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Trennen der Komponenten des Actinomycins C Im deutschen Patent
925 o64 ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, nach dem das nach dem deutschen
Patent 9i2 oio zugängliche Actinochrysin (Actinomycin C) in drei verschiedene Komponenten,
nämlich in die Actinomycine Cl. C, und C3 aufgeteilt werden kann. Das geschieht
dadurch, daß man das auf mikrobiologischem Wege anfallende Actinomycin C einer Verteilung
zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln unterwirft.
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Als Lösungsmittel werden nach dem deutschen Patent 925 o64 z. B. einerseits
wäßrige Lösungen von Harnstoff, Salzen aromatischer Sulfosäuren oder wäßrige Salzsäure,
andererseits organische, mit Wasser beschränkt mischbare Lösungsmittel, wie Äther
oder Ester, verwendet. Die Verteilung des Actinomycin C zwischen diesen Lösungsmitteln
erfolgt z. B. in Form einer Gegenstromverteilung in speziell dafür eingerichteten
Verteilungsapparaturen. Dieses Verfahren ist außerordentlich mühsam und erfordert
für die Reindarstellung von einigen Milligramm der Actinomycinkomponenten einen
großen Aufwand an Zeit und Arbeitskraft.
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Es wurde nun gefunden, daß es gelingt, die reinen Actinomycinkomponenten
des auf mikrobiologischem Wege anfallenden Actinomycin C in ausreichenden Mengen
präparativ dadurch zu gewinnen, daß man sie durch Verteilungschromatographie trennt.
Es ist wesentlich, daß man für die Verteilungschromatographie Paare von nicht miteinander
mischbaren Lösungsmitteln einsetzt, von denen eines eine wäßrige Phase darstellt,
in der sich das Actinomycin C in möglichst hoher Konzentration löst, während als
anderes Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel verwendet wird.
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In Wasser ist Actinomycin C sehr wenig löslich. Auch die bisher verwendeten
wäßrigen Lösungen von Harnstoff, Salzen aromatischer Sulfosäuren
oder
wäßrigeSalzsäure, sind hierfür nicht geeignet, da ihre Lösungsfähigkeit für Actinomycin
C zu gering ist. Es wurde aber gefunden, daß man die als wäßrige Phase notwendigen
höher konzentrierten wäßrigen Lösungen erhält, wenn man als Lösungsmittel wäßrige
Lösungen von Salzen, von Oxycarbonsäuren oder Oxysulfosäuren verwendet. Es gelingt
überraschenderweise, die Löslichkeit von Actinomycin C in Wasser durch Zusatz von
Salzen aromatischer Oxycarbonsäuren oder Oxysulfo'-säuren so zu steigern, daß man
leicht zu Konzentrationen von i o °/o Actinomycin C und mehr kommt. Als Kation dieser
Salze sind sowohl anorganische wie organische Ionen brauchbar. Es ist gleichgültig,
ob man z. B. entweder mit den Natriumsalzen oder mit den Salzen organischer Basen,
wie z. B. Trimethylamin oder Äthanolamin, arbeitet. Die aromatischen Oxycarbonsäuren
bzw. Oxysulfosäuren können eine odermehrerephenolischeHydroxylgruppen enthalten.
Diese phenolischen Hydroxylgruppen brauchen nicht in freier Form vorzuliegen, sondern
können z. B. durch Alkylgruppen substituiert sein.' Als organische Lösungsmittel,
die mit diesen wäßrigen Lösungen nicht oder nur beschränkt mischbar sein dürfen,
haben sich höhere aliphatische Alkohole sowie Äther, z. B. Methylbutyläther oder
Dibutyläther, oder Ester bewährt. Es ist zweckmäßig, dieZusammensetzung des organischen
Lösungsmittels so, zu wählen, daß es in seinem Lösungsvermögen für Actinomycin C
hinter dem des wäßrigen Lösungsmittels zurückbleibt. Das läßt sich durch Mischung
von zwei verschiedenen Lösungsmitteln leicht erreichen, z. B. durch Mischungen von
Butanol mit Dibutyläther in geeignetem Verhältnis. Da im allgemeinen die Löslichkeit
von Actinomycin C in organischen Lösungsmitteln weit höher ist als die in wäßrigen
Lösungsmitteln, bereitet die Auswahl eines geeigneten organischen Lösungsmittels
keine Schwierigkeiten.
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Als Träger für die Verteilungschromatographie haben sich inerte Stoffe,
wie z. B. Cellulosepulver, bewährt. Beispiel i Zur präparativen Trennung des Actinomycins
werden 3 Volumtei.le Di-n-hutyläther, 2 Volumteile Butanol und 5 Volumteile einer
ioo/oigen wäßrigen Lösung des m-kresotinsauren Natriums durch anhaltendes Schütteln
ins Gleichgewicht gesetzt und die wäßrige Phase abgetrennt. Mit dieser wird ein
homogener, luftb.lasenfreier Brei aus Cellulosepulver angerührt, der in ein Chromatographierrohr
von 4,6 ccm Durchmesser und 6o ccm Länge eingeschlämmt und unter Anwendung eines
geringen Überdruckes zu einer Säule von 700 ccm Sehüttvolum zusammengepreßt
wird. Nach Durchdrücken von 150 ccm organischer Phase werden 5,8 g Actinomycin-C-Gemisch,
gelöst in wenig organischer Phase, heranchromatographiert und unter konstantem Überdruck
durch laufendes Nachgeben organischer mobiler Phase verteilt. Die Komponenten des
Gemisches sind an der Säule als drei getrennte, rote Zonen zu erkennen und können
nach bekannten Verfahren zu den reinen kristallisierten Actinomycinen Cl. C2, C3
aufgearbeitet werden. Beispiel e Die Trennung wird wie im Beispiel i ausgeführt.
Das Zweiphasensystem besteht aus einer Mischung von 3 Volumteilen Di-n-butyläther,
2 Volumteilen Butanol und 5 Volumteilen einer 5o/oigen wäßrigen Lösung des 2-naphthal-3-carbonsauren
Natriums. Die zu trennende Menge Actinomycin soll unterhalb 1,5 mg pro Kubikzentimeter
Schüttvolum der Säule gewählt werden. In gleicher Weise können auch wäßrige Lösungen
folgender Salze verwendet werden: salicylsaures. Natrium, geiltisinsaures Natrium,
3-methoxybenzoesaures Natrium, 2-naphthol-6, 8-disulfonsaures Natrium, m-kresotinsaures
Ammonium sowie Alkyl- und OxyaJkylammoniumsalze der genannten Säuren.