller -sirupper. Sådanne produkter tages ofte før man går i seng, dvs. efter at 149118 8 tænderne allerede er rensede, og har således en langtidsvirkning på tandbelægningen.

Særligt vigtige farmaceutiske præparater, hvortil det omhandlede middel kan anvendes, er mundhygiejnetab-5 letter i videste forstand, såsom tandhygiejne-drageer, tyggetabletter eller tandrensende tyggegummi. Den fordelagtige virkning af midlet beror også her på, at der ved blandingen med spyt i mundhulen kan dannes en enzymatisk beskyttelseshinde over tænderne, hvilken hinde kan for-10 hindre omdannelsen af eventuelt tilstedeværende sukkerrester til cariogene produkter.

De nævnte tandplejemidler kan f.eks. foreligge i form af en tandtablet, der indeholder de sædvanlige polerings-, binde-, fortykkelses- og befugtningsmidler.

15 Egnede poleringsmidler, der f.eks. er anvendelige til tandplejemidler, er f.eks. de sædvanlige calcium-phosphater, såsom tricalciumphosphat, alkalimethaphosphat, magnesiumcarbonat, pulverformige kunststoffer, såsom polymethylmethacrylat eller urinstof-formaldehyd-konden-20 sationsprodukter eller blandinger af sådanne stoffer.

Derudover kan tandplejemidlerne også indeholde konserveringsmidler, aromastoffer og andre hjælpestoffer.

I enkelte tilfælde kan det imidlertid også være ønskeligt at understøtte eller forstærke virkningen af andre 25 aktive stoffer, der tjener til cariesbeskyttelse på grundlag af andre principper, ved hjælp af det omhandlede middel. Af sådanne sædvanlige aktive stoffer kan især nævnes fluorforbindelser, såsom aminfluorider eller alkalifluorider, eller også dextranaser.

30 Det i det omhandlede middel indgående enzym lac- tatdehydrogenase (i det følgende betegnet LDH) er tilgængeligt i handelen. Lactatdehydrogenase kan blandt andet fremstilles ud fra forskellige mikrober, f.eks. gær.

Det af gær vundne LDH er forholdsvis stabilt, f.eks. for-35 bliver et i glycerol opløst enzympræparat aktivt i et år ved +18°C. Desuden kan LDH lagres i længere tid uden nævneværdigt aktivitetstab i pufferopløsninger i et de- 9 149118 fineret pH-område. Som forsøg i forbindelse med opfindelsen har vist, undergår det i vandfattige eller vandfri levnedsmidler eller farmaceutiske præparater indførte LDH kun et forholdsvis ringe aktivitetstab i løbet af sædvan-5 lige lagringstider, hvis der overhovedet indtræder et aktivitetstab .

Den mængde af det omhandlede middel, der skal indføres i et levnedsmiddel eller farmaceutisk præparat, såsom tandrensetabletter, men især i tabletformede pleje-10 midler for tandproteser, kan let bestemmes af fagmanden på grundlag af den specifikke enzymaktivitet, materialets omtrentlige sukkerindhold, såfremt et sådant forefindes, samt på grundlag af det i bindematerialet eller ved dettes fremstilling foreliggende pH-område.

15 Det foretrækkes at fastlægge mængden af indbragt enzymaktivitet i overensstemmelse med den anslåede lag-· ringstid for materialet og i det mindste således, at indholdet på indtagelsestidspunktet i det store og hele er tilstrækkeligt til at fremkalde den ønskede virkning.

20 I almindelighed er en LDH-mængde på 0,2 mg til 0,5 g/kg egnet. Fortrinsvis anvendes 0,5 mg-0,05 g/kg, henført til en specifik aktivitet på ca. 300 U/mg.

Desuden bør også materialets temperatur og even-25 tuelt dets vandindhold ved tilsætningen af midlet eller dets sædvanlige lagringstemperatur tages i betragtning.

Den mængde af midlet, der hensigtsmæssigt bør tilsættes, kan fastlægges ved hjælp af simple forsøgstilsætninger.

Også for farmaceutiske præparater og især tand-30 pleje- eller mundhygiejnemidler, hvori det omhandlede middel indføres, gælder, at den mængde af midlet, der skal tilsættes, fastlægges ved overslagsberegninger eller empiriske forsøg. I sådanne tandpleje- eller mundhygiejnemidler forefindes sædvanligvis ikke noget sukkerind-35 hold, som der må tages hensyn til ved beregningerne. I dette tilfælde tjener indføringen af midlet det formål at frembringe en væskefilm i mundhulen og især på tænder- 149118 10 ne, hvilken film er carieshæmmende, således at de eventuelt tilbageværende spiserester, der heller ikke fjernes ved børstning, ikke kan føre til caries, selv om der er cariogene bakterier til stede.

5 Indføringen af det omhandlede middel udføres hen sigtsmæssigt således, at der fås en homogen fordeling i f.eks. levnedsmidlet. På den anden side kan det undertiden være at foretrække, .især når levnedsmidlet ikke selv viser isotrop sukkerfordeling, ligeledes at sørge for en 10 ujævn fordeling af midlet. Således vil det f.eks. ved chokolade, hvori der er fordelt hele nødder, ikke være nødvendigt også at fordele det enzymholdige middel homogent i nødderne.

Indføringen af det omhandlede middel sker sædvan-15 ligvis ved en pH-værdi, ved hvilken enzymet er stabilt, samt ved en temperatur, ved hvilken enzymet ikke denatureres. Et foretrukket pH-område ligger mellem pH 5 og 7.

Det er især at foretrække at indføre midlet i f,eks, levnedsmidlet ved den pH-værdi, hvor enzymet har sin optima-20 le stabilitet. Egnede indføringstemperaturer ligger mellem 0 og 50°C, idet temperaturerne mellem 20 og 50°C må anses for særligt gunstige. Alt efter anvendelsesformålet kan temperaturområdet fra 2Q-4Q°C især være at foretrække.

25 Alt efter arten af det produkt, hvortil det om handlede middel skal sættes, kan det være ønskeligt enten at tilsætte midlet under fremstillingsprocessen eller efter færdigfremstillingen af f.eks. levnedsmidlet eller det farmaceutiske præparat. I tilfælde af stærkt sukker-30 holdige varer, såsom pladechokolade eller praliner, foretrækkes det, at midlet først tilsættes på et forholdsvis sent tidspunkt, således at der ikke sker aktivitetstab under fremstillingen af varerne.

I det følgende beskrives forsøg, der viser den 35 anti-cariogene virkning ved tilsætning af det omhandlede middel: 11 149118

Som caric gent substrat anvendtes et i handelen gående fedt- og sukkerholdigt vandfattigt smørepålæg. Som forsøgsdyr anvendtes hvide homozygote rotter af typen "Wistar". Nævnte smørepålæg blev i en mængde på 50% 5 blandet med et standard-tørfoder bestående af en vitaminrig protein-fedt-diæt, der er udviklet under hensyntagen til alle rottens stofskiftebehov.

Den lufttørre forsøgsdiæt blev proportioneret og doseret således, at dyrene under fodririgsperioden på 10 280 dage stadig kunne tage på i vægt. Dyrene blev holdt i kunststofbure, der var forsynet med drikke- og fodringsautomater. Til drikkevandet blev der med intervaller 3 på 30 dage sat 50 til 60 x 10 Streptococcusmutans-kim pr. milliliter. Som indstrøningsmateriale anvendtes ste-15 riliseret træ-fingranulat, der blev udskiftet med intervaller på 36 timer. Rumluften var klimatiseret.

Der blev dannet forsøgsgrupper på hver 60 dyr.

Alle dyrene blev inspiceret dagligt og vejet hver 30. dag, hvorved der ikke kunne konstateres nogen bivirk-20 ninger som følge af indholdet af LDH.

Konstatering af tegn på caries, især cariøse læsioner, skete ved hjælp af et stereomikroskop ved 12 ganges forstørrelse: Følgende trin blev noteret: 25 0 = ingen caries 1=1 til 5 læsioner 2=5 til 10 læsioner 3 = mere end 10 læsioner Følgende diætsammensætninger blev afprøvet: 30 A = 50% tørfoder + 50% smørepålæg B. = 50% tørfoder + 50% smørepålæg + lactatdehydrogenase.

Lactatdehydrogenasemængden androg 0,5 mg/kg smørepålæg.

Ved fodring med diæt A indtrådte talrige cariøse 35 læsioner: Af forsøgsdyrene var ialt 30 (50%) angrebet.

I nedenstående tabel er forsøgsresultaterne såvel med hensyn til antal af læsionerne som med hensyn til disses 149118 12 sværhedsgrad sammenfattet. Som resultaterne viser, blev der ved fodring med diæt A konstateret til dels meget stærke cariesangreb (>10 læsioner) hos forsøgsdyrene.

Ved tilsætningen af LDH ved diæt B formindskedes 5 såvel antallet som sværhedsgraden af læsionerne vidtgående.

Dette viser tydeligt den tandskånende virkning af den med LDH forsynede diæt.

Tabel.

10 Forsøgsgruppe Caries-læsioner _(antal x grad)_ A (diæt A) 15x1,9x2,6x3 B (diæt B) 6x1,3x2 15

Nedenfor er anført yderligere eksempler på produkter, der indeholder en tilsætning af lactatdehy-drogenase.

20 1. Plade af mælkechokolade: indeholdende Cacaomasse 26 g

Saccharose 60 g Mælkefedt 3,2 g

Fedtfri tørmasse 9,5 g 25 Lactatdehydrogenase, der før afkølingen af den færdige chokolade er blevet indrørt ved ca 40-45°C i homogen fordeling 5 - 10 mg 30